Francis Crick

James Watson
Métodos de alteración de expresión génica:

Tecnologías de antisentido

Ribozimas

Aptámeros

RNA de interferencia
 Andrew Fire, SiQun X, Mary K. Montgomery, Steven A. Kostas, Samuel E. Driver & Craig C. Mello
Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans
Nature 391, 806-811 (19 February 1998)

Por sus trabajos , Andrew Fire y

Craig C. Mello recibieron el premio
Novel de Fisiología y medicina
2006

C. elegans
Hay dos principales, formas distintas de RNA pequeño interferente:

• Generado a partir de partículas ribonucleicas extrañas.

• Mecanismo de defensa celular para proteger contra los potenciales
efectos deletéreos de elementos genéticos extraños como transposones.

• Codificados por el propio genoma

• Silenciamiento y regulación de la expresión de genes endógenos.
microRNAs (miRNAs)

Small interference RNAs (siRNAs)

o RNA pequeños interferentes transactivador (ta-siRNA)
o RNAs pequeños interferentes asociados a repeticiones
(rasiRNAs)
o Scan RNA (scnRNA)
o siRNA largos (lsiRNAs)

RNAs de interacción con piwi (piRNAs)

21U-RNAs
Los genes de miRNA constituyen en torno al 1% del total de genes
codificados, y forman la mayor clase de moléculas reguladoras.
Transcrito por RNA pol. II

Biosíntesis
• Vía canónica de miRNAs

• Vía no canónica: los mintrones

Los animales han mostrado seguir otro modo de biogénesis de miRNA
donde la secuencia intrónica puede producir miRNAs.
 Regulación de la expresión génica
o Cuidan de forma intensiva las vías de desarrollo lo cual puede ser
conseguido a través de la supresión de la traducción
o Activación de la maquinaria de traducción en determinadas
circunstancias.
o Regulación del grado de compactación de la cromatina
• .
Juega un rol crítico en conferir inmunidad
tanto a animales como a plantas.
 Los miRNA pueden funcionar como
supresores de tumores o como oncogenes.
RNA pequeños interferentes transactivador (ta-siRNA)

RNAs pequeños interferentes asociados a repeticiones (rasiRNAs)

Scan RNAs (scnRNA)

siRNA largos (lsiRNAs)

RNA pequeños interferentes transactivador (ta-siRNA)

o Requieren transcritos endógenos como molde, que son convertidos a dsRNA

por una polimerasa dependiente de RNA (RdRP).
o Probable ser responsable de prevenir a la célula de cualquier evento de
transcripción errónea que pueda afectar a la integridad celular.

Caenorhabditis elegans
RNAs pequeños interferentes asociados a repeticiones (rasiRNAs)

o Generados normalmente a partir de locis de retrotransposones, requiriendo

también de RdRP.
o RasiRNAs juegan un importante rol durante la gametogénesis a través de la
modulación del estado de la cromatina, y el silenciamiento de transcritos
virales a través del reclutamiento de proteínas modificadores de histonas.
• .

Caenorhabditis elegans
Scan RNAs (scnRNA)
Encontrado en el protozoo Tetrahymena thermophyla; participa en la
generación del dimorfismo nuclear

Tetrahymena thermophyla
siRNA largos (lsiRNAs)
• Constituyen la clase de siRNA mas recientemente introducida
• Uno de los lsiRNAs tiene como diana una proteína que confiere resistencia
contra infecciones bacterianas.

Drosophila melanogaster
La tecnología del iRNA mediante el empleo de siRNA permite
diseñar estrategias de knock-out o screenigs genéticos.

• Problema: introducción directa de siRNA transilente.

• Solución: empleo de vectores de expresión diseñados para dirigir la
síntesis intracelular de siRNA.
Silenciamiento transilente

Silenciamiento estable
 RNAs de interacción con piwi (piRNAs)

• La mayoría de las piRNA secuencias fueron mapeadas en regiones del genoma

que previamente se pensaban ser no trascritas.
• Se piensa que se sintetizan por una vía paralela denominada como modelo
ping-pong.
• Realizan múltiples funciones que van desde la programación epigenética y la
represión de la transposición a la regulación post trascripcional además de
promover la estabilidad del mRNA diana y probablemente mejora también su
traducción en determinados contextos.
 21U-RNAs

• Fue identificado en C. elegans, y se caracterizan por tener

exactamente 21 nucleótido de longitud con uridina en el extremo 5´.

• La mayoría estaban mapeadas en regiones intergénicas e intrónicas.

• Puede jugar un posible papel en la estabilidad del genoma, así como

en el splicing, aunque no está clara su función.

• .
• Drosha forma complejo de
500 kDa en Drosophila y
650 en humanos.

• Pasha/DGCR8 confiere
especificidad de corte.
Dicer
• El sustrato del complejo
Drosha/Pasha es un hairpin
con un loop de no menos
de 10 nts.
Forma una estructura
en sándwich αβ
 Constituido por 7
alfa-hélices, dos de
las cuales forman el
centro activo
Reconoce 2´OH y conformación A
Implicada en 10% de
cáncer de estomago,
colon y útero
Posee 6 dominios estructurales:
Dominio dsRBD
• Dominio de unión a RNA bicatenario

DUF283
• Dominio plataforma

PAZ
• Se asocia al extremo 3´ de una de las cadenas de RNA

RNAsa IIIa y IIIb

• Dominios implicados en el clivaje del dsRNA

Dominio DexH helicasa

• Actúa sobre los productos del clivaje
Dominio Dominio
RIIIDa RIIIDb

Hélice
``regla’’

Dominio
plataforma

Dominio
PAZ
Dicer de Giardia intestinalis
 Dominio
RIIIDa
Dominio
RIIIDb

65 A = 25 nucleótidos
Distancia entre PAZ y
RNAsas constituye una
regla molecular
Hélice
``regla``

Dominio
PAZ
• Aprox. 150 aas
• Variable estructural del dominio OB
• En todas las Dicer que procesan miRNA
• El extremo 3´ se ubica en el bolsillo
• Los siguientes nucleótidos se
disponen sobre un surco en
superficie.
Humanos y nematodos
• Biosíntesis de miRNA Requiere TRBP

Una única Dicer

• Biosíntesis de siRNA

4 genes que codifican proteinas

Arabidopsis
similares a dicer

Drosophila

Dicer 2 Biosíntesis de siRNA Requiere R2D2

Dicer 1 Biosínteis de miRNA Requiere Loqs

3 isoformas que confieren especificidad

Posee distintos componentes:
Proteina Tudo-SN
• 5 dominios Snasa (nucleasa estafílococa)
• Dominio Tudor

Proteína VIG
• Dominio RGG
Proteina DFRX /FMRP (humanos)
• Dos dominios RGG
• Un dominio HK

Proteinas helicasas
Proteína Argonauta
• Dominio PAZ
• Dominio PIWI
Muy conservadas , desde arqueas a
eucariotas superiores.
Mutantes en genes Ago muestran importantes defectos en el desarrollo

• Mutaciones en dAgo1 de Drosophila afectan a todos los tipos

neuronales y provoca letalidad en estado de embrión.

• Ratones con Ago2 mutantes muestran anormalidades varias durante el

desarrollo y mueren en estado de embrión.
 Domino
PAZ

Dominio MID

Argonauta de Domino PIWI

Archaeoglobus fulbus
Muestra plegamiento Rossman, generando un bolsillo donde se protege
el extremo 5´ de la cadena guía
Extremo 5´ interacciona con
cuatro aminoácidos muy
conservados y un átomo de
magnesio en el dominio MID
El dominio PIWI posee un motivo
estructural similar a RNAsa H que
constituye el motor catalítico.
 Varía en distintas proteinas Ago ,
mostrando mayor afinidad por DNA o
RNA, pudiendo participar en distintos
niveles de regulación.
Extremo 3´ del siRNA asociado al domino PAZ y el 5´ asociado al dominio MID

• siRNA pequeños degradación mRNA y supresión traduccional

• siRNA largos silenciamiento transcripcional

Distintas isoformas de argonauta, implicadas en distintos niveles de regulación:

Ej. En humanos hay 4 proteinas Ago, pero solo Ago2 participa en clivaje.
Complejo RISC : ensamblaje
Bibliografía:
Dicing and slicing:The core machinery of the RNA interference pathway. Scott M. Hammond

A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies
with eukaryotic RNAi, and
hypothetical mechanisms of action. Kira S Makarova1, Nick V Grishin2, Svetlana A Shabalina1, Yuri I Wolf1 and Eugene V Koonin.

Advanced Information on The Nobel Prize in Physiology or Medicin 2006

The Fascinating World of RNA Interference. Afsar Raza Naqvi, Md. Nazrul Islam, Nirupam Roy Choudhury, Qazi Mohd. Rizwanul Haq.

RNA Interference: Endogenous siRNAs Derived from Transposable Elements Darren J. Obbard and David J. Finnegan.

Rational siRNA design for RNA interference. Angela Reynolds, Devin Leake, Quea Boese, Stephen Scaringe, William Marshall and Anastasia Khovorova

RNA interference and innate immunity. Mouldy Sioud

TransKingdom RNA interference: a bacterial approach to challenges in RNAi therapy and delivery. ANDREW C. KEATES, JOHANNES FRUEHAUF,
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RNA-Binding Proteins in RNA Interference. R. N. Kotelnikov, G. Shpiz, I. Kalmykova and V. A. Gvozdev

Structural insights into RNA interference. Dipali G Sashital1 and Jennifer A Doudna

RNA interference in biology and disease. Carol A. Sledz and Bryan R. G. Williams

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Fortes1,*

The therapeutic potential of RNA interference. Susan L. Uprichard.