2015 Selyanin, Boykov, Khabarov Ácido Hialurónico Preparación

Ácido hialurónico
Ácido hialurónico
Preparación, propiedades, aplicación
en Biología y Medicina
Mikhail A. Selyanin, Petr Ya. Boykov
y Vladimir N. Khabarov
Centro Internacional de Investigación Martinex, Moscú,
Rusia
Traducido de la versión rusa por el editor científico Felix Polyak
Esta edición se publicó por

primera vez en 2015 ©
2015 John Wiley & Sons,
Ltd.
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Datos de catalogación en publicación de la Biblioteca del Congreso
Khabarov, VN (Vladimir N.)

Ácido hialurónico: preparación, propiedades, aplicación en biología y medicina / Mikhail A.
Selyanin, Petr Ya. Boykov y Vladimir N. Khabarov; traducido de la versión rusa por el editor
científico Felix Polyak.
páginas cm
Incluye referencias bibliográficas e indice.
ISBN 978-1-118-63379-3 (tela)
1. Ácido hialurónico. 2. Ácidos orgánicos. I. Boykov, P. Ya. II. Selyanin, MA (Michael A.) III. Título.
QP702.H8H9313 2015
612.015782 – dc23
2014038400
Un registro del catálogo de este libro está disponible en la Biblioteca Británica.
ISBN: 978-1-118-63379-3 (HB)
Ambientado en 10/12 puntos por SPi Publisher Services, Pondicherry, India
1 2015
Este libro está dedicado a nuestras hijas Daria, Maria y Vasilisa
La naturaleza no es como la imaginas:

Ella no es un molde, ni tampoco una máscara sin alma.
Ella esta hecha de alma y libertad
Ella está hecha de amor y habla ...
FI Tyutchev (poeta ruso)

Contenido
Prefacio
Introducción
1 La historia del descubrimiento del ácido hialurónico, fundamental

Investigación y uso inicial
1.1 Descubrimiento
1.2 Investigación Fundamental
1.3 Aplicaciones médicas iniciales
1.4 Fuentes de hialuronano
1.5 Estudio médico actual y uso
1.6 Impacto y direcciones futuras
Referencias
2 El papel biológico del ácido hialurónico
2.1 Filogénesis del ácido hialurónico

2.1.1 Estructura de polisacárido y problemas de filogénesis

2.1.2 Diferencias físico-químicas y funcionales de polisacáridos

2.1.3 Características bioquímicas del ácido hialurónico y otros

Glicosaminoglicanos
2.2 Funciones del hialuronano en la ontogénesis humana

2.2.1 Papel del ácido hialurónico en la fertilización

2.2.2 Hialuronano y otros glucosaminoglicanos en la división celular,

Migración y diferenciación

2.2.3 Ácido hialurónico y glucosaminoglicanos sulfatados

en el mantenimiento de un estado diferenciado de las células

2.2.4 Hialuronano e inducción de ciclos celulares para células diferenciadas

2.2.5 La fuente de las propiedades funcionales del ácido hialurónico y la

Dinámica de su síntesis y degradación

2.2.6 Las reglas de la división funcional de biopolímeros
2.3 Sistemas de señalización hialuronanos
2.4 Funciones hialuronanas en la matriz extracelular

2.4.1 Espacio extracelular

2.4.2 Composición y funcionamiento de la matriz extracelular

2.4.3 El papel del hialuronano en el transporte de sustancias

a través de la Matriz Extracelular: Difusión, Ósmosis,

Electroósmosis y transporte vesicular

2.4.4 Hialuronano en la matriz extracelular de diferentes

Tejidos conectivos se
Referencias
viii Contenido
3 métodos de producción de ácido hialurónico

3.1 Fuentes y extracción de hialuronano

3.1.1 Producción de hialuronano de origen animal: métodos generales

3.1.2 Purificación de hialuronano

3.1.3 La producción química de hialuronano a partir de peines de pollo

3.1.4 Producción de HA para Oftalmología
3.2 Métodos bacterianos de producción de ácido hialurónico
3.3 Destrucción de hialuronano durante la producción, almacenamiento

y esterilización
3.4 Destrucción enzimática de hialuronano

3.4.1 Clasificación de hialuronidasa

3.4.2 Propiedades y funciones de las hialuronidasas
3.5 Destrucción no enzimática de hialuronano

3.5.1 Hidrólisis ácido-base de hialuronano

3.5.2 Despolimerización por oxidación-reducción de hialuronano
3.6 Calidad de los productos comerciales de origen animal hialuronano

y origen bacteriano
Referencias
4 Estructura molecular y supramolecular del ácido hialurónico
4.1 Estructura primaria del ácido hialurónico
4.2 Estructura de hialuronano en solución
4.3 Propiedades reológicas del ácido hialurónico
Referencias
5 modificaciones químicas, fase sólida, radioquímica
y transformaciones enzimáticas del ácido hialurónico
5.1 Características principales de los hidrogeles reticulados
5.2 Métodos de enlace cruzado de ácido hialurónico

5.2.1 Relación cruzada con carbodiimidas

5.2.2 Enlace cruzado con aldehídos
5.2.3 Vinculación cruzada con divinilsulfona

5.2.4 Reticulación por iones de metales polivalentes

5.2.5 Relación cruzada con epóxidos

5.2.6 Enlace cruzado de fotografías

5.2.7 Relación cruzada de estado sólido a alta presión

y deformación por cizallamiento ( mezcla reactiva de estado sólid
5.3 Transformaciones radioquímicas (radiolisis)

de soluciones acuosas de hialuronano
Referencias
6 aplicaciones médicas de hialuronano
6.1 Medicina hialurónica y estética

6.1.1 Microimplantes intradérmicos a base de hialuronano
6.1.2 Enlace cruzado de hialuronano en una red tridimensional

Contenido

6.1.3 Ácido hialurónico en cosmetología inyectable (biorrevita

6.1.4 Peso molecular de hialuronano en productos de biorrevit

6.1.5 Eficiencia antioxidante de hialuronano y otros biológicam

Los compuestos activos como productos potenciales par

6.1.6 Biorreparadores como una nueva clase de productos in

Ácido Hialurónico Modificado con Baja Molecular

Biorreguladores de peso
6.2 Hialuronano en artrología
6.3 Hialuronano en Oftalmología
6.4 Hialuronano en Oncología
6.5 El papel del hialuronano en la curación de heridas
6.6 Hialuronano en inmunología
Referencias
Conclusión
Índice ?
Prefacio
En marzo de 2012, encontré un libro sobre el ácido hialurónico, que se
había publicado recientemente en ruso 1 . Lo leo con creciente interés.
Lo encontré extremadamente educativo y esclarecedor, especialmente
los capítulos sobre biología y aplicaciones médicas del ácido
hialurónico (HA). Sorprendentemente, cuando intenté encontrar otros
manuscritos publicados recientemente, mis búsquedas no arrojaron
resultados. Utilizo la palabra "sorprendentemente", porque existe un
enorme interés en este compuesto y un crecimiento creciente, incluso
exponencial, en la aplicación y uso de productos a base de HA en la
industria cosmética y en la medicina. No hay duda de que veremos
una aplicación aún más amplia de HA en estas áreas en un futuro
próximo.
Encontré este libro muy completo en su descripción y análisis de HA

y muy bien escrito. Cubrió todos los aspectos de HA; su historia y
descubrimiento, su papel biológico y funciones en el cuerpo,
producción y purificación, estructura y propiedades reológicas,
modificaciones químicas, aplicación en medicina, cosmetología y
medicina estética. Debe tenerse en cuenta que el manuscrito se
escribió hace varios años, por lo que el capítulo sobre la producción
de HA podría considerarse obsoleto. Sin embargo, decidimos dejarlo
intacto en esta versión, porque contiene información importante
sobre la purificación de HA para necesidades industriales. Además,
sirve para permitir a los autores presentar su importante logro con
respecto a la modificación química de HA, un logro que ha abierto las
puertas a muchos productos nuevos.
Como mencioné, el libro se publicó en ruso, razón por la cual muchos
lectores potenciales no pudieron leerlo. No me tomó mucho tiempo
decidirme a traducirlo y tratar de encontrar una manera para que los
lectores de habla inglesa disfrutaran del libro. Me gustaría expresar un
enorme agradecimiento a la editorial John Wiley & Sons, Ltd, por aceptar
publicarlo.
Es importante mencionar que el manuscrito ruso, además de su
gran valor científico, está escrito con un estilo literario increíblemente
hermoso. Intenté con gran esfuerzo mantener el estilo original y dar a
los lectores ingleses la oportunidad de disfrutarlo tanto como yo.
Llevó más de un año traducir y editar el libro y ahora está listo para
conocer a los lectores. Me gustaría expresar mi más sincero
agradecimiento a todos los que me ayudaron a preparar el manuscrito
en inglés, especialmente a los editores de John Wiley & Sons, que me
apoyaron mucho en cada paso durante la preparación del manuscrito.
Como los autores mencionaron en su Introducción, apreciamos
todos y cada uno de los comentarios críticos, que tomaremos en
cuenta en nuestros esfuerzos por mejorar esta primera versión.
Felix Polyak, PhD
1 La versión original en ruso fue publicada en 2012 por Prakticheskaya Meditsina en Moscú: VN Khabarov,
P.Ya. Boykov, MA Selyanin, ácido hialurónico . Moscú: Prakticheskaya meditsina, 2012 (en ruso).
Introducción
'Biopolímeros' es el nombre común (o general) de las macromoléculas
biológicas, que incluyen proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos.
La existencia de los principales procesos de la vida está determinada
por la interacción de estas sustancias. El ácido hialurónico posee uno
de los lugares principales entre ellos; no se le llama accidentalmente
"una maravillosa invención de la evolución". No sería fácil encontrar
una monografía dedicada a un solo compuesto en particular entre las
publicaciones científicas.
El ácido hialurónico es un polisacárido que se descubrió hace 80
años. Incluso hoy en día, continúa sorprendiendo a los investigadores
con sus propiedades únicas en diversas áreas de la química, la
biología y la medicina.
Por ejemplo, los aspectos médicos incluyen el estudio del papel del
hialuronano en la fecundación, la embriogénesis, el desarrollo de
respuestas inmunes, la cicatrización de heridas en enfermedades
infecciosas y oncológicas, en los procesos de envejecimiento y en la
solución de problemas de medicina estética. El hialuronano participa
en numerosos procesos biológicos. Está presente en prácticamente
todos los tejidos corporales, donde desempeña su papel en la
regulación de la actividad celular o, por otro lado, ralentiza la división
celular, la migración y participa en la reorganización de la estructura
de la cromatina y el cambio de genes.
La pregunta natural es, ¿cómo se originó tal variedad de
propiedades fisiológicas y funcionales de este polisacárido, a pesar de
su estructura química bastante simple? Para aclarar este tema, incluso
parcialmente, los autores intentaron vincular las funciones biológicas
del ácido hialurónico con los principios generales de la estructura y
las propiedades fisicoquímicas, utilizando un enfoque
multidisciplinario.
El manuscrito consta de seis capítulos. Se discuten muchos temas
con los diferentes niveles de complejidad y con diferentes grados de
completitud. Cada capítulo tiene su propia bibliografía.
El primer capítulo describe la historia del descubrimiento del ácido
hialurónico, los principales hitos de su investigación y aplicación
práctica. El capítulo más grande, el Capítulo 2, está dedicado al papel
biológico del ácido hialurónico en la naturaleza, en particular en el
cuerpo humano. El capítulo parte de la filogénesis del ácido
hialurónico, luego describe las funciones del hialuronano en la
ontogénesis humana y especialmente el papel que juega el
hialuronano en la matriz extracelular de los diferentes tejidos.
Los problemas de producción y purificación del ácido hialurónico se
analizan en detalle en el Capítulo 3. Los datos comparables de los
productos comerciales se presentan también en el Capítulo 3. La
estructura y las propiedades reológicas se discuten en el Capítulo 4. La
discusión está unida por una idea general acerca de las
transformaciones conformacionales cooperativas como los principales
fenómenos que manifiestan la bioespecificidad del ácido hialurónico,
así como su efecto único de las relaciones entre las propiedades
biológicas y la masa molecular. Los métodos físicos y químicos de
modificación estructural hialuronano se presentan en el capítulo 5.
Presenta las reacciones de la macro-molécula de reticulación con
bi-funcionales reactivos, así como altamente
xiv Introducción
método prometedor de modificación del estado sólido del ácido

hialurónico. Este método, que aplica tanto alta presión como pura
deformación, parece ser muy prometedor tanto científica como
prácticamente. La aplicación del enfoque de estado sólido permite la
producción de productos médicos únicos, incluso ahora. Estas
preparaciones, que pertenecen a la clase de fármaco-menos (o
no fármaco) macro-molecular productos terapéuticos, se preparan a
partir de ácido hialurónico, modificado con diferentes vitaminas,
aminoácidos y oligopéptidos. El último capítulo 6 proporciona una
descripción general de la aplicación médica del ácido hialurónico.
Además de su amplia aplicación en medicina estética y mesoterapia,
el hialuronano se ha vuelto muy popular en áreas como oftalmología,
artrología, cicatrización de heridas, inmunología, oncología, etc. Con
una mejor comprensión del papel biológico del hialuronano y el
desarrollo de los métodos químicos y físicos de su derivatización,
podemos esperar un papel cada vez mayor del ácido hialurónico y sus
productos en la medicina.
Los lectores encontrarán que la parte central del libro está dedicada
al papel biológico y la aplicación médica de ese polisacárido. El
completo material científico permitió a los autores tener una nueva
mirada sobre el lugar extremadamente importante del ácido
hialurónico en el mundo multifacético de las biomoléculas.
El libro está dirigido a una amplia gama de lectores: estudiantes,
profesores e investigadores interesados en la química de los
biopolímeros, la biología molecular y la medicina.
Los autores están muy agradecidos por el valioso consejo que
recibieron del Profesor A. Shilov, el Profesor N. Milanov, el Profesor A.
Zeleneckiy, el Profesor A. Shehter, el Dr. A. Safoyan, el Profesor I.
Samoilenko y el Dr. V. Volkov. Estas sinceras palabras están dirigidas a
todos los que ayudaron a preparar este manuscrito.
Los autores admiten que el libro obviamente no está libre de
inconvenientes, causados por la gran cantidad de material fáctico y
agradecen de antemano los comentarios críticos.
1
La historia del ácido hialurónico
Descubrimiento,
Fundamental
Investigación y uso inicial
1.1 Descubrimiento
En 1934, Karl Meyer y John Palmer escribieron en el Journal of

Biological Chemistry sobre un polisacárido inusual con un peso
molecular extremadamente alto aislado del vítreo de ojos bovinos [1].
Al ser el primero en mencionarlo, dieron la nueva postura sub el
nombre de ácido hialurónico (HA, el nombre moderno 'hialuronano')
derivado de 'hyaloid' (vítreo similar al vidrio en apariencia) y 'ácido
urónico'. Si bien generalmente se considera que Meyer y Palmer
descubrieron el ácido hialurónico, es justo mencionar que ya en 1918
Levene y López-Suárez habían aislado un nuevo polisacárido del
cuerpo vítreo y la sangre del cordón que llamaron
'ácido mucoitín-sulfúrico ' [2]. Consistía en glucosamina, ácido
glucurónico y una pequeña cantidad de iones sulfato. Ahora está claro
que esta sustancia era en realidad ácido hialurónico extraído junto
con una mezcla de glicosaminoglicanos sulfatados.
En el momento del descubrimiento del hialuronano, los

polisacáridos, que representan la mayor parte del material orgánico
de nuestro planeta, ya eran bastante conocidos. Un nú- mero de
los llamados mucopolisacáridos, actualmente conocido como
glicosaminoglicanos, que ya había sido descubierto. Se sabe que el
ácido hialurónico también pertenece a esta clase. Se aislaron
mucopolisacáridos del moco, al que confieren propiedades
lubricantes viscosas. Estas propiedades, a su vez, están relacionadas
con la capacidad del glicosaminoglicano para unirse a una cantidad
significativa de agua.
Ácido Hialurónico: Preparación, Propiedades, Aplicación en Biología y

Medicina , Primera Edición. Mikhail A. Selyanin, Petr Ya. Boykov y
Vladimir N. Khabarov.
© 2015 John Wiley & Sons, Ltd. Publicado en 2015 por John Wiley & Sons, Ltd.
2 ácido hialurónico
1.2 Investigación fundamental
Poco después de la publicación del trabajo original, se descubrieron

propiedades únicas del nuevo biopolímero, que demostraron que era
diferente de otros glicosaminoglicanos similares.Según Meyer y
Palmer, el polisacárido aislado contenía ácidos urónicos y
aminoazúcares, así como pentosa, y no era sulfatado [1]. También
decidieron que la masa molecular de la unidad repetible es de
aproximadamente 450 Da. Más tarde se demostró que HA de hecho no
contiene grupos sulfato o pentosa. También se estableció que la masa
molecular del residuo de disacárido repetible es 397 Da.
Durante los siguientes 10 años, Meyer y otros autores aislaron
hialuronano de varios órganos animales. Por ejemplo, el polisacárido
se encontró en el líquido articular, el cordón umbilical y
recientemente se ha hecho posible extraer HA de casi todos los tejidos
de vertebrados. En 1937, F. Kendall aisló hialuronano de las cápsulas
de los estreptococos de los grupos A y C. Este trabajo tuvo una gran
importancia científica y práctica, ya que en la actualidad los grupos de
estreptococos son la fuente más económica y confiable para la
producción industrial de ácido hialurónico [3].
En 1928, F. Duran-Reynals encontró cierto compuesto biológicamente activo
en conejos
testículos que conducen a un descubrimiento extremadamente
importante en la química y biología del ácido hialurónico. Cuando se
inyectó el compuesto con tinta china negra por vía subcutánea, los
autores observaron una distribución extremadamente rápida del
color negro a través del tejido conectivo [4]. Se encontraron
propiedades similares para los extractos de semen, sanguijuelas,
picadura de abeja y veneno de serpiente. Otros estudios confirmaron
que el aumento observado de la permeabilidad del tejido conectivo se
debió principalmente a la despolimerización de su sustancia básica, el
ácido hialurónico. Por lo tanto, se determinó que el extracto contiene
una enzima específica que recibió el nombre de "hialuronidasa". El
material biológico que contiene hialuronidasa se denominó
recientemente factor de propagación de Duran-Reynals .
El descubrimiento de enzimas que podrían descomponer
selectivamente el hialuronano abrió la puerta para el establecimiento
de la estructura química de la molécula de polisacárido. En aquellos
días, no se conocía una poderosa herramienta para analizar la
estructura de polisacáridos como la espectroscopia de resonancia
magnética nuclear RMN. En la actualidad, la RMN permite determinar
la composición del residuo del biopolímero monosacárido, los centros
de reacciones de sustitución, la secuencia y la estructura
tridimensional .
En 1943, EA Balazs y L. Piller publicaron un artículo en el que
describían un estudio del papel del hialuronano en las articulaciones
de la rodilla de los perros. Descubrieron que la sustancia intercelular
del tejido conjuntivo de la membrana sinovial contiene suficiente
mucina viscosa que puede reemplazar la mucina extraída de la rodilla
[5]. Estas observaciones literalmente abrieron la puerta a más
estudios sobre el papel del hialuronano en las articulaciones normales
y traumáticas. En 1949, C. Ragan y K. Mayer publicaron un artículo
muy importante en el que describían la observación de hialuronano
en el líquido sinovial reumatoide. Este fue el primer estudio en el que
se compararon los fluidos sinoviales normales y patológicos mediante
la determinación de la concentración y viscosidad de hialuronano [6].
En el corto período entre 1948 y 1951, varios químicos iniciaron
investigaciones para dilucidar la estructura del ácido hialurónico. En
1948 A. Dorfman publicó los primeros resultados de una cinética de
hidrólisis fermentativa de hialuronano [7]. Tres años más tarde, en
1951, AG Ogston y JE Stanier publicaron los primeros datos
significativos sobre la estructura de la macromolécula de HA en
solución acuosa. Descubrieron que la relación entre la viscosidad
La historia del descubrimiento del ácido hialurónico, la investigación fundamental y el uso

inicial 3
y los gradientes de velocidad aumentaron con concentraciones más

altas del polisacárido. [8]. Se encontró que este fenómeno se debe al
entrelazamiento de las moléculas vecinas, no a la asimetría de
macromoléculas individuales. En 1955 se confirmó una configuración
helicoidal irregular de hialuronano midiendo la dispersión de la luz
[9].
En la primera mitad del siglo XX se identificaron varias direcciones
de investigación importantes sobre el ácido hialurónico. Últimamente,
se han convertido en ramas independientes dentro de diferentes
campos de la ciencia, incluida la química de polímeros, radioquímica,
bioquímica, biología molecular, medicina y glicobiología. Este último
término fue aceptado en 1988 para describir una rama de la ciencia
que combina una bioquímica tradicional de los hidrocarburos con
una comprensión moderna del papel de los azúcares complejos en la
biología celular y molecular.
Causando particular curiosidad y asombro científico para los
investigadores fueron las diferentes viscosidades observadas de las
soluciones de hialuronano en presencia de las diferentes sales
inorgánicas. La mayor viscosidad se observó para la solución en agua
destilada. Se propuso que la viscosidad pudiera estar relacionada con
los valores de pH y la fuerza iónica de la solución. Este fenómeno se
ha vuelto de conocimiento común pero fue descrito inicialmente por
R. Fuoss sólo para soluciones de polielectrolitos sintéticos [10].
Se considera que la investigación fundamental sobre las
propiedades físico-químicas de la HA comenzó en 1951 con la
publicación del artículo de EA Balazs [11]. Uno de los primeros
intentos de esterilizar HA mediante luz ultravioleta condujo a una
pérdida completa de la viscosidad de la solución. A. Caputo obtuvo un
resultado similar en 1957 mediante la exposición a rayos X de la
solución de hialuronano [12]. Más tarde, se descubrió que cuando se
expone a radiación gamma o rayos de electrones, incluso a niveles
iniciales bajos de dosis absorbida de radiación ionizante, el HA se
degrada por completo. Los procesos de radiólisis de polisacáridos, que
están asociados con la degradación de polímeros e involucran
radicales libres, ahora se estudian intensamente en la radioquímica
de biomoléculas.
A diferencia de los polisacáridos sulfatados, algunas de las pruebas
iniciales de la capacidad del HA para interactuar con las células vivas
se obtuvieron con la observación de que el hialuronano acelera el
crecimiento celular. También se ha observado que el hialuronano
inicia cierta agregación celular. Esta fue la primera indicación de una
unión única del polisacárido a la superficie celular. Actualmente, se
han aislado varias proteínas receptoras que se unen a la superficie de
la membrana citoplásmica de HA, incluido el receptor de alta afinidad
CD44 y el receptor RHAMM (receptor para la motilidad mediada por
hialuronano).
El receptor de la endocitosis de HA se ha encontrado en la
membrana de las células endoteliales de los senos hepáticos y difiere
fundamentalmente de otras proteínas de unión a hialuronano (ver
[13] y las referencias allí incluidas).
Estos primeros estudios lograron mucho en un corto período de
tiempo, en particular el establecimiento de la estructura y
composición monomérica de la macromolécula. En 1954, Meyer
publicó un artículo en Nature que presentaba el resultado de un
estudio sobre los productos de descomposición de HA [14]. El artículo
incluía la fórmula estructural del disacárido, que es el producto de la
escisión de HA por estreptococo hialuronidasa (Figura 1.1).
1.3 Aplicaciones médicas iniciales

Durante la segunda mitad del siglo XX, se descubrió HA en diferentes tejidos
y líquidos de vértebras animales y humanos. También se encontró que tiene
aplicaciones clínicas, principalmente para cirugía ocular, tratamiento de
enfermedades articulares y medicina estética. El primer uso real

OH
H C
H C
H C OH H C NHAc
HO C HOO
C H O
H C
H C OH
C HC
COOH CH 2 OH
Disacárido bacteriano
Figura 1.1 Estructura del disacárido 4,5-insaturado , obtenido por escisión de HA

por hialuronidasa bacteriana
de HA en la práctica médica no ocurrió hasta 1943 durante la Segunda

Guerra Mundial. NF Gamaleya ( Н.Ф. Гамалея ) creó vendajes
complejos para tratar a los soldados congelados en el hospital de
campaña militar núm. 1321. El componente principal del vendaje era
un
extracto del cordón umbilical, al que llamó un "factor de
regeneración". El método fue posteriormente aprobado por el
Ministerio de Salud de la URSS y el fármaco recibió el nombre de
"Regenerador". Es evidente que HA contribuyó de manera importante
al efecto positivo del tratamiento, dado que el cordón umbilical
humano contiene una cantidad significativa de HA. De hecho, en ese
momento se consideraba que el cordón umbilical era una de las
fuentes industriales más importantes de HA junto con otros
materiales biológicos.
Siguieron varias empresas prácticas que exploraron las aplicaciones
médicas de HA. En la década de 1950, EA Balazs inició experimentos
con HA para investigar su potencial como prótesis para el tratamiento
del desprendimiento de retina. En 1969 se informó que se utilizó HA
para prevenir la soldadura posoperatoria. En 1970, el hialuronano se
inyectó por primera vez en las articulaciones de los caballos de
carreras que padecían artritis y se observó un resultado claro y
positivo. Unos años más tarde, R. Miller comenzó a utilizar HA en
lentes intraoculares implantados [15]. Desde estos casos innovadores,
el hialuronano se ha convertido en uno de los componentes más
importantes en oftalmología (consulte la revisión sobre la aplicación
del hialuronano en oftalmología y las referencias en la misma [16]) y
ha encontrado una aplicación extremadamente amplia en la medicina
estética. Hoy en día, los productos que contienen HA son el "estándar
de oro" para los cosméticos inyectables.
1.4 Fuentes de hialuronano
Debido a sus crecientes aplicaciones, la demanda de hialuronano ha crecido

desde el momento de su descubrimiento hasta ahora. A medida que se
amplían las ramas de la medicina y la cosmetología antes mencionadas, se
está reconsiderando el papel de la HA desde la matriz estructural pasiva del
tejido conectivo hasta la comprensión del papel principal de esa
macromolécula en muchos procesos fisiológicos importantes. Estos procesos
incluyen la comunicación celular, la migración, la diferenciación, la
regulación de procesos en la matriz extracelular y la activación del
metabolismo de la estructura celular.

inicial 5
En la actualidad, se sabe que el HA no es una macromolécula
inactiva de tejido conectivo, sino un biopolímero metabólicamente
muy activo. Su vida media en las articulaciones es de 1 a 30 semanas,
hasta 1 a 2 días en la epidermis y la dermis y solo de 2 a 5 minutos en
el torrente sanguíneo. En otras palabras, durante un día,
aproximadamente 5 g de HA seco pueden sintetizarse y escindirse en
el cuerpo de un hombre adulto de 70 kg , un tercio de la cantidad total
de HA en el cuerpo [17].
La cadena del polisacárido HA sufre degradación por la
endoglucanasa (hialuronidasa) y exoglucanasa (beta-glucouronidasa y
beta-N-acetil hexosaminidasa). Las hialuronidasas testiculares
descomponen polisacáridos con una hidrólisis del enlace glucósido en
tetra, octa y otros sacáridos.
Se señaló que el HA se descubrió por primera vez como un
polisacárido animal, pero poco después se descubrió que el
biopolímero también existe entre las bacterias. En 1937, Kendall,
Heidelberger y Dawson informaron sobre la extracción de un
polisacárido del líquido cultural del estreptococo hemolítico que se
precipitó con ácido acético y etanol [3]. Los autores propusieron que
el biopolímero aislado es idéntico al ácido hialurónico, hipótesis que
luego se confirmó. Finalmente se descubrió que el glicosaminoglicano
de mamíferos existe entre varios grupos de estreptococos, muchos de
los cuales son patógenos para humanos y animales.
El HA se produjo inicialmente por extracción del material animal.
Sin embargo, debido a la creciente demanda de HA, los científicos
comenzaron a buscar nuevos métodos para su producción, métodos
que eran preferiblemente microbiológicos. Un estudio de la síntesis
bacteriana de hialuronano a nivel de células libres se inició cuando se
obtuvieron UDP-glucosa, UDP-N- acetilglucosamina y UDPP- ácido
glucurónico a partir de extractos de estreptococos.
En 1953, Roseman et al. Publicaron un artículo en el que describen
la precipitación de HA del líquido de cultivo (CL) del estreptococo del
grupo A [18]. Informaron el rendimiento de 200 a 300 mg de 4 l de CL.
Más tarde, Warren y Gray encontraron los medios semisintéticos para
el cultivo de los productores de HA [19].
Se ha presentado un número significativo de patentes sobre la
producción y aplicación clínica de HA. La producción de HA mediante
el cultivo de la cepa única Streptococcus equi se describió en más de
20 patentes de 1985 a 2002. Sin embargo, a pesar de estos esfuerzos,
persiste el problema de que el suministro de HA no satisface la
demanda mundial. El precio del HA de grado farmacéutico altamente
purificado se ha reducido drásticamente durante los últimos años,
pero el precio mínimo actual todavía se encuentra en el nivel de $ 10
000 / kg. En comparación, el precio del xantano polisacárido
producido a partir de Xanthomonas campestris es de $ 11 / kg. Las
enzimas responsables del metabolismo del hialuronano se han
estudiado desde 1959, cuando se describió por primera vez la
hialuronato sintasa (HAS) de Streptococcus pyogenes [20]. Muchos
investigadores trataron de identificar, solubilizar y aislar una enzima
activa pura que podría sintetizar HA tanto en estreptococos como en
células eucariotas o clonar el gen HAS en E. coli. Desafortunadamente,
después de varias décadas de perseverancia, sus esfuerzos no
tuvieron éxito.
En 1993, un grupo de científicos estadounidenses informó sobre el
aislamiento de HAS, su operón y la clonación del gen hialuronato sintasa en
E. coli [21]. Recientemente se descubrió que sus hallazgos eran un error
científico. Van de Rijn y Drake aislaron tres proteínas de membrana de
estreptococos con masas moleculares de 42, 33 y 27 kDa y propusieron que la
proteína con masa de 33 kDa es de hecho hialuronato sintasa [22]. Mediante
la electroforesis, otros estudios han encontrado que la hialuronato sintasa de
Streptococcus tiene una masa molecular de 42 kDa, lo que demuestra que
esta conclusión es incorrecta.
Poco después, se produjo un gran avance en un estudio del mecanismo de
síntesis y regulación de HA. Casi simultáneamente, DeAngelis y sus
colaboradores informaron que el operón del
La síntesis de HA se encontró, aisló, caracterizó y clonó [23]. Fue la

primera hialuronato sintasa clonada con éxito cuya expresión se
confirmó mediante la síntesis de HA en un microorganismo que antes
no sintetizaba tal polisacárido.
1.5 Estudio médico actual y uso
En la actualidad el hialuronano es objeto de estudio en bioquímica,

biofísica molecular, bioorgánica y radioquímica y química de
compuestos poliméricos. Los estudios médicos de HA incluyen su
papel en la fecundación, la embriogénesis, el desarrollo de la
respuesta inmune, la curación de heridas, enfermedades oncológicas
e infecciosas, procesos de envejecimiento y los problemas de la
medicina estética.
La amplia gama de aplicaciones médicas prácticas del hialuronano
sigue basándose en sus efectos antiinflamatorios, desinfectantes y
cicatrizantes. HA promueve la regeneración epitelial; previene la
formación de tejido de granulación, adherencias y cicatrices; reduce
la hinchazón y la picazón; normaliza la circulación sanguínea;
promueve la cicatrización de las úlceras venosas y protege el tejido
ocular interno [24].
El hialuronano se usa ampliamente en bioquímica aplicada y
enzimología como sustrato para la determinación cuantitativa de la
enzima hialuronidasa. Las disputas científicas sobre la posible
relación entre HA y hialuronato liasa y la patogenicidad de algunos
estreptococos deben, al parecer, llevarse a cabo de forma permanente.
Actualmente, se presta mucha atención al estudio de las estructuras
secundarias y terciarias y la conformación dinámica de HA en
soluciones acuosas y fluidos biológicos; la interacción de HA con
proteínas, particularmente receptor CD44 y otras hialadherinas; y la
escisión biocatalítica de HA con diferentes hialuronidasas; la
progresión hacia la creación de cepas recombinantes y productos de
quimera con las propiedades deseadas.
La investigación teórica sobre la biosíntesis de polisacáridos con
enzimas tanto bacterianas como de mamíferos se centró inicialmente
en comprender los mecanismos de reacción, pero recientemente se ha
centrado la atención en resolver los problemas de aplicación, incluida
la creación de cepas recombinantes y organismos quimeras que
podrían producir HA. con las propiedades inicialmente requeridas.
En los últimos años, un área muy prometedora de la medicina y la
farmacología ha ganado una atención significativa: la administración
dirigida de medicamentos a órganos o tejidos específicos. El desarrollo de la
nanotecnología ha llevado estos estudios a un nuevo nivel porque los
'nanocontenedores' tienen un gran potencial para dirigir compuestos
biológicamente activos a células específicas del cuerpo. Los liposomas,
partículas poliméricas y lipídicas con un diámetro de 100 a 300 nm, o
nanocápsulas del mismo tamaño, se utilizan normalmente como
nanocontenedores. El hialuronano podría usarse como un enfoque
alternativo en la creación de un contenedor macromolecular. Las
macromoléculas de HA podrían unirse a los receptores en las membranas
citoplasmáticas de varias células para administrar compuestos
biológicamente activos unidos al portador de biopolímero.
Utilizando la tecnología de modificación en estado sólido de
polisacáridos que incluía la acción mutua de deformación por
cizallamiento y presión súper alta , un grupo de científicos rusos ha
producido una serie de productos únicos que contienen ácido
hialurónico. Los nuevos productos podrían considerarse terapias
macromoleculares libres de fármacos (o no fármacos) . Estas áreas de
investigación han hecho posible una amplia gama de nuevos
productos basados en el hialuronano modificado y podrían utilizarse
en los diversos campos de la medicina.

inicial 7
1.6 Impacto y direcciones futuras
Han pasado setenta y cinco años desde que se descubrió el ácido

hialurónico. En el mundo de la investigación científica, en este punto
después del descubrimiento de una sustancia, la investigación
generalmente se limita a un grupo bastante reducido y especializado
de académicos. Sin embargo, el interés por este compuesto está lejos
de disminuir; en realidad está creciendo. Las publicaciones dedicadas
a la estructura, síntesis, degradación, el papel biológico de la HA y su
aplicación en diversos campos de la química, la medicina y la biología
están en constante aumento. Entre 1966 y 1975 se han publicado 790
artículos; entre 1976 y 1985 el número llegó a 2200, entre 1986 y 1996 -
3300, entre 1996 y 2006 - más de 7000. Recientemente se han
publicado dos monografías fundamentales [25, 26] y una revisión [27].
Es importante mencionar la monografía fundamental más reciente: la
serie de cinco volúmenes bajo el título Hyaluronan: From Basic Science to
Clinical Application de Balazs et al. [28]. La monografía cubre muchos
aspectos de la ciencia y la aplicación del ácido hialurónico, pero lo que hace
que este libro sea especial es la descripción general completa de la historia
temprana, seguida de los capítulos que describen las contribuciones de los
científicos más destacados a la química y la biología del ácido hialurónico.
Las patentes de HA también están en aumento: entre 1979 y 1987, la
oficina de patentes de EE. UU. Emitió cinco patentes de HA por año. En
1988 la cantidad alcanzó un número 35. El mismo nivel fue hasta
1995. En 1996 se observó un fuerte aumento de las patentes
relacionadas con HA, y la cantidad de nuevas patentes sigue
aumentando cada año. En febrero de 2013, el número de patentes
relacionadas con las palabras clave 'ácido hilaurónico' ascendía a casi
80000.
A principios de la década de 1980, era obvio que el ácido hialurónico atraía
la atención de científicos de química, biología, física, medicina, etc. de todo el
mundo. Se hizo necesario reunirse para discutir los últimos resultados y
perspectivas. El primer encuentro internacional dedicado a HA tuvo lugar en
1985 en Saint-Tropez (Francia). Posteriormente, las conferencias se llevaron
a cabo en Londres (Reino Unido) (1988), Estocolmo (Suecia) (1996), Padua
(Italia) (1999), Gales (Reino Unido) (2000), Cleveland (EE. UU.) (2003),
Charleston (EE. UU.) ) (2007) y Kyoto, Japón (2010). En octubre de 2004 se
creó la Sociedad Internacional de Ciencias Hialuronanas (ISHAS,
www.ishas.org) . Inicialmente, reunió a científicos de 16 países.
En junio de 2013, la ciudad de Oklahoma (EE. UU.) Fue la sede de la
última Conferencia Internacional de Ácido Hialurónico. Reunió a más
de 200 científicos de 22 países. Desde entonces se han llevado a cabo
conferencias similares cada dos años, la próxima será en Florencia
(Italia) en 2015.
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2
El papel biológico
de ácido hialurónico
Muchas características del hialuronano son maravillosos inventos de la
evolución. Esta definición evolutiva podría atribuirse obviamente a otros
biopolímeros como proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos. De hecho, el
potencial evolutivo, relacionado principalmente con los biopolímeros,
depende en gran medida de la naturaleza físico-química molecular [1]. La
HA se considera una de las formas evolutivas más tempranas de la familia de
los polisacáridos. Entonces, veamos el papel biológico del hialuronano en
comparación con las evoluciones moleculares de otros biopolímeros.
2.1 Filogénesis del ácido hialurónico
Desde un punto de vista evolutivo, HA se considera un polisacárido

bastante conservador ya que su estructura química es completamente
idéntica para todas las especies conocidas en los diferentes niveles de
la escalera evolutiva. Tal conservadurismo químicamente evolutivo
indica la importancia de sus funciones biológicas. Una comparación
entre las estructuras de los diferentes polisacáridos 'ubicados' en las
diferentes ramas del 'árbol evolutivo' lleva a varias conclusiones
interesantes [2]:
●● Los alfa-d-glucanos (glucógeno, amilosa y amilopectina) suelen ser
fuentes de respaldo intercelulares de energía y componentes básicos
de las células. Al mismo tiempo, los beta-d-glucanos están
relacionados con polisacáridos estructurales intracelulares.
●● Los homoglucanos y heteroglucanos de las diferentes familias de la
naturaleza viva se caracterizan por el estereoisomerismo de los
monómeros y las características de la naturaleza de los enlaces
entre ellos.
●● Cantidades considerables de hialuronano, condroitín sulfato y
otros glicosaminoglicanos (Figura 2.1.) Se encuentran solo en
animales Chordata.

Glucosaminoglycan Mol. peso Unidad de disacárido - [AB] - Comentarios

COO - CH OH
2
O O Polisacárido
H
H H H
O no sulfatado, no unido a proteínas que se
OH
Ácido hialurónico4000 - 8 × 10 6 HH O HO H H encuentra en líquido

sinovial y del globo ocular,
H OH H NHCOCH 3
cuerpo vítreo, cartílago
Ácido glucurónico N-acetilglucosamina
COO - - O S CH OH
3 2
O
O
H O H
H O Polisacárido sulfatado
Condroitín sulfato 5000 - 50000 OH H

unido a proteínas que se
HOH HH
encuentra en cartílago,
H OH H
NHCOCH 3 córnea, huesos, piel y
Ácido glucurónico arterias.
N-acetilglucosamina
-4- (o 6) -sulfato
H -O S
3 CH OH
2
H -OH O
Dermatan sulfato 15000 - 40000 COO O H OPolisacárido sulfatado
OH H H H H unido a proteínas que se

O encuentra en la piel, los
H OH H NHCOC vasos sanguíneos, el

Ácido idurónico N-acetilglucosamcorazón y la válvula
-4-sulfato
cardíaca.
- CH OSO -
COO 2 3
Sulfato de heparán 5000 - 12000

O O
H
H H H
O
O
OH H
OH HH H Polisacárido sulfatado

H OSO 3 -
H

NHCOC unido a proteínas que se
Glucironato N-acetilglucosamencuentra en los

-2-sulfato -4-sulfato
pulmones, las arterias, la
H CH OSO - lámina de bazal y las

Heparina 6000 - 25000 2 3
H ARRULLO - O H membranas celulares.
H O O
O
OH OH H
HH H

H OSO 3 -
H

NHS
Iduronar N-sulfo-glucosam

-2-sulfato -6-sulfato Polisacárido sulfatado

unido a proteínas que se
CH 2 OH CH OSO

2 3encuentra en los
Sulfato de queratán4000-19000

O

O

H H Opulmones, el hígado, la
HH
OH O H piel y las células
HH OH
H corpulentas.

H OH H NHCOC

Galactosa N-acetilglucosamina
-6-sulfato
Polisacárido sulfatado,
unido a proteínas ,
que se encuentra en
cartílago, córnea, disco
intervertebral
Figura 2.1 Estructura de los principales glicosaminoglicanos
En el sistema moderno del mundo orgánico, los principales grupos

de organismos vivos se diferencian por el modo de nutrición, que está
determinado principalmente por polisacáridos y se encuentra en las
paredes celulares externas. Por lo tanto, la pared celular de celulosa
permite que el sistema vivo consuma solo agua, compuestos
inorgánicos y gases. Estas células adquirieron la capacidad de
fotosíntesis de los compuestos orgánicos, es decir, de tipo de nutrición
autónoma, que es un factor clave en la evolución del reino vegetal.
Otras células en el proceso de evolución adquirieron la pared celular
hecha del polisacárido quitina, que proporciona la capacidad de
El papel biológico del ácido hialurónico 11
consumir los compuestos orgánicos de alto peso molecular. Estos

organismos son capaces de utilizar la nutrición de materiales
orgánicos descompuestos (nutrición saprofítica) y dar origen al reino
de los hongos [3]. La quitina se ve ampliamente en la rama de los
animales invertebrados, mientras que el HA y los
glucosaminoglicanos relacionados se encuentran en la rama de los
animales Chordata. Sin embargo, el papel evolutivo de HA y otros
glicosaminoglicanos aún no está del todo claro.
Aparentemente, muchas características de los sistemas biológicos
podrían ser comprensibles en base a las propiedades de los
componentes polisacáridos macromoleculares y su bioquímica
relativa. Basándonos en las conocidas propiedades fisicoquímicas de
la HA podemos intentar comprender su papel en la evolución
biológica de la especie. O, en otras palabras, trataremos de determinar
cuándo y cómo llegó HA al 'árbol de la vida' y qué cosas nuevas ha
introducido en el proceso de evolución de acuerdo con sus
propiedades físico-químicas y fisiológicas.
En 1924, basándose en las propiedades, los procesos y las reglas del
compuesto en la química orgánica, física y biológica conocidas en ese
momento, AI Oparin formuló un entendimiento sobre la
autoorganización de las estructuras moleculares que podrían haber
llevado a la llegada de la vida a la Tierra [ 4-11]. El problema del
origen de las macromoléculas y su evolución molecular estuvo sujeto
a un impulso de desarrollo activo después de 1953, cuando S. Miller,
H. Uri y más tarde, otros científicos (TE Pavlovskaya y AG Pasynsky,
1957), confirmaron experimentalmente la posibilidad de síntesis de
monómeros biológicos (aminoácidos, ácidos orgánicos y otros
compuestos orgánicos) a partir de los gases de la supuesta atmósfera
primaria de la Tierra (H 2 , CH 4 , NH 3 y vapor de H 2 O) bajo cargas
eléctricas. Se encontró que la polimerización de los aminoácidos y la
formación de las proteínas podían ocurrir con bastante facilidad en
condiciones no biogénicas.
condiciones a alta temperatura [12,13]. Debido a la fácil
polimerización de los aminoácidos, la evolución molecular en las
primeras etapas podría desarrollarse en ausencia de ácidos nucleicos
que requieran un sistema más complicado para la biosíntesis y
polimerización de precursores. Ésta es la razón por la que se formuló
la hipótesis de la "proteína primero" [14] en contraposición a la
hipótesis del "gen primero" [15]. Para descartar una discusión sobre el
"huevo y la gallina", nos gustaría señalar un hecho evidente. En el
proceso de evolución molecular, se encontró que la matriz
no biogénica menos síntesis de proteínas fue reemplazada por síntesis
de matriz biogénica bajo el control de los codones de ácidos nucleicos
(genes). En este punto comienza a formarse el "árbol genealógico" de
la molécula de proteína [16].
Un estudio de la secuencia de aminoácidos de las mismas proteínas
aisladas de los animales, que ocupan diferentes niveles de la escalera
evolutiva, permitió determinar la tasa de evolución de las proteínas y
sus genes. La evolución de algunas proteínas, como la globina
(hemoglobina), el citocromo C y el fibrinopéptido es uno de los
mejores ejemplos para esta tarea [17,18]. La evolución de las proteínas
en estos sistemas de vida se lleva a cabo paso a paso y está
relacionada con los cambios de las bases purínicas y pirimidínicas en
los ácidos nucleicos, es decir, las mutaciones en el ADN.
Contrariamente a la síntesis no biogénica , la síntesis de la matriz
biogénica de las proteínas se volvió estereoespecífica, lo que significa
que las proteínas se sintetizan solo a partir de aminoácidos de
formas L. Debido a la configuración L de los aminoácidos, las cadenas
laterales de la estructura proteica crean un entorno en el que el
impedimento estérico es mínimo [18]. La propiedad de este polímero
proteico es importante porque la actividad biológica y las funciones
de las proteínas están relacionadas principalmente por la
configuración tridimensional de la cadena del polímero. Esta
configuración es el resultado de la secuencia de aminoácidos y la
orientación en las estructuras primarias, secundarias y terciarias de
las proteínas. Todas las proteínas y ácidos nucleicos son lineales.
12 Ácido Hialurónico
polímeros e incluyen el conjunto estándar de monómeros: 20

aminoácidos y cinco nucleótidos conectados con el péptido estándar y
los enlaces fosforoéster correspondientemente. Los polisacáridos, por
otro lado, pueden formarse a partir de un solo residuo de
carbohidrato (homopolisacáridos) o de varios residuos diferentes
(heteropolisacáridos).
Tanto las proteínas como los ácidos nucleicos son representativos de la
"unidad biológica" de un sistema vivo. Los polisacáridos reflejan en gran
medida su "diversidad" [18]. Así, los polisacáridos extracelulares celulosa y
pectina están bien representados en el reino de las plantas; quitina en la
rama de los animales invertebrados y hialuronano en la rama de las especies
Chordata. La síntesis de polisacáridos en condiciones no biogénicas es más
difícil que la síntesis de proteínas y ácidos nucleicos, por lo que es muy
posible la aparición del gen de la hialuronano sintasa, seguida de la
aparición de hialuronano. Esta secuencia de eventos significa que este
polisacárido se originó en la evolución por vía biogénica como resultado de
la formación del gen (genes) correspondiente de la hialuronano sintasa, la
enzima responsable de la síntesis de hialuronano. La evidencia indirecta de
tal hipótesis podría proporcionarse mediante experimentos que modelen las
reacciones no biogénicas de la polimerización de la glucosa. Por lo tanto, la
irradiación gamma de las soluciones acuosas de glucosa dio como resultado
polímeros que contienen muchas reticulaciones no típicas , pero el
monómero de carbohidrato inicial se descompone debido a la acción de
radicales OH y electrones solvatados que se originaron como resultado de la
radiólisis. de la solución acuosa de glucosa (ver sección 4.3). Como resultado,
los polisacáridos contienen grupos carbonilo y gamma-lactonas. Esta
característica polimérica del producto se mantiene incluso después de la
hidrólisis ácida y la oxidación con peryodato [19]. Se podría llevar a cabo
una polimerización similar de polisacárido en las soluciones acuosas bajo
irradiación UV [20]. Sin embargo, en los polisacáridos de origen biológico, los
monómeros no suelen estar conectados entre ellos con enlaces éster o
puentes CC , sino que tienen enlaces glicosídicos. De manera similar a otros
modelos de reacciones de condensaciones no biogénicas (aminoácidos y
nucleótidos), los polímeros, que se basan en los monosaccharaides, se
forman mejor en las reacciones térmicas. En hexosa (particularmente en
glucosa), el hidroxilo primario en C 6 tiene mayor reactividad que los grupos
hidroxilo secundarios en C 2 , C 3 y C 5 . Debido a que la reactividad del
hidroxilo glicosídico en C 1 excede a todos los demás hidroxilos, la energía de
activación del segundo, tercer y quinto hidroxilo no puede alcanzarse a las
temperaturas de reacción de 141-143 ° C. Entonces, en el polímero formado,
los enlaces 1,6-glicosídicos son predominantes [21]. A temperaturas más
altas, se forma una cantidad considerable de geles insolubles y se produce
una cantidad significativa de reticulación de éter. La hidrólisis de tales
polisacáridos conduce a la formación de glucosa, como evidencia de la
ausencia de entrecruzamiento de tipo CC . Aproximadamente a 155 ° C, no se
forman los enlaces cruzados de la naturaleza del éter [21]. El resultado de la
oxidación con peryodato de los polímeros polisacáridos está de acuerdo con
la regla general según la cual el tipo y la frecuencia del tipo específico de
enlace en el polímero se determina por la reactividad del hidroxilo específico
a la temperatura de reacción específica [18]. . Con base en esa regla, se
podría suponer que los precursores evolutivos del glucagón y el almidón
(alfa-d-glucanos) se originaron por vía no biogénica como resultado de las
reacciones térmicas y se incluyeron en los objetos biológicos primarios. El
hidroxilo secundario en C 3 tiene la reactividad más baja (la energía de
activación más alta) y, por lo tanto, la síntesis de hialuronano con
enlaces beta-1-3, incluso en condiciones no biogénicas , es difícil. Por eso es
posible suponer que HA llegó más tarde que otros biopolímeros en la
'escalera de la evolución molecular': probablemente cuando el gen capaz de
crear un enlace beta-1-3 entre el ácido d-glucurónico y el N-acetil-d- Aparece
glucosamina .
2.1.1 Estructura de polisacárido y problemas de filogénesis

Para comprender el lugar y el momento de la aparición del
hialuronano en la filogenia (el desarrollo histórico de la vida),
debemos señalar sus principales hitos. Se supone que las primeras
células vivas aparecieron en la Tierra hace aproximadamente 3.500
millones de años.
[22]. Una era en la que coexistían "vida" y "proto-vida" llegó a su fin
hace aproximadamente 1.800 millones de años [23]. Aparecieron los
organismos capaces de realizar la fotosíntesis y el contenido de
oxígeno biogénico en la atmósfera alcanzó el "punto Pasteur" (0,01 del
nivel actual), lo que significa que el "lingote primario" se había
agotado para siempre. Los compuestos orgánicos no sintetizados
biogénicamente se gastaron debido a organismos heterótrofos y
oxidación por el oxígeno atmosférico. Al mismo tiempo, entraron en
acción las reglas de la unión simbiótica del material genético de los
simbiontes, aumentando la confiabilidad y supervivencia de las
nuevas células que unían a los socios en la simbiosis. Como resultado,
hace aproximadamente 1.400 millones de años aparecieron células
eucariotas. Se encuentran en los rastros fósiles de las rocas del
Precámbrico tardío [24].
Obviamente, las grandes lagunas en nuestra comprensión de la filogénesis
solo se pueden llenar con un razonamiento sin fundamento. Sin embargo, los
rastros fósiles y los estudios bioquímicos comparativos de moléculas y
organismos en diferentes niveles de 'escaleras de evolución' proporcionan
información suficiente para apoyar una hipótesis sobre las principales
etapas y mecanismos del desarrollo evolutivo de los sistemas vivos. En forma
condensada, estas etapas se presentan en una tabla biogeocronológica (Tabla
2.1). Siguiente,
Cuadro 2.1 Biogeocronología y evolución de animales cordados

Era Período Comenzando, Duración, Tiempo de cordados animales

millones de millones de apariencia

hace años que años

Cenozoico Cuaternario 70
Evolución del ser humano
Neógeno siendo
Divergencia de mamíferos
mesozoico Cretáceo 135 sesenta y cinco Mamíferos placentarios
jurásico 180 45 Aves
Triásico 225 45 Mamíferos no placentarios
Paleozoico Pérmico 270 45
Carbonífero 350 80 Reptiles
devoniano 400 50 Anfibios
siluriano 440 40 Peces huesudos
Peces cartilaginosos
Ordovícico 500 60 Cyclostomatousoka
cordados
cambriano 600 100 Cordados sin mandíbula.
Proterozoico Apariencia de
célula eucariota
aproximadamente 1.4 mil millones
hace años que
Arcaico Aparición de la primera
células procariotas
aproximadamente 3,5 mil millones
hace años que

necesitamos determinar el tiempo aproximado de aparición del gen

de la hialuronano sintasa, que es la enzima responsable de la síntesis
de HA.
El desarrollo evolutivo y la aparición de una variedad de especies
tuvo lugar como resultado de las reglas genéticas de la evolución. La
evolución de los genomas fue en una dirección en la que se
incrementó la cantidad de información genética, es decir, un aumento
del contenido de ADN. Por lo tanto, el micloplasma, la célula
bacteriana más simple sin una capa externa de polisacárido, tiene
solo 0.5 × 10 6 pares de nucleótidos en su ADN y puede codificar
alrededor de 470 proteínas generales. Las bacterias con capas de
células polisacáridas (mureína) tienen 3 × 10 6 pares de bases
nucleicas en su ADN. Las células eucariotas monocelulares, como la
levadura, incluyen aproximadamente 15 × 10 6 pares de la base
nucleica.
Un organismo multicelular requiere hasta 80 × 10 6 pares de bases
nucleicas para existir. En las células de los peces, el material genético
contiene aproximadamente 300 × 10 6 pares de bases nucleicas,
mientras que en una célula de mamífero hay aproximadamente 3000
× 10 6 pares. El genoma humano contiene 3164 × 10 6 pares de
nucleótidos con un número de genes de 20 000 a 27 000 (según los
resultados del programa "Genoma humano"). Así, durante la
evolución, la cantidad de material genético y nuevos genes
responsables de la síntesis de nuevos biopolímeros aumentó de
manera constante. En el proceso de evolución molecular, las
estructuras de biopolímeros recién llegados "buscan" sus funciones.
Como es sabido, la selección natural ocurre a nivel funcional [25]. Los
diferentes polisacáridos extracelulares probablemente jugaron un
papel importante en la divergencia de las especies.
Una revisión de 1969 sobre la geoquímica de los hidrocarburos
fósiles contiene información que determina que se encontró quitina
en los residuos de invertebrados marinos [26]. Uno de los productos
de la degradación del HA, la glucosamina, se encontró en los enlaces
de los peces fósiles [27]. La gran cantidad de materiales bioquímicos
fósiles podría encontrarse en el Cámbrico.
sedimentos (hace unos 500–570 millones de años), así como en capas
más recientes [12,18,28]. Las primeras criaturas cartilaginosas como
cyclostomata y cordados craneales, que contenían cantidades
considerables de hialuronano en sus tejidos, aparecieron hace unos
500 millones de años en el período Ordovícico temprano [16,18,29,30]
(Tabla 2.1) y florecieron dur - ing los períodos Silúrico y Ordovícico.
En ese período de tiempo se observa una explosión evolutiva en el
número de animales marinos. Los animales evolutivamente más
viejos, como los coelenteratos, los gusanos, los moluscos y los
artrópodos, no contienen hialuronano en cantidades considerables.
Así, existe un límite bastante claro que permite supuestamente
determinar el momento de la aparición del gen de la hialuronano
sintasa. Precedió o coincidió con la aparición de criaturas
cartilaginosas primitivas, que podrían remontarse al comienzo del
período Cámbrico de la era Paleozoica. Por lo tanto, se puede suponer
que el gen o genes de la hialuronan sintasa y el propio HA
aparecieron en el período precámbrico o en el cámbrico temprano
hace unos 570 millones de años. Desde ese momento, la tasa de
evolución aumentó significativamente, lo que resultó en una
explosión evolutiva en la rama de los animales cartilaginosos
conocida como 'Explosión Cámbrica'. Otra corriente de indicaciones
de que el gen de la hialuronano sintasa apareció por primera vez
durante el período de la filogénesis reside en la ley de la biogénesis.
Al comparar embriones de diferentes clases y grupos de cordados,
K. von Baer postuló una ley de similitud embrionaria, que establece
que los embriones del mismo filo de animales son muy similares en
las etapas iniciales del desarrollo. Más tarde (en 1866), sobre la base
de estos y otros datos, E. Haeckel formuló una ley básica de biogénesis
que establece que la ontogénesis es una breve repetición de la
filogénesis. Etapas tempranas de animales y humanos
El desarrollo embrionario conserva algunos rasgos característicos de

las especies primitivas de cordados. Esto sucede porque uno de los
principales mecanismos de integración de las primeras etapas del
desarrollo son los mecanismos de inducción embrionaria según los
cuales las estructuras embrionarias, como el cordón, el tubo nervioso
y los somitas, representan centros de organización que determinan
una mayor ontogénesis. Así, el cordón, por ejemplo, induce el
desarrollo del tubo nervioso y la columna vertebral del embrión [3].
Según el conocimiento actual, la base de tales interrelaciones es un
control genético del desarrollo por parte de los genes generales de
regulación de la ontogénesis heredados de ancestros comunes. El gen
que codifica la hialuronano sintasa y es responsable de la síntesis de
HA es probablemente uno de esos genes, ya que se sabe que HA
participa en la formación del proteoglicano principal del cordón. La
síntesis de HA en sí misma requiere la disponibilidad de derivados de
nucleótidos de precursores de azúcar, como las uredinas fosfohexosas
( UDP- ácido glucurónico y UDP-N- acetilglucosamina), que podrían
verse en las vías metabólicas de la glucosa (Figura 2.2).
Glucosa

HK

Arkansas NADP +

Glucosa-6-P NADPH

NADP + NADPH
Sorbitol

G6PDH 6-fosfogluconolactona

NAD + SDH

NADP +
PFK Fructosa-6-P
NADH

NADPH
GFPT
Fructosa Fructosa-1: 6-BiP 6-fosfogluconato

Glc-6-P

Gliceraldehído-3-P TK Ribulosa-5-P

N -AcetilGlc-6-P

1 3-bis-fosfoglicerato Xilulosa-5-P + Ribosa-5-P

N -AcetilGlc-1-P TK

3-fosfoglicerato Gliceraldehído-3-P +
Sedoheptulosa-7-P
UPD- N -AcetilGlc

HAS2 OGT
2-fosfoglicerato

Eritrosa-4-P +
Hialurónico O- ligado Fructosa-6-P
ácido glicosilación
Fosfoenolpiruvato

TK

Gliceraldehído-3-P +
Piruvato Fructosa-6-P

Lactato
Figura 2.2 Biosíntesis de HA, sus precursores de azúcar y otros glicosaminoglicanos a

partir de glucosa [31]. Enzimas limitantes o importantes: AR - aldosa reductasa; ECM - matriz
extracelular; G6PDH - glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; GFPT - glucosamina: fructosa acetil
transferasa; HAS2 - hialuronano sintasa-2; HK - hexoquinasa; OGT - transferasa de
glicosilación unida a O ; PFK - fosfofructoquinasa; SDH - sorbitol deshidrogenasa
También es posible que el gen que codifica la hialuronano sintasa se

haya formado mucho antes, pero su expresión se inhibió o bloqueó
por completo. Se puede suponer que la síntesis activa in vivo de HA y
glicosaminoglicanos relacionados contribuyó significativamente a
nuevas direcciones y aceleración de los procesos de evolución. La
evolución se dirigió además a conducir a un aumento en el tamaño y
la forma de las especies de cordados y también a su transición a la
tierra. Sin HA, que retiene grandes cantidades de agua en la piel,
trasladarse a la tierra sería problemático. La rama de invertebrados
que tienen esqueletos de quitina incluye una gran variedad de
especies (aproximadamente 2 millones de artrópodos) pero está
limitada en la reproducción celular y el tamaño del organismo. Al
mismo tiempo, la rama de cordados con esqueleto cartilaginoso o óseo
y tejidos conectivos que contienen una cantidad significativa de HA,
tuvieron éxito en aumentar la multicelularidad, el tamaño del
organismo, la organización
complejidad, así como la interacción entre células, tejidos, órganos y
sistemas de órganos. Por tanto, parece que la variedad de células y
tejidos de un vertebrado ricos en HA y glicosaminoglicanos
relacionados contribuyeron a la aceleración del proceso evolutivo y la
complejidad de la reproducción y el crecimiento. Los animales
invertebrados se caracterizan en parte por limitaciones en el
crecimiento y el número de células (gusanos, artrópodos). Las
limitaciones están directamente asociadas con los exoesqueletos
basados en quitina. En la rama de los animales cordados, la quitina no
está presente y las relaciones intercelulares están mediadas en gran
medida por hialuronano y otros polisacáridos relacionados.
Sin embargo, a la luz de lo antes mencionado, las raras excepciones
de HA en bacterias, protozoos, moluscos y plantas, como se informa
en la literatura, requieren cierta explicación. La capacidad de los
animales y plantas más antiguos para sintetizar HA se debe a la
presencia del gen que codifica la hialuronano sintasa. Al examinar
esta conexión, uno debería revisar los mecanismos genéticos de los
nuevos genes y la formación del genoma.
Actualmente, se conocen diversos mecanismos de la evolución
estructural del genoma eucariota. La poliploidía está en este rango. Sin
embargo, su contribución probablemente no sea importante, ya que
por este mecanismo uno esperaría ver un aumento revolucionario
como un salto en el volumen de material genético. En realidad, hubo
una acumulación evolutiva fluida de material de ADN desde especies
menos organizadas hasta especies altamente organizadas en el árbol
de la evolución. Se cree que se produjo un aumento en la cantidad de
ADN en las células eucariotas a través de la amplificación, por ejemplo,
la formación de ciertas copias de ADN y la divergencia en las
secuencias de nucleótidos debido a la acumulación de mutaciones en
nuevos genes. Según las estimaciones obtenidas en los estudios de
evolución, una mutación útil en un gen de tamaño medio se produce
una vez cada 200 000 años. Uno de los ejemplos notables es la proteína
hemoglobina. Se ha demostrado que hace unos 500 millones de años,
durante la evolución de los peces superiores, ciertas mutaciones
dieron lugar a la duplicación del gen de la hemoglobina [16,17]. Se
sabe que fenómenos similares son responsables de la aparición del gen
del colágeno [17], una proteína que funciona en la matriz extracelular
en asociación con el hialuronano. Posiblemente, los genes que
codifican la hialuronano sintasa evolucionaron de la misma manera. El
informe [32] proporciona un análisis comparativo de las secuencias de
nucleótidos en la familia de genes y secuencias de aminoácidos en las
hialuronanas sintasas HAS 1 , HAS 2 y HAS 3 de anfibios, aves y
mamíferos (por ejemplo, especies cuya aparición se remonta a
diferentes períodos de historia). Los autores llegaron a la conclusión
de que la síntesis de HA en vertebrados está regulada por un grupo
relativamente antiguo de genes que apareció a través de la duplicación
y divergencia de un gen parental aún más antiguo [32]. Tres genes de
hialuronano sintasa están localizados en diferentes cromosomas, lo
que respalda la teoría de que aparecen a través de la duplicación del
gen antiguo.
Los eventos de recombinación juegan un papel importante en la

formación y evolución de nuevos genes. Otros mecanismos, como la
duplicación, la transposición, la transcripción inversa, la
incorporación de materiales genéticos lábiles en el ADN animal y la
duplicación en tándem, se comportan todos en la misma dirección
evolutiva [33]. Como resultado de los diferentes mecanismos, un
nuevo gen complejo está disponible a partir de genes simples. Un
ejemplo de alargamiento de genes a través de la duplicación en
tándem es el gen responsable de la síntesis de colágeno [34]. Tales
procesos en la evolución del genoma han llevado a la divergencia de
genes, la multiplicación de familias de genes y la variedad de
estructuras de proteínas que regulan. Los cambios en la estructura de
los genomas se transfieren de una generación a otra o, en otras
palabras, de forma vertical. Sin embargo, hoy sabemos que la
transferencia lateral de genes existe entre organismos a través de los
mecanismos de conjugación, transformación y transducción. Los
papeles principales en la transferencia lateral de información
genética pertenecen a virus y fagos. Pueden transferir ADN extraño en
varias células eucariotas donde se puede almacenar como un
elemento extracromosal o parte integral expresable de un gen. La
posibilidad de transferencia lateral de material genético puede servir
como explicación para la presencia de genes que codifican la síntesis
de HA en los animales que ocupan niveles más bajos en las escaleras
de evolución en comparación con las especies de cordados que se
supone que forman el primer gen de la hialuronan sintasa. . Los casos
únicos de existencia de HA se describen en la literatura para
invertebrados como el molusco mytilus galloprovincialis [35] y
relacionados con la clorella.
solo células beta algas verdes [36]. Para la última especie, la
transferencia lateral del gen de la hialuronano sintasa a una célula
eucariota de algas verdes se confirmó experimentalmente usando un
virus. Después de 30 minutos de infectar la célula con el virus PBCV-1,
las algas comienzan a sintetizar HA idéntico al de los animales
vertebrados. El gen de la hialuronano sintasa viral comparte un
28-30% de homología con el gen de hialuronano sintasa de los
vertebrados [37]. Este es un claro ejemplo de transferencia lateral de
genes entre células eucariotas. Es mucho más difícil explicar la
presencia del gen de la hialuronano sintasa en las células procariotas
que producen HA extracelular homóloga a la de los animales
vertebrados. Esta capacidad es conocida para las bacterias
estreptococos gram-positivas (grupos A y C) [38] y las
bacterias gram-negativas Pasteurella multocida [39].
Estos ejemplos deberían revisarse a través del prisma del
parasitismo. Los microorganismos capaces de sintetizar HA en general
son patógenos de animales y humanos. Resulta obvio que al adquirir
el gen de la hialuronano sintasa, estas bacterias obtuvieron la
capacidad de cruzar la inmunidad celular y humoral del organismo
huésped. De hecho, una vez que la enzima hialuronidasa elimina la
cápsula de hialuronano de las células de la bacteria Streptococci , el
potencial patógeno de las células bacterianas se reduce 10 000 veces
[40], lo que sugiere un reconocimiento y eliminación efectivos del
patógeno por el sistema inmunológico del huésped. . Si las bacterias
vestidas con la cápsula de HA se presentan como lobos con piel de
cordero, entonces muchos parásitos eucariotas de animales
vertebrados pueden cruzar las barreras inmunes destruyendo el
escudo de hialuronano con el uso de la enzima hialuronidasa. Así es
como actúa un parásito eucariota unicelular Balantidium coli en un
organismo humano. La bacteria probablemente ha adquirido el gen
de la hialuronidasa y ha utilizado la enzima para romper la barrera
de la mucosa intestinal en el cuerpo humano. La tercera estrategia,
utilizada por los parásitos para adaptarse al huésped con la ayuda de
polisacáridos, es la formación de cáscaras de quitina. Los animales
vertebrados no tienen enzimas ni sistemas inmunológicos capaces de
reconocer y descomponer la quitina, razón por la cual el mundo de los
'parásitos quitina' compuesto por hongos, helmintos y artrópodos, es
tan abundante. El fenómeno del parasitismo es tan
viejo como la vida misma. Notablemente, las vías de adaptación del

parásito incluyen diferencias en los polisacáridos extracelulares.
2.1.2 Diferencias físico-químicas y funcionales de polisacáridos

Como se mencionó, los beta-D-glicanos, con los que está relacionado el
hialuronano, son polisacáridos extracelulares o intercelulares. Es
importante averiguar qué nuevos HA y glucosaminoglicanos
relacionados se han introducido en las relaciones intercelulares de los
animales cordados. Para ello, veamos las diferencias de las
estructuras químicas y las propiedades físico-químicas de los
polisacáridos con el propósito de entender qué funciones fisiológicas
realizan.
Funcionalmente, los polisacáridos se dividen en tres grupos
principales. El primer grupo son los polisacáridos intercelulares, que
cumplen funciones energéticas (almidón en el mundo vegetal y
glucógeno en el mundo animal). Las funciones de reserva de estos
polisacáridos vienen dictadas por su naturaleza polimérica. Son
menos solubles que los monosacáridos y por lo tanto no afectan la
presión osmótica en la célula. Debido a eso, pueden acumularse en las
células y, si es necesario, pueden servir como fuente de glucosa para
la energía y las funciones de construcción. Químicamente son
principalmente homopolisacáridos, lo que significa que todos los
monómeros son idénticos y están conectados con enlaces
alfa-1-4-glucosídicos con alguna presencia de enlaces
alfa-1-6-glucosídicos en los puntos de ramificación. Hay enzimas
hidrolíticas en la célula capaces de romper estos enlaces y liberar
azúcares monoméricos.
El segundo grupo son los polisacáridos estructurales, cuya función
principal es proporcionar rigidez mecánica a las células, tejidos y
órganos. El compuesto típico relacionado con este grupo es la celulosa
de polisacárido vegetal extracelular. Este es un homopolisacárido
lineal construido a partir de residuos de glucosa. Debido a tal
estructura, la celulosa extracelular es similar a los polisacáridos
intracelulares almidón y glucógeno. Sin embargo, existe una
diferencia muy importante entre estos homopolisacáridos: en el
glucógeno y el almidón, los enlaces 1-4-glucósidos están en
configuración alfa, pero en celulosa están en configuración beta. Tal
diferencia en la estructura conduce a diferencias esenciales en su
estructura secundaria y propiedades funcionales. Debido a las
características geométricas de los enlaces alfa-1-4 , los fragmentos
lineales de la cadena de glucógeno y almidón adoptan una
conformación helicoidal con bandas. Como resultado, se forman
gránulos densos y compactos que ocupan un volumen mínimo en la
celda.
La configuración beta de los enlaces 1-4 en la molécula de celulosa
conduce a cadenas poliméricas extendidas que forman fibrillas largas
e insolubles en agua como resultado del enlace de hidrógeno
intermolecular. Además, mientras que los enlaces alfa-1-4 del
glucógeno y el almidón se hidrolizan con enzimas animales
(alfa-amilasas), los enlaces beta-1-4 en la molécula de celulosa no se
hidrolizan, ya que los animales no tienen el correspondiente gen de la
celulasa, la enzima que hidroliza la celulosa.
Otro polisacárido lineal del grupo de los polímeros estructurales es
la quitina. Está construido a partir de residuos de
N-acetil-d-glucosamina, conectados también con los enlaces
beta-1-4-glicosídicos . En la molécula de aminoazúcar de
N-acetil-d-glucosamina, el segundo átomo de carbono está unido a
grupos amino acetilados en lugar de grupos hidroxilo. En los
biopolímeros, el grupo amino del aminoazúcar suele estar acetilado,
lo que da como resultado la eliminación de su carga positiva.
Las largas cadenas paralelas de quitina están dispuestas en

mechones similares a los de las cadenas de celulosa. La quitina
participa en la composición de las cutículas, los esqueletos externos de
los animales invertebrados y las envolturas celulares de los hongos,
donde generalmente se une a proteínas, lípidos, pigmentos, sales
inorgánicas y, más típicamente, carbonato de potasio [2].
El tercer grupo son los polisacáridos implicados en la matriz intercelular.
Contrariamente a
celulosa y quitina, los polisacáridos de la matriz extracelular son
solubles en agua y están fuertemente hidratados. El hialuronano y
otros glicosaminoglicanos pertenecen a este grupo (Tabla 2.1). En
comparación con otros polisacáridos extracelulares (celulosa, quitina),
poseen funciones significativamente más amplias y participan
activamente en la proliferación, migración, diferenciación y
reconocimiento celular.
Las principales ramas del 'árbol de especies' evolutivo difieren
claramente en su composición de polisacáridos. Los polisacáridos
estructurales más antiguos son probablemente las paredes celulares de
las células bacterianas formadoras de mureína . La base estructural de
la mureína comprende largas cadenas de polisacáridos
orientadas en paralelo compuestas de N-acetil-d-glucosamina y ácido
N- acetilmurámico unidas por enlaces beta-1-4. Las cadenas de
polisacáridos están reticuladas por fragmentos cortos de polipéptidos
de diversas composiciones en diferentes bacterias.
Los polisacáridos de los tres grupos mencionados anteriormente son
característicos de las células eucariotas. En el primer grupo de polisacáridos
de reserva, que tienen enlaces alfa-1-4- y alfa-1-6- glicosídicos para el
almacenamiento de energía, se observa una clara diferenciación entre
diferentes ramas evolutivas de especies eucariotas. El reino vegetal ha
elegido el almidón, mientras que el reino animal prefiere el glucógeno como
polisacárido de reserva. Estos dos polisacáridos comparten una gran
similitud estructural. Por ejemplo, el glucógeno es un análogo estructural de
la amilopectina de almidón; la única diferencia es el mayor grado de
ramificación del glucógeno. En el glucógeno, cada fragmento de
10 residuos de largo tiene un enlace 1-6-glicosídico , mientras que en la
amilopectina de almidón se encuentra un enlace 1-6-glicosídico por cada
20-25 residuos de glucosa. Esta diferencia química aparentemente no esencial
tiene una profunda implicación fisiológica, ya que el glucógeno forma
estructuras más compactas que ocupan un volumen menor en la célula. El
tamaño de los gránulos de glucógeno está en el rango de nanómetros
(10–40 nm), mientras que los de los gránulos de almidón está en el rango de
micrómetros (15–50 μm). Al mismo tiempo, el peso molecular del glucógeno y
el almidón es comparable, es decir, de 300 000 a 100 000 000 para el
glucógeno y de 100 000 a 100 000 000 para el almidón [41]. Un mayor grado
de ramificación de glucógeno crea otra ventaja funcional para las células
animales: las estructuras altamente ramificadas presentan un mayor número
de monómeros terminales, lo que mejora el cambio enzimático ya sea por
hidrólisis o síntesis de glucógeno, ya que múltiples moléculas de enzima
pueden actuar en múltiples ramas al mismo tiempo.
Al igual que el glucógeno, la amilopectina de almidón se compone de

residuos de glucosa unidos por enlaces alfa-1-4-glucósidos . En los
puntos de ramificación, los residuos de glucosa están unidos por
enlaces alfa-1-6-glicosídicos . Esto conduce a la formación de una
estructura arbórea . El almidón también comprende el polisacárido
lineal amilosa, que se compone de 200 a 300 residuos de glucosa
unidos por enlaces alfa-1-4-glucósidos . Esta estructura se debe a la
configuración alfa de los residuos de glucosa que forman
configuraciones espaciales en forma de hélice . La disposición de estos
dos polisacáridos en forma de gránulos de almidón conduce a un
aumento del tamaño de los gránulos y a una diferenciación de la
forma. La forma del glucógeno se puede describir como esférica. El
tamaño del nanómetro, la forma esférica de las macromoléculas de
glucógeno y las altas tasas metabólicas (tanto de síntesis como de
degradación) son propiedades funcionales muy adecuadas para las
células animales móviles.
Al considerar el glucógeno y el almidón como ejemplos, se puede

ver claramente cómo las propiedades químicas, físico-químicas y
conformacionales de los biopolímeros se han transformado en sus
características funcionales de acuerdo con la lógica de la evolución
celular. El segundo grupo de polisacáridos con enlaces
beta-1-4-glucosídicos y funciones estructurales bien definidas también
es evolutivamente diverso: la celulosa se encuentra en plantas,
mientras que la quitina es típica de invertebrados y hongos. El tercer
grupo de polisacáridos, la familia de los glicosaminoglicanos que
comprende HA, es característico de los animales cordados. Por lo
tanto, incluso a partir de una revisión tan breve de la distribución de
polisacáridos en organismos vivos, está claro que los polisacáridos
han jugado un papel importante en la ramificación del árbol de
evolución y la aparición de una variedad de especies. Es bastante
obvio que HA participó en la evolución de la rama altamente
organizada de los animales cordados. Examinemos ahora qué tipo de
novedad funcional ha aportado HA al proceso de evolución.
2.1.3 Características bioquímicas del ácido hialurónico y otros

glicosaminoglicanos
Todos los glicosaminoglicanos tienen varias características comunes.
●● Todos los glicosaminoglicanos son polisacáridos lineales no ramificados .
●● Todos los glicosaminoglicanos se construyen a partir de unidades
de disacáridos repetidos y, por lo tanto, son heteropolisacáridos
(Figura 2.1) contrarios a los homopolisacáridos con monómeros
idénticos (el almidón, el glucógeno y la celulosa se forman a partir
del monómero de glucosa y la quitina se forma a partir del
monómero de acetil amino glucosa).
●● Todos los glicosaminoglicanos (con la excepción del hialuronano)
contienen grupos sulfato como O-ésteres o N-sulfatos.
●● El grupo amino de los aminoazúcares suele estar acetilado, lo que
conduce a la desaparición de la carga positiva.
● ● Con la excepción de HA, todos los glicosaminoglicanos se unen
covalentemente con proteínas y esto conduce a la formación de
agregados de proteoglicanos. El hialuronano puede estar presente
no solo unido a otros componentes, sino también como molécula
libre.
Por lo tanto, incluso en función de la composición química, la familia
de los glicosaminoglicanos se diferencia de otros polisacáridos. La
característica importante de los glicosaminoglicanos que se diferencia
de otros polisacáridos es la solubilidad en agua. Otros polisacáridos
son parcialmente solubles o insolubles en agua. Además, el
hialuronano podría diferenciarse de los demás miembros de la
familia por las siguientes características: no está sulfatado, no se
modifica químicamente después de la síntesis, tiene un peso
molecular elevado y se puede encontrar en estado libre. Otra
característica interesante de HA es su método de síntesis. El
hialuronano es sintetizado por la hialuronano sintasa, que está
conectada con la membrana celular citoplásmica y se elimina a través
de la membrana directamente en la superficie celular externa hacia la
matriz extracelular durante el alargamiento de la cadena. (Es
interesante que las cadenas de polisacáridos de celulosa en las células
vegetales se sintetizan de manera similar [42]).
Se cree que HA es la forma evolutiva más temprana de
glicosaminoglicanos. A diferencia de HA, otros glicosaminoglicanos se
sintetizan en el aparato de Golgi. Se unen covalentemente con
proteínas para formar los proteoglicanos, que se transfieren aún más
a la matriz extracelular por el mecanismo de exocitosis [41]. Tres
formas de hialuronano sintasa (HAS 1 , HAS 2 , HAS 3 ) se encuentran
en cuerpos humanos y vertebrados. La enzima HAS 1 realiza una
síntesis lenta de HA de alto peso molecular, la enzima
HAS 2 es más activo y sintetiza polisacáridos con pesos moleculares

más bajos hasta 2 000 000 Da. La enzima HAS 3 es la más activa, pero
solo puede sintetizar cadenas cortas de HA de 200 000 a 300 000 Da
[32,43,44].
Las tres sintasas de hialuronano mencionadas anteriormente son el
producto de tres genes diferentes. Como se demostró a través de
experimentos con ratones, el más importante desde el punto de vista
evolutivo es el gen HAS 2 . Los ratones con deficiencias de HAS 1 - y
HAS 3 - eran viables, pero los que tenían HAS 2 no lo eran. Tal
mutación en el gen HAS 2 es letal durante el desarrollo embrionario.
Se descubrió que los embriones carecían casi por completo de HA y
tenían graves deficiencias incompatibles con la vida [32]. En términos
evolutivos, el papel de tres hialuronano sintasas con diferentes
cinéticas de actividad y HA de diferente peso molecular sigue sin estar
claro.
Como se mencionó anteriormente, el hialuronano es glicosaminoglicano
no ramificado y no sulfatado que consta de 5000-30 000 unidades de
disacárido formadas por N-acetil-d-glucosamina y ácido D-glucurónico
conectados con un enlace glucósido beta-1-3 . Los disacáridos están
conectados con enlaces beta-1-4-glicosídicos (Figura 2.1). El hialuronano
puede alcanzar el peso molecular de 8 × 10 6 Da, que excede
significativamente la longitud de otros glicosaminoglicanos, cuyo peso
molecular está dentro del rango de 4000-50 000 Da (Tabla 2.1). Todos los
glicosaminoglicatos son solubles en agua. Las cadenas de polisacáridos de
HA son estructuras estéricamente más rígidas en comparación con, por
ejemplo, las cadenas de polipéptidos de proteínas. Es por eso que las
moléculas de HA no pueden formar estructuras globulares extracompactas
características de las proteínas.
En condiciones con un pH alrededor de 7.0, los grupos carboxílicos
de HA se disocian y las moléculas de polímero tienen cargas negativas
de alta densidad . Atraen sodio, potasio, magnesio, calcio y otros
cationes osmóticamente activos. Debido a eso, HA puede unir hasta
1000 veces más agua que el peso de la macromolécula en sí. Debido a
estas propiedades físico-químicas , la molécula de HA adopta una
conformación ampliada, ocupa un volumen extremadamente grande
en relación con su masa y forma geles incluso a concentraciones muy
bajas.
Dependiendo de la concentración de hialuronano y el peso
molecular, los medios de gel de biopolímero determinan las funciones
fisiológicas de las células, tejidos y órganos, en funciones de
unión al agua, intercambio iónico, difusión dependiente del
tamaño de la molécula e impermeabilidad hacia moléculas y células
grandes. Como consecuencia, proporciona protección contra la
penetración de toxinas de alto peso molecular y las invasiones
microbiológicas. La presencia de una gran cantidad de agua
unida a HA crea una presión de hinchamiento (turgencia) que resiste
las fuerzas de compresión en oposición a las fibras de colágeno que
resisten las fuerzas de extensión. Las propiedades viscoelásticas del
hialuronano en el líquido sinovial de las articulaciones permiten que
el biopolímero actúe como lubricante y amortiguador. Después de la
síntesis, el HA no se somete a modificaciones químicas adicionales, no
contiene grupos cromóforos y no se absorbe en el rango visible del
espectro de luz. La solución acuosa del polisacárido es completamente
transparente y se utiliza para rellenar el vítreo y otras estructuras
oculares. Cada una de estas características físico-químicas y funciones
biológicas relacionadas del hialuronano y otros glicosaminoglicanos
han dado forma al complejo de nuevas propiedades funcionales para
asegurar una evolución acelerada en la rama de los animales
cordados.
Una breve revisión de la evolución molecular de los polisacáridos
permite sacar algunas conclusiones generales: (1) Polisacáridos
extracelulares como celulosa, quitina e hialuronano participaron en la
ramificación del árbol de evolución de las especies, (2) la celulosa
participó en la formación del mundo vegetal, (3) la quitina estuvo
involucrada en la evolución de la rama de
los animales invertebrados, (4) el HA contribuyó a la evolución de los

animales cordados, (5) todos los polisacáridos extracelulares incluyen
beta-d-glucanos y (6) polisacáridos extracelulares que contienen
enlaces beta-1-3 glucósidos que probablemente aparecieron por una
ruta biogénica después de los genes que codifican la enzima capaz de
formar enlaces beta-1-3 surgieron como resultado de la evolución
genómica de las células eucariotas.
Es interesante que las enzimas responsables de la síntesis de los
principales polisacáridos extracelulares (es decir, hialuronano y
celulosa) estén localizadas en la membrana de la célula
citoplasmática. Durante la síntesis, una cadena de polímero en
crecimiento se difunde a través de la membrana directamente hacia el
espacio extracelular. Esta ruta de síntesis es aparentemente más
antigua y difiere de la síntesis de otros polisacáridos extracelulares
que se sintetizan dentro de la célula y se transportan al medio
extracelular por el mecanismo de exocitosis.
2.2 Funciones del hialuronano en la ontogénesis humana
Las últimas décadas presenciaron un número creciente de

publicaciones sobre el papel del hialuronano en la fertilización (en
correlación directa con el desarrollo de numerosos programas de
fertilización in vitro), división y migración celular, angiogénesis,
cicatrización de heridas y regeneración tisular. Hoy en día se sabe que
la HA participa activamente en la regulación de la división celular, la
migración, la diferenciación y la regeneración de tejidos y órganos en
todas las etapas del desarrollo u ontogénesis del organismo. Hay tres
períodos en la ontogénesis: (1) el período de desarrollo embrionario
desde la fertilización hasta el nacimiento, (2) el período de crecimiento
y madurez sexual y (3) el período de envejecimiento. La función de HA
es particular durante los tres períodos. La mayor parte de HA se
sintetiza en el período embrionario. En los animales cordados domina
el tipo regulador de desarrollo embrionario [3] y todo el proceso
incluye tres etapas:
(1) escisión del cigoto y formación de la blástula, (2) gastrulación o
formación de capas germinales y (3) histo- y organogénesis o
formación de tejidos y órganos. HA participa activamente en todas las
etapas de la embriogénesis.
2.2.1 Papel del ácido hialurónico en la fertilización

Cuando un óvulo sale del ovario, está recubierto por dos capas [45]. La
superficie externa de la membrana citoplasmática está cubierta con zona
pelúcida , una capa compuesta de una sustancia gelatinosa no celular . La
superficie de la zona pelúcida está poblada por muchas capas de las células
foliculares que componen la capa llamada corona radiata (Figura 2.3). Tanto
la zona pelúcida como la corona radiada contienen cantidades significativas
de hialuronano en la matriz extracelular. Se ha demostrado
experimentalmente que la hialuronano sintasa sintetiza HA con un peso
molecular de 2 a 5 millones de Da [46]. La microscopía electrónica reveló que
las moléculas largas de HA en la matriz intercelular de la corona radiada
están entrelazadas y organizadas en forma de fibras formando una red
homogénea anclada en la superficie de las células. Las células sintetizan la
proteína CD44, el receptor de HA en la superficie de las células foliculares. La
organización del hialuronano en esta matriz estructurada se logra con la
ayuda de proteínas. Esto se evidencia por el hecho de que el tratamiento con
proteasas conduce a la disociación de las fibras en cadenas de biopolímeros
individuales y la dispersión de las células. A medida que el óvulo avanza en
las trompas de Falopio, el HA de la matriz extracelular se destruye y las
células foliculares de la corona radiata sufren apoptosis, la muerte
controlada de las células, a diferencia de

corona radiata

Óvulo
(UN)
Núcleo

Zona pelúcida

Cuello uterino
(SEGUNDO)
Fertilización de óvulos
Acrosoma
Mitocondrias
Espermatozoide
(C)
División de huevos
Blastomer
Hacia el útero
Figura 2.3 Participación de hialuronano en la fertilización del óvulo
citólisis y lisis incontrolable de células. Recientemente se ha

establecido la correlación entre la intensidad de la degradación de HA
y la pérdida de células foliculares por apoptosis.
[46]. Después de la hidrólisis del polisacárido, el desmantelamiento de la
matriz intercelular y la desaparición de las células foliculares, el espesor de
la capa de corona radiata se reduce gradualmente.
Simultáneamente, se reduce la probabilidad de fertilización del
huevo. En los seres humanos, la fertilidad del óvulo se conserva
durante un período de 12 a 24 h después de la ovulación y el
descubrimiento completo del ovocito ocurre después de 30 h. El
hialuronano y otros glicosaminoglicanos de la zona pelúcida y la
corona radiada evitan que el óvulo se adhiera a la pared de la trompa
de Falopio, lo que reduce el riesgo de embarazo ectópico. Se ha
demostrado experimentalmente que el retraso de la degradación de
HA en la matriz intercelular conduce a la inhibición de la apoptosis de
las células foliculares ya la preservación de la fertilidad del huevo [46].
Para que tenga lugar la fertilización, es decir, introducción
del núcleo del espermatozoide al óvulo, la reacción del acrosoma debe

ocurrir primero [34]. Esta reacción comienza con el contacto del
espermatozoide con la capa gelatinosa del óvulo. El contenido del
acrosoma del espermatozoide se libera mediante exocitosis. Entre las
enzimas hidrolíticas del acrosoma, la hialuronidasa está presente
para descomponer el biopolímero.
Los estudios futuros nos ayudarán a comprender los mecanismos de
participación de las moléculas finas de HA en las primeras etapas de la
embriogénesis. Pero hasta ahora, se puede suponer que los productos de la
fragmentación secuencial de hialuronano participan en los procesos de
fertilización, inicio de la división celular y escisión del cigoto. Estos
supuestos se basan en una serie de hechos descritos en la literatura sobre
una variedad de propiedades funcionales de HA en función de su peso
molecular (Figura 2.4). Se sabe, por ejemplo, que el HA con un peso
molecular de 500 000 Da y superior suprime la proliferación y migración
celular. Sin embargo, una vez que el peso molecular se reduce a
50 000–100 000 Da, la actividad supresora se invierte, es decir, la HA
comienza a estimular la proliferación y migración celular. Por tanto, el
hialuronano puede realizar funciones mutuamente opuestas, dependiendo
del tamaño de las macromoléculas. Los fragmentos de
tamaño mediano (25-50 disacáridos de largo) muestran una fuerte actividad
angiogénica inmunoestimulante y aceleran los procesos inflamatorios. Los
oligosacáridos de menor tamaño inducen la expresión de proteínas de
choque térmico y actúan como factores antiapotosis. Algunos oligosacáridos
de pequeño peso molecular son, aparentemente, factores de señalización y
endógenos del estrés celular, mientras que otros desencadenan varias vías
de regulación de señales. Por tanto, HA con un peso molecular de
1300 a 4500 Da (3 a 10 unidades de disacárido) inicia la proliferación de
células endoteliales. Por el contrario, la fracción con un peso molecular en el
rango de 1300 a 7200 Da (3 a 16 unidades de disacáridos) inhibe
definitivamente la proliferación de células epiteliales normales, pero no
suprime la proliferación de fibroblastos normales y células de músculo liso
normales in vitro.
Mantenimiento del equilibrio hídrico

normal, hidratación de la piel, retención
Ácido hialurónico de humedad, mejora del tono, elasticidad,
microcirculación y velocidad de
Fracciones regeneración de la piel.
≤ 30000 Da Penetra la barrera transepidérmica,

estimula el crecimiento de los capilares
50 000 - 100 000 Da sanguíneos y linfáticos, mejora la
microcirculación y la nutrición de la piel.
Posee propiedades curativas de heridas,

500 000 - 730 000 Da estimula la proliferación de células y su
migración a las heridas.
Suprime la proliferación y migración de

células, inhibe el crecimiento de capilares
sanguíneos y linfáticos, previene la
degradación del cartílago y reduce en ???
procesos ammatorios.
Figura 2.4 Funciones de las fracciones de hialuronano de diferentes pesos

moleculares
El hialuronano con un peso molecular de 100 000 Da estimula la

proliferación de los fibroblastos humanos en la matriz de colágeno y el
polímero con un peso molecular de 860 000 Da acelera la proliferación
de las células epiteliales corneales. Por el contrario, un biopolímero
con un peso molecular de 400 000 a 1 000 000 Da inhibe la
proliferación de células endoteliales normales. Los polisacáridos con
un peso molecular de 1 000 000 Da suprimen la proliferación de
células sinoviales de conejo y fibroblastos de ratas 3T3, pero se ha
demostrado que a 1 mg / ml estimulan la proliferación de células
sinoviales de conejo y fibroblastos de ratas 3T3.
Estos resultados variables pueden estar asociados con las diferencias en la
concentración de biopolímero, la presencia de diversas impurezas y las
diferencias en la expresión del receptor de HA en diferentes tipos de células,
entre otros fenómenos. Sin embargo, es obvio que el hialuronano posee un
espectro amplio y una actividad dependiente del tamaño , lo que hace que
los fragmentos de HA sean moléculas de señal poderosas para los sistemas
reguladores [47]. El aislamiento y la caracterización funcional de fragmentos
de oligosacáridos es un campo importante de investigación en biología
molecular y medicina.
2.2.2 Hialuronano y otros glucosaminoglicanos en la

división, migración y diferenciación celular
El organismo de cualquier animal multicelular puede considerarse como un
clon de células formadas a partir de un óvulo impregnado. Por lo tanto, todas
las células son genéticamente idénticas, pero difieren en el fenotipo, ya que
interpretan las "instrucciones" genéticas de diferentes maneras,
organizándose con el tiempo y el medio ambiente del organismo
multicelular (es decir, se diferencian). Después de la fertilización, el
desarrollo de los vertebrados se puede dividir en tres fases. La primera fase
implica la división (escisión) del óvulo impregnado (cigoto) en múltiples
células a través de la mitosis y la formación de blástula, una estructura de
una sola capa y en forma de bola cerrada . Estas células forman una capa
similar a un epitelio y, como células de todos los epitelios, poseen polaridad.
Por ejemplo, sus superficies (externas, internas y laterales) se distinguen por
su composición química y sus funciones, lo cual es importante para la
coordinación de su comportamiento posterior. Las células de la blástula
están conectadas mutuamente por contactos de hendidura y una matriz
extracelular que contiene hialuronano . Los espacios entre las células se
agrandan constantemente, lo que se asocia, aparentemente, con la síntesis
activa de hialuronano y otros componentes de la matriz extracelular. Los
glicosaminoglicanos y las proteínas que cubren la superficie de las
membranas celulares y forman la matriz intercelular entre las células
adyacentes son portadores de las propiedades superficiales específicas de la
célula que determinan el futuro destino de las células. A diferencia de los
glicosaminoglicanos sulfatados, el hialuronano es capaz de acelerar el
crecimiento de las células y su proliferación.
La fase de escisión y formación de blástula es seguida por la fase de

gastrulación, que implica la formación de capas de las hojas
germinales a partir de las cuales se desarrollan tejidos y órganos en la
tercera fase. Estas fases no tienen límites claros y pueden
superponerse. Los procesos de proliferación, migración y
diferenciación secuencial de células son intensivos en las tres etapas.
Se cree que el hialuronano juega un papel activo en todos estos
procesos, ya que la acumulación de HA coincide con los períodos de
migración de las células en los tejidos. Al ser el componente principal
de la capa pericelular (casi celular) formada en la superficie de las
células en proliferación y migración, el HA facilita la separación de las
células. Además, puede formar canales de diferente grado de
hidratación y una matriz menos densa para facilitar la migración de
las células. Como se descubrieron muchos receptores
específicos de HA llamados hialdherinas, es posible sugerir que HA
influye en la migración de las células mediante la interacción directa
con estos receptores (ver Tabla 2.2).
26 Ácido hialurónico
Cuadro 2.2 Hialdherinas, proteínas específicas para la unión de HA [48]

Proteínas celulares Proteínas extracelulares

Proteínas errantes Transmembrana La matriz extracelularProteínas solubles
Proteinas Proteinas

cdc37 Familia CD44 Versicano (VCAN) / inhibidor de la alfa-tripsina
p68 (gclqR) hialuronectina
RHAMM * Proteína conectada
HBP ** Agregado
IHABP *** Neurocan
Fibrinógeno
TSG-6 ****

Colágeno VI

* Receptor para la motilidad mediada por
ácido hialurónico ** Proteína de
unión a hepatocitos
*** Proteína de unión al ácido hialurónico intracelular
**** Factor de necrosis tumoral - gen estimulante 6
Se considera un hecho bien establecido que la HA estimula la

proliferación de fibroblastos humanos a través del colágeno de la
matriz extracelular [48] con la que se asocia.
[49]. La producción de HA no requiere la síntesis activa de la
proteína, ya que el aparato sintético ya formado se localiza en la
superficie interna de la membrana citoplasmática donde se vuelve
insensible a la acción de los inhibidores de la síntesis proteica y
proteasas extracelulares. . Las cadenas de HA perforan la membrana
celular que inmediatamente se fusiona con la matriz extracelular. La
escisión de estas cadenas por hialuronidasas extracelulares estimula
la síntesis de hialuronano. Es posible que el polisacárido juegue un
papel importante en la regulación de la síntesis del componente
proteico de la matriz intercelular, ya sea acelerando o ralentizando su
formación. Las características dependientes del peso molecular de la
matriz extracelular y la gama extremadamente amplia de
conformaciones adoptadas por la macromolécula polisacárida en ella
pueden ser responsables del control de la división, migración o
diferenciación de las células [49,50]. Comunicaciones recientes
sugieren la presencia de HA intracelular e intranuclear en células en
división [51]. Por métodos de microcopia confocal, se detectó que en
fibroblastos permeables tratados con fluorescina , HA se localiza en
estructuras nucleares y cromatosferitas. Después de la estimulación
de las células 3T3 (fibroblastos de ratón) con suero, se detectó un
aumento considerable en el contenido de citoplasma de HA marcado,
especialmente durante la profase y la metafase temprana de la
mitosis. En las células no estimuladas , el biopolímero marcado se
localiza solo en las proximidades del núcleo, especialmente en la
cromatosferita y en las regiones de heterocromatina alrededor de la
periferia nuclear. En las células mitóticas estimuladas, se encontró
que la HA marcada llenaba todo el espacio nuclear que rodea a los
cromosomas durante la metafase y luego cubre la región entre los
cromosomas separados durante la anafase. La fluorescencia de HA
marcado también persiste durante la telofase. En la telofase tardía, se
puede detectar una pequeña cantidad de hialuronano en las
proximidades de los "puentes" delgados del diafragma que conectan
dos células divididas.
Después de la estimulación de las células con suero embrionario
bovino o factor de crecimiento trombocítico, se detectó el HA marcado
(después de la adición al medio de cultivo) en los viales y el
citoplasma celular. La distribución de HA en el citoplasma ocurre de
manera compatible con el
retículo endoplásmico y ampollas endosomales. Esto plantea la

pregunta sobre la ubicación: ¿dónde transportan HA los viales
endosomales? ¿En una red endoplásmica de retículo o en los
lisosomas?
Se supone que aparece HA marcado en la célula como resultado de la
internalización a través de
endocitosis. Dentro de la célula, el HA puede unirse a factores
intracelulares y participar en la regulación de la transcripción de
genes, un ciclo celular, o escindirse en los lisosomas donde se
utilizaría más en la síntesis de hialuronano como precursor. Por lo
tanto, existe un ciclo que incluye la síntesis de hialuronano en la
membrana citoplasmática, seguida de su extradición en la matriz
intercelular, así como el proceso inverso de transporte de HA de
regreso a la célula a través de endocitosis. En este ciclo se produce la
despolimerización parcial y completa del polisacárido. Se puede
suponer que la fragmentación controlada de HA da como resultado la
formación de fragmentos funcionalmente activos que pueden cumplir
funciones reguladoras del control de la actividad génica y la
proliferación celular. La intensidad de los procesos de síntesis y
degradación de biopolímeros durante la embriogénesis es
especialmente alta. Se cree que un mayor contenido de hialuronano
en la matriz intercelular puede facilitar la separación de las células
durante la división y migración. Tras la observación microscópica, el
HA marcado en la matriz intercelular y en la superficie de la célula
aparece como una intrincada red vellosa. El tratamiento con
Streptococcus hialuronidasa conduce a la desaparición del marcaje
tanto en las superficies de la célula como en la matriz pericelular. Se
sabe que tanto la síntesis como la secreción de HA aumentan durante
la proliferación celular. En el cultivo celular de células no estimuladas
, solo el 25% de las células mostró la presencia de matriz pericelular.
Después de la estimulación celular por el factor de crecimiento
trombocítico, el número de células cubiertas con la capa de HA
aumentó hasta un 70%. Casi todas las células mióticas estaban
cubiertas con una capa de hialuronano. Al mismo tiempo, la capa de
polisacárido era más gruesa en las células estimuladas en
comparación con las células de control. La formación de la capa
pericelular se produjo cuando las células se separaron de la superficie
de los sustratos durante el redondeo mitótico, lo que facilitó el
deslizamiento de la célula a lo largo del sustrato. Por tanto, la cantidad
de HA intracelular y extracelular aumenta de forma coordinada
durante la multiplicación mitótica de las células. Este fenómeno
también se observó para algunos otros tipos de células, incluidas las
epiteliales, endoteliales y tumorales. Sin embargo, la fuente y las
funciones de la HA intracelular aún no se comprenden
completamente.
Una vez que las células de la blástula han formado una capa
epitelial, la capa de matriz extracelular se sintetiza alrededor de la
blástula esférica de una sola capa . Esta estructura es un punto de
partida para la gastrulación: la migración activa de células y el
desplazamiento de masas celulares. La capa de matriz extracelular
contribuye a estos procesos. La superposición de tres capas germinales
(es decir, ectodermo, entodermo y mesodermo) y la formación de un
embrión de tres capas es el resultado final de la gastrulación. Las
células de estas capas ya están determinadas para dar forma a
diferentes tejidos y órganos. Los procesos de proliferación activa,
migración y diferenciación genética de las células también acompañan
a los procesos de histogénesis y organogénesis [52-55]. La gastrulación,
la histogénesis y la organogénesis presentan un mayor contenido de
hialuronano. Una gran cantidad de biopolímeros durante el
crecimiento embrionario se concentra en el líquido amniótico (hasta
20 mg / ml) y en el cordón umbilical (hasta 4 mg / ml). La formación de
capas de cuerdas cartilaginosas en este período de desarrollo también
requiere disponibilidad de HA, condroitín sulfato, dermatansulfato y
proteínas; los bloques de construcción del complejo supramolecular de
agrecano, que es el componente básico del tejido cartilaginoso. Por
tanto, se puede suponer que los genes que codifican la síntesis
de HA y otros glicosaminoglicanos pertenecen al grupo de genes

antiguos que alguna vez dieron forma al tipo regulador del
crecimiento embrionario [3], cuya expresión activa es especialmente
necesaria durante la embriogénesis.
Hasta la fecha, los mecanismos moleculares del hialuronano como sus
funciones en los procesos de embriogénesis están poco estudiados y son
temas importantes para futuras investigaciones. Solo se conocen ciertos
detalles sobre el funcionamiento del hialuronano a nivel molecular en
modelos de cultivo celular de regeneración, reparación y recuperación de los
órganos animales dañados. Se cree que los procesos de recuperación de
daños de células, tejidos y órganos comparten ciertas similitudes con los
procesos de crecimiento embrionario. Repasemos algunos resultados
experimentales. Utilizando un método de reacción en cadena de la
polimerasa, la actividad de la expresión (síntesis) del ARNm (ARN de matriz)
para las tres enzimas HAS 1 , HAS 2 y HAS 3 , así como la dependencia de la
tasa de migración celular de la concentración de hialuronano en la
monocapa dañada, se determinó en la monocapa de las células humanas
mesoteliales peritoneales
[56]. Los resultados mostraron que un aumento en la actividad del gen
(aumento en la expresión
sión de ARNm) para HAS 2 ocurre 6 h después de dañar la monocapa
de células y se alcanzó un máximo de actividad genética con un
aumento de 15 veces en la cantidad de ARNm después de 12-24 h.
Después de esto, la expresión de ARNm de HAS 2 disminuyó. Después
de 48 h casi había alcanzado el nivel de las células de control intactas
(Figura 2.5). El contenido de ARNm de la enzima HAS 3 fue constante
en las células normales. El nivel comenzó a disminuir 6 h después de la
herida y se detectó una disminución de seis veces después de 24 h; el
contenido de ARNm volvió a un nivel normal después de 96 h
(Figura 2.5). La expresión de ARNm de HAS 1 no se descubrió ni en
cultivos de control ni en cultivos dañados.
De los resultados se deduce que la actividad de los tres genes que codifican
las síntesis de hialuronano se regula de forma diferencial en respuesta a los
daños. También se estableció que la síntesis de hialuronano se activa en el
borde frontal de la herida y que la reparación en presencia de HA se acelera
mediante el aumento de la tasa de migración celular hacia la herida (Figura
2.6). Es característico que tanto en la embriogénesis como en la monocapa de
peritoneal
En las células mesoteliales humanas, el gen de HAS 2 se activa en
respuesta al daño [32, 56] (Figuras 2.6 y 2.7).
Otro ejemplo es la restauración del daño óseo. La superficie de un
hueso está cubierta por un tejido conectivo (periostio) con una
pequeña cantidad de células capaces de formar nuevo tejido
cartilaginoso. Tras un daño, digamos una fractura ósea, estas células
comienzan a 'repararse' reproduciendo los procesos embrionarios
iniciales de la formación ósea a partir de los modelos de cartílago.
Primero, se produce cartílago para llenar la fractura de un hueso.
Luego, el tejido cartilaginoso es reemplazado por tejido óseo con la
ayuda de los osteoblastos y los osteoclastos.
[45]. La composición cualitativa y cuantitativa
relacionada con la edad de los glicosaminoglicanos en diferentes tipos
de tejido del cartílago se ha estudiado bastante bien. La propiedad
característica de la composición cualitativa de los glicosaminoglicanos
en las primeras etapas de la embriogénesis de los animales
vertebrales es la ausencia de queratán sulfato en todos los tipos de
modelos de cartílago [57-60]; en esta etapa hay un aumento en el
contenido de condroitín sulfatos [60] y el grado de sulfatación de
glicosaminoglicanos [61-63]. A medida que avanza el desarrollo del
embrión, aumenta el contenido de queratán sulfato y disminuye el
contenido de heparán sulfato [60]. Se observa una clara correlación
entre la intensidad de los glicosaminoglicanos y el intercambio de
colágeno. En ambos casos, la máxima intensidad del metabolismo se
observa al comienzo de la ontogénesis, especialmente durante la
histogénesis y la organogénesis [61,64]. Además, el nivel de
intercambio de glicosaminoglicanos alcanza
(UN)
0,6
n HAS-2 / α-actina
0,5
0.4
Relación
0,3
0,2

0,1

0
03612 18 24 48 7296120 144

Tiempo, horas
(SEGUNDO)

0,25

0,2
α-actinaproporción
0,15
/ 3-
0,1
TIENE

0,05

0
0 3 6 12 18 24 48 72 96120144 Tiempo,
horas
Figura 2.5 Transcripción de HAS 2, HAS y α- actina después de la lesión de células

mesoteliales peritoneales humanas (HPMD). Los datos se presentan como la relación de
HAS 2 / α -actina (A) y HAS 3 / α -actina (B) para las células lesionadas ( ▪ ), en comparación
con los experimentos de control ( ▫ ). Reimpreso con permiso de Macmillan Publishers Ltd:
Kidney International, de ref. [56], derechos de autor (2000)
un máximo antes del intercambio de colágeno [63]. Se observa una

situación similar durante la regeneración de heridas de tejidos
conectivos en organismos adultos. Por tanto, las primeras etapas de la
cicatrización de las heridas cutáneas van acompañadas de la
acumulación de hexosamina [65] (figura 2.8).
(UN)

120
90
3–

HA, dpm ×
60
10

H] -etiquetado

30
]3

0
0 3 6 12 18 24 48 72 96 120

Tiempo, horas
(SEGUNDO)

600
500
/

1–horas

400
DECIRdpm ×
,AH 10
300

200
tado
H] -etiquet

3
100
]

0
0/66/1218/12 18/24 24/48 48/72 72/96 96/120

Tiempo, horas
Figura 2.6 Síntesis de hialuronano por HPMC heridas [56]. (A) La acumulación de HA en
los tiempos indicados se determinó de acuerdo con la cantidad de marcador incorporado en
macromoléculas de [ 3 H] resistentes a hialuronidasa y digeridas con papaína ; (B) Los
cultivos de control y lesionados se marcaron por pulsos con [ 3 H] -glucosamina durante el
tiempo indicado. La velocidad de síntesis de HA se expresa como [ 3 H] -HA dpm / h. Las
células lesionadas ( ▪ ) se comparan con experimentos de control ( ▫ ). Reproducido con
autorización de Macmillan Publishers Ltd: Kidney International de ref. [56], derechos de autor
(2000)
40
Tasa de migración, mμ / hora
30
20
10
0
0 HAse Disacc 0,05 0,20 1,6 3,3 FCS al 10%
Figura 2.7 Efecto de HA exógena sobre la tasa de migración de HPMC después de

la herida [56]. Reproducido con autorización de Macmillan Publishers Ltd: Kidney
International de ref. [56], derechos de autor (2000)
Se estudió el progreso del cierre de la herida, contenidos de colágeno y

hexozamina (como marcador de proteoglicanos) en las heridas normales
comparándolas con las tratadas por microesferas de gelatina con un agente
antimicrobiano. Se demostró que el cierre de la herida progresó desde el día
0 al día 15, al mismo tiempo que se observó el máximo de contenido de
hexosamina en el día 3 de heridas tratadas y el día 9 de heridas no tratadas ,
pero el máximo de contenido de colágeno se observó en el día 6 con las
heridas tratadas y 12 de las no tratadas . Estas observaciones indican
claramente que los complejos de proteoglicanos que contienen
glicosaminoglicanos se forman al comienzo de la fase productiva de
crecimiento. Pero las primeras fibras de colágeno aparecen solo al final de
esta fase. En consecuencia, la síntesis de glicosaminoglicanos y
proteoglicanos siempre precede a la síntesis de colágeno y la formación de
cicatrices. Lo más probable es que los glicosaminoglicanos determinen el
tipo de cicatriz. El tratamiento acelera la cicatrización de la herida pero no
cambia la dinámica de síntesis de proteoglicanos y colágeno.
[sesenta y cinco]. También hay pruebas experimentales sólidas de
que el condroitín sulfato y la glucosamina sulfatada son capaces de
estimular la síntesis de colágeno y proteoglicanos en los tejidos del
cartílago [66-68]. Además, se demostró que los glicosaminoglicanos en
concentraciones bajas (menos de 10 mg / ml) aceleran la proliferación
de condrocitos en el cultivo celular, pero en concentraciones más altas
(150-200 mg / ml) suprimen la proliferación [65]. Tal
efectos de glycosaminoglycans- pueden ser descritas
como asociadas con cualquiera de construc- ción y / o el
mantenimiento de la matriz intercelular con propiedades
características, o mediante la utilización de metabolitos intermedios.
Se demostró experimentalmente que los glicosaminoglicanos
sulfatados suprimen la actividad de las enzimas que participan en la
degradación de la matriz intercelular, como la hialuronidasa [65] y la
elastasa de granulocitos [69,70],
(A) *
100
Tratado Controlar *
80
herida cierre
60
*

40

*
%

20 *

0
Día 3 Día 6 Día 9 Día 12 Día 15
(SEG
4

Controlar Tratado
(mg / g)
3,5
*

3 *
2.5
*
2
Contenido de
1,5
1
0,5
0
Día 3 Día 6 Día 9 Día 12 Día 15 Día 18 Día 21
(C)
90
Contenido de colágeno (mg

80 *
Controlar Tratado
70
60
*
50
*
40
30
(/ g
20
10
0
Día 3 Día 6 Día 9 Día 12 Día 15 Día 18 Día 21
Figura 2.8 Progreso en la cicatrización de heridas (A), dinámica del contenido de

hexosamina (B) y contenido de colágeno (C) en la piel después de la herida [65].
Reproducido con permiso de la ref. [sesenta y cinco]. Copyright © 2009, John Wiley
& Sons, Ltd
colagenasa [71], serina proteasas [72], catepsinas ácidas, hidrolasas

lisosomales [73] y otras enzimas [74,75]. Curiosamente, se conocen
propiedades similares del sulfato de monosacárido glucosamina [76].
Estas propiedades de los glicosaminoglicanos pueden servir como
explicación del fenómeno de supresión de la apoptosis de condrocitos
in vitro [77].
Los metabolitos intermedios de los glicosaminoglicanos (azúcar,
glucosamina y sulfatos) pueden estimular las reacciones de
intercambio y el crecimiento del tejido del cartílago [78]. Incluso los
metabolitos individuales manifiestan una alta actividad fisiológica.
Por ejemplo, la glucosamina sulfatada afecta el recambio y la
proliferación de las células del tejido del cartílago y los condrocitos
[66,68]. Una pequeña disminución de la concentración de sulfato en
los fluidos biológicos de 0,3 ppm a 0,2 mm conduce a una fuerte
reducción (hasta un tercio) de la velocidad de síntesis de
proteoglicanos en el tejido del cartílago humano [79,80]. De ello se
deduce que las cadenas reguladoras con retroalimentación directa e
inversa para controlar el metabolismo celular, la división y la
apoptosis incluyen hialuronano y glicosaminoglicanos sulfatados.
La migración celular es otro fenómeno que juega un papel
importante en los procesos de desarrollo embrionario. Antes del
comienzo de la migración, los tipos de células no están
completamente determinados. Para llegar al lugar de su designación,
las células migran a través de otros tejidos del embrión. A esto le sigue
la diferenciación de estas células en los lugares de destino
correspondientes, que está determinada por contactos mutuos y
factores químicos de las membranas celulares y la matriz
extracelular. Las rutas de migración están determinadas, en
particular, por los tejidos conectivos [81-83].
Ya se ha mencionado que HA participa en la migración celular,
creando un medio gel favorable en los espacios intercelulares y
también a través de los contactos con los receptores proteicos
específicos. Los mecanismos moleculares que subyacen a la migración
celular están poco investigados. Independientemente del mecanismo
exacto más allá del fenómeno de migración, las células penetran en
las diferentes secciones del embrión donde se diferencian de diversas
formas para cumplir las funciones específicas correspondientes. La
diferenciación de las células está determinada por el entorno local
[84,85]. La matriz extracelular participa en la diferenciación y
retención del estado diferenciado de las células [86-88]. Así, un óvulo
impregnado en el proceso de embriogénesis da lugar a un organismo
multicelular complejo que comprende aproximadamente 200 tipos de
células diferenciadas.
2.2.3 El ácido hialurónico y los

glucosaminoglicanos sulfatados en el
mantenimiento de un estado
diferenciado de las células
Una vez que la matriz extracelular es sintetizada por las células, ayuda a
mantener su estado diferenciado [44,45]. Los siguientes datos
fenomenológicos sirven como base para esta conclusión. Las células
cartilaginosas diferenciadas (condrocitos) crecen y proliferan en el medio
permeable y adecuado, formando finalmente clones de los condrocitos
diferenciados. Se sintetizan y se cubren con grandes cantidades de una
matriz cartilaginosa muy específica. El fenotipo cartilaginoso se conserva
durante varias generaciones de células subclonadas si crecen en el medio
permeable. Pero si los condrocitos se cultivan a baja densidad en el medio
no estándar después de varias subclonaciones repetidas , la fracción de
células que han sufrido cambios fundamentales aumenta gradualmente. En
lugar de una característica de colágeno tipo II del tejido del cartílago, las
células comienzan a sintetizar un colágeno tipo I típico de los fibroblastos.
Estos dos tipos de colágeno están controlados por diferentes genes. En
consecuencia, el cambio de genes e incluso la posible reprogramación del
genoma ocurre en aquellos
células. En tales condiciones, la parte de los condrocitos aparentemente se

convierte en fibroblastos. Lo más probable es que el cambio se produzca con
bastante rapidez, ya que la síntesis simultánea de ambos tipos de colágeno se
observa solo en muy pocas células. Los mecanismos de conmutación no se
conocen por completo. Sin embargo, algunos datos sugieren que las
moléculas poliméricas de matriz extracelular secretadas por condrocitos y
fibroblastos participan en el proceso. Los condrocitos crecen en forma de
clones y forman colonias separadas en la superficie del medio de cultivo
sólido. La densidad de la matriz del cartílago es mayor en el centro de la
colonia en comparación con la periferia. Las células periféricas cambian
antes que las centrales para comenzar a sintetizar un colágeno de tipo I. Por
tanto, se asumió que la matriz formada por condrocitos participa en la
preservación de un determinado fenotipo de condrocitos y su estado
diferenciado [31, 45].
Hay otros datos experimentales a favor de esta hipótesis. Cuando los
proteoglicanos específicos del cartílago (que consisten en los
glicosaminoglicanos sulfatados unidos covalentemente con la proteína
lineal) se agregan al cultivo de condrocitos, se refuerza la síntesis de una
matriz de tipo cartílago por los condrocitos. El hialuronano también influye
en la diferenciación de los condrocitos, pero de manera opuesta. Los
fibroblastos secretan una gran cantidad de HA, mientras que los condrocitos
sintetizan comparativamente menos. La HA libre añadida al cultivo de
condrocitos suprime fuertemente la síntesis de la matriz del cartílago
[1,44,45]. Es posible suponer que los componentes de la matriz extracelular
actúan como un componente de la retroalimentación positiva en los sistemas
reguladores, gracias a lo cual la síntesis de la matriz intercelular se convierte
en un proceso autosostenible .
Estos resultados experimentales proporcionan motivos para sugerir
que el hialuronano, los glicosaminoglicanos sulfatados y otros
compuestos de la matriz intercelular secretados por las células actúan
sobre las mismas células y, por tanto, contribuyen a la retención de los
programas genéticos en las células diferenciadas. Si la matriz
intercelular influye en la diferenciación de una célula, las células
circundantes que secretan los compuestos de la matriz intercelular
también deberían influir en este proceso. Aparentemente, las células
de condrocitos interactúan cooperativamente y se estimulan a sí
mismas para sintetizar la matriz similar a un cartílago , mientras que
los fibroblastos actúan como antagonistas y suprimen la
diferenciación de condrocitos. Por tanto, el estado diferenciado de las
células no se conserva de forma completamente autónoma. Las
interacciones intercelulares pueden cambiar el estado de
diferenciación celular [46]. También puede modificarse por la acción
de factores hormonales.
Pueden ocurrir cambios radicales en la diferenciación celular como
resultado de la acción de las sustancias que cambian el grado o la
naturaleza de la metilación del ADN [de 47 a 50]. Sin embargo, estos
cambios en las propiedades de las células del organismo adulto
diferenciado rara vez son radicales. La mayoría de esas alteraciones
pueden considerarse modulaciones de estados diferenciados o
transmutaciones reversibles de fenotipos celulares similares [45]. Sin
embargo, estas modulaciones de los estados de células diferenciadas
están asociadas con el cambio de genes o la reprogramación del
genoma celular. ¿Cómo pueden el HA y otros glicosaminoglicanos
influir en el genoma e inducir la modulación del estado diferenciado
de las células? Como ya se mencionó, el hialuronano es sintetizado
por la hialuronano sintasa localizada en la célula de la membrana
citoplasmática y "expulsado" inmediatamente durante la síntesis
hacia la matriz intercelular para ocupar sitios de dislocación y
funcionamiento específicos. Por lo tanto, los contactos directos de HA
con los cromosomas y genes del núcleo son inexistentes, lo que
permite asumir solo interacciones distantes. Es posible que estas
interacciones se realicen mediante la unión con los receptores
transmembrana CD44 (Figura 2.9) o mediadas por interacciones con
las hialdherinas de la matriz extracelular, que a su vez están
conectadas al citoesqueleto celular interno a través de proteínas
transmembrana.
Dominio de unión a HA

DECIR AH

NH 2
Péptido de La matriz extracelular

tallo
Membrana
Actina ??? ber
Ankyrin
COOH
Dominio citoplasmático Espectrina Espacio intracelular

Espectrina obligado- citoplásmica

??? bril
Figura 2.9 Estructura esquemática del receptor CD44 específico de HA
Hasta ahora, los mecanismos moleculares exactos detrás de la

acción de HA sobre los genomas y la actividad de los genes a través de
este sistema de señales distantes no han sido suficientemente
investigados. Sin embargo, se sabe que el HA de alto peso molecular
(500 000 Da y más) suprime la proliferación celular (Figura 2.4). Como
se ha revelado la presencia de hialuronano en el interior de las células
y su localización intranuclear [51], es posible que la macromolécula
de polisacárido, sus fragmentos con las conformaciones específicas, o
los complejos de HA con otros compuestos, afecte directamente la
actividad y el cambio de genes . En este caso, surge una pregunta en
torno a las formas en que el HA se transporta al núcleo.
Por tanto, en el período de crecimiento embrionario, las células
proliferan y se diferencian en diferentes tipos de células. Y aunque los
estados diferenciados son, por regla general, bastante estables,
algunos tipos de células están sujetos a cambios reversibles limitados
o las denominadas modulaciones. Por ejemplo, los condrocitos se
pueden convertir en fibroblastos en condiciones no óptimas y volver
al estado inicial cuando las condiciones óptimas estén disponibles. En
muchos otros tipos de células son posibles pequeños cambios
reversibles en el estado diferenciado. El tipo de matriz extracelular
sintetizada por las células junto con el componente hialuronano de
alto peso molecular ayuda a mantener el estado diferenciado de las
células del organismo adulto. Sin embargo, la preservación de las
células diferenciadas en la mayoría de los tejidos de los animales
vertebrales no se basa en su longevidad, sino que se produce
mediante la sustitución de las células viejas por otras nuevas. Para
lograr esto, las células diferenciadas deben sufrir un ciclo celular
ocasional de división y proliferación. Estos procesos también forman
la base de la regeneración fisiológica y la recuperación de tejidos y
órganos después del daño.
2.2.4 Hialuronano e inducción de ciclos celulares para células diferenciadas

La integridad de una célula no se basa en la resistencia de los
materiales con los que está construida, sino en la coordinación de los
procesos de descomposición y síntesis [89-94]. Las células son capaces
no solo de una autorrenovación continua sino también de una
autorreproducción. La mayoría de las poblaciones de células
diferenciadas en vertebrados están sujetas a la
autorreproducción. Cuando las células se 'desgastan' en términos
biológicos y mueren, son reemplazadas por nuevas células formadas
como resultado de la división mitótica de las células diferenciadas. El
estado diferenciado
y el ciclo mitótico de división son estados alternativos de las células

que se asocian con la desdiferenciación, es decir, la reprogramación
del genoma y la reorganización cardinal de las estructuras celulares.
En el estado diferenciado, está activo el grupo de genes responsables
de la síntesis de proteínas y otros biopolímeros secretados para
cumplir funciones tisulares específicas. Con el inicio del ciclo celular,
este grupo de genes "exportadores" se apaga y el grupo de genes
responsables de la síntesis intracelular se activa. Es por esto que el
estado de diferenciación y el estado de división mitótica compiten
hasta cierto punto.
Una hipótesis sobre las relaciones competitivas de proliferación y
diferenciación ya ha sido formulada y sustentada por Brodsky et al. en
1981. [95]. Brodsky afirma que la competencia se produce debido a las
limitadas posibilidades metabólicas dentro de una célula que resulta
en la competencia de las funciones celulares. Una célula diferenciada
no solo sintetiza una composición única de proteínas, polisacáridos y
otros biopolímeros para cumplir funciones específicas de tejido , sino
también biopolímeros para la renovación celular interna. Sin
embargo, cuando la célula entra en el ciclo celular, el genoma se
reprograma para la síntesis de proteínas cromosómicas, proteínas para
la replicación del ADN y un aparato necesario para la división y el
avance de una célula a través de las fases del ciclo celular. En la fase
premitótica, la masa de toda la célula se duplica. Las síntesis celulares
de diferentes propósitos biológicos están aseguradas por reacciones
metabólicas uniformes comunes que involucran compuestos
macroérgicos como ATP, UTP, etc., precursores, moléculas reductoras,
etc. En una sola célula de hepatocito diferenciada, por ejemplo, se
observa un período de síntesis de proteínas de una hora que incluye la
síntesis de proteínas para la secreción, así como proteínas
intracelulares [96]. En condiciones no óptimas , cuando se encuentra la
escasez de metabolitos y posibilidades sintéticas, la célula entra en un
ciclo celular. El suministro de metabolitos depende, en particular, de la
relación entre la superficie celular y su volumen. La colisión depende
de la forma de la celda , ya que en las celdas redondas el volumen
aumenta más rápidamente (V = 4 / 3πr 3 ) que en las celdas de
superficie más plana (S = 4πr 2 ). La composición lipídica y la
integridad estructural de una membrana celular también son
importantes, ya que estos factores determinan la actividad de los
sistemas de transporte de una célula, particularmente la distribución
de las fases básicas de gel, cristal líquido, cristal líquido ordenado o
balsa. En términos funcionales, la estructura de la matriz intracelular y
el estado físico-químico del citosol ( transiciones gel-sol ) también son
importantes. Todos estos factores determinan las posibilidades
sintéticas y los estados estacionarios de las células. Por ejemplo, un
factor limitante de la retención del fenotipo (un estado diferenciado)
de las células del cartílago (condrocitos) es, en particular, la
concentración de trifosfato de uridina (UTP) en el medio de cultivo
[96]. La formación de los precursores de la síntesis de
glicosaminoglicanos, como UDP- ácido glucurónico , UDP- ácido
idurónico , UDP- acetilglucosamina y UDP-acetilgalactosamina,
depende en gran medida de la concentración de UDP. En las
condiciones óptimas de cultivo, los condrocitos realizan diversas
funciones. Por ejemplo, sintetizan sulfato de condroitina para la matriz
extracelular y, en presencia de activadores de la proliferación, algunas
células se dividen. Cuando la cantidad de UDP en el medio de cultivo es
limitada, las células cesan la síntesis de sulfato de condroitina y
comienzan a dividirse. En este caso, el fenotipo de las células ha
cambiado. Hay ejemplos de diferenciación celular acelerada como
consecuencia de la proliferación retardada de células. Cuando los
condrocitos se cultivan durante muchas generaciones en un medio
no del todo adecuado y carecen de la capacidad de producir una
matriz de cartílago, a medida que el fenotipo cambia a uno
fibroblástico, se transfieren más al medio permeable donde las células
recuperan la capacidad de sintetizar glicosaminoglicanos y cartílago.
matriz [86-88,97].
Se encuentran disponibles múltiples modelos para investigar los

mecanismos de las transiciones celulares del estado diferenciado al
ciclo celular: los cultivos celulares en medio nutritivo sólido y líquido,
el daño de la monocapa celular, las heridas de la piel y otros tejidos
conectivos, hepatectomía del hígado y así sucesivamente. Se
encuentran varios activadores e inhibidores de la proliferación celular
[98]. Las células diferenciadas conservan la capacidad de mitosis en el
tejido donde residen durante mucho tiempo, donde no hay reserva de
células madre y donde la reproducción es la única fuente de
crecimiento de la masa celular. Estas células son miocitos del corazón,
hepatocitos, células endoteliales de vasos sanguíneos, etc. El modelo
más popular para investigar los mecanismos de transición de células
diferenciadas a proliferativas es a través de los hepatocitos del hígado
en organismos adultos. Esto se debe a que la población de hepatocitos
es funcionalmente homogénea y todos los hepatocitos realizan el
mismo espectro de funciones. En condiciones normales, los hepatocitos
se renuevan a un ritmo bajo pero estrictamente controlado, es decir,
mediante la regeneración fisiológica. Más importante aún, a través de
la experimentación se descubrió que después de extraer 2/3 de un
hígado de un animal, el resto de la población de hepatocitos entra en el
ciclo celular para regenerar el tamaño inicial del órgano
[95,97-99]. Además de la extirpación quirúrgica del hígado, la
proliferación de hepatocitos puede ser inducida por tetracloruro de
carbono, radiación ionizante y no ionizante, ultrasonido,
calentamiento a corto plazo , daños mecánicos, tratamiento de células
con proteasas, detergentes, inhibidores de ATPasa de sodio y potasio
[100 ], colchicina y vinblastina [101], con dosis bajas de carcinógenos
[102], al cambiar el medio iónico [103], mediante la inhibición
reversible de la síntesis de proteínas [104] y así sucesivamente.
Muchos de estos factores interrumpen o destruyen el hialuronano, los
proteoglicanos y otras estructuras de la matriz celular. Es posible que
estos procesos de destrucción actúen como un desencadenante que
incite a las células diferenciadas a entrar en el ciclo celular. Al menos
se sabe que la mejora de la síntesis y secreción de hialuronano, seguida
por el transporte de HA de regreso a la célula y al núcleo a través de
endocitosis, se encuentran entre las primeras respuestas a tales
estímulos. La estimulación de las células para la división se acompaña
de una degradación acelerada de HA tanto extracelular como
endosomal (intracelular). En otras palabras, se acelera el recambio de
hialuronano [51].
Los productos de la degradación intracelular de HA pueden jugar un papel
regulador en los procesos de proliferación celular. Las propiedades
estimulantes se atribuyen al polisacárido con un peso molecular de
50 000 a 100 000 Da (Figura 2.4). Recientemente se ha demostrado que el HA
oligomérico de cierto tamaño (oHA) estimula la rápida proliferación de
células endoteliales.
[105]. En el último caso, oHA induce la activación de los genes de
respuesta temprana, en particular el gen ras , así como la proteína
quinasa C y la MAP quinasa. También deben considerarse las
posibilidades de transducción de señales de HA oligomérico a genes
de núcleos. A continuación se examinan las vías y los mecanismos de
transferencia de señales.
Tras el daño mecánico de la monocapa de células mesoteliales humanas, se
activa el gen que codifica la hialuronano sintasa-2 , mientras que, por el
contrario, se suprime el gen responsable de la hialuronano sintasa-3 . Esta
conclusión se basa en datos experimentales obtenidos mediante el método
de PCR que mostró un rápido aumento de 15 y 6 veces en la expresión de
ARNm de hialuronano sintasa-2 y ARNm de hialuronano sintasa-3 ,
respectivamente [56]. El gen de la hialuronano sintasa-2 aparentemente se
relaciona con el grupo de genes de respuesta temprana que son silenciosos
en las células diferenciadas pero que se convierten en primeros genes
activados en respuesta a los estímulos de proliferación. Los siguientes genes
pertenecen a este grupo de genes: c-myc (que codifica la proteína nucleósido
difosfato quinasa B), c-fos , c-ras , c-jun , y P53. Anteriormente se los conocía
como protooncógenos, ya que su activación ocurre cuando un
la célula normal se transforma en una célula cancerosa. Los genes que

controlan la síntesis de proteínas en respuesta a un aumento brusco
de la temperatura, es decir, proteínas de estrés por calor o HSP,
también pertenecen al mismo grupo de genes. Los HSP, como su
nombre indica, se llaman para reducir los daños celulares bajo
acciones desfavorables como altas temperaturas, etc. La proteína de
estrés térmico HSP70, por ejemplo, suprime la apoptosis (muerte
celular programada genéticamente) al evitar la producción de caspasa
3. La familia de genes de caspasa codifica el grupo de proteasas que
participan en la apoptosis a través de la activación en cascada de las
enzimas, lo que finalmente conduce a la muerte de una celda. En el
modelo de artritis se demostró que la terapia intraarticular con
administración de HA con un peso molecular de 840 000 Da (HA84)
conduce a la supresión de la apoptosis de las células sinoviales y la
regulación de la expresión de HSP72. En el mismo experimento, se
estudió la cinética de degradación de HA84 en el tejido sinovial. Se
estableció que los productos oligoméricos de la degradación de HA84
al regular la expresión de HSP72 pueden reducir los daños de las
células. A continuación, los fragmentos oligoméricos de diferente peso
molecular se prepararon y estudiaron para determinar su actividad
estimulante de la expresión de HSP72 e inhibidora de la apoptosis .
Resultó que todas estas funciones se atribuyen al fragmento de
tetrasacárido de hialuronano.
Otros productos de la despolimerización de HA, es decir di-, hexa-,
deca- y dodecasacáridos no poseen tales actividades. Es importante
destacar que el tetrasacárido obtenido a partir del queratán sulfato de
glicosaminoglicano sulfatado tampoco mostró tales propiedades. El
tetrasacárido de HA suprime la muerte celular y regula la expresión
de HSP72 tanto a nivel de transcripción de ARNm (actividad del gen)
como de traducción (actividad de síntesis de proteína), pero solo en
las células sometidas a estrés hipertérmico (42-43 ° C durante 20 min).
Para las células intactas no sometidas a la temperatura de choque, el
tetrasacárido de hialuronano no afectó ni al nivel de expresión de
HSP72 ni a la viabilidad de las células. También se estableció el
mecanismo molecular de regulación de la expresión de HSP72 en
condiciones de estrés. Parece que los tetrasacáridos activan el factor
de estrés térmico HSF 1 . Como se sabe, una vez activada, la proteína
HSF 1 se fosforila y se transporta desde el citoplasma al núcleo, donde
se une al elemento ADN del estrés por calor, activando así el gen
responsable de la síntesis de HSP en situaciones de estrés [106]. .
Otra población de células diferenciadas capaces de renovarse
mediante división mitótica similar a los hepatocitos es el endotelio de
los vasos sanguíneos. Las células endoteliales forman una sola capa
que recubre todos los vasos sanguíneos y regulan el intercambio de
sustancias entre la sangre y el tejido circundante. La matriz
extracelular del endotelio contiene una cantidad significativa de
hialuronano. Se desarrollan nuevos vasos sanguíneos en forma de
excrecencias de células endoteliales de las paredes de los pequeños
capilares. Estas células son capaces de formar estructuras capilares
huecas incluso en el cultivo celular. Los tejidos dañados y algunos
tumores en organismos adultos estimulan la formación de nuevos
capilares (angiogénesis) por las células endoteliales adyacentes con la
ayuda de activadores especiales. Entre estas moléculas se encuentra el
HA de bajo peso molecular [107].
Se ha demostrado que los productos de la despolimerización de HA,
que tienen una longitud de 4 a 20 unidades de disacárido, estimulan la
proliferación de células endoteliales, su migración y las etapas iniciales
de la conformación capilar in vivo e in vitro [107]. Mientras que el HA
de bajo peso molecular estimula la angiogénesis, el biopolímero de alto
peso molecular , por otro lado, inhibe el crecimiento de nuevos vasos
sanguíneos. Se sabe que el crecimiento de un tumor cesa rápidamente
si el tejido no es capaz de inducir la proliferación de células
endoteliales y la penetración de vasos sanguíneos en el tumor. El
tumor sólido que crece en forma de masa densa se alimenta solo
debido a
la difusión de nutrientes desde la periferia, y por lo tanto no puede

crecer a más de varios milímetros de tamaño. Se sabe que el HA de
alto peso molecular impide la migración de células normales y
tumorales. Las células tumorales capaces de invadir y formar
metástasis sintetizan y secretan hialuronidasas en la matriz
extracelular para escindir el hialuronano. Nuevos estudios de los
mecanismos de la influencia del hialuronano en el crecimiento
tumoral y la diseminación metastásica y la angiogénesis en tejidos
tumorales y de heridas conducirán posiblemente a nuevas tecnologías
de tratamiento y profilaxis de procesos tumorales.
Por lo tanto, el inicio del ciclo celular en las células diferenciadas se
acompaña de varios procesos que incluyen la mejora de la síntesis y
secreción de HA y su transporte al núcleo [51], la aceleración del
transporte de proteínas no histonas desde el citosol al núcleo. [108],
activación de la síntesis de polipéptidos nucleares [109], cambios
secuenciales en la macroestructura de la cromatina nucleolo y
no nucleolo [110] y activación de la síntesis de proteínas nucleares y
ADN [104,111]. Sin duda, todos estos procesos están interconectados y
representan el algoritmo de reestructuración de la cromatina.
[112] y cambio de genes. Como se demostró en el modelo de
hepatocitos [113], los genes de respuesta temprana c-myc, c-fos, c-ras,
c-jun y P53 [114,115] que alguna vez fueron silenciosos en células
diferenciadas ahora se han convertido rápidamente activado, pero el
gen que codifica la síntesis de albúmina está inactivo [116]. Por tanto,
se produce el cambio de "los genes de diferenciación" a "los genes del
ciclo celular".
Sorprendentemente, la mayor concentración de hialuronano en las
células se encuentra en la cromatoesferita en la vecindad de la
membrana del núcleo [51]. Específicamente, la cromatina en la
vecindad de una membrana nuclear está compuesta por la forma más
condensada de cromatina inactiva con cromosomas que están
conectados con la superficie interna de la membrana nuclear. Un alto
grado de organización cromosómica se conserva en el núcleo en
interfase de las células diferenciadas [117]. Los centrómeros de los
cromosomas están agrupados y asociados con la membrana nuclear
en un lado del núcleo, mientras que los telómeros
(secciones terminales de los cromosomas) están conectados con la
membrana en el otro lado. (Figura 2.10).
La región de 10 cromosomas diferentes que contienen genes
ribosómicos que codifican la síntesis de ARN ribosómico se ensambla
en la estructura del nucleolo. El siguiente reordenamiento citológico
cronometrado para las diferentes etapas del ciclo celular ocurre en el
núcleo. Inicialmente, la "separación" del núcleo ocurre a través de la
lisis de las membranas del retículo endoplásmico cerca de la
membrana nuclear. Entonces ocurre la 'separación' de los
cromosomas, lo que requiere el desmantelamiento de la membrana
nuclear y el nucleolo. Sigue la separación de los cromosomas en las
etapas de metafase y anafase. El contenido más alto de HA se nota
específicamente en estas etapas. El biopolímero llena toda la región
que rodea a los cromosomas durante la metafase y las separaciones de
los cromosomas durante la anafase [51]. El papel del HA en los
procesos nucleares probablemente se asocia no solo con su alta
viscosidad, sino también con la posibilidad de autoorganización en las
estructuras ordenadas de cristal líquido (véase el capítulo 4). El
biopolímero aparentemente crea el medio en el que se reestructuran
las reacciones mecanoquímicas de la cromatina en interfase [108-115]
y se producen las replicaciones y recombinaciones de los cromosomas
[117] y su separación en células hijas.
Al mismo tiempo, como se mencionó [106], algunos oligosacáridos
de hialuronano pueden participar en el cambio de genes en las
primeras etapas del inicio del ciclo celular, es decir, pueden cumplir
funciones reguladoras. Por tanto, con toda probabilidad, el HA
nuclear participa en la estructura

Centrómero cromosómico

Núcleo
Nucleolo
Alto contenido
de hialuronano Membrana del núcleo interno

Membrana condensada
heterocromatina

Telómeros cromosómicos

Cromosomas
en metafase

Fragmentos de
membrana del núcleo

Centriolo

Cromosoma

C

C centrómero

Nucleolo

Nucleolo
Núcleo Núcleo

T
T T T

Telómeros
Figura 2.10 Hialuronano en el núcleo en interfase de la célula (I) y el ciclo celular

(II, III). Las regiones con mayor concentración de HA se muestran en rojo
organización de los cromosomas en el núcleo en interfase de la célula

diferenciada, ayuda a desmantelar los cromosomas cuando entran en
el ciclo celular (así como a su separación) y da forma a las estructuras
de cromatina en los núcleos de las células hijas durante su
diferenciación (Figura 2.10). La entrada de células diferenciadas en el
ciclo celular se asocia con una mayor renovación de hialuronano
(Figura 2.11).
Este recambio incluye las etapas de activación del gen de la
hialuronano sintasa-2 para las transcripciones del ARNm de la
enzima, la incorporación de la enzima en la membrana citoplasmática
seguida de la síntesis y la translocación directa de HA al espacio
intercelular, el transporte adicional desde el espacio intercelular al
núcleo y la realización. de las funciones necesarias para la
reconstrucción, el movimiento y la organización de los cromosomas
en el núcleo. Todavía no hay suficientes datos experimentales para
confirmar con seguridad esta imagen común, pero a partir de los
datos disponibles es posible sugerir tal descripción. Esta conclusión
proporciona direcciones para futuras investigaciones experimentales.
Hialuronidasa
Vesícula exocitótica

Vesícula endocitótica
Lisosomas Endocitosis, transporte

Núcleo de HA en núcleo

DECIR AH
Receptor
DECIR AH
Núcleo
CD44 Nucleolo
Receptor
CD44
HA unido al receptor
Agrupación de
receptores
Figura 2.11 Rotación de hialuronano
No todas las células diferenciadas en organismos adultos son

capaces de reproducirse ingresando al ciclo celular. Esto depende de
en qué etapa se haya detenido el ciclo celular antes de la
diferenciación. Si las células se detienen en el punto de restricción, es
decir, en el punto R, las células en el estado diferenciado permanecen
normales y viables durante mucho tiempo, incluso en condiciones de
deficiencia de nutrientes. Las células que dejan de dividirse en el
"punto seguro" R son las llamadas células en la fase G0 del ciclo
celular. Cuando las células se detienen en otros momentos del ciclo
celular, por lo general mueren si están condenadas a la inanición [34].
Cualquier condición no óptima, incluida la inanición, que provoque
que las células diferenciadas entren en la desdiferenciación y el ciclo
celular, provocará una reducción en la tasa de síntesis de proteínas.
Sobre la base de este principio, se creó un modelo útil para investigar
los mecanismos del inicio del ciclo celular en los hepatocitos
diferenciados [104,113]. En esencia, en este modelo, la inhibición
temporal pero reversible de la síntesis de proteínas por el antibiótico
cicloheximida provoca que algunas células hepáticas diferenciadas
entren en el ciclo celular [104], mientras que otras se someten a
apoptosis [118]. Es posible que estas diferencias en cómo se realiza
una elección estratégica de respuesta estén asociadas con las
diferencias en los puntos en los que se detuvo la división de células.
Hay ciertas células que, después de formarse en una cantidad
necesaria en el embrión, permanecen inalteradas a lo largo de la vida
del organismo. Estas células nunca se dividen y no pueden
reemplazarse en caso de pérdida. Estas se denominan células
diferenciadas permanentemente. Estas son casi todas las variedades
de células nerviosas, células del músculo cardíaco, fotorreceptores y
células del cristalino del ojo en los mamíferos. Las macromoléculas de
proteínas y hialuronano son renovables en las células permanentes.
Aún no se dispone de evidencia confiable que indique que HA
participa en el mantenimiento de las células diferenciadas
permanentemente.
El tercer tipo de diferenciación se encuentra en células
diferenciadas terminalmente. En varios tejidos, el estado final de
diferenciación celular es incompatible con la división celular. Esto se
debe a que los núcleos de las células pueden ser destruidos, es decir,
la célula de las capas externas de la epidermis de la piel, por ejemplo,
o expulsados de las células, como ocurre durante la 'maduración' de la
piel.
eritrocitos en mamíferos. La realización de la mitosis y la citocinesis

se puede prevenir si el citoplasma está lleno de miofibrillas (células
musculares) o por otros factores bioquímicos. En tales tejidos, la
necesidad de células recién diferenciadas es constante. La
reproducción en estos casos se produce debido a las células madre.
Las células madre pueden dividirse ilimitadamente y dar
descendientes diferenciados. Las propias células madre no están
diferenciadas, pero están programadas para
producir una forma de las células diferenciadas (células madre unipotentes)
o varias formas (células madre pluripotentes). El modelo de formación de
células epidérmicas cutáneas a partir de células madre y su comportamiento
en las diferentes etapas de diferenciación hasta la terminal es el más
estudiado. La epidermis de la piel contiene varias capas celulares
bien diferenciadas . La capa más profunda consiste en células basales
ubicadas cerca de la lámina basal. La lámina basal separa la epidermis de la
piel de la dermis que se encuentra debajo. La membrana es una estructura
no celular compuesta principalmente por fibras de colágeno tipo IV. Actúa
como una barrera para la migración de fibroblastos, macrófagos y otras
células de la matriz extracelular de la derma a la matriz extracelular de la
epidermis. Dado que la sangre y los capilares venosos no están presentes en
la epidermis, la membrana es permeable y transporta los nutrientes. Varias
capas de células espinosas grandes y planas se encuentran por encima de las
células basales. Las capas de células granulares se encuentran arriba. Más
cerca de la superficie, el tejido está compuesto por células hexagonales y
sin orgánulos que solo contienen proteína queratina. Las células basales
adyacentes a la lámina basal son células madre unipotentes y conservan
constantemente la capacidad de división. Después de la división, la célula
asociada con la lámina basal sigue siendo la célula madre, mientras que otra
célula forma la capa espinosa, la primera etapa del movimiento ascendente
"escalera mecánica". En la capa espinosa, la célula pierde irreversiblemente
la capacidad de división y comienza a diferenciarse. Y, a medida que avanza
hacia arriba en la piel, la célula sintetiza diferentes tipos de queratina
codificada por diferentes genes. Esta familia de genes, similar a la familia de
genes de la hialuronano sintasa, aparece en la evolución como resultado de
duplicaciones y mutaciones de un gen ancestro [119,120].
A medida que la célula pasa de los "pisos" inferiores a las capas

superiores, expresa diferentes grupos de genes en una colección
completa de genes de queratina homólogos. El tiempo desde el
momento de la división de las células madre hasta su descamación de
la superficie de la piel en un ser humano es de 2 a 4 semanas. Se
supone que las células madre conservan la capacidad de división
debido al contacto con la lámina basal [78]. Tan pronto como se pierde
el contacto, la célula pasa por sucesivas etapas de diferenciación que
eventualmente conducen a una diferenciación terminal. La lámina
basal está en contacto con la matriz intercelular dérmica rica en HA
sintetizada activamente por los fibroblastos dérmicos.
Aparentemente, debería haber una especificidad aún por descubrir de
la matriz compuesta de colágeno IV, hialuronano y otros compuestos
que apoyan la "inmortalidad" de las células madre en la epidermis. El
hialuronano está presente en la matriz intercelular de diferentes
capas epidérmicas (alrededor de 0,1 mg / g), pero se desconoce si el
HA es transportado desde la dermis o sintetizado por las células
epidérmicas y qué papel juega en las diferentes etapas de la
diferenciación de las células epidérmicas.
En resumen, la mayoría de las poblaciones de células diferenciadas en
vertebrados adultos están sujetas a reproducción de diferentes formas. Con
mayor frecuencia, esto ocurre al ingresar al ciclo celular. La división de las
células se inicia por muchos factores físicos y químicos que alteran la
homeostasis celular. La consecuencia común de las acciones disruptivas
desfavorables se convierte, por regla general, en la inhibición de la síntesis
de proteínas, el proceso más complejo con respecto al número de
componentes participantes, organización estructural y alto coste energético.
Las acciones desfavorables limitan las posibilidades metabólicas de una
célula y, ante todo, las posibilidades de síntesis de proteínas. En estas
condiciones, las funciones celulares comienzan a
competir. La síntesis por polirribosoma en el retículo endoplásmico de las

proteínas "exportadoras" destinadas a cumplir las funciones diferenciadas se
ralentiza o cesa por completo. La célula comienza a sintetizar proteínas
intracelulares para su propia supervivencia o para ingresar al ciclo celular.
Esta hipótesis está respaldada por datos experimentales sobre la
transferencia de los hepatocitos diferenciados al ciclo celular como resultado
de la inhibición directa reversible de la síntesis de proteínas por la
cicloheximida, un inhibidor específico [108-115]. Este antibiótico no altera
las estructuras del aparato de síntesis de proteínas, sino que lo une de
manera competitiva al centro de la transferasa de los ribosomas y detiene
temporalmente la máquina de síntesis de proteínas en las células eucariotas
[113]. En este momento, se pone en marcha el algoritmo de reconstrucción
de la cromatina para desactivar el grupo de genes que están activos en las
células diferenciadas y funciones codificantes específicas y activar el grupo
de 'genes tempranos' que inicia el ciclo celular [ 113]. Entre estos genes
tempranos se encuentra el gen que codifica la hialuronano sintasa-2. Incluso
en las condiciones de bloqueo completo de la síntesis de proteínas, la enzima
existente aún puede sintetizar hialuronano, y la síntesis de precursores se
activa incluso en ausencia de la competencia por los compuestos
macroérgicos (ATF, UTF), reduciendo así moléculas y azúcares iniciales como
se observó experimentalmente.
La acción de factores químicos y físicos desfavorables conduce a

mutaciones espontáneas ocasionales. La frecuencia promedio de tales
mutaciones, según estimaciones generales, es de 10 a 6 mutaciones por gen
por ciclo de división. En el organismo humano tienen lugar alrededor de 10
16 divisiones a lo largo de su vida. Cada gen durante la vida del individuo
puede sufrir mutaciones aproximadamente 10 10 veces. Por lo tanto, dividir
células diferenciadas enfrenta numerosas 'opciones':
(1) terminar el ciclo celular normalmente y pasar al estado diferenciado
inicial, (2) pasar al nuevo estado estable de la célula diferenciada, (3) adoptar
el estado inmortalizado, es decir, el estado que ocurre cuando el El sistema
que regula la transición de división a diferenciación se interrumpe y la
célula se divide o (4) se transforma constantemente en células cancerosas.
Cuando los sistemas reguladores están seriamente dañados, la célula sufre
(5) proceso de cadena citolítica controlada, apoptosis o (6) citólisis
incontrolable. Las dos últimas opciones conducirán a la muerte de la célula.
La destrucción controlada de células en apoptosis es importante en
la última etapa de la curación de heridas. La apoptosis aparentemente
regula la sustitución del tejido de granulación temporal por el tejido
cicatricial final. Varios tipos de células, por ejemplo, fibroblastos,
células endoteliales, miofibroblastos y células inflamatorias sufren
apoptosis. La apoptosis está completamente regulada. Cuando la
apoptosis se ralentiza o se detiene, los fibroblastos continúan
proliferando creando tejido queloide. Curiosamente, este proceso
involucra los genes de respuesta temprana, es decir, c-myc, P53, que
se activan con el inicio del ciclo celular. El gen P53 controla el ciclo
celular normal y el retorno de las células a su estado diferenciado. Las
mutaciones en este gen, como se sabe, pueden provocar el desarrollo
de tumores en humanos. También se encuentran mutaciones
puntuales en el gen P53 en los fibroblastos de las cicatrices queloides.
En los fibroblastos de piel normal de los mismos individuos, no se
detectaron tales mutaciones [121].
Así, en el equilibrio dinámico, el organismo adulto que consta de 75
billones de células agrupadas en 200 tipos histológicos está respaldado
por dos procesos opuestos: proliferación celular y apoptosis.
Hyaluronan ejecuta un sorprendente conjunto de funciones en estos
procesos. Al estar localizado en la matriz intercelular, el HA se ve
obligado a 'aceptar el fuego' proveniente de la influencia mutagénica
de acciones físicas y químicas externas, así como de factores internos,
en particular los radicales libres omnipresentes, sobre sí mismo. Por
tanto, el hialuronano y otras macromoléculas reducen el fondo
mutagénico y la frecuencia de mutaciones, disminuyendo así la
probabilidad de diferentes enfermedades.
Por otro lado, el hialuronano puede contribuir al desarrollo de

patologías. Las células cancerosas mutantes, por ejemplo, tienen con
frecuencia una ventaja selectiva sobre las células normales. Son
capaces de replicarse ilimitadamente ya que 'ignoran' el principio de
Hayflick y penetran en los espacios intercelulares de las células
normales, es decir, para crecer de forma invasiva e incontrolable y
diseminarse metastásicamente. Se muestra que la matriz extracelular
de células cancerosas es rica en HA e hialuronidasas que
aparentemente participan en la diseminación metastásica [122]. Por
un lado, las células tumorales utilizan la hialuronidasa como un
"saboteador molecular", provocando la despolimerización de HA, de
modo que los productos de degradación pueden facilitar aún más la
propagación de un tumor al provocar angiogénesis; es decir, la
germinación de vasos sanguíneos en el tumor. Por otro lado, el HA de
alto peso molecular de la matriz extracelular previene la replicación,
la migración y la diseminación metastásica de las células, e incluso
refuerza la actividad de los agentes anticancerosos . Además, las
células de muchos tejidos y órganos están densamente encapsuladas
por tejido conectivo y su matriz extracelular contiene cantidades
significativas de hialuronano. Las células de algunos tipos mueren y
se ven privadas de los factores específicos necesarios para la
supervivencia a medida que atraviesan la barrera del tejido conectivo.
Las células epiteliales están inmovilizadas debido a la adhesión
extracelular selectiva y al anclaje a la lámina basal, el límite entre el
epitelio y los compartimentos de tejidos circundantes. Además de
colágeno de diferentes tipos, la lámina basal contiene hialuronano.
Solo unos pocos tipos de células especializadas, es decir, macrófagos,
linfocitos y proyecciones ramificadas de neuronas (dendritas) pueden
cruzar esta barrera en condiciones normales. El papel de la HA no se
limita a la participación en la adhesión y la compartimentación de
células y tejidos [123-125]. El biopolímero también participa en el
mantenimiento del equilibrio dinámico de replicación celular
-apoptosis a través de los sistemas de señales de regulación [118].
Los sistemas de regulación en los vertebrados superiores son
ultraestables en el sentido cibernético. Están organizadas según el
principio de jerarquía y poseen una regulación de múltiples contornos,
lo que permite a las células buscar los estados más óptimos y estables
con un cambio de condiciones. A continuación se examinará el papel
que juega el hialuronano en la creación de estados óptimos y estables
y también en patologías asociadas con alteraciones en los sistemas de
señales, excedentes o deficiencias en la síntesis de HA y otros
glicosaminoglicanos.
2.2.5 La fuente de las propiedades funcionales del ácido

hialurónico y la dinámica de su síntesis y degradación
En cada tipo de célula, tejido y órgano humanos, la tasa de equilibrio de
síntesis y descomposición crea y mantiene los niveles fisiológicos normales
de concentración de sustancia. Esta regla biológica general también se aplica
al hialuronano. La regla está involucrada en el
apoyo de la homeostasis [126] y la organización oportuna de las
células [127] como un oscilador bioquímico, lo que provoca
oscilaciones no amortiguadas de concentraciones de macromoléculas
debido a la existencia de retroalimentación positiva y negativa en los
circuitos de transformaciones bioquímicas. La capacidad de HA para
formar estos modos de reacción de vibración (es decir, oscilatorios) se
discutirá en la siguiente sección.
El hialuronano está involucrado en muchos procesos biológicos y está
presente en casi todos los tejidos corporales de los vertebrados donde juega
un papel en la regulación de las actividades celulares. Acelera (o ralentiza) la
división celular, influye en la migración y participa en la reorganización de
la estructura de la cromatina y el cambio de genes. El hialuronano se localiza
en el núcleo, el citoplasma.
y la matriz intercelular, donde interactúa con receptores en la

superficie celular y proteínas de la matriz intercelular. La HA está
involucrada en el proceso de adaptación de una célula a la exposición
física y química, el proceso de fertilización, embriogénesis,
angiogénesis, inflamación, regeneración y crecimiento tumoral. Puede
exhibir propiedades aditivas, sinérgicas y antagonistas con
polisacáridos sulfatados relacionados y entre oligosacáridos de
hialuronano con diferentes pesos moleculares.
¿Cuál es la razón de tal variedad de propiedades fisiológicas y funcionales
del HA, a pesar de su estructura química relativamente simple que no sufre
modificaciones químicas posteriores a la síntesis ? Para aclarar esta cuestión,
examinaremos el metabolismo de HA a través de la cinética de síntesis y
degradación in vivo e in vitro. Debemos investigar cómo se modifican las
propiedades fisicoquímicas y las funciones fisiológicas relacionadas de los
oligosacáridos de hialuronano y por qué la familia de la hialuronano sintasa
(y sus genes correspondientes) son necesarias para la síntesis de
polisacáridos con un peso molecular diferente.
El hialuronano tiene una tasa diferente de síntesis y descomposición
en diferentes tejidos. Por ejemplo, la vida media de HA en la piel es de
24 a 48 h. Durante este tiempo, el 50% del hialuronano se descompone
y se sintetiza la misma cantidad. El período de vida media de los
proteoglicanos cutáneos, en comparación, es de varios días, y para el
colágeno cutáneo maduro puede ser de varios meses. Las proteínas de
la piel se regeneran por completo en aproximadamente 160 días.
Como se señaló anteriormente, la naturaleza creó un mecanismo
muy interesante de síntesis de hialuronano en las células eucariotas
que es diferente de otros glicosaminoglicanos. Los
glicosaminoglicanos sulfatados se sintetizan en el aparato de Golgi,
donde se unen covalentemente a las proteínas centrales, formando
proteoglicanos. Luego se empaquetan en vesículas y se secretan en la
matriz extracelular por el mecanismo de exocitosis. A su vez, el
hialuronano es sintetizado por hialuronano sintasas, que son
proteínas de membrana integradas en la membrana celular
citoplásmica. Estas enzimas agrandan la molécula de HA añadiendo
ácido glucurónico y N-acetilaminoglucosa, una tras otra, al
polisacárido inicial. Después del alargamiento, la cadena polimérica
se transfiere a través de la membrana a la matriz extracelular. El HA
se puede transportar al núcleo celular desde la matriz extracelular
mediante el mecanismo de endocitosis.
Tales direcciones opuestas de la síntesis y transporte de HA y
glucosaminoglucanos sulfatados deben tener sentido biológico. Una de las
hipótesis sugiere que al inicio del ciclo celular por los factores ambientales
agresivos, la célula interrumpe las síntesis de exportación, incluida la
síntesis de proteoglicanos para la matriz extracelular. Durante la
preparación para la división, muchas estructuras intracelulares que
sintetizan proteínas centrales para proteoglicanos, incluidas las membranas
intracelulares, sufren una descomposición parcial o completa. Al mismo
tiempo, la membrana citoplasmática y la síntesis de hialuronano por
hialuronano sintasas conectadas a la membrana se mantienen intactas.
Aparentemente son más resistentes a diferentes perturbaciones, porque en
condiciones tan extremas es necesario sintetizar HA a un ritmo creciente.
Esto se demostró en numerosos experimentos. El nivel creciente de HA
precede o coincide con los períodos de inicio del ciclo celular, división y
migración celular, inflamación, regeneración, angiogénesis o crecimiento
tumoral.
A diferencia de los glicosaminoglicanos sulfatados, la síntesis de

hialuronano no requiere la síntesis activa de la proteína. Las
hialuronano sintasas preexistentes como proteínas transmembrana
contienen un dominio citoplásmico en el que existen varios sitios,
objetivos para la fosforilación por las proteínas quinasas C y A. Los
compuestos, que aumentan la actividad de la proteína quinasa C (p.
Ej., Ésteres de forbol) y la proteína quinasa A, también aceleran la
síntesis de hialuronano. Así, se crea el mecanismo de regulación del

contenido de biopolímero por fosforilación-desfosforilación .
La preferencia por la síntesis de hialuronano no solo se debe al
supuesto aumento de la estabilidad del aparato de síntesis conectado a
la membrana , sino también a la activación de genes. Como se
describió anteriormente, existe una familia de tres genes que codifican
tres hialuronano sintasas. Durante la transformación de las células
diferenciadas en el ciclo celular, se activa el gen de la hialuronan
sintasa-2 . Esa hialuronano sintasa sintetiza un polisacárido particular
con una masa molecular de hasta 2 000 000 Da. El gen de la
hialuronano sintasa-3, que sintetiza las cadenas de hialuronano más
cortas, está activo en las células diferenciadas y se suprime durante la
transformación en el ciclo celular. Estas conclusiones se han elaborado
a partir de datos experimentales obtenidos por el método de PCR que
describen las correspondientes modificaciones en el ARNm de la
hialuronano sintasa 1, 2 y 3 a partir del modelo de regeneración del
daño de la monocapa de las células mesoteliales humanas. [56]. No se
encontró expresión de ARNm para la hialuronano sintasa-1 , ni en el
control ni en los cultivos dañados (hasta 40 divisiones celulares). Esta
enzima realiza la síntesis de HA con el peso molecular más alto, que
probablemente sea necesario para la preservación del estado
diferenciado de las células in vivo. Tal sistema de actividad genética
ajustable diferencialmente en los niveles de transcripción, traducción
y síntesis a diferentes velocidades y diferentes valores de pesos
moleculares indica que el hialuronano juega un papel clave en la
selección y determinación del estado de la célula y sus propiedades de
adaptación.
Una alta tasa de síntesis de HA también corresponde a una alta tasa
de biodegradación. El hialuronano puede ser degradado por la familia
de enzimas hialuronidasas. En el cuerpo humano, se han encontrado
al menos siete tipos de hialuronidasas. Su síntesis está controlada por
genes correspondientes y sus actividades están reguladas por
numerosos factores, incluidas las hormonas (Figura 2.12).
El mecanismo de acción de la hormona vasopresina de la glándula
pituitaria se basa en la activación de la hialuronidasa [2]. Uno de los
rasgos característicos de las hialuronidasas es
formación de los oligosacáridos con diferentes pesos moleculares y
diferentes propiedades funcionales. Por ejemplo, HA con un peso
molecular superior a 500 000 Da suprime la proliferación de células, la
migración y la angiogénesis. Por el contrario, los productos de
despolimerización con un peso molecular de 50 000 a 100 000 Da
estimulan la proliferación y la migración de las células. Los
oligosacáridos con un peso molecular de 30 000 Da y menos estimulan
la angiogénesis (proliferación de células endoteliales y formación de
capilares) así como la inflamación. Se señaló anteriormente que el
tetrasacárido HA es capaz de activar varias proteínas en condiciones
de choque térmico y muerte celular lenta [106]. También se descubrió
que los fragmentos de HA - tetra y hexasacáridos - provocan la
maduración del inmunofenotipo de las células dendríticas de los
monocitos humanos [128]. El efecto de la activación de las células
dendríticas por tetra- y hexasacáridos es muy específico, ya que no
puede ser iniciado por los oligosacáridos HA con pesos moleculares de
80 000 a 200 000 y 600 000 a 1 000 000 Da. Es importante que otros
glicosaminoglicanos, como el condroitín sulfato y el heparán sulfato y
sus productos de fragmentación, no tengan tal efecto de activación.
Se ha demostrado que la expresión de CD44, que es el principal receptor
celular del hialuronano, no es necesaria para revelar los efectos de la
"maduración" de las células dendríticas bajo la influencia de pequeños
fragmentos de HA de 4-16 oligosacáridos. Esta conclusión está de acuerdo
con los resultados de la investigación sobre inflamación y curación de
heridas. Pequeños 3-10 fragmentos de oligosacáridos del biopolímero
aceleran la neoangiogénesis durante la cicatrización de heridas en las
primeras 48 a 72 h. Alto

Activadores Sustratos Inhibidores

Ácido glucurónico, Hormonas
Hormonas sulfato de condroitina,
(ACTH, cortisona)

(tiroides, somatotropina) sulfato de dermatán
y sus oligosacáridos Proteinas
(hexasacáridos y más) (glicoproteínas,
albúminas de plasma,

β-lipoproteínas, pepsina,
tripsina)
Mediadores de • n • ammation Salicilatos, magnesio
(histamina, serotonina) Hialuronidasa
sales, óxido de cuprum, yodo,

peróxido de hidrógeno,
cianuros, sulfamidas

Polisacáridos
(heparina (en alto
Cisteína concentraciones),
protamina sulfato de condroitina)

Sulfato de dermatán

Sulfato de dermatán
Condroitín sulfato B

Glucosamina sulfatada
Figura 2.12 Sustratos, activadores e inhibidores de hialuronidasa
El HA de peso molecular no afecta la angiogénesis, pero a alta

concentración incluso la suprimiría. Se concluyó que solo los
fragmentos de polisacárido de 10-16 unidades de disacárido activan las
células dendríticas y solo los fragmentos que comprenden más de 6-10
oligosacáridos pueden unirse con CD44 en las células endoteliales o
queratinocitos. Otros receptores HA, distintos de CD44 y RHAMM, no
participan en la inducción de la maduración de las células dendríticas
por los fragmentos pequeños, porque no se encontraron ni ARNm ni
RHAMM de proteína en las células dendríticas humanas. Estos datos
sugieren que los pequeños fragmentos de polisacárido creados en las
zonas de inflamación activan las células dendríticas in vivo , migrando
dentro o fuera del tejido inflamatorio, estimulando y apoyando la
respuesta inmune.
Sin embargo, otro estudio presentó resultados diferentes [129]. Los
oligosacáridos con un peso molecular de 1300 a 4500 Da (3-10
unidades de disacáridos) provocaron la proliferación de las células
endoteliales aórticas. La fracción de alto peso molecular no provocó
tal efecto. Los oligosacáridos con un peso molecular de 1300 a 7200 Da
(3-16 unidades de disacárido) inhibieron definitivamente la
proliferación de las células del endotelio normal, pero no influyeron
en la proliferación de los fibroblastos normales o de las células
normales del músculo liso . El HA con un peso molecular de 1 100 000
Da estimula la proliferación de fibroblastos humanos, pero los
polisacáridos con un peso molecular de 860 000 Da activan las células
epiteliales de la córnea. El hialuronano con un peso molecular de 400
000 a 1 000 000 Da suprimió la proliferación de las células endoteliales
normales, mientras que un polímero con un peso molecular superior
a 1 000 000 Da inhibió la proliferación de fibroblastos 3T3 de rata y
células sinoviales de conejo. Estos efectos dependen de la
concentración. En concentraciones inferiores a 1 mg / ml lo mismo
La fracción HA estimuló la proliferación de ambos tipos de células. Tales

diferencias en estos resultados experimentales, que a menudo se observaron
con formas similares de productos de HA, podrían estar relacionadas con
diferentes concentraciones de HA por la presencia de impurezas (p. Ej.,
Glucosasminoglicanos sulfatados), así como diferencias en la expresión,
cantidad y sensibilidad de los receptores de hialuronano en la membrana
celular citoplásmica. Otro ejemplo interesante es el modelo de angiogénesis.
Los resultados obtenidos en un modelo de este tipo podrían interpretarse sin
ambigüedades. Se demostró que los oligosacáridos HA con 4-20 unidades de
disacáridos estimulan el crecimiento capilar in vivo, pero in vitro inducen la
proliferación de células endoteliales, su migración y las etapas iniciales de
formación de vasos sanguíneos. Sin embargo, no se establecieron los límites
de peso molecular que causan o inhiben los efectos de la angiogénesis. Se
realizaron varios intentos de estudiar los efectos directos o indirectos sobre
la angiogénesis, pero los mecanismos precisos de tales procesos siguen sin
estar claros. Al mismo tiempo, la fenomenología establecida indicó
claramente que la variedad de funciones de HA se produce no solo por la
diversidad de los genes de la hialuronano sintasa y los polímeros de los
diferentes pesos moleculares que producen, sino también por una matriz de
sus productos de descomposición. La variedad de funciones de HA se
correlaciona fuertemente con la variedad de productos de descomposición
del polisacárido, que tienen diferentes propiedades funcionales importantes
en el organismo vivo.
Aunque la intensidad del intercambio de glicosaminoglicanos es
significativamente mayor que la intensidad del intercambio de
proteínas, los científicos señalan, no obstante, la fuerte relación entre
la intensidad de los glicosaminoglicanos y el colágeno [65]. Esta
relación se mantiene incluso en el caso de la máxima intensidad del
intercambio de glicosaminoglicanos y colágeno en el comienzo de la
ontogénesis y el período de formación de las estructuras tisulares. El
efecto más estudiado es la dinámica de intercambio (síntesis -
descomposición) de glicosaminoglicanos y colágeno en la matriz del
cartílago, donde una gran cantidad de las cadenas de
glicosaminoglicanos sulfatadas se unen covalentemente con la
proteína del eje para formar proteoglicanos. A su vez, los
proteoglicanos están asociados con el hialuronano en los complejos
supramoleculares de alto volumen (Figura 2.13). Esta estructura podría
incluir más de cien monómeros de proteoglicanos, unidos de forma
no covalente a la única molécula de HA. Dicho complejo se estabiliza
mediante proteínas de enlace unidas a la proteína central de
proteoglicano y hialuronano. El complejo supramolecular llamado
agrecano puede tener un peso molecular superior a 10 8 Da y puede
ocupar un volumen igual al volumen de una célula bacteriana.
Aggrecan es el principal elemento estructural de la matriz del cartílago
[41].
En estado libre, los glicosaminoglicanos sulfatados prácticamente nunca se
encuentran, pero aparecen en condiciones patológicas. Como se mencionó
anteriormente, el sulfato de condroitina y la glucosamina sulfatada
estimulan la síntesis de proteoglicanos y colágeno en el tejido cartilaginoso,
lo que influye en la proliferación de condrocitos [66,67]. De manera similar a
HA, se pueden observar muchas características funcionales
dependientes de la concentración . Con cantidades elevadas de
glicosaminoglicanos libres en los medios de cultivo (150-200 mcg / ml), se ha
encontrado inequívocamente la supresión de la proliferación de condrocitos,
pero al mismo tiempo aumentó la producción de proteoglicanos y colágeno
por los condrocitos [65]. En concentraciones inferiores a 10 mcg / ml, el
mismo producto acelera la proliferación de condroicitos, pero no influye en
la síntesis de colágeno y proteoglicanos. Este es un excelente ejemplo de las
relaciones competitivas de proliferación y diferenciaciones: a medida que las
células comienzan a dividirse, dejan de sintetizar proteínas extracelulares.
Muchas propiedades funcionales de los glicosaminoglicanos se manifiestan

en la capacidad de los glicosaminoglicanos para suprimir la actividad de las
enzimas que participan en la destrucción de la matriz celular del tejido
conectivo. Suprimen la actividad de la hialuronidasa y los granulocitos.
G3

Núcleo

de proteína
Sulfato de condroitina
G2
Sulfato de queratán
Ácido hialurónico G1
Proteoglicano
monómero
Proteína de enlace
Ácido hialurónico
región de unión (G1)
Figura 2.13 Participación de hialuronano en la formación de complejos

supramoleculares de agregado de proteoglicanos. G1, G2 y G3 son regiones
plegadas globulares de la proteína del núcleo central [41]. Reproducido de [41].
Oficina Internacional del Trabajo, Ginebra
elastasas [69,70], colagenasas [71], lisosomas hidrolasas y serina proteasas

[72], así como otras enzimas [59,74]. Hay datos sobre la estimulación de la
cicatrización de heridas por los proteoglicanos del cartílago [130,131] y otros
productos de descomposición del sulfato de condroitina con un peso
molecular de 4000 Da [132]. Los productos de descomposición del colágeno
(péptidos) también activan la síntesis de colágeno por los fibroblastos. La
acción de los péptidos puede ejercerse a través de receptores específicos de
moléculas de colágeno y péptidos que se encuentran en las membranas de
los fibroblastos [133].
Los productos finales de la descomposición se pueden utilizar como
materiales de partida o precursores para la síntesis de sustancias
fisiológicamente activas. Por ejemplo, los azúcares podrían ser los
precursores de la síntesis de azúcares nucleotídicos, aminoácidos de ciertas
enzimas, etc. Es obvio que múltiples productos de la descomposición de
biopolímeros, debido a la adquisición de nuevas propiedades funcionales,
intentan 'regenerar' el estado inicial del tejido celular o formar un nuevo
estado estacionario. Este es un ejemplo de la manifestación biológica del
principio general, que se conoce en química como el principio de Le
Chatelier. Obedecer este principio de los sistemas vivos químicos y
no lineales (no linealidad significa que existen varios grados de libertad en el
desarrollo del proceso biológico) que poseen una regulación de
múltiples contornos (sistema de transferencia de un estado a otro) asegura la
transferencia de el sistema biológico de un estado estacionario a otro cuando
las condiciones han cambiado.
En condiciones difíciles, cuando una célula no puede volver al estado

inicial o transferirse a otra condición estacionaria, una célula puede entrar
en un proceso catalítico de apoptosis en cadena. Se trata de una degradación
celular controlada con una característica activación en cascada de enzimas
hidrolíticas. El grupo de genes que codifica la familia de proteasas (kaspasas)
juega un papel clave en el proceso de apoptosis.
mediante la activación en cascada de una enzima por otra. Propiedades

similares son características de la familia de enzimas de las hialuronidasas.
Su concentración está regulada a nivel genético por el cambio en la actividad
de los genes correspondientes y a nivel metabólico por glicosilación de los
fragmentos conservadores específicos en diferentes hialuronidasas [134].
Para resumir estos resultados mencionados, es posible sugerir que una parte
considerable de los productos de descomposición celular, como fragmentos
de polisacáridos, polipéptidos y polinucleótidos, adquieren nuevas
propiedades fisiológicas que permiten la recuperación de los sistemas
biológicos.
¿Cuáles son los posibles mecanismos de recuperación? Uno podría
ser la activación o inhibición de la síntesis y actividad de la enzima.
Los fragmentos de biopolímeros de bajo peso molecular
probablemente pueden crear un "campo de información" para los
sistemas reguladores activando receptores específicos y / o formando
una matriz extracelular temporal.
La descomposición de los complejos proteína-carbohidrato en la matriz
extracelular es catalizada principalmente por lisosomas hidrolasas. En
condiciones normales, los glicosaminoglicanos sulfatados están conectados
por enlaces covalentes con proteínas centrales y prácticamente no se
presentan en estado libre. Sin embargo, en condiciones patológicas donde el
equilibrio de síntesis-descomposición en la matriz extracelular se desplaza
hacia la descomposición, aparecen fragmentos de hialuronano libre y
glicosaminoglicanos sulfatados que pueden revelar propiedades únicas
adicionales. Los fragmentos suprimen las actividades de diferentes enzimas
que participan en la descomposición de la matriz extracelular:
hialuronidasas, elastasas, colagenasas, serina proteasas, pepsina, hidrolasas
lisosómicas, catepsinas ácidas y otras enzimas. Suprimen la apoptosis
celular, neutralizan la acción de los radicales libres y ayudan a acelerar la
cicatrización de heridas. Por ejemplo, la hialuronidasa de la matriz
extracelular de la piel es capaz de hidrolizar los sulfatos de dermatán
además del hialuronano. A una cierta concentración de fragmentos libres,
los sulfatos de dermatán suprimen la actividad de la hialuronidasa (Figura
2.12), formando así una cadena reguladora que controla la actividad
enzimática.
Los productos intermedios de la descomposición de los biopolímeros
son participantes activos del sistema de señalización celular.
Obviamente, esto también es característico del hialuronano. Los
fragmentos de polipéptidos a menudo poseen actividad hormonal. La
descripción más completa de la descomposición de proteínas
hormonales, que da como resultado una serie de péptidos hormonales,
se describe en
[135]. En la descomposición de la proteína del núcleo (histona H4), se
crea un octapéptido con claras propiedades opioides. Los productos
monoméricos de la descomposición de biopolímeros podrían
reutilizarse en nuevos polímeros o en síntesis de hormonas.
Otra área poco estudiada es el uso de fragmentos de biopolímeros
intermedios en la construcción de las estructuras de transición. La matriz
intercelular es una zona de macromoléculas autoensambladas que se
exportan desde la célula. Se ha declarado una conexión entre la matriz
extracelular y el sistema de microfilamentos y microtubos de la matriz
intracelular a través de proteínas transmembrana y su influencia mutua.
Pero dado que la matriz extracelular está involucrada en la transducción de
señales, las rutas de las señales entre la matriz extracelular y las células
juegan un papel dominante en la selección de la dirección de adaptación
celular según las variaciones ambientales. La descomposición de HA por
hialuronidasa de la matriz extracelular, así como la descomposición de
glicosaminoglicanos sulfatados y proteínas por el
corresponding- enzimas, que probablemente conduce a la
formación de la matriz temporal que se basa en los fragmentos
intermedios. Esta matriz temporal es capaz de transferir señales.
Además, su funcionamiento puede transferir una celda a otro estado
estacionario. Durante la descomposición fraccionada del biopolímero,
es posible que se produzca la formación de estructuras
tridimensionales multinivel de la matriz extracelular hasta
cristalino líquido . El esquema sugerido de la formación de la matriz
temporal intermedia se presenta en la Figura 2.14.
HA hidratada de alto peso molecular

Fragmentos de HA
Hialuronidasa
yo

300 nm
Proteína
Proteoglicano
Hidrolítico
enzimas Temporal
II DECIR AH Cristal liquido

matriz

Unión
proteinas Glucosaminoglicanos
Colágeno ??? brils Colagenasa Colágeno

III
fragmentos
300 nm Fragmentos de colágeno

Figura 2.14 Hitos posteriores del remodelado de la matriz intercelular durante la

posición de descomposición de hialuronano (I), proteolicanos (II) y proteínas (III)
La autoorganización de HA en diferentes estructuras tridimensionales en
presencia y ausencia de las sales se ha demostrado experimentalmente
[128,136]. El HA puede formar hélices de diferentes estructuras,
dependiendo de su peso molecular, composición de disolvente iónico y
contenido de agua (esto se discutirá en detalle en el Capítulo 4). Se sugiere
que incluso una doble hélice puede existir bajo ciertas condiciones
conformacionales [137]. En soluciones acuosas, HA adopta una
conformación con enlaces de hidrógeno entre cadenas. Las características de
dispersión de la luz muestran que la molécula se comporta como una cadena
con bandas al azar y empaquetada de forma bastante suelta con un radio de
curvatura de 200 nm. El nivel de empaquetamiento y rigidez de la cadena
está asociado con la presencia de enlaces de hidrógeno internos. Finalmente,
la macromolécula de hialuronano podría aproximarse como una esfera
altamente hidratada. En solución acuosa, la viscosidad del HA tiene valores
máximos como resultado de su conformación más extendida. Cuando
aumenta la concentración de HA en solución acuosa, la viscosidad también
aumenta rápidamente debido al tejido de la cadena y la formación de una
red tridimensional . Así es como se forma la estructura similar a un gel . La
adición de las sales a soluciones acuosas reduce drásticamente su viscosidad.
El hialuronano es un polímero altamente hidrofílico. Cada dímero contiene
un grupo carboxilo que se disocia al pH fisiológico (7,0 a 7,4), lo que mejora
aún más el carácter polianiónico del polisacárido. El polianión puede unir
una cantidad considerable de cationes metálicos como sodio, potasio, calcio,
magnesio y otros debido a su capa de hidrato. Como resultado, la molécula
de hialuronano puede incrementarse en volumen 1000 veces y formar 1000
matrices hidratadas débilmente empaquetadas. La comprensión de las
características de tales características fisicoquímicas aclara el papel
fisiológico del hialuronano. Los sistemas vivos utilizan propiedades de
polisacáridos como elasticidad, viscosidad, propiedades reológicas (relleno
de volumen y lubricación de las articulaciones), presión osmótica (el tampón
osmótico se utiliza para mantener la homeostasis tisular), barrera de
difusión (diferentes velocidades de difusión del tamaño diferente
moléculas), resistencia al flujo (una red de cadena gruesa retrasa el

flujo de fluido) y volumen excluido (una red tridimensional de
cadenas de HA desplaza otras macromoléculas).
Se cree que el hialuronano es capaz de existir tanto en la matriz
extracelular como en la superficie celular en una cantidad
increíblemente grande de estados conformacionales que incluyen
cadenas alargadas, hélices, espirales 'flojas', 'clips' y estructuras
condensadas en forma de varilla . Al interactuar entre sí, las cadenas
de HA forman fibrillas, redes, pilas y otras formas [47,123,137,138]. En
la solución fisiológica se pueden formar las hélices rígidas. Su tamaño
es aleatorio y podría tener una media de 2,5 mcm (longitud del
perímetro) en cada cadena con un peso molecular de 1 millón de Da.
Dichas cadenas contienen aproximadamente 2650 fragmentos de
disacáridos. Los enlaces de hidrógeno secundarios se forman a lo largo
del eje del polisacárido. Aseguran la estabilidad y ayudan a formar
dominios hidrofóbicos. Debido a estos enlaces, HA se organiza en
estructuras ordenadas.
Los polisacáridos naturales de diferentes fuentes tienen pesos moleculares
que oscilan entre 5000 y 10000000 Da. El biopolímero del líquido sinovial
humano, por ejemplo, tiene un peso molecular medio de 3 140 000 Da. La
macromolécula de HA es energéticamente estable debido a la
estereoquímica de los disacáridos constituyentes. Los sustituyentes
voluminosos de los anillos de piranosa se encuentran en las posiciones
estéricamente favorables, mientras que los átomos de hidrógeno ocupan una
posición axial menos favorable (véase el capítulo 4). Obviamente, debido al
hecho de que el HA en el cuerpo no está sujeto a modificaciones químicas
adicionales después de la síntesis, los grupos funcionales permanecen
intactos.
La variedad de estados conformacionales de HA - sus propiedades
físico-químicas - dependen de la longitud de la cadena, los iones
circundantes y el pH del medio, y se unen con otros componentes celulares
para formar un amplio espectro de propiedades fisiológicas, funcionales y
biológicas del biopolímero. . Como se mencionó anteriormente, el
hialuronano puede revelar funciones biológicas opuestas según el tamaño de
la macromolécula. Los oligosacáridos de hialuronano de bajo peso molecular
pueden funcionar como señales de alarma endógenas y, dependiendo de su
peso molecular, pueden iniciar diferentes vías de señalización. La capacidad
de los fragmentos de HA de bajo peso molecular para unirse con el receptor
CD44 en la membrana celular plasmática es un hecho probado
experimentalmente. Numerosos datos indican un amplio espectro de
actividades funcionales específicas de HA que dependen del tamaño [47]. En
particular, los fragmentos de hialuronano de bajo peso molecular influyen
en la expresión de la proteína de choque térmico [106]. Los oligómeros con
4-20 unidades de disacáridos estimulan el crecimiento capilar y también
participan en el control de la homeostasis celular [126].
La hialuronidasa testicular hidroliza el biopolímero en 4, 6, 8, 10, 12,
14, 16, 18, 20 y otros fragmentos de disacáridos [139]. Los disacáridos
son capaces de cristalizar y otros oligosacáridos pueden formar
estructuras líquido-cristalinas . Así, los fragmentos de bajo peso
molecular de todos los biopolímeros (hialuronano, ácido nucleico,
proteínas polifosfato y otros biopolímeros policatiónicos y
polianiónicos) pueden formar estructuras biológicas
líquido-cristalinas con estados intermedios, adquiriendo nuevas
propiedades funcionales [140-143].
2.2.6 Las reglas de la división funcional de biopolímeros

A modo de resumen, podemos formular las siguientes reglas de
formación consecutiva de las nuevas funciones durante la
descomposición del biopolímero:
Regla 1. Bajo la escisión controlada de los biopolímeros, se forman
nuevos oligómeros con nuevas propiedades funcionales.
Regla 2 . En la escisión funcional de los biopolímeros están implicados
los mecanismos en cascada de la despolitización.
Regla 3 . Tras la despolimerización del biopolímero, podrían

producirse nuevos productos con funciones antagónicas.
Regla 4 . Las nuevas propiedades funcionales de los productos de
escisión intermedia están destinadas a la restauración del sistema
biológico (principio de Le Chatelier en biología).
Los aspectos médicos importantes de la investigación, el aislamiento
y el uso de productos intermedios de degradación de biopolímeros en
medicamentos han surgido de estas generalizaciones. En particular, los
productos de la degradación del hialuronano in vivo se consideran
productos naturales bioactivos.
[139]. Después de la escisión de los proteoglicanos, el sulfato de
condroitina libre previene la destrucción del marco de colágeno de la
matriz extracelular y apoya la formación de una matriz temporal a
partir de colágeno parcialmente degradado. La creación de una
matriz temporal con la ayuda de glicosaminoglicanos sulfatados sirve
para detener su deterioro adicional y asegura su sustitución más
rápida por la matriz extracelular regular [65].
Bajo exposición severa a radiación gamma, polipéptidos y fragmentos de
ADN circularon en la sangre de los liquidadores de Chernobyl durante
bastante tiempo. Según los datos de diversas fuentes, la concentración de
fragmentos de hialuronano en el suero sanguíneo osciló entre 0,01 y 0,10
mcg / ml. Se estima que la vida media de la HA endógena es de 2.5 a 5.5 h. El
HA marcado radiactivamente, inyectado en la sangre de los animales, se
destruye con bastante rapidez en el hígado. La excreción de HA endógena se
produce a través de los riñones. Los productos de descomposición de los
biopolímeros en los tejidos han sido denominados citoproteínas, hormonas
tisulares o estimulantes biogénicos por muchos autores, y están implicados
en la regulación de diferentes sistemas celulares a nivel regional. Este tipo de
autorregulación se basa en la retroalimentación entre la descomposición y
síntesis de moléculas y células, tanto en condiciones fisiológicas como
patológicas [144]. Los péptidos están implicados en la regulación en todos los
niveles de funcionamiento del cuerpo, debido a la multifuncionalidad es un
rasgo característico de péptidos bio-reguladores [145,146]. Se supone que los
péptidos cortos pueden participar en la regulación de la apoptosis / necrosis
[147]. La evidencia acumulada hasta la fecha sugiere que esta
multifuncionalidad es inherente a los oligosacáridos de hialuronano y otros
glicosaminoglicanos que se convierten en productos naturales bioactivos
[106,137,139].
Así, los fragmentos oligoméricos de polímeros naturales están

implicados en la regeneración de células y tejidos mediante la
activación de la síntesis de nuevos polímeros, la creación de matrices
temporales, el retraso de la apoptosis celular y la citólisis y la
activación de la proliferación celular. Muchas células que no crecen
en condiciones normales comienzan a proliferar después de la lesión
de órganos y tejidos, después de la división de diferentes biopolímeros
y la acumulación de sus fragmentos oligoméricos. Todos estos
mecanismos están diseñados para restaurar los sistemas biológicos,
ayudar a su adaptación a nuevas condiciones y formar un nuevo
estado estacionario del sistema.
2.3 Sistemas de señalización hialuronanos
Se ha determinado que algunas células comienzan a agregarse después de la

adición de hialuronano. La observación de la agregación fue la primera
indicación de que la macromolécula de polisacárido puede unirse a la
superficie celular. En la actualidad, se han aislado varios receptores de
proteínas, que se unen específicamente a biopolímeros en la superficie de la
membrana citoplasmática. Estos tienen una alta afinidad por los receptores
de HA CD44 y el receptor de motilidad mediada por HA (RHAMM) [123]. Otro
receptor para la endocitosis de hialuronano se encontró en la membrana de
las células endoteliales del seno hepático. Se diferencia significativamente de
otros
proteínas capaces de unirse con hialuronano. Para comprender sus

diferencias, debemos examinar la organización y el funcionamiento
del sistema de señales celulares y cómo pueden, por ejemplo,
transferir señales hormonales [41,148].
Las hormonas actúan sobre las células diana uniéndose a los
receptores apropiados. Por su naturaleza química, los receptores son
proteínas y suelen contener varios dominios. los
de la concentración de hormonas en el líquido extracelular es
muy baja, en el intervalo de 10 -6 -10 -11 mmol / l. Por eso es importante que
las hormonas y otras moléculas de señalización tengan una alta afinidad por
los receptores. Para los bien estudiados hormonas, la constante de
disociación (K D ) de su receptor complejo es por lo general en el intervalo de
10 -8 - 10 -10 M y baje [149]. La localización de los receptores es diferente. Los
receptores de las hormonas peptídicas y de la adrenalina se encuentran en la
membrana citoplasmática, mientras que los receptores de las hormonas
esteroides y tiroideas se encuentran en el citosol (glucocortioides) o en el
núcleo celular (estrógenos, andrógenos y enzimas tireoides). Los receptores
de membrana tienen tres dominios funcionalmente diferentes. El primer
dominio es responsable del reconocimiento y está ubicado en la parte
N-terminal de la cadena polipeptídica en la parte externa de la membrana
celular. Suele estar glicosilado y asegura el reconocimiento y la unión de
hormonas. El segundo es un dominio transmembrana que contiene uno o
varios fragmentos de hélice alfa de la cadena polipeptídica. El tercer dominio
se encuentra en el citoplasma y crea una señal química dentro de la célula.
Este dominio debe asociar el reconocimiento de la hormona unida en el lado
externo de la membrana con la respuesta celular apropiada, o en otras
palabras, cambiar la cantidad y / o actividad de las enzimas por su
modificación química (por ejemplo, fosforilación - desfosforilación). La
unión de hormonas u otras moléculas de señalización (mediadores
primarios) altera la conformación del receptor. La alteración luego se
transmite a otras macromoléculas en la membrana o en el citosol, lo que
lleva a la conjugación de una molécula con otra en un proceso llamado
transducción de señales. Como resultado, se genera una señal, ya sea
directamente o mediante mediadores secundarios (monofosfato de
adenosina cíclico, Ca 2+ , NO, etc.). Regula la respuesta celular modificando la
actividad de las enzimas o la cantidad de enzimas y otras macromoléculas.
Por tanto, existen vías de señalización directa desde la superficie celular
hacia el citoplasma y el núcleo. La activación o inhibición de la actividad
génica, síntesis enzimática, proliferación celular, apoptosis, migración y
diferenciación de células se produce a través de estos reguladores.
circuitos. El hialuronano participa en estos procesos al unirse al

receptor de membrana CD44. La estructura del receptor se muestra en
la Figura 2.9.
Cuando se añade HA exógena de alto peso molecular a fibroblastos
transformados muy activos, la actividad motora de las células se
reduce drásticamente por la unión del polisacárido a los receptores
CD44 [150]. Si el fragmento de la proteína CD44, que se encuentra en la
superficie de la membrana citoplasmática y se une específicamente
con HA, pudiera ser escindido por la proteasa unida a la membrana ,
entonces el circuito de señal se rompería y la actividad de migración
de las células cambiaría. [151]. A través del mismo receptor CD44, el
hialuronano afecta la apoptosis celular y la respuesta inflamatoria
[152]. Se supone que, como receptor de las células endoteliales y los
queratinocitos, el CD44 puede unirse al menos de 6 a 10 moléculas de
hialuronano de oligosacárido de longitud [128]. La movilidad celular
está influenciada por otro receptor HA, a saber
RHAMM .
También se ha encontrado otro receptor específico para la
endocitosis de hialuronano, que ha indicado que el HA puede ser
transportado desde la matriz extracelular al interior de la célula
mediante métodos particulares denominados " endocitosis
mediada por receptor" o "endocitosis por absorción". Las
macromoléculas (ligandos) se unen a receptores específicos en la
superficie celular. Entonces el
El complejo ligando-receptor crea un grupo en el área donde se forma

una vesícula de endocitosis (endo- algunos) para ser transferida más
al interior de la célula. Este método de transporte de macromoléculas
específico es mucho más rápido que el transporte debido a la
endocitosis en fase líquida. Además, la endocitosis mediada por
receptores es un mecanismo de concentración selectiva de los
compuestos de señalización, que implica su captura y transferencia
dentro de la célula. Así es como varias hormonas, incluida la insulina,
los polipéptidos y el colesterol, se transfieren al interior de la célula
[153,154]. Recientemente se descubrió que el HA, que tiene un
receptor específico en la superficie de la membrana citoplasmática, se
transfiere por el mismo mecanismo. La endocitosis mediada por
receptores suele conducir a la transferencia de moléculas
intercelulares a los lisosomas. Es posible que las moléculas de
señalización de proteínas y polisacáridos, o los productos de su
división, actúen más dentro de la célula de manera similar a las
hormonas esteroides o tiroideas. Los tetrasacáridos de hialuronano
probablemente actúan en la activación de las proteínas de choque
térmico utilizando el mismo mecanismo [106].
Además de las funciones estructurales y de intercambio iónico en la
organización de la matriz extracelular y su hidrodinámica, el
hialuronano participa en rutas de señalización que regulan la
activación, proliferación, migración, adhesión, diferenciación y
apoptosis celular. Para realizar estas fracciones, HA coopera con
grupos de proteínas llamadas hialedrinas.
Las hialhedrinas podrían dividirse en tres tipos: (1) proteínas
solubles, (2) proteínas que unen hialuronano con otros polímeros de
la matriz extracelular y (3) proteínas, que actúan como receptores de
la membrana celular para el hialuronano. Se conocen bien dos
receptores, hialhedrinas CD44 y RHAMM. El receptor principal en la
superficie celular, es decir, CD44, tiene una afinidad muy alta por los
biopolímeros y se expresa en diferentes tipos de células, incluidos
fibroblastos, células epiteliales y algunas endoteliales, queratinocitos y
otras. La figura 2.15 muestra esquemáticamente HA
Hialuronidasa
La matriz extracelular
HMW HA
(HA de alto peso molecular) HA de bajo peso molecular
Erb 2
Src
CD44 Cascada PKC
Ras Pho UN
Hialuronano sintasa

RAS

C
UDP-acetilglucosamina PMAP-quinasa Real academia de bellas a
Cascada PKS

Ácido UDP-glucurónico cascada
Suministros
resión de gen NF-KB | 1K-B
transcripción
Activación genética Citosol

ADN
Agrecanasa-2 HSP-72
Núcleo
IL-8, TNF-α HSF-1
Figura 2.15 Esquema de señalización de transformación de hialuronano a través
del receptor CD44 y en la célula, núcleo y sistema genético
vía de señalización mediada por receptores CD44. La unión de hialuronano

con CD44 puede causar una cascada de señales que afectan la activación de
la transcripción de genes, desactivando el grupo de genes de "diferenciación"
y activando el grupo de genes de "proliferación". Esto puede cambiar el
citoesqueleto celular y provocar una alteración de la actividad migratoria de
las células. La composición del citoesqueleto podría modificarse a través de
la ruta de la señal con la participación de los factores Rac- y RhoA. La
cascada de señalización a través de las proteínas quinasas C y MAP-quinasas
puede estar involucrada con la expresión génica dentro del núcleo. Las
proteínas quinasas participan en la modificación química de enzimas, es
decir, en el proceso de fosforilación o desfosforilación de polipéptidos. En
respuesta a la fosforilación-desfosforilación, la enzima se activa o desactiva
[41]. En particular, las hialuronano sintasas, que son proteínas
transmembrana ubicadas en la membrana celular, contienen dominios
citoplásmicos con sitios que son objetivos para la fosforilación por las
proteínas quinasas C y A. Estimulación de la actividad de las proteínas
quinasas A y C (por ejemplo, los ésteres de forbol activan la proteína quinasa
C ) también conduce a la activación de la síntesis de hialuronano.
Probablemente la síntesis de polisacáridos de diferentes pesos moleculares
esté regulada a través del mecanismo en cascada, mediado por el receptor
CD44. El receptor de HA está asociado con diferentes procesos celulares,
incluida la proliferación, el movimiento y la asociación celular, así como la
degradación y reutilización de HA . El receptor RHAMM se localiza en la
superficie de la membrana celular, así como en el citosol y en los núcleos de
diferentes células. Por eso, el receptor puede participar en la endocitosis de
hialuronano. RHAMM participa en la regulación de la respuesta celular a la
estimulación de factores de crecimiento y desempeña un papel en la
migración celular, especialmente de fibroblastos y células de músculo liso.
En la bibliografía se describen otras vías de transducción de señales

iniciadas por hialuronano. Los fragmentos de HA de tamaño mediano con un
peso molecular máximo de 200 000 Da, así como los fragmentos compuestos
por seis oligosacáridos, activan los macrófagos alveolares de ratón al mediar
otra ruta denominada NfkB / IkB [128]. Al mismo tiempo, también se
mejoran la síntesis de ARNm, la secreción de proteínas hemocrinas y la
inducción de NO-sintasa . Existe evidencia de que la transducción de las
señales de inflamación por los productos de degradación del hialuronano se
realiza a través de los receptores TLR 2 o TLR 4, o a través de ambos
receptores en los macrófagos y las células dendríticas. Se cree que estos
receptores tipo toll (TLR) pertenecen al sistema inmunológico innato.
La mayoría de los receptores de superficie, que son activados por ligandos
de señales extracelulares, producen señales intracelulares mediante uno de
dos métodos básicos: (1) alteran la actividad de la adenilato ciclasa unida a la
membrana, que, a su vez, cambia la concentración del mediador
intracelular. monofosfato de adenosina cíclico (AMPc), o (2) afectan la
permeabilidad de los canales iónicos, lo que da como resultado cambios en el
potencial de membrana y el intracelular
de la concentración de Ca 2+ iones. También es posible una
combinación de estos dos métodos. El monofosfato cíclico de
adenosina y el catión bivalente de calcio se denominan mediadores
intracelulares secundarios (mensajeros). El aumento de la
concentración de AMPc activa aún más las proteínas quinasas
intracelulares, que fosforilan varias enzimas en las vías metabólicas,
aumentando o disminuyendo su actividad [155-158]. Estas reacciones
tienen una vida corta porque las enzimas específicas
(fosfodiesterasas) destruyen rápidamente cualquier exceso de cAMP.
Otro mensajero secundario de los sistemas de señalización es el
catión Ca 2+ . La apertura de los canales de calcio en algunas células
secretoras libera iones de calcio de los depósitos internos
(mitocondrias, tanques endoplásmicos) y puede desencadenar
exocitosis. Los canales de calcio también están abiertos sólo durante
un breve período de tiempo y los iones de calcio se bombean
rápidamente y / o se unen a moléculas intracelulares, como la
calmodulina, cambiando su actividad [159,160]. El hialuronano y sus
oligosacáridos desencadenan una cascada de señales a través de estos
mediadores secundarios.
Cabe señalar que los resultados de varios estudios, que son la base
para la presentación de los esquemas de vías de señalización, son
complejos y bastante contingentes. Representan únicamente formas y
mecanismos simplificados y sugeridos de regulación de procesos
complejos. Sin embargo, estos esquemas son importantes para la
sistematización y tienen valor heurístico.
En los procesos biológicos, la importancia del hialuronano no se
limita a su capacidad de interacción física, sino también a su
capacidad de participar en sistemas de regulación que pueden
desencadenar una transducción de señales desde la matriz
extracelular al núcleo y al sistema genético celular. Por lo tanto, HA
participa en la regulación sutil de la actividad celular. Hoy en día, las
vías de señalización no se consideran como secuencias lineales de
modificaciones bioquímicas, sino más bien como redes de distintos
niveles de complejidad. Estas redes son iniciadas por ligandos
extracelulares, que interactúan con otros receptores de la superficie
celular. La complejidad del proceso se debe a la organización de estos
receptores. La irregularidad de la expresión o disfunción del receptor,
incluido el CD44, conduce a numerosas patologías.
El esquema general de transmisión de señales representa las
interacciones entre ligandos y receptores intercelulares que afectan la
interacción entre las proteínas de la superficie celular y, además, la
interacción de las proteínas citoplasmáticas que, a su vez, regulan la
transcripción de genes (Figura 2.15). La singularidad del receptor de
hialuronano CD44 es que puede evitar la última etapa del camino y
activar una transcripción genética por sí mismo. Esto se realiza
mediante el procesamiento proteolítico del receptor CD44 de la
siguiente manera: Primero, la metaloproteasa de la membrana puede
escindir el dominio de la proteína CD44, que se encuentra en la
superficie externa de la membrana citoplasmática y sirve como sitio
de unión al hialuronano [151 ]. Debido a la escisión del ectodominio,
se facilita la migración celular. De hecho, este es un mecanismo de
regulación de la migración celular por CD44. La escisión adicional de
la proteína receptora CD44 por las proteasas conduce al transporte de
dominios al núcleo, así como a su combinación con otros factores de
transcripción (particularmente con c-Fos y c-Jun ). También mejora la
transcripción de varios genes e induce la expresión del gen
responsable de la síntesis de la proteína CD44. Se supone que este
circuito regulador contribuye a un cambio más rápido de la proteína
CD44 necesaria para el control de la migración celular [74]. Cuando
los inhibidores de metaloproteinasas unidas a la membrana bloquean
este circuito regulador, no se observa la aceleración del cambio del
receptor CD44.
El receptor CD44 se presenta en la superficie celular de la mayoría
de los vertebrados. Se trata de un grupo (familia) polimórfico de
proteínas con un peso molecular de 80 000 a 200 000 Da. Las proteínas
de CD44 están codificadas por un solo gen. El gen CD44 es muy
conservador; la familia de proteínas es producida por el mecanismo
de corte y empalme alternativo, que concierne principalmente a la
estructura extracelular del tallo de la proteína. Los primeros cinco
exones inalterados codifican el ectodominio globular N-terminal , que
contiene un fragmento de 90 residuos de aminoácidos (de 32 a 123).
Estos fragmentos se utilizan para la unión de HA y otros
glicosaminoglicanos. La afinidad de CD44 por los glicosaminoglicanos
depende de modificaciones postraduccionales del ectodominio de la
proteína (por ejemplo, glicosilación). Tales modificaciones dependen
de los tipos de células y factores de crecimiento. El receptor CD44 se
une a HA si el polisacárido consta de más de 20 residuos. La unión se
produce con más de una molécula de CD44 [74].
El ectodominio globular N-terminal está separado de la membrana
plasmática por una estructura de tallo corto (46 aminoácidos) que
contiene un sitio de escisión proteolítica putativo (Figura 2.9, 2.15). Las
células tumorales a menudo expresan variedades de CD44 con grandes
estructuras madre que se someten a O-glicosilación. Una región
transmembrana está compuesta por 23 aminoácidos hidrófobos y
residuos de cisteína. Una cola de citoplasma a menudo está conectada

a las proteínas y participa en asegurar la asociación de CD44 con el
esqueleto de las células, particularmente con la proteína anquirina
que proporciona contacto con la espectrina de proteína
citoesquelética. Estas interacciones están involucradas en
proporcionar movilidad y adhesión celular dependiente de HA .
La unión de anquirina con CD44 se controla mediante la
fosforilación de residuos de serina de Rho-quinasa. La ausencia de
esta enzima activa elimina la posibilidad de CD44
fosforilación, fluidez de la membrana, migración celular
y metástasis de células tumorales. Las proteínas ezrin, radixin y
moesin interactúan con el motivo de aminoácidos básicos de la cola
citoplasmática y entrecruzan el citoesqueleto actínico con el CD44.
Estas proteínas son importantes para la regulación de la forma y la
migración celular, y su unión está regulada por la
fosforilación-desfosforilación de residuos de serina en la cola
citoplasmática de CD44 por la proteína quinasa C.Varias reacciones de
aminoácidos de fosforilación-desfosforilación (serina, tirosina y
treonina) en la cola citoplasmática del extremo C-terminal por varias
proteínas quinasas pueden afectar las interacciones intramoleculares
entre la proteína N y la proteína C
terminal en CD44 y las interacciones proteína-proteína . Por ejemplo,
la desfosforilación de varias proteínas se inicia a una densidad celular
elevada o mediante la adición de hialuronano de alto peso molecular
[74].
Los mecanismos moleculares precisos por los que CD44 realiza sus
funciones siguen siendo meras especulaciones. Si actúa como ligando
(que une diferentes componentes receptores de la matriz
intercelular), como plataforma específica para factores de crecimiento
y metaloproteasas de la matriz, como correceptor para modular los
receptores de factores de crecimiento o como organizador del
citoesqueleto de actina cortical. (Figura 2.15).
La proteína CD44 puede participar en la formación de agrupaciones de
receptores. Mientras que CD44 interactúa con varios componentes de la
matriz extracelular, dicha interacción no es esencial, excepto por su
interacción con hialuronano. Es probable que la afinidad de CD44 por el
hialuronano esté modulada por factores extracelulares. En particular,
aumenta por estímulos mitogénicos y depende del nivel de glicosilación del
dominio extracelular. También es posible que dependa de la fosforilación de
residuos de serina específicos en la cola citoplásmica del receptor. La
modulación de la afinidad de unión de CD44 al polisacárido es importante
para la migración de las células en la matriz extracelular rica en
hialuronano . La evidencia es que CD44 se encuentra en el borde exterior y
la liberación de la célula que se había unido con hialuronano es provocada
por lamellipodia de algunos tipos de células migratorias y la escisión del
ectodominio CD44 por
proteasas. La supresión de la actividad de la proteasa, que escinde el
ectodominio CD44, conduce a la inhibición de la migración de las
células tumorales. La unión de HA con CD44 inicia el metabolismo del
hialuronano. CD44 está involucrado en algunas funciones 'pasivas'
que no requieren la activación directa de una cascada de señalización.
De hecho, se sabe que HA puede actuar como una molécula adhesiva,
creando los puentes entre las células que expresan CD44.
Las proteínas de CD44 pueden 'atrapar' y concentrar factores de
crecimiento, así como conectar sustratos y enzimas (es decir,
comportarse como plataformas para la organización de los diferentes
procesos) donde los eventos de señalización de larga y corta distancia
podrían concentrarse en la superficie celular.
Muchos estímulos extracelulares son percibidos por una célula a través de
los receptores tirosina quinasas. Sus dominios citoplásmicos tienen actividad
quinasa y motivos de fosforilación que, después de la activación del receptor,
crean sitios para múltiples componentes de la red de señalización
intracelular. La activación del receptor se logra mediante la
autofosforilación intermolecular mutua de las subunidades del receptor.
Esta asociación se induce o se estabiliza en el receptor mediante la unión del
ligando.
La activación es más compleja para los receptores que carecen del

dominio quinasa. Para activar estos receptores, cooperan con los
receptores tirosina quinasas y se denominan correceptores. En CD44
no hay actividad catalítica en el extremo citoplásmico. Funciona como
co-receptor con respecto a la familia de receptores, que tienen
actividad tirosina quinasa. Muchas proteínas intracelulares, que
participan en la señalización, están asociadas con la cola citoplásmica
del receptor CD44 (figura 2.9). Sin embargo, el papel funcional de estas
asociaciones no está claro. Los únicos datos que apuntan a una
transferencia de señal directa a través de CD44 se presentan en un
estudio en el que el tratamiento de células con mitógenos provoca la
escisión proteolítica del dominio intracelular de CD44. Se encuentra
en el núcleo y modula la actividad de ciertos genes en un complejo
con otras proteínas [74]. La capacidad de CD44 para interactuar con
proteínas, que están conectadas al citoesqueleto de actina, apunta a
otro modo de transmisión de señales celulares desde el HA
extracelular a la célula a través de CD44.
Se encontró que la sobreexpresión de las colas citoplásmicas de
CD44 conduce a una fuerte supresión de ciertas transferencias de
señales. La señalización requiere enlaces de CD44 con actina y
organización del citoesqueleto local. El proceso de señalización está
organizado estructuralmente; Los componentes preformados de los
módulos de transducción de señales pueden operar en asociación con
el citoesqueleto de actina, que está conectado a través de una serie de
proteínas y el receptor CD44.
Resumiendo los numerosos trabajos sobre la estructura y el
funcionamiento de la familia de proteínas CD44, existen tres vías
principales de función:
1. CD44 podría unirse a ligandos de la matriz extracelular
(principalmente hialuronano), lo que tiene un efecto sobre el
comportamiento celular independientemente de su interacción con
los receptores tirosina quinasas, y los citoesqueletos de actina
pueden actuar como plataformas para que los factores de
crecimiento participen en la función de la matriz extracelular ( a
base de hialuronano), en su montaje y desmontaje.
2. CD44 puede funcionar como correceptores que median la
transducción de señales del receptor tirosina quinasa.
3. El CD44 puede proporcionar un vínculo entre la membrana plasmática y el
citoesqueleto celular.
Los proteoglicanos de la superficie celular, como los sindecanos y
los glicanos, se comportan como correceptores. Por tanto, un factor de
crecimiento de fibroblastos que se une a cadenas de heparán sulfato
promueve la interacción del factor de crecimiento con su receptor.
Por el contrario, la interacción del factor de crecimiento beta de
fibroblastos con decorina suprime su actividad. La unión de factores
de crecimiento y citocinas con los proteoglicanos de la matriz
extracelular sugiere que estas macromoléculas pueden concentrarse
en ciertas áreas de la matriz extracelular y luego liberarse localmente
cuando sea necesario. Por tanto, la matriz extracelular puede servir
como depósito de moléculas reguladoras, y el hialuronano y sus
fragmentos proporcionan un sistema de información que señala el
estado de la matriz extracelular [161].
2.4 Funciones hialuronanas en la matriz extracelular
El hialuronano desempeña sus funciones principales en la matriz

extracelular [41,162-164] donde llena la matriz extracelular al
estructurarse mediante interacciones con proteínas [57,165]. El
hialuronano juega un papel importante en la hidrodinámica celular y
tisular, el intercambio iónico y el transporte de los diferentes
compuestos en dos direcciones opuestas (desde los vasos sanguíneos a
la célula y desde la célula a los vasos linfáticos). También participa en
el intercambio activo de metabolitos e iones y gases (O 2 и CO 2 ) entre
sangre y tejidos, y
desempeña el papel de 'mediador estructural' durante la interacción

celular, creando canales para su migración. Hay aproximadamente 15
g de hialuronano en el cuerpo de una persona adulta media [166],
principalmente en la piel (dermis y epidermis), el líquido sinovial de
las articulaciones, el globo ocular y otros tejidos conectivos. La tasa de
rotación de HA es bastante notable. Durante un día,
aproximadamente 5 a 7 g de hialuronano se escinden (hidrolizan) en
el cuerpo humano, que es la mitad de la cantidad total. Se sintetiza la
misma cantidad [167].
Para discutir los mecanismos del funcionamiento de HA en la matriz
extracelular de diferentes tejidos, haremos una pequeña excursión a
la bioquímica de la matriz extracelular.
2.4.1 Espacio extracelular

Las membranas citoplasmáticas de las células adyacentes en varios
tejidos están asociadas entre sí por conexiones de tipo celular de las
uniones estrechas, las uniones gap y los desmosomas. La mayoría de
las células están rodeadas de matriz extracelular, una red compleja de
macromoléculas interconectadas entre las que el hialuronano tiene
un lugar importante. Es posible especular sobre el tamaño del espacio
intercelular (intersticial) de un ser humano mediante la distribución
del líquido en los dos principales compartimentos intracelulares e
intercelulares. El contenido total de agua en el cuerpo de un adulto
que pesa 70 kg es de aproximadamente 42 l. Sin plasma sanguíneo,
diversas fuentes estiman que el volumen de líquido intracelular es de
aproximadamente 28-30 ly el volumen de líquido intercelular de 10 l
[168,169]. El estudio más detallado se realizó para el espacio
extracelular del cerebro, que ocupa del 12 al 14% del volumen total
del órgano. Las neuronas y las células gliales están separadas por
espacios intercelulares que tienen anchos de 15 a 20 nm. Las ranuras
están interconectadas, formando un espacio extracelular lleno de un
líquido a través del cual tiene lugar el intercambio de sustancias entre
las células neurales y gliales por difusión [168]. El espacio extracelular
ayuda al intercambio de sodio-potasio entre las neuronas y los medios
extracelulares y, en consecuencia, la conducción de los impulsos
nerviosos. Durante el desarrollo del cerebro embrionario, la matriz
extracelular contiene una gran cantidad de hialuronano. Sin embargo,
con el tiempo, el contenido de la matriz extracelular del cerebro
disminuye drásticamente. Además del agua, el espacio extracelular
contiene una cantidad significativa de biopolímeros, moléculas e
iones que se unen en el concepto de matriz extracelular.
2.4.2 Composición y funcionamiento de la matriz extracelular

La matriz extracelular (matriz intercelular, pericelular) está
compuesta por una variedad de polisacáridos y proteínas que se
organizan espontáneamente en estructuras ordenadas. Representa un
complejo supramolecular, formado por una red de moléculas
conectadas entre sí [31,41]. En el cuerpo humano, la matriz
extracelular produce estructuras altamente especializadas como el
cartílago del tendón, la membrana basal y después del depósito
secundario de fosfato cálcico, huesos y dientes. Dado que estas
estructuras difieren tanto en la composición molecular como en los
métodos para organizar los componentes principales, comprenden las
diversas formas de la matriz extracelular [31,41]. Aquí dibujamos una
"imagen" generalizada de la matriz extracelular y el papel funcional
del hialuronano en ella.
La matriz extracelular es un área de autoensamblaje de
biopolímeros y estos son exportados al espacio extracelular por los
fibroblastos o las células de esta familia (condroblastos en cartílagos y
osteoblastos en tejido óseo). La estructura molecular de la matriz
extracelular es
influenciados por macrófagos (histiocitos), basófilos (mastocitos o

labrocitos), células mesenquimales, adipocitos (células grasas),
pericitos y células transitorias, que migran al tejido conjuntivo en
respuesta a estímulos específicos: linfocitos, neutrófilos, basófilos ,
eosinófilos y células plasmáticas [133].
La matriz extracelular comprende principalmente estructuras
proteicas fibrosas de colágeno y elastina, incrustadas en un gel de
polisacárido hidratado de HA y otros glicosaminoglicanos
[41,162-164]. Las macromoléculas de hialuronano, otros
glicosaminoglicanos y proteoglicanos forman un gel de «sustancia
básica» muy hidratado de la matriz extracelular, en el que se
sumergen las fibras de colágeno [64]. Las fibras de colágeno fortalecen
y agilizan la matriz, y la fase acuosa del gel de polisacárido asegura la
difusión de metabolitos, hormonas, moléculas de señalización y gases
entre la sangre y las células tisulares. Se podría estimar que el agua
intercelular comprende el 25% del agua total del cuerpo, de la cual
aproximadamente el 5% está en el sistema circulatorio y el resto en la
matriz intercelular. El agua intracelular representa aproximadamente
el 40%.
Se puede ver un intercambio constante de sustancias líquidas, iones,
gases entre estos tres volúmenes. En el cuerpo, los principales
parámetros del líquido, como el pH, la presión osmótica y el volumen,
están estrictamente controlados. Los niveles de pH del líquido
extracelular y de la sangre son los mismos y normalmente son de
aproximadamente 7,36. Varias conformaciones biológicas de
macromoléculas y la actividad catalítica de enzimas dependen del pH.
La presión osmótica del líquido extracelular y el plasma sanguíneo
dependen de manera similar. El ácido hialurónico de la matriz
extracelular juega un papel muy importante en el mantenimiento de
estos parámetros dentro de las normas fisiológicas. Como
intermediario entre los medios externos y las células, la matriz
extracelular realiza las funciones de coordinación entre las células y
las diferentes estructuras celulares. El funcionamiento de la
membrana citoplásmica celular depende directamente de la matriz
extracelular.
Las diferencias en la composición química de la superficie externa de la
membrana (la matriz extracelular es una extensión de la misma) y la
superficie interna crean una asimetría estructural de la membrana. Las
superficies de la membrana que miran hacia el citoplasma y la matriz
extracelular son hidrófilas y las de la parte central de la membrana son
hidrófobas. Los carbohidratos suelen estar unidos a proteínas y lípidos, pero
en cualquier caso se encuentran en la superficie de la membrana más
externa que interna. El hialuronano y otras proteínas de membrana
contribuyen a la asimetría de la membrana. En la membrana, la relación
proteína / lípido en las membranas varía en el rango de 1: 4 a 4: 1, pero la
relación más típica es 1: 1. Las moléculas de proteína incrustadas en la
membrana o adheridas a ellas están orientadas de cierta manera. Algunas
proteínas se localizan en la superficie de la membrana interna y la
proporción de sus aminoácidos hidrófilos e hidrófobos es similar a la de las
proteínas citoplasmáticas. Por lo general, las proteínas secretadas
experimentan glicosilación, mientras que las proteínas citosólicas
generalmente no. Las proteínas de la superficie exterior de la membrana
están estrechamente asociadas con la cadena de carbohidratos de la matriz
extracelular, HA y glicosaminoglicanos sulfatados. Las proteínas integrales
están incrustadas en la doble capa lipídica de la membrana mediante un
núcleo hidrófobo y tienen áreas abiertas (sitios) en ambos lados de la
membrana. El fragmento de la proteína integral, que ingresa a la matriz
intercelular, está compuesto por aminoácidos hidrófilos y generalmente está
glicosilado. El sitio citoplásmico de una proteína integral también es
hidrófilo y realiza funciones enzimáticas o se une a la proteína enzimática.
La matriz y los fragmentos citoplásmicos de proteínas integrales excluyen la
posibilidad de inversiones de proteínas de membrana y ralentizan la
difusión lateral de las moléculas de lípidos de membrana. Las moléculas de
lípidos en la membrana pueden moverse libremente en su propia capa en el
lado (lateral)
dirección cambiando de posición hasta un millón de veces por

segundo. Sin embargo, las transiciones en la tercera dimensión (de
una capa bilipídica a otra en un movimiento de flip-flop ) están
estrictamente limitadas y no ocurren más de una vez al mes. Un lípido
puede pasar la distancia de 1/40 del diámetro medio de las células en
su capa en 2 s, pero la probabilidad de pasar a otra capa es
extremadamente pequeña. Tal evento podría ocurrir no más de una
vez cada 100 s [170]. Esos pases ocasionales dan como resultado el
descubrimiento de una propiedad importante de las membranas: sus
componentes pueden reorganizarse y agruparse para formar sistemas
de señalización, asociaciones de receptores o facilitar el transporte
mutuo, sin mezclar interfaces internas y externas. Se asegura la
existencia de dos fases principales de la membrana: una fase de gel y
una fase de cristal líquido [171]. Al mismo tiempo, existen
posibilidades de transiciones sol-gel en el citosol celular.
En una membrana pueden coexistir fragmentos con diferentes fases. Los
fragmentos estables y altamente ordenados de la membrana (balsas) sirven
para la formación de cascadas de señalización, como la estimulación de la
proliferación. Las zonas de cristal líquido participan en la exocitosis y la
endocitosis [172]. Crean asimetría estructural de la membrana
citoplasmática y proporcionan su asimetría funcional, lo que significa que
las superficies interna y externa de la membrana deben funcionar de
manera diferente. De lo contrario, las moléculas o iones que se transfieren de
la matriz intercelular a la célula podrían transportarse de regreso a la matriz
extracelular en otro lugar. También se puede observar asimetría en otras
propiedades de las membranas. Por tanto, los receptores de hormonas y
otras moléculas de señalización están asociados con la membrana y sirven
para la transmisión de señales desde la matriz extracelular a las células
[173]. La unión del receptor con una molécula de señalización altera la
conformación de la proteína receptora transmembrana que activa o inhibe
la actividad enzimática de su dominio citoplásmico. Ésta es la realización del
principio de regulación conformacional del receptor . Este principio
primario es la base de todas las formas de regulación intercelular. Los
sistemas de señalización más sofisticados se basan en una variedad de
proteínas que transmiten señales de acuerdo con el principio de cascada. En
todos los casos, ya sea una enzima, un receptor o una proteína reguladora, la
molécula de proteína puede reconocer un factor específico e interactuar con
él en consecuencia, cambiando su configuración. En los complejos
multicomponente , los cambios conformacionales de las moléculas
receptoras se transmiten de forma cooperativa a todo el complejo, afectando
su actividad funcional. En el curso de la evolución, los sistemas reguladores
intracelulares emergen primero y gobiernan los niveles de regulación tales
como enzimas, membranas y genética. Con la llegada de organismos
multicelulares, los sistemas de regulación intercelular, tisular y de órganos
evolucionan y mejoran. Incluyen sistemas hormonales, tróficos y
electrofisiológicos. A través del sistema regulador, el hialuronano participa
en asegurar la homeostasis en células, tejidos y órganos [126] (es decir, en
mantener los parámetros constantes de los medios internos del organismo) y
también crea las condiciones para su desarrollo (epigénesis). En todos los
niveles de la organización, la homeostasis está asegurada por
retroalimentación negativa, pero la epigénesis (embriogénesis y
regeneración) está asegurada predominantemente por retroalimentación
positiva. Todos los sistemas de regulación están estrechamente vinculados y
organizados en un único sistema de regulación basado en la jerarquía de
principios. El hialuronano está integrado en el sistema y puede inducir
comentarios tanto positivos como negativos. Así, el polisacárido con un peso
molecular de más de 500 000 Da ralentiza la proliferación celular, pero el HA
de bajo peso molecular (50 000–100 000 Da) activa la proliferación celular.
En la superficie de la membrana citoplasmática, la macromolécula de
hialuronano puede unirse a los receptores de proteínas específicas CD44 y
RHAMM [123] a través de los cuales inicia una cascada de señales
intracelulares. Los proteoglicanos a menudo también se comportan como
proteínas receptoras. Se unen a las citocinas.
y otras moléculas de señalización y regulan el metabolismo, la

actividad genética y la proliferación celular. Por ejemplo, el factor de
crecimiento de fibroblastos FGF-beta puede estimular la síntesis de
hialuronano en cultivo celular a través de receptores de dos formas:
(1) activando los genes de la hialuronano sintasa; (2) activando
hialuronano sintasas por fosforilación a través de la activación de la
proteína quinasa C [150,174]. Sobre la base de varias características
indicadoras de moléculas de señalización especializadas, como la
longevidad de la acción, la vida útil ( vida media), la afinidad por el
receptor y otros, el hialuronano se puede atribuir tanto a la célula (que
envía la señal de la matriz intercelular a la célula ) y moléculas de
señalización intracelular. Las señales de la matriz extracelular hacia
las células determinan la intensidad de los procesos metabólicos, los
procedimientos y las actividades para la extracción de información
genética, la actividad de la biosíntesis de la matriz de ARN y proteínas
[106] y la secuencia y velocidad de transporte de macromoléculas
desde células en la matriz extracelular [175]. Así, en las relaciones
entre la célula y la matriz intercelular se forman cadenas reguladoras
con participación de HA, lo que proporciona coherencia y control
mutuo del proceso de síntesis-descomposición y su condición dinámica
estacionaria. Con la aparición de hialuronano en la matriz
extracelular, aumenta el grado de asimetría del espacio celular externo
e interno. La asimetría de la membrana celular citoplásmica está
asegurada por diferencias en la composición química de las moléculas
en las superficies externas e internas de la membrana, como lípidos,
proteínas y principalmente polisacáridos, que están asociados con
proteínas y lípidos en la superficie externa de la membrana. La
inclusión de HA, otros polisacáridos solubles y glicosaminoglicanos en
la matriz intercelular aumenta el grado de asimetría de la membrana y
de los compartimentos celulares tanto intra como intercelulares. El
compartimiento intracelular contiene una cantidad significativamente
menor de polisacáridos solubles en comparación con el intercelular. El
grado de asimetría de la membrana varía en los diferentes tipos de
membranas y puede ser diferente durante las diferentes etapas de la
vida celular [31,41]. La asimetría es un requisito previo para el
correcto funcionamiento de las membranas, por ejemplo, el flujo
unidireccional de diferentes compuestos solo desde una célula o fuera
de las células. Además, HA de dimensiones lineales suficientemente
grandes (hasta 2,5 µm) lleva a cabo las funciones de comunicaciones
intercelulares entre las células separadas por la matriz extracelular. La
capacidad de las moléculas de HA para unirse con 1000 veces más
agua de la que pesan y al mismo tiempo crear un volumen
hidrodinámico 10 veces mayor que el espacio ocupado por las
moléculas no hidratadas , facilita la migración, adhesión, clasificación
de las células durante la embriogénesis y Dañar la regeneración en el
organismo adulto que repite ciertos pasos de la embriogénesis. Por
ejemplo, en caso de daño óseo (fractura), el tejido del cartílago se
forma inicialmente y luego se reemplaza por tejido óseo [45]. Todas
estas propiedades funcionales del hialuronano contribuyeron al
surgimiento de una nueva rama de cordados en la filogénesis y aún
hoy contribuyen a la preservación y evolución de las especies animales
más avanzadas.
2.4.3 El papel del hialuronano en el transporte de

sustancias a través de la matriz extracelular:
difusión, ósmosis, electro-ósmosis y transporte
vesicular
Los grandes vasos sanguíneos (arterias, venas) atraviesan el tejido adiposo
subcutáneo. La derma tiene una red capilar bastante desarrollada, pero la
epidermis no tiene vasos sanguíneos ni venosos. La misma situación se
puede encontrar en los tejidos del cartílago. Por lo tanto, el transporte de
sustancias desde los capilares sanguíneos hacia la epidermis, el cartílago y
otros tejidos celulares pasa
a través de la matriz intercelular. La única diferencia es la distancia

del capilar a la célula y las características estructurales de las matrices
en diferentes tejidos.
Durante el transporte de gases desde los capilares sanguíneos, el oxígeno
pasa a la matriz intercelular y penetra en la membrana, el citosol celular y
finalmente la doble membrana mitocondrial, donde encuentra el objetivo
final de oxidación. Tal mecanismo de transporte podría denominarse
"difusión pasiva", ya que asegura la transferencia de moléculas desde el área
de alta concentración, es decir, debido al gradiente de presión (ley de Fick).
En 1 h se pueden transportar 190 a 750 ml de oxígeno, según la temperatura
y la actividad física. Dado que la matriz extracelular está saturada de agua, la
velocidad de transporte de los gases depende de su solubilidad en medios
líquidos (ley de Henry). Según la solubilidad, el coeficiente de difusión del
dióxido de carbono es 2,7 veces superior al del oxígeno. La cantidad de agua
en la matriz extracelular depende directamente del contenido de
hialuronano y de otros glicosaminoglicanos, lo que influye en la velocidad de
transporte de los gases. Siguiendo todas las leyes de los gases, el sistema
coloidal de la matriz extracelular influye en el intercambio de gases. Sin
embargo, estos datos son escasos y contradictorios.
La mayor parte del agua en la matriz extracelular está unida y
podría verse como un componente de la estructura de hialuronano,
glicosaminoglicanos sulfatados, proteoglicanos y glicoproteínas, que
aparecen como polianiones macromoleculares que forman una
estructura de red. En las condiciones fisiológicas, las cargas negativas
de tales polianiones podrían ser neutralizadas por los cationes de
sodio, potasio, calcio y otros iones osmóticamente activos que están
rodeados de capas de hidratos. Como resultado, se forman estructuras
similares a geles y altamente hidratadas. En estas estructuras, el agua
y los iones experimentan un intercambio rápido con formación de un
estado estacionario. De manera similar, el agua está unida al espacio
intracelular (citosol). La membrana, que divide los espacios
intracelulares e intercelulares, es un regulador activo del transporte
de electrolitos y crea un gradiente de concentración de iones entre
estos dos compartimentos. El sodio es el catión principal de la matriz
intercelular (alrededor de 144 mM) y la concentración de iones de
potasio, calcio y magnesio no excede de 1 a 1,5 mM. El cloro es el
anión principal de la matriz extracelular (aproximadamente 114 mM).
El catión principal dentro de la célula es potasio (aproximadamente
160 mM), luego cationes de magnesio (13 mM) y sodio (10 mM). Los
aniones del líquido intracelular están representados por proteínas (8
mM), fosfatos (50 mM), sulfatos (10 mM) y bicarbonatos (11 mM)
[168,169].
El hialuronano y la glucosamina de la matriz extracelular poseen
funciones como el depósito de agua y la regulación de las velocidades
de difusión de compuestos dentro y fuera de las células. También
pueden funcionar como medios de intercambio iónico. El transporte de
macromoléculas a través de la matriz de la red hidratada es bastante
difícil. Es evidente que el transporte vesicular "inventado"
naturalmente se basa en el mecanismo de exocitosis [176] para el
suministro de biopolímero (desde la célula a la matriz extracelular) así
como en el mecanismo de endocitosis (desde la matriz extracelular a la
célula). Los glicosaminoglicanos sulfatados se transportan a la matriz
intercelular mediante un mecanismo de exocitosis, no como moléculas
libres sino como agregados de proteoglicanos. El hialuronano no se
transporta a través del procedimiento de exocitosis, sino que es
"expulsado" de la célula a través de la membrana citoplasmática por la
enzima que lo sintetiza. Para penetrar en la célula, el hialuronano
utiliza el mecanismo de endocitosis. Un posible mecanismo de
endocitosis de hialuronano es que se une a varios receptores de la
pared celular. Durante la despolimerización, los fragmentos de
hialuronano pueden adoptar diferentes conformaciones y los
receptores unidos al hialuronano se acercan entre sí (agrupamiento).
La agregación del receptor inicia la formación de una vesícula de
endocitosis que transfiere los receptores y los fragmentos de
hialuronano unidos al citosol celular [45,176]. Usando este mecanismo,
hialuronano
y sus fragmentos pueden regular simultáneamente el transporte de

diferentes sustancias al interior de una célula a través de la vía de la
endocitosis.
2.4.4 Hialuronano en la matriz extracelular de diferentes tejidos conectivos

Un complejo supramolecular de la matriz intercelular está formado
por la compleja red de macromoléculas que están conectadas entre sí.
En las diferentes formas de la matriz intercelular, estas estructuras se
diferencian entre sí tanto por su composición molecular como por la
organización de los componentes principales, que son proteínas y
polisacáridos, incluido el HA. En la matriz extracelular de la piel, la
mayor parte del hialuronano se encuentra entre las fibras de colágeno
y elastina [177,178]. Hay 0,1 mg de HA en 1 g de tejido crudo de la
epidermis, pero 0,5 mg / g en la dermis. El hialuronano está conectado
con hialadherinas (proteínas que tienen sitios de unión específica con
polisacáridos) y forma una red polimérica que llena la matriz
extracelular. El hialuronano, saturado de agua, forma las estructuras
de gel en la matriz extracelular, por lo que mantiene un alto nivel de
elasticidad cutánea y actúa como un filtro selectivo que regula la
velocidad de difusión de los compuestos que se diferencian por peso
molecular, volumen hidrodinámico y carga. Además, el hialuronano
tiene algunas propiedades protectoras en la piel, evitando la
penetración de microorganismos a través de la superficie herida. El
equilibrio acuoso de la piel se mantiene mediante dos direcciones de
flujo opuestas : la difusión del agua hacia la dermis desde los capilares
sanguíneos y su evaporación a través del estrato córneo (capa córnea).
Los queratinocitos de la epidermis de la piel son capaces de sintetizar
HA y su factor de crecimiento estimula la síntesis de hialuronano en
los queratinocitos mediante la activación de hialuronano sintasa-1 y -3
[179]. La difusión y la evaporación son procesos pasivos. Por tanto, el
hialuronano dérmico tiene una importancia particular en el
intercambio de agua. Usando su capacidad para retener una gran
cantidad de agua, HA juega un papel importante en el mantenimiento
del estado hidratado de la dermis y la epidermis. La capa córnea de la
epidermis es la barrera para la evaporación del agua y también es
capaz de extraer la humedad del aire y retenerla debido al HA y otras
estructuras higroscópicas. Debido a la deshidratación, la piel pierde
elasticidad y desarrolla arrugas. Para los primeros animales terrestres,
la retención de humedad en la piel era equivalente a la supervivencia.
Por lo tanto, en términos evolutivos, HA aparentemente contribuyó no
solo a la aparición de la primera rama de cordados acuáticos, sino
también a su tránsito hacia la tierra. En el tejido del cartílago, la matriz
extracelular ocupa un volumen bastante grande. Tiene las principales
funciones de este tejido conectivo, incluida la función de resorte,
resultado de sus propiedades de elasticidad y resiliencia. Los
principales componentes de la matriz extracelular, como colágenos
fuertes, elastinas, proteínas adhesivas y "los compuestos principales",
hialuronano y proteoglicanos, podrían encontrarse en ella. Una
característica de la matriz intercelular es que, a diferencia de los
fibroblastos dérmicos, los condrocitos del cartílago sintetizan
significativamente menos HA. Además, en la matriz del cartílago, el
hialuronano forma grandes complejos supramoleculares.
En estos complejos, el polisacárido ocupa la parte central agrandada
del complejo donde las moléculas de agrecano (proteoglicano) se
ubican perpendicularmente al eje con el intervalo de
aproximadamente 10 unidades de monosacárido (Figura 2.13). El
agrecano es el principal proteoglicano de la matriz del cartílago y
comprende el 10% en peso del tejido y el 25% en peso seco de la matriz
del cartílago. Este monómero de proteoglicano tiene un peso molecular
de aproximadamente 2 500 000 Da. La molécula está compuesta por
carbohidratos (93%) y proteínas (7%). La cadena de péptidos se
encuentra en el centro del monómero y se denomina proteína
aceptante . Consiste en los residuos de aminoácidos de serina, glicina,
glutamina y
Alanina Los residuos de serina están unidos covalentemente a hasta

100 cadenas de condroitín sulfatos y aproximadamente 30 a 60
cadenas de queratán sulfatos a través del trisacárido
xilosa-galactosa-galactosa. Por lo tanto, la molécula de agrecano se
asemeja a la forma de un cepillo de botella. El sulfato de condroitina
consta de 20 a 70 unidades de disacáridos y tiene un peso molecular
de 5000 a 50 000 Da, y el queratán sulfato incluye 25 unidades de
disacárido y tiene una masa molecular total de 4000 a 19 000 Da. En la
matriz del cartílago, las moléculas de agrecano se agregan con
hialuronano mediante una pequeña proteína de enlace (Figura 2.13).
Ambas proteínas se conectan a HA mediante enlaces no covalentes en
el dominio C 1 . Este dominio interactúa con aproximadamente cinco
unidades de disacárido del polisacárido. Luego, el complejo es
estabilizado por la proteína de enlace. El dominio C 1 y la proteína de
enlace ocupan 25 unidades de disacárido de hialuronano. El complejo
supramolecular final contiene una molécula de hialuronano de
aproximadamente 1200 nm de longitud, a la que se unen
aproximadamente 100 moléculas de agrecano con una longitud de
300 a 400 nm y la misma cantidad de proteína de enlace. La distancia
entre dos moléculas de agrecano unidas a HA es de 25 a 50 nm. Las
proteínas agregadas y de enlace son producidas por condrocitos. Estos
componentes podrían interactuar entre sí dentro de la célula, pero el
proceso de ensamblaje se completa en la matriz extracelular. Se
necesitan aproximadamente 24 h para construir un complejo triple
funcionalmente activo [41,170,177].
También se incluyen pequeños proteoglicanos en la matriz del
cartílago. La matriz contiene una pequeña proteína central a la que
están conectadas una o dos cadenas de glicosaminoglicanos. Dichos
proteoglicanos incluyen decorina, biglicano, perlecano, lumican y
fibromodulina. Los pequeños proteoglicanos son macromoléculas
multifuncionales conectadas con otros componentes de la matriz
extracelular y pueden afectar su estructura y funciones. Por ejemplo,
la decorina y la fibromodulina se pueden adherir a las fibrillas del
colágeno tipo II para limitar su diámetro. La decorina y el biglicano se
conectan con la fibronectina y suprimen su adhesión celular, y
también se conectan con el factor de crecimiento tumoral beta para
reducir su actividad mitogénica. Hay datos que confirman que los
pequeños proteoglicanos tienen un papel regulador en el proceso de
regeneración del tejido conectivo. Los principales componentes
estructurales de la matriz del cartílago intercelular son el colágeno
tipo II, agrecano, hialuronano (1 mg / g de tejido crudo) y agua. Junto
con el proteoglicano pequeño, existen colágenos de tipos VI, IX y XI,
proteínas de unión, proteínas oligoméricas de cartílago,
condroadherina, anquirina y factores de crecimiento.
La red fibrilar de la matriz del cartílago está compuesta de colágeno
de tipos II, IX y XI, lo que proporciona resistencia al cartílago. Las
fibrillas de colágeno están conectadas con HA, que, a su vez, forma
complejos supramoleculares con agrecanos. Los agregados de alto
peso molecular compuestos de hialuronano y agrecano pueden
considerarse polianiones debido a una gran cantidad de grupos
carboxilo, que proporcionan un alto nivel de hidratación de la matriz
del cartílago y capacidad para realizar funciones de resorte.
El contenido de agua en el cartílago articular no es permanente
[180]. Bajo presión, el agua sale del cartílago y cuando se quita la
presión, el agua regresa. Por la mañana, el contenido de agua de los
discos intervertebrales de cartílago es aproximadamente el 75% de la
masa del disco. Bajo presión durante el día, el contenido de agua se
reduce aproximadamente en un 20%. Es por eso que un humano es
más alto por la mañana que por la noche. La diferencia es de
aproximadamente 1 a 2 cm. Además, debido a estas razones, en
condiciones de gravedad cero se encontró que la altura del astronauta
aumenta hasta 5 cm.
La matriz extracelular del tejido óseo se caracteriza por un alto
nivel de mineralización. Incluye el 50% de los compuestos inorgánicos
en masa, principalmente en forma de hidroxiapatita, el 25% de los
compuestos orgánicos y el 25% de agua. La principal proteína de la
matriz ósea es
colágeno tipo 1 (90-95%). Los compuestos orgánicos están

representados por una pequeña cantidad de proteoglicanos, incluida
una parte de carbono que incluye dermatán sulfato y queratán
sulfato. Los proteoglicanos, junto con otras proteínas (osteocalcina y
sialoglicoproteínas), son proteínas de unión al calcio y, por tanto,
participan en la creación de un depósito de calcio y fosfato inorgánico.
Es posible que también participen en el control de la modulación
cada segundo de los niveles de calcio celular, así como los niveles de
calcio y fósforo en el suero sanguíneo. En el período embrionario, los
'modelos' de cartílago esquelético son reemplazados gradualmente
por tejido óseo. Cuando los huesos se lesionan y / o fracturan, la
regeneración comienza con el reemplazo del tejido del cartílago
dañado seguido del reemplazo del tejido óseo. El papel del
hialuronano en la matriz del cartílago se discutió anteriormente. Las
funciones de la HA en la sustitución del tejido cartilaginoso por tejido
óseo en sí no están claras. Sobre la base de los estudios intensivos de
las propiedades estructurales, metabólicas y reguladoras del
hialuronano, en la actualidad se han configurado las principales
aplicaciones medicinales del hialuronano (ver Capítulo 6).
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3
Métodos de ácido hialurónico
Producción
A primera vista, puede parecer que este capítulo está saturado con
detalles tecnológicos que serían de interés solo para los tecnólogos
que trabajan en la producción de hialuronano. Sin embargo, el
material se presenta de esta manera intencionalmente con el fin de
dilucidar adecuadamente las dificultades de la producción de ácido
hialurónico y los problemas potenciales causados por las impurezas
tecnológicas en el producto final cuando se destina a una aplicación
médica.
3.1 Fuentes y extracción de hialuronano
El hialuronano se puede extraer del tejido de los animales

vertebrados (Tabla 3.1) o de la bacteria que crea la cápsula protectora
a partir de los polisacáridos. La mejor cepa bacteriana para tal fin es
el estreptococo hemolítico de los grupos A y B.
3.1.1 Producción de hialuronano de origen animal: métodos generales

Hasta hace poco, la forma más económicamente viable de obtener HA
era su extracción de las crestas de los pollos [1,2]. Un procedimiento
completo incluye etapas posteriores de homogeneización de tejidos,
extracción, purificación y preparación del producto final comercial de
HA, que puede estar en forma de polvo seco, solución, gránulos o en
sustancias medicinales. La novedad de los diversos métodos
protegidos por patente es que cada uno implica diferentes tecnologías
de extracción y / o procedimientos de purificación. El siguiente es el
procedimiento típico para la extracción y purificación de hialuronano
de las peinetas de pollo.
Las crestas de gallo contienen hasta 7,5 mg del polisacárido por 1 g de
tejido. El polisacárido se localiza principalmente en las fibras mucosas de la
capa subcutánea. Antes de la extracción del tejido recién congelado, los
peines deben lavarse a fondo con agua, acetona

Tabla 3.1 Contenido de ácido hialurónico en varios tejidos

Tejido (líquido) Contenido, mg / g (ml)

Peine de lista para adultos Hasta 7.5
Cuerpo vítreo ocular 0,1-0,4
Líquido sinovial 1.3–4.0
Cartílago hialino 1.0
Cordón umbilical 4.1
Epidermis 0,1
Derma 0,2-0,5
Líquido amniótico 20

(5 a 10 extracciones hasta una solución transparente) [3], etanol al

95% [4] o una mezcla de etanol y cloroformo. Este procedimiento es
necesario para evitar la destrucción enzimática y oxidativa de HA,
que tiene un mecanismo de radicales libres con la participación de
iones de hierro, cobre y fosfato [1].
Los tejidos sin sangre se pueden almacenar hasta por 24 meses en
etanol al 95% a 4–22 ° C [3]. Luego, los tejidos deben ser molidos en un
homogeneizador, desintegrador o molino de bolas para obtener la
máxima extracción. Se pueden utilizar diferentes disolventes para la
extracción, incluidos
agua destilada a diferentes temperaturas, soluciones salinas y mezclas
acuoso-orgánicas . En la Tabla 3.2 se presentan varios de los métodos
más comunes de producción de ácido hialurónico a partir de la cresta
del gallo, aunque un método describe la producción a partir de la
membrana de la cáscara del huevo.
Se puede obtener hasta el 93% del ácido hialurónico de un peine de
pollo cuando se extrae agua a una temperatura del tejido de
80–100 о С. Al mismo tiempo, tiene lugar una inactivación de
hialuronidasas. Sin embargo, a altas temperaturas, el HA sufre una
despolimerización parcial independientemente de la hidrólisis
enzimática. Por tanto, es necesario encontrar el óptimo
régimen de temperatura para asegurar la inactivación de las enzimas
de descomposición por la alta temperatura y evitar (o al menos
minimizar) la destrucción del biopolímero.
Se describe un método para la extracción de ácido hialurónico
mediante una mezcla de alcohol y agua , que contiene 5–25% de
alcohol n-propílico, isopropílico o terc- butílico , cloruro cálcico 2 M
(de origen cartilaginoso). Para aislar el hialuronano de sus complejos
con proteínas, se trata un tejido homogeneizado con enzimas
proteolíticas (pepsina, tripsina, papaína y / o pronasa) y mezclas
acuoso-orgánicas . Pero en la mayoría de los métodos, estos
procedimientos se incluyen en el tratamiento de los extractos
primarios.
3.1.2 Purificación de hialuronano

Después de la extracción, el hialuronano debe someterse a una
purificación como la siguiente operación de producción. El extracto de
tejido animal suele contener las siguientes impurezas: proteínas,
péptidos, lípidos, ácidos nucleicos, mucopolisacridos y precursores de
bajo peso molecular. La primera etapa de purificación implica la
precipitación de HA del extracto primario usando etanol o acetona o
ácido acético, o un volumen doble de etanol con acetato de sodio a
2-4 ° С
[4]. A veces, los ciclos de disolución-precipitación se repiten varias
veces para ayudar a eliminar los compuestos de bajo peso molecular y
los lípidos que son solubles en acetona y etanol. Se eliminan las
proteínas (que son libres y están conectadas con los polisacáridos)
Tabla 3.2 Métodos de extracción y purificación de hialuronano
# FuenteExtracción Purificación Producto final

1 Gallo Agua 100 ° С , 6 veces Papaína; Polvo liofilizado de
peines ultrafiltración en una mezcla de agua y etanol al 40% .hialuronano de sodio
2 Gallo Agua Extraiga el calentamiento a 90–100 ° С ; Polvo liofilizado de
peines eliminación de lípidos; hialuronano
filtración;
tratamiento con carbón activado.
3 Gallo y Agua acidificada a pH 3-4, 90-100 ° С , Tratamiento con carbón activado luego Polvo liofilizado de
pollo 40–50 min. celulosa; hialuronano, proteína
peines filtración. contenido por debajo del 0,05%
4 Gallo y Agua, 2 extracciones Tratamiento con cloroformo; Polvo liofilizado de
Pollo precipitación con etanol. hialuronano, proteína
Peines contenido por debajo del 0,5%
5 Pollo Solución acuosa de n-propilo o terc- butilo Cloruro de sodio para la creación de dos fases Blanco amorfo
peines módulo líquido alcohol dos veces (5 - 25%) sistema; polvo, contenido proteico
1: (10-15) precipitación con etanol. por debajo del 1%
6 Gallo Solución fisiológica, 80–90 ° С , 2 Filtración; Sin polvo liofilizado
peines extracciones precipitación con ácido acético saponificado con de ácidos nucleicos
hidróxido de sodio a рН 7.0–7.3;
calentamiento a 80–90 ° С ;
filtración repetible.
7 Gallo Extracción de agua Múltiples tratamientos con una mezcla de cloroformo'Healon'

peines y cloruro de sodio 4-5 ° С durante 3-5 h;
tratamiento con pronaze;
precipitación con etanol.
8 Gallo Agua, 3 extracciones. Tejido: agua 1 (4-6), Precipitación con ácido tricloroacético (1-2%) Polvo liofilizado

peines 2-4 h del volumen de extracto a 20–22 ° С durante 1–2 h;
Eliminación de lípidos y agua con acetona y
éter tres veces.
9 Gallo Solución de cloruro de sodio al 1-15% a Centrifugación; Blanco similar a la fibra

peines 60 ° С , 18 h. Rendimiento 1,92% de la declaraciónliofilización. sustancia; contenido de proteí
material. 9-24%; densidad óptica de
Solución acuosa al 0,1%
0,1–0,14 a 540 nm
10 Gallo y Lavado de la materia prima puesta a tierra con Los extractos se filtran, las proteínas se eliminan en Hialuronano ultrapuro

pollo etanol con 1% de cloroformo. Extracción 60–80 ° С , 1–2 h con carbón, luego polvo, contenido proteico
peines con 3–3,5 volúmenes de agua, acidificada a dietilaminoetilcelulosa (1–1,5% de la menos del 0,1%
pH 3-4 a 90-100 ° С durante 40-60 min. volumen de extracción); (ovoalbúmina 0,001%)

Rendimiento 0,09%. filtración a 30–40 ° С a través de polivinil-
membranas de cloruro.
( Continuacion )
Tabla 3.2 (continuación)
# Fuente Extracción Purificación P

11 Gallo Antes de moler el tejido se trata con Filtración al vacío de los extractos; P
peines etanol en una proporción de 1: 2, luego triturar, tratar con Precipitación de pureza del 95% de HA con etanol
ultrasonido (16–20 kHz 20–25 min), Extracción en la proporción 1: 3, secado.

con agua a 45–50 ° С 20–25 min. 55% de
Podría extraerse ácido hialurónico.
12 Gallo La materia prima triturada se congela a (−20– Precipitación de HA con ácido acético; P
peines o 70 ° C), 2 partes de agua en peso añadidas ultrafiltración;
umbilical y la mezcla se calienta durante 15-25 liofilización.
cable minutos a 95–100 ° C. El método aumenta
el rendimiento de HA en 3-4 veces.
13 Gallo El tejido se trata con etanol en proporción Precipitación con etanol en la proporción 1: 3; P
peines 1: 2, extraído con agua con colagenasa filtración al vacío, secado al vacío o so
0.03–0.04% al peso del tejido para sublimación.

45–50 min, a 45–50 ° С , рН 6,8–7,0.
Como resultado, aumenta el rendimiento y mejora
calidad de HA.
14 Gallo El tejido congelado se trata con agua a 55 ° С , Precipitación con cloruro de cetilpiridinio; P
peines triturar y ajustar el pH a 7,5. La proteinasa es el polvo precipitado disuelto en 30% de
añadido y la proteólisis se lleva a cabo para etanol con cloruro de sodio y

3,5 h a 37 ° С . Después de la filtración 5,6 g del final volvió a precipitar con etanol.
El producto se obtiene a partir de 1 kg de tejido.
15 Gallo Los peines se hierven en agua durante 45 min, Filtración; P

peines o molido y calentado durante 4 ha 50 ° С y рН precipitación con cetilpiridinio
umbilical 7.5 con pronaze. Rendimiento 6,7 g de 1 kg de cloruro (CPC);
cable el tejido. El precipitante se disuelve en etanol al 30% con
cloruro de sodio y tratado con amonio
cloruro para precipitar el producto final.
dieciséis Cáscara de huevoLa membrana de cáscara de huevo húmeda se trata con un ajuste de pH a 7,2; P
membrana complejo de enzimas de levadura para reducir la Se añade cloruro de cetilpiridinio a 1:60 (v / v);
partículas de la membrana de la cáscara de huevo a un espesor,centrifugación o filtración;
lechada casi transparente. La lechada se diafiltra etanol añadido a la solución de HA filtrada a
utilizando un límite de peso molecular de 20000 Relación 2: 1;
membrana. centrifugación o filtración;
el precipitado se disuelve en NaCl 0,2 M
en tampón fosfato 0,2 M, pH 7,2;
precipitación con etanol, filtración y lavado con acetona.

Métodos de producción de ácido hialurónico 81
mediante extracción con agua-cloroformo o mediante una mezcla de

cloroformo- alcohol isoamílico en una proporción de 5: 1 [22]. Para
completar la eliminación de las proteínas, después de que la
precipitación HA se disuelva en agua, se agrega el mismo volumen de
cloroformo y la mezcla se agita intensamente durante 30-60 min hasta
que se crea la emulsión. Luego, la mezcla se deja crear dos capas, agua
y cloroformo, con o sin centrifugadora. Por lo general, las proteínas se
localizan en el borde situado entre las fases de agua y cloroformo.
Varias repeticiones de este procedimiento permiten la eliminación
de una cantidad considerable de impurezas proteicas. Sin embargo, la
HA de origen animal también contiene péptidos y proteínas unidos
covalentemente. Para eliminarlos, se podrían utilizar varias enzimas
proteolíticas como pepsina, tripsina, papaína o pronasa. Estas
enzimas tienen diferentes actividades óptimas dependiendo de su
temperatura, pH, composición iónica y fuerza del medio iónico. Para
eliminar otros mucopolisacáridos del producto final, se podría
realizar una precipitación fraccionada con cloruro de cetilpiridinio
[23], seguida de la disolución del complejo en cloruro de sodio 0,2N.
Los polisacáridos podrían eliminarse con cromatografía de
intercambio iónico, celulosa, filtración en gel en la columna de
agarosa o mediante sephadex. También podrían usarse otros métodos
para purificar hialuronano, incluyendo ultrafiltración, sorción sobre
carbón activado, resina de intercambio iónico , electrodiálisis,
electroforesis y ultracentrifusión con cloruro de cesio.
3.1.3 La producción química de hialuronano a partir de peines de pollo

Se han utilizado tres métodos principales para producir
químicamente hialuronano a partir de peines de pollo.
3.1.3.1 Ejemplo 1
El primer método es un proceso relativamente simple y corto [5] que
implica múltiples extracciones de agua de panales de gallo molidos,
precipitación de extractos combinados de HA con ácido acético,
tratamiento con base, hidrólisis enzimática de la proteína,
ultrafiltración, precipitación con etanol y disolución final. del
precipitado hialuronano en agua.
Primero, los panales de gallo se mantienen bajo agua fría que se debe
cambiar periódicamente para mantener la temperatura. Luego, los peines se
retiran del agua, se exprimen para drenar y se conectan a tierra con cuidado.
Se agrega agua al tejido molido en una proporción de peine / agua de 1: 2.5 y
se lleva a ebullición, después de lo cual se separa el extracto. El proceso de
extracción se repite seis veces. Es interesante que los extractos quinto y sexto
estén libres de lípidos, la proteína
El contenido es bastante mínimo y el contenido de HA es comparable
a los primeros cuatro extractos. A continuación, se combinan los
extractos quinto y sexto y se precipita el polisacárido con ácido acético
a pH 5 durante 18,5 h. El precipitado formado se separa, se disuelve
en agua destilada en una proporción de 1: 3 y el pH se ajusta a 8 con
una solución de hidróxido de sodio.
Luego se agrega una solución de papaína (200 ml de solución de
papaína al 0.1% por 1 kg de material). La hidrólisis enzimática de
proteínas se lleva a cabo durante 20 a 40 h. Cada 6-8 h, el pH debe
ajustarse a 6-7 (para optimizar la actividad enzimática). La mezcla de
HA se purifica mediante ultrafiltración y precipitación con etanol al
96%. El producto final, hialuronato de sodio, se seca por liofilización y
luego el precipitado se disuelve en una mezcla de agua y alcohol que
contiene 40% de etanol. La purificación final de hialuronano se
realiza mediante filtración por membrana de una solución que
contiene etanol al 30-50% .
3.1.3.2 Ejemplo 2
El segundo método de producción química [9] incluye la extracción doble del
peine de pollo molido con una solución acuosa del 5 al 25% de alcohol
n-propilo o isopropilo o terc- butílico con una relación peines / disolvente de
1: 10-15. Los extractos se combinan y se agrega cloruro de sodio hasta que se
hayan creado dos capas. Se separa la capa acuosa y se precipita HA con
etanol. El precipitante se seca por liofilización. El producto final representa
casi el 50% del contenido inicial de HA en los panales con un contenido de
proteínas inferior al 1%.
3.1.3.3 Ejemplo 3
El tercer método de producción de HA incluye un lavado inicial del tejido de
las crestas del gallo con agua caliente a 60 ° С durante 20-30 min. La
extracción en dos etapas de los panales homogeneizados con solución
fisiológica a 80–90 ° С se realiza con una relación tejido / disolvente de 1: 5.
La extracción con la solución fisiológica excluyó la contaminación con ácidos
nucleicos (los lípidos podrían eliminarse fácilmente de la superficie de la
solución). Las soluciones combinadas se tratan con ácido acético al 1-2% . El
precipitante obtenido se disuelve en agua destilada manteniendo la relación
precipitante / agua 1: 2, luego se añade 0,1% de hidróxido de sodio a la
solución hasta pH 7,0–7,3 y la solución se calienta lentamente hasta 80 ° С y
se filtra. La solución filtrada se liofiliza para producir hialuronato de sodio
con un rendimiento del 4% de la cantidad inicial en los peines.
3.1.4 Producción de HA para oftalmología

Un producto de HA especialmente puro para uso médico,
particularmente para oftalmología, fue obtenido en 1980 por la
compañía sueca Pharmacia con el nombre de 'Healon' [4]. El método
de producción incluye las siguientes etapas. El tejido animal molido se
trató con etanol al 95% desnaturalizado con cloroformo durante 24 h.
El tratamiento se repitió varias veces hasta que la solución
permaneció incolora y transparente. Luego se extrajo HA con una
mezcla de agua y cloroformo 20: 1. La mezcla se agitó y se dejó
reposar sin agitar durante 24 ha 4–25 ° С, la mezcla se filtró y la
extracción se repitió dos veces. Cloruro de sodio acuoso y cloroformo
1: 1 se añadieron a extractos combinados y una mezcla se agitó
durante 3-5 h a 4-25 ° С. Luego, la mezcla se mantuvo hasta que se
separaron las fracciones completas y se aisló la fracción orgánica. La
fracción acuosa se trató con ácido clorhídrico hasta pH 4-5 y se añadió
nuevamente el mismo volumen de cloroformo. Se repitió el
procedimiento hasta que la capa de cloroformo se volvió
transparente.
El método alternativo para eliminar proteínas es mediante el
tratamiento de la solución acuosa de hialuronano con enzimas
proteolíticas. Las enzimas proteolíticas se agregaron a la fase acuosa a
un pH de 6-7 mediante la adición de cloroformo y se agitó a 20-40 ° С
durante 5 días. La capa orgánica se separó y la fase acuosa se
esterilizó mediante filtración a través de filtros de teflón y se precipitó
con tres volúmenes de etanol. A continuación, el polisacárido se
precipitó de nuevo con etanol y acetona y finalmente se lavó tres
veces con acetona estéril y luego se secó al vacío.
El producto final contenía menos del 0,5% de proteínas y péptidos y tenía un
masa superior a 750 000 Da. La viscosidad cinemática de la solución al
1% en el tampón fisiológico fue de 10 1 –10 3 Stokes. El espectro UV de
una solución al 1,0% ( Å см 1%) a 257 y 280 nm (λмах): 257 (3), 280 (2).
El rendimiento típico es de 0,8 g de ácido hialurónico a partir de 1 kg
de panales de pollo. Healon es estéril, apirógeno y no tiene actividad
antigénica.
En otra patente [24] se describió un producto de gran pureza similar

al de Healon con una masa molecular de 1 586 000. Usando el método
descrito, se trató un tejido con etanol y luego se extrajo hialuronato de
sodio con agua. Las proteínas se eliminaron con enzimas proteolíticas,
seguido de extracción con cloroformo a pH 6-7. La esterilización se
realizó con cloruro de cetilpiridinio.
La patente [24] describía el método de producción de fracciones de
hialuronano con una masa molecular media de 250 000 a 350 000 Da.
Las proteínas, que todavía se encontraban en los extractos, se
hidrolizaron con papaína y luego la solución resultante se sometió a
ultrafiltración a través de una membrana. Además de la purificación,
la ultrafiltración permitió la separación de la fracción de 30 000 Da e
inferior, ya que una masa molecular de HA tan baja podría activar
procesos de inflamación cuando se aplica por vía parenteral. La
membrana puede contener fracciones de HA por encima de 30000.
La siguiente etapa de ultrafiltración se llevó a cabo en otra
membrana que podía contener moléculas con una masa superior a
200 000 Da. La segunda fracción que pasó a través de la membrana
tenía una masa promedio de 50 000 a 100 000 Da. Este producto
recibió el nombre de 'Hyalastine'. La fracción que permaneció en la
membrana tenía una masa molecular promedio de 500 000 a 730 000
y se llama 'Hyalectina'.
S. Lorenzi y A. Romeo encontraron un método interesante que evita la
despolimerización del HA durante el proceso de extracción [25]. Se logró
mediante la adición de 1,10- fenantrolina en una solución de extracción. La
purificación de las proteínas se realizó mediante proteasas. Se realizó una
etapa de purificación final mediante una transformación de HA en sal de
amonio trimestral y las impurezas se aislaron mediante cromatografía de
intercambio iónico utilizando dimetilsulfóxido o N-metilpirrolidona como
disolventes. La esterilización se realizó con cloruro de cetilpiridinio en un
tampón fosfato. La filtración molecular final permitió el aislamiento de la
fracción del biopolímero con una masa molecular de 750 000–1 230 000 Da.
El producto recibió el nombre 'HA-1'. Su contenido de proteína no
supera el 0,2% (por J. Lowry [26], calculado para la albúmina), su
viscosidad estática está en el rango de 14,5-21 dl / g (determinada por
un viscosímetro tipo Ubbelohde a 25 ° С a 0,15М ), su solución de
cloruro de sodio tiene un pH de 7,0 y la absorción de UV de la solución
al 1,0% a 257 y 280 nm no es superior a 1,0 AU). Según lo determinado
en el instrumento con plasma acoplado inductivo (ICP), el contenido
de mucopolisacáridos sulfatados no excedió el 0.07% basado en el
contenido de azufre. El contenido de hierro no excedió de 10 ppm por
absorción atómica espectral o por ICP. La estabilidad de las soluciones
tampón isotónicas a pH 7,0 de HA-1, que experimentaron el
envejecimiento normal y la esterilización térmica, se midió mediante
la viscosidad estática y se describió como la reducción de la masa
molecular media. La estabilidad de HA-1 no excedió los siguientes
datos límite:
●● 97% de los valores iniciales en el almacenamiento durante 6 meses a 25 ° С
●● 75% de los valores iniciales en la esterilización (118 ° С) durante 32 min
●● 90% de los valores iniciales en la esterilización (124 ° С) durante 8 min.
Los tejidos conectivos y los líquidos de HA, por regla general, existen
en primer lugar como condroitín sulfatos en asociación con colágeno
[27, 28] y otros glicosaminoglicanos. Por tanto, los métodos de
purificación deben incluir la purificación de HA a partir de estas
impurezas. Una extracción de hialuronato con agua y soluciones
salinas acuosas se acompaña de la presencia de una gran cantidad de
impurezas de naturaleza proteica, otros polisacáridos, ácidos
nucleicos, lípidos y lipoproteínas. La limitación de los métodos
fermentativos de eliminación de proteínas.
depende de la actividad de las enzimas proteolíticas del contenido de

lípidos residuales. La purificación parcial de los lípidos se realiza con
agua caliente, acetona y etanol. Este método de extracción de base
requiere la eliminación de los lípidos y podría conducir a la
destrucción del biopolímero. Como reactivos de precipitación, se
utilizan con mayor frecuencia cloruro y bromuro de
cetiltrimetilamonio [26,29]. Las propiedades de las sales de amonio de
los glicosaminoglicanos ácidos y las proteínas son bastante diferentes,
lo que permite su separación.
Usando las sales de amonio trimestrales, es posible realizar el
fraccionamiento de hialuronano, que se puede hacer agregando
cloruro de cetilpiridinamonio a una solución de hialuronato de sodio
en una solución de sulfato de sodio 0.25 N. El sobrenadante se diluye
posteriormente con sulfato de sodio acuoso a concentraciones de 0,19,
0,174, 0,165, 0,130 y 0,06 N. Después de cada dilución, la solución se
centrifuga y el HA se aísla del precipitante mediante diálisis y se
vuelve a precipitar con tres volúmenes de etanol. Como resultado, se
aíslan varias fracciones con diferentes masas moleculares. Se podría
lograr un resultado similar mediante precipitación fraccionada con
acetona o ultrafiltración molecular a través de las membranas
apropiadas [24, 25].
Complejos Cetylpiridinum de HA se purifican y se fraccionó por el
diferencial de re-precipitación y cromatografía en Sephadex y
de intercambio iónico resinas [25]. Las proteínas, péptidos y
nucleótidos se eliminan del HA por absorción en el carbón activado a
través de resinas de intercambio iónico como Dowex-1. El HA y los
mucopolisacáridos
la mezcla se separa sobre las columnas cromatográficas con los
sorbentes elaborados a partir del vidrio poroso, sephadex, agarosa,
resinas de intercambio iónico y otros portadores y se centrifuga en los
gradientes de densidad. Al mismo tiempo, se analizan parámetros
físico-químicos como la masa molecular media y la distribución de la
masa molecular del biopolímero. Las características de los otros
métodos de aislamiento de HA se presentan en la Tabla 2.2.
Las fuentes de materiales para el aislamiento preparativo de HA
suelen incluir crestas de gallo, ojo vítreo, cordones umbilicales, piel de
mamíferos y cartílagos de tiburones y ballenas. Los nuevos métodos
de producción de HA están relacionados con su biosíntesis en cultivo
celular y la creación de simulacros de microorganismos modificados
genéticamente.
3.2 Métodos bacterianos de producción de ácido hialurónico
La producción moderna de HA se realiza mediante métodos microbiológicos;

gran cantidad de
Se ha acumulado literatura científica y de patentes sobre la
producción de ácido hialurónico por métodos microbiológicos y está
disponible como referencia [30].
Una cantidad limitada de bacterias grampositivas ( Streptococcus sp
. Y Pasteurella sp.) Son capaces de sintetizar un polisacárido de la
cápsula superior (1 mm de espesor) que crean [31,32]. La mayoría de
estos microorganismos son patógenos para los seres humanos y los
animales, pero también pueden parasitar en el espacio intercelular
del tejido del mamífero. Es por eso que existe una gran demanda de
estos microorganismos:
1. No deben ser patógenos para los seres humanos y no

mostrar actividad hemolítica. 2. Deben ser capaces de
sintetizar HA de alto peso molecular a alta velocidad.
3. No deben mostrar ninguna actividad hialuronidasa para no
hidrolizar el producto de alto peso molecular.
4. Deben ser estables cuando se almacenan.

5. Deben utilizar un sustrato lo más completo posible.
En la actualidad, tales cepas no hemolíticas y negativas a hialuronidasa se
obtienen habitualmente mediante mutagénesis inducida por UF y química
no directa , seguida de selección o clonación del gen de hialuronidasa para
transformar Streptococcus sp. en bacterias no patógenas [33]. De todos los
productores de hialuronano, la cepa más apropiada es el estreptococo del
grupo C, que es Streptococcus equi porque produce el mayor rendimiento de
HA [30].
Los métodos biotecnológicos de producción de hialuronano a partir de cepas
bacterianas implican
cultivo en condiciones seleccionadas donde la cápsula de polisacárido
se forma durante la etapa de crecimiento logarítmico en la superficie
de las células bacterianas. Pero en la etapa de crecimiento
estacionario, el HA puede pasar al líquido de cultivo y una cápsula
puede adelgazarse o desaparecer por completo [30]. Al final del
proceso, se podrían acumular hasta 1–6 g del producto deseable en 1 l
del líquido de cultivo. La acumulación de HA podría controlarse
midiendo la viscosidad del líquido de cultivo.
La producción de HA a partir de los medios de cultivo implica la
remoción de microorganismos, remoción de sustancias de bajo peso
molecular por ultrafiltración, precipitación con solvente orgánico y
purificación del producto final utilizando los métodos descritos
anteriormente para los tejidos animales (Cuadro 2.2). Al final, el
producto comercial aparece como un polvo blanco, escamas o una
solución al 1% (la solución tiene un peso molecular promedio de 1 000
000 Da y puede tener distribuciones de peso molecular variables).
3.3 Destrucción de hialuronano durante la

producción, almacenamiento y
esterilización
Una de las tareas más importantes durante la extracción de

polisacáridos de tejidos animales y microorganismos es mantener la
integridad de la macromolécula. Dado que el HA tiene un alto peso
molecular (hasta 9 000 000 Da) y estructuras lineales rectas de hasta
2,4 mm [34,35], es muy sensible a las perturbaciones mecánicas,
térmicas, químicas y enzimáticas que podrían resultar en una
disminución de la concentración molecular. peso o grado de
polimerización durante los procesos de extracción, purificación,
esterilización y almacenamiento.
Las cadenas largas de polisacáridos de HA en soluciones acuosas
podrían fragmentarse en diversas condiciones físicas y químicas,
incluidos ultrasonido, radiación, alta temperatura, pH extremo,
exposición a reactivos de oxidación, radicales libres y movimiento
dinámico. Sin embargo, debe tenerse en cuenta principalmente que el
HA podría verse afectado por las hialuronidasas, lo que provocaría
una degradación enzimática. Como resultado, generalmente la
extracción y purificación proporciona a los productos comerciales de
HA una masa molecular promedio de 1 a 2 × 10 6 Da y una
distribución de masa bastante amplia (Figura 3.1).
Es importante controlar el peso molecular (o la longitud) del
polisacárido durante la producción porque tiene un efecto directo
sobre las propiedades biológicas y terapéuticas de HA. Por ejemplo,
los oligosacáridos con un peso molecular de aproximadamente 10 000
Da podrían inducir la angiogénesis [36] y los tetra- y hexasacáridos
podrían activar las células dendríticas [37]. (Las funciones de los
oligosacáridos se describen en los Capítulos 2 y 6.) Por tanto, es
importante para las aplicaciones médicas y cosméticas de HA obtener
los oligosacáridos con el peso molecular requerido.
3.4 Destrucción enzimática de hialuronano
La destrucción de HA tiene lugar inicialmente mediante hialuronidasa

de los tejidos animales o hialuronidasa bacteriana. En los tejidos
animales, la despolimerización del biopolímero se realiza mediante
hialuronidasas (endoglicolasas), beta-glucuronidasa y
beta-N-acetilhexozaminidasa (exoglucolasa). Las acciones de la
hialuronidasa conducen a la hidrólisis de los enlaces a lo largo de la
cadena del polisacárido que se atribuyen a la reducción del peso
molecular del polisacárido durante la extracción. Otras enzimas
afectan el extremo de la cadena y descomponen el polímero al final de
la molécula. La velocidad de reacción depende de la longitud de la
cadena: cuanto más larga es la cadena, mayor es la velocidad de
descomposición hasta que da como resultado oligosacáridos y se
descompone en mezclas de octa-, hexa-, tetra- y disacáridos. Con un
aumento en el grado de despolimerización del biopolímero, la
actividad de las endohialuronidasas se reduce pero la actividad de las
exoglicanasas aumenta. Además, las exoglicanas transforman incluso
los oligosacáridos en extraños (p. Ej., Trisacáridos y pentasacáridos ) y
aumentan la concentración de ácido glucurónico libre y
acetilglucosamina [2]. Para suprimir la actividad de las enzimas y la
hidrólisis enzimática no controlada , se recomienda realizar la
extracción de HA a baja temperatura y, en presencia de cloroformo
[38-40], tratar los peines con agua caliente, realizar extracción a alta
temperatura (60–100 ° С) [5,7,10,12] y use un pH bajo hasta 3–4 [7]. Se
conocen bien muchos activadores e inhibidores de la hialuronidasa
tisular animal (véase el capítulo 2). El uso de inhibidores de la
hialuronidasa permite reducir la tasa de despolimerización del
hialuronano durante su extracción [25]. La reducción de la tasa de
destrucción enzimática durante la síntesis microbiológica podría
lograrse mediante el uso de cepas bacterianas
hialuronidasa negativas .
A continuación se presenta la descripción detallada de las
principales características de las enzimas hialuronidasas.
3.4.1 Clasificación de la hialuronidasa

Recientemente, se han publicado numerosos estudios sobre la
localización, estructura y propiedades del hialuronano [41]. Sin
embargo, la sistematización propuesta inicialmente por K. Meyer
sigue siendo relevante. Según la clasificación de Meyer [42], las
hialuronidasas se pueden dividir en tres tipos según los criterios de la
enzima fuente, el tipo de reacción que la enzima podría catalizar y los
productos finales.
Tipo 1. Hialuronidasas de tipo testiculante (hialuronato-endo-β-N-acetilhexozam
●● Tipo 1a. Hialuronidasa testicular, que está contenida en las
glándulas seminales y el esperma de los animales;
●● Escriba 1b. Hialuronidasa lizosomal, que está presente en los
lzosomas de las diferentes células, suero sanguíneo, líquido
sinovial;
●● Escriba 1c. Hialuronidasa submandibular, que está presente en la saliva y
salival de los animales
glándulas.
Tipo 2. Hialuronidasa de la saliva de sanguijuela. Los productos
finales de la hidrólisis por tanto de tipo 1 y tipo 2 hialuronidasas son
tetrasacáridos, que poseen amino azúcar en su extremo reductor y
se activan con las enzimas de tipo 1. Además, las hialuronidasas
testiculares y lyzosomal son capaces de trans-glicosilasa actividad y
puede transferir fragmentos de disacáridos entre las moléculas del

sustrato. La hialuronidasa testicular es activa dentro del rango de pH
de 4.0 a 7.0, pero la litosoma y
submandibular- hialuronidasas sólo están activos en el
intervalo más estrecho de pH 3.5 hasta 4.5. A pH 8,2, las enzimas no
están activas.
Tipo 3. Hialuronidasas microbianas (por ejemplo, Streptococcus
hialuronidasa). Las hialuronidasas microbianas hidrolizan los
enlaces β-N-acetilaminoglucósidos de un sustrato y simultáneamente
deshidratan el residuo de ácido urónico en el extremo no reductor de la
molécula. La especificidad de sustrato de las hialuronato liasas bacterianas
varía considerablemente en las diferentes especies de productores de
microbios. La hialuronidasa de Streptococcus pneumoniae tiene la
especificidad de sustrato más alta; hidroliza el HA solo y no destruye otros
glucosaminoglicanos [43]. La hialuronato liasa, cuando se aísla de
Streptococcus pneumoniae , alcanza una actividad óptima a pH 6,0 con la
constante de Michaelis con respecto a HA igual a 3,8 × 10 –4 mol / l (en
términos de cinética de Michaelis-Menten ) [44]. La presencia de Са 2+
(aproximadamente 10 mM) es necesaria para mostrar la máxima actividad
enzimática.
3.4.2 Propiedades y funciones de las hialuronidasas

Las hialuronidasas de mamíferos, como la hialuronidasa testicular,
hidrolizan enlaces β-1,4-glucósidos dentro de la cadena HA, formando
oligosacáridos de diferentes tamaños. Después de una incubación
prolongada, los productos finales son principalmente hexa y
tetrasacáridos [37]. Las hialuronidasas de mamíferos no tienen una
especificidad de sustrato absoluta y podrían hidrolizar el condroitín
-4-sulfato, el condroitín-6-sulfato y el dermatansulfato. Además, estas
enzimas tienen actividad transglicosilato (en [45] se describen más
detalles sobre las isoformas de hialuronidasa y las propiedades en los
tejidos somáticos humanos y los fluidos corporales).
En las tecnologías microbiológicas de producción de HA se
fragmenta por las hialuronidasas bacterianas que se transportan a los
medios de cultivo. Se denominan hialuronato liasas porque son
endo-β-acetilhexosamina eliminasas. El representante más típico de
esta clase de enzimas son las hialuronato liasas de Streptococcus . Las
hialuronato liasas bacterianas hidrolizan los enlaces
endo-β-1,4-glucósidos en HA a través de la reacción de eliminación β ,
el resultado de la misma es la formación de oligosacáridos
4,5-insaturados de diferentes longitudes.
El producto final de la escisión enzimática es un disacárido
4,5-insaturado . Por lo tanto, la despolimerización de HA con
hialuronato liasas bacterianas puede controlarse no solo mediante
métodos viscosimétricos sino también espectrofotométricos. A
diferencia de la hialuronidasa bacteriana, las de tejidos animales
pueden fragmentar el HA, lo que podría resultar en la producción de
oligosacáridos saturados.
La enzima más apropiada para la fragmentación de HA puro es la
hialuronidasa testicular. Hidroliza el HA mediante la formación de
oligosacáridos saturados (que son importantes para el uso
terapéutico), es activo en el amplio rango de pH 4.0–7.0 y tiene una
alta estabilidad térmica (puede mantener la actividad enzimática
hasta 50 ° С).
Las hialuronato liasas bacterianas tienen una especificidad de sustrato
estrecha. Dividen el HA que tiene una tasa más alta para reducir el peso
molecular de los productos finales. Al mismo tiempo, crean oligosacáridos
insaturados que probablemente tengan propiedades terapéuticas diferentes
a los oligosacáridos saturados. Se aislaron varios oligosacáridos insaturados
después de un tratamiento con hialuronato liasas para estudiar sus
propiedades [46]. Las hialuronato liasas bacterianas podrían ayudar a
estudiar la cinética de la despolimerización de HA utilizando métodos
espectrofotométricos que permitan identificar el nivel de insaturación de los
productos de reacción.
En las referencias [47] se recopilan más detalles sobre el efecto de la

concentración de enzima HA y la fuerza iónica de los medios sobre la
cinética de la hidrólisis.
Después del tratamiento enzimático, el nivel de fragmentación de
HA y el peso molecular medio de los oligosacáridos pueden
determinarse mediante viscosimetría. El análisis de la distribución del
peso molecular y el aislamiento de las diversas fracciones podría
realizarse mediante cromatografía en gel utilizando las columnas con
sefarosa 4B (Figura 3.1) o cromatografía de intercambio iónico [46].
El HA también se podría hidrolizar con dimetilsulfóxido / ácido
clorhídrico [46] o con ácido clorhídrico diluido [48], seguido por el
aislamiento de las fracciones de oligosacáridos. Sin embargo, la
fermentación enzimática es económicamente más viable. Un ejemplo
de la producción típica de oligosacáridos de HA de bajo peso
molecular se describe en [37], en el que HA se fragmentó con
hialuronidasa testicular durante 12 h en tampón acetato de sodio 1 M
a pH 5,0 y 37 ° С. Los fragmentos se aislaron en la columna Biogel P10.
El tamaño de los fragmentos se determinó mediante electroforesis en
gel de poliacrilamida 30.
3.5 Destrucción no enzimática de hialuronano

Además de la hidrólisis enzimática, el HA es bastante sensible a
diferentes tratamientos no enzimáticos ; que es hidrólisis
ácido-alcalina , oxidación-reducción y otras.
3.5.1 Hidrólisis ácido-base de hialuronano

En primer lugar, el HA es sensible a la hidrólisis ácido-alcalina .
Incluso una ligera acidificación de HA por una solución de ácido
acético conduce a una disminución irreversible de la viscosidad en 2,5
veces [34]. Los ácidos minerales pueden hidrolizar completamente HA
en ácido glucurónico, glucosamina, ácido acético y dióxido de
carbono. Y, en un corto período de tiempo, el ácido sulfúrico diluido
hidroliza el ácido hialurónico para formar cristales de disacárido [35].
3.5.2 Despolimerización por oxidación-reducción de hialuronano

Mediante el proceso de tratamiento de los medios redox, la
degradación de las macromoléculas de polisacárido se realiza
mediante un mecanismo de radicales libres mediante el cual los
radicales libres se forman en presencia de ácido ascórbico, oxidasa y
oxígeno [49]. El HA podría ser despolimerizado por los iones Fe 2+ y Fe
3+ en presencia de reactivos reductores, particularmente ácido
ascórbico. Esto explica por qué el HA aislado en la atmósfera de
nitrógeno o argón tiene un nivel de polimerización más alto en
comparación con el HA aislado en el aire [1].
Durante la liofilización de soluciones de hialuronano, la
degradación de polisacáridos se inicia con iones fosfato [50]. Para la
purificación de proteínas, las enzimas proteolíticas también podrían
usarse para reducir la viscosidad del biopolímero, particularmente
los grupos SH de papaína que son agentes reductores y aceleran la
descomposición del hialuronano.
[34]. La tripsina, que contiene iones Fе 3+ , también podría usarse
para la purificación de hialuronano y para iniciar el proceso de
despolimerización. El uso de 8-hidroxiquinolina evita la reducción de
la viscosidad del HA [25]. Para mantener el nivel de polimerización de
hialuronano, el tejido inicial debe lavarse a fondo de la sangre, que
contiene iones de hierro, cobre y fosfato.
Para uso médico, las soluciones de hialuronano deben esterilizarse.

La esterilización generalmente se logra mediante autoclave a
120-130 ° C o mediante radiación gamma ionizante. En ambos casos se
produce una despolimerización significativa del biopolímero y
pérdida de su actividad terapéutica inicial. Existen métodos para
proteger las soluciones de hialuronano contra la despolimerización
mediante la adición de aminoácidos, ácido bórico y glicerol, sulfato de
hidroprolina, ácido úrico y compuestos fenólicos, por ejemplo
pirogalol [40].
El método más eficaz se describe en la patente [40]. Se disolvió 1 g de
HA en 100 ml de solución de cloruro de sodio al 0,9%. La solución
resultante se purgó con argón durante 30 min a 10 ml / min y se
añadieron 0,02-0,04 g de sulfato de cobre y 0,06-0,08 g de ascorbato de
sodio. A continuación, la solución se vertió en ampollas de 1 ml bajo
argón y las ampollas se sellaron y esterilizaron mediante una dosis de
15 kGy de radiación gamma. Este método permite prevenir la
destrucción de hialuronano en solución durante la irradiación y el
almacenamiento prolongado.
3.6 Calidad de los productos comerciales de

hialuronano de origen animal y
bacteriano
El producto comercial de hialuronano debe cumplir con varios

requisitos de calidad al cumplir los criterios de aceptación. En la Tabla
3.3 se muestra la especificación típica del producto con varios
parámetros de calidad y criterios de aceptación.
Las características adicionales podrían incluir peso molecular
promedio, nitrógeno, contenido de azufre y otros elementos.
Se han descrito varios métodos para determinar el contenido de
hialuronano. Según el método Dische antes mencionado, el contenido
de ácido glucurónico podría encontrarse en HA [51]. El método
Morgan-Elson , modificado por Bitter, podría utilizarse para evaluar el
contenido de HA por el contenido de N-acetilaminoglucosa [52]. Si el
producto no contiene otros polisacáridos como impurezas, el
contenido de ácido glucurónico y N-acetilaminoglucosa debe ser
cercano a 1: 1.
La ausencia o el bajo nivel de contenido de azufre en un producto de
hialuronano es otro criterio que sugiere una ausencia o una pequeña
cantidad de mucopolisacáridos sulfatados. La presencia de otras impurezas
podría determinarse cualitativamente mediante la absorción del
biopolímero en el papel de filtro y la coloración con azul de toluidina [53]. El
hialuronano da un fuerte color azul brillante, mientras que el quitosano y
otros polisacáridos que contienen grupos amino se revelan como puntos
débiles. Los ácidos nucleicos (ADN y ARN en la concentración de 10 mg / ml y
más) aparecen como una mancha azul débil con un anillo más débil
alrededor de la mancha. Los polisacáridos neutros, las proteínas y las
moléculas pequeñas no aparecen en la cromatografía en papel, aunque sí lo
hacen muchos polisacáridos ácidos. El número de impurezas de ácidos
nucleicos podría determinarse con mayor precisión mediante métodos
químicos [4], o espectrofotométricamente por efecto hipercrómico.
[54]. La concentración de proteínas se suele determinar mediante el
método de Lowry [26] utilizando el reactivo de Folin-Chokalteu . Este
es el método más sensible para la determinación cuantitativa de
proteínas ya que se basa en una combinación de reacción de biuret y
la reducción del reactivo de Folin-Chokalteu por residuos de tirosina y
triptófano en la proteína.
Cabe señalar, sin embargo, que la sensibilidad del método se reduce
porque el HA en los tejidos animales está conectado principalmente
con proteínas fibrosas de la matriz intercelular (colágeno, elastina,
etc.), que contienen cantidades muy pequeñas de estos aminoácidos. .
Por la misma razón, los métodos espectrofotométricos para determinar
la concentración de proteína a 280 nm
Tabla 3.3 Especificación típica del producto comercial de hialuronano

No. Parámetro de calidad (prueba) Criterios de aceptación

1 Apariencia
En disolvente orgánico tiene una estructu
la forma de las fibras individuales y los g
en forma seca es una sustancia en po
2 Color Material blanco, puede ser ligeramente c
3 Olor Olor débil, característico de ciertos
tipo de materia prima
4 Contenido de masa en seco- humedad 6.0
compuesto,% no - proteínas 0,5
más que - ceniza 4.0
5 Viscosidad cinemática, m 2 / с 2,0 × 10 –4
6 Solución al 1% 6,5 ± 1,0
7 Sales de metales pesados, - dirigir 5,0
mg / kg, no más de - arsénico 5,0
- mercurio 1.0
8 Datos toxicologicos - toxicidad aguda Más de 2500
LD 50 en la piel
- acción irritante sobre No presente
piel acción de una vez
- acción irritante sobre No presente
piel múltiples acciones
- acción sensibilizante No presente
- acción irritante para No presente
el ojo de conejo
membrana mucosa
9 Datos microbiológicos - Microbios en 1 g de
el producto
- Enterobacteriaceae No más de 100
- Pseudomonas No presente
aeruginosa
- Staphilococcus No presente
aereus

- Hongo Р. candida No presente
- Moho en No presente
1g del producto

(la máxima absorción de aminoácidos aromáticos - triptófano, tirosina

y fenilalanina) también tienen una sensibilidad reducida. Por tanto,
un método más preciso y fiable para determinar la concentración de
proteínas en hialuronano es el método mediante el cual se mide la
cinética de la concentración de aminoácidos en las condiciones de
proteólisis (p. Ej. Pronasa). La dinámica de crecimiento de la
concentración de aminoácidos libres se determina mediante la
reacción estándar con ninhidrina [55].
Un contenido de proteína total de 0.5% o menos en un producto
comercial se considera seguro con respecto a las propiedades
inmunogénicas del producto. Entre las impurezas de la proteína, las
propiedades más antigenéticas se atribuyen a la ovoalbúmina, que
tiene la capacidad de penetrar a través de la piel y las membranas
mucosas sin pasar por la barrera inmune. El contenido de
ovoalbúmina se pudo determinar mediante un sistema de
prueba de enzimas inmunes en fase sólida con una sensibilidad de
-0,5 ng / ml. Su contenido debe ser inferior al 0,2% del contenido total
de proteínas.
Cromatografía en gel de HA sobre sefarosa 4B

1,16

1,14
Muestra 2 Muestra 1

1.12
viscosidad
1,10
1.08
Relativo
1.06
1.04

1.02

1,00
560000
350000
140000
2800000
2200000
1800000
1000000
250000
80000

Peso molecular, Da
Figura 3.1 Distribución del peso molecular de dos productos comerciales de HA
El valor del peso molecular medio de hialuronano requerido por la

especificación no revela su distribución de peso molecular. Dichos datos
podrían evaluarse mediante cromatografía en gel utilizando medios de
sefarosa. La Figura 3.1 muestra un espectro de distribución de peso
molecular de dos productos comerciales diferentes de HA de origen
bacteriano [56,57].
Estos datos, producidos por dos empresas diferentes mediante
fermentación microbiológica, muestran el amplio rango de peso
molecular del HA. Sin embargo, ambos certificados de análisis indican
el mismo peso molecular medio: 1 000 000 Da. Según nuestra
experiencia, los productos comerciales de diferentes proveedores
podrían variar en su distribución de peso molecular dependiendo del
lote del producto comercial, incluso del mismo proveedor. Esta
importante característica depende de muchos factores diferentes,
como la fuente y el método de extracción, la purificación, la
esterilización y el almacenamiento.
El conservadurismo evolutivo del hialuronano es un hecho
bien conocido . Esto significa que durante la evolución de los
organismos vivos, la estructura química de HA no cambia. El
conservadurismo evolutivo es característico de las estructuras
biológicas vitales. Debido a este rasgo, cualquier HA extraído de
diferentes fuentes es compatible con las células y tejidos del cuerpo
humano; no provoque alergias, reacciones pirogénicas, irritación u
otras consecuencias negativas de la aplicación. Sin embargo, los
análisis toxicológicos de los productos comerciales de HA incluyen
solo un número limitado de evaluaciones cuantitativas de
contaminantes microbiológicos y reacciones en la piel de los animales
después de la aplicación de HA (Tabla 3.2).
En la actualidad, la cuota de mercado del hialuronano comercial de
origen bacteriano es significativamente superior a los productos
extraídos de origen animal, debido a que la síntesis microbiológica
ofrece un rendimiento significativamente superior: la fermentación de
la cepa Streptococcus sp. resultó en una concentración de polisacárido
de 5-6 g por 1 l de medio de cultivo. Comparativamente, el rendimiento
de HA en la extracción de las crestas de pollo es de 0,5 ga 6 g por 1 kg
de materia prima. Debido a que la purificación de HA bacteriano a
partir de proteínas y péptidos es más fácil, por lo tanto, es más fácil
obtener el producto de HA con una masa molecular de ~ 1 millón de Da
y un contenido de proteína de menos del 0,05%. Los productos HA de
Los tejidos animales tienen un peso molecular medio de 750 000 Da y

un contenido de proteínas de aproximadamente el 0,5% y poseen
proteínas de bajo peso molecular unidas covalentemente. La
purificación de estas proteínas requiere manipulaciones estrictas que
reduzcan el peso molecular del hialuronano. Debido a que las
proteínas contaminantes son alérgenos importantes, el grado de
purificación de las proteínas es una característica principal de la
seguridad de los medicamentos. Sin embargo, se debe considerar que
el grado de inmunogenicidad de las impurezas proteicas en el
producto de origen bacteriano podría ser mayor que en los productos
de origen animal a pesar de los niveles generales más bajos.
Como se mencionó anteriormente, durante la extracción los
polisacáridos se descomponen parcialmente por las hialuronidasas
para convertirse en oligosacáridos que poseen hexosamina en el
extremo reductor y ácido glucurónico en el extremo no reductor . Se
sabe que las hialuronidasas animales y las hialuronidasas bacterianas
tienen diferentes mecanismos de acción. Cada uno de ellos escinde
enlaces β- (1-4) -glucósidos en el biopolímero, pero al contrario de las
hialuronidasas animales, las hialuronitliasis bacterianas realizan
hidrólisis intermolecular con eliminación de agua. Como resultado, se
crean diferentes disacáridos con el doble enlace entre los átomos de
carbono С4 y С5 del ácido glucurónico [58]. La presencia de dobles
enlaces ayuda a evaluar el nivel y la cinética de la despolimerización
enzimática midiendo la acumulación de dobles enlaces mediante
análisis espectrofotométrico a 232 nm.
La presencia de ácidos nucleicos en los productos de HA no suele
evaluarse ni declararse en el certificado de análisis. Aunque la
antigenicidad de las impurezas de ARN y ADN es baja, debido a la
presencia de proteínas residuales, pueden ser parcialmente
responsables de la antigenicidad total. El material de tejido animal
podría contener polisacáridos sulfatados como contaminación.
Existen métodos para separar los polisacáridos que pueden reducir la
concentración de estas impurezas al 0,07% en función del contenido
de azufre [25]. Además, los mucopolisacáridos sulfatados, como el
hialuronano, son polisacáridos naturales de los tejidos animales y, por
tanto, no provocan reacciones inflamatorias.
El verdadero problema durante la síntesis enzimática de
hialuronano podría ser el cultivo de patógenos en los reactores. La
creación de cepas de microorganismos modificados genéticamente
que sintetizan el polisacárido es un peligro potencial en la
transferencia de ADN transgénico (ARN) a otras cepas y sistemas
parasitarios [59]. Considerando el hecho de que la mayoría de los
organismos que sintetizan HA son, hasta cierto punto, patógenos para
animales avanzados y humanos y parásitos en la matriz intercelular
de tejidos de mamíferos, desde el punto de vista toxicológico, los
productos de HA de tejidos animales pueden ser más deseable para
aplicaciones médicas. Sin embargo, esta cuestión requiere un estudio
más profundo .
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4
Estructura molecular y
supramolecular del
ácido hialurónico
4.1 Estructura primaria del ácido hialurónico
La estructura molecular (estructura química) de cualquier sustancia

polimérica, es decir, su composición química y la forma en que los átomos
están conectados en la molécula, no determina inequívocamente el
comportamiento y las propiedades de los materiales biopoliméricos
construidos a partir de estos.
macromoléculas . Las propiedades de tales sustancias
dependen también de su estructura supramolecular (física). Se refiere
a la organización tridimensional de las macromoléculas. Las
estructuras supramoleculares de los compuestos poliméricos tienen
diversas formas que determinan las propiedades estructurales y
funcionales de los biopolímeros. Es imposible observar la estructura
de las moléculas biológicas y su dinámica a nivel atómico in vivo ,
aunque se podrían utilizar varios métodos de investigación física
diferentes, incluidos los rayos X hidrodinámicos, ópticos, de
bajo ángulo y la difracción de neutrones, los rayos X estructurales y de
neutrones. -Análisis estructurales , RMN, microscopía electrónica y
micro calorimetría de barrido .
El laboratorio de K. Meyer tardó casi 20 años (desde el primer
descubrimiento en 1934 hasta la publicación en Nature que incluía
una fórmula completamente descrita) para completar el trabajo que
determinó la estructura química precisa de la macromolécula de
hialuronano (Figura 4.1) [1,2]. Las moléculas de HA son
heteropolisacáridos lineales aniónicos construidos a partir de
residuos que se alternan regularmente de ácido d-glucurónico y
N-acetil-d-glucosamina. En una molécula de ácido hialurónico, el
amino-azúcar está unido al ácido d-glucurónico por un enlace
β- (1 → 4) -glucósido y el ácido glucurónico con amino-azúcar por un
enlace β- (1 → 3) -glucosídico (Figura 4.1) [3].
Todos los sustituyentes voluminosos unidos a átomos de carbono del anillo
de piranosa (grupos hidroxilo, carboxilo y acetamida) y un enlace glicosídico
con residuos hidrocarbonados conectados ocupan una posición ecuatorial y
estéricamente más favorable. Los átomos de hidrógeno se encuentran en
posiciones axiales menos favorables desde el punto de vista estérico (Figura
4.2), lo que explica por qué parte de la molécula


COOH
CH 2 OH
H O H O
Ácido hialurónico
H H
O O O
OH H H
H H
HO

H OH
H NHCOCH 3 norte

Residuo de ácido glucurónico Residuo de glucosamina
Figura 4.1 Estructura de la unidad de disacárido de la molécula de hialuronano.

Ambos residuos de hidrocarburos corresponden a la forma β de la molécula de
glucosa (β- d -glucopiranosa)
CO - CH OH

H 2 H 2

O

O

O HO
H H
HO H O H O

H

OH H

H
O NUEVA HAMPSHIREH

C
CH 3
Figura 4.2 Imagen esquemática tridimensional de la unidad de disacárido de la

molécula de hialuronano, que muestra la conformación de los residuos de
hidrocarburos.
es hidrofóbico. Los grupos carboxilo, hidroxilo y acetamida proporcionan

hidrófilos
propiedades de la molécula de polisacárido.
La presencia de fragmentos polares y no polares en la estructura de
la macromolécula determina la capacidad del hialuronano para
interactuar con diferentes compuestos químicos y juega un papel
importante en las diversas transformaciones conformacionales. El
hialuronano puede existir en la célula.
superficie en un número increíblemente grande de estados
conformacionales (cadenas alargadas, hélices 'relajadas'
(no condensadas) , estructuras condensadas en forma de varilla ,
hélices, estructuras similares al collar de perlas y 'clips'). Las cadenas
de HA, cuando interactúan entre sí, forman fibrillas, redes y otras
estructuras.
Para la molécula de hialuronano, una característica es la creación de una
serie de enlaces de hidrógeno, que estabilizan la macromolécula en
soluciones acuosas. Esto se ha de demostrarse a través 13 estudio C RMN [4].
Estos enlaces se forman dentro de la macromolécula entre los residuos de
hidrocarburos vecinos y las moléculas vecinas. En soluciones acuosas, los
enlaces de hidrógeno también podrían involucrar moléculas de agua. Los
enlaces de hidrógeno se crean entre el oxígeno del grupo carboxilo y el
hidrógeno del grupo acetilamina ya sea directamente o mediante la molécula
de agua que sirve como puente. Se forman otros enlaces de hidrógeno entre
el hidrógeno del grupo hidroxilo que se encuentra en el plano ecuatorial y el
átomo de oxígeno del enlace glicosídico. Se considera que la estructura
creada
Estructura molecular y supramolecular del ácido hialurónico 99
(UN)
O CH 3
- O C
O C CH 2 OH OH NUEVA HAMPSHIRE
O HO O HO O

OH
1O 3
1O4 O HO O

OH O C NUEVA HAMPSHIRE OC CH 2 OH
-
CH 3 O
(SEGUNDO)
(C)
Figura 4.3 Estructuras primarias, secundarias y terciarias en soluciones HA [4]. (A) Un

fragmento de tetrasacárido de HA que comprende dos disacáridos repetidos, que muestra
cinco enlaces H que ayudan a mantener la doble hélice; (B) Tres cadenas de HA en una
estructura terciaria propuesta, que acomoda los hallazgos de rayos X y RMN disponibles , es
decir, hélices dobles con curvas suaves en la estructura del polímero en dos planos en
ángulos rectos (5, 2) y parches hidrofóbicos (rayados ) en lados alternos del polímero. En
matrices antiparalelas, los grupos acetamido ( ■ y □ ) y carboxilato ( ⦁ y ) se colocan de ⚬
modo que los enlaces H son posibles entre ellos como se indica mediante flechas que
apuntan desde el donante a los grupos aceptores; (C) Esquema de moléculas de HA
superpuestas que permitirían la formación de mallas infinitas a partir de HA de alta masa
molecular. Reproducido con permiso de [4]. Copyright © 1999, Academia Nacional de
Ciencias, EE. UU.
es muy estable tanto en solución acuosa como en estado libre. La

Figura 4.3 muestra los posibles enlaces de hidrógeno y su influencia
en la estructura terciaria de HA.
El enlace de hidrógeno directo entre el acetamido NH y el carboxilato de la
figura 4.3 (a), que se observa en la solución de dimetilsulfóxido, se reemplaza
en gran parte en la solución acuosa por un puente de agua. Las líneas de
puntos verticales delinean las unidades de azúcar y las flechas en los lados
derecho e izquierdo indican la dirección del terminal reductor. Solo en la
orientación antiparalela las curvas suaves en la columna vertebral de las
moléculas participantes se complementan entre sí de modo que
las interacciones son óptimas. Como puede verse en la Figura 4.3 (b),
los grupos donantes (NH) tienen su enlace NOH trans al enlace 2COH
en este modelo. Los parches hidrófobos (rayados) en las moléculas
vecinas son contiguos y pueden producirse enlaces hidrófobos entre
ellos. Los enlaces H ocurren en pares en la estructura propuesta, con
pares alternos dirigidos en sentidos opuestos (arriba y abajo en el
diagrama). Esta estructura es formalmente equivalente a la de la
hoja beta en las proteínas, en la que los pares de enlaces H están
dispuestos en direcciones alternas (arriba y abajo) entre las cadenas
polipeptídicas antiparalelas. En combinación con los parches
hidrófobos, estas interacciones cooperativas permitirían que un gran
número de moléculas de HA se agreguen específicamente, opuestas
por la repulsión electrostática. Esta situación es similar a la de la
doble hélice de ADN, en la que las fuerzas repulsivas se equilibran
mediante enlaces hidrofóbicos y enlaces H, aunque la hélice de ADN
carece de la propiedad ambidextera que permite una agregación
lateral extensa.
El estudio teórico [5] concluyó que el comportamiento
conformacional de la molécula de hialuronano y su estabilidad está
relacionado con la estructura de las unidades di-, tri- pero
principalmente tetrasacáridas como el fragmento repetido de la
macromolécula HA (Figura 4.4).
La longitud y flexibilidad de las macromoléculas de HA son
significativamente variables. Cabe señalar que la flexibilidad de la cadena
del polímero es una de las características más importantes del material,
determinando sus propiedades macroscópicas básicas. La flexibilidad de la
cadena es la capacidad de cambiar su forma bajo la influencia del
movimiento térmico de las ramas de la cadena o bajo la influencia de
campos externos. Esta propiedad de las macromoléculas se debe a la
rotación interna de las partes individuales de la molécula entre sí, lo que
conduce a diferentes estados conformacionales (espiral macromolecular,
hélices y espirales). La estabilización de tales estructuras biológicamente
activas sigue estrictamente las leyes de la termodinámica en las que las
propiedades del disolvente y la presencia de varias sales son primordiales.
La naturaleza del catión tiene la influencia dominante sobre la
conformación de la macromolécula de hialuronano, así como otros
glicosaminoglicanos. Los cationes más influyentes son Са 2+ y Mg 2+ [6]. En el
estado sólido, el HA podría mostrar una considerable variabilidad
conformacional, podría empaquetarse de tal manera que las cadenas vecinas
se vuelvan antiparalelas. La naturaleza del catión y el nivel de hidratación
podrían influir en el empaquetamiento. Se demostró [6] que la sal sódica de
HA
O

CH 3 OH
O
OH
OH Φ Ψ
NUEVA HAMPSHIRE
HO C 4 O Φ HO C 3 C1
C 5 C2 O C3
O
O
C2 1
O O1C
C5
C3 C1 γ O HO C ω O HO
4 4
δ N2H Ψ C6 O OH OH
HO 6
O C7 CH 3 norte
GlcNAc GlcA GlcNAc GlcA
(Nʹ) (Gʹ) (NORTE) (GRAMO)
Figura 4.4 Representación esquemática del tetrasacárido β – d-GlcNAc (1–4) β-d-GlcA

(1-3) β-d-GlcNAc (1–4) β-d-GlcA, considerado como fragmento repetido de HA [ 5]. El residuo
GlcNAc se abrevia como N, mientras que el residuo GlcA se abrevia como G. Se indica el
etiquetado de las principales posiciones atómicas, junto con los ángulos de torsión de
interés.
que no contiene agua tiene una celda elemental de forma tetragonal

(a = b = 0.989 nm yc = 3.381 nm). La cadena de hialuronano es una
hélice a la izquierda que consta de cuatro unidades de disacáridos
repetibles. En esta estructura, hay enlaces de hidrógeno
intramoleculares ОН . . . .
О a través de los enlaces 1 → 3- glucósidos y NH . . . . O a través de enlaces 1 →
4 glicósido, así como la coordinación bonos О . . . . Nа . . . . О. A una hidratación
relativamente alta de hialuronano sódico pudimos observar una creación de
las células elementales de formas ortorrómbicas (a = 1,153 nm, b = 0,989 nm
yc = 3,380 nm). La forma ortorrómbica contiene al menos cuatro agua
moléculas para cada unidad de tetrasacárido del polímero.
Usando espectroscopía de RMN se reveló que HA tiene tales
disposiciones tridimensionales de grupos donantes y aceptores, que es
necesaria para la creación de enlaces de hidrógeno estables entre los
grupos acetamida y carboxilato [7].
La espectroscopia IR permitió a los investigadores encontrar que la
disposición de los enlaces de hidrógeno en la macromolécula de
hialuronano depende de la naturaleza del catión. Utilizando la
oxidación de RMN y HA con peryodato, se demostró que las
características conformacionales de la macromolécula relacionadas
con los enlaces de hidrógeno entre los grupos carboxi, acetamida e
hidroxilo se conservan en soluciones acuosas del polisacárido [6].
El hialuronano es un polisacárido lineal aniónico (en el rango de los
valores de pH fisiológicos, el grupo carboxi del residuo de ácido
D-glucurónico está prácticamente desprotonado por completo), cuyo
peso molecular depende esencialmente de la fuente y del método de
producción (ver Capitulo 2). Por lo general, el valor de la masa
molecular está en el rango de 10 5 a 10 7 Da, que corresponde a 25 000
y más unidades de disacáridos repetibles.
Otros glicosaminoglicanos químicamente relacionados con el
hialuronano, como el sulfato de condroitina, el sulfato de queratán y
el sulfato de heparán, tienen un peso molecular mucho más bajo y
tienen mucha más variedad en los isómeros. Esta variedad de
isómeros se debe a la presencia de grupos sulfatados, cuyo número y
disposición podrían variar significativamente. El hialuronano, aislado
de una variedad de fuentes, es siempre químicamente idéntico, la
única diferencia entre los productos de HA es el peso molecular.
4.2 Estructura de hialuronano en solución
El HA y sus sales con metales alcalinos, magnesio y iones de amonio

son bien solubles en agua e incluso en concentraciones bajas forman
soluciones acuosas muy viscosas. En altas concentraciones (1-4 % en
peso) forma pseudo-geles: soluciones con una viscosidad enormemente
alta
[8]. En soluciones acuosas neutras, la macromolécula de HA está
cargada negativamente. El valor de p K del grupo carboxilo es de
3 a 4 dependiendo del contraión (Na + , K + , Са 2+ , Mg 2+ , etc.). Es
importante para el funcionamiento del hialuronano en la matriz
extracelular del tejido conectivo.
Las sales de hialuronano con cationes de dos o más valencia son
prácticamente insolubles en agua. Dichos iones, al introducirse en la
solución de polisacárido, forman reticulaciones intermoleculares , lo que
conduce a la formación de una estructura de gel estable con un alto
contenido de agua. El hialuronano también forma las sales con bases
inorgánicas y orgánicas que son insolubles en agua, por ejemplo, con cloruro
de cetilpiridinio, así como los meta-cromática complejos con azul de
toluidina y con algunos otros colorantes orgánicos. El hialuronano puede
interactuar con diferentes proteínas. Como resultado, se podrían formar
complejos con una viscosidad increíblemente alta. La esterificación de los
grupos carboxilo de HA conduce también a la reducción de la solubilidad del
polisacárido [8].
La dimensión longitudinal promedio del disacárido libre es de

aproximadamente 1 nm, por lo que la longitud total de las
macromoléculas desplegadas con un peso molecular de 2.5 millones
de Da en solución podría ser más de 10 μm, que es aproximadamente
igual al diámetro del eritrocito humano y mucho más alto que el
tamaño medio de una célula bacteriana. Evidentemente, la molécula
de hialuronano a concentraciones suficientemente altas en una
solución acuosa toma una forma enrollada más o menos compacta. La
formación de la estructura de la bobina es característica de los
biopolímeros porque la condición necesaria para la formación de
dicha estructura es el nivel de
homogeneidad en tamaño de las macromoléculas.
Mediante análisis de rayos X , dispersión de luz láser y espectroscopia de
RMN, los métodos que ya se utilizaban para el estudio de soluciones acuosas
de hialuronano, se encontraron numerosas conformaciones. Todos ellos
estaban relacionados con el entorno iónico, la concentración, la temperatura,
etc. La macromolécula de HA podría agruparse y formar hélices simples y
dobles orientadas a la izquierda , o incluso formar estructuras planas de
múltiples cadenas [7]. Utilizando análisis de rayos X , se demostró que las
sales de hialuronano Na y K existen como una doble hélice [9], aunque en
otra publicación se encontró que la doble hélice consiste en hebras
antiparalelas orientadas a la izquierda [10]. Cleland y col. determinó la
existencia de los anillos móviles formados por moléculas de hialuronano con
un peso molecular superior a 100 kDa a la fuerza iónica media y el pH
neutro de la solución [11]. Usando RMN, Darke et al. calculó que parte de la
estructura rígida de la molécula de hialuronano podría ser de hasta un
50-70% [12]. Podría explicarse por la existencia de segmentos rígidos
conectados entre sí por fragmentos de cadenas flexibles. Utilizando
viscometría y métodos de dispersión de luz láser en combinación con
difracción de rayos X, los autores [13] encontraron que además de la
estructura de doble hélice, también existe la conformación supra-helicoidal .
En esta conformación, HA forma fragmentos de microgel denso. Con una
mayor concentración de polisacáridos en solución, se pudo observar una
formación de la red intermolecular. En la solución acuosa diluida, el HA se
comportó como una molécula independiente, pero en las soluciones de alta
concentración aparecen estructuras en forma de red . Ocurre debido a la
incapacidad de las moléculas vecinas para aceptar diferentes
conformaciones independientemente unas de otras. Solo son posibles tales
estados conformacionales, en los que cada fragmento de disacárido de cada
macromolécula acepta el espacio que no está ocupado en ese momento por
otros fragmentos de la misma macromolécula o vecina. Significa que las
macromoléculas de HA libres deben enrollarse en una bobina. Es muy
probable que este estado se deba a que una conformación extendida podría
realizarse mediante una conformación unidireccional pero plegada: por
muchos medios.
En varias publicaciones se demostró que la estructura secundaria de

HA es similar a las bandas planas convertidas en una hélice (Figura
4.5) o dobladas en una hoja [4,7]. Los datos experimentales basados en
el análisis de los cambios en los desplazamientos químicos de RMN y
la oxidación lenta por periodato muestran que la característica de
rigidez del HA y el ordenamiento parcial de la estructura del HA en
solución dependen principalmente de los enlaces de hidrógeno
intermoleculares [2,7,9 , 10]. El estudio de RMN de los oligosacáridos
de HA con marcadores radiactivos confirmó que los enlaces de
hidrógeno son responsables de la estructura secundaria atípica que
puede adoptar la macromolécula de polisacárido [14].
Los estudios hidrodinámicos adicionales de las soluciones de
hialuronano [9-11] y, en particular, las mediciones de viscosidad
realizadas para soluciones diluidas muestran que en las soluciones
salinas acuosas la macromolécula acepta la estructura de la espiral
estadística semirrígida y esta consiste en la hélice- como bandas y los
anillos de banda de estructura helicoidal [14]. Al formar una espiral
más o menos rígida, la molécula une una gran cantidad de agua y crea
dominios bastante grandes de estructura terciaria. Debido a la
repulsión electrostática entre el negativo

1 2
1,35 nm
Figura 4.5 El modelo de estructura HA, basado en [4,7]. Está claro que la molécula
tiene forma de banda plana organizada en estructura helicoidal.
grupos cargados en hialuronano, no se produce superplegamiento

macromolecular. La densidad real dentro de las cadenas moleculares
del hialuronano dentro del dominio molecular es bastante baja,
alrededor del 0,1% en peso. Significa que a la concentración del
polisacárido en una solución acuosa de 1 mg / ml y más, las bobinas
macromoleculares individuales interactúan entre sí. Por lo tanto, solo
en soluciones muy diluidas, las bobinas macromoleculares interactúan
débilmente entre sí, manteniendo sus estructuras individuales. Cuando
la concentración es elevada, se forma la estructura intermolecular,
similar a la rejilla tridimensional . Esta estructura es la principal
responsable de las propiedades reológicas de los fluidos y tejidos
biológicos, como el vítreo [8]. Las transiciones conformacionales como
la hélice-espiral son fenómenos extremadamente interesantes
característicos de las macromoléculas de biopolímeros como proteínas,
ácidos nucleicos y polisacáridos. Estas transiciones van acompañadas
de un cambio brusco en varias propiedades físicas, químicas y
biológicas importantes del sistema.
La estructura de red de HA en solución es de gran importancia. Las
moléculas pequeñas, como agua, electrolitos y nutrientes, pueden difundirse
libremente dentro del dominio de baja densidad de las moléculas de
biopolímero. Al mismo tiempo, las moléculas grandes, como las proteínas,
habitan debido a su gran tamaño hidrodinámico. Los factores decisivos en la
formación de una estructura de red son la concentración y el peso molecular
del polisacárido. La microscopía electrónica nos permite revelar que la
estructura de la red en soluciones de HA de alto peso molecular (MW de 1 M
Da y más) se crea, incluso a concentraciones muy bajas. Las micrografías
electrónicas con sombreado rotatorio permiten visualizar la estructura de
red de HA de alto peso molecular, que parece infinita en solución. Los
polisacáridos de bajo peso molecular
El peso también forma una estructura de red a bajas concentraciones en

solución acuosa. Sin embargo, la red tiene una estructura tipo isla , donde
algunas áreas están separadas por una distancia significativa [7]. Es
importante que estas redes estén muy organizadas. Una repulsión
electrostática de grupos carboxilo y los enlaces de hidrógeno entre el átomo
de hidrógeno del grupo acetamida y el átomo de oxígeno del grupo
carboxilo, además de interacciones hidrófobas, hacen que la estructura de
red intermolecular antiparalela del hialuronano sea muy favorable. Podría
ser extremadamente importante en la comunicación y organización
intercelular, por ejemplo, en el proceso de morfogénesis. Además, se ha
encontrado que una estructura específica, que la molécula de HA podría
crear in vivo , depende de las condiciones hidrodinámicas, el entorno
químico y la presencia de otros biopolímeros, específicamente aquellos
unidos con HA.
Las cadenas, fibras y redes más extendidas se pueden formar en el
estrecho espacio intercelular, pero en los tejidos conectivos líquidos se
pueden encontrar formas de anillos libres y espirales aleatorias. En
consecuencia, la estructura del hialuronano in vivo debe verse como
un producto de conjuntos conformacionales y un resultado del
impacto del entorno local [8].
Por lo tanto, podemos concluir que el HA de alto peso molecular en
solución acuosa forma una conformación de espiral aleatoria
semirrígida, cuya forma promediada en el tiempo es la esfera, pero en
todo momento la molécula está lejos de ser esférica. Este efecto se
produce como resultado del movimiento de los segmentos de la
molécula entre sí en una escala de tiempo de nanosegundos. La
espiral dinámica de moléculas de HA no es densa e incluye una gran
cantidad de moléculas de agua. Incluso a concentraciones muy bajas
de hialuronano tiene lugar la interacción intermolecular y el
ordenamiento. Como resultado, se forma una estructura de red
tridimensional intermolecular . Tal estructura estipula las
propiedades únicas de HA [8].
4.3 Propiedades reológicas del ácido hialurónico
Hace relativamente poco tiempo, hace un par de décadas, se

descubrió un nuevo grupo de fitohormonas de oligosacáridos y esto
amplió y cambió sustancialmente la comprensión de ciertos aspectos
del problema de la regulación química en las plantas [15].
Los oligosacáridos, que son generalmente cortos de siete u ocho
unidades de longitud, cadenas de oligosacáridos ramificados
compuestas de monosacáridos simples (p. Ej. Glucosa), parecen ser
reguladores específicos del crecimiento, desarrollo, reproducción y
activación de diferentes mecanismos de defensa de las plantas. A
diferencia de las fitohormonas ya conocidas que exhiben múltiples
acciones, cada oligosacárido transmite una señal para regular
funciones muy particulares. Una característica similar es característica
del hialuronano, cuyos múltiples efectos biológicos dependen del peso
molecular de la molécula, es decir, del tamaño molecular [16-21]. Esta
propiedad única aún no se ha explicado completamente
científicamente pero podría probablemente estar asociada con la auto-
organización de la macromolécula en una definida de cristal líquido de
fase. Los cristales líquidos son sustancias que, en determinadas
condiciones de temperatura, presión y concentración, pueden pasar a
un estado de cristal líquido. Se sabe que los líquidos biológicos pueden
considerarse como materiales autoorganizados que forman
espontáneamente estructuras de orden de cristal líquido . Hay
múltiples ejemplos de sistemas biológicos autoorganizados . Por
ejemplo, el ARN del virus del mosaico del tabaco se une a las proteínas
de la cubierta y esto da como resultado la formación de un virión
helicoidal en forma de varilla , capaz de infectar plantas de tabaco. Las
cadenas polipeptídicas de muchas enzimas globulares pueden plegarse
correctamente para formar biocatalizadores funcionales. Múltiples
lípidos forman fácilmente estructuras bicapa, que luego se bloquean
espontáneamente en vesículas.
En vista de que los procesos biológicos son ante todo procesos de

ordenación, su interpretación física se basa principalmente en las
teorías de las transiciones de fase y los procesos cooperativos. Las
biomoléculas muestran propiedades de cristalitos líquidos liotrópicos
y / o termotrópicos y exhiben propiedades que corresponden a su
estructura de cristal líquido . Los cristales líquidos ( fase nemática
de cristal líquido ) poseen propiedades físicas únicas. Es decir,
combinan la fluidez de los líquidos habituales con las características
típicas de los cristales. En los líquidos liotrópicos, tales propiedades se
manifiestan dentro de un cierto rango de temperatura o en un rango
estrictamente restringido de concentración de moléculas de un peso
molecular dado (longitud de cadena). A este respecto, es de gran
interés la investigación de las propiedades reológicas de los polímeros
biológicos liotrópicos, en particular, su viscosidad (se puede decir que
la reología estudia las propiedades viscoelásticas de los materiales).
La capacidad de las macromolecules biológicas para participar en
numerosos procesos de vital importancia, como por ejemplo,
amortiguación de golpes en el cartílago, contracción de los músculos
estriados cruzados , elasticidad de la piel y la
movimiento de las células sanguíneas en las arterias: en todos esos procesos,
la investigación de las propiedades viscoelásticas es necesaria para
comprender el funcionamiento del biopolímero en los sistemas biológicos
reales. Cabe señalar que la investigación de las propiedades viscoelásticas de
los polielectrolitos, ya que el hialuronano pertenece a esta clase de
polímeros, es un problema complejo tanto desde el punto de vista teórico
como práctico. Dependiendo de la longitud, las macromoléculas forman
cadenas flexibles, semirrígidas y rígidas que afectan el orden de orientación
de un biopolímero en solución. Bajo la influencia del movimiento térmico,
las cadenas de biopolímeros pueden adoptar diferentes conformaciones sin
cambios en la configuración, es decir, sin ruptura de enlaces químicos. Para
describir la estructura y dinámica de cada una de estas clases en solución, se
utilizan diferentes modelos teóricos. Se forman cadenas de polímero
rígidas y semirrígidas
fases líquido- cristalino . Como ya se señaló, las moléculas de la

sustancia en estado de cristal líquido tienen la propiedad de
autoorganizarse, formando estructuras organizadas espacialmente.
La organización tiene lugar en diferentes niveles de la jerarquía:
desde el nanoscópico al mesoscópico y luego al macroscópico. Todo
esto está en línea con el principio de conservación mínima de energía
en un estado particular. Hay varios tipos de conformaciones de
macromoléculas: conformación de espiral macromolecular,
conformación alargada en forma de varilla, conformación helicoidal y
conformación espiral. Los sistemas de tipo hélice parecen ser los más
favorables energéticamente. En el capítulo anterior se proporcionó
información sobre la naturaleza helicoidal de las macromoléculas de
ácido hialurónico en una solución acuosa.
La energía asociada con la deformación de los cristales líquidos es
pequeña y, por lo tanto, su estructura molecular se puede cambiar
fácilmente utilizando campos externos, por ejemplo, pequeños
cambios de presión mecánica o flujo de cizallamiento. Los fluidos
estructurados son las estructuras inducidas por cizallamiento. Las dos
propiedades principales de los cristales líquidos nemáticos son la
cristalinidad ( orientación de orden superior ) y la fluidez. La mayoría
de las interacciones soluto-solvente son interacciones que conducen a
una organización de orden superior . Existen varios criterios para la
formación de estructuras liotrópicas nemáticas poliméricas [22]:
●● concentración y peso molecular del biopolímero por encima de un valor crítico;
●● temperatura por debajo de un valor crítico.
Estos valores críticos dependen del tipo de disolvente. Se sabe que la
fase cristalina líquida nemática contiene una mayor concentración de
polímero que la fase isotrópica [23,24]. El estado de cristal líquido se
puede asociar con la estructura química así como con el tamaño de las
macromoléculas.
Las moléculas en forma de varilla pueden orientarse en solución en

una dirección que conduce a la aparición de anisotropía fluida y
reducción de su viscosidad. Los cambios en el pH y la fuerza iónica de
una solución pueden cambiar el tamaño de los polielectrolitos cinco
veces o más. Existen diferentes tipos de estructura supramolecular
que son capaces de reproducir la característica de "rigidez
correspondiente" de los cristalitos líquidos. Algunas macromoléculas,
incluido el hialuronano, tienen cierta flexibilidad conformacional. Los
movimientos conformacionales de las partes flexibles permiten la
disposición orientativa de los mesógenos, lo que determina el
comportamiento de un cristal líquido como un todo. Ciertas cadenas
flexibles y semirrígidas como el glutamato de gamma-bencilo pueden
volverse rígidas a través de la transformación en espiral-hélice . Este
tipo de transformación ocurre también con hialuronano; en este caso
se produce una transición de fase [24]. En solución acuosa diluida, las
macromoléculas de hialuronano se comportan como cuerpos
independientes. Por el contrario, en soluciones altamente
concentradas aparecen los sistemas ordenados que se asemejan a los
de los cristales líquidos. La cristalización de las moléculas de
biopolímero está asociada con su flexibilidad, más precisamente, la
rigidez de las macromoléculas que no pueden empaquetarse de otra
manera que en cierto orden, debido a la rigidez limitada y al volumen
disponible. Por tanto, el comportamiento de las macromoléculas de
biopolímero en solución depende de su rigidez, concentración y, por
supuesto, fuerza iónica y pH del medio. Por ejemplo, la conformación
del hialuronano está influenciada por la repulsión eléctrica mutua
entre las cargas distribuidas a lo largo de la cadena del polímero y
esto conduce a una conformación tensa de las cadenas. A medida que
aumenta la concentración de ácido hialurónico, sus cadenas
comienzan a superponerse, se produce un blindaje de las cargas y la
distancia entre los extremos de las cadenas disminuye de modo que se
forma una estructura de red. Parece que las macromoléculas de ácido
hialurónico similares a las moléculas de polipéptido pueden existir en
solución en dos formas diferentes, es decir, estado ordenado y espiral
aleatoria. Bajo ciertas condiciones, las transiciones de hélice a espiral ,
a veces llamadas "fusión intramolecular", ocurren repentinamente. La
peculiaridad de tal transición es que este tipo de fusión
intramolecular ocurre dentro de una sola macromolécula y está
asociado con la desaparición de la estructura ordenada. La transición
de hélice a espiral ocurre en sistemas biológicos en diversas
situaciones e involucra diferentes moléculas de biopolímeros como
polisacáridos, polipéptidos y ácidos nucleicos. Es importante tener en
cuenta que tales transiciones en condiciones biológicas naturales
pueden ocurrir tanto en una dirección como en la inversa,
dependiendo de los estímulos externos. Las cadenas de biopolímeros
pueden sufrir la transición de espiral a hélice cuando se modifican los
parámetros del entorno, como la temperatura, el pH y el entorno
iónico; esto es de gran importancia biológica. Parece que aquí se
debería buscar un vínculo entre las propiedades biológicas y el peso
molecular del hialuronano.
Se sabe [24] que los biopolímeros líquidos-cristalinos son muy
sensibles a la orientación en campos externos, es decir, campos
eléctricos y magnéticos, así como bajo la acción de la presión o la
fluidez de la solución. Cuando no existen otros campos de orientación,
la dinámica de los sistemas estructurados depende en gran medida
del esfuerzo cortante aplicado.
El componente principal del líquido sinovial, es decir, hialuronano,
tiene dos funciones principales; a saber, lubricante y amortiguación
de impulsos de choque [25]. Además, el ácido hialurónico es un
componente importante de la matriz extracelular del tejido conectivo.
Este tipo de polímero debe exhibir propiedades viscoelásticas que
dependan directamente de su microestructura y parámetros externos
como velocidad de cizallamiento, tensión y temperatura. El
conocimiento de la dependencia de la viscosidad del líquido sinovial
del modelo de la velocidad de cizallamiento, el estrés y la temperatura
es muy útil para aplicaciones biomédicas, por ejemplo, en el
tratamiento de enfermedades articulares.
La reología de los polímeros de cristal líquido es muy diferente de la

reología de los cristales líquidos habituales. Sin embargo, el
comportamiento reológico de los polímeros de cristal líquido también
es diferente del de los líquidos poliméricos habituales. Al mismo
tiempo, el comportamiento de estos materiales muestra algunas
similitudes. Es decir, los polímeros líquido-cristalinos y los cristales
líquidos se comportan como líquidos no newtonianos. Su viscosidad
depende de la velocidad de corte. La dinámica de los materiales
cristalinos líquidos nemáticos en el flujo de cizallamiento depende en
gran medida de la posición de la molécula y la dirección del flujo [26].
Los polímeros líquidos-cristalinos pueden experimentar transiciones
de un estado a otro. Las moléculas de cristal líquido se relajan muy
rápidamente; por el contrario, las macromoléculas de los polímeros
líquidos-cristalinos se relajan muy lentamente, especialmente en los
sistemas concentrados. Los efectos entre superficies (interacciones de
contorno, efecto de superficie, efectos de adhesión) son muy
importantes para describir la dinámica cercana a la superficie de las
macromoléculas poliméricas y la viscosidad / viscoelasticidad entre
superficies [27].
Los factores que determinan la estructura secundaria de las
macromoléculas de ácido hialurónico en estado sólido influyen en su
comportamiento en soluciones acuosas, como se desprende de los
resultados de estudios viscosimétricos y de otro tipo. Al mismo
tiempo, pueden existir macromoléculas de ácido hialurónico en
solución acuosa en forma de espirales desordenadas que ocupan un
volumen superior al de las propias cadenas de macromoléculas en
más de 100 veces. El despliegue de las bobinas se ve facilitado por el
debilitamiento de las interacciones intermoleculares bajo la fuerza
iónica fisiológica y el pH [28]. Una observación de una reducción
repentina pero reversible a pH 7,0 en la viscosidad a pH 12,5 sin
cambios en el peso molecular demuestra peculiaridades y la
naturaleza lábil única de las macromoléculas de ácido hialurónico en
solución acuosa [5]. Aquí, nuevamente nos enfrentamos a la
transición de espiral a hélice antes mencionada . Al calentar o tratar la
solución de ácido hialurónico con ácido o álcali en condiciones
suaves, se observan cambios repentinos en las propiedades
hidrodinámicas. Se produce un cambio significativo en la viscosidad
de la solución sin cambios sustanciales en el peso molecular del
hialuronano.
Los estudios mediante métodos de RMN y dicroísmo circular [29]
permitieron identificar la presencia de estructuras relativamente
rígidas y más flexibles que se alternan dentro de una única cadena de
hialuronano con un equilibrio entre estas estructuras. La viscosidad
extremadamente alta de las soluciones de hialuronano se debe, por
un lado, a su estructura y, por otro lado, está condicionada por
interacciones intermoleculares específicas y no específicas de
macromoléculas [29]. Todo apunta al hecho de que no solo las
interacciones hidrófilas sino también hidrófobas juegan un papel
significativo en la estabilización de la estructura de hialuronano
asociada con la estructura macromolecular específica.
Las interacciones entre macromoléculas de hialuronano conducen a
la formación de asociaciones intermoleculares que tienen una
estructura de panal y ocupan un espacio aún mayor que las bobinas
desordenadas. Las propiedades dinámicas de estas estructuras
complejas aumentan al aumentar la fuerza iónica y disminuyen al
disminuir el pH de la solución. Muy
Otra característica interesante es que el hialuronano de sodio que
consta de 3500 unidades de disacárido en solución forma rápidamente
una estructura espacial debido a las interacciones en cadena, como se
puede encontrar mediante viscosimetría y otros métodos. Agregar a
esta solución una fracción de hialuronano que consta de 60 unidades
de disacárido en concentraciones iguales destruye la asociación
estructural. Las soluciones mixtas se comportan como soluciones de
cadenas de polisacáridos no asociadas aisladas . Los fragmentos muy
cortos (cuatro disacáridos) y extralargos (de 400 unidades de
disacáridos) no muestran este efecto particular [30]. Este es un
resultado muy importante que debe tenerse en cuenta al abordar una
amplia gama de cuestiones relacionadas con la fabricación de
medicamentos a base de hialuronano .
Las características conformacionales de las macromoléculas definen las

propiedades viscoelásticas de las diversas macromoléculas biológicas de
fluidos biológicos, matriz extracelular y otras estructuras, formadas por este
polisacárido y otros proteoglicanos. La reducción del tamaño de las
macromoléculas de polisacáridos en condiciones patológicas puede conducir
a la alteración de las estructuras normales, lo que es peligroso para los
sistemas que realizan funciones ópticas y mecánicas (ojos vítreos, líquido
sinovial, cordón umbilical, etc.) y en los que el hialuronano es el
predominante. elemento estructural. Al formar una estructura de panal en
las soluciones, las cadenas de ácido hialurónico dan lugar a la capacidad de
las soluciones para resistir la deformación de la presión externa [31].
Al unir una cantidad significativa de agua y formar una estructura
de panal en solución acuosa, el hialuronano controla la distribución
de otras macromoléculas cargadas de manera similar a través de la
exclusión estérica del volumen ocupado por macromoléculas. Este
efecto conduce a una concentración de las sustancias excluidas en el
volumen extremadamente limitado, lo que puede conducir a
diferentes interacciones de estos compuestos y, en consecuencia, da
como resultado la formación de nuevas estructuras. El hialuronano
como polímero aniónico puede interactuar con compuestos cargados
positivamente de bajo y alto peso molecular . Esto es más
pronunciado en el ambiente débilmente ácido, donde la interacción
del hialuronano con tales sustancias se observa en forma de
complejos insolubles [5]. En los rangos fisiológicos de fuerza iónica y
pH, las interacciones electrostáticas del hialuronano con proteínas y
otras sustancias, que no producen complejos insolubles, pueden dar
lugar a una cierta orientación espacial de las moléculas y podrían
conducir a la formación de estructuras con composición
macromolecular heterogénea.
Matsuoka y Cowman [32] propusieron la consideración de dos
modelos simples para estudiar las propiedades hidrodinámicas del
hialuronano sobre la base de la viscosidad inherente. El primer
modelo de la bobina no articulada libremente o no ideal se basa en las
conformaciones estadísticas de las cadenas de polímero. Bajo este
modelo, la viscosidad intrínseca [ η ] es directamente proporcional al
volumen ocupado por unidades de masa de los segmentos de
polímero. El volumen se llena principalmente con disolvente y tiene
una baja densidad de segmentos de polímero. El segundo modelo es el
modelo de cadena articulada libremente . Se asume que la cadena está
más extendida y su viscosidad corresponde a la de las cadenas en
forma de gusano . La viscosidad intrínseca cambia como un cuadrado
de la distancia media al cuadrado de un extremo a otro . Los estudios
experimentales de la viscosidad intrínseca del hialuronano indican
que las cadenas cortas actúan como cadenas que se
articulan libremente y la cadena larga de hialuronano se comporta
como las cadenas que no se articulan libremente . El peso molecular
al que coexisten estos dos tipos de comportamiento es de
aproximadamente 3,75 × 10 4 Da. El tamaño del polímero corresponde
a una bobina más pequeña de hialuronano (Figura 4.6).
Por lo tanto, es posible calcular la masa molecular de hialuronano
con base en los datos de viscosidad y viceversa, utilizando la ecuación
que describe el comportamiento macromolecular del hialuronano, es
decir, [ η ] = 0.029 M 0.8 a la característica de viscosidad para ciertas
moléculas pesos. Esta ecuación se usa a menudo para determinar el
peso molecular promedio de hialuronano. Sobre la base de los
resultados obtenidos en [32] se llegó a la conclusión de que el
enrollado de la macromolécula de hialuronano en solución es
energéticamente ventajoso. Se requieren aproximadamente 20
segmentos para formar una bobina. La bobina (esfera) es, por
supuesto, solo un estado conformacional transitorio. La longitud de
cadena más pequeña suficiente para que una macromolécula de
hialuronano se comporte como una espiral corresponde a un peso
molecular de 37 500 Da.
En el estudio [33] se investigó el efecto de la urea, el cloruro de
sodio, el cloruro de guanidina y la sacarosa. Estos compuestos
participan en la formación de enlaces de hidrógeno intermoleculares
y, por lo tanto, afectan el comportamiento reológico del hialuronano,
el radio de giro Rg y

10000

[ η ] = KM 2
1000

a = 0,80
viscosidad

100
Intrínseco
a = 1,16

10 M = 37 500

1
1000 10000 100 0001000 000 10000000

Peso molecular, Da
Figura 4.6 Dependencia experimental de la viscosidad intrínseca del peso molecular del
hialuronano en una solución 0,15 M de NaCl. Las cadenas cortas actúan como cadenas
articuladas libremente y las cadenas largas de hialuronano se comportan como cadenas no
articuladas libremente [32]. Reproducido de [32]. Con permiso de Elsevier
radio hidrodinámico Rh. La adición de urea no cambia ni el módulo de

elasticidad ni la tangente de pérdida dinámica, mientras que la presencia de
NaCl y clorhidrato de guanidina disminuye ambos parámetros y la sacarosa
los aumenta. La concentración crítica C * se calculó como un punto de
inflexión en las curvas de viscosidad intrínseca en soluciones de hialuronano
que contienen urea, NaCl, clorhidrato de guanidina o sacarosa. Los cambios
de todos los parámetros hicieron posible suponer que los iones de sodio y
guanidina filtran la repulsión electrostática entre las moléculas de
hialuronano y, en consecuencia, reducen el tamaño de una bobina. Por el
contrario, la sacarosa aumenta las interacciones estadísticas entre
macromoléculas de hialuronano. Esto concuerda bien con los datos de
dispersión de luz. Se encontró que el radio de giro Rg y el radio
hidrodinámico Rh dependían de la concentración de urea y sacarosa en
presencia de NaCl 0,2M.
La adición de sacarosa reduce el tamaño de las bobinas de las
macromoléculas y hace que las moléculas de hialuronano sean más
rígidas en soluciones diluidas debido a la formación de una red
transitoria como resultado de los enlaces de hidrógeno [34-36]. Los
autores de esos trabajos concluyen que incluso si se produce la ruptura
de los enlaces de hidrógeno con la adición de urea, esto no tiene un
impacto significativo en el comportamiento reológico del hialuronano.
Enlaces de hidrógeno intermoleculares que conducen a la formación
de redes en muchos polisacáridos formadores de gel en opinión del
autor
[33] no se realizan en soluciones de hialuronano. Se puede
demostrar, basándose en la evaluación de las dimensiones lineales de
moléculas de polisacárido de alto peso molecular, que a una
concentración de aproximadamente 1 g / l (0,1% p / p) las
macromoléculas de hialuronano saturan casi por completo la
solución. A altas concentraciones, las moléculas se superponen y la
solución se convierte en una red hecha de cadenas de hialuronano. El
punto de inicio de la superposición es fácil de determinar;
corresponde al momento en que ocurre la saturación, es decir, el
momento después del cual su viscosidad aumenta bruscamente al
aumentar la concentración.
Otra propiedad de la solución de hialuronano, que depende de su

concentración, es la viscosidad de cizallamiento [25]. Las propiedades
elásticas de un hidrogel cambian a medida que aumentan la
concentración de polímero y el peso molecular. La fluidez del hidrogel
de hialuronano fue determinada por primera vez por C. Jensen y J.
Koefoed [37].
Al estudiar la dependencia de la viscosidad de la solución acuosa de
hialuronano de los estímulos externos, E. Szwajczak [25] proporcionó
las curvas isotérmicas para muestras de HA 1 y HA 2 (Tabla 4.1), que se
muestran en la Figura 4.7 y 4.8 a temperaturas fijas de 20 y 37 ° C, es
decir, la temperatura ambiente y la temperatura del cuerpo humano,
respectivamente.
Las figuras 4.7 y 4.8 muestran las dependencias de η ′ y η ″ en la
velocidad de corte para muestras polidispersas HA 1 y HA 2 a dos
temperaturas fijas.
Se puede notar que para ambos materiales la viscosidad disminuye
al aumentar la temperatura. En la fase nemática de cristal líquido, los
ejes largos de la molécula pueden orientarse a lo largo del flujo del
fluido. Se puede suponer que las moléculas de los líquidos
estructurados se comportan de la misma manera. La viscosidad de los
líquidos que contienen moléculas largas orientadas (especialmente las
cadenas poliméricas largas) es menor que la viscosidad de los líquidos
compuestos por
Cuadro 4.1 Las muestras estudiadas en [17,18]
Muestra C, mg / ml Mw Ме

HA 1 10 5 . 10 5 –7. З . 10 5 1.8 · 10 6
HA 1 2,7 5 . 10 5 –7. З . 10 5 6,7 · 10 6
DECIR AH2 8 6 · 10 6 2,26 · 10 6

10 0
10 –1
η ′ , η ″ Pa
HA 1
η ′ 20 ° C
∙s
η ″ 20 ° C
10 –2
η ′ 37 °
C η″
37 ° C
10 –2 10 –1 10 0
Tasa de corte, s –1
Figura 4.7 Dependencia de viscosidades η ' y η " en velocidad de cizalladura para
la muestra de HA 1 a dos temperaturas: 20 y 37 ° С, M w1 = (5 . 10 5 -7. З . 10 5 ,) C 1
= 10 mg / ml
10 2
η ′, η ″ Pa ∙ s
HA 2
10 1 η ′ 20 ° C
η ″ 20 ° C
η ′ 37 °
C η″
10 0 37 ° C
10 2
10 1
10
0 Velocidad de corte,
s –1
Figura 4.8 Dependencia de las viscosidades η ′ y η ″ de la velocidad de corte para

la muestra HA 2 a dos temperaturas: 20 y 37 ° С, M w2 = 6 . 10 6 , C 1 = 8 mg / ml
moléculas desordenadas. Esto significa que la viscosidad del material

en la fase de cristal líquido es menor que la viscosidad en la fase
isotrópica [38]. La propiedad reológica bien conocida de los cristales
líquidos es que la viscosidad disminuye bruscamente cuando se pasa
de la fase isotrópica a la nemática.
La dependencia de la temperatura del coeficiente de viscosidad η
para HA 1 se presenta en la Figura 4.4. Se ve que la viscosidad de la
muestra inicialmente disminuye constantemente al aumentar la
temperatura. Entonces, la viscosidad aumenta bruscamente a cierta
temperatura. La viscosidad vuelve a disminuir cuando aumenta la
temperatura, similar a lo que ya se observó. Este tipo de efecto
térmico se vuelve notable a velocidades de cizallamiento más bajas.
Este efecto está asociado con la transición de fase
anisotrópica-isotrópica . A velocidades de cizallamiento más altas, este
efecto disminuye [25].
Otra característica de los sistemas de polímeros de cristal líquido es
la dependencia de la viscosidad del esfuerzo cortante τ. La viscosidad
de los sistemas complejos disminuye con el aumento de la tensión en
el rango de pequeñas velocidades de cizallamiento. Con un aumento
adicional de la tensión, la viscosidad permanece constante en un
cierto intervalo de τ y luego vuelve a disminuir.
Los valores de η ′ y η ″ para HA 2 en función del esfuerzo cortante se
muestran en las Figuras 4.9 y 4.10. El biopolímero estudiado muestra
el comportamiento típico de los materiales viscoelásticos con el orden
cristalino. La viscoelasticidad de HA 2 desaparece a mayores esfuerzos
cortantes. La viscosidad η ′ y η ″ disminuye significativamente a
mayores esfuerzos cortantes [25] (Figura 4.10).
Al estudiar la dependencia de la viscosidad de la solución acuosa de
hialuronano con su microestructura, Szwajczak [24] ha demostrado la
influencia de la temperatura sobre la viscosidad como función de la
velocidad de cizallamiento para las dos concentraciones del
biopolímero (Figura 4.11). Los experimentos se llevaron a cabo a
diferentes temperaturas.

0,26

0,24 HA 1

5 s –1

0,22

0,20
η , Pa ∙ s
0,18
0,16

0,14

0,12

0,10

0,08

15 20 25 30 35 40 45

T, ° C
Figura 4.9 Viscosidad dinámica η de la muestra HA 1 como función de la

temperatura a 5 s −1 velocidad de corte, M w = (5 · 10 5 −7,3 · 10 5 ), C 1 = 10 mg / ml
14
η′
12 η″

10
η ′ , η ″ Pa ∙ s

8

6

4
0

20 40 60 80 100
0 τ, Pa
Figura 4.10 Dependencia de η ′ y η ″ del esfuerzo cortante para la muestra HA 2 ,

M w2 = 6 · 10 6 , C 1 = 8 mg / ml, Т, ° C = 20 ° С
0,27% 1,0%
16 ° C 19 °
20 ° C 23 °
25 ° C 24 °
30 ° C 26 °
Viscosidad, Pa · s
35 ° C 27 °
0,01 39 ° C 30 °
32 °
34 °
C
37 °
C
0,01
1 10 100 1000
Tasa de corte, s –1

Figura 4.11 Dependencia de la viscosidad de la velocidad de cizallamiento a diferentes
temperaturas para la solución biológica de sal sódica de hialuronano en dos
concentraciones de biopolímero (2,7 y 10 mg / ml)
La figura 4.12 muestra la dependencia de la viscosidad específica de

la concentración de HA bacteriano para moléculas que tienen un peso
molecular particular a una temperatura fija a diferentes velocidades
de cizallamiento. La evaluación se llevó a cabo sobre la base de los
datos obtenidos en [39].
η sp = (η −η )
s

ηs
donde η sp - viscosidad específica, η - viscosidad de la solución, η s -
viscosidad del disolvente (agua). La viscosidad del hialuronano es
función de la velocidad de corte [24,40]. La 'familia' de tempera-
Las curvas de flujo dependientes de la temperatura para ciertas
concentraciones se presentan en [24]. Se encuentra que hay una
región en las curvas donde la viscosidad es casi constante e
independiente de la velocidad de corte. Tras un aumento adicional en
la velocidad de cizallamiento, las soluciones estudiadas muestran una
viscosidad reducida. Por tanto, las altas tasas de cizallamiento
favorecen los flujos orientados. A veces, puede producirse una
reducción de la viscosidad al aumentar la velocidad de cizallamiento
cuando se aplican velocidades muy pequeñas. Además, puede
producirse un efecto similar cuando se aumentan las concentraciones
de hialuronano [27].
Los datos sobre la dependencia de la viscosidad de la concentración,
según Saito et al. [41], muestran que existe una correlación entre la
concentración c (mg / ml), el peso molecular y el punto en el que se
produce la estructura de espiral entrelazada (M e ) en una solución
acuosa suficientemente diluida, es decir,
cM e = 1.8 ⋅10 4
Sobre la base de los resultados enumerados en la tabla 4.1, el autor [24]
llega a la conclusión de que los polímeros de peso molecular inferior a M e
existen como una estructura en forma de hélice que puede adoptar
libremente diversas formas espaciales. El polímero con un peso molecular
superior a M e se organiza en una estructura similar a una red que forma un
hidrogel debido a las reticulaciones. La tendencia de

10 5

10 4
10 3
Viscosidad

reducida

10 2

10 1

0 2 4 6 8 10 12
C, mg / ml
Figura 4.12 Dependencia de la viscosidad específica del HA bacteriano de la

concentración de biopolímero a diferentes velocidades de cizallamiento (3; 5; 10;
20 s -1 ), T, ° C = 20 ° C, M w = 2.2 · 10 6 (de Fouissac et al. [39]) (las tasas de
cizallamiento aumentan desde las curvas de abajo hacia arriba). Reproducido con
permiso de [39]. Copyright © 1993, Sociedad Química Estadounidense
el aumento de la viscosidad puede ser una consecuencia directa de la

asociación de cadenas. Como se desprende de lo anterior, la viscosidad es un
parámetro que caracteriza las propiedades hidrodinámicas de las
macromoléculas. Es evidente que la viscosidad también depende del tamaño
y la forma de las macromoléculas y, por lo tanto, proporciona información
sobre la conformación de la molécula en la solución estudiada.
Se muestra la variación de la ' viscosidad de esfuerzo cero ' (también
conocida como viscosidad específica η sp0 para líquidos newtonianos)
de HA como una función del parámetro de 'parecido a varilla' ( q )
para soluciones diluidas y semidiluidas a temperatura constante. en la
Figura 4.13.
En el estudio de [42], se investigó la influencia de diferentes iones de
metales en la reología de las soluciones de hialuronano a temperatura
ambiente (Figura 4.14 y 4.15). Se encontró que con el aumento de la
masa atómica del ión metálico hay una reducción progresiva de la
viscosidad de cizallamiento cero (viscosidad Williamson η 0 ). Se puede
sugerir que la caída de la viscosidad se debe al efecto de los iones, que
se encuentran entre las cadenas de HA y filtran la repulsión
electrostática entre los grupos carboxílicos vecinos. Además, se
produce la ruptura de los enlaces de hidrógeno entre las
macromoléculas. Esto da como resultado una estructura de bobina
más compacta y se acompaña de una reducción de la viscosidad. Esta
propiedad muy importante de los biopolímeros de polielectrolitos es
característica no solo de HA, sino también conocida por polipéptidos y
ácidos nucleicos y es de suma importancia en entornos biológicos.
η sp, o η sp, o

10 5 10 5

10 4 10 4

10 3 10 3

10 2
10 2
10 1
10 1
10 0 10 0

10 0 10 1 10 5 10 6
q
Mw
Figura 4.13 Dependencia de la viscosidad a una velocidad de cizallamiento cero en el

parámetro 'parecido a una varilla' para soluciones de HA bacteriano en NaCl a las
concentraciones de biopolímero de C = 0,5 mg / ml (solución diluida) y C = 10 mg / ml
(semidiluido solución); T, ° C = 25 ° C (de los datos de Fouissac et al. [39]). Reproducido con
permiso de [39]. Copyright © 1993, Sociedad Química Estadounidense
1,00
Controlar
N/A
Viscosidad, Pa · s
Li
Minnesota
0,10
0,01
1 10 100 1000 10000
Corte, s –1
Figura 4.14 Perfiles de flujo aparentes (velocidad de cizallamiento versus

viscosidad) para soluciones de HA incubadas en agua (control) y en presencia de
iones Na + , Li + y Mn 2+ (todas son sales de Cl- ) [42]. Reproducido con permiso de
[42]. Copyright © 2002, Elsevier
Los resultados presentados en las Figuras 4.14 y 4.15 ilustran de hecho la

reticulación intramolecular de las bobinas de biopolímero por iones
polivalentes. El organismo contiene grandes cantidades de iones metálicos
(particularmente K + , Na + , Ca 2+ y Mg 2+ ), que pueden cambiar la viscosidad
y, en consecuencia, la estructura de las soluciones de sal de agua hialurónica.
El efecto de Li + , el más significativo debido
1,00
K
California
a·s
Co
Viscosidad, Pa
0,10 Ce
0,01
1 10 100 1000
Corte, s –1
10000
Figura 4.15 Perfiles de flujo aparentes (velocidad de cizallamiento versus
viscosidad) para soluciones de HA incubadas en presencia de iones K + , Ca 2+ , Co 2+
y Ce 3+ (todos son sales de Cl - ) [42]. Reproducido con permiso de [42]. Copyright ©
2002, Elsevier
por su tamaño y carga, es especialmente interesante en vista de la

aparición de un número considerable de preparados farmacéuticos
que contienen litio.
Cowman y col. [43] investigó el efecto de la temperatura en el rango de
25 a 65 ° C sobre el comportamiento reológico dinámico de una solución
acuosa de hialuronano que contiene sal , Hylan A ( HA reticulado ) y una
mezcla de hilanos (conocida con el nombre comercial Synvisc ® ). El aumento
de temperatura reduce sustancialmente el módulo y la viscosidad compleja
de las tres muestras.
Así, en soluciones acuosas, HA exhibe las propiedades de líquido
cristalino nemático que se manifiesta en su comportamiento con los
cambios en la velocidad de cizallamiento. El aumento de las
concentraciones del polisacárido en solución da como resultado un
aumento sustancial del volumen de espirales macromoleculares que,
debido al solapamiento, forman una estructura de hidrogel. Esta
estructura tiene la propiedad de ser permeable a sustancias de bajo
peso molecular e impermeable a compuestos macromoleculares. La
conformación de las moléculas de HA depende tanto del tamaño de
las cadenas del polímero (peso molecular) como del pH del entorno,
así como de la naturaleza de los iones. La flexibilidad conformacional
de las macromoléculas de hialuronano determina la aparición de las
estructuras de orden superior necesarias para la manifestación de la
especificidad biológica. La posibilidad de formación de una amplia
variedad de estructuras supramoleculares completa o parcialmente
ordenadas a partir de sus macromoléculas juega un papel biológico
fundamental en la orquestación de procesos intra e intercelulares .
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5
Modificaciones químicas, fase
sólida,
Radio-química y enzimática
Transformaciones de ácido
hialurónico
Desde el punto de vista químico, el hialuronano posee cuatro tipos
diferentes de grupos funcionales: acetamida, ácido carboxílico,
hidroxilo y aldehído terminal. Después de la desacetilación, se pudo
obtener una amina libre a partir de un grupo acetamida. Las cuatro
funcionalidades permiten reacciones químicas características. Una
variedad tan amplia de posibles modificaciones químicas crea una
marcada diferencia entre el ácido hialurónico y otros polisacáridos
cuya reactividad depende principalmente de los grupos hidroxilo.
Nos damos cuenta de que la descripción de la reactividad general y las
modificaciones químicas del hyaluronan es un tema denso que podría llenar
una monografía separada. Sin embargo, este capítulo se centrará
principalmente en las modificaciones químicas del hialuronano que
conducen a la reticulación. Tales modificaciones juegan un papel importante
para la creación de ácido hialurónico con valiosas propiedades químicas y
físicas necesarias para la aplicación biológica de productos hialurónicos.
Históricamente, el hialuronano era conocido por la transformación
química de sus grupos hidroxilo. Solo recientemente, varios procesos
también describieron la transformación de grupos carboxilo y grupos amino
desacetilados. Generalmente, los polisacáridos, incluido el hialuronano,
poseen todas las reacciones químicas características de los compuestos que
contienen hidroxilo , incluida la formación, sustitución, eliminación, etc. de
éteres y ésteres. La reactividad de los ácidos hialurónicos depende
principalmente de la funcionalidad de los grupos hidroxilo. Además, la
contribución del grupo aldehído es relativamente pequeña. La presencia de
los grupos hidroxilo libres ofrece la posibilidad de modificaciones
estructurales de la base de azúcar, que permite directa bio-específico
modificación se lleve a cabo por medio de, por ejemplo, bi-funcionales
reactivos que interactúan simultáneamente con dos grupos funcionales de
las macromoléculas vecinos . Consideramos bi-funcionales reactivos como
compuestos químicos que generalmente poseen dos de los mismos grupos
tivos reacciones separadas por un espaciador. Los reactivos bifuncionales se
utilizan ampliamente para un covalente

enlace de fragmentos estéricamente cerrados de macromoléculas de

polisacárido. Un método de bio-específico modificación es
foto-iniciación de enlace polisacárido con una introducción inicial de
foto-reacción fragmentos en su estructura.
Este capítulo se centra en dos temas relacionados con el campo de
las reacciones estimuladas mecánicamente: (1) entrecruzamiento
químico y fotoquímico de HA en soluciones acuosas y (2) métodos
avanzados de modificación de polisacáridos en fase sólida . A partir
de estos procesos, los hidrogeles hialurónicos reticulados adquieren
una serie de propiedades valiosas que amplían significativamente el
rango de sus aplicaciones médicas.
5.1 Características principales de los hidrogeles reticulados
En solución acuosa, el hialuronano forma una estructura similar a un

gel como resultado de la interacción intermolecular de
macromoléculas lineales. La química coloidal define a los geles como
sistemas estructurados con medios de dispersión líquidos que exhiben
propiedades mecánicas más o menos similares a las de los sólidos. Las
partículas de la fase dispersa se conectan entre sí en una red
tridimensional (que contiene medios de dispersión en sus células y, en
el caso de los hidrogeles, agua) que priva al sistema de fluidez. Es
obvio que las propiedades de los hidrogeles dependen principalmente
de la fuerza de los enlaces y el nivel de reticulación en la estructura
reticulada . Los enlaces cruzados en los biopolímeros se pueden
clasificar como físicos (formados por interacciones electrostáticas o
enlaces de hidrógeno) o químicos (formados por enlaces covalentes).
Los geles físicos, al calentarse, experimentan una descomposición del
nodo web que conduce a una reducción en el módulo de
desplazamiento. Los geles químicamente reticulados son
significativamente más resistentes al calor, pero a altas temperaturas
se produce una destrucción completa e irreversible de la estructura
química del gel. El nivel de reticulación está determinado por el peso
molecular medio de la cadena de polímero ubicada entre las
reticulaciones. La densidad de una reticulación afecta directamente
las propiedades fundamentales de los hidrogeles, como el grado de
hinchamiento, la resistencia mecánica y la elasticidad, la
permeabilidad y las características de difusión [1].
Los hidrogeles, formados por hialuronano como resultado de
la reticulación, son sustratos poliméricos anfifílicos capaces de
hincharse en agua y formar una red voluminosa insoluble. La red
polimérica está en equilibrio con el medio acuoso, mientras que existe
el equilibrio de las fuerzas elásticas de los polímeros reticulados con
las fuerzas osmóticas de la solución. Las composiciones químicas y el
peso molecular del fragmento de macromolécula entre dos
enlaces cruzados determinan una densidad de enlaces cruzados que,
a su vez, influye en la hinchazón y el tamaño de los poros del gel [1, 2].
Además de eso, la reticulación caracteriza al hidrogel como un
compuesto pseudo-sólido , no a la solución, lo que le confiere
propiedades viscoelásticas [3]. Estas propiedades se expresan a través
de las características físicas de los hidrogeles, incluido el nivel de
hinchamiento o la cantidad de agua absorbida. El hinchamiento está
directamente relacionado con la estructura química del polímero y
está en proporción inversa a la densidad de las reticulaciones.
En 1943, Flory y Rehner fueron los primeros en encontrar una conexión
entre el nivel de densidad de reticulación del polímero y su hinchamiento
[4]. En el modelo de Flory-Rehner , el nivel de hinchamiento está
determinado por el equilibrio entre las propiedades elásticas y las fuerzas
originadas por la mezcla del polímero y el disolvente. En 1977, Peppas y
Merrill modificaron la teoría de Flory-Rehner para aplicarla al
comportamiento de los hidrogeles [5]. Debido a las fuerzas elásticas, la
presencia de agua afecta el cambio en el potencial químico dentro del
sistema [5] y la estructura química afecta la hinchazón. Por ejemplo,
hidrogeles con grupos hidrófilos, a los que
Las modificaciones químicas, en fase sólida, Radio-química y enzimática Transformaciones 123
El HA está relacionado, se hincha más que los hidrogeles con grupos

hidrófobos; estos últimos no aumentan de volumen en presencia de
agua [6]. El hidrogel de hinchamiento muy a menudo puede depender
del pH, la temperatura u otros factores [7].
El límite de hinchamiento puede determinarse experimentalmente o
calcularse teóricamente. La medición precisa de la hinchazón límite es útil
en los cálculos de reticulación densidad, tamaño de malla y el coeficiente de
difusión. Muchos geles naturales están formados por polielectrolitos. Las
propiedades físicas de estos sistemas están muy influenciadas por una
presión osmótica causada por contraiones asociados con las cadenas
poliméricas. Los contraiones libres aumentan significativamente el
hinchamiento de los geles cargados y afectan el módulo elástico. Las
características mecánicas de los hidrogeles cargados determinan las
propiedades de muchas estructuras biológicas como el cartílago, el líquido
sinovial, la córnea y el músculo estriado. Para medir el hinchamiento de los
hidrogeles, se podrían utilizar diferentes métodos experimentales. Una
característica importante de los hidrogeles es la porosidad o el tamaño de la
malla. Es una propiedad estructural del material, que se determina como
una distancia entre enlaces cruzados adyacentes . El estudio realizado con
diacrilato de polietilenglicol (PEGDA) estableció experimentalmente cambios
significativos en la porosidad ante cambios en el peso molecular del
polímero y pequeños cambios en el tamaño de las células a diferentes
concentraciones [8]. Las mediciones directas de la porosidad implican
microscopía electrónica o dispersión láser cuasi-elástica . Los métodos
indirectos incluyen porosimetría de mercurio y mediciones de alta
elasticidad y máximo hinchamiento [7,9].
Al diseñar tejido celular, la velocidad de difusión del compuesto

solubilizado es importante para determinar la velocidad de liberación
de fármacos o transporte de nutrientes y metabolitos. La difusión de
nutrientes, metabolitos y otros compuestos solubilizados depende de
muchos factores, incluida la morfología de la red, la composición
química del hidrogel, el contenido de agua, la concentración de
compuestos solubilizados y el nivel de hinchamiento del material [7]. .
La naturaleza de los enlaces cruzados afecta la formación del
hidrogel, su forma, tamaño y degradación. La formación de
enlaces cruzados debe monitorearse para las aplicaciones biomédicas
de hidrogeles. En esta sección, se describen tres tipos diferentes de
reticulación en hidrogeles: interacciones covalentes, iónicas y físicas
[10].
La aparición de enlaces cruzados covalentes químicos puede tener
lugar durante la polimerización radical bajo exposición a radiación de
alta energía (gamma y electrón) [10]. Antes de la polimerización por
radicales, los polímeros se modifican normalmente añadiendo grupos
reactivos adicionales. Por ejemplo, se añade acrilato al polietilenglicol
(PEG) para conseguir una reticulación covalente [11]. La
polimerización radical de los grupos acrilato puede iniciarse mediante
catálisis ligera, a alta temperatura y redox [12,13].
Una vez iniciado el proceso de reticulación , no se puede cancelar ni
detener; está controlado únicamente por las condiciones iniciales del
proceso. La fotopolimerización es la conversión de una solución de polímero
líquido en gel bajo la acción de aditivos fotosensibilizantes y luz [10] y es el
método más ideal para la síntesis de hidrogeles reticulados destinados a la
práctica médica, ya que permite que la reacción se lleve a cabo. con casi el
100% de eficiencia.
El segundo tipo de enlaces químicos en hidrogeles representa los enlaces
basados en interacciones iónicas. Varios polisacáridos naturales - por
ejemplo, el alginato, un polisacárido natural hecho de algas, hialuronano y
otros polímeros cargados - forman el hidrogel con interacción iónica en
presencia de cationes bivalentes o multivalentes. La reacción normalmente
se desarrolla a temperatura ambiente y pH neutro [14]. Las interacciones
iónicas son más débiles que los enlaces covalentes, por lo que estos
hidrogeles sufren una rápida degradación en solución fisiológica.
(los medios en los que se supone que deben usarse). Un ejemplo de un

polímero sintético que forma hidrogel con interacciones iónicas es el poli [di
(carboxilatefenoxi) fosfaceno] [15].
El tipo más débil de interacción realizado por enlaces de hidrógeno,
interacciones hidrófobas y fuerzas de Van der Waals también conduce
a la estructuración del gel. Los enlaces de hidrógeno suelen ser más
fuertes que las interacciones hidrofóbicas y de Van der Waals; sus
valores de energía están en el rango de 10 a 40 kJ / mol, pero siguen
siendo un orden de magnitud más débiles que los enlaces iónicos y
covalentes. Sin embargo, estas interacciones débiles juegan un papel
central en el proceso de autoensamblaje molecular , ya que las
diversas combinaciones de estas interacciones en las macromoléculas
conducen a una fuerte unión. R. Zhang y col. describió el
autoensamblaje molecular como un conjunto de bloques de
construcción moleculares que forman espontáneamente estructuras
de red estables y físicamente conectadas [16]. A pesar de la debilidad
de cada acto de unión física, la multiplicidad de tales enlaces hace que
las estructuras de la red de gel sean bastante estables. Por tanto, los
diversos enlaces químicos y físicos pueden participar en la formación
de hidrogeles reticulados estables .
5.2 Métodos de enlace cruzado de ácido hialurónico
Como se mencionó anteriormente, el ácido hialurónico posee cuatro

funcionalidades: acetamida,
carboxilo, hidroxilo y aldehído terminal. Todos son adecuados para
reacciones de reticulación . Dependiendo de la naturaleza del reactivo
de reticulación , se han sintetizado una gran variedad de materiales
de ácido hialurónico, desde las películas con bajo contenido en agua
hasta hidrogeles con alto contenido en agua. La mayoría de los
métodos de la producción de reticulado hialuronano se relaciona con
uno de dos esquemas: (1) una sola etapa de proceso con un
bi-funcional reactivo capaz de crear reticulados puentes o (2) una
de dos etapas proceso en el que se sintetizan derivados de HA
altamente reactivos, seguido de una segunda reacción que crea
enlaces cruzados. Se utilizan típicamente diferentes reactivos para la
reticulación de hialuronano , incluidas diaminas, aminoaldehídos
(obtenidos de aminoacetales), dialdihídos, butadienosulfonas,
diepóxidos, sales de metales divalentes y otros [17].
5.2.1 Enlace cruzado con carbodiimidas

Una de las reacciones más comunes del grupo carboxílico HA con
aminoácidos y diaminas es la condensación en presencia de HOBT en
agua / DMSO [18]. Se sabe que uno de los mejores métodos de
condensación de funciones carboxílicas y amino es la reacción en
presencia de DCC (diciclohexilcarbodiamida). Uno de los primeros
estudios de la condensación con DCC se realizó en 1991 [19]. Se utilizó
un método similar para la reacción con diferentes aminas [20].
Desafortunadamente, DCC requirió la reacción en condiciones
no acuosas . Sin embargo, existe la posibilidad de realizar reticulación
con EDC - análogo soluble en agua de DCC [21]. En [22, 23] se describe
un proceso similar, que menciona la condensación con EDC y da lugar
a hidrogeles reticulados .
Los métodos generales para la reticulación de biopolímeros como la
hidroxietilcelulosa (HEC), la sal sódica de carboximetilcelulosa (CMC
Na) y el ácido hialurónico (HA) que utilizan carbodiamida soluble en
agua se resumen en una revisión publicada en 2005 [24]. La
interesante invención describe la síntesis de un derivado
insoluble en agua de ácido hialurónico reticulado con
biscarbodiimida [25].

H
+ X-

R norte C norte R (UN)
O O

R norte C norte R (SEGUNDO)

DECIR AH C OH +
HA OH

DECIR AH C O DECIR AH
A - EDC o análogos

B - DDC o análogos
Figura 5.1 Ácido hialurónico de reticulación con carbodiimida

R4 O O

R O R3O
3 O
O3 O O norte R2

O norte

COR H

O
H 3 COC NUEVA HAMPSHIRE O
R3O R1
O3
O O
O3

R4
Figura 5.2 Ácido hialurónico reticulado con enlace amida después de la reacción
con carbodiamida utilizando el método Ugi
Uno de los últimos estudios investiga el papel del disolvente en la

reticulación de carbodiimida del ácido hialurónico. Los productos
reticulados estaban destinados a su uso en oftalmología. Se llegó a la
conclusión de que después del tratamiento con EDC en presencia de
una mezcla de acetona / agua (85:15, v / v) las membranas de hidrogel
de HA tienen el menor contenido de agua en equilibrio, el mayor
estrés de rotura y la mayor resistencia a la rotura. digestión de
hialuronidasa. Independientemente de la composición del disolvente
(en el intervalo del 70 al 95%), las membranas de hidrogel de HA
reticulado son compatibles con las líneas celulares del EPR humano
sin causar toxicidad e inflamación [26].
En la patente [27] se describe un método interesante de conectar dos
fragmentos de ácido hialurónico a través de funciones de amina
primaria y carboxílica utilizando el enfoque Ugi [27]. En el método, la
amina primaria se generó por desacilación, luego se dejó reaccionar
dos moléculas en presencia de formaldehído y ciclohexilisocianuro
(Figura 5.2). La reacción de Ugi permitió a los científicos producir HA
reticulado con un enlace amida N-sustituido , en el que las funciones
carboxílicas y amino procedían de las diferentes moléculas de HA.
Otra forma posible de sintetizar HA reticulado es mediante el uso de
reactivos bifuncionales. El producto de HA reticulado se sintetiza
después de la reacción de HA con dihidrazida en presencia de HOBT y
carbodiimida (Figura 5.3) [28]. En esta reacción, solo se utilizaron las
funciones carboxílicas de ambas moléculas de HA para la reticulación.
Otro ejemplo de la síntesis de HA reticulado con un puente de
dihidrazida se describe en [29]. Para la formación del enlace entre
hialuronano y amina primaria, se utilizaron carbodiimida y
N-hidroxisulfosuccinimida . Los autores sintetizaron muchos
O

O
H2 N norte C CH 2 norte C norte NH 2 O

O

O

H H
2HA C OH

DECIR AH
C
norte
norte CH
C
2 C
norte

norte
nor
S.S

Figura 5.3 Reticulación de HA con dihidrazida

Primer paso Segundo paso

DECIR AH Intermedio de HA Doble reticulado

Red HA
Figura 5.4 El proceso de doble reticulación de HA [21]. Reproducido con permiso

de [21]. Copyright © 1997 John Wiley & Sons, Inc.

CH 2 O
2HA CH 2 OH HA CH 2 O CH 2 O CH 2 HA
Figura 5.5 Reticulación de HA con formaldehído
reactivos de hidróxido polivalente (2 a 6 hidracidas por reactivo) para

su uso en las reacciones de reticulación de HA por carbodiimidas.
Para realizar la reticulación, Zhao et al. desarrollaron un método de
dos etapas en el que se utilizó polímero sintético alcohol polivinílico en
la primera etapa, seguido de alginato de sodio de biopolímero iónico
en combinación con hialuronato (Figura 5.4) en la segunda etapa [30].
Este método permitió obtener la red polimérica con una bioestabilidad
incrementada.
5.2.2 Enlace cruzado con aldehídos

El formaldehído y el glutaraldehído se han utilizado durante mucho
tiempo para entrecruzar proteínas para la conservación de tejidos. El
formaldehído se utiliza para la síntesis de varios productos de HA
reticulados (Figura 5.5). La reticulación con glutaraldehído conduce a
materiales con una alta resistencia a la biodegradación. Tomihata e
Ikade estudiaron la reacción con glutaraldehído en la solución acuosa
ácida con acetona con el fin de obtener películas hialurónicas con
hinchamiento restringido [31,32]. Mediante una comparación de los
geles de HA reticulados con glutaraldehído y carbodiimida, se
encontró que el tratamiento con carbodiimida conduce a productos
finales con una mayor cantidad de enlaces cruzados . Los materiales
obtenidos se utilizan para esqueletos de tejidos [33].
5.2.3 Enlace cruzado con divinilsulfona

Los hidrogeles estables de HA pueden obtenerse mediante reticulación de HA
con divinilsulfona.

O

CH 2 CH S CH
CH 2

O

O

2HA
OH
DECIR AH
O

O

DECIR AH
CH 2 S CH

CH CH CH 2 CH CH

2 2 2 2 2
O

Figura 5.6 HA de reticulación con divinilsulfona
O Ca 2+
O O

2HA C OH DECIR AH C O - + Ca + - O C DECIR AH
Figura 5.7 HA de reticulación con bivalente de metal iones
En medios alcalinos, divinilsulfona o butadienosulfona, se forma un

enlace sulfonil éter entre grupos hidroxilo de HA. Dependiendo de las
condiciones de reacción, los productos de reacción podrían tener
diferentes consistencias desde geles blandos hasta películas sólidas (se
podría usar el mismo método para formar las membranas y el tubo
hueco). Dichos productos, utilizados como microimplantes, pueden
permanecer en el cuerpo durante mucho tiempo, especialmente en los
lugares donde los implantes no se ven afectados por fuerzas
mecánicas.
5.2.4 Reticulación por iones de metales polivalentes

La adición de sales de metales polivalentes a la solución de
hialuronano conduce a la reticulación física de los polisacáridos
debido a la formación de enlaces iónicos. Por ejemplo, metales
divalentes como calcio, zinc, cobre, etc., forman sales de HA
reticuladas [34]. Sin embargo, dicha unión iónica con metales
polivalentes (Figura 5.7) es significativamente más débil en
comparación con los enlaces covalentes químicos fuertes. La
estabilidad de dicha unión iónica depende de diferentes factores como
el pH, el medio, la fuerza iónica y la temperatura. Por lo tanto, cuando
estas sales de ácido hialurónico se utilizan como materiales
biomédicos, para inyección intradérmica en mesoterapia, por ejemplo,
su presencia en la dermis tiene una vida útil corta y es difícil de
controlar para asegurar la necesaria acción fisiológica de los
hidrogeles HA sobre el organismo. [35].
5.2.5 entrecruzamiento con epóxidos

Hace casi 40 años, Laurent et al. obtuvieron hidrogeles de
hialuronano reticulados utilizando éter diglicidílico de polietilenglicol
[36]. Otros investigadores extendieron las posibilidades de la química
diepoxyde utilizando ethelene glicol diglicidil éter como un
bi-funcional reactivo y glicidil éter de poliglicerol como un reactivo
trifuncional. El método de reticulación por epóxidos se describe en
[37]. El estudio detallado del mecanismo de reacción mostró que a pH
alto los diepóxidos forman enlaces éster involucrados en grupos
carboxílicos, mientras que a pH bajo se forman enlaces éter entre
grupos hidroxilo.
El método de reticulación con oligómeros diepóxido y epóxido tiene
un gran potencial porque los productos, especialmente en
combinación con enlaces éter, poseen una resistencia relativamente
alta a la descomposición hidrolítica. Está relacionado con los productos
de reacción del diepóxido de bis-alcoholes y oligómeros de etilenglicol,
incluido el bis- etilenglicol [38]. Uno de los métodos más comunes para
la reticulación de HA es usar diepóxido de bis-alcoholes,
particularmente

CH 2 CH R CH CH 2 O
O Oh oh O
O O
2HA C OH HA CO CH 2 CH R CH CH 2 OC HA
Figura 5.8 Reticulación de HA con BDDE en el grupo carboxílico (esterificación)

CH 2 CH R CH CH 2 OH OH

O O

2HA OH DECIR

AH O CH 2 CH

R CH CH 2 O DECIR AH
pH <7
R = CH 2 CH 2 O

CH 2 CH 2 O CH 2 CH O
2 CH
2 CH

2
DEG
R = CH 2 CH 2 O CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 O CH 2 CH 2 BDDE

Figura 5.9 Reticulación de HA con BDDE en el grupo hidroxílico (eterificación)
Éter 1,4-butanodioldiglicidílico (BDDE) en medios alcalinos [39]. Sin

embargo, este método tiene varias deficiencias:
●● Uso de exceso de reactivo, lo que dificulta predecir el nivel de
reticulación y purificación del producto final;
●● La reacción tiene lugar utilizando los grupos carboxílicos, lo que
conduce a productos que son menos estables a la hidrólisis y se
degradan fácilmente en el cuerpo (Figura 5.8).
Otro método de reticulación de HA con BDDE fue descrito por De Belder y
Malson [40]. La reacción de HA con BDDE podría llevarse a cabo en medio
ácido, que fue creado por ácido clorhídrico. Sin embargo, se demostró que en
medios ácidos la reacción de reticulación tiene lugar utilizando también el
grupo carboxílico. El estudio completo de la reticulación del BDDE en
diferentes condiciones fue realizado por Schante et al. [41]. Finalmente se
demostró que, contrariamente a los primeros datos, la reacción en
condiciones ácidas conduce a la reticulación en los grupos carboxílicos
(esterificación). La reticulación en condiciones alcalinas (pH alrededor de 10)
tiene lugar en los grupos hidroxílicos (esterificación), lo que conduce a
productos más estables (Figura 5.9).
Es importante mencionar que los agentes reticulantes como
carbodiimes, aldehídos y epóxidos, son compuestos tóxicos. Su
presencia en el medicamento final, incluso en pequeñas cantidades, es
absolutamente inaceptable. La purificación del reticulado gel de
hialuronato de impurezas tecnológicos es un proceso muy difícil que
conduce a un aumento considerable en el coste de procesamiento de
mercancías. Por eso es importante desarrollar procesos de
reticulación tecnológicamente "limpios" basados en los métodos
físicos de las reacciones químicas, como la modificación en
estado sólido y la foto-reticulación.
5.2.6 Enlace cruzado de fotografías

Se podría conseguir una formación de hialuronano reticulado
mediante exposición a los rayos UV. Así es como se produjeron y
utilizaron dos hidrogeles unidos covalentemente en la ingeniería de
tejidos [42]. Una modificación del hialuronano y otros polímeros
similares por exposición a los rayos UV con moléculas fotoactivas
añadidas aumenta la funcionalidad bioquímica y la estabilidad
mecánica del
hidrogeles. Las moléculas de polietilenglicol acrilato (PEGA) llevaron a

cabo una fotopolimerización radical para formar hidrogeles
reticulados [43].
Para iniciar la reacción fotorradical de la reticulación química en HA, su
los grupos funcionales sufren modificaciones estructurales. Leach y
col. llevó a cabo la reacción entre los ésteres metacrílicos y el
hialuronato [44]. Shu y Prestwich [45] sintetizaron con éxito tioatos de
HA. Raeber y col. fueron los primeros en modificar PEGA con el
péptido de unión a integrina derivado de fibronectina
Ac-GCGYG RGDSP G con el fin de aumentar la adhesión celular y la
estimulación del crecimiento tisular [46]. Se llevaron a cabo
transformaciones similares con hialuronano para aplicaciones
posteriores de ingeniería ósea, concretamente para mejorar la
reparación del cartílago [45].
Es importante señalar que es posible realizar transformaciones
fotoquímicas en condiciones suaves para mantener la actividad de las
moléculas biológicas o células encapsuladas. Para tales fines, la
foto-transformación de HA se lleva a cabo en presencia de varios
compuestos, tales como derivados del ácido cinámico, cumarina, timina,
anhídrido metacrílico, metacrilato de glicidilo y estireno. La figura 5.10
muestra cómo los ésteres metacrílicos se someten a fotopolimerización en
presencia de HA para formar un polímero injertado [46].
La ventaja de tal método es que el producto de la derivatización
fotorreactiva de HA es un compuesto soluble en agua . Antes de que
comience el proceso de foto-solidificación , cuando la red
tridimensional aún no se ha formado, los compuestos tóxicos no
reactivos con bajo peso molecular podrían eliminarse fácilmente de la
zona de reacción.
La foto solidificación es, por tanto, el último paso de un método de
reticulación en gel de dos etapas que tiene lugar en lugar de la reacción con
reactivos químicos. Al mismo tiempo, la primera etapa incluye dos
operaciones: la introducción de un espaciador seguida de un grupo
fotoactivo [35]. Como resultado, la exposición a los rayos UV permite obtener
hidrogeles reticulados , libres de impurezas y listos para usar. Al mismo
tiempo, este método, dado que todos los procesos se llevan a cabo en fase
líquida, no asegura la misma densidad de reticulación en todo el volumen
del material. Esto está relacionado con el hecho de que todos los polímeros
sintéticos están dispersos por el peso molecular y, en otras palabras,
representan una mezcla de macromoléculas de diferentes tamaños.
Los biopolímeros naturales, a los que pertenece HA, no son polímeros
polidispersos debido a la naturaleza matricial de su síntesis. La naturaleza
de la síntesis bioquímica está determinada por la matriz; la enzima sobre la
que se sintetiza el biopolímero. Sin embargo, durante los procesos de
extracción y purificación de biopolímeros, estos se degradan de una forma u
otra. Por ejemplo, poligalactomanano, diferentes tipos de celulosa (madera o
algodón), quitosano y hialuronano se aíslan como una amplia gama de
fracciones de macromoléculas dispersas relativamente estrechas.
La purificación y aislamiento del producto final de la síntesis bioquímica,
como regla, siempre proporciona un conjunto multimodal de fracciones
estrechas (la distribución de tipo multimodal es un modo en el que aparece
más de un pico en el gráfico de la distribución del peso molecular). Esto lleva
al hecho de que durante la unión de un sistema polidisperso en condiciones
suaves

O CH 3
2H O C C CH 2 O CH 3 Fotorreactivo

2HA CH 2 OH 2HA CH 2 O C C CH 2 hv

O CH 3 CH 3 O

DECIR AH CH 2 O C CH CH 2 CH 2 CH C O CH 2 DECIR AH
Figura 5.10 Reticulación de HA por fotopolimerización
en el medio acuoso, las fracciones de alto peso molecular se reticulan

más rápidamente que las fracciones de bajo peso molecular. El
resultado es el problema obvio de la heterogeneidad del gel, que se
nota especialmente en altos grados de reticulación. Estas desventajas
pueden evitarse utilizando polisacáridos de proceso de modificación
en fase sólida (mezcla reactiva en estado sólido (SSRB) [47].
5.2.7 Estado Sólido entrecruzamiento bajo alta presión y

deformación por cizallamiento (Solid-State reactiva de
fusión: SSRB)
Desde la década de 1970, se han realizado estudios sistemáticos de los
efectos de la alta presión y el esfuerzo cortante en compuestos
orgánicos sólidos. El principal instrumento utilizado en los estudios
fueron los yunques Bridgman, el dispositivo inventado por el premio
Nobel PW Bridgman [48] para estudiar las propiedades de detonación
de los explosivos orgánicos. Durante ese período se publicaron una
serie de observaciones sobre la evolución de ciertas sustancias
orgánicas bajo alta presión (1,5 GPa) y deformación por cizallamiento.
Hace más de 40 años, Enikolopov publicó el primer informe sobre la
polimerización de varios monómeros de vinilo en estado sólido bajo el
efecto de alta presión y esfuerzo cortante. Desde entonces se han
estudiado las conversiones de cientos de compuestos orgánicos y
diferentes tipos de reacciones químicas que tienen lugar en estas
condiciones [49]. Muchas reacciones químicas en las que intervienen
sustancias y polímeros de bajo peso molecular se han llevado a cabo
mediante eterificación y amidación directas e inversas. Estas
reacciones involucran epóxidos, varios tipos de transposiciones,
polimerización y policondensación y modificación de polímeros de
diferentes estructuras. Las reglas identificadas en estos estudios
demuestran un papel crítico de la deformación en la determinación
del grado de conversión y la existencia de presión crítica, por debajo
de la cual la reacción no ocurre en todos los grados de deformación.
La identificación de los estados activos durante las diferentes condiciones
de la acción mecánica permite establecer posibilidades para realizar
procesos químicos y hacer un pronóstico de cómo utilizarlos eficazmente. La
deformación de los materiales sólidos, independientemente de su naturaleza
química, va acompañada de un profundo desorden del compuesto sólido
mediante la creación de estructuras nanométricas y una gran cantidad de
centros activos ( enlaces salidos por electrones y vibraciones , electrones e
iones estabilizados en las trampas, átomos de baja coordinación en el núcleo
de dislocación y otros defectos estructurales, átomos metaestables , etc.). Es
por esto que los procesos mecánicos en estado sólido son bastante similares
a los procesos fotoquímicos y radioquímicos.
La base de las reacciones en fase sólida es un tratamiento mecánico
intensivo de la mezcla sólida de los reactivos que tiene lugar en ausencia de
los disolventes bajo la acción mutua de alta presión y pura deformación en
diferentes aparatos. Como resultado del tratamiento, se produce la conexión
a tierra y la amorfización de los polímeros a medida que los componentes se
acercan entre sí a nivel nano con la deformación plástica mutua bajo
presión. Proporciona una transferencia de masa sin dislocación , lo que
resultó en una mezcla deformativa a nivel molecular [31]. Al final, esto
conduce a altas tasas de conversión en mecano-estimulación de las
reacciones químicas. La activación de compuestos sólidos a la alta presión y
la tensión de cizallamiento crea posibilidad de que las transformaciones
químicas dirigidas en la que no se derrite y compuestos ble insolu- con alto
rendimiento. Mientras que el plástico es fluido bajo presión, tanto los
polímeros cristalinos como los amorfos se ven afectados por cambios
estructurales. Al mismo tiempo se forma la estructura, que contiene los
responsables de tamaño nanométrico áreas de los dominios cristalinos
ordenados y recién formados nano-áreas de fase amorfa. Estas estructuras
están muy ordenadas debido a
la orientación de la cadena en el plano de flujo. En los casos en los que

la reticulación se produce en el flujo local (al nivel de la deformación
plástica de tamaño nanométrico ), todos los sistemas de unión que
podrían estar dentro de este volumen están involucrados en la
formación de nuevas uniones. La razón es que el tamaño lineal de
cualquier macromolécula es significativamente mayor que el tamaño
de la deformación (3-5 nm) [47].
Por tanto, las macromoléculas están en la conformación extendida y
se unen localmente durante la reticulación provocada por la
deformación por presión y cizallamiento en el estado sólido. En
consecuencia, las cadenas de HA reticuladas en tal modo son más
uniformes en toda la longitud de la macromolécula. Además de eso, la
reticulación en fase líquida proporciona más enlaces intermoleculares
y menos intramoleculares porque las macromoléculas existen como
espirales en la solución. En otras palabras, el sistema reticulado en el
medio líquido es menos homogéneo en comparación con un sistema
reticulado en el estado sólido. Al conservar la selectividad de la
reacción, se permite que la combinación óptima de temperatura e
intensidad de deformación alcance el alto nivel de transformación de
los grupos funcionales.
El agente de unión, que se utiliza en la deformación plástica, se
distribuye por todo el volumen del polímero a un nivel cercano al
monomolecular. Como resultado, es posible obtener reticulación de
cualquier frecuencia. El método de gel-sol análisis basado en la teoría
estadística de la formación de los de tipo web polímeros permite que
los parámetros de tal trabajo NET a determinar, es decir, la
concentración y la funcionalidad de enlaces cruzados y dimensiones
de cadena entre cruzada enlace. Dicha estructura de red tiene
nanoperíodos tanto a lo largo de la macromolécula
reticulada (5-30 nm) como a través de los puentes de reticulación , que
están limitados por la longitud de la molécula de enlace
(generalmente 2–4 nm).
El método de entrecruzamiento en estado sólido del ácido
hialurónico (SSRB) incluye la homogeneización inicial de la sal de HA
en polvo con los agentes de enlace (por ejemplo, diglicidil éteres de los
diferentes dioles) [50-53]. La homogeneización suele tener lugar en el
mezclador a 20–50 ° С. La mezcla obtenida se trata luego con presión y
pura deformación sobre el yunque Bridgman. Para ello, la mezcla de
reacción se coloca entre dos yunques en forma de cono . Los yunques
se presionan hasta tal punto que la muestra se somete a una presión
de hasta 10 HPa. Una vez aplicada la presión, se produce la gran
deformación de la muestra debido a la rotación del yunque inferior
en el ángulo especificado. El tratamiento tanto de la presión como de
la deformación pura tiene una duración de 2 a 3 min. El HA reticulado
resultante también se estudió mediante espectroscopia IR-Fourier ,
métodos de RMN y análisis de rayos X [47,52,53].
La influencia del método de reticulación en estado sólido sobre la
estructura molecular del hialuronano se estudió mediante el método
de difracción de rayos X [50]. El estudio estableció que todos los
difractogramas de las muestras reticuladas del polisacárido con dos
enlaces por cada 100 unidades de HA son idénticos a los
difractogramas de las muestras del material de partida. La conclusión
es que la estructura molecular nativa de HA se mantiene a un nivel
de reticulación bajo. En el nivel de reticulación más alto (8 enlaces por
cada 100 unidades de disacárido), la estructura molecular del HA
inicial ha cambiado levemente: en el ángulo de dispersión de 20 °, la
mitad de ancho del reflejo más intenso (que es indicativo de la
estructura cristalina de HA) aumenta hasta en un 10%. Estos datos
muestran un defecto insignificante de la estructura molecular. El
estudio de espectroscopia IR de transformada de Fourier de las
muestras iniciales de HA y el HA reticulado con diferentes niveles de
reticulación (2 a 16 enlaces por cada 100 unidades; ver Figura 5.11)
muestra la ausencia completa de los enlaces de absorción
característicos de un grupo epoxi. (750– 950 cm –1 y
1240–1260 cm –1 ), lo que indica la conversión completa de los
compuestos epoxi. Una vez completada la reticulación , es posible
calcular un número de reticulaciones en cada 100 unidades de
macromoléculas en función de la proporción de reactivos en la mezcla
de reacción tomada para
0,5 8
7
6
Absorbancia
3
0
1500 1000
Número de onda, cm –1
Figura 5.11 Espectros de infrarrojos:

1. Éter diglicidílico de dietilenglicol
2. Sal sódica del ácido hialurónico, anhidro
3. Sal sódica del ácido hialurónico
4. Ácido hialurónico reticulado con DEG-1 (100% mol) 5.
Ácido hialurónico reticulado en el yunque de Bridgeman
6. Ácido hialurónico reticulado con DEG-1 (16% en moles, modo de
reflectancia) 7. Ácido hialurónico reticulado con DEG-1 (8% en moles, modo
de reflectancia) 8. Ácido hialurónico reticulado con DEG-1 ( 8% en moles,
modo de transmisión) 9. Ácido hialurónico reticulado con DEG-1 (16% en
moles, modo de transmisión)
reticulación. La intensidad del enlace característico del enlace

acetamida (1640 cm -1 ) es igual en los espectros de todas las muestras,
pero al mismo tiempo no se encuentran las bandas características de
los grupos amino. Tampoco se encuentran las bandas de éster
características (1730-1750 cm -1 ) , lo que indica la ausencia de
enlaces cruzados a través de grupos carboxilo. Por tanto, es seguro
concluir que la reticulación tiene lugar por interacción de grupos
epoxi del reactivo de enlace con grupos hidroxilo libres de
hialuronano. La espectroscopia IR no puede responder qué grupos
están involucrados en la reticulación, razón por la cual se ha utilizado
el método más informativo de espectroscopia С 13 RMN [47] (Figura
5.11, 5.12). Este método mostró que la intensidad decreciente del pico С
6 (desplazamiento químico 63,5 ppm) es responsable del átomo de
carbono conectado con el grupo hidroxilo primario.
200 150 100 50 0
Figura 5.12 Espectro de 13 C-NMR del material de referencia de ácido hialurónico
200 150 100 50 0
Figura 5.13 Espectro de 13C-RMN del ácido hialurónico reticulado en estado sólido
Los datos experimentales muestran que el proceso de

reticulación en estado sólido realizado en un único régimen
tecnológico a través de la acción simultánea de la presión y la
deformación pura crea muestras igualmente reticuladas de
hialuronano con niveles prediseñados de reticulación sin aditivos
tecnológicos extraños. . Se han obtenido varios resultados avanzados
mediante métodos de acción mecanoquímica . Muchas reacciones
químicas que
Se han estudiado tanto polímeros de bajo como de alto peso molecular,

incluidas reacciones de esterificación directa e inversa, amidación,
diferentes tipos de transposición y diferentes tipos de modificación de
polisacáridos. La activación mecánica del sustrato y el reactivo a través
de su mezcla intensiva permite la realización de procesos no posibles
en medios líquidos. Los métodos desarrollados de síntesis en
estado sólido y modificación de polisacáridos parecen
extremadamente prospectivos para la obtención de materiales de
aplicación biomédica. Las principales ventajas son la exclusión de
disolventes tóxicos, iniciadores de reacción y catalizadores. Se podrían
obtener muchos productos únicos usando la modificación en
estado sólido de los biopolímeros (ver Capítulo 6). Estos productos son
difíciles o incluso imposibles de sintetizar mediante cualquier otro
método conocido en la química de los polímeros.
5.3 Transformaciones radioquímicas (radiólisis)

de soluciones acuosas de hialuronano
Un número considerable de estudios publicados sobre hialuronano están

relacionados con estudios de las transformaciones químicas del polisacárido
por la acción de la radiación ionizada. Las transformaciones radioquímicas
de las soluciones acuosas de hialuronano se estudian mediante la química de
la radiación de los biopolímeros. El interés de esta investigación está
relacionado con los problemas prácticos de la radiobiología: la protección de
las células vivas y los medios biológicos frente a las radiaciones ionizantes y,
por el contrario, la estimulación de su descomposición (por ejemplo, en el
caso de la radioterapia del cáncer). En segundo lugar, los métodos utilizados
en química de la radiación como la radiolisis de pulsos, la resonancia
paramagnética de electrones (espectroscopia EPR) y otros, pueden
proporcionar información cuantitativa valiosa sobre la reactividad de
diferentes partículas radicales relacionadas con la macromolécula de
hialuronano. En tercer lugar, los efectos de la radiación ionizante pueden
considerarse como un método para estimular físicamente las reacciones
químicas de los polisacáridos para modificaciones posteriores con el fin de
proporcionar propiedades únicas del material. Finalmente, el conocimiento
de los procesos que ocurren durante la irradiación optimiza la esterilización
por radiación de productos médicos con hialuronano.
Durante las etapas iniciales de irradiación de soluciones acuosas de
hialuronano, el efecto principal es la reducción de la viscosidad relacionada
con el proceso de despolimerización [54-59] en el que se hidrolizan enlaces
glicosídicos y se forman oligosacáridos de bajo peso molecular. Con el
aumento de las dosis absorbidas de radiación electrónica y gamma, se
produce una degradación profunda de las macromoléculas de HA y la
destrucción del anillo de piranosa [60-64]. La Tabla 5.1 muestra los datos
relacionados con la reducción del peso molecular promedio en función de la
dosis absorbida para cuatro muestras con diferentes pesos moleculares
iniciales de HA.
Los datos presentados en la Tabla 5.1 muestran que el aumento de la dosis
absorbida de la exposición a la irradiación gamma resultó en una fuerte
disminución del peso molecular de todas las muestras de HA. Al mismo
tiempo, la composición de la fracción del polisacárido expuesto no cambió.
Se obtuvieron resultados similares después de la irradiación de otro
polisacárido similar: carboximetilcelulosa [61,63]. Estos datos muestran que
las partículas de radicales que se originaron en la exposición de las
soluciones acuosas reaccionan eficazmente con la macromolécula del
polisacárido, lo que conduce a su degradación. La acción de la exposición
ionizada sobre el agua dio como resultado la formación de partículas
radicales extremadamente activas, como el radical hidroxilo (ОН *), el
hidrógeno atómico (Н *) y el electrón hidratado [65]. El radical hidroxilo
elimina el átomo de hidrógeno de la macromolécula de polisacárido,
mientras que los electrones hidratados atacan principalmente a los grupos
carbonilo, lo que da como resultado la formación de radicales aniónicos. El
radical OH * podría
Cuadro 5.1 Dependencia de la masa molecular media (MW) y la distribución de la

masa molecular (MW / MN) de la dosis de irradiación gamma absorbida [61]
Lote А Lote B Lote С Lote D

Dosis, kGrey М W, kD а М W / М W, kD а М W / М W, kD а М W / М W, kD а М W /

М N М N МN МN
0 1640 1.1 1800 1.2 1100 1.3 2100 1.1
2.0 420 1.2 430 1.2 340 1.2
4.1 260 1.2 290 1.2 210 1.2
6.4 180 1.2 190 1.2 150 1.2
7.8 170 1.2 180 1.1 130 1.1
8,9 260 1.2
11,0 130 1.2 150 1.1 130 1.1
11,9 180 1.1
12,9 150 1.2 130 1.1 110 1.1
14.3 150 1.1
14,9 110 1.1 110 1.1 92 1.1
17.1 100 1.1 100 1.1 81 1.1
18,1 80 1.2 90 1.1 75 1.1
20,4 120 1.1
26,2 90 1.1
30,0 78
60,0 44
90,0 29
atacar a todos los átomos de carbono en el ciclo de los carbohidratos, a los

que se unen los grupos hidroxilo; o átomos de carbono implicados en enlaces
glicosídicos. En el primer caso, los electrones no apareados se localizaron en
cualquier átomo de carbono 'medio' del ciclo de la piranosa, en el segundo
caso se localizaron en el átomo С 1 que se forma en la escisión del enlace
glucósido en la posición 1-3 o 1 –4. Como resultado de tal ataque se forman
los macrorradicales polisacáridos de diferentes estructuras.
[66]. Usando la radiolisis de pulso, las constantes de velocidad para la reacción de
HA con electrones hidratados
Radicales е -
aq y OH *: se determinaron
K (е - aq + HA) = 3,5 × 10 8 М –1 s –1 y K (ОН * + HA) = 8,4 × 10 8 М –1 s –1
[67 ]. A partir del análisis de los datos presentados en [68–71] para
radiaciones químicas
decoloración de diferentes compuestos (incluido HA), es posible hacer
una estimación del valor de K (ОН * + HA) en una reacción
competitiva de radicales OH * con tinte. Tal estimación conduce al
valor de K (ОН * + HA) = (1.0 +/− 0.5) × 10 9 М –1 s –1 , que se
correlaciona bien con los datos reportados [65]. En [72] se
presentaron constantes de velocidad similares de la reacción OH * y el
electrón hidratado con heparina, queratán sulfato y
carboximetilcelulosa.
Cabe mencionar que si las soluciones acuosas saturadas de aire son expuestas por
ionizado
irradiación, se forman partículas adicionales О 2 - y СО 2 - que también
participan en la radiolisis de polisacáridos. La mayoría de los
investigadores confirman que la reactividad del parti-
Los cristales formados durante la irradiación disminuyen en la serie
ОН *> е aq - > СО 2 - > О 2 - [73].
Así, en base a la reactividad de los diferentes radicales, es posible concluir que
la destrucción (reducción del peso molecular) de HA durante la
solución acuosa tiene lugar principalmente como resultado de la
reacción del polisacárido con el radical oxidativo ОН *. Las reacciones
de los agentes radicales reductores е aq - , СО 2 - y О 2 - son menos
eficientes en comparación con OH *, sin embargo, podrían
transformar el grupo acetamida en un grupo amino sin afectar la
cadena principal de polisacridos (Figura 5.14).

DECIR AH NUEVA HAMPSHIRE C CH _ { 3 } + e - ac O - 2 ; CO - 2
O

+H+
DECIR AH NUEVA HAMPSHIRE C CH 3 DECIR AH NH 2 + CH

O -
Figura 5.14 La reacción de la transferencia de electrones durante la interacción
del radical reductor con la macromolécula HA
COOH CH 2 OH COOH CH 2 OH
O O O O
O O O
=O+
OH O 2
OH
Oh oh Oh oh
OH NHCOCH 3 OH NHCO
CH 3
COOH
CH 2 OH
O O
O
O
OH H O
C OH
OH
NHCOCH 3
Figura 5.15 Diferentes caminos para la transformación del peróxido de

hialuronano macrorradical [62]. Reproducido de [62]. Con permiso de Elsevier
La exposición de soluciones de hialuronano en presencia de oxígeno

solubilizado conduce a un aumento de la velocidad de varias
radiaciones destructivas y transformaciones químicas del polisacárido
[57,62]. El oxígeno molecular influye en el rendimiento del radical
primario y los productos moleculares finales. La formación de tales
productos se debe a la profunda destrucción del ciclo de la piranosa.
Los macrorradicales de hialuronano formados tras la irradiación
reaccionan con la molécula de oxígeno con la formación de dos
radicales de tipo peróxido. La estructura de estos macrorradicales de
peróxido se estableció mediante espectroscopía EPR [55,64,66]; el
primero se forma como resultado de la reacción de О 2 con un
fragmento libre en el átomo С 1 , el segundo, menos estable, se forma
al atacar el oxígeno molecular del electrón no apareado en el átomo
de carbono 'medio' del ciclo de la piranosa. Luego, parte de los
radicales de peróxido ROO * se descompone después de la reacción,
como se muestra en la Figura 5.15 [74], lo que conduce a la
destrucción de la macromolécula de polisacárido. Otra parte participa
en la reacción con la molécula de HA no dañada, lo que da como
resultado la formación de compuestos de hidroperóxido de fórmula
general ROOH. La siguiente descomposición de los hidroperóxidos
ROOH en presencia de О 2 puede conducir al desarrollo de la radiólisis
de cadena múltiple de la destrucción oxidativa del hialuronano, como
lo revela la creciente pérdida de viscosidad durante la irradiación de
las soluciones acuosas aireadas.
Varios estudios presentaron los resultados del aislamiento cromatográfico
de varios productos oligosacáridos finales de la destrucción oxidativa del
hialuronano [62,74]. Los métodos de espectroscopía IR, UV y NMR, así como
la espectrometría de masas, revelan su estructura química (Figura 5.16).
(UN) (SEGUNDO)
COOH CH 2 OH COOH CH 2 OH
O O COOH O O OH
O O COOH
O OH
OH OH OH
OH OH OH
OH NHCOCH 3 OH NHCOCH 3
(C) CH 2 OH
O

OH

HO
O NHCOCH 3
OH
OH
HOC

OH
Figura 5.16 Los productos finales de la destrucción oxidativa del hialuronano, (A)
4,5 GlcUA insaturado (d1–3) GlcNAc (b1–3) -D- ácido pentaurónico ; (B) Ácido 4,5
Glc UA (b1-3) -N -acetil-D- glucosamina insaturado ; (C)
L-tri-tetradialdocil- (b1–3) GlcNAc
La radiólisis de soluciones acuosas de hialuronano podría

describirse como procesos oxidativos destructivos en los que el radical
hidroxilo OH * juega el papel principal. Por tanto, cualquier proceso
que conduzca a la formación del radical hidroxilo, ya sea en
experimentación científica o en la naturaleza, irá acompañado de la
destrucción irreversible del HA con la formación de fragmentos de
bajo peso molecular de diferentes estructuras químicas. Es necesario
comprender el mecanismo de radiólisis del hialuronano para
desarrollar una estrategia que proteja al polisacárido de los efectos
destructivos de los radicales oxidativos.
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6
Aplicaciones médicas de
hialuronano
6.1 Medicina hialurónica y estética
Es difícil imaginar la cosmetología y el campo de la medicina estética moderna sin

hialuronano. Un vistazo a la literatura periódica mundial revelaría
que prácticamente todos los números incluyen varios artículos más o
menos relacionados con HA. Los médicos cosmetólogos se interesaron
inicialmente en el hialuronano debido a su capacidad única para
retener grandes cantidades de agua. Esta propiedad se ha maximizado
para productos cosméticos y mascarillas hidratantes. Desde
mediados del siglo XIX hasta el siglo XX, el HA químicamente
estabilizado (reticulado) se utilizó como microimplantes
intradérmicos (rellenos) para la corrección del contorno de la piel con
cambios involuntarios [1].
El desarrollo de la cosmetología por inyección está estrechamente
relacionado con los métodos de plásticos de contorno, mesoterapia y
bio-revitalización, para los que han aparecido una enorme cantidad
de productos que contienen HA no estabilizado o parcialmente
modificado. El arsenal de la cosmetóloga se ha enriquecido
recientemente con una nueva clase de productos: agentes terapéuticos
macromoleculares no medicinales llamados biorreparaciones en los
que los compuestos biológicamente activos se inmovilizan
químicamente sobre las macromoléculas de hialuronano. Con la
ayuda de estas formulaciones de acción sostenida, ahora es posible
realizar el suministro objetivo de vitaminas, aminoácidos y
oligopéptidos a las células específicas con el fin de estabilizar la
homeostasis de la piel y prevenir los cambios relacionados con la
edad .
6.1.1 Microimplantes intradérmicos a base de hialuronano

La historia del desarrollo de la primera intradérmica
a base de ácido hialurónico Microimplantes órdenes de revisión breve.
Desde principios de la década de 1980, las inyecciones de
microimplantes de HA se han utilizado común y ampliamente para la
corrección de defectos cosméticos depresivos. En 1984-1988, la
preparación

Hylan B, que consiste en hialuronano químicamente reticulado con

divinilsulfona (DVS), se desarrolló en los EE. UU. La primera mención
sobre la reticulación de HA por compuestos epoxi se remonta a
principios de la década de 1960, pero las primeras pruebas preclínicas
y clínicas para la corrección de tejidos blandos se llevaron a cabo para
Hylan B entre 1990 y 1994, aproximadamente al mismo tiempo, en
1993, sobre la base de HA reticulado con 1,4-butanodiol diglicidil éter
(BDDE), el producto Restylane fue aprobado en Europa y se posicionó
como relleno intradérmico . Hoy en día, la cantidad de productos
similares que incluyen hialuronano reticulado y se producen en
diferentes países ha alcanzado varias docenas. El HA, como reconocen
prácticamente todos los especialistas en medicina estética, es un
material casi ideal para la implantación. Según el informe de la
Sociedad Estadounidense de Cirugía Plástica y Estética (ASAPS), la
inyección de hialuronano ocupa el segundo lugar entre todos los
demás métodos no quirúrgicos de rejuvenecimiento de la piel con
1313 038 inyecciones en los EE. UU. Solo en 2009, que es el segundo en
uso únicamente para las inyecciones de toxina botulínica tipo A (2 557
068 inyecciones en los EE. UU. en 2009). Al lograr la tarea principal de
proporcionar volumen adicional en los sitios de déficit tisular (por
ejemplo, arrugas, pliegues, zonas de lipodistrofia, pequeños defectos
de la piel debido a efectos de 'menos tejido' después de intervenciones
quirúrgicas y lesiones), los implantes de hialuronano permanecen en
la piel durante mucho tiempo, no tiene efectos secundarios, no
requiere pruebas alérgicas y la aplicación es simple e indolora
durante la inyección.
A medida que se optimizó y perfeccionó la tecnología de
reticulación , se logró el éxito en el diseño de microimplantes de HA.
En particular, algunos rellenos a base de hialuronano
contemporáneos se caracterizan por sus tiempos de corrección activa
considerablemente largos, es decir, hasta 15-18 meses. A pesar de que
diferentes basados en HA rellenos dérmicos tienen mucho en común,
todos ellos, sin embargo, difieren en la consistencia, concentración,
grado de reticulación y la química de bi-funcionales reticulantes
agentes usados; diferenciaciones que se manifiestan en diferentes
grados de efecto corrector.
En la siguiente sección, se analizan las propiedades de los
microimplantes de hialuronano desde el punto de vista actual de la
química física de los materiales poliméricos similares a geles .
6.1.2 Enlace cruzado de hialuronano en una red tridimensional

En el proceso de preparación de material que se puede utilizar como
implante dérmico a base de HA , el paso principal se refiere a la
modificación química de la macromolécula de polisacárido. Esta
modificación se produce mediante la formación de la tridimensional
estructura como resultado de una reacción con un bi-funcional
de reticulación agente. Los compuestos utilizados para tal
modificación química se analizan en detalle en la Sección 5.2. Estos
bi-funcional reactivos contienen grupos activos y son capaces de
reaccionar con los grupos funcionales de la macromolécula de
polisacárido.
Los principales 'objetivos' para la modificación química en la
molécula de hialuronano se muestran en la Figura 6.1. Actualmente, el
agente de reticulación más popular utilizado en la producción de
rellenos a base de HA es el derivado epóxido 1,4-butanodiol diglicidil
éter (Figura 6.2), y el proceso de producción en sí es análogo a la
reacción que tiene lugar durante la endurecimiento de la resina epoxi.
En los EE.UU., la FDA permite tanto el uso de divinilsulfona (DVS)
(Figura 6.3) como de BDDE como agentes de reticulación .
En la reticulación de HA con bi-funcionales reactivos como BDDE o DVS,
primero se prepara una solución acuosa de ácido hialurónico, en el que la
cantidad dada de la reticulación agente
Aplicaciones médicas de Hyaluronan 145
Principales objetivos para modificaciones químicas ??? catión

O CH 3
- C
O O
C CH 2 OH
O HO O HO OH 1 O NH 1

1O 3 1 O 4 O O
HO
HO OH NUEVA HAMPSHIRE O CO CH 2 OH

jefe CH 3
-
Figura 6.1 principales grupos químicos de HA que reaccionan con bi-funcionales de reticulación
agentes
CH 2 CH CH 2 O CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 O CH 2 CH CH 2
O O
Figura 6.2 Estructura química de la molécula de BDDE
O
CH 2 CH S CH CH 2
O
Figura 6.3 Estructura química de la molécula DVS
está agregado. La reacción se lleva a cabo a un pH diferente y,

dependiendo de las condiciones de reacción, se forman enlaces éster
simples o complejos en las cadenas de HA reticuladas (véanse las
Secciones 5.2.3 y 5.2.5 del Capítulo 5). Si se supone que todas las
cadenas macromoleculares del polisacárido están interconectadas a
través de enlaces tridimensionales , entonces se puede considerar que
todo un volumen de polímero es una macromolécula gigantesca. En
este caso, se puede considerar un gel de hialuronano reticulado
monofásico . Una situación similar se da en la síntesis de gel de
poliacrilamida [2] o en la reticulación de polioxietileno [3]
inducida por radiación . Sin embargo, ahora es bien conocido [4] que
los biopolímeros estructurados como HA no forman redes
tridimensionales regulares con la alternancia secuencial de
enlaces cruzados, ya que este es generalmente un proceso
termodinámicamente desfavorable. El bloque de este biopolímero
estructurado en tres dimensiones generalmente se construye a partir
de macromoléculas reticuladas de hialuronano de estructura globular
(para más detalles, véase el Capítulo 4). Por tanto, al crear un alto
grado de reticulación intermolecular , ya que éste determina el tiempo
de residencia del relleno dérmico en el lugar de implantación, es
imposible obtener un gel monofásico uniforme cuando el proceso se
lleva a cabo en fase líquida. Estudios recientes [4] muestran que el HA
reticulado se caracteriza por una heterogeneidad estructural
significativa, es decir, en lugar de la macromolécula gigantesca, la
estructura del gel está compuesta por partículas discretas de tamaños
microscópicos que representan bloques tridimensionales
microheterogéneos conectados con el macromoléculas de hialuronano
no reticulado mediante enlaces de hidrógeno (Figura 6.4).
La micrografía electrónica de barrido de nanopartículas de hidrogel
reticulado basadas en HA se presenta en la Figura 6.5.
(UN) (SEGUNDO)
Figura 6.4 Representación esquemática del entrecruzamiento entre partículas (A)

y entrecruzamiento entre partículas (B) [4]
UDEL LEI 2,0 kV × 4500 WD 8,0 mm 1 μ m
Figura 6.5 Micrografía electrónica de barrido de partículas de hidrogel reticulado

de HA [4]. Reproducido con permiso de [4]. Copyright © 2009, Sociedad Química
Estadounidense
La polimerización adicional da como resultado un aumento del tamaño de

grano después de su acercamiento e interacción entre sí por medio del
agente de reticulación . La densidad de reticulaciones en tales zonas es alta,
lo que conduce a la formación de una estructura hidrófoba
microheterogénea rígida que consta de elementos extendidos altamente
reticulados (granos, cuerpos) distribuidos de manera desigual en el hidrogel.
Esto, a su vez, conduce a un aumento de la viscosidad, pérdida de fluidez de
la solución de polisacárido y corresponde al punto de gelificación. Sobre la
base de la teoría estadística desarrollada para polímeros reticulados [5], es
posible calcular el grado de reticulación definido como una cantidad de
reticulaciones por 100 unidades de disacárido de HA utilizando el método
sol-gel. de análisis. En estudios [6,7] los autores llevaron a cabo análisis
comparativos de la estructura de los hidrogeles de HA reticulado obtenidos
mediante el método tradicional de fase líquida con el sintetizado mediante la
tecnología de fase sólida
Aplicaciones médicas del hialuronano 147
modificación (el método de síntesis en fase sólida se describe en la

Sección 5.2.7 del Capítulo 5). Se estableció que diferentes métodos de
reticulación de HA dan como resultado un cambio sustancial en la
estructura espacial de los geles reticulados . Cuando se utiliza la
tecnología tradicional en fase líquida de reticulación de HA con un
grado relativamente alto de reticulación, es imposible lograr una
distribución uniforme de reticulaciones en la muestra. Con el grado de
reticulación general de nueve reticulaciones por 100 unidades de
disacárido en HA, el gel comprendía las regiones de las estructuras
densamente reticuladas junto con la zona donde las macromoléculas
no sufrieron modificación química. El problema con tal método de
reticulación del sistema polimérico está asociado con la distribución
heterogénea del peso molecular del material hialurónico en bruto.
Prácticamente en todos los materiales de HA, independientemente del
método de producción, siempre hay una amplia colección de
fracciones de polisacáridos de diferente peso molecular (la
distribución de masa molecular se analiza con más detalle en la
siguiente sección). Según las leyes estadísticas, tras la reticulación de
tales sistemas polidispersos en condiciones suaves de solución acuosa,
el componente de alto peso molecular de hialuronano se reticula
considerablemente más rápidamente en comparación con las
fracciones de bajo peso molecular. Por tanto, la heterogeneidad del gel
resultante se produce debido a la concentración de enlaces cruzados
dentro de la espiral macromolecular. Este problema puede resolverse
en cierta medida utilizando la tecnología de la modificación en
fase sólida de polisacáridos (el procedimiento del llamado
desplazamiento reactivo en fase sólida o mezcla reactiva en
estado sólido (SSRB) [8].
Con este método de iniciación del proceso químico, los segmentos de
la macromolécula de HA se orientan a lo largo del plano de flujo
plástico del polímero (dichas regiones son aproximadamente de 3 a
5 nm) y las moléculas del agente de reticulación se ubican en las
mismas regiones. En este caso, las regiones nanodimensionales donde
se produce la reacción de reticulación se distribuyen casi
uniformemente a lo largo de todo el plano de la presión aplicada y, en
consecuencia, la reacción se produce de manera uniforme en todo el
espesor de la muestra con un grado de BDDE del 100%.
transformación. El grado de reticulación de HA está determinado por
la cantidad de componente de reticulación que se toma para la
síntesis. El uso de dicha modificación en fase sólida permitió a los
autores [6,7,9] obtener gel de HA con el grado de reticulación de 16
enlaces cruzados por 100 unidades de disacárido de HA. Este fue el
grado máximo alcanzable de reticulación en el que el material
resultante no perdió sus propiedades viscoelásticas requeridas para
su uso como implante inyectable.
Cabe señalar que el material obtenido mediante la aplicación antes
mencionada de tecnología innovadora de fase sólida se puede atribuir
a las cargas monofásicas (homogéneas). Sin embargo, este material
monofásico se biodegrada completamente en el lugar de la inyección
después de 4 a 6 meses. La prolongación del tiempo de retención de
este implante intradérmico aumentando el grado de reticulación de
HA mientras se conserva la estructura monofásica del material
parecía imposible. El valor de 16 reticulaciones por 100 unidades de
disacárido es aparentemente el grado máximo de reticulación , ya que
su aumento adicional condujo a una caída en la elasticidad del
material.
Discutamos esto con más detalle. La 'elasticidad' es la capacidad del
material para restaurar su forma inicial después de eliminar la
tensión ejercida por fuerzas externas. Cuando la forma se restaura
por completo, el material se llama "elástico". Los materiales
poliméricos que poseen propiedades elásticas se pueden dividir en
dos grupos. El primer grupo incluye materiales que manifiestan una
resistencia muy fuerte a un cambio en la forma y son reversiblemente
deformables hasta cierto punto. El segundo grupo incluye polímeros
que cambian fácilmente de forma y son capaces de
deformado reversiblemente a muchos cientos por ciento. En muchos

aspectos, estas propiedades pueden describirse por dos parámetros
básicos utilizados con frecuencia en la química física de los polímeros
[4], el módulo a saber cizallamiento (módulo de rigidez) G y módulo
de elasticidad E . El módulo de rigidez y el módulo de elasticidad se
relacionan de la siguiente manera:
2 G T (1 + m ) = E (6,1)
donde m es una relación de Poisson (cantidad adimensional;

generalmente para polisacáridos m = 0.5). En la teoría estadística de
la elasticidad para polímeros estructurados espacialmente, el
módulo de
la elasticidad es función del número de enlaces cruzados efectivos :
3 RTd
E= (6.2)
Mc
donde R es la constante universal de los gases, Т es la temperatura, d

es la densidad del polímero, М с es el peso molecular del fragmento de
la cadena del polímero entre dos enlaces cruzados.
La densidad de la red o el número de enlaces cruzados se determina
como М с o concentración molar de los fragmentos de cadena entre
dos enlaces cruzados ( v ) en la unidad de volumen ( V ):
N = v = re (6,3)
V M c
donde N es una densidad de red o número de enlaces cruzados efectivos .

Estas relaciones utilizadas en la teoría de la elasticidad y
desarrolladas para redes ideales permiten determinar el grado de
reticulación del polisacárido y establecer el grado máximo de
reticulación en el gel de hialuronano, tras lo cual su inyección en la
dermis se vuelve técnicamente imposible. Específicamente, esto
determina tiempos comparativamente cortos (hasta medio año) de la
corrección de los cambios de volumen de la piel mediante la
administración intradérmica de los rellenos monofásicos
(homogéneos) basados en HA reticulado . La solución al problema de
aumentar la duración de la corrección se encuentra en el campo de la
administración de microimplantes bifásicos (heterogéneos) .
Una de las etapas en el proceso de preparación de rellenos dérmicos
de HA consiste en romper la masa de gel densamente reticulada en
partículas pequeñas (el grado de reticulación de las macromoléculas
de hialuronano en tales partículas de gel puede ser tan alto como
30-40 cruces). enlaces por 100 unidades [10]), seguido de tamizado de
la masa de gel triturado a través de varios filtros reticulares o tamices.
En el siguiente paso, estas partículas de gel densamente reticuladas se
suspenden en las soluciones de HA no estabilizado , haciendo que el
tamaño de las partículas varíe en intervalos estrechos, como se
determina para productos fabricados por diferentes proveedores
(Figura 6.6).
Dichos microimplantes de hialuronano se caracterizan por las
siguientes propiedades físico-químicas :
●● Son bifásicos, es decir, hay una interfaz de fase entre los componentes del
sistema.
●● Existe una afinidad entre los componentes a través de la parte que
forma el material y las partículas de gel no estabilizadas y
densamente reticuladas , lo que conduce a la formación de un
material termodinámicamente y estable a la agregación .
Aplicaciones médicas de hialuronano 149
1
.Partículas de gel, % vol
8 3
2
4
2 40 100 200 400 1000 2000
Tamaño de partícula, micras
Figura 6.6 Distribución del tamaño de partículas en los productos basados en HA

Restylane (1), Perlane (2) y Hyalaform (3) [11]. Reproducido de [11] con permiso de
Taylor & Francis
●● Distribución específica de partículas de gel (perlas) según tamaño.

Los rellenos de dos fases contemporáneos se caracterizan por un
tamaño relativamente uniforme de las perlas de gel reticuladas
(Figura 6.5). La excepción son las cargas obtenidas por
homogeneización mecánica de las masas de gel que da como
resultado una consistencia uniforme del producto final, pero
conduce a una distribución de tamaño de partícula más amplia.
Las diferencias fundamentales entre bi-fase y de fase mono
intradérmicas rellenos de HA son como sigue:
1. Bi-fásica HA gel contiene densamente reticulados partículas de
polisacárido con un gran número de enlaces químicos. Esto conduce a una
capacidad reducida del biopolímero para absorber agua; Debido a la
densa red tridimensional , el HA reticulado pierde casi por completo su
capacidad de hincharse. En los sistemas monofásicos , el número de
enlaces cruzados es comparativamente pequeño (es decir, los segmentos
de cadena entre enlaces cruzados químicos son relativamente grandes y
las moléculas de agua pueden penetrar la fase polimérica para inducir un
hinchamiento limitado). Dado que la etapa inicial de degradación de la
estructura de hialuronano reticulado implica predominantemente la
hidrólisis no enzimática de los enlaces químicos entre los restos
reticulados y la macromolécula de HA, este proceso se reanuda a
velocidades más altas en el material monofásico .
2. Los geles bifásicos contienen HA no estabilizado que desempeña el
papel de plastificante de un tipo de efecto bio-revitalizante .
3. Los rellenos bifásicos contienen HA con un mayor grado de
reticulación en comparación con los sistemas monofásicos, por lo
que el contenido de modificador químico BDDE o DVS unido a HA
es 2-3 veces mayor en los geles bifásicos . Tras la biodegradación de
los microimplantes, hay
una probabilidad de formación de moléculas libres de
etileno-bis-1,2-propanodiol НОСН 2 СН (ОН) СН 2 О (СН 2 ) 4 ОСН 2
СН (ОН) СН 2 ОН o tionil -bis-etanol НОСН 2 СН 2 SО 2 СН 2 СН 2 ОН.
Aunque se sabe que estos compuestos no son citotóxicos, su
metabolismo en el cuerpo humano no se ha estudiado lo suficiente
como para excluir la posibilidad del desarrollo de
efectos secundarios no deseados después de la implantación.
En resumen, los microimplantes dérmicos basados en HA que se

comercializan actualmente se acercan en sus características al relleno
"ideal" debido a la bioinercia, la simplicidad de administración y la
duración de la acción correctora en el organismo. Sin embargo, no se
puede ignorar el posible riesgo potencial asociado con la aplicación
prolongada de tales materiales. La estructura química del HA
modificado ahora comprende grupos -CH 2 - del agente de reticulación
, que es inusual para las macromoléculas de hialuronano nativas. Bajo
la acción de la irradiación ultravioleta, se forman radicales libres
(principalmente radicales hidroxi) en la piel que, en presencia de
oxígeno, reaccionan con -CH 2 - mediante el proceso de oxidación en
cadena de radicales libres [12]. Como resultado de tales reacciones
oxidantes , el HA reticulado puede exhibir propiedades prooxidantes ,
es decir, convertirse en una fuente de radicales libres que atacan y
dañan la estructura del colágeno y las proteínas dérmicas en los sitios
de implantación. Por lo tanto, los principales esfuerzos de los
científicos que trabajan con materiales de HA se centran en el
desarrollo de los físico-química métodos de modificación de HA que
no requieren el uso de bi-funcionales reactivos.
6.1.3 Ácido hialurónico en cosmetología inyectable (biorrevitalización)

El contenido de hialuronano en la piel humana es variable. Hay variaciones
estacionales insignificantes en el contenido dérmico de HA: en verano, el
nivel de hialuronano es algo bajo en comparación con el invierno. Esto
ocurre debido a una mayor tasa de degradación del HA bajo la acción de la
radiación UV [13]. El efecto más significativo es la disminución
relacionada con la edad en la concentración de HA. El estudio [11] analiza los
numerosos datos sobre las mediciones del contenido de hialuronano en
diferentes grupos de edad de pacientes. A partir de los 60 años, la
concentración de HA en la dermis disminuye rápidamente. Por lo tanto, las
inyecciones intradérmicas de HA nativo representan un método bastante
natural de reposición de biopolímeros. Este método de inyección en
medicina estética se llama biorrevitalización. Se cree que el término
'biorevitalización' fue propuesto en 2001 por el investigador italiano Di
Pietro, quien originalmente lo definió como un método de inyecciones
intradérmicas de hialuronano no modificado que permite restaurar el medio
fisiológico y normalizar los procesos metabólicos en derma [14].
En consecuencia, la biorrevitalización puede considerarse

principalmente como un método de restauración de la matriz
extracelular, que a su vez determina el algoritmo óptimo de
bioactividad de las células de la piel. La administración de HA nativo
conduce a una mejora en la actividad proliferativa de fibroblastos,
estimulación de la síntesis de colágeno y elastina mediada por células
, simulación de la diferenciación de fibroblastos en fibroblastos y
activación de la angiogénesis. Diez años de experiencia con la
aplicación nativa de HA en medicina estética ha permitido determinar
experimentalmente las características fundamentales de los
biorrevitalizadores. Primero, el peso molecular de hialuronano y la
concentración de material activo varía de 0,5 a 1,8 en masa en
porcentaje (se considera que el peso óptimo es aproximadamente 1
MDa). El rango de concentraciones de trabajo de HA en los
biorrevitalizadores está determinado por la facilidad de
administración y por la ausencia de efectos secundarios indeseables
en forma de edema dérmico. El peso molecular del hialuronano es un
parámetro extremadamente importante ya que las macromoléculas
de diferentes pesos influyen en el comportamiento celular de
diferentes formas.
Se supone [15] que el peso molecular juega el papel más importante
en los mecanismos de regulación fisiológica. La fracción de peso
molecular relativamente bajo de HA (es decir, menos de 10 000 Da)
exhibe una acción inflamatoria e induce la angiogénesis (proliferación
de los vasos sanguíneos y linfáticos). El hialuronano con un peso
molecular de 50 000 a 100 000 Da estimula la proliferación celular y
activa la migración de las células. La fracción
de HA con un peso molecular de más de 500 000 suprime la

angiogénesis, inhibe la proliferación celular y bloquea la secreción de
interleucina 1b y prostaglandina E2 (mediadores de la inflamación).
En el estudio [16], se demostró experimentalmente que la eficacia de
la protección de los fibroblastos de la acción citotóxica de los radicales
libres aumenta correlativamente con el tamaño de las
macromoléculas de HA. El más eficaz a este respecto es el hialuronano
con un peso molecular de aproximadamente 1 MDa. Los datos del
estudio antes mencionados demuestran que las macromoléculas de
HA con diferentes longitudes de cadenas de polisacáridos poseen una
capacidad única para ejercer efectos completamente opuestos a nivel
molecular y celular. Aún no se ha encontrado una explicación
convincente de este fenómeno, al igual que los mecanismos de
regulación aún por descubrir, además del sistema único de
'receptor de hialuronano' , en el que la transferencia de señal cambia
dependiendo de la dimensión molecular del ligando. Por tanto, se
deduce que el peso molecular de HA en los biorrevitalizadores
debería controlarse estrictamente para incluir sólo fracciones
relativamente estrechas con un peso molecular definido. El peso
molecular del hialuronano en tales formulaciones es, por tanto, de
suma importancia. En la siguiente sección se proporciona una
discusión de los tipos de peso molecular usados para la
caracterización de biorrevitalizadores basados en HA .
6.1.4 Peso molecular de hialuronano en productos de biorrevitalización

Es bien sabido que los datos existentes sobre el peso molecular de HA
deben evaluarse con precaución, ya que obtener un polisacárido
limpio e intacto con el alto grado de polimerización y el 100% de
rendimiento es prácticamente una tarea imposible (ver Sección 6.2).
Cualquier muestra de polisacárido no es absolutamente homogénea
porque está compuesta por una mezcla de homólogos de polímeros,
cuyas cadenas contienen una unidad de polímero adicional que se
repite. Prácticamente todas las muestras de HA, ya sean aisladas de
materia prima animal o de un biopolímero de origen bacteriano,
contienen una mezcla de macromoléculas de diferentes longitudes que
son más o menos uniformes en masa. Por tanto, el peso molecular del
polímero se describe mediante algún valor medio. Dependiendo del
método utilizado para determinar y calcular el valor promedio, el
valor de peso promedio de las muestras puede aparecer de manera
diferente. Por lo general, el valor calculado son los pesos moleculares
М n promediados en número y М w promediados en peso:
M= ∑ NNi M i (6,4)
norte ∑ i
METRO w = ∑
N i M i2

(6,5)

∑ NiMi
donde N i es el número de macromoléculas de peso М i .
Consideremos un ejemplo numérico simple [4]. Si hay una mezcla
de macromoléculas de diferente masa, digamos, 100 moléculas de
1000 Da de peso, 200 moléculas de 10000 Da y 200 moléculas más de
100000 Da, entonces los valores de peso molecular calculados de
acuerdo con la fórmula (6.4) y ( 6.5) sería: M n = 44 000 Da y M w = 91
000 Da, respectivamente. Se desprende del ejemplo dado que el
promedio numérico de M n para la distribución polimodal (es decir, la
presencia de fracciones de diferentes longitudes de macromoléculas)
no coincide con
el peso ponderado M w . En ciertos casos [4], la diferencia en los valores de

peso molecular determinados por diferentes métodos para una misma
muestra de polímero puede alcanzar cinco o más veces. Por ejemplo, el HA
aislado del cultivo de Streptococus equi (producido en Japón) con un peso
molecular declarado de 1,6 MDa parece tener un peso de 480 000 Da cuando
se analiza mediante la técnica de dispersión de luz . Así, cuanto más
heterogéneo, es decir, más 'polimolecular' es el polisacárido inicial, mayor es
la diferencia en los valores medios de peso molecular obtenidos por
diferentes métodos. La polidispersidad se mide mediante la relación M w / M
n y se usa para caracterizar la distribución del peso molecular del
polisacárido no fraccionado inicial. Esta relación es una característica
fundamental que es especialmente importante para las preparaciones
médicas que contienen hialuronano. Desde el punto de vista de la
distribución del peso molecular, el biopolímero idealmente debería tener
una distribución monomolecular para la cual la relación M w / M n se
aproxima a la unidad.
Tanto M n y M w de polisacáridos se determinan utilizando métodos
físicos de osmometría, dispersión de luz, difusión, ultracentrifugación,
y viscosimetría. El peso molecular se determina con mayor frecuencia
midiendo la viscosidad de las soluciones de HA. Gracias a la
simplicidad del equipo utilizado, mediante este procedimiento el peso
molecular viscosimétrico medio difiere del promedio de M w en no
más del 20%. El método viscosimétrico se basa en la medición de la
viscosidad reducida (en función de la concentración del polímero),
seguida de la determinación de la viscosidad intrínseca a dilución
cero.
Este método tiene limitaciones, la primera de las cuales está
asociada a la polidispersidad de la muestra. Solo es posible establecer
la correlación experimental directa entre la viscosidad intrínseca y el
peso molecular medio para polímeros más o menos uniformes con
respecto al peso molecular. En otras palabras, solo una fracción
relativamente estrecha de un polímero puede probarse por
viscosimetría ya que incluso una polidispersidad insignificante afecta
fuertemente los resultados de la determinación de la viscosidad
intrínseca. En segundo lugar, la determinación del peso molecular por
viscosimetría para polielectrolitos como HA polianiónico está
asociada con dificultades. En particular, la presencia de los grupos
ionizados (en el caso de HA, estos son grupos carboxilo del ácido
glucurónico) influye fuertemente en la viscosidad de las soluciones
diluidas debido a la repulsión mutua de macromoléculas, lo que
conduce a un aumento significativo de la viscosidad tras la dilución.
Como consecuencia, la correlación entre la viscosidad reducida y la
concentración de polímero se desvía de una extrapolación lineal a
una extrapolación más engorrosa de la viscosidad reducida a una
concentración cero, así como la determinación de la viscosidad
intrínseca. Por lo tanto, el método de viscosimetría se recomienda
principalmente para determinar el cambio relativo en el peso de la
macromolécula en diferentes procesos, por ejemplo, la destrucción del
polímero. Esta discusión de la viscosimetría como método para la
determinación del peso molecular se proporciona en detalle porque la
mayoría de los certificados de análisis de HA en el mercado establecen
valores de peso molecular basados en la viscosimetría.
La Tabla 6.1 cita datos experimentales sobre la determinación de la
composición de la fracción y el peso molecular de HA de diferentes
proveedores [17].
La Tabla 6.1 resume los valores de peso molecular máximo y mínimo
obtenidos experimentalmente en los materiales de HA estudiados. La
amplia gama de valores de peso molecular medio se debe a la fuerte
heterogeneidad en la distribución del peso molecular de las
macromoléculas. El contenido de fracciones de bajo peso molecular
reportado en la Tabla 6.1 para HA comercial estudiado se determinó
mediante filtración en gel sobre sephadex G-50 (fracciones de menos
de 10000 Da) y G-50 (fracciones con el peso de menos de 150000 Da).
Los datos de la Tabla 6.1 muestran que el contenido de estas fracciones
alcanza el 26% en algunas muestras de HA.
Tabla 6.1 Características del ácido hialurónico comercial (HA)
País Fuente de HA Apariencia Mol declarado. Max mol. Min mol. Contenido de bajo mol. fracciones de peso,%

peso, MDa peso, MDa peso, MDa Hasta 10 kDa 10-150 kDa Total hasta 150 kDa

Rusia Animal polvo 0,5 1.2 0,5
Francia Bacteriano escamas 2.6 7.2 2.4 4.8 11,2 dieciséis
Japón Bacteriano gránulos 2.8 6.4 2.6 5.4 12,6 18
China Bacteriano gránulos 1,6 5.2 1,7 9,6 16,4 26
Suiza Bacteriano gránulos 1.2 3.4 0,9 8.0 15.0 23


14

12

10
8
%
6

4

2

0
000 500 ~ 000 300
000 700 ~ 000 500
000 900 ~ 000 700
000 1100 ~ 000 900
000 903 2 ~ 000 2700

000 1300 ~ 000 1100
000 1500 ~ 000 1300
000 1700 ~ 000 1500
000 1900 ~ 000 1700
000 2100 ~ 000 1900
000 3100 ~ 000 2900

000 2700 ~ 000 2500
300 2 ~ 000 100 2
100 ~ 0
300 ~ 000 100
500 2 ~ 000 300 2

000
000
000
000

Figura 6.7 Distribución del peso molecular del hialuronano (según Shiseido Co,
para la muestra HA, lote No. 339)
Además, todas las muestras estudiadas son heterogéneas con respecto

a la composición fraccional. La compañía japonesa de producción de
HA biotecnológico Shiseido Co. Ltd. informa hallazgos similares sobre
la heterogeneidad en la composición fraccional de hialuronano. La
composición de peso molecular de HA suministrada por Shiseido Co.
se muestra en la Figura 6.7.
Los resultados, presentados en la Figura 6.7, muestran el porcentaje
de fracciones de hialuronano de alto peso molecular en el producto
comercial de HA. El rango de peso molecular abarca desde 100 000 a 3
100 000 Da, mientras que el peso molecular medio determinado por
viscosimetría se indica en 2,5 MDa en el certificado de análisis de este
producto. Los fabricantes de preparados médicos a base de HA deben
tener en cuenta que el HA suministrado por empresas biotecnológicas,
si no se indica lo contrario, es una mezcla de diferentes fracciones.
Por tanto, es claramente insuficiente indicar el parámetro de peso
molecular medio para tales materiales. La característica fundamental
del material para aplicaciones biomédicas y medicina estética no es
una excepción aquí y debe incluir el parámetro de distribución del
peso molecular (polidispersidad del polímero), es decir, una
información sobre la composición fraccionada del polisacárido.
Idealmente, dependiendo de la aplicación específica, el producto
terminado debería comprender una fracción estrecha de HA con un
peso molecular bien definido . Tal control del peso molecular
permitiría reducir el número de reacciones secundarias después de la
administración del producto a base de HA .
6.1.5 Eficiencia antioxidante del hialuronano y otros

compuestos biológicamente activos como productos
potenciales para la medicina estética
La siguiente parte resume los estudios dedicados a la evaluación de la
acción de los oxidantes, incluidos los radicales libres en la piel, y la
eficacia antioxidante del hialuronano y otros compuestos
biológicamente activos como productos potenciales para la medicina
estética [18].
No han pasado más de 50 años desde que evolucionó la hipótesis del
papel de los radicales libres en el envejecimiento de los animales y los
seres humanos. Desde entonces, la hipótesis se convirtió en la teoría
de los radicales libres del envejecimiento. La palabra 'antioxidante',
que significa un compuesto que ralentiza el desarrollo de procesos de
oxidación destructivos, se convirtió en una palabra permanente en los
médicos y
vocabularios de cosmetólogos. La mayoría de las vitaminas,

aminoácidos, oligopéptidos y mono y polisacáridos son hasta cierto
punto capaces de inhibir las reacciones oxidativas debido a sus
interacciones con especies de radicales que contienen oxígeno (su otro
nombre es 'especies reactivas de oxígeno, ROS') así como influyen en
la velocidad de descomposición de compuestos de peróxido
estructuralmente diferentes. No es de extrañar entonces que casi
todos los insertos de los productos de medicina estética mencionen su
actividad antioxidante. Sin embargo, dado que tantos compuestos
orgánicos tienen propiedades antioxidantes, es importante conocer
los criterios cuantitativos de la evaluación de la eficacia de la acción
antioxidante. Desafortunadamente, no es muy común encontrar un
estudio científico en el que se pueda presentar una evaluación
semicuantitativa de dicha acción.
Los principales mecanismos de aparición de las formas radicales
activas de oxígeno (ROS) en el organismo suelen estar relacionados con
la distorsión del funcionamiento de las cadenas de transporte de
electrones (ETC) de las mitocondrias o microsomas. Las funciones del
ETC mitocondrial son una realización de las reacciones posteriores de
oxidación-reducción de la transferencia de electrones desde el sustrato
de oxidación al oxígeno como aceptor final de electrones. Al mismo
tiempo, se produce la reducción de dos electrones de O 2 a H 2 O, por lo
que no deberían aparecer los radicales libres (especies muy reactivas
con valencia libre). Sin embargo, se demostró en [19,20] que la
transferencia normal de electrones en las mitocondrias ( reducción de
dos electrones de O 2 ) se interrumpe inevitablemente de forma
espontánea, durante la cual sólo tiene lugar la reducción de
un electrón de O 2 y el radical ion superóxido Aparece O 2 . Este radical
no es muy reactivo, pero cuando discutimos el mecanismo del daño
potencial del O 2 , generalmente se hace referencia a la reacción 6.6:
O - + HO → OH - + OH * + O (6,6)
2 2 2 2
Esta reacción da como resultado un radical hidroxilo oxidativo

extremadamente fuerte ОН *, que reacciona con prácticamente
cualquier molécula orgánica a una velocidad extremadamente alta.
Los radicales O 2 y OH * inician las reacciones de oxidación de lípidos
por peróxido y la oxidación de proteínas, nucleótidos y polisacáridos.
También pueden causar la destrucción de las hélices de ADN y
destruir la célula completa [21,22]. Además de estos dos radicales, otro
radical hidroperóxido, HO 2 *, está relacionado con ROS y con oxígeno
singlete. Es de conocimiento común que para neutralizar el efecto
negativo de las ROS, el organismo debe tener el sistema de defensa
antioxidante. Este sistema contiene superóxido dismutasas (SOD),
catalasas, glutatión, glutatión peroxidasas, aminoácidos que
contienen azufre , tocoferol y ácido ascórbico. La enzima SOD se
encontró en todos los organismos aeróbicos, a saber, citozol (Cu,
Zn-SOD), mitocondrias (Mn-SOD) y en bacterias aeróbicas (Fe-SOD)
[23]. Esta enzima cataliza la reacción de dismutación del
radical aniónico O 2 -:
O - + O - + 2 H + → HO + O (6,7)
2 2 2 2 2
La glutatión peroxidasa funciona de la misma manera para

descomponer el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, pero
además destruye los hidroperóxidos por otro mecanismo no radicales
. El peróxido de hidrógeno es peligroso porque en presencia de
metales de transición (por ejemplo, Fe 2+ ) puede ser la fuente del
radical OH *. La vitamina E (alfa-tocoferol) supuestamente intercepta
los radicales peróxido ROO *, aparece en la oxidación del peróxido de
los lípidos, los transfiere a hidroperóxidos ROOH y la vitamina C
(ácido ascórbico) reactiva el alfa-tocoferol. Es al mismo tiempo un
cofactor de peroxidasa (una enzima ascorbato
peroxidasa). El glutatión presentado en las células en alta

concentración, es un radical OH y un aceptor de oxígeno singlete y es
un cofactor de la glutatión-peroxidasa y la glutatión reductasa [24]. Un
sistema tan poderoso de protección del organismo antioxidante se
acumula principalmente en la célula, ya que los ROS son producidos
por las mitocondrias. Desafortunadamente, la aparición de los
radicales contenidos en oxígeno puede ocurrir no solo durante los
procesos biológicos naturales, sino como resultado de la acción de
factores ambientales agresivos y desfavorables. La acción del fondo
natural de emisión de iones, la exposición a los rayos UV y el smog
fotoquímico, son fuentes de concentraciones aumentadas de ozono, lo
que conduce a la aparición del mismo radical OH extremadamente
activo químicamente en las sustancias intercelulares de la dermis y
epidermis. Ésta es la razón del envejecimiento cutáneo prematuro
[25]. En este caso, un sistema antioxidante de protección del
organismo no es eficaz porque los procesos patológicos tienen lugar a
nivel intercelular. Por eso es lógico que la inyección subcutánea de los
fármacos proporcione una eficaz terapia antioxidante. Para
comprender mejor qué se debe incluir en estos productos
(composición, interacción mutua y proporción cuantitativa de los
diferentes componentes) es necesario conocer el mecanismo de su
acción.
La base del mecanismo de oxidación por radicales libres , que
incluye la combustión y la explosión, fue creada por N. Semenov como
parte de su trabajo fundamental dedicado a la teoría de las reacciones
en cadena ramificada (Premio Nobel de Química en 1956). Con base
en esta teoría (ahora común), la oxidación de los hidrocarburos tiene
lugar según el mecanismo de la reacción en cadena de radicales libres
con ramificación forzada. Veamos las reglas principales de este
mecanismo, que puede tener lugar en la matriz extracelular de la piel.
La primera etapa implica el inicio de la oxidación. Como se

mencionó anteriormente, como resultado de la acción de los factores
ambientales desfavorables, en la capa superior de la piel se pudo
formar el radical hidroxilo reactivo. En el lugar de su formación
reacciona inmediatamente (la eficiencia de la reacción está
determinada por la constante de velocidad de este proceso) con la
biomolécula vecina (RH):
RH + OH * → R * + H O (6,8)
2
donde RH es cualquier biomolécula del material cutáneo extracelular.

El biorradical R *, formado como resultado de esta reacción, se
puede transferir al radical peróxido ROO * por reacción con oxígeno,
que la piel ya contiene:
R * + O → ROO * (6,9)
2

La probabilidad de una reacción de este tipo en la piel es bastante

alta, ya que en condiciones normales el O 2 puede penetrar en la piel
hasta 260-270 µm [26]. La epidermis, la capa papilar y la capa superior
de la dermis reciben oxígeno del aire. La capacidad de la piel para
consumir oxígeno no se reduce con la edad.
El siguiente `` destino '' del radical peróxido depende de su
estructura química, pero, por regla general, se sabe que esta partícula
de radical participa en reacciones concurrentes de desproporción,
isomerización o eliminación de H atómico de la biomolécula vecina:
ROO * + RH → ROOH + R * (6,10)
Por ejemplo, los polisacáridos son conocidos por crear radicales peróxido de dos
tipos.
[27]. El primero se crea como resultado del ataque del O 2 de valencia
libre sobre el átomo C1, que se creó al romper el enlace glicosídico. El
radical peróxido menos estable del segundo tipo se crea como
resultado de la reacción del oxígeno con un electrón no apareado y se
localiza en cualquier átomo de carbono medio del ciclo de la piranosa.
El final de estos procesos conduce a la destrucción oxidativa del
polisacárido. La cadena principal se rompe, lo que a su vez da como
resultado la formación de productos que contienen oxígeno de bajo
peso molecular . Junto a los procesos de destrucción, las reacciones de
enlace son características de moléculas de proteínas como el colágeno,
estas reacciones conducen a la formación de enlaces peróxido
intermoleculares. Todos estos procesos conducen inevitablemente a la
degradación de la matriz extracelular.
La reacción (6.10) es el paso inicial del desarrollo del proceso de
oxidación de radicales libres en cadena . El radical R *, que se crea en
la reacción, vuelve a pasar a la reacción (6.9), pero el hidroperóxido
ROOH puede descomponerse según el mecanismo del radical
dependiendo de las condiciones de reacción:
ROOH → RO * + OH * (6,11)
Esta etapa es una etapa de la ramificación forzada de la cadena (es

decir, conduce a la aparición del nuevo radical OH *), que es un
iniciador del proceso en cadena de oxidación de carbohidratos. El
macro-radical RO * suele ser menos activo y podría hacer que la
cadena se rompa según la reacción (6.12) con la formación del enlace
peróxido:
RO * + RO * → ROOR (6,12)
Partiendo de este ya clásico mecanismo de oxidación en cadena de
radicales libres , es obvio que es posible inhibir este proceso mediante
la introducción de sustancias que, por un lado, concurren con RH para
la unión con el radical hidroxilo en la reacción (6.8), y por otro lado
concurren con RH en la reacción (6.10), que no forma el
macrorradical R * ni conduce a la transformación del hidroperóxido
ROOH sin formación del radical OH *. Significa que la reacción (6.11)
no puede pasar por el mecanismo radical. Para un antioxidante eficaz
se deben seguir las siguientes ecuaciones:
K ( AH + OH ) ⋅ [ AH ] K ( RH + OH ) ⋅ [ RH ] (6,13)
K ( AH + ROO ) ⋅ [ AH ] K ( ROO + RH ) ⋅ [ RH ] (6,14)
donde К (АН + ОН) - Constante de velocidad de la reacción del antioxidante (АН) con
ОН *, М –1 s –1 ;
[AH] - concentración de antioxidante, М;
К (RH + ОН) - constante de velocidad de la
reacción (6.8), М - 1 s –1 ; [RH] -
concentración de biomoléculas, М;
К (АН + ROO) - constante de velocidad de la reacción del antioxidante
con el radical peróxido, М - 1 s –1 : К (ROO + RH) - constante de
velocidad de la reacción 6.10, М –1 s –1 .
Si se conocen todos los parámetros de las ecuaciones (6.13) y (6.14),
es posible evaluar cuantitativamente la eficiencia antioxidante en
función de la concentración del antioxidante introducido [AH]. La
evaluación antioxidante in vivo es extremadamente difícil y casi
siempre un problema imposible. Para realizar el experimento modelo, los

autores en
[18] aplicó la metodología, que se utilizó con éxito para el estudio de la
oxidación química- radiactiva de diferentes compuestos orgánicos
[28-33]. Es por eso que la aplicación de los métodos de la radioquímica
no fue involuntaria. El científico estadounidense Hartman, autor de la
hipótesis sobre el papel de los radicales libres en el envejecimiento
humano y animal formulada en 1954, dio el título de su primer
artículo dedicado a este tema 'Envejecimiento: teoría, basada en
radicales libres y radioquímica '.
Este capítulo describirá los productos de los compuestos
biológicamente activos relacionados con las diferentes clases:
glicosaminoglicanos - hialuronano (como sal de sodio); aminoácidos
que contienen azufre - L-cisteína, L-metionina y oligopéptidos -
L-glutatión; vitaminas - ascorbilfosfato (derivado de la vitamina C). La
exposición se realizó mediante irradiación gamma de Co 60 . La
metodología experimental detallada fue similar a la mencionada en
[28-33]. Se realizaron dos series de experimentos. En la primera serie,
se estudió el papel de los aditivos de los compuestos investigados en la
oxidación radioquímica de poliamidas. (La poliamida alifática se
considera en muchos experimentos de radioquímica como un análogo
de una molécula de proteína).
En la figura 6.8 se muestran las curvas cinéticas de acumulación de
los hidroperóxidos ROOH, que se forman como resultado de la
oxidación de poliamida bajo la acción de exposición ionizada en las
condiciones de muestra pura de polímero y con diferentes
bioaditivos. En la exposición de los polímeros en presencia de oxígeno,
tienen lugar los mismos procesos (6.9–6.12), que se consideraron
anteriormente. La diferencia es que la etapa de inicio de la reacción
(6.8) ha sido

Sin aditivos Cisteína

Vitamina C Glutatión

4
Ácido hialurónico Metionina

ROOH], mMol / g]
10 50 100
Tiempo de oxidación, min
Figura 6.8 Curvas cinéticas de acumulación de hidroperóxidos en la poliamida expuesta con

diferentes aditivos
reemplazado por la aparición de macrorradical R * en la acción

directa de la exposición. Los resultados, obtenidos en los
experimentos, muestran que el hialuronano y la vitamina C
prácticamente no influyen en la tasa de acumulación de
hidroperóxido en la poliamida expuesta. Al mismo tiempo, el
glutatión y aún más la metionina y la cisteína reducen
significativamente la cantidad de hidroperóxido generado. Esto
probablemente sucedió debido a la presencia de un fragmento
contenido en azufre, que conduce a la descomposición parcial de
ROOH a través de un mecanismo no radical . Como resultado de tal
descomposición, el hidroperóxido produce el ion hidroxilo OH- en
lugar del radical hidroxilo activo OH *. El ion hidroxilo OH- no puede
inducir el desarrollo posterior de procesos de oxidación destructivos.
Por lo tanto, la serie de experimentos mostró que el aminoácido que
contiene azufre y el glutatión tripéptido en las condiciones
experimentales ralentizan eficazmente la oxidación del polímero en la
etapa de destrucción del hidroperóxido. Al mismo tiempo, el HA y el
ascorbilfosfato de sodio no influyen en la velocidad de oxidación por
radiación de la poliamida alifática, es decir, no revelan ninguna
actividad antioxidante.
La segunda serie del experimento estuvo dirigida al estudio de la
eficiencia de la interacción de los compuestos estudiados con el
radical OH. Para ello se ha utilizado el método de los aceptadores en
competencia radical. La base de este método es el estudio de la
destrucción radioquímica del compuesto disuelto (indicador) en
presencia del compuesto estudiado. Con este método se ha estudiado
la reactividad de una gran cantidad de compuestos de origen
biológico cuando se exponen a radicales, en particular biopolímeros
[27].
En esta serie de experimentos, las soluciones acuosas neutras del
colorante orgánico Rodamina 6 g se prepararon en la concentración
2.5 × 10 –4 M. Estas soluciones se saturaron con óxido nitroso N 2 O y se
trataron con exposición a irradiación gamma. Bajo la acción de la
exposición ionizada sobre la solución acuosa saturada de N 2 O,
prácticamente la única partícula de radical formada bajo exposición
es el radical OH [46]. Si la solución contiene colorante orgánico, en
nuestro caso rodamina 6 g, entonces el resultado de la reacción con
OH * será su descomposición, que se mostrará como la decoloración
de la solución. El nivel de decoloración se pudo medir
espectrofotométricamente en el máximo de absorción de colorante de
545 nm. Los resultados experimentales se utilizaron para curvas
cinéticas de decoloración por radiación en los diferentes tiempos de
exposición. Los fragmentos lineales iniciales de estas curvas
determinaron la tasa de oxidación radioquímica del tinte. En
radioquímica, dicho parámetro cinético se marca como un
rendimiento radioquímico de la decoloración del tinte G, que es igual
al número de moléculas decoloradas en 100 eV de la energía
absorbida de la exposición ionizada. En la adición de diferentes
compuestos biológicamente activos al acuoso
solución de tinte, se evaluó el efecto de la tasa de oxidación
radioquímica de rodamina 6 g. La concentración molar de los
compuestos añadidos fue similar e igual a la concentración de
rodamina disuelta 6 g. La Tabla 6.2 muestra los resultados
cuantitativos del estudio realizado.
Los resultados presentados en la tabla muestran que todos los
compuestos estudiados protegen de manera bastante eficiente el tinte
de la decoloración, un rasgo relacionado con los aditivos introducidos.
La acción más antioxidante se muestra para el glutatión, la cisteína y
la vitamina С; cada uno reduce al doble la velocidad de degradación
oxidativa del colorante . La introducción de glutatión, cisteína y
vitamina C en conjunto conduce al efecto sinérgico y ralentiza el
proceso de decoloración casi tres veces. Este efecto común de estos
componentes podría explicarse por el hecho de que el glutatión y la
cisteína pueden reducir la forma oxidada del ácido ascórbico.
Tabla 6.2 El rendimiento radioquímico de la decoloración del tinte en

presencia de diferentes bioaditivos
# Solución acuosa de rodamina, 6 gRendimiento radioquímico de tinte

decolorante, moléculas / 100 EV

1 Sin aditivos 2,06
2 Glutatión 1.12
3 Ácido hialurónico 1,45
4 Cisteína 1.05
5 Metionina 1,20
6 Vitamina С 1.02
7 Glutatión + Vitamina С 0,81
8 Glutatión + Cisteína + Vitamina С 0,70
Al mismo tiempo, se transforman en compuestos disulfato, que

también tienen una gran afinidad por el radical hidroxilo.
De todos los estudios de compuestos biológicamente activos, el
hialuronano revela el nivel más bajo de propiedades antioxidantes.
Esto se correlaciona con el hecho de que la constante de velocidad de
reacción de OH * con hialuronato de sodio es aproximadamente tres
veces menor que los valores de las constantes de velocidad de
glutatión, ascorbato de sodio y cisteína [18]. Con base en los datos
mencionados anteriormente, intentamos evaluar el efecto
antioxidante máximo de la introducción de los compuestos estudiados
en la dermis.
Imagine que 3 ml de la solución acuosa del producto con la
concentración de los compuestos activos del 1% en peso (10 mg / ml)
inyectados de una vez en la zona de inyección de 100 cm 2 . Si la capa
dérmica tiene un ancho de 2 a 4 mm, podemos encontrar que la
concentración molar de antioxidante (a condición de que el producto
se distribuya por igual en la zona de inyección durante algún tiempo)
es de aproximadamente 10-3 M.
La constante de velocidad K (AH + OH) para el glutatión, la cisteína y el
ascorbato es de aproximadamente 1010 М –1 s –1 . La concentración de ácido
hialurónico endógeno en derma es aproximadamente de 10 - 3 М
[33] y el colágeno es casi 10 veces mayor. La constante de velocidad
de la reacción (6.8) para el hialuronano es 5 × 10 9 y para las proteínas
de colágeno 1 × 10 8 [7]. Si los datos antes mencionados se incluyen en
la ecuación (6.8), el esquema cinético simple permitirá evaluar
adecuadamente el límite superior del efecto antioxidante. En el caso
del hialuronano, la tasa de degradación oxidativa se puede reducir en
tres veces, y para el colágeno, en casi 10 veces. Obviamente, dicha
estimación se basa en el modelo simple y es bastante aproximada. Sin
embargo, incluso si el efecto in vivo después de la adición de
antioxidantes es menor, el valor de la terapia antioxidante es difícil de
subvalorar. Esta protección contra la oxidación es extremadamente
importante para el colágeno, ya que está relacionada con las llamadas
"proteínas de bajo intercambio"; su vida media es de semanas o
incluso meses. A modo de comparación, la vida media de los
glicosaminoglicanos es significativamente menor (para el ácido
hialurónico en la piel, solo 1 a 2 días). Durante períodos de tiempo tan
prolongados, el colágeno es capaz de acumular una cantidad
significativa de estructuras defectuosas, lo que afectará la calidad de
la matriz extracelular dérmica.
Finalmente, nos gustaría señalar que la inyección compleja de
derivados de glutatión, cisteína y ácido ascórbico es un medio de
antioxidación bastante eficaz cuyo mecanismo de acción se revela en
las diferentes etapas del proceso de la cadena de radicales libres de
oxidación de biomoléculas.
6.1.6 Bio-Repairants como una nueva clase de inyectable

productos basados en ácido hialurónico modificado con
bajo peso molecular Bio-Reguladores
El envejecimiento de la piel como un aspecto particular de todo el organismo
puede verse como un cambio en el estado estable cuando compuestos
complejos como colágeno, elastina y glicosaminoglicanos, incluido el HA, se
sintetizan continuamente en el curso de un proceso y se descomponen en el
curso de otros. La coordinación de los procesos de síntesis y degradación es
extremadamente importante para mantener la salud de la piel. Así, por
ejemplo, existe una clara correspondencia entre la intensidad del
metabolismo de los glicosaminoglicanos y las proteínas del colágeno
dérmico. La intensidad del envejecimiento cutáneo depende en gran medida
de la prevalencia de uno de estos procesos. Con el envejecimiento, o bajo la
acción de factores ambientales desfavorables, los cambios en la intensidad
de estos procesos conducen a una tasa de formación decreciente con una
tasa creciente de degradación de biomoléculas. Desde este punto de vista, la
estrategia realizada en cosmetología inyectable debe estar dirigida a la
creación de condiciones fisiológicamente favorables para fortalecer la
actividad metabólica de las células de la piel, lo que conduciría a la
activación de la síntesis de los componentes básicos de la matriz dérmica
extracelular. Para realizar tal estrategia, los científicos rusos desarrollaron la
tecnología de modificación en fase sólida de polisacáridos, particularmente
hialuronano, por diferentes moléculas de bajo peso molecular.
biorreguladores de peso (aminoácidos, vitaminas y oligopéptidos) [34-39]. El

funcional
-ОН, -СООН, -NН 2 y -SH grupos en la estructura de bajo peso molecular de
peso bio-reguladores hacen posible 'injerto' requerida compuestos
biológicamente activos sobre las macromoléculas de HA bajo condiciones de
mecano-estimulado reacciones, es decir, a realizar inmovilización química.
Es importante señalar aquí que la propiedad única de HA, que hace posible
realizar la entrega dirigida de ingredientes activos, es el motivo
bio-reconocible en la estructura de una macromolécula de polisacárido que
puede interactuar con la superficie celular de los fibroblastos (como ya se
mencionó, el polisacárido se une a los receptores proteicos específicos CD44
y RHAMM ubicados en la superficie de la membrana citoplasmática).
El método de modificación en fase sólida se basa en el
procesamiento mecánico intensivo de la mezcla sólida de reactivos,
realizado en ausencia de solventes y diluyentes bajo la acción
conjunta de presión y deformación por cizallamiento utilizando
equipos de diferentes tipos (ver Sección 5.2.7 en Capítulo 5 para más
detalles). Es de suma importancia tener en cuenta que MITS la
tecnología per- reacciones químicas que se llevan a cabo con
diferentes molecular bajo peso bio-reguladores sin el uso de
bi-funcionales reactivos. Las composiciones bioactivas que
comprenden HA injertado (inmovilizado) con vitaminas, aminoácidos
y oligopéptidos se obtienen en un régimen tecnológico de una
sola etapa . A continuación, los ingredientes activos se unen
covalentemente a la macromolécula de biopolímero. La figura 6.9
resume los compuestos de diferentes clases que se 'injertan' en la
macromolécula de hialuronano [25, 40].
Por su propia naturaleza, el proceso de formación de enlaces químicos
entre macromoléculas de hialuronano y compuestos orgánicos bajo la acción
conjunta de presión y deformación plástica es similar a la reacción de
síntesis de polipéptidos a partir de aminoácidos o polisacáridos formados a
partir de azúcar simple. La formación de enlaces químicos se puede
visualizar como una unión de
Grupos –ОН, –СООН y –NН 2 acompañados de la eliminación de la molécula
de agua. Sin embargo, en medios acuosos, el equilibrio de este tipo de
reacción se desplaza hacia las sustancias originales en lugar de los productos
de la reacción. Por tanto, tales reacciones, tanto en sistemas vivos como en
condiciones de laboratorio, se consiguen como resultado de un complejo
proceso de múltiples etapas, lejos de ser similar a un simple proceso de
remoción de agua. La fase sólida propuesta
Fórmula estructural Nombre

OH

HO

O Sodio (o magnesio)
O Fosfato de ascorbilo
O (Derivado de vitamina C)
PAGS
-
O OH

O- O-

3Na +

OH

OH

OH OH
Ribo ??? avin (vitamina B 2 )

norte NO
NUEVA HAMPSHIRE
norte

O

HO

O
HN
norte HN
Ácido fólico (vitamina B
norte norte O O

H2N HO
HN
O
Retinol (vitamina A)
OH
O OH
α - Tocoferol (vitamina E)
Figura 6.9 de bajo peso molecular bio-reguladores utilizados para de estado sólido
modificación de hialurónico
ácido

Fórmula estructural Nombre

Oh oh
+ L - carnitina (vitamina BT)
norte
-O

O
O NH 2 O HO
NUEVA HAMPSHIRE

HN Glutatión
HO
(tripéptido - glutamil -
O
O S S O OH - cisteinil - glicina)
NUEVA HAMPSHIRE

HN

HO
OH 2 N O

O
O
H 2 N H 2 N
OH OH Aminoácidos - Glicina,

HO
NH 2 Prolina, Lisina

norte
O H

O

O Que contiene azufre

HS OH
aminoácidos -
S
OH NH 2 Metionina, cisteína
NH 2

Figura 6.9 (continuación)
procedimiento hace que sea posible llevar a cabo el proceso necesario en

una etapa, sin el uso de bi-funcionales componentes tóxicos. La
inmovilización química en fase sólida se puede comparar con la costura de
cuentas a una tela: la molécula del ingrediente biológicamente activo está
unida al HA a través de un enlace químico covalente estable y la molécula
unida aparentemente cuelga de un pequeño filamento ', formando un gran
complejo que, en esencia, representa un' depósito 'macromolecular único de
material biológicamente activo en el lugar de la inyección. La movilidad de
la cadena de polisacárido en el HA modificado es limitada en comparación
con la estructura nativa. Ya no es fácil "desenredar" y despolimerizar las
unidades repetitivas complejas mediante hialuronidasas activas. Esto
conduce a un mayor tiempo de residencia de la formulación en las capas
dérmicas. Además, los pequeños filamentos se hidrolizan y descomponen,
liberando el componente bioactivo que puede permanecer en la zona de
inyección durante un tiempo suficientemente largo y suministrando las
vitaminas, aminoácidos y oligopéptidos necesarios en concentraciones
constantes.
Utilizando la tecnología de modificación en fase sólida , se creó la
línea de productos denominada 'Hyalrepair' [41,42] para incluir 10
composiciones bioactivas diferentes de sales de HA densamente
reticuladas de Na + , Cu 2+ y Zn 2+ con inmovilización química
vitaminas (ascórbicas y fólicas
ácidos y riboflavina), aminoácidos (glicina, prolina, lisina, valina,

carnitina, cisteína y metionina) y oligopéptidos (glutatión). Cabe
mencionar que el hialuronano, en estas formulaciones, desempeña el
papel de transportar "activamente" importantes compuestos
biológicos a las células objetivo del organismo. Uno de esos
compuestos es el ácido ascórbico (Asc), cuyo valor para la salud de la
piel no puede subestimarse. El Asc tiene una función biológica básica
que determina la integridad del tejido conectivo: con la formación de
hidroxiprolina e hidroxilisina, participa en el metabolismo de glicina,
tirosina e hidroxilación de residuos de prolina y lisina en
proteocolágeno. La hidroxilación de la prolina es necesaria para la
estabilización de la triple hélice del colágeno, mientras que la
hidroxilación de la lisina es muy importante para el enlace covalente
posterior entre las moléculas de colágeno que tiene lugar con la
formación de fibrillas de colágeno. Este proceso de producción de
fibrillas determina la estabilización del tejido conectivo extracelular y
la reducción de la permeabilidad capilar. El colágeno sintetizado en
condiciones de deficiencia de vitamina C demuestra estar privado
significativamente de grupos hidroxilo y residuos O-glicosilo . Estas
alteraciones estructurales previenen la formación de fibras fuertes y
funcionales y son la causa de los defectos cutáneos que se ven con
frecuencia. Además, como inhibidor de la melanogénesis, la vitamina
C bloquea la acción de la tirosinasa, la enzima clave de la formación
de melanina y, al hacerlo, bloquea la síntesis de melanina, reduciendo
el dopa-cromo en dopaquinona.
Según la nueva clasificación funcional, la vitamina C pertenece al grupo de
los antioxidantes vitamínicos "potentes" . La acción antioxidante de la
vitamina C consta de dos procesos: (1) la unión eficaz con radicales hidroxilo,
que conduce a la inhibición del proceso de oxidación de la cadena de
radicales; y (2) su colaboración con el α-tocoferol (vitamina E), donde la
vitamina C reduce la forma oxidada de la vitamina E. De manera similar, la
vitamina C convierte el ácido fólico (vitamina B9) en un estado bioactivo.
Existe información en la literatura científica sobre la capacidad de la
vitamina C para influir en la formación de glicosaminoglicanos, en particular
HA y sulfato de condroitina, y para estimular la proliferación de fibroblastos
[43]. La acción fisiológica del ácido ascórbico no solo se debe a su capacidad
para estimular la síntesis de colágeno, sino también a la inhibición de la
producción de metaloproteinasas, las enzimas que destruyen el colágeno
dérmico.
[44]. Numerosos trabajos publicados han confirmado que el ácido
ascórbico tiene la capacidad de mejorar la salud de la piel, incluida la
reducción eficaz de los signos primarios del envejecimiento. La
vitamina C pertenece a la clase de vitaminas solubles en agua y, por
tanto, se elimina rápidamente del organismo sin una acumulación
apreciable. En el caso de los productos 'Hyalrepair', la tecnología de
estado sólido permite 'injertar' químicamente hasta el 95% del peso
del ácido ascórbico en una macromolécula de HA, creando así un
'depósito' activo de vitamina en el lugar de la inyección. que dure un
tiempo suficientemente largo [34].
Los aminoácidos glicina, prolina, lisina y valina son componentes de
las principales proteínas de la matriz dérmica extracelular. La
inclusión de estos aminoácidos en la composición de 'Hyalrepair',
junto con otros bio-reguladores y microelementos de bajo peso
molecular , es esencial para desencadenar la síntesis de colágeno
dérmico y elastina, que son extremadamente importantes para lograr
un efecto constante a largo plazo .
Los aminoácidos que contienen azufre como la cisteína, la
metionina y el tripéptido glutatión son antioxidantes muy poderosos
que participan en diferentes etapas de reacciones en cadena de
radicales libres de oxidación de biomoléculas [18]. Por ejemplo, la
cisteína participa en la síntesis de taurina, la sustancia que bloquea
eficazmente la oxidación del peróxido de los lípidos al unirse al anión
hipoclorito para formar un complejo de cloramina. En cualquier
organismo, la cisteína y el glutatión reducen la forma oxidada de
vitamina C a su forma activa inicial, mientras que la metionina (que
es un
aminoácido esencial) está metabólicamente relacionado con la

cisteína. Para fortalecer las propiedades antioxidantes, ciertas
preparaciones de 'Hyalrepair' están enriquecidas con ácido fólico, el
aceptor de radicales OH , que es especialmente eficaz en presencia de
vitamina C. Otras funciones bioquímicas del ácido fólico como
componente enzimático incluyen la capacidad para transferir los
radicales de un solo carbono , es decir, formilo, hidroximetilo, metilo,
metileno, metino y formimina, y participar en la síntesis de los
aminoácidos como serina o metionina. El papel biológico de la
riboflavina (vitamina B) consiste en la estabilización de la matriz
extracelular del tejido conectivo. La molécula también facilita la
absorción de oxígeno por las células de la piel y acelera la
transformación in vivo de piridoxina en su forma activa.
Además de su papel principal como portador de formas activas de

ácidos grasos a través de las membranas durante la oxidación
lipotrófica, la presencia de carnitina contribuye a la normalización
del equilibrio agua-sal en la piel. Los microelementos en forma de
catones de Cu 2+ , Zn 2+ y Mg 2+ en el complejo con proteoglicanos y
glucosaminoglicanos de la matriz extracelular determinan el estado
de inflamación de la piel. El cobre es un componente de la enzima lisil
oxidasa extracelular que contiene cobre y que participa en la
formación de enlaces cruzados intra e intercadena en el colágeno y la
elastina. La formación de enlaces cruzados se interrumpe cuando la
disponibilidad de cobre es escasa, lo que reduce la resistencia y
elasticidad de las fibras de colágeno. El cobre suele ser más eficaz
cuando se combina con zinc. En el organismo humano, el zinc se
encuentra principalmente en la piel donde este microelemento actúa
como componente de 70 enzimas, la mayoría de las cuales participan
en los procesos que impiden la degradación de los compuestos
dérmicos extracelulares.
Los autores que desarrollaron la tecnología de la fase sólida modificación
de hyaluronan por de bajo peso molecular bio-reguladores consideran la
línea 'Hyalrepair' de los productos a ser agentes no medicados
macromoleculares terapéuticos (NMMTA), mientras que su administración
se lleva a cabo dentro de en el marco del complejo programa
"Bio-reparación" . El programa ' Biorreparación ' implica la administración
inyectable de NMMTA con el objetivo de activar el metabolismo celular en la
piel con el fin de restaurar los daños de la matriz extracelular seguido de la
protección preventiva de los componentes dérmicos frente a factores
ambientales desfavorables y agresivos. Las inyecciones de NMMTA cambian
el equilibrio fisiológico de los procesos metabólicos establecidos entre los
conjuntos de células y la matriz dérmica extracelular y modulan el estado
estacionario en este sistema. La invasividad de la administración de NMMTA,
especialmente en mesoterapia, puede desarrollar una reacción similar a la
de las lesiones cutáneas pero, obviamente, con menor intensidad y en menor
escala. El daño de diferentes tipos de células en la epidermis y la derma
desencadena la secreción incontrolada de lisosomas y enzimas lisosomales
en la matriz extracelular. Esto inicia una cascada completa de interacciones
intercelulares que consiste en una serie de reacciones coordinadas en
diferentes tipos de células en los tejidos dañados y orquestadas por
mediadores locales que controlan los factores de crecimiento. Esto conduce a
la intensificación de los procesos de degradación de biopolímeros, es decir,
escisión de HA por hialuronidasa, escisión de glucosaminoglicanos
sulfatados de proteoglicanos, proteólisis de proteínas, etc. pero también
promueve procesos opuestos a la destrucción y dirigidos hacia las
estructuras de restauración de la matriz extracelular y reparadora.
regeneración. Como consecuencia, de acuerdo con la ley de compensación
excesiva, los procesos de reparación en las células no solo restauran el daño,
sino que también conducen a la renovación ('rejuvenecimiento') de las
estructuras celulares y sustancias extracelulares y permiten que los procesos
equilibrados de síntesis-desintegración se desarrollen a puntuación alta. HA
modificado por bioreguladores de bajo peso molecular es una fuente de
compuestos biológicamente activos
necesario para completar los procesos de bio-reparación . Al mismo

tiempo, se desarrollan procesos contra la degradación de estructuras
de biopolímeros por radicales libres.
Para determinar la duración de la reabsorción y la reacción tisular
después de la administración intradérmica de geles 'Hyalrepair' en la
región interescapular, se llevaron a cabo pruebas con animales en
ratas blancas en el laboratorio de patomorfología experimental. Los
períodos de observación fueron de 1 a 30 días. Se sacaron dos
conclusiones muy importantes tras el estudio
[41]. En primer lugar, las secciones de tejido del lugar de la inyección
no contenían grandes conglomerados de gel, sino que se componían
de pequeñas cavidades, cada una de las cuales está llena con el gel y
recubierta por una cápsula poco desarrollada. En las micrografías, el
material de gel se ve en forma de pequeños fragmentos de una
sustancia basófila (Figura 6.10 y 6.11).
En algunos animales, no se detectaron cápsulas ni microcápsulas
que rodean los fragmentos de gel. Así, la preparación introducida se
considera bio-inerte, ya que no está encapsulada en el tejido sino que
más bien se esparce dentro de él y se incorpora a la matriz
extracelular (Figura 6.12).
El HA modificado es un "nanocontenedor" único de compuestos
biológicamente activos, tanto a nivel de macromoléculas individuales
como de pequeñas estructuras celulares entrecruzadas
uniformemente . Se trata de una especie de estructura reticular
compuesta por nano fragmentos de 50 a 300 nm. Estas estructuras
podrían estudiarse mediante el método sol-gel basado en la teoría
estadística de la formación de polímeros similares a células .
La segunda conclusión del estudio es que la administración de todas
las preparaciones probadas condujo a una notable proliferación de
fibroblastos en forma de grandes células activas con citoplasma
relativamente abundante. Después de la inyección de la
composición 'Hyalrepair-02' , que incluye el complejo de aminoácidos,
se observa la formación de fibras de colágeno.
Los ensayos clínicos de la línea de productos 'Hyalrepair' se llevaron
a cabo en el Departamento de Derma-Oncología y Cirugía Láser del
Hospital Clínico Central de la Academia de Ciencias de Rusia y el
Instituto de Cirugía Plástica y Cosmetología. Medidas de piel
Figura 6.10 Micrografías de la sección de tejido 3 días después de

la inyección de 'Hyalrepair-02' . Se observa una distribución no uniforme de
estructuras de filamentos gruesos en el gel. En la parte superior de la imagen se
pueden ver capilares recién desarrollados. Ampliación 400 ×

la inyección de 'Hyalrepair-10' . Se muestra la zona límite entre el tejido graso y el
gel. Se detecta un mayor número de fibroblastos y capilares sanguíneos
completamente desarrollados. Ampliación 400 ×

la inyección de 'Hyalrepair-02' . La parte superior de la imagen muestra el gel con fibroblasto
y vasos sanguíneos encarnados. La parte inferior muestra el tejido graso. No se detecta la
cápsula conectora que rodea el implante de gel
Se realizaron niveles de elasticidad, pH e hidratación para confirmar

la efectividad de las preparaciones. Las mediciones de la elasticidad e
hidratación de la piel en los pacientes se realizaron antes de la
administración y después de 2, 3 y 4 semanas
después de la introducción.
En el 90% de los pacientes, la elasticidad de la piel mejoró en un
10-12% en promedio en comparación con el valor inicial y permaneció
en este nivel durante 3 meses después de la finalización del
procedimiento. Se sabe que la piel envejecida presenta propiedades
viscoelásticas reducidas como resultado de
cambios cuantitativos en las proteínas del colágeno dérmico. La inyección de

preparados 'Hyalrepair' permite mejorar considerablemente las
características viscoelásticas de la piel, lo que indica indirectamente que se
ha producido una estimulación de las síntesis de colágeno y elastina. Dos
semanas después de la primera inyección, el nivel de hidratación de la piel
en todos los sujetos aumentó en un 6–8%, mientras que después de 4
semanas el aumento fue del 12–15% en comparación con el nivel inicial a pH
constante. Esto indica que el HA que ha sido modificado en estado sólido se
retiene en el sitio de inyección durante al menos un mes, actuando como
fuente de vitaminas, microelementos y aminoácidos esenciales incluidos en
la preparación. En conclusión, es importante señalar que la tecnología
innovadora de la modificación en estado sólido de los biopolímeros permite
obtener los productos novedosos con HA modificado por biomoduladores de
bajo peso molecular en el régimen tecnológico de un solo paso sin el uso de
tecnología extranjera. aditivos.
Cuando el proceso se lleva a cabo en estado sólido en ausencia de

los disolventes, los componentes bioactivos insolubles o parcialmente
solubles como la riboflavina o el ácido fólico pueden unirse a una
macromolécula HA, transfiriéndolos así a una forma soluble en agua
adecuada para inyección. Los componentes biológicamente activos
con la macromolécula HA en el estado químicamente unido
adquieren estabilidad de almacenamiento, lo que es extremadamente
importante para compuestos inestables como la vitamina C y el
aminoácido cisteína, que podrían oxidarse fácilmente en las
condiciones habituales de almacenamiento y esterilización. Con el
proceso de 'injerto' de los biorreguladores, la distribución de la masa
molecular de HA simultáneamente se volvió más homogénea, lo que
reduce el riesgo de efectos secundarios no deseados relacionados con
la no homogeneidad de la composición fraccionada de hialuronano.
El producto innovador 'Hyalrepair' también podría utilizarse para la
profilaxis y la terapia sin inyección de las enfermedades y síndromes
metabólicos como productos tópicos. Las variaciones de composición
de la línea Hyalrepair consisten principalmente en los metabolitos
naturales, que deben administrarse a los tejidos y órganos específicos.
La permeabilidad transcutánea suele ser baja y es aceptable para el
tratamiento con dosis bajas y ultrabajas . Hoy en día, la farmacología
de dosis ultrabajas se reconoce como una tendencia prometedora en
la medicina. Incluye hormonas y péptidos reguladores, que son parte
de un sistema complejo de moléculas de señalización específicas
(citomedinas), mediadores de información entre células. La
característica más importante de las citomedinas es su alta afinidad
por los receptores.
Por ejemplo, la constante de disociación (K d ) de los complejos
hormonales con los receptores tiene valores en el rango de
10 –8 –10 –10 М [31]. Esta es la razón por la que las concentraciones muy
bajas de las moléculas de señalización tienen un efecto fisiológico o
bioquímico significativo. El hialuronano a menudo muestra las
características de las citomedinas. Tiene receptores específicos y, por
tanto, participa directamente en los procesos de
intercambio de información a nivel celular e intracelular.
La descomposición rápida es otro criterio importante de las
moléculas de señalización que podría atribuirse al hialuronano. Los
fragmentos de la macromolécula HA tienen una amplia gama de
estados estructurales y conformacionales y mantienen la capacidad de
unirse con el receptor CD44 si el fragmento contiene al menos 20
monómeros.
Es posible sugerir que los fragmentos de hialuronano con diferente peso
molecular y conformaciones estructurales tienen diferentes capacidades
para transferir las señales intercelulares y extracelulares en comparación
con HA de alto peso molecular. Las moléculas de señalización de
polipéptidos están protegidas de la rápida degradación por los portadores de
proteínas especiales. El ejemplo clásico son los complejos de oxitocina y
vasopresina con neurofisinas [45]. Es interesante notar que la vasopresina
octapéptido cíclica (la hormona neurohipófisis) junto con el hialuronano
crea un sistema biológico con la capacidad de mantener el contenido de agua
en el cuerpo.
En este sentido, la hormona pituitaria vasopresina ayuda a la

retención de agua en el cuerpo mediante su reabsorción en los
túbulos renales y, por tanto, controla la expresión del gen hialuronano
sintasa-2 en el riñón [46].
El 'injerto' de diferentes componentes bioactivos en hialuronano
mejora la estabilidad del complejo. Con la ayuda de los receptores
CD44, tales complejos tienen la capacidad de transporte prolongado
hacia las células que carecen de metabolitos clave utilizando el
mecanismo de endocitosis.
Hoy en día, la medicina utiliza dosis ultrabajas de anticuerpos para
el tratamiento, prevención y rehabilitación de diversas enfermedades.
La tecnología innovadora permite la síntesis de la línea de productos
de bio-reparación ('Hyalrepair'). Estos productos pueden encontrar
una amplia aplicación en la medicina, particularmente para la
prevención y terapia de anomalías metabólicas que requieren la
corrección del metabolismo mediante dosis bajas y ultrabajas de los
metabolitos naturales.
Se sabe que diferentes factores dañinos pueden provocar los mismos
síntomas. Normalmente, los síntomas están relacionados con los procesos de
integración en la célula y resultan como un desequilibrio de los tres tipos
principales de metabolismo: carbohidratos, proteínas y lípidos [47]. A
menudo es posible observar efectos como bifurcación, ciclos inútiles y
'círculos viciosos' en las vías metabólicas, todos los cuales pueden ser
eliminados mediante la administración de dosis fisiológicas de reguladores
naturales y / o metabolitos. Por lo tanto, los enfoques sistémicos de cualquier
patología dan importancia a encontrar los vínculos entre los diferentes tipos
de metabolismos, así como sus relaciones integradoras con dosis bajas y
ultrabajas de metabolitos clave. Los productos a base de hialuronano
modificados con biorreguladores de bajo peso molecular pueden servir como
un medio ideal para lograr estos objetivos.
Un análisis de la literatura sobre la administración de dosis bajas y
ultrabajas de compuesto biológicamente activo revela dos áreas de
estudio distintas. El primero examina moléculas de señalización y sus
receptores y el segundo explora dosis bajas y ultrabajas de
metabolitos clave. La base científica de los efectos fisiológicos de dosis
ultrabajas de metabolitos fue establecida por EB Burlakova et al. en
1986. Publicaron un artículo que describe la inusual dependencia de
la dosis y el efecto y mostraron que se pueden alcanzar efectos
fisiológicos iguales tanto en el campo de concentraciones ultrabajas de
antioxidantes como en concentraciones casi fisiológicas más altas. La
concentración intermedia no produjo ningún efecto. Es bastante
notable que la diferencia entre las concentraciones efectivas sea de
varios órdenes de magnitud [48]. Se ha encontrado que este efecto
bimodal puede ser revelado por sustancias con una estructura
electrónica particular de la molécula [49].
Para realizar los estudios detallados sobre dicho efecto, se sintetizó una
serie de 35 compuestos químicos (derivados del ácido picolínico). Todos los
compuestos se estudiaron en una amplia gama de concentraciones, desde
niveles ultrabajos hasta fisiológicos. De esta serie se identificaron dos
compuestos. Estos compuestos mostraron una actividad bimodal
significativa que afecta la tasa de proliferación de células vegetales [50]. Para
encontrar la correlación entre la estructura electrónica y las propiedades
fisiológicas de los dos compuestos con una actividad bimodal distinta, se
utilizaron métodos de química cuántica [51]. Estos estudios dieron como
resultado la hipótesis de que el mecanismo del efecto bimodal está asociado
con el efecto aceptor de electrones de los ciclos de piridina. Una unión de los
sustituyentes donantes de electrones a la piridina conduce a un aumento de
energía de los orbitales moleculares ocupados más altos del anillo de
piridina y, en consecuencia, a disminuir el potencial de ionización. Por
ejemplo, se demostró que los grupos amino podrían ser tales sustituyentes
[51]. En la cadena de reacción de la síntesis bioquímica de hialuronano, la
etapa clave ( reacciones que limitan la velocidad ) es la síntesis de
glucosamina a partir de fructosa-6-fosfato. La fuente de grupos amino en
esta reacción es la glutamina. La transferencia al grupo amino de glutamina
a fructosa-6-fosfato compite por glutamina
con varias otras reacciones en las que la glutamina se usa para la

síntesis de bases nucleotídicas de purina y pirimidina para la síntesis
de ADN y ARN, así como ciertos aminoácidos, y así sucesivamente. Por
tanto, la glutamina es un metabolito clave en la 'encrucijada' de la
síntesis de ácidos nucleicos, proteínas, hialuronano y otros
glucosaminoglicanos. Un nivel reducido de glutamina en la sangre y
los tejidos conduce a una síntesis más lenta de los biopolímeros y al
desequilibrio de los procesos de descomposición de síntesis de los
biopolímeros. Tal desequilibrio en la síntesis y descomposición de HA
ocurre principalmente en tejidos donde no hay un sistema
circulatorio, a saber, la epidermis de la piel y los tejidos del cartílago.
Esta es una de las razones de las diferentes patologías. Estos datos
revelan una perspectiva muy interesante sobre el 'diseño' de los
productos basados en hialuronano modificado en estado sólido .
Dichos productos podrían ser activos en dosis muy bajas y / o tener
una actividad bimodal, que es capaz de "extinguir" los desequilibrios
en las vías metabólicas y eliminar los sistemas biológicos del "círculo
vicioso" en varios órganos y tejidos.
6.2 Hialuronano en artrología
Como se señaló anteriormente, la capacidad reductora de los

condrocitos del tejido del cartílago para sintetizar glucosamina es uno
de los principales factores del desarrollo de la osteoartritis. La rodilla
sana contiene alrededor de 2 ml de líquido sinovial y la concentración
de hialuronano varía de 2.5 a 4 mg / ml (0.25 a 0.4%). Los pacientes
con osteoartritis tienen una tasa de síntesis y concentración de
hialuronano en el líquido sinovial 2-3 veces menor en comparación
con la tasa normal, reducción del peso molecular de HA debido a la
hidrólisis acelerada y reducción de las propiedades viscoelásticas [52].
Como resultado, aumenta la fricción de las superficies del cartílago,
así como la destrucción del cartílago y el tejido óseo [53-55]. Es por eso
que la práctica médica mundial considera que las preparaciones de
glucosamina con sulfato de condroitina (ver Tabla 6.3) son un
producto de primera clase para la regeneración del tejido
cartilaginoso de las articulaciones mediante la activación de la síntesis
de HA mediante la administración de los precursores por vía
subcutánea u oral. El otro enfoque de la tecnología biomédica del
tratamiento de la osteoartritis es la inyección directa de productos de
alto peso molecular o ácido hialurónico reticulado (ver Tabla 6.4).
Existe una cantidad significativa de literatura científica, de patentes y
médica con resultados positivos del tratamiento de la osteoartritis con
estas dos tecnologías [56-60]. También hay un montón de evidencia
que confirma la eficacia de la intra-articular Inyectable de
hialuronano en la reducción del síndrome de dolor y mejora de la
actividad funcional de las articulaciones en la gonartrosis y
coxartrosis. Se demostró que la aplicación de HA ayuda a recuperar
las propiedades del líquido sinovial, suprime la síntesis de citocinas
antiinflamatorias y prostaglandinas, activa los procesos anabólicos y
reduce los procesos katabólicos en el tejido del cartílago [61-67]. La
Tabla 6.3 muestra varios productos a base de hialuronano con
actividad de modificación de estructura . Estos productos se utilizan
para el tratamiento de la osteoartrosis. La mayoría de ellos están
formulados en forma de polvo o tabletas y están destinados a la
administración oral.
Otros productos, presentados en la Tabla 6.4, se utilizan para el
tratamiento de la osteoartritis. Todos ellos están formulados como
soluciones en jeringas precargadas para inyectables.
Glucosamina (Tabla 6.3) y hialuronano productos (Tabla 6.4)
pertenecen a la categoría de estructura modificadores de compuestos
que, contrariamente a no esteroides anti-inflamatorios drogas, no sólo
detener el síndrome de dolor, pero también ayuda a recuperar tejido
de cartílago.
Tabla 6.3 Productos con hialuronano para el tratamiento de la osteoartrosis

Producto Ingrediente activo Fabricante Fórmula de la droga

DONA Sulfato de glucosaminaRottafarm (Italia) 2 ml de solución (200 m
para intramuscular
inyección
DONA Sulfato de glucosaminaRottafarm (Irlanda) 1,5 g de polvo para
preparación de oral
solución
Aminoartrina Glucosamina Moscú Comprimidos de 300 m
Farmacéutico
Empresa (Rusia)
Structum Sulfato de condroitina Pierre Fabre 500 mg y 250 mg
Productos farmacéuticos capsulas
(Francia)
Condroitina-AKOC Sulfato de condroitina Sintez (Rusia) Cápsulas de 250 mg
Artra condroitina 750Sulfato de condroitina Unipharm Inc. (Estados Unidos) Comprimidos recubierto
Artra Condroitina Unipharm Inc. (Estados Unidos)Tabletas recubiertas
sulfato + glucosamina
clorhidrato
Theraflex Condroitina Sagmel Inc. (Estados Unidos) Cápsulas
sulfato + glucosamina
Alflutop Bioactivo natural BIOTEHNOS SA Ampolla de 10 mg / 1 m
concentrado (Rumania) inyección
Piascledine Extracto de hierbas Laboratoires Cápsula de 300 mg
Expanscience

Tabla 6.4 Productos con hialuronano para el tratamiento de la osteoartritis

Producto Ingrediente activo Fabricante Fórmula de la droga

Orto viscornealAlto peso molecular, alto CORNEAL (Francia) Jeringa de 2 ml
pureza de hialoronato de sodio 1%
solución, pH 7.0–7.5
SYNVISC ® Gel viscoelástico estéril Genzyme Corporation Jeringa de 2 ml
(hilan GF 20) que contiene Hylan A (sodio (ESTADOS UNIDOS)
hialuronato de 6 M Da) y
hylan B (gel hidratado
(pH 7,2 ± 0,3)
Syinocrom Hialurónico altamente purificado Croma (Austria) Jeringa de 2 ml
ácido 1,6 M Da
Suplasyn Hialuronato de sodio - 20 mg, Grupo Bioniche Pharma Jeringa de 2 ml
tampón de fosfato - 2 ml Limited, (Irlanda)
Ostenyl 1% gel de gel viscoso de TRB Chemedica Ltd (Reino Unido)Jeringa de 2 ml
ácido hialurónico con
peso molecular 1,2 Da
Viscosa Hialuronato de sodio 0,5% TRB Chemedica Ltd (Reino Unido)Jeringa de 10 ml
solución


Los mecanismos de acción de la HA a nivel molecular se han estudiado
intensamente. Se ha establecido que cuando se añade HA de alto peso
molecular al cultivo celular de los sinovicitos, se reduce la actividad de los
genes responsables de la síntesis de agrecanasa-2 (la enzima que destruye los
proteoglicanos) y genes de síntesis de los mediadores inflamatorios TNF ,
IL-8, iNOS [68]. Estos efectos están mediados por los receptores CD44 [69,70].
A diferencia del hueso, el cartílago es capaz de crecer intersticial debido a las
células, que están rodeadas de matriz. Las células del cartílago (condrocitos)
sintetizan hialuronano, con el que se conectan los agrecanos. Como
resultado, los complejos supramoleculares ocupan una parte significativa de
la matriz extracelular [71]. Cada célula ocupa una pequeña cavidad (laguna)
en la matriz extracelular. El cartílago no tiene vasos sanguíneos ni capilares,
por lo que las funciones vitales de los condrocitos se mantienen mediante la
difusión de los nutrientes y gases de los vasos sanguíneos ubicados lejos del
cartílago. Dicha difusión tiene lugar a través de la matriz y el líquido sinovial
antes de regresar a los vasos sanguíneos. El cartílago generalmente está
rodeado de pericondrio, la capa gruesa del tejido conectivo que contiene una
cantidad significativa de colágeno y células similares a los fibroblastos . El
pericondrio crece desde el interior a medida que los condrocitos secretan los
componentes de la matriz. El pericondrio fibroso actúa como un corsé que
evita posibles cambios de forma. A medida que crece el cartílago, los
condrocitos se dividen y dan como resultado la formación de nuevas células.
Las células pueden ingresar al tejido del cartílago desde el pericondrio.
Luego , las células de pericondrio similares a fibroblastos se dividen y
experimentan una transformación que da como resultado la formación de la
matriz del cartílago. Así es como estas células se convierten en condrocitos.
A diferencia de la matriz del cartílago, la matriz ósea es dura, por lo

que un hueso puede crecer solo por aposición, que es la superposición
de matriz y células adicionales en la superficie del hueso. Un embrión
crea un conjunto de "modelos" óseos. A medida que se crea el
cartílago nuevo, el hueso reemplaza el anterior. El organismo adulto
mantiene una forma "embrionaria" similar del comportamiento de las
células cuando el hueso debe renovarse. El hueso está cubierto por
una capa de tejido conjuntivo grueso llamada periostio. Los haces de
fibras de colágeno que emergen del periostio se insertan en un hueso
y proporcionan una base para la unión de otros tejidos conectivos
como los tendones. La capa interna del periostio incluye osteoblastos,
que son células con capacidad para proliferar. La matriz ósea secreta
estos osteoblastos, que se encuentran en la superficie de la matriz
ósea existente, y capas de nueva matriz ósea sobre la parte superior.
Otras células, incluidos los osteoclastos, pueden destruir la matriz
celular. Alrededor del hueso hay células capaces de crear la matriz del
cartílago. En la rotura del hueso, estas células reproducen el proceso
embrionario inicial: primero se crea el cartílago para llenar el espacio
y luego la matriz del cartílago se reemplaza por la matriz ósea. La
'colaboración' del cartílago y el hueso se basa en su origen común.
Ambos tejidos están formados por células mesenquimales que
secretan grandes cantidades de matriz extracelular con HA. Tras la
maduración del cartílago, algunas de sus partes se mineralizan por la
deposición de cristales de fosfato de calcio y otras sales en la matriz
del cartílago. En estas áreas, los condrocitos sufren apoptosis, lo que
deja grandes vacíos. Estas lagunas están llenas de vasos sanguíneos y
osteoclastos, que destruyen la matriz de cartílago mineralizada. Los
siguientes osteoblastos inician un proceso para depositar la matriz
ósea. Después de este proceso, lo único que queda del cartílago en los
huesos largos del organismo adulto es la capa de tejido cartilaginoso,
que crea una superficie lisa en la zona de las articulaciones donde un
hueso se une a otro. El papel de HA en dicho proceso no se comprende
del todo. Está claro que un hueso, como organismo completo, es un
sistema dinámico que mantiene su estructura debido a un equilibrio
entre tipos opuestos de funciones de las diferentes células
especializadas.
En los casos de artritis o artrosis, las irregularidades de la función del

hialuronano en las articulaciones y las patologías están bien documentadas.
Esto se debe al hecho de que la osteoartritis es un
enfermedad común asociada con trastorno metabólico, daños
degenerativos del cartílago articular y tejido óseo adyacente. La
cavidad glenoidea y la cabeza de los huesos articulados están
cubiertas por un cartílago hialino liso y brillante que contiene
aproximadamente 1 mg de HA por 1 g de tejido crudo. La capa
externa del cartílago está cubierta con una capa que se asemeja al
periostio y realiza funciones similares. Las superficies de
acoplamiento de los huesos y los cartílagos articulares están rodeadas
por la cápsula articular. La superficie interna de la cápsula está
revestida con una membrana que secreta un líquido sinovial viscoso
que contiene una cantidad significativa de hialuronano
(3-4 mg / ml). Actúa como lubricante y realiza funciones de resorte.
El cartílago hialino contiene principalmente matriz extracelular
(95%) con una cantidad relativamente pequeña de condrocitos que
sintetizan HA, condroitín sulfato y otros componentes de la matriz
extracelular. En comparación con los fibroblastos, los condrocitos
sintetizan menos HA, que está casi completamente conectado a los
agrecanos, para formar los complejos supramoleculares. La síntesis de
condroitín sulfato se lleva a cabo con la participación de seis tipos de
glicosiltransferasas, que son específicas para los seis tipos de enlaces
intersacáridos . La esterificación adicional tiene lugar con la ayuda de
dos sulfotransferasas debido a la presencia de dos tipos de enlaces
sulfato en las posiciones 4 y 6 de los aminoazúcares. Cada cadena de
condroitín sulfato comprende normalmente al menos 40 unidades de
sacárido y tiene un peso molecular de aproximadamente 20 000 Da.
Muchas de estas cadenas (aproximadamente 100 cadenas de
condroitín sulfato y aproximadamente 30 cadenas de queratán
sulfato) están conectadas por enlaces covalentes con una pequeña
proteína central. Como resultado, se forma una macromolécula de
proteoglicano agrecano. Esta es la principal proteína de la matriz del
cartílago (10% en peso). Los proteoglicanos se unen al HA mediante
dos proteínas. Cada macromolécula de hialuronano puede unirse a
100 moléculas de agrecano y formar complejos supramoleculares de
la matriz extracelular. Se unen a las estructuras de colágeno y
proporcionan la fuerza, la resistencia y la elasticidad del cartílago.
Otro componente importante de la matriz extracelular del cartílago es
el colágeno tipo II [72].
El hialuronano del líquido sinovial es producido por sinoviocitos (un tipo
de fibroblasto). Los sinoviocitos aseguran el deslizamiento de las superficies
articulares y la nutrición del cartílago. La concentración de hialuronano en
el líquido sinovial es bastante alta (2 a 4 mg / ml). Su distribución de peso
molecular es de 100 000 a 10 000 000 Da. Debido a su alta naturaleza
hidroscópica, mantiene el agua
equilibrio en el líquido sinovial. Las patologías aparecen en determinadas
condiciones, incluso cuando los sinoviocitos comienzan a producir un exceso
de citocinas, metaloproteasas, hialuronidasas, eicosanoides (productos del
metabolismo del ácido araquidónico) y óxido de nitrógeno, y también
cuando las formas activas de oxígeno aceleran los procesos de degradación
de HA y otros biopolímeros en el líquido sinovial. El desequilibrio de la
síntesis y degradación de los biopolímeros hacia la aceleración de la
descomposición conduce a la degradación del cartílago articular.
La capa superior de la capa de matriz articular, que está en contacto
directo con el líquido sinovial, está recubierta con una placa no celular con
un grosor de 4 a 7 μm. La matriz de la capa superficial del cartílago consiste
principalmente en fibras de colágeno muy adyacentes entre sí. Están
ubicados paralelos a la superficie del cartílago. Los espacios interfibrilares
en la capa superficial se rellenan con el material, que consiste en
proteoglicanos, hialuronano y agua. En respuesta a la presión, el agua
intercelular sale de la placa de cartílago hacia el espacio articular. Después
de retirar la carga, el agua regresa para restaurar el estado del cartílago
superhidratado. El agua, que sale del cartílago, absorbe la mayor parte de la
presión de compresión y lubrica la superficie de la articulación. Contenido
de colágeno del fémur
La capa superficial del cartílago de la cabeza es de 8 a 16% más alta que

dicho contenido en todo el cartílago y el contenido de glicosaminoglicanos es
de 1,6 a 2,0 veces menor que en todo el cartílago. En consecuencia, la
proporción de colágeno a glicosaminoglicanos en la capa superficial del
cartílago articular es 2 a 3 veces mayor que en todo el cartílago. Sin embargo,
la capa superficial del cartílago articular está 8 a 10% más hidratada que el
tejido del cartílago en general. Parece extraño que con un contenido
reducido de glicosaminoglicanos, que son los componentes más hidrófilos, la
capa superficial del cartílago tenga una mayor capacidad de retención de
agua que todo el tejido. Esta contradicción podría explicarse por el hecho de
que un aumento en la proporción de colágeno a glicosaminoglicanos
conduce a una reducción de detección de grupos de colágeno cargados
positivamente con grupos de glicosaminoglicanos cargados negativamente,
lo que aumenta el grado de hidratación del colágeno.
[56]. En el colágeno, a la humedad relativa máxima, casi todo el
contenido de agua está asociado con los grupos activos del
biopolímero. Pero en los glicosaminoglicanos, se encontraron al
menos dos formas de agua libre además del agua unida [73]. Se
estableció experimentalmente que con un bajo contenido de
glicosaminoglicanos, la capa superficial del cartílago articular tiene
una mayor capacidad de agua en comparación con el resto del tejido
debido a un mayor contenido de agua ligada. En el desarrollo de la
osteoartritis, se puede observar un cambio en la estructura de la capa
superficial, lo que resulta en una reducción de su espesor y un cambio
en la estructura de las capas de fibras. Además, el contenido de agua
unida en el cartílago articular se reduce aproximadamente 10 veces.
En general, el equilibrio del intercambio de agua en las articulaciones
depende de la condición de HA en el líquido sinovial.
Según los conocimientos modernos, las causas principales de la
osteoartritis son cambios patológicos que se originan como resultado de la
alteración de los procesos normales en los condrocitos y la degradación de
estructuras en la matriz extracelular del cartílago articular [58,59]. Durante
el desarrollo de dicha patología, posiblemente por razones genéticas, se
observa una disminución en el tamaño de las moléculas de hialuronano así
como de otros glicosaminoglicanos, lo que significa que ha tenido lugar la
despolimerización de biomoléculas (estos procesos se discuten en detalle en
la Sección 4.3). Por lo tanto, los glicosaminoglicanos, que se pueden
encontrar en el cartílago, se representan como subunidades más pequeñas
que podrían eliminarse más fácilmente de la matriz y migrar fuera de la
cápsula articular. Estos cambios ya se registran en las primeras etapas de la
osteoartritis y su intensidad se correlaciona con el desarrollo del proceso.
En el curso crónico de la enfermedad, los fragmentos degradados de

glicosaminoglicanos en complejo con proteínas pueden causar
estimulación antigénica y resultar en un aumento del nivel de
anticuerpos enviados a complejos de hialuronano y otros complejos
de glicosaminoglicanos enviados a proteínas. A niveles elevados de
anticuerpos en estos complejos se observó una reducción significativa
en el número de resultados positivos en el tratamiento de las
enfermedades articulares con condroprotectores (condroitín sulfato,
glucosamina, etc.) [74].
El desarrollo de la osteoartritis a menudo comienza con citocinas, que son
factores de crecimiento sintetizados en los tejidos articulares, que luego se
transfieren al líquido sinovial, donde actúan como factores autocrinos y
paracrinos para el mantenimiento de la homeostasis. La osteoartritis no
muestra los clásicos signos macroscópicos de inflamación revelados en la
infiltración de células y tejidos articulares. Sin embargo, el aumento de las
cantidades de citocinas antiinflamatorias como la interleucina -1-beta, el
factor de necrosis tumoral alfa se pueden encontrar en el líquido sinovial del
paciente. Bajo la influencia de la interleucina-1-beta, los condrocitos
aumentan drásticamente la síntesis de metaloproteinasas y detienen la
síntesis de proteoglicanos y colágeno del cartílago. En condiciones normales,
los condrocitos sintetizan y exportan a enzimas proteolíticas de matriz
extracelular que incluyen metaloproteinasas, cisteína y serina proteasas. El
controlado
La actividad de estas enzimas es necesaria para el proceso de

remodelación de intercambio permanente del cartílago de la matriz
extracelular [56-59].
Los productos para el tratamiento de la artrosis se podrían dividir
en dos grupos: los que modifican los síntomas y los productos y los
que modifican la estructura. El segundo grupo incluye
condroprotectores, que tienen la capacidad de restaurar la estructura
del tejido del cartílago. Estos condroprotectores son el producto de la
despolimerización del tejido del cartílago (glucosamina, sulfato de
glucosamina y sulfato de condroitina) y HA, que es necesario para
restaurar la viscoelasticidad del líquido sinovial en la cápsula
articular. Los condroprotectores (tabla 6.4) se consideran una base del
tratamiento constructivo de las enfermedades articulares. La
glucosamina exógena pasa a través del tracto gastrointestinal hasta
llegar al cartílago donde las células la unen a HA, heparina y
condroitín sulfato. En el cuerpo, el sulfato de condroitina se puede
encontrar principalmente en la matriz del cartílago donde, junto con
el hialuronano, retiene el agua y, por lo tanto, contribuye a la
elasticidad y a las propiedades del tejido de absorción de impactos .
Además de eso, el condroitín sulfato es un inhibidor de las
metaloproteinasas y tiene efectos antiinflamatorios, analgésicos y
antiateroscleróticos . Los glucosaminoglicanos sulfatados como el
condroitín sulfato y la heparina mostraron una capacidad
dependiente de la dosis para inhibir la actividad de las agrecanasas en
cultivos celulares [58]. La glucosamina y el sulfato de condroitina
ayudan a restaurar la estructura del tejido del cartílago y actúan como
sinergistas, potenciando su acción mutua. Los mecanismos de acción
condroprotectora están dirigidos a estimular la síntesis de los
componentes de la matriz del cartílago, ralentizar su destrucción y
activar la actividad metabólica de la célula. Se encontró que los
condrocitos no solo son capaces de sintetizar los precursores de los
glicosaminoglicanos sino también de utilizar las moléculas que llegan
a los medicamentos. Las macromoléculas acabadas se utilizan en la
matriz extracelular durante el autoensamblaje de sus estructuras [57].
El segundo enfoque de las tecnologías biomédicas para el tratamiento de la
osteoartritis está relacionado con el hialuronano. Los pacientes con artritis
deformante tienen una concentración y un peso molecular reducidos de HA
en el líquido sinovial de la articulación en comparación con la norma. Esto
conduce a un deterioro de las propiedades viscoelásticas del biopolímero y
del líquido sinovial en general. Una cantidad reducida de hialuronano
conduce a una capacidad reducida para proteger las superficies articulares
del daño y el desgaste y a los receptores del dolor articular de una irritación
innecesaria. Una simple inyección de HA exógena de alto peso molecular en
la cavidad articular conduce a la restauración de las propiedades
viscoelásticas del líquido sinovial. También conduce a la estimulación de la
síntesis de polisacáridos por los sinoviocitos y la síntesis de los
proteoglicanos del cartílago por los condrocitos. Los proteoglicanos, a su vez,
previenen la destrucción de los condrocitos e inhiben la liberación de las
enzimas que pueden destruir el cartílago. Además, el HA tiene un efecto
analgésico debido a su capacidad para bloquear los receptores del dolor
articular. Se supone que el hialuronano también revela
actividad antiinflamatoria al poseer la capacidad de inactivar los radicales
libres, inhibir la migración de leucocitos y la quimiotaxis. El fármaco, a base
de ácido hialurónico, se ha introducido recientemente en el mercado con el
nombre de Gialgan . Es una solución purificada de la sal sódica del ácido
hialurónico con un peso molecular de 500 000 a 700 000 Da.
El tamaño de las macromoléculas de Gialgan es significativamente menor

que el HA en el líquido sinovial normal. Por lo tanto, cuando se inyectó en la
cápsula articular, Gialgan aumentó la elasticidad del líquido sinovial solo en
un 1-15%. Como resultado de la despolimerización de hialuronano en la
articulación, la duración de la acción de dicha "prótesis" temporal se limita a
2 días. Mediante reticulación química de moléculas de HA, se obtuvo el
nuevo producto Synvisc . Su peso molecular es de aproximadamente 6 000
000 Da. Debido a la reticulación intermolecular y al aumento del peso
molecular
del biopolímero, la elasticidad del líquido sinovial se incrementó hasta un 78%

y la acción
duración hasta 7 días. Se llevaron a cabo varios estudios
experimentales para dilucidar la eficacia y los mecanismos de acción
de diversos fármacos basados en hialuronano, como Gialan, Synvisc,
Restylane, Dermalife y otros, que deben inyectarse directamente en la
cápsula articular de la rodilla (gonartrosis ) y cadera (coxartrosis). La
conclusión general es que HA proporciona un efecto positivo sobre las
funciones celulares e inmunológicas, especialmente en las primeras
etapas y sobre síntomas moderados de enfermedad. Se establece una
relación directa de las diversas acciones biológicas sobre el peso
molecular de HA: cuanto mayor es el peso molecular, se relaciona con
un efecto mejor y más prolongado. Se ha demostrado que el HA con
un peso molecular de 500 000 a 750 000 Da en combinación con
condroitín sulfato en una amplia gama de concentraciones (10 a 1000
mcg / ml) inhibe la síntesis de estromelisina-1 (metaloproteinasa-3,
que destruye el cartílago y actúa como mediador de la inflamación).
Está comprobado que varios cambios en el metabolismo de los
proteoglicanos en el cartílago articular y el líquido sinovial en el
desarrollo de procesos degenerativos y distróficos en la rodilla están
interrelacionados y son interdependientes [53,56]. Los diferentes
análisis y estudios del líquido sinovial permiten comprender mejor la
proporción de los procesos de degradación y regeneración del
cartílago articular.
6.3 Hialuronano en Oftalmología
Los productos a base de hialuronano se utilizan ampliamente tanto en

la terapia general como local de las enfermedades oculares. El
hialuronano se incluye en la composición de las gotas para los ojos
("lágrimas artificiales") para el tratamiento de las córneas secas. Existe
un medicamento llamado 'Healon' desarrollado por Pharmacia,
Suecia, que contiene un HA de alto peso molecular y se usa
ampliamente para procedimientos de cirugía ocular y para medios
quirúrgicos (viscoprotector) para prevenir daños mecánicos en los
tejidos internos del ojo.
El cuerpo vítreo del ojo consiste principalmente en HA producido
por las células de la córnea. Debido a las propiedades viscoelásticas
del hialuronano, el cuerpo vítreo asegura una presión intraocular
permanente y previene el desprendimiento de retina y el epitelio
pigmentario.
Se han desarrollado varias formulaciones de soluciones de HA con
aminoácidos, antioxidantes y otros compuestos. Pueden prescribirse
para la irrigación del globo ocular o inyectarse en la cámara anterior
del ojo durante la cirugía de cataratas [61,75,76]. Los productos de la
línea Hyalrepair también podrían ser muy útiles para tales fines.
6.4 Hialuronano en oncología
El hialuronano se utiliza en oncología como terapéutico. Existen

varios mecanismos de acción de HA sobre las células tumorales. A
nivel molecular, el mecanismo principal está relacionado con el hecho
de que la HA de alto peso molecular puede unirse a receptores en la
membrana celular de las células tumorales, lo que da como resultado
una migración celular más lenta y metástasis [77]. Para la invasión de
células cancerosas y la formación de metástasis, se requiere la
proteólisis del dominio extracelular del receptor CD44. En este caso, la
célula se libera de su conexión con el ácido hialurónico y se retira del
"ancla" [78,79]. Por tanto, el polisacárido de alto peso molecular puede
utilizarse como inhibidor del crecimiento del cáncer y la formación de
metástasis [61]. Otro
El mecanismo de acción está relacionado con la capacidad del HA de

alto peso molecular para promover la formación de una cápsula que
rodea el tumor. La cápsula se construye a partir del tejido conectivo.
Un tercer mecanismo está relacionado con la capacidad de la HA de
alto peso molecular para inhibir la vascularización del tumor
(brotación de vasos sanguíneos en el tumor), lo que conduce al
crecimiento lento y la metástasis de los tumores [80,81]. El brote de
nuevos vasos sanguíneos en el tumor (angiogénesis) es un elemento
clave de su progresión. Los factores de crecimiento de fibroblastos
secretados por las células tumorales estimulan la proliferación de
células endoteliales y promueven la formación de nuevos capilares.
La angiogénesis proporciona a las células cancerosas beneficios
adicionales de crecimiento e invasión. En este contexto, los
investigadores se enfrentan a la dualidad del efecto fisiológico del
hialuronano. A diferencia del HA de alto peso molecular, que inhibe la
angiogénesis, la fracción de bajo peso molecular (por debajo de 30 000
Da), lo indujo
[82]. Para la invasión, las células tumorales secretan hialuronidasa
extracelular, que hidroliza el hialuronano de la matriz extracelular
tisular. Por lo tanto, existe la necesidad de fármacos (y posiblemente
complejos) de HA de alto peso molecular en combinación con potentes
inhibidores de hialuronidasa.
Otra propiedad notable del hialuronano es que mejora el efecto de
los medicamentos convencionales contra el cáncer . El HA permite
reducir sus dosis terapéuticas y, en consecuencia, la toxicidad adversa
para las células normales [83]. Se encuentra una gran cantidad de
hialuronano e hialuronidasas en la matriz extracelular del tumor.
Muchos estudios sobre el gran número de diversos tipos de células
tumorales demostraron que la HA de alto peso molecular puede
inhibir tanto la proliferación como la migración de las células
tumorales [80,81,83].
Se supone que el uso de hialuronidasa por parte de las células
tumorales como un 'sabotaje molecular' para la despolimerización de
macromoléculas de polisacáridos de matriz extracelular por dos
razones: primero, para facilitar la invasión entre células normales y
formar metástasis en los tejidos y segundo, para usar el capacidad de
los productos de HA de degradación de bajo peso molecular para
estimular la angiogénesis haciendo brotar vasos sanguíneos en el
tejido tumoral. Para discutir los mecanismos moleculares por los
cuales el hialuronano afecta la proliferación celular y el crecimiento
tumoral, es importante examinar las diferencias entre las células
normales y las tumorales [72].
Los tumores representan un grupo de enfermedades genéticas
caracterizadas por una proliferación celular incontrolada. Las células
tumorales suelen ser redondas o en forma de estrella y son más
grandes que las células normales. Tienen una relación
núcleo-citoplasma diferente . El núcleo no suele contener conjuntos de
cromosomas diploides, sino poliploides o aneuploides. Las células
diferenciadas se mantienen dentro de ciertos tejidos y no se
inmiscuyen en las "áreas adyacentes". Tienen una serie de ventajas
sobre las células normales debido a varias características:
1. Mayor tasa de síntesis de ADN y ARN por una mayor actividad de la
enzima ribonucleótido reductasa y una tasa reducida de
catabolismo de purinas y pirimidinas.
2. Tasa acelerada de glucólisis y aumento de la producción de lactato.
La relación de actividad de las enzimas clave de la glucólisis y la
respiración cambia y se correlaciona con la tasa de crecimiento
tumoral [84].
3. Se aumenta el contenido de proteínas y enzimas. Entonces, la isoenzima
de la hexoquinasa tumoral tiene una afinidad extremadamente alta por la
glucosa. Tales cambios en el metabolismo de los carbohidratos
proporcionan a las células cancerosas la capacidad de asimilar la glucosa,
incluso a concentraciones sanguíneas muy bajas. Da otra ventaja a las
células tumorales en competencia con las células normales. Se podrían
observar y encontrar cambios similares en otros procesos que permiten
que las células tumorales compitan con éxito con los tejidos circundantes
por los metabolitos vitales.
4. Pueden encontrarse proteínas y enzimas embrionarias en las células

tumorales. En particular, la enzima telomerasa altamente activa, que es
característica de las células embrionarias, aparece en las células
tumorales. La función principal de la telomerasa es agregar telómeros al
extremo 3 'de una hebra de cromosoma de ADN. Los telómeros
representan los fragmentos finales de los cromosomas lineales de
humanos y animales avanzados. Hay miles de repeticiones altamente
conservadoras del hexadesoxinucleótido TTAGGG que se denominan
"telómeros". Las partes teloméricas del cromosoma están unidas a la
membrana nuclear y, como resultado, evitan la destrucción y
recombinación de los cromosomas en las células diferenciadas
no proliferantes . En cada ciclo celular y replicación del ADN, la longitud
de los telómeros se acorta en aproximadamente 120 pares de bases
nucleicas, lo que conduce a la incapacidad de la ADN polimerasa para
agregar fragmentos finales en el extremo 3 'del ADN. Las células somáticas
normalmente divididas no tienen telomerasa. Por tanto, el acortamiento
de los telómeros sirve para medir el número de réplicas que determinan
el número de divisiones (límite de Hayflic) y la vida útil de la célula
normal. Después de alcanzar el tamaño crítico de las secuencias
teloméricas, las células pierden su capacidad para dividirse y sufrir una
muerte celular programada (apoptosis). En las células embrionarias y
tumorales, la telomerasa está activa y completa los telómeros en los
extremos del ADN del extremo 3 'después de la replicación y restaura su
longitud original. Como resultado, la capacidad de la célula para envejecer
se termina y se vuelven inmortales.
5. Las células transformadas tienen la composición y estructura

modificadas de las cadenas de oligosacáridos de glicoproteínas y
glicoesfingolípidos de la membrana plasmática. Como resultado, la
estructura, la carga y la permeabilidad de la membrana se
modifican y se reduce la intensidad de la síntesis de proteínas
adhesivas y receptores de integrina. Las proteasas, colagenasa y
hialuronidasas se secretan en la matriz extracelular. Hidrolizan
colágeno, hialuronano y otros glicosaminoglicanos, descomponen la
estructura de la matriz extracelular y facilitan la invasión de
células tumorales al tejido. Se acelera la síntesis de los factores de
angiogénesis, que contribuyen al brote de los vasos sanguíneos y
suministran al tumor sus metabolitos.
6. Tanto en las células normales como en las tumorales, el crecimiento
y la división celular comienza a partir de la acción de los factores
de crecimiento en la célula. Al interactuar con receptores en la
superficie celular o receptores intracelulares, activan la cascada de
reacciones dentro de la célula. Esto conduce a la activación de
genes responsables de la síntesis de proteínas de división celular. Si
los genes que codifican los receptores, transductores y factores de
transcripción se modifican como resultado de la mutación de tal
manera que la expresión no está coordinada, entonces la división
celular controlada se reemplaza por la inmortalización de la
división celular no controlada (transformación celular). En las
células tumorales, aumenta la velocidad de síntesis y secreción de
ciertas hormonas y factores de crecimiento. Las células adquieren
la capacidad de crecimiento autónomo cambiando a mecanismos
paracrinos o autocrinos de regulación del crecimiento. El
mecanismo de regulación autocrino permite a las células tumorales
sintetizar factores de crecimiento, receptores y oncoproteínas, que
son análogos de los factores de crecimiento o sus receptores. Al
interactuar entre sí, provocan la autoestimulación del crecimiento
y la división de las células.
7. Cambia la actividad de los protooncogenes y genes supresores de
tumores. La mayoría de los tumores se originan a partir de células
somáticas. Debido a que las células somáticas son diploides, tienen
dos alelos de cada gen. Si la (s) mutación (es) en un alelo conducen a
una disfunción de las células hijas, significa el tipo dominante de
característica de herencia para los protooncogenes y el gen P53.
Los protooncogenes controlan la síntesis de proteínas, que
desencadenan el ciclo celular y, por lo tanto, pueden revelar las
propiedades oncogénicas. Estos genes se adquieren de
varios virus humanos y animales. Para diferenciar entre genes

normales y oncogenes virales, la definición de genes del huésped es
protooncogenes. Este grupo incluye los genes que controlan la
síntesis de ciertas proteínas. Estas proteínas juegan un papel central
en la regulación de la división celular tales como factores de
crecimiento, receptores de factores de crecimiento, factores de
transcripción y proteínas involucradas en la transducción de
señales. La mitad de los oncogenes virales codifican tirosina
proteokinasas. Los protooncogenes contienen información sobre la
familia de proteínas Ras que poseen actividad GTPasa y participan
en la transducción de señales. Obtenidos en los receptores de la
membrana celular y localizados en el lado interno de la membrana,
están en estrecho contacto con las proteínas de la membrana y los
fosfolípidos. Se demostró que las proteínas Ras están involucradas
en el cambio de la estructura del citoesqueleto, la regulación de la
exocitosis y endocitosis, la implementación de las señales
mitogénicas y la activación de proteínas y la regulación de la
transcripción de genes. Existe una familia especial de
protooncogenes nucleares ; un grupo que incluye genes como myc,
fos, jun, myb y erb A. Las oncoproteínas producidas por estos genes
están unidas con secuencias específicas en el ADN y funcionan como
factores de transcripción.
También se describen los antioncogenes o genes supresores de

tumores. Los productos proteicos de estos genes inhiben el potencial
de replicación de las células y previenen el desarrollo de tumores. En
el curso de la transformación maligna, las funciones de estos genes a
menudo se pierden, lo que conduce a un control deficiente de la
proliferación celular. En este sentido, el gen mejor estudiado es el gen
P53. Codifica una fosfoproteína nuclear con un peso molecular de 53
000 Da que evita que las células pasen a la fase S, así como la
amplificación y la mutación genética.
Se cree que la función fisiológica de la proteína P53 es principalmente
retrasar las células (que tienen daño en la estructura del ADN) en las
fases G1-G2 del ciclo de división celular hasta que estos daños sean
eliminados por los sistemas de reparación de daños. Si los sistemas
reparadores no pueden eliminar los defectos en las estructuras del ADN, la
proteína P53 inicia los mecanismos de apoptosis que destruyen la célula
dañada. El tetrámero de la proteína P53 se une a las áreas reguladoras de
muchos genes y modula su expresión. Al activar genes clave, que inician la
apoptosis, la proteína P53 acelera la destrucción de células potencialmente
peligrosas que están dañadas y son capaces de transformarse. La proteína
P53 aumenta la expresión del gen que codifica la proteína trombospondina.
Esta proteína evita que los vasos sanguíneos broten en tumores y la
formación de metástasis. Así, la proteína P53 funciona como 'policía
molecular', manteniendo las células sanas y eliminando las dañadas.
Durante la vida humana, hay aproximadamente 10 16 divisiones celulares,
durante las cuales cada gen puede mutar 10 10 casos. Varios científicos creen
que el problema del cáncer no es por qué ocurre, sino por qué ocurre con
menos frecuencia. Existen sistemas reparadores de células y supresores de
genes, que en la mayoría de los casos eliminan la reproducción ilimitada de
células diferenciadas.
Los tumores benignos pueden crecer rápidamente y alcanzar

grandes tamaños, pero no hacen metástasis. Solo los tumores malignos
pueden invadir los otros tejidos (hacer metástasis). Cuando un tumor
celular alcanza aproximadamente 2 mm de diámetro, las células
secretan factores proteicos que estimulan el crecimiento del tejido
conjuntivo alrededor del tumor y el crecimiento de vasos sanguíneos
en el tumor. La angiogénesis proporciona a las células tumorales
beneficios adicionales para el crecimiento y la invasión. Las células
metastásicas secretan una variedad de enzimas para la destrucción de
la matriz extracelular y las membranas basales del tejido circundante.
Estas enzimas incluyen colagenasas que pueden escindir el colágeno
de la matriz extracelular y una poderosa proteasa catepsina B que en
las células normales se localiza en los lisosomas y en las células
metastásicas se incrusta en la membrana plasmática.
La catepsina B activa la procolagenasa, que escinde específicamente el

colágeno tipo IV. La lista de enzimas también incluye la plasmina (la
enzima que rompe algunas proteínas no colágenas de la matriz
extracelular), la familia de las metaloproteinasas y la heparasa (la
enzima que cataliza la hidrólisis del heparán sulfato: el proteoglicano
predominante de las membranas basales ). Los fragmentos de la
matriz extracelular, incluida la HA que rodea a las células tumorales,
camuflan estas enzimas de la vigilancia inmunológica y proporcionan
unión a la membrana basal de los órganos diana. Los carbohidratos
ubicados en la superficie de una célula tumoral se unen al
componente carbohidrato del receptor de células endoteliales y
finalmente se unen a las paredes de los vasos sanguíneos con la ayuda
de la proteína integrina.
La mayoría de las poblaciones de células diferenciadas de animales
humanos y vertebrados se rejuvenecen. La integridad del tejido se
mantiene mediante células somáticas diferenciadas que a veces
abandonan el estado diferenciado y entran en el ciclo de división
mitótica para reemplazar las células dañadas. Esta ruta (estado
diferenciado -> inicio del ciclo celular -> ciclo mitótico -> terminación
del ciclo mitótico y regreso al estado diferenciado) tiene un riesgo
sustancial de factores mutagénicos, cancerígenos y otros externos,
fallas en los sistemas reguladores y vínculos que podrían conducen a
una proliferación celular ilimitada (inmortalización), transformación,
malignidad y el proceso del cáncer, que causan la muerte de todo el
cuerpo.
Según la OMS (Organización Mundial de la Salud), el 80% de las
enfermedades cancerosas humanas son inducidas por factores
ambientales. Las dosis de carcinógenos en el medio ambiente son
bajas, pero actúan en combinación con otros factores que inducen el
aumento de la proliferación de células diferenciadas y por lo tanto
crean las condiciones necesarias para transformar las acciones de
carcinógenos. Es difícil predecir el resultado de la compleja influencia
de factores físicos y químicos debido a una gran variedad de señales
entrantes, así como al conocimiento insuficiente del comportamiento
y la interacción de varios sistemas celulares en tales condiciones. El
ataque combinado a las células se caracteriza por fenómenos tales
como competencia, efectos aditivos y sinérgicos, sensibilidad colateral
o resistencia cruzada. En condiciones extremas o incluso no óptimas ,
las células diferenciadas pueden pasar a estados de proliferación,
transformación, estabilidad, apoptosis o procesos citolíticos en
cadena.
Partiendo de la hipótesis de que la matriz extracelular sustenta el fenotipo
celular (que sintetiza esta matriz), es posible plantear la hipótesis de que la
selección del estado de transición de la célula se inicia a partir de la matriz
extracelular ya que es la primera en recibir las señales de la matriz
extracelular. medios y está expuesta a factores físicos y químicos externos.
Las estructuras de la matriz extracelular y, en primer lugar, el hialuronano y
los proteoglicanos pueden proteger las células de factores externos, pero
también acumulan mutágenos y carcinógenos. Estos dos factores pueden
cambiar la relación síntesis / descomposición de los componentes de la
matriz extracelular y, por lo tanto, eliminar las células del estado
diferenciado e iniciar estados de transición. Esto se confirma con los
siguientes datos: cuando se agregan proteoglicanos de matriz de cartílago
típicos a los condrocitos, la síntesis de componentes de la matriz se activa en
los condrocitos. El HA libre, que se añade al cultivo de condrocitos, inhibe
fuertemente la síntesis de la matriz del cartílago [85]. Estos resultados
sugieren que la matriz extracelular, secretada por las células, afecta a las
células y les ayuda a mantener un estado diferenciado específico. El efecto
excesivo por encima del umbral ayuda a mover la célula al ciclo mitótico.
Según nuestros datos, la transición de las células diferenciadas al ciclo
celular está asociada con importantes reordenamientos de la cromatina en el
núcleo. La transición va acompañada de varios cambios metabólicos y la
activación de protooncogenes nucleares que eran "silenciosos" en las células
diferenciadas. El resultado es la supresión de la actividad de los "genes de
diferenciación"; activación del
grupo de 'genes de proliferación'. En última instancia, las células pasan de la

síntesis de biopolímeros secretados a la síntesis de proteínas intracelulares
sobre la base de las relaciones competitivas de proliferación y
diferenciación. Sobre la base de estos datos, se han formulado principios
generales de transición de células diferenciadas en el ciclo celular [86]. Esta
importante reorganización de la cromatina en el núcleo y el ciclo celular en
general aparentemente ocurre con la célula y la HA, se localiza en el núcleo y
se delega de la matriz celular. Sin embargo, estas cuestiones quedan por
estudiar. En la actualidad se sabe que la síntesis y secreción de hialuronano
aumenta durante la proliferación. En las células mitóticas, este polisacárido
llena toda el área alrededor de los cromosomas durante la metafase, anafase
y telofase [87]. El tetrasacárido HA puede regular la expresión de genes para
ciertas proteínas de choque térmico.
[88] que, al igual que los protooncogenes nucleares , pertenecen al
grupo de genes de "respuesta temprana". Existen estudios que
exploran las vías de transducción de señales mediadas por
hialuronano. Así, durante la mitogénesis de las células endoteliales,
que es causada por oligosacáridos de hialuronano (oHA), se estimula la
actividad de la proteína quinasa C y MAP-quinasas y se activan genes
de 'respuesta temprana' en las células endoteliales junto con la síntesis
de la proteína Ras-. Los genes de 'respuesta temprana' incluyen los
genes nucleares myc , fos y jun antes mencionados , así como algunos
otros. Se muestra que el HA exógeno inhibe la migración de
fibroblastos transformados por el gen ras , un fragmento de proteína
que se une específicamente a un polisacárido en la superficie de los
fibroblastos. Además, el mismo fragmento de proteína reduce la
capacidad del polisacárido para inhibir la locomoción de los
fibroblastos transformados por ras . La especificidad de esta acción
podría entenderse por el efecto dosis-dependiente y por el hecho de
que el sulfato de condroitina y el sulfato de heparán no muestran tal
efecto [77].
La actividad antiproliferativa del hialuronano con un peso molecular de
500 000 a 750 000 Da en concentraciones de 0,8 a 80 mcg / ml se ensayó in
vitro en varias células cancerosas [83]. Se encontró que HA suprime la
proliferación de células de cáncer de próstata, cáncer de vejiga, melanoma,
fibrosarcoma y cáncer de mama. El grado de supresión depende de la
concentración de biopolímero. El mismo trabajo contenía el análisis de los
posibles mecanismos de actividad antiproliferativa del hialuronano para las
células cancerosas. La inhibición de la proliferación de células cancerosas
por hialuronano no dependió del nivel del receptor CD44. La glicoproteína
CD44 está asociada con un proceso maligno en varios tipos de cáncer y
contribuye a la supervivencia de las células cancerosas. Se informó que la
supresión de CD44 en el carcinoma de mama inducía la apoptosis en las
células cancerosas [89]. Hasta ahora no se ha descrito ninguna correlación
entre el nivel de expresión y el número de receptores CD44 en la superficie
de las células cancerosas de un lado y la actividad antiproliferativa del HA
del otro lado. Sin embargo, hay varios datos que sugieren que tal correlación
podría existir. Por ejemplo, la actividad antiproliferativa de HA sobre las
células cancerosas puede explicarse por la destrucción de los complejos del
polisacárido con el receptor CD44 [90]. Otra razón de la actividad
antiproliferativa de HA podría estar relacionada con otro receptor, por
ejemplo RHAMM. Las isoformas del receptor RHAMM también participan en
la regulación del ciclo celular.
Se encontró que la sobreexpresión de RNAMM por transfección en

fibroblastos normales los convierte en células de fibrosarcoma
metastásico. La capacidad del hialuronano para inhibir el crecimiento
de células cancerosas no está relacionada con mutaciones de r53 / r21
o Rb-, deleción de p16, estabilidad de Fas, ausencia de sobreexpresión
de caspasa-3 o P-glicoproteína .
Es interesante que la acción antiproliferativa hacia las células
tumorales podría ser mostrada por el hialuronano con un amplio
rango de peso molecular. Los experimentos in vitro demostraron que
a concentraciones superiores a 0,32 mg / ml, las fracciones de
hialuronano con un bajo peso molecular
de peso (por debajo de 5600 Da) y con alto peso molecular (por encima
de 1 200 000 Da), ambos inhibieron la proliferación de células de
melanoma hasta en un 50-90%. Estas son las células del melanoma de
rata altamente maligno, que expresan el receptor CD44. Se
presentaron otros datos controvertidos que exploran el papel del
hialuronano en la proliferación de las células normales. Se encontró
que el HA con un peso molecular de 1300-4500 Da (3 a 10 unidades de
disacáridos) provoca la proliferación de células endoteliales. Este
fenómeno se correlacionó con un aumento del contenido de proteína
quinasa.
Por el contrario, un polisacárido con un peso molecular en el rango de
400 000-1 000 000 Da inhibe la proliferación de células endoteliales
normales. En varios estudios se demostró que el hialuronano modula la
proliferación celular en varios tipos de células normales. La inconsistencia
de los resultados, que podría encontrarse con bastante frecuencia en el
análisis de los datos publicados sobre el efecto de la HA en los diferentes
procesos celulares, puede estar relacionada con diferencias en la expresión
de los receptores de hialuronano, la presencia de impurezas, la molecular
dispersión ponderal y fuente de este polisacárido. No obstante, es posible
decir que el HA con un peso molecular de 500 000 a 750 000 Da aumenta la
actividad de agentes anticancerosos como el 5-fluorouracilo, el cisplatino y el
tamoxifeno.
También se encontró que el hialuronano actúa tanto como aditivo como
sinérgico con los fármacos contra el cáncer [83]. Esto insinúa que el
hialuronano tiene un potencial significativo en el ámbito del desarrollo de
fármacos contra el cáncer como agente quimioterapéutico, aditivo de los
agentes contra el cáncer y como refuerzo de los fármacos contra el cáncer .
Se pueden observar propiedades adicionales de HA en complejos con varios
cationes metálicos (zinc, cobre, plata, oro, etc.). Se demostró una actividad
similar para el hialuronano en composición con agentes antivirales,
inmunoestimulantes y antibacterianos . Se demostró que el hialuronano
aumenta la síntesis de interferón por las células T y los monocitos, que son
los principales inductores de interferón [91,92].
Composición de HA con ARN - inductor de interferón (0,15% de ARN

y 1% de HA) es el mayor activador de interferón en los animales. Es
probable que el mecanismo de acción esté relacionado con el hecho
de que la macromolécula de polisacárido bloquea algunos factores
inflamatorios moleculares como CD44 y RNAMM [93,94], tiene algunas
propiedades antitumorales [81] y activa el metabolismo y la
proliferación de células normales. También es un posible efecto
directo del biopolímero sobre la síntesis de interferón por linfocitos y
monocitos a través de la activación de CD44 en estas células [91].
Se han descrito muchas funciones para el receptor de proteína
principal CD44, que une HA de la matriz extracelular con la superficie
celular [95,96]. La transmembrana
glicoproteína CD44 contiene ectodominio en la superficie de
la membrana citoplasmática, otro dominio que se localiza en la
membrana y el dominio intracelular. El ectodominio une HA a la
matriz extracelular, un proceso que ocurre con más de una molécula
de CD44 y cuando la longitud de la parte de unión de la
macromolécula es de más de 20 monómeros. Se encuentra que el
ectodominio de CD44 puede escindirse proteolíticamente mediante
metaloproteinasas unidas a la membrana .
La escisión del ectodominio CD44 conduce a la liberación de células
que se han unido con hialuronano, que es la forma en que se regula la
migración celular. La inhibición de la escisión conduce a la inhibición
de las células tumorales que migran sobre un sustrato de HA. Es
posible que la fragmentación del hialuronano asociado con la
hialuronidasa CD44 secretada por las células cancerosas abra vías de
migración y metástasis de las células cancerosas. Los biopolímeros
introducidos de forma exógena pueden inhibir estos procesos. Se
confirmó experimentalmente un aumento de las metástasis
pulmonares después de la inyección de células de carcinoma. Este
fenómeno está relacionado con la actividad de la matriz.
metaloproteinasa-9, que promueve la degradación del colágeno IV y,

por lo tanto, media una invasión de las células tumorales.
El receptor CD44 puede unirse a metaloproteinasa-9 fuera de un motivo de
unión a hialuronano en áreas sensibles a la hialuronidasa y reclutarla en la
membrana (función de plataforma). Escinde el ectodominio CD44 solo
después de la unión al ectodominio de HA y se ha producido la
internalización. Se observó que en las células tumorales, que son capaces de
unir HA con CD44, se ralentiza la migración celular y se reduce el
crecimiento metastásico. En tal situación, la unión de HA con CD44
probablemente previene la apoptosis de las células tumorales. Se cree que el
CD44 desempeña un papel fundamental en la metástasis de las células
tumorales, pero no en el inicio de la carcinogénesis [90,96].
6.5 El papel del hialuronano en la curación de heridas
El hialuronano tiene una serie de propiedades que lo distinguen

favorablemente de muchos otros productos utilizados para curar
heridas. Es decir, el HA no tiene acciones alergénicas ni irritantes, pero
puede proporcionar efectos tanto antiinflamatorios como
bioestimulantes y acelerar los procesos de regeneración. Estas
propiedades de HA, en combinación con otros fármacos, se utilizan
para acelerar la curación de quemaduras, úlceras tróficas y
procedimientos quirúrgicos. La curación de las heridas cutáneas está
directamente relacionada con un aumento de HA durante los primeros
tres días y una disminución al nivel inicial al séptimo día después de la
lesión. En el apósito quirúrgico, el polisacárido se usa como producto
primario de cicatrización de heridas y en combinación con otros
agentes.
La película en la base del HA oxidado demostró capacidad para
acelerar la cicatrización de la sutura (de las anastomosis intestinales
de alto riesgo . También se puede utilizar para cerrar la membrana
serosa defectuosa y para la profilaxis de la perforación intestinal
durante la laparoscopia [97,98]. El hialuronano se utiliza para el
tratamiento de las úlceras de estómago y duodeno. La acción
antiulcerosa de HA está relacionada con su capacidad para inhibir los
receptores de histamina H2 y la actividad de la tripsina [61]. Debido a
la capacidad de los fragmentos de bajo peso molecular de El HA para
penetrar la barrera epidérmica de la piel, se utiliza como
transportador de compuestos bioactivos. Según algunas fuentes, solo
los fragmentos de HA con una masa molecular de 400 kDa pueden
penetrar a través de la piel [99]. Cuanto más pequeños son los
fragmentos de la macromolécula de polisacárido cuanto mayor sea la
tasa de permeación [76,99,100].
Como se mencionó anteriormente, el hialuronano es un biopolímero de
alta tasa de rotación. Su vida media en la piel es de unas 24 h. Cualquier
cambio en los procesos de renovación de hialuronano (tasa de la relación de
síntesis: descomposición) podría provocar el desarrollo de patologías.
Cuando el tejido está dañado, el hialuronano existente se descompone, lo que
da como resultado la aparición de fragmentos de oligosacáridos que
participan en la formación de una matriz extracelular temporal. Al mismo
tiempo, la síntesis y acumulación de hialuronano se induce rápidamente en
el área de daño tisular mediante la activación de genes y diferentes
hialuronatos sintasas. Esto sugiere que la macromolécula es un participante
activo de los procesos de reparación del tejido dañado.
La cicatrización de heridas es un proceso dinámico que consta de
tres fases superpuestas: inflamación, proliferación y maduración
(reestructuración).
1. En la primera etapa (etapa de inflamación), el proceso principal es la
formación de un coágulo de sangre para detener el sangrado. El coágulo
de sangre es una matriz temporal que consta de proteínas como fibrina y
trombocitos sanguíneos. Los coágulos se forman a partir de sangre como
resultado de vasos sanguíneos dañados. Las células inflamatorias migran
hacia el coágulo. Durante el siguiente
descomposición de los trombocitos, se liberan varios factores de

crecimiento diferentes, pero en la descomposición de la fibrina por
las proteasas, aparecen varias moléculas señal (polipéptidos). Los
polipéptidos atraen neutrófilos, monocitos y fibroblastos. Incluso en
las primeras etapas, se nota un aumento de la concentración de
hialuronano, que se une a la red de fibrina formando una matriz de
transición. Interactúa con las células mediante el uso de receptores y
una gran cantidad de proteínas, a saber, proteoglicanos para formar
"tamices" densos. Su matriz de dispersión forma pequeños túbulos
para la difusión selectiva de moléculas solubles en agua . La
macromolécula de HA contiene regiones hidrófobas que se repiten
regularmente, lo que permite la interacción entre las membranas
celulares y las estructuras de la matriz. Al mismo tiempo, se activan
las enzimas de la matriz extracelular. Estas enzimas catalizan la
descomposición de proteínas y polímeros de polisacáridos en
fragmentos de menor peso molecular y nuevas funciones. Estos
fragmentos de proteínas y polisacáridos participan en la formación
de la matriz de transición. Las propiedades estructurales y
funcionales de las diferentes formas de matriz de transición parecen
ser diferentes. Es posible ver dos fases principales de la matriz de
transición: gel y cristales líquidos. El HA de alto peso molecular,
cuando se inserta en la red de proteínas, crea una matriz similar a
un gel . Los polipéptidos y HA fragmentados pueden formar
estructuras similares a los cristales líquidos. Las estructuras de
cristal líquido tienen una movilidad mucho mayor, lo que facilita la
migración celular hacia una herida. En respuesta a la acción de
factores de crecimiento y sistemas de señalización, se inicia una
migración y proliferación de fibroblastos de dermis adyacentes a la
herida. En un organismo adulto, la proliferación de fibroblastos
precede a la síntesis de colágeno (capítulo 2).
2. En la segunda fase (etapa de proliferación o etapa de fibroblastos o etapa
de tejido de granulación), continúa la síntesis activa y la descomposición
de hialuronano y proteoglicanos. Esta etapa prosigue con la participación
activa de metaloproteasas, un grupo de enzimas de la matriz cuya
actividad depende del zinc. La parte principal del zinc corporal se
encuentra en la piel. Las metaloproteasas catalizan la descomposición de
las moléculas de la matriz extracelular. Se desconocen sus mecanismos de
activación en la matriz extracelular. Se cree que en pocos casos la
activación de las enzimas se produce mediante autocatálisis. Como
resultado, se elimina el polipéptido de proteasa N-terminal .
Simultáneamente, las células secretan inhibidores de metaloproteasas. La
profundidad de la destrucción de las estructuras de la matriz extracelular
y la creación de la matriz temporal depende de la interacción de los
activadores e inhibidores. En última instancia, afecta la remodelación del
tejido dañado. La segunda etapa de la cicatrización de la herida se
caracteriza por la proliferación activa de fibroblastos, síntesis de gran
cantidad de hialuronano y colágeno nuevo. Los fibroblastos del colágeno
adulto sintetizan predominantemente colágeno tipo I. Curiosamente, los
fibroblastos embrionarios en las primeras etapas del desarrollo fetal
producen más tipos de colágeno III y ΙV. De manera similar, el contenido
de colágeno tipo III es más alto que el colágeno tipo I en las heridas que
cicatrizan. La justificación podría ser la siguiente. Muchos factores de
crecimiento y nuevos fragmentos de señales, formados en la
descomposición de HA y proteínas, inician la migración de células madre
(mesenquimales) hacia una herida. Dentro de la herida se diferencian en
fibroblastos "jóvenes" que probablemente no están limitados por el
número de Hayflick, se dividen rápidamente y producen una cantidad
significativa de colágeno tipo III y IV similar a los fibroblastos
embrionarios. Al mismo tiempo, se forma una nueva matriz extracelular,
más cercana a la organización estructural y funcional de la matriz fetal.
Un papel importante en la cicatrización de las heridas cutáneas es la
membrana basal, que crea una plataforma para la migración celular y
acelera la proliferación de las células epiteliales (epitelización de la
herida). Las heridas de la piel cambian el
composición química de la membrana basal. Por ejemplo, aumenta

la cantidad de fibronectina, lo que promueve la migración celular
de manera similar a la HA.
3. En la tercera etapa (maduración, envejecimiento y reconstrucción o
reorganización), cuando se forman gránulos y aparece un exceso de
matriz de colágeno, el número de células se reduce por apoptosis
[101]. El exceso de hialuronano se despolimeriza y los fragmentos
cortos de las macromoléculas de polisacárido estimulan la
angiogénesis (un brote de vasos sanguíneos en la matriz
extracelular [82]). La matriz temporal es destruida por las
hialuronidasas y metaloproteasas de la matriz en un proceso que
es, esencialmente, una remodelación de la matriz temporal. La
hialuronidasa no solo hidroliza el HA sino que también escinde el
sulfato de condroitina de los proteoglicanos. En el estado libre, los
glicosaminoglicanos sulfatados exhiben propiedades únicas:
reducen la actividad de las hialuronidasas y enzimas proteolíticas
en la matriz extracelular, bloquean la síntesis de mediadores de la
inflamación enmascarando los determinantes antigénicos y
cancelando la quimiotaxis, disminuyen la actividad de los radicales
libres, previenen la apoptosis celular, inhibe la síntesis de lípidos y
previene los procesos de degradación en la cicatrización. Los
interferones, que son producidos por linfocitos T, leucocitos y
fibroblastos, reducen la tasa de síntesis de colágeno. Es probable
que se atribuya la misma función al hialuronano [102]. Como
resultado de tal verdad de proceso, se alcanza el equilibrio.
Se podría concluir que los procesos de regeneración de tejidos y

órganos pasan por etapas de estimulación de las células diferenciadas
a proliferación, migración y nuevamente a etapa diferenciada. El
hialuronano de diferentes pesos moleculares es importante para cada
etapa del ciclo de remodelación. Su función no se limita a hidratar la
superficie de la herida. HA participa en la remodelación de la matriz
extracelular, los procesos de diferenciación, proliferación y migración
de las células y el establecimiento de nuevos equilibrios acuoso e
iónico. Por eso, en la práctica médica, una de las principales
aplicaciones del hialuronano es la aceleración de la cicatrización de las
heridas, especialmente en las quemaduras [102]. HA es
extremadamente eficaz para la reconstrucción de la epidermis dañada.
Se encontró que la capa granular y la capa interna contienen más
ácido hialurónico que las capas superiores de la piel. Las
macromoléculas de polisacáridos de alto peso molecular son incapaces
de penetrar la capa córnea superior (queratinosa) de la epidermis. Por
tanto, su papel en la aplicación tópica en solución o cosmética se limita
a la formación de la red molecular que une la humedad atmosférica y
reduce la evaporación a través del estrato córneo de la epidermis,
manteniendo así la hidratación de la piel. Los estudios experimentales
mostraron que después de la destrucción de la barrera epidérmica con
acetona, el HA se acumula en la epidermis entre la base y el estrato
espinoso (capa espinosa) [103]. En respuesta a una lesión, la epidermis
se vuelve más gruesa de lo habitual. Esta es una respuesta adaptativa
que conduce a la reducción de daños adicionales. Por tanto, la
hiperplasia de la epidermis por irradiación UV reduce el efecto dañino
de la radiación. Sin embargo, para enfermedades como el eccema y la
psoriasis, la hiperplasia es parte del proceso patológico. El manejo de
los procesos epidérmicos podría ser un nuevo enfoque para el
tratamiento de estas enfermedades.
La membrana basal tiene un papel importante en la regeneración de
las heridas de la piel y otros tejidos y órganos. Crea una plataforma
para la migración de células y cambia la arquitectura del tejido
dañado. En la membrana basal de la piel, la composición química se
modifica mediante la adición de fibronectina, que, como hialuronano,
acelera la migración celular.
Nuestra comprensión generalizada de la regeneración de la piel
todavía deja preguntas para debatir. Al mismo tiempo, es evidente que
la piel humana es uno de los indicadores de salud y la HA es
uno de los principales factores para su conservación y buen estado.

Los estudios experimentales en esa dirección ya han dado como
resultado una serie de productos importantes [11] y es muy probable
que conduzcan a la creación de nuevas composiciones terapéuticas y
cosméticas basadas en hialuronano [104].
6.6 Hialuronano en inmunología
El sistema inmunológico está conectado con HA [91-94]. El hialuronano se

incluye en los medicamentos que se utilizan para el tratamiento complejo de
las condiciones inmunodeficientes asociadas con enfermedades virales. A
nivel molecular, el mecanismo de acción del biopolímero está relacionado
con el bloqueo de varios factores moleculares de inflamación [93]. Por un
lado, el hialuronano activa la inferonogénesis, pero por otro, aumenta la
acción del inductor del interferón (p. Ej. , ARN bicatenario ) [91,92]. El
interferón es producido principalmente por los monocitos activados y
las células T del sistema inmunológico. Las interleucinas 2 y 5 (IL-2, IK-5)
juegan un papel importante en la activación de las células T que, a su vez,
activan la síntesis de hialuronano por las células capilares endoteliales.
Luego, el hialuronano estimula la síntesis de los receptores CD44, que es el
evento clave para la activación de los linfocitos y monocitos [93]. El HA se
utiliza solo o en combinación con interferón para ralentizar el desarrollo de
la infección por el virus del herpes simple mediante su aplicación sobre el
epitelio infectado [61]. La obvia acción antimicrobiana del HA puede
lograrse mediante su reticulación con polímeros hidrófilos, que son capaces
de acelerar la penetración a través de las membranas celulares o los espacios
intercelulares [61].
Recientemente, se han considerado varias otras aplicaciones del

ácido hialurónico en la ciencia y la práctica farmacéuticas y son
altamente prospectivas, como la aplicación de HA como un sistema de
administración de fármacos para aumentar la eficacia del fármaco,
prolongar su acción, reducir los efectos secundarios, etc. Sin embargo,
este es un tema muy amplio que podría abordarse en la monografía
separada.
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Conclusión
Información significativa sobre la estructura química, características

macromoleculares,
Las propiedades biológicas y la aplicación médica del hialuronano se
han acumulado en la literatura internacional. La comprensión de los
mecanismos moleculares del ácido hialurónico en el cuerpo aún es
limitada, pero está claro que ha jugado un papel crucial en el
desarrollo histórico (filogenicidad) de los cordados y la ontogenicidad
de los vertebrados superiores modernos. Forma parte de los
principales tipos de sustancia intercelular del tejido conjuntivo, está
presente en grandes cantidades en el cuerpo vítreo del ojo, líquido
sinovial de articulaciones, oviductos, gelatina de Wharton del cordón
umbilical, piel, paredes de arterias y venas, válvulas cardíacas, la
membrana basal glomerular de los riñones, etc.
Desde el descubrimiento del hialuronano, ha habido una evolución
significativa de las opiniones sobre este biopolímero. El polisacárido
se consideró inicialmente como un componente estructural pasivo de
la matriz extracelular. Sin embargo, ahora se ha hecho evidente que
está involucrado dinámicamente en muchos procesos biológicos,
desde la modulación de la reproducción, la migración y diferenciación
celular durante la embriogénesis, hasta la regulación de los procesos
de inflamación y cicatrización de heridas y metástasis de células
cancerosas. El hialuronano tiene múltiples funciones fisiológicas en el
cuerpo. Es la base del funcionamiento del sistema mucolítico
(hialuronano - hialuronidasa) que determina, en particular, la
permeabilidad del tejido y el sistema circulatorio vascular, la
resistencia a la penetración de infecciones y la filtración de sustancias
en los riñones. El hialuronano actúa como una estructura que forma
compuestos y almacena agua en la matriz gelatinosa de la matriz
extracelular. Esta función proporciona soporte mecánico, turgencia
tisular, resistencia a la presión de compresión y determina las
propiedades amortiguadoras y antifricción del líquido sinovial de las
articulaciones. El hialuronano participa en la fertilización de los
ovocitos, así como en su división, migración, mantenimiento de las
células en el estado de diferenciación y transiciones de las células
diferenciadas al ciclo celular y viceversa. Hyaluronan participa en el
funcionamiento de los sistemas de señalización celular.

194 Conclusión
Una variedad tan amplia de propiedades biológicas del hialuronano

son, en primer lugar, funciones de peso molecular, polimorfismo de las
diferentes formas estructurales, propiedades fisicoquímicas de
moléculas de diferente peso molecular y el entorno iónico y la
concentración del biopolímero en tejidos y órganos. Tras la escisión de
las macromoléculas de polisacáridos, se forman las diferentes
estructuras polimorfas con diferentes estructuras y propiedades
funcionales. Los fragmentos formados tienen funciones y propiedades
amplias y a menudo contradictorias. Las cadenas cortas de
biopolímeros a menudo se comportan como "señales de alarma",
mientras que los fragmentos más largos actúan como disparadores de
los sistemas de señalización. Por ejemplo, los tetrasacáridos inducen
proteínas de choque térmico que supuestamente curan el daño celular
e inhiben la apoptosis, lo que conduce a la muerte celular. Las
propiedades biológicas similares de los productos de degradación del
hialuronano, que ayudan a la preservación celular, representan el
brillante ejemplo de la extensión del principio de Le Chatelier a los
sistemas biológicos. Tales propiedades confirman la validez del
concepto de que los productos de degradación de los biopolímeros
promueven la restauración y / o preservación de la homeostasis del
sistema y pueden usarse como factores de control del proceso
regenerativo en el ambiente en el que están presentes. Por lo tanto,
esta es una forma natural, mediante la cual podría desarrollarse una
estrategia para el uso médico de productos conocidos basados en
hialuronano y podría crearse la nueva generación de productos
terapéuticos.
En este libro hemos intentado considerar muchas cuestiones con
diferentes grados de complejidad e integridad del material
presentado. Parece que al elegir un problema en particular, por
ejemplo, el papel biológico del hialuronano, podríamos proteger al
lector de la variedad inagotable de otras áreas de conocimiento y
datos no menos interesantes pero sin embargo diferentes. Sin
embargo, utilizamos intencionalmente un enfoque multidisciplinario,
siendo conscientes de que algunos problemas se describen de manera
superficial y requieren una dirección en la literatura especial
adicional.
Nos damos cuenta de que este libro presenta más preguntas que
respuestas. Debería servir sólo como una introducción al mundo
infinitamente interesante y todavía en gran parte desconocido de esta
macromolécula verdaderamente asombrosa que enfrentan los
biólogos, médicos, físicos y químicos. Por eso, nos gustaría terminar el
libro con las palabras del famoso profesor israelí Shlomo Sand:
… Es un hecho conocido: permanecer fuera de una esfera específica
del estudio y equilibrar las fronteras que dividen las distintas esferas
puede, en ocasiones, permitir la aparición de una visión no estándar
de las cosas y revelar vínculos inesperados entre ellas. Muy a menudo
es pensar 'afuera' en lugar de 'adentro' lo que puede enriquecer la
mentalidad científica, a pesar de todas las debilidades asociadas con la
falta de especialidad ...
Índice
Acrosoma 23, Carnitina (ver Vitamina B T )
24 163-165 Cartílago 10, 24, 28, 31, 33,
Adrenalina 34, 36, 48, 49, 60,
54 61, 63, 65, 66–67, 78, 84, 105,
Medicina estética 123, 129, 170, 172–176, 180
143,154 Agregado 48, Caspasa 38, 181
65, 66, 173 Catepsina B 179, 180
Envejecimiento 158 Diferenciación
Albúmina 39 celular 34, 41
Alginato 126 Migración celular 28, 33, 56, 57,
Alfa-D-glucanos 176, 182, 184, 185 Proliferación
9 Líquido celular 19, 24, 27, 53–55,
amniótico 78 62, 63, 169, 177, 179, 180,
Amplificación 182 Celulosa 10, 12, 18, 19,
16, 179 20, 21, 22,
Amilopectina 9, 79, 81, 124, 129 Cloruro
19 Amilosa 9, 19 de cetilpiridinio 80, 81, 83
Andrógenos 54 Flexibilidad de la cadena
Angiogénesis 22, 38, 39, 44–48, 85, 100 Reticulación 12
150, 151, 177–179, 185 Quitina 10, 11, 12, 14,
Anión 16–21 Quitosano 89,
radical 129 Colesterol 55
Ankirin Condrocitos 31, 33, 34, 36, 48,
Antioxidantes 160, 164, 176 65, 66, 170, 172, 173, 174,
Apoptosis 22, 23, 33, 38, 41, 43, 44, 175, 180
49, 50, 53–55, 172, 179–181, Condroitín sulfato 9, 31, 36,
183, 185, 194 46–49, 53, 66, 171, 173, 175,
Ácido araquidónico 176, 181, 185
173 Artritis 4, 38, Cordados 16, 63, 65, 193 Cromatina
173, 175 13, 39, 40, 43, 180, 181
Fosfato de ascorbilo (ver Cromatografía 81, 83, 84, 88, 89, 91
vitamina C) 162 Hidrógeno Cromosomas 16, 26, 34, 39, 40, 177,
atómico 178, 181 Ácido cinámico 129
Síntesis bacteriana 5 Cisplatino 182
Colágeno 16, 17, 21, 25, 26, 28, 29,
31, 32, 33, 34, 42, 44, 45, 48, 49,
b b l
Membrana basal 60, 180, 51, 53, 61, 65, 66, 67, 83, 150,
184, 185 Bastula 157 , 160, 161, 164, 165, 166,
Basófilos 61 168, 172, 173, 174, 178, 179,
Beta-D-glucanos 180, 183, 184, 185
9, 22 Reactivos Química coloide
bifuncionales Microscopía
Biglycan 66 confocal 26
Biorreguladores 53, 161, 162, 164, Estados conformacionales 52, 98,
165, 168, 169 Biorrevitalización 150, 100, 102, 168 Proteína central 45,
151 48, 49, 50, 66, 173 Cumarina 129
Yunque bridgman 130, 131 Coxartrosis 170,
176 Líquido de
Células cancerosas 43, 44, 177, 181, 182 cultivo
Carbodiimida 124-126
Carboximetilcelulosa 124, 135
Carcinógenos 37, 180

196 Índice
Cicloheximida 41, 43 Fertilización 6, 22-24,

Cisteína 57, 159, 160, 163, 45, 193 Fibrinopéptido
164, 174 Citocromo C 11 11
Citocinas 59, 62, 170, Fibroblastos 24-26, 33-35, 42, 43,
173, 174 Citomedinas 47, 55, 60, 65, 150, 161, 164, 166,
168 167, 173, 181, 184, 185
Membrana citoplasmática 3, Fibromodulina 66
22, 34, 40, 43, 54, 61, 62, Fluidez 57, 105, 106, 110,
64 122, 146 Fluoresceína 26
Citopoyetinas 5-fluorouracilo 182
Ácido fólico (ver Vitamina B9) 162,
Decorin 59, 164, 165, 168 Células foliculares 22,
66 23
Destrucción Formaldehído 125, 126
de hialuronano Radicales libres 3, 43, 50, 85,
86, 88 enzimático
88, 150, 151, 154, 155, 158,
85 oxidativo 137,
157 166, 175, 185
radiación-química Radiación gamma 3, 53,
135 89, 134 Gastrulación 22,
Células dendríticas 85 25, 27
Despolimerización de Gene
hialuronano 86, 88 Dermatan c-myc 37, 39,
sulfato 10, 27, 47, 50, 67, 87 43 c-fos 37,
Dermis 60, 65 39, 57 c-jun
Desmosomas 60 37, 39, 57
Diglicidil éteres 131 P53 37, 39, 43, 178,
Constante de 179 Geoquímica 14
disociación 168 Estructura globular
Divinilsulfona 126, 127, 21
144 Glucosamina 1, 5, 10, 12, 14, 15, 18,
ADN 11, 14, 16, 17, 34, 36, 38, 39, 53, 19, 21, 30, 33, 36, 47, 48, 58, 64,
58, 89, 92, 100, 155, 170, 177, 178, 86, 88, 97, 98, 137, 169-171,
179 174, 175
Duplicación 16, 17, 42 Glucosa 5, 12, 15, 18-20, 45, 89, 98,
104, 177 Glutamina 65, 169, 170
Módulo de elasticidad 123 Glutaraldehído 126
Elastina 65, 89, 150, 161, 164, Glutatión 155, 156, 158, 159, 160,
165, 168 Microscopía 163, 164 Glicerol 89, 127
electrónica 22, 97 Glicobiología 3 Glucógeno 9,
Embriogénesis 6, 22, 24, 27, 18, 19, 20
28, 33, Glucosaminoglicanos 1, 2,
45, 62, 63, 193 9–11, 15, 16,
Endocitosis 3, 27, 37, 41, 45, 19-21, 23, 25, 28, 31, 33, 34, 36,
53, 54, 55, 62, 64, 65, 169, 44, 45, 48, 50, 53, 57, 61, 63, 64,
179 66, 83, 84, 100, 101, 160, 161,
Células endoteliales 3, 37, 38, 46, 47, 164, 165, 170, 174, 175, 178, 185
53, 177, 181 Endotelio 38, 47 Enlace glucosídico 12, 18-21,
Enzimas 2, 5, 6, 15, 17, 18, 22, 24, 97, 98, 134, 135, 157
28, 31, 33, 38, 45, 48, 49, 50, 51,
Glypican 59
54, 55, 56, 58, 61, 62, 78, 81 , 82,
83, 84, 86, 87, 88, 104, 164, 165, Aparato de Golgi
174, 175, 177, 178, 179, 180, 184, 45 Gonartrosis
185 170, 176
Granulocitos 48
Enzimología 6
Epidermis 5, 41, 42, 60, 63, Principio de Hayflick
65, 78, 156, 165, 170, (límite) 44 Proteínas
185 de choque térmico
Epigénesis 62 194 Hemoglobina 11,
Estrógenos 54 16
Etilendioxi-bis-1,2-propanodiol Heparán 10, 28, 46, 59, 101,
149 Células eucariotas 5, 13, 14, 180, 181 Heparina 10, 47,
i i i
16, 17, 22, 43, 45 Exocitosis 20, 22, 135, 175 Hepatocito 26, 36-39,
64, 179 Matriz extracelular 4, 16, 41, 43 Hexoquinasa 177
19, 20, 22, 25 , Hexosamina 29, 31, 32, 87, 92
26, 27, 33–36, 38, 39, 42, 44,
45, 50, 52, 53–56, 58–66, 101, Homeostasis 42, 44, 51, 52, 62, 143, 174, 194
106, 108, 157, 160, 165, 166,
172–175, 177– 180, 182–185,
193
Proteínas extracelulares 26, 48
Índice 197
Hormonas 46, 47, 53, 54, 55, 104, Líquido-cristalino 50, 42, 106, 107
168, 178 Hyaladherinas 6, 65 Biorreguladores de bajo peso
Cartílago hialino 78, 173 molecular 161, 162, 168
Macrorradical hialurónico 136 Lumican 66
Hialuronano sintasas (HAS) 16, 21, Liofilización
45, 63 Ácido hialurónico 1, 3, 7, 9, 79-82, 88 Lisina
20, 22, 33, 61, 77, 163, 164
78, 80, 82, 84, 88, 105, 106, Lisis 23, 39
107, 121, 124, 125, 127, 131,
132, 133, 150, 153, 160, 171, Lisosomas 27, 41, 165,
175, 186, 193 179 Lisil oxidasa 165
Hialuronidasa 2–6, 17, 24, 26, 27, Macrófagos 42, 44, 56,
30, 31, 39, 41, 44, 46–48, 50–52, 61 Matriz de tejido
58, 84, 85–88, 92, 125, 163, 165, conectivo 165 Asimetría
173, 177 178, 182, 183, 185, 193 de membrana 63 Malla
Electrón hidratado 134, 135 99
Radio hidrodinámico 109
Células mesoteliales 29, 37
Hidrogeles 122-124, 126, 128,
129, 146 Hidrólisis Mesoterapia 127, 143, 165
Metaloproteinasa 57
ácido-base 88
enzimático 78, 81, 86, Metástasis 39, 182 Metionina
88, 149 Hidroxiapatita 66 158-160, 163-165
Radical hidroxilo 134, 137, Microimplantes 127, 143, 144,
155-157, 159, 160, 164 148-150 Mitosis 25, 26, 37, 42
Hiperplasia 183 Moesin 57
Peso molecular 1, 11, 19-22, 24-26, 35, 37-39,
Inmortalización 178, 180 44-48, 50-52, 54, 55, 57, 58, 62, 66, 78, 80,
Cosmetología inyectable 84-89, 91, 92, 101–105, 107–110, 113,
143, 150, 161 Insulina 55 116, 122, 123, 129, 134, 135, 137, 147,
Interferón 182, 185, 186 150–152, 154, 157, 161, 162, 168–173,
Fuerza iónica 3, 88, 102, 106, 107, 175, 176, 177, 181–185, 194
108, 127 Radiación ionizante 3, 37,
134 Distribución del peso
Iones de molecular 85, 88, 91, 129,
calcio 21, 51, 56, 60, 64, 67, 78, 152, 154, 173
127, 172 potasio 19, 37, 51, 60, 64 Morfogénesis
cloruro 79-84, 89, 101, 10 Fibra
108, 109 cobre 78, 88, 89, mucosa 77, 90
127, 165, 182 hierro 78, 83, Mureína 14, 19
88 Mutagénesis 85
litio 115 Mutágenos 180
magnesio 21, 47, 51, 64, 101, 162 Mutaciones 11, 16, 34, 42,
fosfato 15, 36, 37, 52, 54, 56, 60, 64, 43, 181 Miofibrillas 42
67, 78, 80, 83, 88, 158, 159,
162, 169, 171, 172 Necrosis 26, 53, 174
sodio 21, 37, 51, 60, 64, 78, Ácidos nucleicos 11, 12, 78, 79,
79–84, 88, 89, 100, 101, 82, 83, 89, 92, 103, 106, 114,
107–109, 113, 124, 126, 132,
158–160, 162, 171, 175 170
sulfato 1–3, 9, 10, 20, 21, 25, 27, Oligosacáridos 24, 39, 45–48,
28, 31, 33, 34, 36, 38, 45, 46–49, 52, 53, 56, 85–88, 92, 102,
53, 59, 61, 64, 66, 67, 83, 84 , 87, 104, 134, 181
89, 92, 101, 135, 164, 165, 170, Ontogénesis 13-15, 22,
171, 173-176, 180, 181, 185 28, 48 Oftalmología 4, 82,
zinc 127, 165, 182, 184 125, 176 Orden de
orientación 105
Queloide 43 Osteoartritis 170, 171,
Keratán 10, 28, 38, 49, 66, 67, 101, 135, 173-175 Osteoblastos 28,
61 Osteoclastos 28, 172
173
Ovoalbúmina 79, 90
Principio de Le Chatelier Oxitocina 168
49, 53, 194 Liposomas 6
Papaína 30, 78, 79, 81, 83, 88
Pepsina 47, 50, 78, 81
198 Índice
Péptidos (polipéptidos, oligopéptidos) 49, 50, UV 3, 12, 82, 83, 128, 13

53, 55, 81, 82, 84, 91, 106, 114, 143, 155, 156, 185
158, 161, 163, 164, 168, 184 EPR 134, 136
Pericondrio 172 Almidón 12, 18, 19, 20
Oxidación de periodato 12 Células madre 42
Células permanentes 41 Esterilización de hialuro
Fenilalanina 90 Estructura supramolecu
Ésteres de forbol 55 Hinchazón 6, 21, 122, 12
Fosfodiesterasa 56 Líquido sinovial 21, 60, 7
Foto-reticulación 128
Filogénesis 9, 13, 14, 63 Tamoxifeno 182
Fitohormonas 104 Taurina 164
Ácido picolínico 169 Telómeros 39, 40, 178
Gel de poliacrilamida 88, 145 Thionil-bis-etanol 149
Polielectrolitos 3, 105, 106, 123, 152 Trombospondina 179
Polietilenglicol 123 Hormonas tiroideas 54,
Reacción en cadena de la polimerasa 28 Virus del mosaico del tab
Polioxietileno 145 Tocoferol (ver vitamina
Polirribosomas 43 162, 164
Células procariotas 13, 17 Azul de toluidina 89, 101
Prolina 163, 164 Permeabilidad transcutá
Pronase 78, 81, 90 Proteína transmembran
Proteína quinasa C 37, 55, 57, 181 Transposición 17
Proteoglicanos 20, 31, 34, 37, 45, 48, 49, Úlcera trófica 183
53, 59, 62, 64–67, 108, 165, 172–176, Tripsina 26, 47, 78, 81, 88
180, 184, 185 Triptófano 89, 90
Protooncógeno 37, 178-181 Células tumorales 39, 44
Radiólisis de pulsos 134, 135 Turgencia 21, 193
Tirosina 57, 58, 59, 90, 16
Química de la radiación 134
Radiobiología 134 UDP-acetilgalactosamina
Radiólisis 3, 12, 134-137 UDP-glucosa 5
Radioterapia 134 UDP- ácido glucurónico
Radio de giro 108, 109 Ácido UDP-idurónico 36
Receptor UDP-N-acetil glucosamin
CD44 3, 6, 22, 26, 34, 35, 41, 46–59, 62, Ácido urónico 1, 2, 87
168, 169, 172, 176, 181–183, 186 Irradiación UV 12, 150, 1
RHAMM 3, 26, 47, 53–55, 62, 161, 181
TLR2 56 Vasopresina 46, 168, 169
TLR4 56 Vesícula 41, 45, 55, 64, 10
Retinol (ver vitamina A) 162 Vitamina A 162
Riboflavina (ver vitamina B2) 162, 164, 165, 168Vitamina B2 162
ARN 28, 37-39, 46, 47, 63, 89, 92, 104, 177, 182 Vitamina B9 162
Vitamina B T
Serina 33, 49, 50, 57, 58, 65, 66, 165, 174 Vitamina C 155, 159, 162
Módulo de corte 148 Vitamina E 155
Elasticidad de la piel 65, 105, 167 Cuerpo vítreo 1, 10, 78, 1
Modificación en fase sólida 130, 147, 161,
163, 165 Cicatrización de heridas 6,
Spectrin 35, 57 49, 183, 184, 193
Espectroscopia
IR 101, 131, 132, 136 Difracción de rayos X 13
NMR 2, 97, 98, 99, 101, 102, 107, 131,
132, 133, 136
ACUERDO DE LICENCIA DE USUARIO FINAL DE

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2015 Selyanin, Boykov, Khabarov Ácido Hialurónico Preparación

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Ácido hialurónico

Traducido de la versión rusa por el editor cientíﬁco Felix Polyak

Esta edición se publicó por

Datos de catalogación en publicación de la Biblioteca del Congreso

Khabarov, VN (Vladimir N.)

ISBN: 978-1-118-63379-3 (HB)

Ambientado en 10/12 puntos por SPi Publisher Services, Pondicherry, India

Este libro está dedicado a nuestras hijas Daria, Maria y Vasilisa

La naturaleza no es como la imaginas:

FI Tyutchev (poeta ruso)

1 La historia del descubrimiento del ácido hialurónico, fundamental

3 métodos de producción de ácido hialurónico

Encontré este libro muy completo en su descripción y análisis de HA

método prometedor de modiﬁcación del estado sólido del ácido

En 1934, Karl Meyer y John Palmer escribieron en el Journal of

En el momento del descubrimiento del hialuronano, los

Ácido Hialurónico: Preparación, Propiedades, Aplicación en Biología y

1.2 Investigación fundamental

Poco después de la publicación del trabajo original, se descubrieron

La historia del descubrimiento del ácido hialurónico, la investigación fundamental y el uso

y los gradientes de velocidad aumentaron con concentraciones más

1.3 Aplicaciones médicas iniciales

Figura 1.1 Estructura del disacárido 4,5-insaturado , obtenido por escisión de HA

de HA en la práctica médica no ocurrió hasta 1943 durante la Segunda

1.4 Fuentes de hialuronano

Debido a sus crecientes aplicaciones, la demanda de hialuronano ha crecido

La historia del descubrimiento del ácido hialurónico, la investigación fundamental y el uso

La síntesis de HA se encontró, aisló, caracterizó y clonó [23]. Fue la

En la actualidad el hialuronano es objeto de estudio en bioquímica,

La historia del descubrimiento del ácido hialurónico, la investigación fundamental y el uso

1.6 Impacto y direcciones futuras

Han pasado setenta y cinco años desde que se descubrió el ácido

2.1 Filogénesis del ácido hialurónico

Desde un punto de vista evolutivo, HA se considera un polisacárido

Ácido Hialurónico: Preparación, Propiedades, Aplicación en Biología y

Glucosaminoglycan Mol. peso Unidad de disacárido - [AB] - Comentarios

Figura 2.1 Estructura de los principales glicosaminoglicanos

En el sistema moderno del mundo orgánico, los principales grupos

consumir los compuestos orgánicos de alto peso molecular. Estos

polímeros e incluyen el conjunto estándar de monómeros: 20

El papel biológico del ácido hialurónico 13

2.1.1 Estructura de polisacárido y problemas de ﬁlogénesis

Cuadro 2.1 Biogeocronología y evolución de animales cordados

necesitamos determinar el tiempo aproximado de aparición del gen

El papel biológico del ácido hialurónico 15

El desarrollo embrionario conserva algunos rasgos característicos de

Figura 2.2 Biosíntesis de HA, sus precursores de azúcar y otros glicosaminoglicanos a

También es posible que el gen que codiﬁca la hialuronano sintasa se

El papel biológico del ácido hialurónico 17

Los eventos de recombinación juegan un papel importante en la

viejo como la vida misma. Notablemente, las vías de adaptación del

2.1.2 Diferencias físico-químicas y funcionales de polisacáridos

Las largas cadenas paralelas de quitina están dispuestas en

Al igual que el glucógeno, la amilopectina de almidón se compone de

Al considerar el glucógeno y el almidón como ejemplos, se puede

2.1.3 Características bioquímicas del ácido hialurónico y otros

El papel biológico del ácido hialurónico 21

HAS 2 es más activo y sintetiza polisacáridos con pesos moleculares

los animales invertebrados, (4) el HA contribuyó a la evolución de los

Las últimas décadas presenciaron un número creciente de

2.2.1 Papel del ácido hialurónico en la fertilización

El papel biológico del ácido hialurónico 23

Figura 2.3 Participación de hialuronano en la fertilización del óvulo