INFORME DE PRCTICAS DE TRANSPORTE INICO DE PLANTAS

Cristbal Gallardo, Ailec Ho, Patricia Rivas, Juan Manuel Martn, Farah Mohand y Noelia Collantes.
Departamento de fisiologa vegetal, Universidad de Mlaga.

Resumen
En el presente informe se describen como se llevaron a cabo las prcticas de transporte inico, detallndose los materiales y las mtodos empleados en cada una de las 4 prcticas para comprobar, de forma independiente, los efectos de la luz y el cianuro sobre el potencial de membrana, demostrar la existencia del potencial de difusin, el efecto del pH sobre la incorporacin de nutrientes y la cintica de incorporacin de amonio, presentndose al final del mismo los resultados y las conclusiones a las que se llegaron.

1. Introduccin general
El estudio de los procesos fisiolgicos que generan flujos elctricos a travs de las membranas celulares se denomina Electrofisiologa. Esta tcnica permite la medida del potencial de membrana (Em) de forma directa, insertando un electrodo de dimetro pequeo (microelectrodo) en el interior celular (Felle, 1981). Para que la punta del microelectrodo atraviese la membrana plasmtica sin alterar el funcionamiento de la clula, el dimetro de su punta debe ser pequeo, en torno a 0,5 m, permitiendo que, una vez perforada la membrana, sta se selle alrededor del microelectrodo. La medida del Em se obtiene como la diferencia de potencial elctrico entre el microelectrodo insertado en la clula y un electrodo de referencia situado en el medio externo. Adems de proporcionar la medida en continuo del Em en clulas intactas, el uso de microelectrodos selectivos para iones permite realizar medidas de la actividad inica intracelular de un in concreto (Felle, 1993; Miller et al., 2001). As mismo, la sofisticacin de los aparatos que detectan los flujos elctricos, junto con la posibilidad de adherir un electrodo a la superficie de la membrana de un protoplasto, mediante la tcnica denominada patch-clamp, permite medir la corriente asociada al flujo de iones a travs de una pequea superficie de membrana (patch) sellada al microelectrodo o registrar el paso de corriente a travs de todo el plasmalema. El organismo modelo empleado en las prcticas fue Riccia fluitans L. (Linnaeus) , una heptica de agua dulce (Fig. 7) perteneciente a la divisin Bryophyta, clase Marchantiopsida, orden Marchantiales, familia Ricciaceae, gnero Riccia (Strasburger et al., 1994). Se trata de plantas verdes talosas (con frondes), con un caracterstico tejido aerfero formado por lminas oblicuas de clulas que limitan espacios irregulares abiertos en comunicacin con el aire exterior (CasaresGil, 1919). Los brifitos presentan generacin alternante. La fase ms desarrollada y duradera por lo general es la de gametfito. sta carece de races verdaderas, presentando rizoides (radicelas), que son simples pelos absorbentes formados por una nica clula; y tampoco posee vasos verdaderos, aunque en algunas especies presentan un nivel inicial de diferenciacin de tejido conductor. La fase gametfita se caracteriza por poseer rganos sexuales (anteridios y arquegonios), en los que se producen gametos (anterozoides y oosferas). El esporfito es en realidad una planta independiente, a pesar de que aparece como un rgano de la fase gametfita y de que depende de ella. En la fase esporfita se diferencian clulas estriles (sostn y proteccin) y clulas frtiles que constituyen el arqusporo, donde se formarn las clulas madre de las esporas. Finalmente, se forman cuatro esporas por cada clula madre.

Imagen 1: Fotografa de Riccia Fluitans

A pesar de presentar gene racin alternante, es frecuente la aposporia, en la que un grupo de clulas se desprende de la planta con la capacidad de generar toda una gametfita directamente (Casares-Gil, 1919). En las brifitas se distingue una fase haploide (abarca desde la espora al gameto individual, es decir, incluye protonema y gametfita) y una diploide (desde los gametos conjugados hasta la segunda mitosis de las clulas madres de esporas, es decir, incluye embrin y esporfita). Como predomina la fase haploide (gametfita), se dice que las brifitas son haploidales

1.1. Efecto luz - oscuridad El mantenimiento del potencial de membrana depende en gran medida de la actividad de la bomba de protones del plasmalema, la cual acta extrayendo iones H+ desde el citosol al exterior, con consumo de ATP; en este contexto la transicin luzoscuridad esta asociada a una rpida pero transitoria hiperpolarizacin seguida de una lenta despolarizacin hasta los valores de reposo; del mismo modo, la transicin oscuridad-luz da lugar a los fenmenos contrarios.

Estas alteraciones del potencial de membrana son el resultado de, por un lado, la disminucin de la concentracin de ATP, debida a la inhibicin de la ATP-asa F1 del cloroplasto, dado que en ausencia de luz cesa el flujo de electrones (dado que en ausencia de luz el complejo MSP del PSII no puede actuar oxidando la molcula de agua), y con ello el bombeo de protones del cual depende la ATPasa F1 para la sntesis de ATP; por otro lado en ausencia de luz el CO2 deja de fijarse (dado que muchas de las enzimas implicadas en este proceso se encuentran reguladas por luz de forma directa o indirecta, como es el caso de la rubisco), lo que lleva a un incremento de la concentracin de CO2 citoslico , y con ello a un aumento de la concentracin de H+ (dado que parte del CO2 se disuelve ), provocando la alcalinizacin del interior celular. En la homeostasis del pH citoplasmtico destaca la participacin de dos enzimas, la fosfoenolpiruvato carboxilasa y la enzima mlica. El objetivo de esta prctica es poner de manifiesto como los ciclos luz-oscuridad afectan al potencial de membrana.

1.2. Efectos difusin

del cianuro y potencial de

El establecimiento de una diferencia de potencial elctrico a ambos lados de las membranas (Em) en una clula vegetal se debe a la actividad de bombas primarias que transportan H+ hacia el exterior celular, en el caso de las localizadas en plasmalema, o hacia el lumen de la vacuola, en el caso de las presentes en tonoplasto. Como consecuencia de la continua extrusin de H+ (en el caso del plasmalema), o su inclusin en la vacuola (en el caso de tonoplasto), el citoplasma de las clulas vegetales es tpicamente alcalino y negativo, siendo mayor la energa acumulada en las membranas vegetales que en las de clulas animales. El valor de Em de una clula vegetal vara entre 100 y 200, aunque se han descrito valores ms negativos en el caso de especies de agua dulce como la heptica Riccia fluitans L. o Chara corallina Klein ex Willd, cuyo Em es prximo a -230 mV. Adems de la actividad de la H+ ATPasa, a ambos lados de la membrana se produce una reorganizacin (difusiva) de iones, que genera una diferencia de potencial elctrico residual denominada potencial de difusin (ED) cuyo valor se obtiene mediante la desactivacin de la H+ -ATPasa . El potencial de difusin en plantas puede predecirse de las asimetras entre el exterior y el interior de la clula de tres iones fundamentales, K+, Na+ y Cl - segn la ecuacin de Goldman-Hodgkin-Katz.

En plantas, como se dijo anteriormente, el Em es ms negativo que el ED, la diferencia entre ambas variables se denomina componente metablico del Em y es generada por la extrusin de H+ (Fernndez y Maldonado, 2000). En el caso del plasmalema, dicha extrusin de H+ se realiza a travs de H+ -ATPasas, consideradas de tipo P porque se unen al anin Pi durante la hidrlisis del ATP (Serrano 1993; Palmgren 2001; Buch-Pedersen y Palmgren, 2003). En plantas es posible estudiar la dependencia del potencial de membrana del ATP observando el efecto del cianuro sobre dicho potencial; el cianuro acta envenenado las mitocondrias, actuando concretamente a nivel del complejo citocromo oxidasa, provocando el bloqueo de la cadena de transporta de electrones, y con ello a la sntesis de ATP. As, la prctica tiene dos objetivos: comprobar la dependencia del potencial de difusin en plantas, y por otro lado, comprobar la dependencia del potasio en dicho potencial de difusin.

1.3. Efecto del pH e incorporacin de nutrientes En esta prctica evaluaremos el efecto del pH sobre el potencial de membrana, as como sobre el transporte de determinadas sustancias, como son la glucosa y la alanina. La influencia del pH sobre sobre el potencial de membrana y el flujo de iones fue estudiado por primera vez por Kitasato en 1968, empleado Nitella en sus experimentos, un alga que se caracteriza por generar potenciales de accin. El trabajo de Kitasato puso los cimientos para comenzar a entender la energtica de las membranas celulares, dado que mediante sus observaciones indic que probablemente existiera un mecanismo de extrusin de protones (fue el primer indicio de que en plantas haba una bomba de protones y no una bomba sodio/potasio), el cual sera el principal responsable sera el responsable en gran medida del potencial de membrana.

En la ecuacin nicamente se consideran las asimetras de estos tres iones debido a que suelen encontrarse en elevadas concentraciones alrededor de las clulas vegetales, siendo los principales iones que fluyen pasivamente a travs de la membrana.

As mismo, mediante sus experimentos se comenz a intuir el papel de otros iones en la homeostasis de dicho potencial, indicando por ejemplo que la permeabilidad para el potasio y el cloro eran funcin del potencial de membrana. El efecto de la variacin del pH extracelular es debido a que provoca un cambio en el gradiente de protones a ambos lados del plasmalema, lo que a su vez afecta a la energa protn-motriz: H+/F= Em RT/F* (pHi pHe) As, al incrementar el pH externo provoca que las bombas de protones trabajen con mayor dificultad, lo que conduce a incremento de la concentracin de H+ en el interior celular, lo que resulta en la despolarizacin del potencial de membrana; por su parte el descenso del pH externo conlleva a que se produzca una disminucin del gradiente de protones entre el exterior y el interior celular, con lo que las bombas de protones del plasmalema trabajaran a una mayor velocidad, provocando la hiperpolarizacin celular. En esas circunstancias se produce la apertura de los canales rectificadores de potasio o de cloro, los cuales participan en la homeostasis del potencial de membrana. El funcionamiento de las clulas vegetales depende de la regulacin adecuada del trfico de iones y molculas a travs del plasmalema y entre los distintos compartimentos celulares. El flujo de iones permite la gnesis, el mantenimiento y la regulacin de la turgencia; la nutricin mineral; los procesos de adaptacin a condiciones salinas o acumulacin de sustancias nocivas, como metales pesados e iones radioactivos. As pues, en el caso de la nutricin mineral, muchos iones y molculas son incorporados al interior celular en simporte con protones, como es el caso de la glucosa y la alanina, cuya incorporacin puede ser estudiada mediante las variaciones en el potencial de membrana.

As, los nutrientes (ejemplo iones como el NO3-) tienden a moverse cuando hay una fuerza que los empuja; ese movimiento depende, aparte de sus caractersticas intrnsecas, de su concentracin (Cj) y de las condiciones elctricas que existen all donde se encuentra (). La suma de esos tres componentes se denomina potencial electroqumico:

Si se tienen dos compartimentos celulares e e i, separados por una membrana semipermeable y el in esta en equilibrio termodinmico, los potenciales electroqumicos en ambos compartimentos son iguales, a partir de lo cual es posible deducir la ecuacin de Nerst:

Sin embargo, en los sistemas vivos la mayora de los iones no estn en equilibrio, y la magnitud de la desigualdad puede calcularse a partir de la diferencia entre el potencial electroqumico de un in en los dos compartimentos involucrados. As pues se denomina gradiente de potencial electroqumico a la diferencia entre ambos compartimentos, y se calcula entre el compartimento y el externo. Finalmente la expresin de la ecuacin queda como:

As pues los objetivos de la prctica son analizar como vara el potencial del membrana en funcin del pH externo, y como se ve afectada la incorporacin de alanina y glucosa.

1.4. Cintica de incorporacin de amonio El transporte de sustancias mediado por transportadores se caracteriza, generalmente, por presentar cinticas de saturacin.

As, en aquellos transportadores que muestran cinticas de saturacin, ajustables al modelo de Michaelis-Menten, la caracterizacin del transporte puede definirse en trminos de velocidad mxima (Vmax) y constante de semisaturacin o de Michaelis (Km). La Vmax del transportador estima la capacidad mxima de transporte y hace referencia a la velocidad de transporte cuando el sustrato que se transporta ocupa todos los lugares de unin a los transportadores presentes en la membrana, siendo dependiente de la concentracin del enzima.

Adems, la actividad de un transportador puede ser constitutiva, es decir, la actividad del transportador est presente en la membrana, o por el contrario, puede ser inducible, es decir, la actividad del transportador se manifiesta (o se amplifica) en respuesta a una seal. Existen al menos dos sistemas distintos de transporte de amonio en plantas: un sistema de alta afinidad (HATS) y un sistema de baja afinidad (LATS). El primero de ellos muestra una cintica Michaeliana y opera a concentraciones inferiores a 1 mM, con una Km usualmente por debajo de 100 M; por su parte el LATS exhibe una cintica lineal y acta a concentraciones por encima de 1 mM. Sin embargo, no se conoce muy bien el mecanismo de incorporacin; la ltima contribucin , empleando la electrofisiologa, ha llegado a la conclusin de que los transportadores AMT de alta afinidad localizados en el plasmalema actuaran como uniportadores conducidos por la diferencia de potencial electroqumico para el amonio. Tambin se ha sugerido que el trasporte de amonio al interior de las clulas es un proceso activo, posiblemente en cotrasporte NH4/H+, especialmente cuando las concentraciones externas de amonio son bajas. En cualquier caso su incorporacin da lugar a despolarizaciones en la membrana.

Grfico 1: Imagen de cintica Michaeliana

Por otra parte, la Km, o constante de Michaelis, indica la concentracin de sustrato necesaria para que el transportador funcione a la mitad de su velocidad mxima, reflejando la relacin especfica entre un transportador y su sustrato. En este sentido, se distinguen transportadores denominados de alta afinidad, que se caracterizan por presentar un valor bajo de Km (del orden M), lo cual indica que el transportador puede funcionar a mitad de su velocidad mxima incluso cuando la concentracin de sustrato es escasa. Y, por otra parte, los transportadores de baja afinidad, que se caracterizan por tener valores altos de Km, es decir, requieren una concentracin de sustrato elevada (prxima al orden mM) para que el sustrato sea transportado.

El amonio es un compuesto txico para la planta, dado que acta como agente desacoplador, por lo que una vez dentro el amonio es rpidamente asimilado por medio de la glutamina sintasa. As, el objetivo de la prctica es caracterizar dichos transportadores, exponiendo a nuestra planta a concentraciones crecientes de amonio.

Imagen 2: Composicin del medio de cultivo Murashige y Skoog

2. Material y mtodos general

Utilizaremos tcnicas de electrofisiologa que nos permitirn la medicin del Em (potencial de membrana) de forma continua y directa. En todas las prcticas se utilizar Riccia fluitans L, concretamente la cepa Tubinguen-Mlaga., cultivadas en medio Murashige y Skoog, cuya composicin se adjunta en la imagen 2. Para su estudio, se monta un fragmento de talo en una cmara de perfusin, se fija con parafina por los extremos y ayuda de un soldador, se cubre con un porta y se llena el espacio comprendido entre el porta y la planta con medio base. Este procedimiento debe realizarse 4 o 5 horas antes de la prctica, para asegurarnos que la planta se encuentra habituada al nuevo medio. Para comenzar el montaje, se coloca la cmara de perfusin sobre la platina de un microscopio (Zeiss, Modelo: Primo Star). La cmara de perfusin se conecta por un tubo a un matraz que contiene el medio de ensayo (en principio un medio base) que se encuentra situado por encima del microscopio para que el medio caiga por su propia gravedad. 6

Imagen 3: Puller David Kopf Instruments720

El medio base est constituido por concentraciones 0'1 mM de KCl, NaCl, CaCl2 y tamponado con BTP/MES a pH 7'3. Para medir las cantidades necesarias para la elaboracin de las distintas soluciones se emple una balanza de precisin.

Para medir el potencial de membrana se utilizarn microelectrodos, que se fabrican calentando un capilar de vidrio simple (Hilgelberg, con dimetro externo de 1.5mm y dimetro interno de 0.87 mm) que se estira hasta quedar dividido en dos microelectrodos con una punta que alcanza entre 0.2 y 0.6 m. Esto se realiza con un aparato llamado puller (David Kopf Instruments, modelo 720) que sujeta al capilar de vidrio por los extremos y en vertical (el extremo superior fijo en un punto y el inferior sometido a la tensin de la gravedad), calentando con una resistencia un punto determinado, el capilar se va estirando hasta que se divide en dos partes (microelectrodos). Uno de los microelectrodos se rellena utilizando una jeringa con una solucin 0.5M KCl y se utiliza un microelectrodo al que se le haya roto la punta como electrodo de referencia relleno con la misma solucin solidificada con agar 3%. Ambos se introducen en holders (World Precision Instruments, MEH3SF) llenos previamente con la solucin y se conectan al electrmetro diferencial de alta impedancia (World Precision Instruments, Modelo Duo 773 Electrometer).

Imagen 4: Microscopio Zeiss, Modelo: Primo Star

Para poder cambiar los medios experimentales sin que el flujo se detenga se utiliza una llave de paso conectada a dos vas. Se enfoca y se centra la planta en el microscopio y mediante una pipeta conectada a una bomba de succin se retira el medio residual.

Imagen 5: Electrmetro de alta impedancia World Precision Instruments, Modelo Duo 773 Electrometer

Imagen 6: Agitador magntico

El electrodo de referencia y el microelectrodo se sita fuera de la clula e inmerso en el medio de ensayo. Una vez montado el aparato de medida, se pone en funcionamiento el electrmetro que comienza a registrar los cambios de voltaje mediante un registrador (Houston Instrumentent, Modelo Omniseribe, Series D5000 Recorder) en un papel milimetrado.

El microelectrodo se conecta a un micromanipulador controlado mediante un joystick (Narishige, modelo MM 188) que nos permitir mover el microelectrodo en todas las direcciones hasta que enfoquemos la punta del microelectrodo y el tejido en el mismo nivel, en este momento el potencial recogido por el microelectrodo debe de ser cercano a 0 mV, aunque negativo (de lo contrario indicara que la punta est rota). Para introducirlo en una clula nos ayudaremos de un micromanipulador (Narishige MM-88) que mueve el microelectrodo en horizontal con mucha precisin y lentitud, una vez dentro tenemos que dejar que se estabilice el potencial de membrana en unos -230 mv, que es el caracterstico para Riccia fluitans en reposo. Todo el instrumental est situado sobre una mesa que asla las vibraciones y dentro de una caja de Faraday que lo asla elctricamente. Por ltimo, para la elaboracin de las diluciones se emplearan agitadores magnticos que permitan homogeneizar soluciones de forma adecuada. A continuacin se expondrn los materiales y mtodos especficos de cada prctica.

2.1. Efecto luz - oscuridad Queremos cuantificar la variacin del Em en ausencia y presencia de luz. Para ello, una vez pinchada la clula con el microelectrodo, y una vez alcance un potencial de membrana estable en presencia de luz, impedimos que la planta realice fotosntesis cortando el flujo de luz mediante un papel, registrando el nuevo potencial de membrana que se alcanza en las nuevas condiciones.

2.2. Efecto del cianuro y potencial de difusin Los materiales propios de esta prctica son distintas disoluciones de NaCN y KCl en medio base.

Imagen 7: Holders

Imagen 8: Representacin del tratamiento de la prctica 2

Las disoluciones que emplearemos son: * Solucin A -500 mL de solucin medio base * Solucin B - 250 mL de solucin NaCN 0,1mM + medio base * Solucin C -150 mL de solucin 1'1 mM KCl + 0'1 mM de NaCN+ medio base Para la elaboracin de las soluciones madre se prepar 1 litro de medio base aadiendo 100 L de NaCl,100 de KCl y 100 de CaCl2 (para conseguir una concentracin 0'1 mM de cada una de las sales) y se ajust a pH 7'3 aadiendo 0,976 g de MES y 1,1g de BTP, tras lo cual la solucin fue movida con el agitador magntico A continuacin deberemos pasar 400 mL del medio base preparado a otro matraz y se les aadi 0,2 ml de una disolucin 200mM de NaCN. Los clculos realizados para obtener este volumen son los siguientes: 200mM x Vi = 0,1mM x 400ml Vi=0,2 ml de la disolucin 200nm NaCN se deben aadir. El resultado fueron 400ml de una disolucin de medio base ms 0,1mM de NaCN. De esta ltima disolucin de extrajeron 150ml a los que se les aadi 1mM de KCl.

Este proceso se hizo del siguiente modo: A los 150mL de medio base se le aadieron 0,15ml de una disolucin 1M de KCl los clculos que llevaros a utilizar dicho volumen de la disolucin de KCl fueron los siguientes:
1000mM x Vi = 1mM x 150ml

As, una vez preparadas las disoluciones, la planta se expuso a los distintos tratamientos en el siguiente orden, en intervalos de aproximadamente 10 min, el tiempo suficiente para que los potenciales de membrana se estabilicen: solucin A, solucin B, solucin C, solucin B y por ltimo solucin A de nuevo. A la hora de cambiar de un medio a otro es importante evitar que se formen burbujas en los tubos a travs de los que circula el medio.

2.3 Efecto del pH e incorporacin de nutrientes Para la realizacin de esta prctica fue necesario la preparacin de 1'5 de medio base a pH 7'3 (ms 1 litro que ya estaba preparado), 1 litro a pH 5'3 y 1 litro a pH 9'3. De este modo, por un lado prepararemos 1'5 L de solucin a pH 7`3, para lo cual ser necesario tomar de las soluciones concentradas, 150 L de NaCl, 150 de KCl y 150 de CaCl2, as como 1'464 g de MES y 1'65 g de BTP. 9

Imagen 9: Representacin del tratamiento de la prctica 3

Para la elaboracin del medio base a pH 5'3, se midi 1 L de agua destilada con la probeta, del cual se verti en el matraz aproximadamente el 90% del volumen, dejando un pequeo margen para ajustar el volumen final; a continuacin se aadi 100 L de NaCl,100 de KCl y 100 de CaCl2 de las soluciones de sales concentradas; tras ello se pes 0,976 g de MES y a continuacin se fue aadiendo de forma progresiva el BTP hasta conseguir el pH de 5'3. Para la elaboracin del medio base a pH 8'3 se procede de forma similar, pero con la diferencia de que en este caso se aaden 1,1g de BTP y a continuacin el pH se ajusta hasta 5'3 aadiendo MES. De esas 3 diluciones, se extrajeron otras 6 del siguiente modo: 1 Del 1,5L del medio base a pH7, 3 se extrajeron 2 diluciones de 100ml cada una, que contenan una 1mM de L-Alanina, y la otra 1mM de glucosa. 2 Del litro de pH 5,3 se extrajeron 200ml. A 100 de los se aadi glucosa hasta una concentracin de 1 mM y a los restantes 100, hasta 1mM de L-Alanina. 3 Al de pH de 9,3 de extrajeron 200ml. A 100 de los se aadi glucosa hasta alcanzar una concentracin de 1mM y a los restantes 100, hasta 1mM de L-Alanina. Para la realizacin de los clculos es necesario tener en cuenta que la masa molar de la glucosa es 180'2 g/mol y la de la alanina 89'1 g/mol. 10

As, iremos pasando de un medio a otro, dejando el suficiente tiempo para que se alcance un potencial de membrana estable, en el orden que muestra la figura siguiente: Tanto los pulsos de glucosa como de alanina debern ser rpidos para evitar que la clula se saturen realizando lavados con medio base entre el puso de glucosa y el pulso de alanina; as mismo, como se observa en la figura, para pasar de pH 5'3 a pH 9'3 pasaremos por pH 7'3 para evitar que el electrodo se salga debido a los posibles cambios de turgencia.

2.4. Cintica de incorporacin de amonio Para observar el efecto del amonio sobre el potencial de membrana utilizamos concentraciones crecientes de amonio: 1 M, 3 M, 5 M, 10 M, 15 M, 25 M, 50M, 100M, 200M, 500 M, 1000 M, 2000 M y 5000 M , a partir de dos diluciones de 10 mM y 100 mM. Comenzaremos preparando 2L de medio base, para lo cual, en un matraz aadimos 200 L de solucin 0.1 mM de KCl, 0.1 Mm de NaCl y 0.1 mM de CaCl2, as como 0,976 g de MES y 1,1g de BTP 1'952 g de MES y 2'2 g para ajustar el pH a 7'3. A continuacin prepararemos la solucin 10 mM de amonio a partir de una solucin madre NH4Cl 1M, de la cual tomaremos 2.5 ml y enrasamos en un matraz aforado de 250 ml con agua destilada. Esta dilucin se emplea para las concentraciones inferiores (1-25 M).

1 M 10 mM (L) Medi o base (mL) 10

3 M 30

5 M 50

10 M 100

15 M 150

25 M 250

100

100

100

100

100

100

Tras ello prepararemos la solucin 100 mM de amonio que nos servir para elaborar las soluciones de 50, 100, 200 y 500 M. Para ello adicionamos a un matraz aforado de 250 mL un volumen de 25 mL de la solucin madre 1M de NH4Cl y enrasamos con agua destilada.
50 M
100 mM (L) Medio base (ml)

Como era de esperar, al pasar la planta de luz a oscuridad el potencial de membrana se despolariza; este fenmeno se justifica del siguiente al apagar la luz la maquinaria de fijacin de CO2 se detiene debido a que los principales enzimas del ciclo de Calvin implicados en la regulacin del flujo se encuentran regulados por factores dependientes de la luz (tiorredoxinas, pH elevado, concentracin de magnesio elevada) , lo que provoca que cese en flujo de dixido de carbono desde el citoplasma al estroma, con lo que se produce un incremento de la concentracin citoplasmtica de CO2; este hecho provoca un descenso del pH , dado que el dixido de carbono se comporta como un cido dbil. Todo ella provoca una alteracin del potencial de membrana. En ausencia de luz tambin se inhibe la produccin de ATP en el cloroplasto, como resultado del bloqueo del flujo de electrones de la cadena de transporte; sin embargo la dbil despolarizacin que provoca la situacin de oscuridad hace pensar que la principal fuente de ATP que alimenta a la bomba de protones no es el cloroplasto, sino la respiracin mitocondrial. Una explicacin alternativa que permitira devolver el protagonismo al cloroplasto como el encargado de proporcionar ATP requiere de la participacin de la llamada respiracin cloroplastdica, que implica la participacin del complejo Ndh (el cual acta oxidando el NADPH y reduciendo a la plastoquinona), as como el complejo inmuntans, este sistema proporciona una cadena de transporte de electrones alternativa que puede participar en la generacin de un gradiente de H en ausencia de luz. Sin embargo, an son pocas las evidencias que apoyen una participacin activa de esta va.

100 M 100 100

200 M 200 100

500 M 500 100

1000 M 1000 100

2000 M 2000 100

5000 M 5000 100

50 100

Una vez elaboradas todas las diluciones, y partiendo del medio base, la planta se expondr a pulsos de amonio de concentracin creciente mediante el intercambio de medios, a travs de una llave de dos vas, e intercalando lavados con medio base durante aproximadamente 5 minutos.

3.1. Resultados y discusin prctica 1

Los resultados obtenidos en este experimento se encuentran recogidos en la grfica nmero 1 que nos muestra el registro del potencial de membrana que fue obtenido durante el experimento presente. Los resultados obtenidos muestran claras despolarizaciones de aproximadamente 6 mV cuando la planta es expuesta a oscuridad (indicado mediante flechas en la imagen 10). Tambin se observa que aproximadamente en el minuto 19 la planta vuelve a ser expuesta a luz, lo que se correlaciona un una hiperpolarizacin inicial, para posteriormente volver al potencial de reposo.

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Imagen 10: Registro de la prctica luz-oscuridad

3.2. Resultados y discusin practica 2

Tras conectar el cianuro a la muestra el potencial de membrana cay 110 mV aproximadamente, lo cual es debido a la inhibicin de la bomba de protones del plasmalema, que provoca una despolarizacin de la membrana. Sin embargo, sigue quedando un potencial considerable (potencial de difusin) mantenido por las diferencias de concentracin de distintos iones a ambos lados de la membran , principalmente K, aunque tambin Na+ y Cl-.

Imagen 11: Registro del experimento de cianuro

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Cuando conectamos el medio base con KCl y NaCN, el potencial de membrana cae unos 45 mv, debido a que igualamos las concentraciones de K+ internas y externas. Estos 45 mV representan el papel del K+ en el potencial de difusin, resultado de la asimtrica distribucin del in. El potencial de difusin restante es debido a las distribuciones desiguales de cloro y sodio. Tras el lavado de KCl, el potencial se repolariza de nuevo hasta un valor de -122 mV, ya que las bombas de protones siguen inhibidas. Finalmente, al realizar el lavado de NaCN se recupera el potencial de membrana lentamente ya que las bombas tienen que ir activndose de nuevo y repolarizando el potencial de membrana expulsando protones.

Efecto del pH sobre el potencial de membrana Como ya se describi en el apartado material y mtodos correspondiente a esta prctica, las mediciones para los distintos pH se llevaron a cabo primero a 7'3, a continuacin a 5'3 y finalmente a 9'3, realizando los cambios de forma progresiva para evitar que el electrodo pudiera salirse debido a los cambios de volumen celular. El paso de las muestras desde pH 7'3 a pH 53 provoc una despolarizacin del potencial de membrana de 10 mV, resultado de una mayor dificultad de las ATPasas de protones para bombear, con lo cual estos se acumulan en el citosol; por su parte, el paso de pH 5,3 a pH 7,3 provoc una intensa hiperpolarizacin de 43 mV, mientras que en el paso de pH 7, 3 a pH 9, 3 la membrana se hiperpolariz 166 mV. En ambos casos, tras las intensas hiperpolarizaciones los potenciales de membrana retornaron rpidamente a los valores de potencial de reposo, resultado de la apertura de los canales rectificadores de Cl-. Es de destacar la eficiencia de los mecanismos homeostticos de la clula para el mantenimiento del potencial de membrana, la cual, a pesar de los intensos cambios de pH, mantiene un potencial prcticamente constante a lo largo de todo el experimento.

3.3. Resultado y discusin prctica 3

A continuacin se detallarn los efectos que tienen sobre el potencial de membrana la exposicin de la clula a diferentes pH, concretamente a pH 7'3, pH 5'3 y pH 9'3; adems tambin se describirn cmo se ve afectada la incorporacin de glucosa y Lalanina en concentraciones 1 mM en los diferentes medios, a travs del anlisis del efecto sobre el Em, lo cual se llev a cabo de forma simultnea al estudio del efecto del pH .

Imagen 12: Registro del experimento de incorporacin de glucosa y alanina

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Tambin es muy interesante el hecho de que el paso de pH 53 a pH 73 provoque una hiperpolarizacin mucho mayor (casi 3 veces ms) que en el paso de pH 73 a pH 93, lo que puede ser debido a que, debido a que la transicin entre los distintos medios se produjo en un intervalo de tiempo muy corto, es posible que algunos canales rectificadores de cloro permanecieran aun abiertos cuando se pasa a medio de pH 93. Efecto del pH sobre el mecanismo de incorporacin de glucosa La adicin de glucosa a concentracin 1 mM a pH 7'3 provoc la despolarizacin del plasmalema de las clulas de Riccia fluitans; concretamente la variacin fue de aproximadamente 5 mV, lo que indica que su incorporacin debe realizarse en simporte con protones, dado que la glucosa no se trata de una molcula sin carga. Esta afirmacin se ve reforzada por el hecho de que a diferentes pH, su incorporacin alteraciones en el potencial de distinta magnitud. As, por un lado, para pH 5'3 el efecto sobre la adicin de concentraciones equimolares de glucosa fue ligeramente mayor, provocando una despolarizacin de 6,6 mV; Por otro lado, y para pH 93 la adicin de glucosa apenas tiene efectos sobre el potencial de membrana. Todo ello es indicativo de que el transporte de glucosa esta acoplado al transporte de protones, dado que su velocidad de incorporacin es mayor a pH cido que ha pH bsico. Sin embargo, es posible que el escaso efecto del potencial de membrana sobre la incorporacin de glucosa a pH 9'3 sea debido a que en dicha situacin la clula podra mostrar concentraciones de glucosa intracelular muy elevadas, lo que dificultara su incorporacin

en el potencial de membrana; en el caso de la solucin a pH 5'3, la exposicin a 1 mM de L-alanina gener una despolarizacin de aproximadamente 8 mV, mientras que para pH 5'3 a adicin de alanina no tuvo ningn efecto significativo (mostrndose en el registro una ligera hiperpolarizacin, lo que es debo a errores en la preparacin de la solucin de alanina). Para comprender con detalle el comportamiento del mecanismo de incorporacin de la L-alanina puede ser importante tener en cuenta que se trata de una sustancia anftera, es decir, que su carga depende del pH. El punto isoelctrico de la alanina es 6, lo que quiere decir que a un pH por debajo de ese valor esta molcula tiene carga positiva, mientras que por encima su carga es negativa, como resultado de la protonacin y desprotonacin de sus grupos amino y carboxilo. Teniendo en cuenta esto, si analizamos los datos del registro, por un lado vemos que los valores obtenidos para pH 9'3 se corresponde con lo esperado, dado que en esa situacin la fuerza protn motriz es muy baja, y adems la L-alanina presenta carga negativa, con lo cual la incorporacin del aminocido no se ve favorecida. Sin embargo, los datos obtenidos para la solucin a pH 5'3 muestran que la velocidad de incorporacin de la alanina en esa situacin es inferior a la que tiene lugar a pH 7'3, dado que da lugar a una despolarizacin de menor intensidad. Esto puede ser debido a algn error durante la elaboracin de las soluciones.

3.4. Resultados y discusin prctica 4

Los resultados del experimento se recogen en la tabla siguiente. Hay que apuntar que el objetivo inicial del experimento era exponer a Riccia solo hasta concentraciones de amonio de 500 M, sin embargo, como se aprecia en la tabla, en el rango de 100 a 500 M las despolarizaciones provocadas por el amonio son muy similares, lo que puede ser debido a que empleamos un cultivo de Riccia muy viejo.

Efecto del pH sobre el mecanismo de incorporacin de L-alanina Como se observa en el registro de la imagen 12, a pH 7, la adicin de L-alanina a concentracin 1 mM provoc una despolarizacin de aproximadamente 13 mV

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 potencial de membrana (mV)

1,7 3,4 4,3 6,9 8,6 10,34 12,06 13,3 13,3 14,2 15

22,5

41,7

[NH4+] M

10

15

25

50

100

200

500

1000 2000 5000

Tabla 1: Resultados de los registros a distintas concentraciones de amonio

En la imagen 13 se muestra parte del registro en el que se aprecia la existencia de una correlacin entra la despolarizacin de la membrana y las concentraciones crecientes de amonio hasta estabilizarse (al final del presente informe se encuentra el registro completo). Para el procesado final de los datos empleamos el software Kaleidagraph, proporcionado por el departamento de Fisiologa Vegetal de la Universidad de Mlaga; las grficas obtenidas se muestran en la pgina siguiente. Se observa que al representar las despolarizaciones del potencial de membrana frente a la concentracin de amonio, los datos se ajustan a una cintica doble, donde hasta concentraciones de 1000 M los datos se ajustan a una cintica Michaeliana, (con una fiabilidad del 99% como muestra el valor de R2), y a partir de ese valor a una cintica de incorporacin lineal, de lo cual se puede inferir la existencia de un transportador de alta afinidad saturable constitutivo , el cual posee una Km de 108 M, y de un trasportador de baja afinidad constitutivo, el cual se manifiesta a partir de concentraciones superiores a 1000 M.

4.1. Conclusin prctica 1 La luz y la oscuridad afectan al potencial de membrana de dos formas: por un lado, afectando al pH citoplasmtico, y por otro debida a la alteracin del proceso fotosinttico, que a travs de la produccin de ATP influye en el potencial de membrana. Pero la fotosntesis no es el proceso que ms aporta a la formacin de este potencial, dicho proceso es la respiracin mitocondrial.

4.2 Conclusin prctica 2

Hemos observado los efectos de inhibir las bombas de protones aplicando un flujo con NaCN y lo que representa el potasio para el potencial de difusin, la actividad electrognica de la bomba de protones contribuye un 44% al potencial de membrana, mientras que la contribucin del potasio es del 18 % del potencial total. As pues, los resultados obtenidos muestran que el principal responsable del mantenimiento del potencial de membrana son las bombas de protones del plasmalema, teniendo tambin un papel muy importante el sodio como componente del potencial de difusin.

Imagen 13: Registro parcial de la cintica de incorporacin de amonio

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Imagen 14: Representacin de potencial de membrana frente a concentracin de amonio

Imagen 15: Representacin de la franja de cintica lineal

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4.3. Conclusin prctica 3

De acuerdo con los resultados obtenidos, podemos afirmar que la incorporacin de L-alanina y glucosa tiene lugar en simporte con protones, dado que su incorporacin aparece asociada a perturbaciones del potencial de membrana de diversa intensidad, en funcin de las condiciones del medio externo. Adems se demostr la dependencia del pH sobre el potencial de membrana, as como la eficiencia de mecanismos homeostticos. .

4.4. Conclusin prctica 4 Los resultados obtenidos nos permiten confirmar la existencia de dos transportadores implicados en la incorporacin de amonio, uno de alta afinidad, que se satura a concentraciones en torno a 216 M, y un trasportador de baja afinidad, el cual muestra una cintica de incorporacin lineal.

5. Bibliografa
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Jose A. Fernndez, Mara J. Garca-Snchez and Hubert H. Fell. Physiological evidence for a proton pump and sodium exclusion mechanisms at the plasma membrane of the marine angiosperm Zostera marina L. Lourdes Rubio Valverde. Mecanismos de transporte de nitrato, amonio y fosfato y homeostasis citoplasmtica de sodio en Zostera marina L. Hiroshi Kitasato. The Influence of H + on the Membrane Potential and Ion Fluxes of Nitella

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