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  • Vibrio Harveyi, Una Amenaza para Las Piscifactorías Del Sur de La Península Ibérica: Caracterización y Estrategias para Combatirlo

    Cargado por

    Cristobal Gallardo
    178 vistas55 páginas
    Resumen Especímenes de Solea senegalensis enfermos fueron identificados en una piscifactoría del sur de España, los cuales mostraron diversos síntomas tales como úlceras en la parte superior del cuerpo y mayor producción de mucus epitelial. En el presente estudio de llevó a cabo el aislamiento y caracterización del microrganismo responsable. Entre los factores que se analizaron se encuentran la actividad hemolítica, dado que este factor de virulencia es empleado de forma habitual en la industria piscícola de diversas regiones como marcadores de cepas virulentas, y la capacidad para secretar quitinasa por parte del microorganismo, dado que los crustáceos han sido demostrados con anterioridad como importantes reservorios de organismos potencialmente patógenos. Además, dado el creciente problema que supone para el medio ambiente el empleo de antimicrobianos y agentes quimioterapéuticos, se analizó de la capacidad para producir compuestos bioactivos por parte de Chlorella sp, ocho especies de macroalgas recolectadas en la costa de Málaga y de ocho especies bacterianas. Los resultados obtenidos permitieron confirmar la capacidad del aislado para degradar quitina, mientras que en el caso de la actividad hemolítica, los resultados fueron negativos para las condiciones experimentales del presente trabajo. Finalmente fueron obtenidos resultados bastante prometedores en el caso de los probióticos, en los que cinco de las cepas analizadas dieron lugar a halos de inhibición. Summary Solea senegalensis specimens were identified on a hatchery in southern Spain, which showed various symptoms such as ulcers on the upper body and an increase in the production of epithelial mucus. In the present study was carried out the isolation and characterization of the microorganism responsible. Among the factors that were analyzed are the hemolytic activity, since this virulence factor is used routinely in the aquaculture industry of various regions as markers of virulent strains, and the ability to secrete chitinase, since the crustaceans have been shown previously to be important reservoirs of potentially pathogenic organisms. Moreover, given the growing problem posed to the environment the use of antimicrobials and chemotherapeutic agents, we examined the ability to produce bioactive compounds by Chlorella sp, eight species of seaweed harvested off the coast of Malaga and eight bacterial species. The obtained results confirmed the ability to degrade chitin by the isolated, whereas in the case of hemolytic activity, the results were negative for the experimental conditions of this work. Finally, very promising results were obtained in the case of probiotics, in which five of the strains resulted in inhibition halos.

    Título original

    Vibrio harveyi, una amenaza para las piscifactorías del sur de la Península Ibérica: caracterización y estrategias para combatirlo

    Derechos de autor

    © Attribution Non-Commercial (BY-NC)

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    Resumen Especímenes de Solea senegalensis enfermos fueron identificados en una piscifactoría del sur de España, los cuales mostraron diversos síntomas tales como úlceras en la parte superior del cuerpo y mayor producción de mucus epitelial. En el presente estudio de llevó a cabo el aislamiento y caracterización del microrganismo responsable. Entre los factores que se analizaron se encuentran la actividad hemolítica, dado que este factor de virulencia es empleado de forma habitual en la industria piscícola de diversas regiones como marcadores de cepas virulentas, y la capacidad para secretar quitinasa por parte del microorganismo, dado que los crustáceos han sido demostrados con anterioridad como importantes reservorios de organismos potencialmente patógenos. Además, dado el creciente problema que supone para el medio ambiente el empleo de antimicrobianos y agentes quimioterapéuticos, se analizó de la capacidad para producir compuestos bioactivos por parte de Chlorella sp, ocho especies de macroalgas recolectadas en la costa de Málaga y de ocho especies bacterianas. Los resultados obtenidos permitieron confirmar la capacidad del aislado para degradar quitina, mientras que en el caso de la actividad hemolítica, los resultados fueron negativos para las condiciones experimentales del presente trabajo. Finalmente fueron obtenidos resultados bastante prometedores en el caso de los probióticos, en los que cinco de las cepas analizadas dieron lugar a halos de inhibición. Summary Solea senegalensis specimens were identified on a hatchery in southern Spain, which showed various symptoms such as ulcers on the upper body and an increase in the production of epithelial mucus. In the present study was carried out the isolation and characterization of the microorganism responsible. Among the factors that were analyzed are the hemolytic activity, since this virulence factor is used routinely in the aquaculture industry of various regions as markers of virulent strains, and the ability to secrete chitinase, since the crustaceans have been shown previously to be important reservoirs of potentially pathogenic organisms. Moreover, given the growing problem posed to the environment the use of antimicrobials and chemotherapeutic agents, we examined the ability to produce bioactive compounds by Chlorella sp, eight species of seaweed harvested off the coast of Malaga and eight bacterial species. The obtained results confirmed the ability to degrade chitin by the isolated, whereas in the case of hemolytic activity, the results were negative for the experimental conditions of this work. Finally, very promising results were obtained in the case of probiotics, in which five of the strains resulted in inhibition halos.

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    Vibrio Harveyi, Una Amenaza para Las Piscifactorías Del Sur de La Península Ibérica: Caracterización y Estrategias para Combatirlo

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    Cristobal Gallardo
    Resumen Especímenes de Solea senegalensis enfermos fueron identificados en una piscifactoría del sur de España, los cuales mostraron diversos síntomas tales como úlceras en la parte superior del cuerpo y mayor producción de mucus epitelial. En el presente estudio de llevó a cabo el aislamiento y caracterización del microrganismo responsable. Entre los factores que se analizaron se encuentran la actividad hemolítica, dado que este factor de virulencia es empleado de forma habitual en la industria piscícola de diversas regiones como marcadores de cepas virulentas, y la capacidad para secretar quitinasa por parte del microorganismo, dado que los crustáceos han sido demostrados con anterioridad como importantes reservorios de organismos potencialmente patógenos. Además, dado el creciente problema que supone para el medio ambiente el empleo de antimicrobianos y agentes quimioterapéuticos, se analizó de la capacidad para producir compuestos bioactivos por parte de Chlorella sp, ocho especies de macroalgas recolectadas en la costa de Málaga y de ocho especies bacterianas. Los resultados obtenidos permitieron confirmar la capacidad del aislado para degradar quitina, mientras que en el caso de la actividad hemolítica, los resultados fueron negativos para las condiciones experimentales del presente trabajo. Finalmente fueron obtenidos resultados bastante prometedores en el caso de los probióticos, en los que cinco de las cepas analizadas dieron lugar a halos de inhibición. Summary Solea senegalensis specimens were identified on a hatchery in southern Spain, which showed various symptoms such as ulcers on the upper body and an increase in the production of epithelial mucus. In the present study was carried out the isolation and characterization of the microorganism responsible. Among the factors that were analyzed are the hemolytic activity, since this virulence factor is used routinely in the aquaculture industry of various regions as markers of virulent strains, and the ability to secrete chitinase, since the crustaceans have been shown previously to be important reservoirs of potentially pathogenic organisms. Moreover, given the growing problem posed to the environment the use of antimicrobials and chemotherapeutic agents, we examined the ability to produce bioactive compounds by Chlorella sp, eight species of seaweed harvested off the coast of Malaga and eight bacterial species. The obtained results confirmed the ability to degrade chitin by the isolated, whereas in the case of hemolytic activity, the results were negative for the experimental conditions of this work. Finally, very promising results were obtained in the case of probiotics, in which five of the strains resulted in inhibition halos.

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    Interaccin Pez Bacteria

    C. Gallardo, D.L. Mrquez, J. Almagro, L. Cern, A. Cruz, F. Codes, D. Lpez, A. Alves, N. Perea, R. Gmez, J. Moreno, M. Fontiveros e I. Pla.
    Departamento de Microbiologa, Facultad de Ciencias Universidad de Mlaga 29071

    Prcticas de M.T.E. en Microbiologa

    Introduccin

    Solea senegalensis

    Introduccin

    Vibrio harveyi

    Anlisis de la capacidad hemoltica


    Introduccin
    Evidencias experimentales sugieren que las hemolisinas podran ser uno de los factores de mayor importancia en el desarrollo de las enfermedades .

    Anlisis de la capacidad hemoltica


    Metodologa

    y 24 h adicionales a 37 C

    Anlisis de la capacidad hemoltica


    Resultados
    No aparecieron indicios de degradacin

    Anlisis de la capacidad hemoltica


    Discusin

    Produccin de antimicrobianos por macroalgas

    Introduccin

    Produccin de antimicrobianos por macroalgas

    Introduccin

    Ocho especies de algas fueron recolectadas:

    Jania rubens Faro de Calaburra 3630'23.03"N, 438'39.78"W

    Produccin de antimicrobianos por macroalgas

    Introduccin

    Procedimiento experimental
    Co-cultivo de Dyctiota dichotoma Efecto de extractos de macroalgas

    Produccin de antimicrobianos por macroalgas

    Introduccin
    Co-cultivo de Dyctiota dichotoma

    Produccin de antimicrobianos por macroalgas

    Metodologa
    Co-cultivo de Dyctiota dichotoma

    Resuspensin de V. harveyi en solucin salina a concentracin aproximada de 108 UFC/mL

    Standards de McFarland (0.5, 1 y 2)

    Produccin de antimicrobianos por macroalgas

    Metodologa
    Co-cultivo de Dyctiota dichotoma

    0,2 mL de solucin bacteriana

    Muestra problema

    + 200 mL de agua de mar + 4 g del alga

    Muestra control

    0,2 mL de solucin bacteriana

    + 200 mL de agua de mar

    Produccin de antimicrobianos por macroalgas

    Metodologa
    Co-cultivo de Dyctiota dichotoma

    Estimacin de bacterias cultivables mediante titulacin en placa

    Toma de muestras de dilucin a tiempo 0, a las 24 y a las 48 horas

    Produccin de antimicrobianos por macroalgas

    Resultados
    Co-cultivo de Dyctiota dichotoma

    Produccin de antimicrobianos por macroalgas

    Discusin
    Co-cultivo de Dyctiota dichotoma

    Descenso del 85,47% en el nmero de vibrios en el co-cultivo frente al descenso del 30% registrado en el control Incorporacin al medio de cultivo de vibrios exgenos algunos de los cuales podran corresponder a V. alginolticus

    Produccin de antimicrobianos por macroalgas

    Introduccin
    Efecto de extractos de macroalgas

    Corallina officinalis

    Jania rubens

    Halopteris filicina

    Ulva rigida

    Cladophora dalmtica

    Cystoseira tamariscifolia

    Osmundea pinnatifida

    Produccin de antimicrobianos por macroalgas

    Metodologa
    Efecto de extractos de macroalgas

    Estimacin de bacterias cultivables mediante titulacin en placa

    Toma de muestras de dilucin a tiempo 0, a las 24 y a las 48 horas

    Obtencin de extractos hidrofbicos e hidroflicos

    Produccin de antimicrobianos por macroalgas

    Metodologa
    Efecto de extractos de macroalgas

    Los extractos hidrofbicos se obtuvieron macerando 0,2 g de alga en 10 mL de acetona


    Los extractos hidroflicos se obtuvieron macerando 0,2 g de alga en 10 mL de solucin salina

    Obtencin de extractos hidrofbicos e hidroflicos

    Produccin de antimicrobianos por macroalgas

    Resultados
    Efecto de extractos de macroalgas

    Extractos hidrofbicos

    En ningn caso se apreci halo de inhibicin

    Extractos hidroflicos

    Produccin de antimicrobianos por macroalgas

    Discusin
    Efecto de extractos de macroalgas

    De acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo, ninguno de las especies analizadas presenta compuestos con actividad antimicrobiana frente a V. harveyi
    La actividad antibacteriana se encuentre enmascarada por la presencia de algunos compuestos inhibidores en los extractos

    El mtodo de extraccin tambin puede haber afectado al grado de susceptibilidad

    Capacidad antimicrobiana de Chlorella

    Introduccin

    Capacidad antimicrobiana de Chlorella

    Metodologa

    Estimacin de la concentracin de Chlorella

    Capacidad antimicrobiana de Chlorella

    Metodologa
    Sembrado de V.harveyi en csped
    Realizacin de perforaciones (tcnica well-in agar)

    Capacidad antimicrobiana de Chlorella

    Metodologa

    Lisado de Chlorella por ultrasonido

    Capacidad antimicrobiana de Chlorella

    Metodologa
    Chlorella lisada

    Chlorella intacta

    Capacidad antimicrobiana de Chlorella

    Resultados
    Los resultados obtenidos fueron negativos en ambos tratamientos

    Chlorella no sonicada

    Chlorella sonicada

    Capacidad antimicrobiana de Chlorella

    Discusin

    La cepa de Chlorella empleada no produce sustancias antimicrobianas frente a V. harveyi Es posible que ejerza su accin beneficiosa a travs de otros mecanismos

    Anlisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

    Introduccin

    Coppodos

    Rotferos

    Artmias

    Anlisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

    Metodologa

    Coccin durante 10 minutos

    Anlisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

    Metodologa
    Exoesqueletos limpios

    Anlisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

    Metodologa
    Exoesqueletos limpios

    Desmineralizacin
    Incubacin en HCl 1N durante 2 horas

    Anlisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

    Metodologa
    Exoesqueletos limpios

    Desmineralizacin
    Incubacin en HCl 1N durante 2 horas
    Lavado con dH2O y filtrado

    Desproteinizacin
    Incubacin en NaOH 15% a 65C durante 3 horas

    Anlisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

    Metodologa
    Exoesqueletos limpios

    Desmineralizacin
    Incubacin en HCl 1N durante 2 horas
    Lavado con dH2O y filtrado

    Desproteinizacin
    Incubacin en NaOH 15% a 65C durante 3 horas
    Lavado con dH2O y filtrado

    Quitina purificada

    Anlisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

    Metodologa
    Quitina purificada

    Resuspensin en dH2O Centrifugado


    Liofilizacin

    Anlisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

    Metodologa
    Preparacin del medio base de acuerdo con
    Furukawa et al. (1978)
    Componente Concentracin Tabla 2. Componentes del agar para la quitina Sulfato amnico 1 g/L Dihidrofosfato potsico 0,2 g/L Monohidrofosfato potsico 1,6 g/L Sulfato magnsico heptahidratado 0,2 g/L Cloruro sdico 0,1 g/L Sulfato de hierro heptahidratado 0,01 g/L Cloruro clcico dihidratado 0,02 g/L Peptonas 15 g/L

    Anlisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

    Metodologa
    0,3 g de quitina en 10 mL de medio base

    Anlisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

    Metodologa
    0,3 g de quitina en 10 mL de medio base

    Sonicacin
    A 10 m de longitud, dos ciclos a 50 Hzs y un ciclo a 85 Hzs

    Anlisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

    Metodologa
    0,3 g de quitina en 10 mL de medio base

    Sonicacin
    A 10 m de longitud, dos ciclos a 50 Hzs y un ciclo a 85 Hzs
    Adicin del agar 1,5 % p/v

    Esterilizacin en autoclave
    121 C durante 15 min

    Anlisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

    Metodologa
    0,3 g de quitina en 10 mL de medio base

    Sonicacin
    A 10 m de longitud, dos ciclos a 50 Hzs y un ciclo a 85 Hzs
    Adicin del agar 1,5 % p/v

    Esterilizacin en autoclave
    121 C durante 15 min

    Vertido de las placas y siembra de las bacterias

    Anlisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

    Resultados

    Placa a 0 h

    Placa a 72 h

    Anlisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

    Discusin

    La confirmacin de la capacidad quitinasa de la cepa de V. harveyi aislada puede ser determinante a la hora de prevenir futuras reapariciones de la enfermedad

    Produccin de sustancias bioactivas por cepas probiticas

    Introduccin
    De acuerdo con la FAO/WHO:

    Un organismo probitico es un microorganismo vivo que cuando es suministrado en cantidades adecuadas confiere un beneficio sobre la salud en el husped

    Produccin de sustancias bioactivas por cepas probiticas

    Metodologa
    Se emplearon ocho cepas potencialmente probiticas
    DCF 12.2.14/3 DCF 12.1.14/3 DCF 12.10.14/3

    DCF 12.4.14/3
    DCF 12.9 P12.14/2 P15.14/3

    Vibrio fisheri 14/3

    Produccin de sustancias bioactivas por cepas probiticas

    Metodologa

    Placas de medio TSA

    Caldo de cultivo

    2 mL de solucin salina + masa bacteriana


    Inoculacin en pocillos

    Cultivo primario

    Produccin de sustancias bioactivas por cepas probiticas

    Resultados
    Los resultados obtenidos fueron positivos

    Produccin de sustancias bioactivas por cepas probiticas

    Resultados
    Dimetro (cm)

    Produccin de sustancias bioactivas por cepas probiticas

    Discusin
    El empleo de probiticos ofrece una alternativa adecuada para el control de patgenos en instalaciones acucolas
    La cepa DCF 12.10 se postula como la ms prometedora Son necesarios estudios adicionales para contrastar la utilidad in vivo No es posible desechar la posible utilidad como organismos probiticos de aquellas cepas que no han dado lugar a halos de inhibicin

    Conclusiones
    La actividad hemolisina no es un marcador adecuado para la identificacin de las cepas virulentas de V. harveyi El empleo de Dictyota dichotoma en piscifactoras se postula como una estrategia eficiente para combatir a V. harveyi

    Ninguna de los extractos de las macroalgas presenta compuestos con actividad antibitica frente a V. harveyi bajo las condiciones empleadas
    Chlorella no produce compuestos bioactivos frente a V. harveyi

    Los organismos quitinosos son potenciales reservorios de V. harveyi Las cepas probiticas DCF 12.2.14/3, DCF 12.4.14/3, DCF 12.9 y DCF 12.10.14/3 ofrecen enormes posibilidades para prevenir los brotes de V. harveyi

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