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UNIVERSIDAD DE CHILE
Doctorado en Nutrición y Alimentos
Programa Interfacultades
Por
Pabla Alejandra Morales Muñoz
Agosto, 2019
Santiago, 2019
EVALUACIÓN DE LA BIODIVERSIDAD DE PSEUDOMONAS ALTERANTES
DE POLLOS REFRIGERADOS Y SU SENSIBILIDAD FRENTE A
LACTOBACILLUS, POTENCIALES BIO-PRESERVANTES DE LA CARNE DE
AVE
Por
Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al Grado Académico
de Doctor en Nutrición y Alimentos
COMITÉ DE TESIS
DIRECTOR DE TESIS
Prof. Dra. María Antonieta Valenzuela P.
CO-DIRECTOR DE TESIS
Prof. Guillermo Figueroa G. Jubilado
FECHA DE APROBACIÓN
Para mi hija…
Que me ha hecho estudiar más
que cualquier doctorado.
Te amo.
ii
Agradecimientos
iii
ÍNDICE DE MATERIAS
Agradecimientos iii
Índice de materias iv
Lista de Tablas vii
Lista de Figuras ix
Lista de símbolos, abreviaturas o nomenclatura xiii
Resumen xvi
Abstract xvii
INTRODUCCIÓN 1
ANTECEDENTES 3
1- La industria avícola nacional 3
1.1.- Limitantes de la industria avícola nacional 5
2.- Deterioro microbiológico de la carne de pollo 6
2.1.- Bacterias alterantes 8
2.1.1. Pseudomonas 9
3.- Bio-preservación 12
3.1.- Bacterias ácido lácticas (BALs) 13
3.1.1.- Ácidos orgánicos. 13
3.1.2.- Peróxido de hidrógeno (H2O2) 14
3.1.3.- Diacetilo 15
3.1.4.- Reuterina 16
3.1.5.- Bacteriocinas 16
3.2.- Requisitos para seleccionar BALs como biopreservante 18
3.3.- Evidencia in vitro e in situ de BALs con actividad antimicrobiana 18
sobre diferentes bacterias patógenas y alterantes.
3.3.1.- Estudios in vitro 18
3.3.2.- Estudios in situ realizados en cecinas 19
3.3.3.-Estudios in situ realizados en carne de vacuno y ave cruda 20
HIPÓTESIS 23
OBJETIVO GENERAL 23
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 23
MATERIALES Y MÉTODOS 24
1.- Diseño experimental 24
iv
2.- ETAPA 1: Prevalencia, aislamiento, identificación y caracterización de 24
Pseudomonas spp. alterantes
2.1.- Carga de Pseudomonas spp. y RAP en pollo deteriorado 25
2.2- Selección e identificación molecular de las especies de 26
Pseudomonas dominantes
2.3- Caracterización genotípica de Pseudomonas. 27
2.4- Caracterización fenotípica de Pseudomonas 29
3.- ETAPA 2: Evaluación del antagonismo microbiano in vitro. 30
3.1.- Caracterización molecular Lactobacillus ssp y selección de cepas 30
no clonales
3.2.- Prueba de inhibición selectiva “spot en doble capa” (SDC) 31
3.3.- Prueba de inhibición competitiva en caldo a 8 ºC. 33
3.4.- Identificación molecular de Lactobacillus antagonistas con 35
Pseudomonas en frio
3.5.- Aproximación a la inocuidad de las cepas de Lactobacillus spp. 36
3.5.1.- Prueba de hemólisis 36
3.5.2.- Prueba de susceptibilidad a antibióticos por difusión en agar: 36
4.- ETAPA 3: Evaluación del antagonismo microbiano in situ y extensión 37
de vida útil de la carne de pollo.
4.1.- Prueba de antagonismo in situ en carne de pollo estéril a 8 ºC. 37
4.2.- Prueba de antagonismo in situ en carne de pollo fresca a 8 ºC. 39
4.3.- Determinación de la estabilidad microbiológica de la carne fresca 42
inoculada con el potencial bio-preservante L sakei 63.
4.4.- Diferenciación de L. sakei 63 y L. sakei CECT 4808 43
4.4.1.- RAPD 43
4.4.2.- PFGE 43
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 45
1.- ETAPA 1: Prevalencia, aislamiento, identificación y caracterización de 45
Pseudomonas spp. alterantes.
1.1.- Carga de Pseudomonas spp. y RAP en pollo deteriorado. 45
1.2- Selección e identificación molecular de las especies de 45
Pseudomonas dominantes.
1.3- Caracterización genotípica de Pseudomonas. 46
1.4- Caracterización fenotípica de Pseudomonas. 49
1.5.- Comentario final de la etapa 1. 54
1.6.- Publicaciones derivadas de la etapa 1. 54
2.- ETAPA 2: Evaluación del antagonismo microbiano in vitro. 55
2.1.- Selección y caracterización molecular Lactobacillus ssp 55
2.2.- Prueba de inhibición selectiva “spot en doble capa” (SDC). 55
v
2.3.- Prueba de inhibición competitiva en caldo a 8 ºC. 59
2.4. Identificación molecular de Lactobacillus antagonistas con 62
Pseudomonas en frio.
2.5.- Aproximación a la inocuidad de las cepas de Lactobacillus. 62
2.5.1.- Prueba de hemólisis 62
2.5.2.- Prueba de susceptibilidad a antibióticos por difusión en agar: 62
2.6.- Presentaciones derivadas de la etapa 2. 64
3.- ETAPA 3: Evaluación del antagonismo microbiano in situ y extensión 66
de vida útil de la carne de pollo.
3.1. Prueba de antagonismo in situ en carne de pollo estéril a 8 ºC. 66
3.2. Prueba de antagonismo in situ en carne de pollo fresca a 8 ºC. 68
3.3. Determinación de la estabilidad microbiológica de la carne fresca 75
inoculada con el potencial bio-preservante L sakei 63.
3.4. Diferenciación de L. sakei 63 y L. sakei CECT 4808 76
3.4.1. RAPD 76
3.4.2. PFGE 77
3.5. Publicaciones derivadas de la etapa 3. 77
CONCLUSIONES 78
PROYECCIÓN FUTURA 79
BIBLIOGRAFÍA 80
ANEXOS 97
vi
LISTA DE TABLAS
vii
Tabla 13: Esquema de tratamientos lácticos desafiantes de P. fragi 1.1 34
en la prueba de inhibición en caldo TSBYE a 8 ± 2 ºC durante 4 días.
Tabla 14: Condiciones de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, 36
Polymerase Chain Reaction) utilizadas para la amplificación del gen 16S
rRNA de los Lactobacillus antagonistas con Pseudomonas en frio, y su
posterior identificación molecular.
Tabla 15: Esquema de tratamientos lácticos desafiantes de P. fragi 1.1 39
en la prueba de antagonismo in situ en carne de pollo estéril a 8 ± 2 ºC
durante 4 días.
Tabla 16: Esquema de tratamientos lácticos desafiantes en la prueba de 40
antagonismo in situ en carne fresca de pollo a 8 ± 2 ºC durante 4 días.
Tabla 17: Perfil de resistencia a antibióticos de Lactobacillus 63 y B, 63
potenciales bio-preservantes, y cepas de referencias L. sakei CECT 4808
y L. rhamnosus LGG obtenidos mediante concentración inhibitoria mínima
(CIM) en agar.
viii
LISTA DE FIGURAS
ix
Figura 11: Dendogramas de similitud fenotípica de Pseudomonas 50
predominantes aisladas a partir de filetes de pollo marinados deteriorados
a 4 ºC, según especie, obtenido mediante el análisis de promedio
ponderado (WAG, del inglés Weighted average linkage) a partir del
coeficiente Simple Matching (Distancia SM) calculado en base a la
presencia/ausencia de las variables: capacidad biosurfactante,
proteolítica, lipolítica, lecitinasa y de replicación a 37 ºC. a) 24 P. fragi; b)
14 P. fluorescens; c) 3 P. lundensis; d) 1 Pseudomonas spp.
Figura 12: Susceptibilidad a antibióticos (Sulfametoxazol-Trimetoprim, 53
Polimixina B, Ciprofloxacino, Tetraciclina) de Pseudomonas alterantes
dominantes de filetes de pollo marinados deteriorados a 4 ºC, según
especie y en total, mediante concentración inhibitoria mínima (CIM) en
agar.
Figura 13: Perfiles de sensibilidad a antibióticos (Sulfametoxazol- 53
Trimetoprim, Polimixina B, Ciprofloxacino, Tetraciclina) de Pseudomonas
alterantes dominantes de filetes de pollo marinados deteriorados a 4 ºC,
mediante concentración inhibitoria mínima (CIM) en agar.
Figura 14: Bandas de los perfiles electroforéticos de Lactobacillus spp., 55
obtenidos por amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, del
inglés Random Amplified Polymorphic DNA) con 2 partidores diferentes:
A) M13F (5`-GAG GGT GGC GGT TCT-3`) y B) Oligo (5`-AGC GGG CCA
A-3`).
Figura 15: Dendograma de asociación de 54 Lactobacillus spp. obtenido 56
mediante el análisis de promedio no pareado (UPGMA, Unweighted Pair
Group Method with Arihtmetical Averages) a partir del coeficiente de Dice
calculado según la posición de las bandas de los perfiles electroforéticos
obtenidos por Amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD,
Random Amplified Polymorphic DNA) con el partidor Oligo (5`-AGC GGG
CCA A-3) y tamaño de halo de inhibición (HI) frente a Salmonella
enteritidis ATCC 2190 y Listeria monocytogenes ATCC 19114 utilizando
prueba de spot con doble capa en agar MRS con bicarbonato al 2%,
modificado, sin sustancias inhibidoras de Gram negativos (acetato de
sodio, citrato de amonio).
Figura 16: Halos de inhibición ejercidos por 2 cepas de Lactobacillus spp., 57
X e Y, sobre Pseudomonas lundensis 12.1 en prueba de antagonismo in
vitro spot en doble capa de agar, utilizando agar MRS modificado (sin
acetato de sodio, citrato de amonio) no tamponado (izquierda) y con
bicarbonato al 2% (derecha).
Figura 17: Tamaño de halos de inhibición medios ejercidos por 21 57
Lactobacillus sobre 10 Pseudomonas alterantes aisladas de carne de
pollo, en prueba de antagonismo in vitro spot en doble capa de agar,
utilizando agar MRS modificado (sin acetato de sodio, citrato de amonio)
no tamponado (MRSm; rojo) y con bicarbonato al 2% (MRSm+bic; azul).
Figura 18: Tamaño de halos de inhibición medios de 10 Pseudomonas 58
antagonizadas por 21 Lactobacillus spp., en prueba in vitro spot en doble
capa de agar, utilizando agar MRS modificado (sin acetato de sodio,
x
citrato de amonio) no tamponado (MRSm; rojo) y con bicarbonato al 2%
(MRSm+bic; azul).
Figura 19: Tamaño de halos de inhibición medios ejercidos por 21 58
Lactobacillus sobre 10 Pseudomonas alterantes aisladas de carne de
pollo, en prueba de antagonismo in vitro spot en doble capa de agar,
utilizando agar MRS modificado (sin acetato de sodio, citrato de amonio)
con bicarbonato al 2%.
Figura 20: Tamaño de halos de inhibición medios de 10 Pseudomonas 59
antagonizadas por 21 Lactobacillus spp., en prueba in vitro spot en doble
capa de agar, utilizando agar MRS modificado (sin acetato de sodio,
citrato de amonio) con bicarbonato al 2%.
Figura 21: Recuentos medios de P. fragi 1.1 desafiada por 5 tratamientos 60
lácticos, inoculados en 2 concentraciones iniciales (≈6 log UFC/mL y ≈8
log UFC/mL) durante 6 días, en prueba de inhibición competitiva en caldo
TSBYE a 8 ºC.
Figura 22: Recuentos medios de Lactobacillus desafiantes de P. fragi 1.1, 61
inoculados en 2 concentraciones iniciales (≈6 log UFC/mL y ≈8 log
UFC/mL, en prueba de inhibición competitiva en caldo TSBYE a 8 ºC
durante 6 días.
Figura 23: Hemolisis α o incompleta de L. rhmanosus B, L. sakei 63 y 62
CECT 4808, usado como control, en agar Columbia 5% sangre de
cordero.
Figura 24: Recuentos medios de P. fragi 1.1 desafiada por 3 tratamientos 66
lácticos, co-inoculados en carne de pollo estéril, a diferentes
concentraciones iniciales, almacenados a 8 ºC durante 4 días.
Figura 25: Recuentos medios de Lactobacillus desafiantes de P. fragi 1.1, 67
co-inoculados en carne de pollo estéril, a diferentes concentraciones
iniciales, almacenados a 8 ºC durante 4 días.
Figura 26: Recuentos medios de Pseudomonas spp. en carne de pollo 70
fresca, inoculada con 3 tratamientos lácticos diferentes, a una
concentración inicial ≈8 log UFC/cm 2, almacenada a 8 ºC durante 4 días.
Figura 27: Recuentos medios de Enterobacterias en carne de pollo fresca 70
inoculada con 3 tratamientos lácticos diferentes, a una concentración
inicial ≈8 log UFC/cm 2, almacenada a 8 ºC durante 4 días.
Figura 28: Recuentos medios de Lactobacillus, potenciales bio- 71
preservantes, inoculados en carne de pollo fresca, a una concentración
inicial ≈8 log UFC/cm 2, almacenada a 8 ºC durante 4 días.
Figura 29: Fluorescencia emitida por Pseudomonas fluorescens y/o 71
putida en carne de pollo bio-preservada con diferentes Lactobacillus, a
una concentración inicial ≈8 log UFC/cm 2, posterior a 4 días de
almacenamiento a 8 ºC, observada bajo luz UV.
Figura 30: Rutas metabólicas de Lactobacillus sakei para la producción 74
de metabolitos antibacterianos.
Figura 31: Horas de estabilidad microbiológica, en promedio (rojo) y en 75
cada réplica (amarillo y azul), de la carne de pollo inoculada con diferentes
xi
tratamientos lácticos, potenciales bio-preservantes, a una concentración
inicial ≈8 log UFC/cm 2, almacenada a 8 ºC durante 4 días.
Figura 32: Bandas de los perfiles electroforéticos de Lactobacillus sakei 76
nacional 63 y español, CECT 4808, en geles de agarosa al 1,8%,
obtenidos por amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, del
inglés Random Amplified Polymorphic DNA) con partidor aleatorio Oligo
(5`-AGC GGG CCA A-3`).
Figura 33: Dendograma de asociación de perfiles electroforéticos de 77
Lactobacillus sakei 63, CECT 4808 y ATCC 15521, obtenidos por
electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE, Pulsed-field gel
electrophoresis), digeridos por la enzima SmaI.
xii
LISTA DE SÍMBOLOS, ABREVIATURAS O NOMENCLATURA
xiii
L252: Lactobacillus 252
L63: Lactobacillus 63 (nacional; aislado en la presente tesis)
LB: Lactobacillus B
LDH: Deshidrogenasa láctica
MH: Agar Müller Hinton
MLGM: Modelo lineal general y mixto
MRS: Agar/Caldo De Man, Rogosa, Sharpe
MRS-BICm: MRS-bicarbonato al 2% modificados
MRSm: MRS modificado
NAD+: Nicotinamida adenina dinucleótido oxidado
NADH: Nicotinamida adenina dinucleótido reducido
NADP+: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidado
NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido
O2: Oxígeno
ºC: Grados Celsius
ODEPA: Oficina de Estudios y Políticas Agrarias
OECD: Organisation for Economic Co-operation and Development
(Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos)
OMS: Organización Mundial de la Salud
PCA: Agar plate count
PCR: Reacción de la polimerasa en cadena
PFGE: Electroforésis de campo pulsado
pKa: Constante de disociación ácida
Pol B: Polimixina B
P.: Pseudomonas
QPS: Qualified presumption of safety (Presunción Cualificada de
Seguridad)
RAM: Recuento de aerobios mesófilos
RAP: Recuento de aerobios psicrótrofos
RAPD: Amplificación aleatoria del ADN polimórfico
S.A.: Sociedad anónima
SAG: Servicio Agrícola y Ganadero
SDC: Spot en doble capa
SOD: Superóxido dismutasa
SOMICH: Sociedad de Microbiología de Chile
spp: Se refiere a todas las especies individuales dentro de un género
S-T: Sulfametoxazol-trimetroprim
Tet: Tetraciclina.
Tris: Trisaminometano
TSA: Agar tripticasa soya
xiv
TSA: Agar tripticasa soya 0,6% extracto levadura
TSB: Caldo tripticasa soya
TSBYE: Caldo tripticasa soya 0,6% extracto levadura
UFC: Unidades formadoras de colonias
USDA: United States Department of Agriculture (Departamento de
Agricultura de los Estados Unidos)
UV: Ultravioleta
VRBG: Agar Bilis Glucosa con cristal violeta y rojo neutro
xv
RESUMEN
xvi
ABSTRACT
xvii
INTRODUCCIÓN
1
bacterias de la misma especie tienen diferente cinética frente un mismo agente
antibacteriano (Foweraker et al., 2005). Esta información debe ser considerada
dentro de los ensayos de antagonismo, y eventuales modelamientos predictivos de
la cinética bacteriana (Aguirre et al., 2009; Lianou y Koutsoumanis, 2011).
Entre las intervenciones tradicionales utilizadas para retardar el deterioro de
la carne de ave y controlar los patógenos asociados, se encuentran el envasado al
vacío o en atmósferas modificadas. Ambas tecnologías desplazan el oxígeno
disponible en los envases y así inhiben la multiplicación de las bacterias alterantes
aeróbicas estrictas, como la mayoría de las Pseudomonas spp. (Narasimha y
Sachindra, 2002). Sin embargo, P. fluorescens puede utilizar nitratos como
aceptores finales de electrones para su respiración, no siendo afectada por estas
tecnologías (Palleroni, 2007).
Otra estrategia habitualmente utilizada es la desinfección final de las
carcasas con productos químicos, ya que disminuye la carga inicial de bacterias en
la carne. En Chile habitualmente se aplica hipoclorito de sodio debido a su bajo
costo, no obstante su uso es controversial en muchos países, ya que pueden
producir residuos potencialmente genotóxicos y carcinogénicos. Otros sanitizantes
químicos inocuos, como el dióxido de cloro o clorito de sodio acidificado, han sido
efectivos biocidas aplicados sobre las carcasas de pollo (EFSA, 2008; FAO/OMS,
2008). No obstante lo anterior, hoy son los consumidores los que demandan
productos mínimamente procesados, preparados con la menor cantidad de
conservantes y aditivos químicos (Roman et al., 2017).
La biopreservación es una tecnología relativamente reciente, basada en la
incorporación de bacterias vivas a la superficie de la carne que antagonizan con las
no deseadas (patógenas y/o alterantes), extendiendo su vida útil (Rodgers, 2001;
Garcha y Natt, 2012). Cada vez es más utilizada en reemplazo de los preservantes
sintéticos, ya que se considera como una tecnología natural bastante aceptada por
los consumidores (Gaggia et al., 2011; Salem, 2012; Silva et al., 2018).
Actualmente esta tecnología ha sido efectiva para retardar el deterioro de la
carne de vacuno envasada al vacío o en atmósfera modificada (Katikou et al., 2005;
Castellano et al., 2010), pero no se encuentra evidencia que extienda la vida útil de
la carne de pollo.
Considerando que múltiples estudios señalan que el éxito de la bio-
preservación radica tanto en la capacidad antimicrobiana de la cepa antagonista
como en la sensibilidad de la bacteria desafiada y la matriz alimentaria utilizada
(Jones et al., 2008; Dortu et al. 2008; Santini et al., 2010; Hatew et al., 2011), es
que esta tesis doctoral postuló que si Pseudomonas alterantes de pollo son
sensibles in vitro frente a cepas de Lactobacillus spp. a 8ºC, entonces, estos
últimos, se podrán usar como bio-preservantes que extenderán la vida útil de la
carne de pollo refrigerada.
2
ANTECEDENTES
Otros*
1,1%
Broilers
88,8%
Bovinos
14,1%
Aves
50,3%
Porcinos
34,5%
Pavos
Gallinas y 10,5%
más*
0,7%
3
cuando ocurrió un par de Brotes de influenza aviar de baja patogenicidad afectando
algunos planteles de pavo [Figura 2] (Giacomozzi, 2015; Gutiérrez, 2017; ODEPA
2018).
800.000,0
700.000,0
600.000,0
Toneladas
500.000,0
400.000,0
300.000,0
200.000,0
100.000,0
0,0
Años
4
Hong Kong (1,4%), quienes suman 94,5% del valor de los envíos (SERVICIO
NACIONAL DE ADUANAS, 2018).
450
400
Millones US$ 350
300
250
200
150
100
50
0
Años
5
literatura da cuenta de la vulnerabilidad de la cadena de frío durante el transporte
de los alimentos en el mundo. Este riesgo aumenta con la distancia de los mercados
(Mercier et al., 2017), por lo tanto, la probabilidad de deterioro y porcentaje de
pérdidas asociadas a productos chilenos es mayor que para otros países
exportadores. Actualmente, la industria chilena sólo exporta productos congelados
(Servicio Nacional de Aduanas, 2018), desperdiciando los mejores precios pagados
a nivel internacional por la carne fresca (FAO, 2018; Tridge, 2018; Hahn, 2018,
comunicación personal*). Si la industria nacional lograra extender la vida útil de sus
productos, podría aprovechar esta oportunidad, maximizando sus ganancias.
Tiempo Tiempo
Distancia navegación a 20 navegación a 30
País destino (Puerto)
(Km) nudos de nudos de
velocidad (días) velocidad (días)
EEUU (San Francisco) 9.697 10,9 7,3
México (Acapulco) 6.393 7,2 4,8
Puerto Rico (San Juan) 6.776 7,6 5,1
China (Shanghái) 19.605 22,1 14,7
Reino Unido (Gibraltar)* 12.982 14,6 9,7
Alemania (Hamburgo) 14.362 16,2 10,8
Holanda (Róterdam) 13.827 15,6 10,4
Hong Kong (Hong Kong) 20.675 23,3 15,5
*Distancias calculadas con la herramienta en línea de MarineTraffic (2018) y corroborados
con datos del SHOA (1997).
6
*Hahn, Bill. USDA-ERS. 2018. Comunicación personal: Bulk frozen chicken v/s bulk fresh
chicken Prices. Correo electrónico whahn@ers.usda.gov Fecha: 5 septiembre 2018.
microorganismos patógenos y alterantes que causan su deterioro (Figueroa et al.,
2009; Vihavainen y Björkroth, 2010).
La microbiota de la carne de ave fresca es heterogénea, inherente al lugar
de producción y evoluciona durante las etapas de la faena y desposte. Su
composición depende de la carga microbiana de las aves vivas y su estatus
fisiológico al momento de la faena, del medio ambiente, prácticas sanitarias e
higiénicas de la industria, del diseño de los equipos existentes en el matadero y
planta de proceso, del tipo de corte, uso de marinado, empaque utilizado y del
control de la temperatura durante la producción, venta y distribución. De ahí la
necesidad de investigar cuáles son las especies bacterianas predominantes en la
carne según el origen de la misma (Upon, 1995; Nychas et al., 2008; Figueroa et
al., 2009; Nieminen et al., 2012).
La multiplicación microbiana es favorecida por los atributos físico-químicos
de la carne de pollo, de ahí su condición de “altamente perecible”. Se caracteriza
por tener alta actividad de agua, pH relativamente neutro (5,6-6,4) y alta variedad
de nutrientes, incluyendo carbohidratos (como glucógeno, glucosa, glucosa-6-
fosfato, ribosa), aminoácidos, nucleótidos, minerales, y vitaminas B que soportan a
las diversas poblaciones microbianas (Vihavainen y Bjôrkroth, 2010).
El deterioro de la carne refrigerada se produce principalmente por la
multiplicación de las alterantes en su superficie, incluso a temperaturas de
almacenamiento de -4ºC (Bailey et al., 2000). Será evidenciado por un cambio
progresivo de las propiedades organolépticas durante el almacenamiento,
distribución y venta del pollo (Nychas et al., 2008), debido al aumento de
compuestos no deseados como alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres, amonio,
compuestos azufrados, aminas biógenas (putrescina y cadaverina) y limo, entre
otros, derivados del metabolismo bacteriano (Casaburi et al., 2015; Geornaras et
al., 1995).
La temperatura y la atmósfera de envasado son los factores más
importantes que afectan la multiplicación y la selección microbiana durante el
almacenamiento de la carne fresca. Cuando ocurre el deterioro, la carga bacteriana
total ha aumentado, sin embargo, ambos factores ejercen una presión de selección
que disminuye la diversidad de especies, e incluso de cepas, en comparación con
la microbiota inicial de la carne (Casaburi et al., 2015; Chaillou. et al., 2015).
La mantención de la cadena de frio es fundamental para evitar el deterioro
temprano de la carne, ya que retrasa la multiplicación de las bacterias psicrótrofas,
extendiendo su fase lag y tiempo de generación, e inhibe a las mesófilas. Pequeños
incrementos en la temperatura pueden estimular la multiplicación microbiana, lo que
tiene un efecto crítico sobre la calidad del producto (Zhang et al., 2012). La
legislación chilena indica que la carne de ave refrigerada debe almacenarse y
transportarse a 4 ºC o menos (Gobierno de Chile, 2010), no obstante no es poco
frecuente que la temperatura en los anaqueles de supermercados y refrigeradores
del hogar sobrepasen esa temperatura (Likar y Jevsnik, 2006; Koutsoumanis et al.,
2010).
El periodo de vida útil del pollo es definido como el tiempo en el cual el
producto alimenticio permanece inocuo, mantiene sus características sensoriales,
7
químicas, físicas, microbiológicas y nutricionales declaradas en la etiqueta, cuando
se almacena bajo las condiciones recomendadas (Kilcast y Subramaniam, 2000).
La vida útil coincide con el tiempo en el que la carga bacteriana de la carne
alcanza los 7,0-8,0 log UFC/g; a partir de ese nivel comienzan a ser perceptibles
los cambios organolépticos de la carne (olores, color, limo) (Vihavainen y Bjôrkroth,
2010).
La vida útil de la carne de ave es altamente variable, dependiente de la carga
inicial de bacterias alterantes psicrótrofas, temperatura de almacenamiento, y tipo
de envasado (ICMSF, 2011). La vida útil puede variar entre 4 a 12 días en envases
con oxígeno o con alta actividad de agua (Aw), entre 7 y 15 días al vacío y entre 15
y 17 días en atmósfera modificada (60-80% CO2), aun cuando las carcasas hayan
sido almacenadas bajo temperatura de refrigeración (Jiménez et al., 1997; James,
2000; Kim y Bin Song, 2004; Pirola et al., 2011)
8
Leuconostoc spp, y Brochothrix thermosphacta (Smolander et al., 2004; Björkrotha
et al., 2005; Vignolo et al., 2010; Vihavainen y Bjôrkroth, 2010).
2.1.1. Pseudomonas
Pseudomonas pertenece a la familia Pseudomonadaceae de la clase
Gammaproteobacteria y es considerado como uno de los grupos de bacterias Gram
negativas más heterogéneo y complejo. Incluye bacilos oxidasa positivos, móviles,
no formadores de esporas y aerobios estrictos, aunque algunas especies, como P.
fluorescens, pueden utilizar nitratos como aceptor final de electrones, lo que les
permite reproducirse en anaerobiosis (Palleroni, 2007). Son bacterias ubicuas,
habiéndose aislado de gran variedad de fuentes, como suelo, agua dulce, humanos,
plantas, animales, cosméticos, productos e instrumentos médicos y alimentos de
origen animal y vegetal (Raposo et al., 2017).
La taxonomía de las Pseudomonas continúa evolucionando
progresivamente; durante los últimos 10 años se han descrito más de 70 nuevas
especies, quedando en evidencia la gran diversidad del género (Peix et al., 2018).
9
La mayoría de las Pseudomonas son psicrótrofas, es decir, se han adaptado
para multiplicarse en temperaturas de refrigeración e incluso, se ha observado que
algunos pueden hacerlo a temperaturas de congelación (-6 ºC) (Sulzbacher, 1950).
Pseudomonas spp. ingresa al matadero de pollos, principalmente, a través
de las plumas o patas de las aves vivas o por el suministro de agua o hielo o por
medio de los manipuladores (Geornaras et al., 1999; Rouger et al., 2017).). Una vez
ingresada la bacteria a la planta, puede persistir en las superficies por largos
periodos de tiempo, formando bio-películas, que le otorgan resistencia a
condiciones medio ambientales desfavorables (Masák et al., 2014).
Pseudomonas spp. alcanza la carne de pollo por contaminación cruzada en
cualquier etapa de la faena, desposte o proceso, cuando el músculo del pollo toma
contacto con superficies, agua y, eventualmente, aire contaminado con la bacteria
(Hinton et al, 2004; Vihavainen et al, 2007). El recuento de Pseudomonas spp. en
carne de pollo fresca es variable en inherente al origen de la carne. Además,
mientras mayor sea la manipulación de la carne, mayor será también la probabilidad
de contacto y la carga bacteriana en su superficie; así es como una carcasa
completa de pollo tiene menor carga bacteriana que al trozarla y menor que al
envasarla (3,30 log CFU/cm 2, 3,81 log CFU/cm 2 y 4,08 log CFU/cm2
respectivamente) (Cerveny et al., 2009). Este dato es de vital importancia
considerando el mercados internacional exige productos frescos y trozados.
Pseudomonas spp. deteriora la carne gracias a sus capacidades
proteolíticas, lipolíticas, sacarolíticas y biosurfactantes derivadas de la producción
de diversas enzimas. Éstas aumentan la disponibilidad de nutrientes en la superficie
del alimento para las bacterias, contribuyendo con su sobrevida y multiplicación
(Casaburi et al., 2015; Mellor et al., 2011; Nychas et al., 2008). El tiempo de
generación de Pseudomonas spp. en carne refrigerada es rápido, 7,6 horas a 2º C
y 2,8 horas a 10º C (Herbert y Sutherland, 2000). Una mayor tasa de replicación
aumenta la probabilidad de deterioro de los alimentos, especialmente si la cadena
de frío se rompe entre la distribución y el consumo (Doulgeraki et al., 2012).
El metabolismo versátil de las Pseudomonas spp. le otorga ventajas
comparativas frente a otras de la microbiota del pollo. En la carne utiliza, al igual
que otras bacterias, la glucosa como primera fuente de energía, pero una vez
agotada ésta en el medio, es capaz de metabolizar una serie de sustratos [Tabla 2]
e incluso la mayor parte de los aminoácidos, multiplicándose a la misma velocidad
que cuando lo hacen a expensas del carbohidrato esto explica su prevalencia en el
pollo deteriorado (Gill y Newton, 1977; Casaburi et al., 2015). Derivados de su
metabolismo se producen compuestos como amonio, dimetil sulfuro, dimetil
disulfuro aminas no volátiles, como putrescina y cadaverina, metanol, etanol y limo,
entre otros (Freeman et al., 1976; Doyle, 2007).
Viehweg et al. (1989) observaron que Pseudomonas spp. produce más
compuestos azufrados que cualquier otra bacteria alterante, y que estos
compuestos enmascaran otros volátiles menos odoríferos cuando se realizan
evaluaciones subjetivas con un panel de humanos. Russel et al. (1996) reportaron
que bacterias aisladas de carcasas de pollos deteriorados a 3 ºC, que producen
consistentemente olores similares al amoniaco, azufre, trapos o calcetines sucios,
entre otros, fueron Pseudomonas fluorecens, P. fragi y P. putida. Arnaut-Rollier et
10
al. (1999) reportaron que bacterias del género Pseudomonas dan cuenta de menos
del 20% de la microbiota inicial de la carne fresca, mientras que al día 8 de
almacenamiento en refrigeración (3 ºC) aumentan al 87,5%.
11
generación del ambiente microaerófilo necesario para la supervivencia aeróbica de
Campylobacter jejuni, un importante patógeno entérico presente en la superficie de
la carne del pollo (Hilbert et al., 2010).
Se estima de vital importancia controlar la multiplicación de Pseudomonas
spp. tanto para extender la vida útil, como para mejorar la inocuidad de la carne de
ave.
3.- Bio-preservación
La bio-preservación es un método innovador para extender la vida útil de los
alimentos y reducir el riesgo de contaminación bacteriana utilizando
microorganismos o sus metabolitos (Rodgers, 2001; Garcha y Natt, 2012). Cada
vez es más utilizada en reemplazo de los preservantes sintéticos, ya que, además
de retrasar el deterioro, es considerada como una tecnología natural que utiliza
generalmente, microorganismos probióticos, con beneficios para la salud de las
personas, por lo que es bastante aceptada por los consumidores (Gaggia et al.,
2011; Salem, 2012; Silva et al., 2018).
Esta tecnología se basa en el antagonismo microbiano donde la inhibición
de los microorganismos se produce por la competencia de nutrientes y/o por la
producción de metabolitos antimicrobianos por parte de ciertas bacterias, conocidas
como agentes bio-preservantes o bio-controladores (Brashears et al., 2005; Trias
et al., 2008; Vásquez et al., 2009].
La bio-preservación se utilizó en forma masiva y empírica en alimentos
fermentados, hoy ha evolucionado y algunas cepas bacterianas con capacidad bio-
controladora han sido seleccionadas y utilizadas en alimentos no fermentados y
refrigerados, como la carne de vacuno, pero poca evidencia existe sobre su
efectividad en carne de pollo (Brashears et al., 1998; Katikou et al., 2005; Dortu et
al., 2008; Maragkoudakis et al., 2009; Castellano et al., 2010; Gaggia et al., 2011;
Salem, 2012; Sakaridis et al., 2014).
Amézquita y Brashears (2002) indican que las BALs ejercen su antagonismo
en refrigeración, incluso sin multiplicarse, cuando se adicionan al alimento en altas
concentraciones (>107 UFC/g).
En general, los agentes bio-controladores más utilizados en la industria de
los alimentos son las bacterias ácido lácticas (BALs), ya que poseen un largo
historial de uso inocuo en los alimentos, forman parte de la microbiota intestinal de
humanos y animales, se encuentran en forma natural en carne, verduras, lácteos y
en alimentos fermentados (Stiles, 1996; Vaughan et al., 2002; Gaggia et al., 2011).
La bio-preservación puede ser aplicada en cárnicos por cuatro métodos
básicos (Vásquez, et al., 2009):
1. Añadiendo un cultivo puro de BALs viables productoras de alguna sustancia
antagonista.
2. Añadiendo BALs mesófilas como una protección contra el abuso de
temperatura.
3. Añadiendo preparaciones de bacteriocina cruda (extracto crudo).
12
4. Adicionando sustancias antagónicas puras o semipuras como las
bacteriocinas producidas por BAL.
No obstante lo anterior, adicionar bacteriocinas para la bio-preservación de
la carne es menos recomendable que utilizar BALs, ya que se adsorben a las
proteínas o grasa y se degradan por proteasas, que frecuentemente se encuentran
en la carne, no quedando disponibles para ejercer su efecto antagonista con las
bacterias de la microbiota (Aasen, et al., 2003; Favaro y Todorov, 2017)
13
La actividad antimicrobiana de los ácidos orgánicos y del pH es
complementaria. No obstante, la fracción no disociada de los ácidos orgánicos es
la que posee una mayor actividad inhibidora debido a su naturaleza lipofílica, ya
que pueden atravesar la membrana celular y disociarse en el citoplasma (que
generalmente tiene un pH mayor que el extracelular). Estas moléculas pueden
ejercer dos efectos: por un lado interfieren con funciones celulares, como puede ser
la translocación de sustrato y la fosforilación oxidativa, y por otro lado, la disociación
de los ácidos orgánicos provoca el incremento de protones en el interior celular.
Cuando la concentración de protones excede la capacidad tampón del citoplasma
se transportan hacia el exterior mediante bomba de protones, reduciendo las
reservas energéticas de la célula. Cuando estas reservas se agotan, la bomba de
protones se detiene y se provoca el descenso del pH interno, lo cual causa a su vez
desnaturalización de las proteínas y desestabilización de otros componentes
estructurales y funcionales de las células, interfiriendo así con la viabilidad de la
célula (Vásquez et al., 2009).
Las bacterias lácticas pueden sobrevivir y multiplicarse en presencia de pH
ácido gracias a estrategias concomitantes. Poseen un sistema de eflujo simultáneo
de ácido láctico y de protones al exterior celular, incluyendo bombas de protones
(ATPasas transmembrana) más permeables, en mayor cantidad y más estables a
pH bajo. Además pueden alcalinizar el citoplasma asociado a los sistemas
glutamato descarboxilasa (GAD) y/o arginina deiminasa (ADI). El primer sistema
internaliza a un aminoácido (lisina, arginina o glutamato), lo descarboxila mediante
la glutamato descarboxilasa, utilizando un protón e intercambia el producto
descaboxilado (cadaverina, agmatina, gama-aminobutyrato) por un nuevo
aminoácido. El sistema ADI por su parte, cataboliza a la arginina en ornitina, amonio
y CO2, mediante las enzimas arginina deiminasa, ornitina transcarbamilasa y
carbamatokinasa (Cotter y Hill, 2003).
14
+ Fe2+) o de Haber-Weiss (•O2- + H2O2 •OH + OH- + O2) (Juven y Pierson, 1996;
Miyoshi et al., 2003).
3.1.3.- Diacetilo
El diacetilo (2,3-butanediona) es conocido como uno de los principales
compuestos responsables del aroma y flavor de la mantequilla (Jay, 1982). Es
producido por la mayoría de las especies de BALs, pero su habilidad de producción
varía entre cepas de la misma especie (Keenan y Lindsay, 1968; El-Gendy et al.,
1983).
Este compuesto es producido por la mayoría de las BALs que son capaces
de metabolizar citrato como fuente de energía y también por las
homofermentadoras cuando la concentración de carbohidratos disponibles en el
medio es limitada, a partir del piruvato (Mayo et al., 2010).
El diacetilo tiene un amplio efecto antibacteriano a pH <7, inhibe a hongos, bacterias
Gram negativas y, en menor medida, a Gram positivos, siendo los más resistentes
Lactobacillus (Jay, 1982). El efecto antibacteriano se debe a que la molécula
reacciona con compuestos que tienen un núcleo de guanidina, como la arginina
entre otros (Harden y Norrys, 1911). Así es capaz de bloquear el uso del aminoácido
por parte de las bacterias y/o inactivar la zona catalítica de algunas enzimas
bacterianas (Jay et al., 1983; Lindgren y Dobrogosz, 1990).
15
3.1.4.- Reuterina
La reuterina (3-hidroxipropionaldehído; 3-HPA) es una sustancia neutra,
soluble en agua y de naturaleza aldehídica producida, tradicionalmente, por la
mayoría de las cepas de Lactobacillus. reuteri cuando metabolizan
anaeróbicamente al glicerol, gracias a la glicerol dehidratasa (Talarico et al., 1988).
Aquellas cepas que no poseen dicha enzima, no son capaces de producir al agente
microbiano (Cadieux et al., 2008). En cambio, se ha observado que otras especies
de Lactobacillus pueden hacerlo, como L. collinoides y L. coryniformis, (Sauvageot
et al., 2000; Martín et al., 2005).
La reuterina es una sustancia de amplio espectro antibacteriano, que inhibe
protozoos, hongos y bacterias, tanto Gram negativas, como positivas, siendo las
menos sensibles las BALs (Talarico et al., 1988; Axelsson et al., 1989). El efecto
antibacteriano se debe a que la reuterina induce estrés oxidativo, reaccionando con
los grupos tioles de proteínas y otras pequeñas moléculas (Schaefer et al., 2010).
3.1.5.- Bacteriocinas
Las bacteriocinas son un abundante y diverso grupo de péptidos
antimicrobianos, sintetizados ribosómicamente, compuestos usualmente por 30 a
60 aminoácidos y secretados extracelularmente (Dobson et al., 2012; Goda, 2012).
Actualmente se acepta que las bacteriocinas se clasifican en 2 grupos: a)
Clase I o lántibioticos: pequeños péptidos (<5 KDa), termo-estables, que contienen
aminoácidos modificados en su estructura (lantionina, 3-methyl-lantionina,
aminoácidos deshidratados, S-aminovinil-cisteina,entre otros), como la Nisina o
Lactocina S; b) Clase II: pequeños péptidos (<10 KDa), termo-estables, que no
contienen aminoácidos modificados, como la Pediocina PA-1 o Sakacina. Algunos
autores agrupan a los péptidos antimicrobianos grandes (>25 KDa) y generalmente
termo-lábiles en la clase III, entre ellos se encuentran las enzimas líticas o
bacteriolisinas y otras moléculas no líticas, como la Lisostafina o Enterolisina A.
(Klaenhammer, 1993. Hugas, 1998; Cotter et al., 2005; De Vuyst y Leroy, 2007; De
Freire et al., 2010).
La producción de bacteriocina es un rasgo fisiológico crecimiento
dependiente y, por lo tanto, sigue una cinética de metabolitos primarios (De Vuyst
y Leroy, 2007). Pueden servir como péptidos “colonizadores” de nichos ecológicos
ocupados por otras bacterias, pero además se conoce que son moléculas de
señalización o de percepción de quórum (“quorum sensing” en inglés), útiles tanto
para autoactivar su transcripción, como para comunicarse con otras bacterias
activando, eventualmente, alguno de los genes estresantes, que limitan su
multiplicación (Dobson et al., 2012).
El efecto antibacteriano de las bacteriocinas es variable, puede ser
bactericida o bacteriostático y afectan, en general, a especies Gram positivas,
próximas con la cepa bacteriocinogénica o que se encuentran en el mismo nicho
ecológico (Collins, et al., 2010). La actividad contra las bacterias Gram negativas
también se ha observado, pero sólo cuando la integridad de la membrana
bacteriana externa se encuentra comprometida, como por ejemplo después de un
shock osmótico, pH bajo, en la presencia de detergentes o quelantes o después de
16
un tratamiento con altas presiones. (De Vuyst y Leroy, 2007). Si bien aún el modo
de acción de todas las bacteriocinas no está elucidado, se puede establecer una
función común de acuerdo a su clasificación (Cotter et al., 2005).
Figura 5: Modo de acción de las bacteriocinas producidas por bacterias ácido lácticas
(BALs)
Adaptado de Cotter et al., 2005.
17
3.2.- Requisitos para seleccionar BALs como biopreservante
Para que una BAL sea considerada como potencial bio-preservante de la
carne de ave, debe sobrevivir y poseer capacidad antagónica frente a bacterias
patógenas y/o alterantes bajo temperaturas de refrigeración, pero además deben
ser inocuas, no poseer resistencia a antibióticos y alterar mínimamente las
características organolépticas en la carne cuando se ha almacenado bajo las
recomendaciones del productor (Amézquita y Brashears, 2002; Maragkoudakis et
al., 2009; Sakaridis et al., 2014).
18
capacidad antagonista y el resto inhibiendo al menos a una de las tres cepas de
Campylobacter estudiadas.
Hatew et al. (2011) evaluaron la actividad antimicrobiana de 200 cepas
presuntivas de Lactobacillus spp. aisladas desde contenido intestinal de pollo frente
a Pseudomonas aeruginosa, encontrando sólo 1 cepa con actividad antagonista,
identificada como Lactobacillus plantarum vN. Además reportaron que el
compuesto antimicrobiano producido por esta BAL no ha sido descrito
anteriormente, fue designada como vN-1, caracterizada por un bajo peso molecular
(<1kD), resistencia a proteasas y catalasas, estable a diferentes pH (2,0-8,0) y alta
temperatura.
Tirloni et al. (2014) evaluaron la actividad antimicrobiana de Lactobacillus
animalis SB310, L. paracasei subsp paracasei SB137 y su interacción sobre
bacterias alterantes de la carne como Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
putida y bacterias patógenas, determinando que cada BAL por sí sola presenta
actividad antagonista y que en la mayoría de los casos la interacción de las mismas
produce mayores halos de inhibición que los Lactobacillus por si solos. También
concluyeron que la actividad antimicrobiana se debió a la producción de ácidos
orgánicos producidos por las BALs y no a otros bio-compuestos inhibidores.
Destacan la necesidad de realizar estudios in vivo para evaluar el potencial
biopreservante de estas cepas.
En la Unidad de Investigación realizada por mí en el Laboratorio de
Microbiología y Probióticos del INTA (2014, no publicado) pude evaluar la capacidad
antimicrobiana de 32 cepas de Lactobacillus spp, aislados desde contenido
intestinal aviar, frente a S. enteritidis, L. monocytogenes y E. coli, identificándose
que el 78% (25/32) tiene actividad antagónica, sobre a S. enteritidis, E. coli, y/o L.
monocytogenes. La acción antibacteriana estaba ligada a la presencia de
compuestos con actividad diferentes a los ácidos orgánicos. La mayoría de estas
cepas presentaron actividad simultánea frente a las 3 bacterias patógenas
desafiadas (24/25), mientras que una cepa presentó actividad antagónica sólo
sobre las bacterias Gram negativas (S. enteritidis y E. coli).
19
tratamientos lácticos no inducían cambios organolépticos en los fiambres al día 28
de incubación.
Vermeiren et al. (2006) demostraron que Lactobacillus sakei subsp.
carnosus (10A) no productor de bacteriocinas es capaz de extender la vida útil del
jamón cocido envasado al vacío y almacenado a 7 ºC, retrasando la multiplicación
de las bacterias alterantes Brochothrix thermosphacta y Leuconostoc
mesenteroides. No obstante, también demostraron que una cepa de Lactobacillus
sakei 148 productora de la bacteriocina lactocina S no ejerce el mismo efecto.
Casaburi et al. (2016) utilizaron al Lactobacillus curvatus productor de
sakacina X, T y P como cepa iniciador en cecinas fermentadas y evaluaron su
potencial bio-preservante durante la fermentación. Ellos demostraron que la cepa
produce bacteriocinas in situ en la cecina y que además controla la multiplicación
de L. monocytgenes, enterobacterias, levaduras y hongos, pero no S. aureus,
manteniendo las características tecnológicas de la cecina y, modificando levemente
las organolépticas. El producto final fue percibido como menos dulce y menos
picante pero con un mayor sabor a maduración.
20
Maragkoudis et al. (2009) inocularon carne de ave tanto con Enterococcus
faecium PCD71 y L. monocytogenes, como con Lactobacillus fermentum ACA-
DC179 y las probaron en su capacidad para inhibir a Salmonella Enteritidis. Los
resultados demostraron que ambas BALs retrasaban la multiplicación de las
bacterias patógenas, sin producir los cambios bioquímicos asociados al deterioro
de la carne de ave almacenada en refrigeración (8-10ºC) durante 7 días.
Castellano et al. (2010) evaluaron la capacidad biopreservante de
Lactobacillus curvatus CRL705, productora de lactocina 705 y lactocina AL705,
sobre carne de vacuno envasada al vacío. Ellos demostraron que luego del
almacenamiento durante 60 días a 2ºC, este microorganismo se vuelve el
predominante y controló la multiplicación de Brochothrix thermosphacta y de otras
bacterias lácticas alterantes naturalmente presentes en la carne, sin afectar las
características sensoriales y estructurales de la carne.
Sakaridis et al. (2014) evaluaron la actividad antagonista de un Lactobacillus
salivarius, aislado a partir de una carcasa de pollo, sobre Salmonella spp. y L.
monocytogenes inoculados en piel y carne de pollo tratados con radiación UV,
además de estimar su efecto sobre las características organolépticas de la carne.
Como resultado, la bacteria láctica retrasó la multiplicación de los patógenos en
ambas matrices, en conjunto con disminuir el limo sobre la carne, mejorando su
apariencia general al día 7 de incubación a 7 ºC.
Goodarzi et al. (2016a) evaluaron la capacidad antagónica de diferentes
concentraciones de un L. acidophilus frente a E. coli O157H7 en carne de vacuno
no estéril, co-inoculada con ambas cepas bacterianas, envasada al vacío y
almacenada a 4 ºC. Ellos demostraron que la magnitud del antagonismo depende
de la concentración inicial de la bacteria láctica. Además evidenciaron que el
antagonismo se produce aun cuando el Lactobacillus no se multiplica en la carne y
debido, principalmente, a la producción de H2O2. Posteriormente, el mismo grupo
de investigadores manipuló genéticamente a la bacteria láctica para aumentar su
capacidad de producción de peróxido de hidrógeno, logrando una mayor la vida útil
de la carne que la BAL inicial (Goodarzi et al., 2016b).
Da Costa et al. (2018), evidenciaron que BALs aisladas partir de fruta,
antagonistas in vitro con Salmonella enteritidis, S. typhimurium, Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa y Listeria monocytogenes son capaces de
antagonizar con S. enteritidis in situ en carne de pollo estéril almacenada a 4 ºC, de
una manera dependiente de la producción de ácidos orgánicos.
Martínez et al. (2018) publicaron una patente comercial de un bio-
preservante multibacteriano que incluye: Lactobacillus paracasei tolerans,
Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus pentosus plantarum
Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus allimentarius y Lactobacillus plantarum.
Este bio-preservante es vendido en polvo y se utilizaría al momento del marinado
de la canal. Ellos indican que el consorcio bacteriano es capaz de multiplicarse
desde los 4 ºC en la superficie de la carne y retarda el deterioro del pollo en 4 días,
considerando una vida útil sin biopreservante de 7 días, en comparación con 11
días con el biopreservante.
La evidencia científica demuestra la viabilidad de uso de BALs como cultivos
protectores frente a bacterias patógenas y/o alterantes en productos cárnicos. No
21
obstante, también se demuestra que el éxito de esta estrategia depende tanto de la
BAL seleccionada, como de la bacteria desafiada y la matriz alimentaria utilizada.
Para retardar el deterioro de la carne de ave nacional envasada en
aerobiosis es fundamental limitar la multiplicación de las bacterias alterantes
primarias, como Pseudomonas. Es por esto que para acercarnos a la fabricación
de un potencial bio-preservante y aumentar la estabilidad microbiológica de la carne
de pollo, primero se describió la diversidad de especies y cepas de Pseudomonas
presentes en la matriz y, posteriormente, se evaluó su sensibilidad frente a las BALs
potenciales biopreservantes.
22
HIPOTESIS
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
23
MATERIALES Y MÉTODOS
24
2.1.- Carga de Pseudomonas spp. y RAP en pollo deteriorado.
Se evaluaron los recuentos de Pseudomonas spp. y de aerobios psicrótrofos
en 12 bandejas de filetes de pechugas de pollo marinado (15%) con diferente
número de lote y fecha de vencimiento, de la principal empresa avícola nacional. El
marinado contiene agua, polifosfatos de sodio, sal, carragenina, goma guar y
maltodextrina.
Cada bandeja fue adquirida en supermercados locales, el primer día en que
fue puesta a la venta al público. Luego, fue transportada al laboratorio de
Microbiología y Probióticos del INTA, manteniendo la cadena de frío (<4 ºC), donde
fue almacenada (deteriorada) a 4 ± 2 ºC en un refrigerador (CFL 633, Haier, China)
hasta 2 días después de completar la vida útil señalada en cada envase. Se registró
el número de lote, las fechas de compra, de vencimiento y de proceso para análisis
microbiológico y el tiempo total de almacenamiento de cada muestra [Tabla 4]
Tiempo
Muestreo Fecha Fecha Fecha
Número Lote almacenamiento
Nº compra vencimiento proceso
(días) a 4ºC
1 14141000 10-oct 18-oct 20-oct 10
2 14146000 14-oct 22-oct 24-oct 10
3 14241000 16-oct 25-oct 27-oct 11
4 14244000 20-oct 28-oct 30-oct 10
5 14245000 21-oct 29-oct 31-oct 10
6 14341000 22-oct 01-nov 03-nov 12
7 14343000 24-oct 03-nov 05-nov 12
8 14346000 28-oct 06-nov 08-nov 11
9 14441000 30-oct 08-nov 10-nov 11
10 14443000 03-nov 10-nov 12-nov 9
11 14641000 05-nov 15-nov 17-nov 12
12 14643000 07-nov 17-nov 19-nov 12
*RAP= recuento de aerobios psicrófilos
25
Oxoid, Reino Unido) (72-120 horas a 20 ± 2ºC) (Arnaut-Rollier et al., 1999). Los
resultados fueron reportados como Log10 unidades formadoras de colonias por
gramo (log UFC/g).
26
mix (Promega, EEUU) y 0.5 uM de cada partidor. En la Tabla 6 se especifican las
secuencias de los partidores y el tamaño del amplicón esperado para la reacción.
27
oligonucleótido (Oligo). Se usó agua estéril y ADN de P. fluorescens ATCC 13525
como controles negativo y positivo respectivamente.
La amplificación fue realizada en termociclador (MultiGene™ OptiMax,
Labnet international Inc., USA) bajo las condiciones establecidas en la Tabla 9 en
triplicado.
28
utilizó el coeficiente Dice (% similitud Dice) para establecer la semejanza genética
entre los patrones de ADN. A partir de estos valores se construyó el dendograma
de asociación mediante el análisis de promedio no pareado (UPGMA, Unweighted
Pair Group Method with Arihtmetical Averages). Pseudomonas con un coeficiente
de Dice mayor al 85% fueron considerados similares genéticamente y agrupadas
en un grupo RAPD común, denominado como tipo RAPD (Aslam y Service, 2008).
29
3.- ETAPA 2: Evaluación del antagonismo microbiano in vitro
En la segunda etapa se evaluó y seleccionó cepas de Lactobacillus spp con
actividad antagonista in vitro frente a Pseudomonas spp. alterantes provenientes de
los filetes de pechuga de pollo aislados en la etapa previa, mediante la prueba de
inhibición en agar spot en doble capa y prueba de antagonismo competitivo en caldo
nutritivo a 8ºC.
Previamente se caracterizó genéticamente y pre-seleccionó cepas no
clonales de Lactobacillus disponibles en el Laboratorio de Microbiología y
Probióticos del INTA. Y además se incorporó al estudio una cepa láctica con
capacidad de multiplicación en frio (8 ºC) aislada desde el pollo deteriorado y a L.
sakei CECT 4808 como control positivo en los ensayos realizados bajo
refrigeración.
Luego las potenciales cepas bio-preservantes seleccionadas se identificaron
molecularmente y se evaluó su inocuidad, midiendo su capacidad hemolítica y la
posible presencia de resistencia a antibióticos.
30
Finalmente, para partidor M13F se utilizó el siguiente protocolo: brevemente,
se preparó ADN crudo mediante protocolo fenol-cloroformo [Anexo 5]. Se utilizó
una mezcla de reacción de 20 uL, compuesta por 1000 ng de ADN crudo, 1x de
GoTaq Green Master mix (Promega, EEUU) y 1 uM del partidor. Se usó agua estéril
como control negativo.
La amplificación fue realizada en termociclador (MultiGene™ OptiMax,
Labnet international Inc., USA). Para M13 se utilizaron las condiciones establecidas
en la Tabla 12 y para oligo en la Tabla 9 (ver etapa 1).
31
monocytogenes, evidenciable por un halo mayor a 4 mm según registros de prueba
de “spot en doble capa” realizada en el laboratorio previamente [Figura 15].
Los Lactobacillus fueron cultivados en agar MRS e incubados a 37 ºC en
anaerobiosis.
3.2.1.2.- Pseudomonas spp.: Considerando la variabilidad biológica inter e
intra especies encontradas en la etapa 1, se incluyó en el ensayo al 20% (n=9) de
las Pseudomonas aisladas según especie (5 P. fragi, 3 P. fluorescens y 1 P.
lundensis). Se consideraron como criterios de selección pertenecer a un grupo
RAPD con similitud mayor al 60% y presentar mayor capacidad enzimática según
las pruebas fenotípicas de la etapa 1. Además se usó la cepa Pseudomonas
fluorescens ATCC 13525 como control.
Las Pseudomonas fueron cultivados en AN o TSA (Tripticasa Soya agar;
BD, Alemania) e incubadas a 22 ºC en aerobiosis.
3.2.2.- Preparación de los inóculos.
Previo al ensayo, cada cultivo mono-microbiano se ajustó a una
concentración de 107 UFC/mL en caldo MRS (Oxoid, Reino Unido) o TSB (Tripticasa
Soya broth; BD, Alemania) utilizando una densidad óptica equivalente a 600 nm.
3.2.3. Prueba “spot en doble capa” (SDC).
Se utilizó el protocolo establecido por Tejero-Sariñena et al. (2012) con
modificaciones. Brevemente, se prepararon placas con 15 mL (5 mm de altura) de
agar MRS y MRS-bicarbonato al 2% modificados, sin sustancias inhibidoras para
Gram negativos (MRSm y MRS-BICm; fórmula [Anexo 6]). Se inocularon 2 spots
de 5 uL de la cepa desafiante de Lactobacillus spp. distanciadas entre sí y se
incubaron a 37 ºC durante 48 horas en anaerobiosis. Posteriormente las placas
fueron expuestas a vapores de cloroformo durante 30 minutos (papel filtro 3x3 cm
embebido con 1 mL cloroformo por placa) y aireadas durante 20 minutos. Luego las
placas fueron cubiertas por una segunda capa de 7 mL de agar blando MH (0,7%
agar, Müller Hinton; BD, Alemania) inoculados con 100 uL de Pseudomonas spp.
Las placas fueron incubadas a 22ºC en aerobiosis (Tirloni et al., 2014). La prueba
fue realizada en duplicado
Los halos de inhibición fueron medidos a las 24 horas y reportados como
promedios ± DE.
3.2.4. Análisis estadístico
Se realizó un análisis descriptivo de los resultados.
Para evaluar si el halo de inhibición depende sólo del efecto de los
Lactobacillus y/o sensibilidad de Pseudomonas o a una interacción entre ambos
factores, se utilizó un modelo lineal general y mixto (MLGM, Infostat®) con
estructura factorial, bloque, covariable y modelamiento de la varianza considerando
el siguiente modelo matemático:
32
Donde:
Yijk= Halo MRS-BICm observado bajo el i-ésimo nivel del factor
Lactobacillus, j-ésimo nivel del factor Pseudomonas y el k-ésimo nivel del
efecto bloque.
= media general del halo MRS-BICm
Ai = Efecto del i-ésimo nivel del factor Lactobacillus, con 27 niveles.
Bj = Efecto del j-ésimo nivel del factor Pseudomonas, con 10 niveles.
ABij = Efecto interacción del i-ésimo nivel del factor Lactobacillus y el del
j-ésimo nivel del factor Pseudomonas.
Blk = Efecto bloque del k-ésimo nivel del factor aleatorio número de
ensayo, con 11 niveles.
Covijk = Covariable, tamaño de spot asociado al ijk-ésimo Halo MRS-
BICm.
eijk = Término del error aleatorio asociado al ijk-ésimo Halo MRS-BICm.
33
3.3.3.- Preparación de los inóculos.
Un día previo al ensayo las bacterias lácticas se ajustaron a una DO600nm
0,01 en caldo MRS y se incubaron a 37 ºC en anaerobiosis (LB, L252) o a 30 ºC en
aerobiosis (L.63 y L. sakei CECT 4808) por 24 horas para alcanzar una
concentración ≈109 UFC/mL. Luego fueron centrifugadas y reconstituidas a la
misma concentración en caldo MRSm (caldo MRS modificado sin acetato de sodio
ni citrato de amonio; fórmula completa en Anexo 6). Además cuando fue necesario,
se realizaron diluciones seriadas para alcanzar ≈107 UFC/mL usando el mismo
diluyente.
34
La prueba fue realizada en duplicado
3.3.5. Análisis estadístico
Los recuentos de Pseudomonas y de Lactobacillus fueron reportados como
medias ± desviación estándar.
Se evaluó si Lactobacillus retrasan la multiplicación de Pseudomonas
mediante un MLGM (Infostat®) utilizando estructura factorial en bloque y parcela
anidada para modelar la covarianza entre los tiempos evaluados y modelamiento
de la varianza considerando el siguiente modelo matemático:
Y = + T + A + () + Bl + P + e
ijkl i j ij k kl ijkl
Donde:
• Yijkl: recuento bacteriano observado en la l-ésima parcela del k-enésimo
bloque, en el j-enésimo tiempo e i-ésimo tratamiento.
• : media general de los recuentos de bacterianos.
• Ti : Efecto del i-ésimo tratamiento; i = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.
• Aj: Efecto del j-ésimo tiempo; j = 0, 4, 5, 6.
• (TA)ij: Efecto de la interacción entre el i-ésimo tratamiento y j-ésimo tiempo.
• Blk: Efecto del k-ésimo bloque (ensayos en 6 tiempos diferentes); l = 1, 2, 3,
4, 5, 6.
• Pkl: Efecto de la l-ésima parcela en el k-enésimo bloque; m = 1, 2, 3,..., 49,
50.
• eijkl= Efecto del error experimental del ijkl-ésimo recuento bacteriano.
35
Los productos de las PCR se enviaron a secuenciar a Macrogen. A partir de
la secuenciación forward y reverse obtenidas, se creó la secuencia consenso
(contig) utilizando las herramientas Reverse Complement (bioinformatics.org) y
Contig Assembly Program (CAPs - BioEdit 7.2.5). Posteriormente estas últimas
secuencias fueron procesadas mediante la herramienta BLAST de NCBI y
Sequence Match de Ribosomal Database Project (RDP).
36
utilizando las mismas condiciones que LB y L63 respectivamente. La prueba fue
hecha en duplicado.
Los halos de inhibición se midieron a las 24 horas y se compararon con los
parámetros de sensibilidad establecidos por Charteris et al. (1998) [Anexo 8].
37
4.1.2.- Preparación de los inóculos.
Un día previo al ensayo 100 mL de bacterias lácticas se ajustaron a una
DO600nm 0,01 en caldo MRS y se incubaron a 37 ºC en anaerobiosis (LB, L252) o a
30 ºC en aerobiosis (L.63 y L. sakei CECT 4808) por 20 horas para alcanzar una
concentración ≈109 UFC/mL. Luego fueron centrifugadas a 7.700 RPM por 10
minutos a 4ºC. El pellet de células fue lavado 2 veces con suero fisiológico y
reconstituido en 1 mL de mismo diluyente, para alcanzar una concentración ≈1011
UFC/mL. Además cuando fue necesario, se realizaron diluciones seriadas para
alcanzar ≈109 UFC/mL.
Paralelamente, el día del ensayo, P. fragi fue ajustada a una concentración
de 107 UFC/mL en caldo nutritivo y luego diluida 1/10 usando el mismo medio hasta
alcanzar ≈106 UFC/mL.
Justo en el momento previo de la inoculación experimental de la carne, se
juntaron en un tubo eppendorf 10 uL del inóculo láctico y 10 uL de Pseudomonas.
Todos los medios utilizados fueron ajustados a pH 5,7-5,9, para no alterar la
acidez de la carne de pollo (pechuga) fresca (Vihavainen y Bjôrkroth, 2010).
4.1.3.- Preparación de la carne estéril.
Se adquirieron bandejas de pechugas de pollo sin marinar de la principal
empresa avícola del país, en supermercados locales. Luego, fueron transportadas
al laboratorio de Microbiología y Probióticos del INTA, manteniendo la cadena de
frío (<4 ºC).
La carne fue cortada manualmente en condiciones asépticas, logrando
trozos de 3x3x1 cm, con una superficie de 9 cm 2 disponibles para la inoculación
experimental. Luego las muestras fueron congeladas en bolsas de polietileno
(Ziploc® para congelar) a -18 ºC.
La carne congelada fue esterilizada por radiación gamma (25 kGy durante
12 horas) en la Comisión Chilena de Energía Nuclear (CCHEN). Se compararon las
características organolépticas de la carne esterilizada con las de una no irradiada
visualmente. La esterilización de las muestras fue corroborada mediante RAM el
día 0 y 7 post almacenamiento a 8±2 ºC.
4.1.4.- Prueba de antagonismo in situ en carne de pollo estéril a 8 ºC.
Los trozos de pechugas de pollo, sin marinar, esterilizados (n=60), se
descongelaron a 8 ± 2 ºC. 10 trozos fueron asignados aleatoriamente a cada uno
de los tratamientos detallados en la Tabla 15. Una de las superficies del pollo, de 9
cm2, fue contaminada experimentalmente inmediatamente después de la
preparación del inóculo bacteriano.
Luego los tratamientos fueron incubados a 8 ± 2 ºC en aerobiosis sin
agitación durante 4 días. Cada día se hicieron recuentos de Pseudomonas en agar
CFC (22 ºC, 48 hrs, aerobiosis) y Lactobacillus en MRS (37 o 30 ºC, 48 hrs,
anaerobiosis o aerobiosis para LB o L63 y L. sakei CECT 4808 respectivamente).
El ensayo fue realizado en duplicado.
38
Tabla 15: Esquema de tratamientos lácticos desafiantes de P. fragi 1.1 en la prueba
de antagonismo in situ en carne de pollo estéril a 8 ± 2 ºC durante 4 días.
Bacteria láctica Bacteria alterante
Tratamiento
Desafiante Desafiada
T0 SF
T1 L. 63
106 UFC/cm2
T2 L. sakei CECT 4808*
P. fragi 1,1 103 UFC/cm2
T3 L. B
T4 L. 63 108 UFC/cm2
T5 L. sakei CECT 4808*
*Cepa utilizada como control positivo. SF=suero fisiológico
Y = + T + A + () + P + e
ijk i j ij k ijk
Donde:
• Yijk: recuento bacteriano observado en la k-ésima parcela, en el j-ésimo tiempo
e i-ésimo tratamiento.
• : media general de los recuentos de bacterianos.
• Ti : Efecto del i-ésimo tratamiento; i = 0, 1, 2, 3, 4, 5.
• Aj: Efecto del j-ésimo tiempo; j = 0, 1, 2, 3, 4
• (TA)ij: Efecto de la interacción entre el i-ésimo tratamiento y j-ésimo tiempo.
• Pk: Efecto de la k-ésima parcela (correlación entre los tiempos) k= 1, 2,.., 12.
• eijk= Efecto del error experimental del ijk-ésimo recuento bacteriano.
39
4.2.1.- Cepas bacterianas y condiciones de cultivo.
Lactobacillus spp.: en base a los resultados de la prueba de antagonismo in
situ en carne estéril, se seleccionó sólo a L. sakei 63 nacional por presentar alguna
capacidad antagonista en algunos tiempos de la prueba [Figura 24]. Además se
utilizó a L. sakei CECT 4808 (español) como control positivo de la prueba y se
incorporó a L252 como control negativo, por no poseer actividad antagónica frente
a P. fragi 1.1 en caldo refrigerado [Figura 21].
Lactobacillus fueron cultivados en caldo MRS e incubados a 30 ºC en
aerobiosis.
4.2.2.- Preparación de los inóculos.
Un día previo al ensayo 100 mL de bacterias lácticas se ajustaron a una
DO600nm 0,01 en caldo MRS y se incubaron a 30 ºC en aerobiosis (L63 y L sakei
CECT 4808) o microaerofilia (L252) por 20 horas para alcanzar una concentración
≈109 UFC/mL. Luego fueron centrifugadas a 7.700 RPM por 10 minutos a 4ºC. El
pellet de células fue lavado 2 veces con suero fisiológico y reconstituido en 10 mL
de mismo diluyente, para alcanzar una concentración ≈10 10 UFC/mL.
4.2.3.- Preparación de la carne
Se adquirieron bandejas de pechugas de pollo sin marinar de la principal
empresa avícola del país, en supermercados locales. Luego, fueron transportadas
al laboratorio de Microbiología y Probióticos del INTA, manteniendo la cadena de
frío (<4 ºC).
La carne fue cortada manualmente en condiciones asépticas, logrando
trozos de 1 cm3, con una superficie de 6 cm2 disponibles para la inoculación
experimental.
4.2.4.- Prueba de antagonismo in situ en carne fresca a 8 ºC.
Los cubos de pechugas de pollo, sin marinar (n=400), fueron asignados
aleatoriamente a los 4 tratamientos detallados en la Tabla 16.
40
homogenizados manualmente para asegurar que el tratamiento cubriera todas las
superficies, logrando una carga experimental ≈108 UFC/cm2 [Figura 7].
Luego 10 cubos de carne de pollo de cada tratamiento fueron repartidos en
placas Petri e incubados a 8±2 ºC en aerobiosis sin agitación durante 4 días [Figura
7]. Los días 0, 2, y 4 se hicieron recuentos de Pseudomonas en agar CFC (22 ºC,
48 hrs, aerobiosis), enterobacterias en agar VRBG (Agar Bilis Glucosa con cristal
violeta y rojo neutro, Oxoid, UK; 37ºC, 24 hrs, aerobiosis) y Lactobacillus en MRS
(30 ºC, 48 hrs, aerobiosis o microaerofilia para L.63 y L. sakei CECT 4808 o L.252
respectivamente).
El ensayo fue realizado en duplicado.
a) b)
41
Bloque y parcela anidada para modelar la covarianza entre los tiempos evaluados
y modelación de la varianza, considerando el siguiente modelo matemático:
Y = + T + A + () + Bl + P + e
ijkl i j ij k kl ijkl
Donde:
• Yijkl: recuento bacteriano observado en la l-ésima parcela del k-ésimo
bloque, en el j-enésimo tiempo e i-ésimo tratamiento.
• : media general de los recuentos de bacterianos.
• Ti : Efecto del i-ésimo tratamiento; i = 0, 1, 2, 3, 4, 5.
• Aj: Efecto del j-ésimo tiempo; j = 0, 1, 2, 3.
• (TA)ij: Efecto de la interacción entre el i-ésimo tratamiento y j-ésimo tiempo.
• Blk : Efecto del k-ésimo bloque (nº de ensayo); k = 1, 2.
• Pkl: Efecto de la lk-ésima parcela (correlación entre los tiempos) k = 1,
2,…,16.
• eijkl= Efecto del error experimental del ijkl-ésimo recuento bacteriano.
42
intrínsecas a la carne de pollo y además se reportaron como medias de los ensayos
± desviación estándar.
La efectividad del potencial bio-preservante se evaluó comparando la
estabilidad microbiológica (horas) de la carne de pollo inoculada con los diferentes
tratamientos mediante un MLGM (Infostat®) utilizando estructura factorial y
bloqueando por el número de ensayo, considerando el siguiente modelo
matemático:
Y = + T + Bl + e
ij i j ij
Donde:
• Yij: Estabilidad microbiológica observada en el i-ésimo tratamiento del j-
ésimo bloque.
• : media general de vida útil.
• Ti : Efecto del i-ésimo tratamiento; i = 0, 1, 2, 3.
• Blj : Efecto del j-ésimo bloque (nº de ensayo); k = 1, 2.
• eij= Efecto del error experimental de la ij-ésima vida útil
43
4,5 mM ácido bórico, 0,125 mM EDTA, pH 8). Las condiciones de la electroforesis
fueron: pulsos iniciales de 1 s; pulsos finales de 12 s; voltaje 6 V/cm, ángulo 120° y
duración 15 horas a 14°C.
Los patrones de digestión PFGE fueron comparados con el programa Gel
ComparII (Bionumerics© 2011, Applied Maths NV), utilizando el coeficiente de Dice
basado en la posición de las bandas y método de agrupamiento UPGMA.
Ambas pruebas utilizaron a L. sakei ATCC 15521 como control.
44
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
45
especies en el pollo fresco en comparación con las del pollo deteriorado,
demostrando una presión de selección entre las bacterias alterantes dominantes.
7% 2%
P. lundensis No id*
33%
P. fluorescens 57%
P. fragi
46
uM y 1 uL de ADN extraído por hervido en la mezcla de reacción; temperatura de
alineamiento a 36 ºC en la PCR; un gel 1,8% agarosa; y una electroforesis a 70
volts durante 90 minutos con un volumen de carga de 5 uL. No se logra optimizar la
RAPD con el partidor M13F; se obtienen electroforesis con bandas tenues y algunas
veces difíciles de identificar. La mejor reacción se obtiene utilizando concentración
de partidor 1,5 uM y 1 uL de ADN; un gel 1,8% agarosa; y una electroforesis a 70
volts durante 90 minutos con un volumen de carga de 10 uL [Figura 9].
47
número de aislados de P. lundensis (n=3), no permite comparar la diversidad
genética relativa con las otras 2 especies dominantes.
a) P. fragi b) P. fluorescens
c) P. lundensis
d) Pseudomonas spp.
48
Las biopelículas son comunidades estructuradas de microorganismos que
están encapsulados por sustancias poliméricas extracelulares o exopolímeros
(EPS), compuestos principalmente de polisacáridos, proteínas, ADN extracelular y
lípidos (Liu et al., 2015). En las superficies de las plantas faenadoras y
procesadoras de pollos se depositan gran cantidad de residuos ricos en proteína,
lípidos y agua, lo que favorece la formación de las biopelículas (Rossi et al., 2017).
Las biopelículas presentan mayor resistencia a los biocidas usados en la
industria alimentaria, entre ellos desinfectantes, antibióticos, detergentes, agentes
quelantes o una combinación de ellos, entre otros (Scher et al., 2005, Masák et al.,
2014). Donlan y Costerton (2002) reportan que los desinfectantes disminuyen su
efectividad principalmente, porque la matriz de EPS de la biopelícula enlentece la
penetración del agente antimicrobiano hasta las células (entre otros). Además,
Kumar y Anand (1998) indican que, después de un tratamiento con biocida, las
células bacterianas pueden incrementar la producción de exopolímeros, como
respuesta de defensa, dejando sin efectividad al producto.
En la literatura se describe que cepas de P. fragi, P. fluorescens y P.
lundensis, pueden producir exopolímeros que les confiere la capacidad primaria de
formar biofilms (Sasahara y Zottola, 1993; Allison et al., 1998, Liu et al., 2015). Pero
además se describe que P. fluorescens produce proteína LapA, una adhesina que
participa en el anclamiento de las células a la superficie donde se formará el biofilm
(Masák et al., 2014), moléculas de comunicación entre células o de “quorum-
sensing” (acil-homoserin lactonas, acyl-HSLs), necesarias para una estructura del
biofilm tridimensional más estable y resistente (Watnick y Kolter, 2000) y también
exopolisacaridasas, necesarias para la separación y dispersión de las células del
biofilm (Allison et al., 1998).
En general, las biopelículas son comunidades microbianas multi-especies,
por lo tanto, pueden co-existir alterantes de la carne como Pseudomonas spp. y
patógenos como Salmonella spp., Campylobacter jejuni y Listeria monocytogenes
(Chasseignaux et al.¸2001, Watnick y Kolter, 2000, Rossi et al., 2017), de ahí la
importancia de identificarlos, controlarlos y erradicarlos de la industria avícola.
49
reconocidas por tener poca grasa, en contraste con los trutros de pollo con piel
usadas por Mellor et al. (2011). Cases et al. (2003) indican que los microrganismos
responden a la presión selectiva del medio ambiente produciendo las enzimas
adecuadas para maximizar la obtención de nutrientes.
50
Estos resultados difieren de los esperados. Dado que el deterioro de la carne
lo provocan directamente las enzimas liberadas al medio por parte de las
Pseudomonas (Casaburi et al., 2015; Mellor et al., 2011; Nychas et al., 2008), se
especulaba que la especie dominante en la carne de pollo sería capaz de producir
todo el perfil enzimático testeado, similar a lo reportado por Franzetti y Scarpellini
(2007). Ellos determinan que la mayoría de las P. fragi aisladas de diferentes
alimentos de origen animal, tienen actividad proteolítica y lipolítica y, alrededor de
la mitad, lecitinasa, haciendo énfasis en que el perfil enzimático que producen las
Pseudomonas es dependiente del alimento de origen. Caldera et al. (2016)
establecen que la mayoría de las P. fragi aisladas de lácteos y hamburguesas no
deteriorados no son proteolíticas, ni lipolíticas ni lecitinasa positivas. Esta disparidad
observada concuerda la variabilidad intrínseca que existe dentro de una especie
(Lianou y Koutsoumanis, 2011).
Ercolini, et al. (2010) demostraron que la capacidad deteriorante de las P.
fragi, determinada por su capacidad de liberar moléculas volátiles a partir de la
carne, es independiente de las capacidades proteolíticas y lipolíticas que presentan
in vitro. Esto se explica porque las bacterias en la superficie de los alimentos forman
biopelículas, y en este estado, cambian su expresión enzimática en comparación
con cultivos planctónicos. Liu et al. (2015) evidenciaron que la actividad proteolítica
en los biofilms es mayor que en el correspondiente cultivo bacteriano in vitro.
En el dendograma también se evidenció que 14 P. fluorescens agruparon
en 4 perfiles fenotípicos al igual que P.fragi [Figura 11b]. Pero in vitro, la primera
especie parece ser más versátil enzimáticamente, ya que todos los aislados fueron
proteolíticos, productores de lecitinasa y la mayoría, lipolíticos (71,4%). Además el
71,6% tuvo una débil capacidad de multiplicación a 37 ºC sugiriendo que se trata
de cepas adaptadas al frio [Anexo 2].
El perfil enzimático de la mayoría de las P. fluorescens fue el esperado para
bacterias alterantes de carne. Estos resultados concuerdan, en parte, con Franzetti
y Scarpellini (2007) cuando reportan que P. fluorescens son lecitinasa positivos,
pero no cuando indican que la mayoría de los aislados tienen actividad proteolítica
variable y poca o capacidad lipolítica. Al igual que con P. fragi, esta disparidad
puede ser explicada por la variabilidad intrínseca existente dentro de una especie
bacteriana (Lianou & Koutsoumanis, 2011).
En la Figura 11c se observa también que las 3 P. lundensis aisladas
presentaron diferente perfil fenotípico. Dos de ellas fueron proteolíticas y todas
lipasas y lecitinasas negativas, similar a la mayoría de las P. fragi de este estudio.
No obstante, a diferencia de P. fragi y P. fluorescens, 2 de las 3 P. lundensis
presentaron una evidente capacidad de multiplicación a 37 ºC.
Está descrito que las Pseudomonas ambientales tienen un rango de
multiplicación óptimo de 25 a 30 ºC y que no son virulentas para el humano. Sin
embargo, se ha observado ciertas P. fluorescens con rango de replicación más
permisivo, sobre 37 ºC, virulentas en células humanas (Scales et al., 2014).
Considerando que 2 P. lundensis aisladas en este trabajo se replican a 37 ºC, se
deben hacer estudios conducentes a evaluar si estas cepas presentan algún
potencial patógeno no reportado.
51
En la Figura 11d también se observa el perfil fenotípico de la Pseudomonas
spp. Ella produce todas las enzimas testeadas y tiene débil capacidad de
multiplicación a 37 ºC, similar a la mayoría de las P. fluorescens de esta
investigación.
La variabilidad enzimática observada, tanto entre especies como intra
especie, confirma que el deterioro organoléptico de la carne no se debe sólo a una
bacteria en particular, si no a un consorcio bacteriano que actúa sinérgicamente.
Éste no sólo está formado por diferente especies de Pseudomonas, sino también
por otras con menor habilidad deteriorante (menor tasa de replicación a bajas
temperaturas y menor producción de volátiles aromáticos), pero capaces de
sobrevivir en refrigeración y producir enzimas exógenas que degradan la carne de
igual forma. La descomposición de la carne es un evento complejo, donde la
producción de compuestos volátiles que marcan el rechazo del consumidor, es el
primer evento perceptible de la cadena (Casaburi et al., 2015; Mellor et al., 2011;
Nychas et al., 2008).
Como parte de la caracterización fenotípica de las Pseudomonas aisladas
en el estudio, se evaluó, a 28 cepas representantes de cada tipo RAPD (P. fragi
n=13, P fluorescens n=12, P. lundensis n=1, Pseudomonas spp. n=1) la sensibilidad
a ciprofloxacino, tetraciclina, polimixina B y sulfametoxazol-trimetoprim. Estos
antibióticos fueron seleccionados por ser los representantes de las familias de
antibióticos que más marcas comerciales tiene el SAG autorizadas para su uso en
aves, que inhiben a bacterias Gram negativas [Anexo 3].
Las sensibilidades o resistencias a los antibióticos encontradas según
especie de Pseudomonas se encuentran en la Figura 12 [Anexo 4]. Se observó
una alta tasa de resistencia a sulfametoxazol-trimetroprim (23/28) y a polimixina B
(2/28 intermedia y 11/28 resistente), menor a ciprofloxacino (2/28 intermedia) y nula
a tetraciclina. Se observó multi-resistencia a 3 antibióticos en una cepa de P.
fluorescens y a 2 antibióticos en 11 cepas, 9 P. fragi, 2 P. fluorescens y 1
Pseudomonas spp. Además se observaron 7 perfiles diferentes de sensibilidad a
antibióticos [Figura 13], lo que evidencia la alta diversidad de Pseudomonas
alterantes presentes en el pollo.
Poca información existe en la literatura relacionada con la resistencia
antibacteriana de Pseudomonas asociadas a alimentos. Demoliner et al. (2015),
determinaron que todas las Pseudomonas aisladas de carne de pollo (n=50) y
búfalo (n=50) fueron resistentes al menos a 1 antibiótico comúnmente usado contra
P. aeruginosa y que más del 90% poseía multi-resistencia; no obstante, ninguna
cepa presentó resistencia a Sulfametoxazol-Trimetoprima o Ciprofloxacino. Lerma
et al. (2014) indican que Pseudomonas aisladas de plantas faenadoras de corderos
son resistentes a Sulfametoxazol, Trimetoprima, Polimixina E y Tetraciclina (entre
otros antibióticos), pero no a Ciprofloxacino. Similar resistencia a Sulfametoxazol-
Trimetoprima y sensibilidad a Ciprofloxacino encontraron Arslan et al. (2011) en
quesos.
Por otra parte, es importante destacar la multi-resistencia de P. fluorescens
aisladas de muestras clínicas o de heces de pollos citada en la literatura (Adeleke
y Omafuvbe, 2011; Trivedi et al., 2015), coincidiendo con que la única cepa, en el
presente estudio, multi-resistente a 3 antibióticos perteneció a la misma especie.
52
Figura 12: Susceptibilidad a antibióticos (Sulfametoxazol-Trimetoprim, Polimixina B,
Ciprofloxacino, Tetraciclina) de Pseudomonas alterantes dominantes de filetes de
pollo marinados deteriorados a 4 ºC, según especie y en total, mediante
concentración inhibitoria mínima (CIM) en agar.
*S-T= Sulfametoxazol-Trimetoprim; Pol B= Polimixina B; Cip= Ciprofloxacino; Tet =
tetraciclina.
53
transmisión horizontal de genes de resistencia entre bacterias comensales y
patógenas del mismo ecosistema, que la transferencia directa entre patógenos
(Wang et al., 2006); más aún cuando en la carne de pollo conviven Pseudomonas
y patógenos Gram negativos, como Campylobacter jejuni o Salmonella enteritidis.
Es importante continuar con la investigación para evaluar si la resistencia detectada
es transmisible o no.
54
2.- ETAPA 2: Evaluación del antagonismo microbiano in vitro.
A) B)
55
RAPD Lacto RAPD Lacto
L. monocytogenes
L. monocytogenes
A) Lactobacillus spp. de origen aviar B) Lactobacillus spp. otros orígenes
S. enteritidis
S. enteritidis
HI (mm)
HI (mm)
RAPD Lacto RAPD Lacto
HI (mm)
HI (mm)
Origen
100
100
20
40
60
80
20
40
60
80
P522a
.
P522`a 7.5
Pollo . 5 94.1
.W W
. 13 Leche11 . Leche
95.2 .P622
P622 5.5
Pollo . 8.5 88.2
. X .X 13 Deposición
10 Deposición
.
91.8 .P612
P612 7.5
Pollo . 5.5 94.1
.T T . 18 Deposición
9 Deposición
.
71.2
88.9 .P611
P611 6.15
Pollo . 6 . V .V 6 Queso11 . Queso
62.5
.P542
P542 6Pollo . 5
57.8
. J J. 12 L. .plantarumCR
16 Ref L plantarum
.P651
P651 6.5
Pollo . 10 31.3 .Q Q
. 15 Leche11 . Leche
49.3
.P151
P151 7Pollo . 4 75.0
. G G`
. 14 Queso11 . Queso
.P222
P222 6.5
Pollo . 6 50.0
.Y Y
. 4 Queso 4 . Queso
37.2 .P223
P223 9Pollo . 6.5 35.6 .E E
. 16 Deposición
10 Deposición
.
P341a
.
P341` 6Pollo . 9 .U U
. 4 Verdura
3 . Verdura
93.3
30.7 77.5 .P342
P342 5.75
Pollo . 10 22.1 .G G
. 13 Leche10 . Leche
.P121
P121 8.5
Pollo . 10 87.5 .N N
. 10 Deposición
1 Deposición
.
27.5
P252
.P251 7Pollo . 4 .R R
. 15 Deposición
9 Deposición
.
84.7
. P33
P33 7.5
Pollo . 6 .P P
. 5 Ref L johnsonii
5 L.. johnsoniiCR
87.5
P341
.P341 5.5
Pollo . 4 38.6 . A` A`
. 12 Queso 7 . Queso
22.6
.P252
P252 6.5
Pollo . 4 .B` B`
. 15 Queso12 . Queso
57.1
50.2 .P33a
P33` 4Pollo . 3.5 .D` D`
. 9 Queso 3 . Queso
31.8 .P632
P632 5.5
Pollo . 9.5
19.6 . S .S 13 Deposición
7 Deposición
.
19.3
.P241
P241 3.5
Pollo . 6 57.9 .B B . 10 Deposición
11 Deposición
.
.P431
P431 5Pollo . 4 . A .A 1 Deposición
10 Deposición
.
15.2 CR
.P432
P432 6.5
Pollo . 4.5 . I i. 12 Ref L rhamno.
12 L rhamnosus
.
44.4 94.7
P522b
.
P522`` 3.5
Pollo . 4 86.0 .H H
. 13 Deposición
9 Deposición
.
.P532
P532 6.5
Pollo . 2 .C` C`
. 12 Queso11 . Queso
81.1
.C C
. 8 Deposición
7 Deposición
.
31.6
88.9 .D D
. 8 Deposición
9 Deposición
.
.O O
. 11 Deposición
8 Deposición
.
.K K
. 13 Deposición
7 Deposición
.
87.5 .M M
. 15 Deposición
9 Deposición
.
.L L
. 14 Deposición
9 Deposición
.
Figura 15: Dendograma de asociación de 54 Lactobacillus spp. obtenido mediante el análisis de promedio no pareado (UPGMA, Unweighted Pair Group Method with Arihtmetical Averages)
a partir del coeficiente de Dice calculado según la posición de las bandas de los perfiles electroforéticos obtenidos por Amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, Random Amplified
Polymorphic DNA) con el partidor Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3) y tamaño de halo de inhibición (HI) frente a Salmonella enteritidis ATCC 2190 y Listeria monocytogenes ATCC 19114 utilizando
prueba de spot con doble capa en agar MRS con bicarbonato al 2%, modificado, sin sustancias inhibidoras de Gram negativos (acetato de sodio, citrato de amonio). *CR: Cepas de referencia.
Línea punteada: indica límite de similitud genética de Dice al 85%. En Rojo: cepas seleccionadas para ensayo de antagonismo in vitro de spot con doble capa.
56
En el agar MRSm no tamponado, todos los Lactobacillus antagonizan a
todas las Pseudomonas con amplios halos de inhibición. Esto era esperado ya que
es conocida la sensibilidad de las Pseudomonas a los ácidos orgánicos. (Gordon y
Dilts, 1995; Ouattara et al., 1997)
Al comparar los halos de inhibición generados en el agar MRSm con los del
MRSm bicarbonato, se observa una disminución general en sus tamaños [Figura
16, 17, 18], e incluso el efecto antagonista se pierde en el agar tamponado. 5 cepas
de Lactobacillus spp. no antagonizan a 1 o más cepas de Pseudomonas, sugiriendo
que la actividad antagonista se debe a la producción de ácidos orgánicos y/o cambio
de pH, en conjunto con otras sustancias.
MRSm
MRSm+bic
Lactobacillus
Figura 17: Tamaño de halos de inhibición medios ejercidos por 21 Lactobacillus sobre
10 Pseudomonas alterantes aisladas de carne de pollo, en prueba de antagonismo in
vitro spot en doble capa de agar, utilizando agar MRS modificado (sin acetato de
sodio, citrato de amonio) no tamponado (MRSm; rojo) y con bicarbonato al 2%
(MRSm+bic; azul).
57
MRSm
MRSm+bic
Pseudomonas
Figura 18: Tamaño de halos de inhibición medios de 10 Pseudomonas antagonizadas
por 21 Lactobacillus spp., en prueba in vitro spot en doble capa de agar, utilizando
agar MRS modificado (sin acetato de sodio, citrato de amonio) no tamponado (MRSm;
rojo) y con bicarbonato al 2% (MRSm+bic; azul).
PF: P. fluorescens usado como control en la prueba.
Lactobacillus
Figura 19: Tamaño de halos de inhibición medios ejercidos por 21 Lactobacillus sobre
10 Pseudomonas alterantes aisladas de carne de pollo, en prueba de antagonismo in
vitro spot en doble capa de agar, utilizando agar MRS modificado (sin acetato de
sodio, citrato de amonio) con bicarbonato al 2%.
*Letras distintas indican diferencias con significancia estadística (p<0,05).
58
Pseudomonas
59
a
a a
b
b
b
c
c
Figura 21: Recuentos medios de P. fragi 1.1 desafiada por 5 tratamientos lácticos,
inoculados en 2 concentraciones iniciales (≈6 log UFC/mL y ≈8 log UFC/mL) durante 6
días, en prueba de inhibición competitiva en caldo TSBYE a 8 ºC.
*T0: tratamiento control, inólulado con suero fisiológico sin bacterias. TSBYE: Caldo
tripticasa soya, 0,6% extracto de levadura. Línea punteada: tratamiento bacteriano ajustado
a concentración inicial ≈6 log UFC/mL. Línea sólida: Tratamiento bacteriano ajustado a
concentración ≈8 log UFC/mL; Letras distintas indican medias diferentes con significancia
estadística dentro de cada tiempo (p<0,0001).
Especulamos que la cepa nacional L.63, al igual que L. sakei CECT 4808,
pudieran producir alguna sustancia antagonista distinta, concomitante a los ácidos
orgánicos, que actuaría en forma sinérgica a la caída del pH. Esto porque ambas
cepas retrasan en mayor magnitud la multiplicación de las Pseudomonas que
Lactobacillus B, aun cuando las 3 cepas disminuyen el pH del medio a un nivel
similar.
Por otra parte, al comparar los recuentos medios de Lactobacillus en el
tiempo mediante MLGM, también se observa una diferencia con significancia
estadística dependiente de la interacción entre el tiempo y tratamiento aplicado
(p<0,0001) [Figura 22, Anexo 11].
60
[Figura 22, Anexo 11]. Es importante mencionar que las cepas con mayor
capacidad de replicación a bajas temperaturas, coinciden con las cepas con el
mayor efecto antagonista frente a P. fragi 1.1, con excepción del tratamiento
TCECT4808.8 que no evidencia una clara diferencia entre el recuento al día 0 y al
día 6.
Este resultado concuerda con Doyle y Zhao (2009), quienes señalan que las
bacterias lácticas bio-controladoras de L. monocytogenes aumentan su recuento
para antagonizar, desde 6 log UFC/mL hasta ≈ 9 log UFC/ml entre el día 1 y 7 de
ensayo a 8ºC en TSBYE; pero no con Amézquita y Brashears (2002), quienes
indican que las BALs pueden ejercer su antagonismo en refrigeración, incluso sin
multiplicarse, cuando se adicionan en un medio a altas concentraciones (>107
UFC/mL). Ellos evidenciaron que un consorcio de bacterias lácticas antagonizan a
L. monocytogenes en caldo MRS aumentando menos de 1 log UFC/mL en 28 días
a 5 ºC.
Considerando los resultados, se seleccionó a Lactobacillus 63 y B para los
desafíos de Pseudomonas spp. in situ en carne de ave fresca.
61
2.4. Identificación molecular de Lactobacillus antagonistas con Pseudomonas
en frio.
Al comparar la secuencia del gen ribosomal 16S de Lactobacillus 63 y B,
potenciales bio-preservantes, con las bases de datos GenBank NCBI
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) y Ribosomal Database Project
(https://rdp.cme.msu.edu/), se concluye que se identifican como L. sakei y L.
rhamnosus respectivamente, ambas especies son consideradas como seguras
para el consumo humano según la EFSA (2017).
B 63
62
cepas nacionales y las de referencia, diferenciándose en 4 de 8 antibióticos
evaluados (Gentamicina, Ciprofloxacino, Eritromicina y Clindamicina). Llama la
atención que las cepas de referencia son resistentes a mayor número de
antibióticos que las cepas nacionales.
Todas las cepas evaluadas fueron resistentes a Vancomicina, Metronidazol,
Sulfametoxazol y Cotrimoxazol. Las 2 cepas nacionales (Lactobacillus 63 y B) y el
L. sakei español fueron resistentes a Gentamicina. L. sakei nacional, L.63, es
medianamente sensible al Ciprofloxacino, mientras que el español es resistente. Y
por último la cepa de referencia LGG, es además resistente a Eritromicina y
Clindamicina [Tabla 17].
Para que las cepas bacterianas sean consideradas como seguras o QPS
según EFSA, y puedan ser incorporadas como aditivos en alimentos, se debe
comprobar, a través de pruebas moleculares o mediante revisión de la literatura,
que la resistencia es intrínseca a su especie bacteriana y/o no transmisible y/o que
la resistencia observada no se transporta en genes de resistencia presentes en
alguna bacteria de la microbiota intestinal (EFSA, 2017; EFSA, 2018).
Especulamos que las cepas nacionales son seguras, ya que se han
reportado Lactobacillus spp. resistentes intrínsecamente a la Vancomicina,
aminoglucósidos, entre ellos la Gentamicina y Ciprofloxacino (Goldstein et al., 2015;
Campedelli et al., 2019).
La Vancomicina inhibe la síntesis de la pared celular bacteriana uniéndose
a los terminales D-alanina de las unidades precursoras de la pared celular. Los
Lactobacillus resistentes tienen D-lactato o D-serina reemplazando al aminoácido
esencial, previniendo la unión del antibiótico (Goldstein et al., 2015). Es una de las
resistencias más comunes entre Lactobacillus (Campedelli et al., 2019).
63
La resistencia intrínseca a los aminoglucósidos se debe a diversos
mecanismos, pero principalmente a que los Lactobacillus, al ser anaeróbicos,
carecen de citocromos y, por lo tanto, no generan la cadena transportadora de
electrones necesaria para la captación del antibiótico (Abriouel et al., 2015; Mella et
al., 2004). No obstante lo anterior, se ha descrito que algunas cepas diferentes de
L. sakei o rhamnosus pueden transportar esta resistencia en genes (aac(6’)-aph(2”),
ant(6), y aph(3’)-IIIa) que codifican enzimas modificantes de aminoglucósidos
(EMA). Estas proteínas catalizan la modificación covalente de grupos aminos e
hidroxilos de la molécula, generando modificaciones químicas que llevan al
aminoglucósido a unirse débilmente a los ribosomas bacterianos. (Mella et al.,
2004; Gueimonde et al., 2013; Abriouel et al., 2015).
Se describe la resistencia intrínseca de algunos Lactobacillus al
Ciprofloxacino, sin embargo, el mecanismo aún es desconocido. (Abriouel et al.,
2015). Hummel et al., (2007) no encontraron determinantes genéticos que pudieran
explicar este proceso, pero especulan que podría ser por factores como la
estructura de la pared celular, permeabilidad o a algún mecanismo de eflujo.
Petronio (2012) demostró in silico que una cepa de L. fermentum posee genes muy
similares a otros presentes en S. aureus o L. lactis que codifican a bombas de eflujo
de quinolonas.
Si bien la mayoría de los Lactobacillus son sensibles a Eritromicina y
Clindamicina, se ha observado que algunas cepas pueden poseer una resistencia
adquirida a estos antibióticos a nivel cromosomal, y que por tanto, es de difícil
transferencia horizontal (Campedelli et al., 2019). Más aún, Flórez et al., (2007)
describieron una mutación puntual del gen 23S rRNA en una cepa de L. rhamnosus
que disminuye la afinidad que requiere la Eritromicina y la Clindamicina por el
ribosoma para ejercer su inhibición. Especulamos que los sucesivos pasajes del
LGG en el laboratorio, podrían haber inducido una mutación espontánea similar a
lo reportado por Flórez et al. (2007), ya que la cepa LGG es reconocida por su
sensibilidad a estos antibióticos (Zhou et al., 2005; Flórez et al. 2007; Gotteland et
al., 2014). Drago et al. (2011), demostraron que LGG puede aumentar su resistencia
a la Eritromicina con una exposición prolongada al antibiótico, sin embargo, no
pudieron explicar este cambio a genes de resistencia ni a mutaciones genéticas.
Es importante mencionar que la selección de los antibióticos para esta
prueba consideró al menos a 1 antibiótico de cada familia recomendada por la EFSA
para Lactobacillus (Ampicilina, Vancomicina, Gentamicina, Eritromicina,
Clindamicina y Cloranfenicol) (EFSA, 2012) y al Ciprofloxacino por ser uno de
antibióticos de elección en salmonelosis severa y Campylobacter AMR (EFSA,
2017).
64
XL Congreso Latinoamericano de Microbiología - SOMICH, 2018:
póster “Bacteria láctica chilena antagoniza con Pseudomonas
alterantes de pollo in vitro e in situ, pero no logra extender
significativamente la vida útil de la carne para su uso industrial”
[Anexo 22].
65
3.- ETAPA 3: Evaluación del antagonismo microbiano in situ y extensión de
vida útil de la carne de pollo.
9
8
Recuento de P. fragi 1.1
7
*
Log UFC/cm2
6 +
5
4 * +
3
2
1
0
0 1 2 3 4
Días
T0 63.6 CECT4808.6
B.8 63.8 CECT4808.8
Figura 24: Recuentos medios de P. fragi 1.1 desafiada por 3 tratamientos lácticos, co-
inoculados en carne de pollo estéril, a diferentes concentraciones iniciales,
almacenados a 8 ºC durante 4 días.
*T0: tratamiento control, inólulado con suero fisiológico sin bacterias; Lactobacillus
CECT4808: control (+). Línea punteada: tratamiento bacteriano ajustado a concentración
inicial ≈6 log UFC/cm2. Línea sólida: Tratamiento bacteriano ajustado a concentración ≈8 log
UFC/cm2. */ +: Indican diferencias con significancia estadística con respecto al grupo control
negativo dentro de cada tiempo (p<0,05); *: Indica diferencia <0,5 log UFC/cm 2; +: Indica
diferencia >0,5 log UFC/cm 2.
66
aumentando en ≈1 log UFC/cm2 el 1º día de prueba y manteniéndose constante
hasta el día 4 [Figura 25, Anexo 13].
12
Recuento de Lactobacillus
Log UFC/cm2 10
0
0 1 2 3 4
Días
67
Shiraia et al., 2001). El medio TSBYE contiene glucosa en forma de dextrosa (D-
glucosa) (BD, 2008), por lo tanto, es fácilmente utilizable por las bacterias presentes
en el medio, en cambio la carne contiene muy poca glucosa, gran parte en forma
de glucógeno dentro de las células musculares, siendo poco disponible y de difícil
metabolización (Lücke, 1994; Lawrie, 1998).
Aasen et al., (2000) evidenciaron que la producción de bacteriocina de un L.
sakei aumenta directamente proporcional a la concentración de extracto de
levadura y triptona que contiene el medio. Ambos factores se encuentran en el
TSBYE y no en la carne.
El estado de agregación de las matrices utilizadas en los ensayos (TSBYE-
líquido v/s carne-sólido) afecta la tasa de difusión y dispersión tanto de las
sustancias antibacterianas liberadas al medio, como de las bacterias. En el líquido
la dispersión de las bacterias y metabolitos es mayor, por lo tanto, la probabilidad
de encuentro, con la bacteria desafiada, será mayor, independiente de su
naturaleza. Incluso Blom et al. (1997) comprobaron in vitro en agar que la difusión
de Nisina y Pediocina se afecta, de manera diferente, dependiendo de la cantidad
de grasa, pH y NaCl del medio, entre otros factores. Además en el medio sólido, las
bacterias crecen en micro-colonias, y eventualmente, podrían hasta formar biofilms,
protegiéndose de la acción de cualquier sustancia antibacteriana. Está descrito que
P. fragi es iniciador de biofilms (Sasahara y Zottola, 1993)
Además, la estabilidad de las bacteriocinas se afecta en la carne. La grasa
puede adsorber a los péptidos, no dejándolos disponibles para ejercer su efecto
antagonista. Además durante el trozado de la carne cruda, se liberan proteasas
intracelulares a la superficie de corte, por la disrupción de las fibras musculares, y
por lo tanto, a mayor proceso de la carne (picado o molido) menor es la estabilidad
o vida útil de las bacteriocinas (Aasen, et al., 2003; Favaro y Todorov, 2017). Más
específicamente, Katla et al. (2002) señalan que la estabilidad y capacidad
antagonista de la sakacina P sobre L monocytogenes, varía dependiendo de la
matriz cárnica usada, demostrando que la estabilidad es menor en el pescado en
contraste con el pollo.
Considerando todo lo anterior, se determinó que el menor efecto antagonista
observado en esta prueba, no es concluyente para descartar el potencial bio-
preservante de las cepas nacionales en pollo fresco.
Además como P. fragi 1.1 demostró ser algo sensible en pollo irradiado
frente a la cepa nacional Lactobacillus 63, al menos, en 2 de los 4 días evaluados,
se decidió inocularla en pollo fresco para evaluar si antagoniza con la diversidad de
Pseudomonas, naturalmente presente en la microbiota alterante, y si esto se
trasunta en una mayor vida útil del producto.
68
El efecto bio-controlador del Lactobacillus sakei nacional L.63 fue evidente.
Retrasó la multiplicación de Pseudomonas spp. en la misma magnitud que la cepa
española, usada como control positivo, y mejor que Lactobacillus spp. 252, usado
como control negativo [Figura 26, Anexo 14]. El mismo efecto se observa sobre las
enterobacterias [Figura 27, Anexo 15], aun cuando ninguna de las bacterias
lácticas se multiplicó en el tiempo [Figura 28, Anexo 16].
El antagonismo de todos los tratamientos se observó a partir del día 2 y se
mantuvo en día 4, cuando el deterioro microbiológico de la carne control (T0) fue
evidente por el recuento de Pseudomonas spp. (>7,5 log UFC/cm2), pero también
por las características organolépticas (olor principalmente).
Es importante mencionar que el pollo tratado con L. sakei 63, presentó un
aroma más ácido, similar a la mantequilla, en conjunto con limo superficial, pero que
no es rechazable por personal no entrenado (opinión personal 5 técnicos del
laboratorio presentes a la hora del análisis) y, por lo tanto, especulamos que podría
no ser un problema para el consumidor habitual. Castellano et al. (2010) informan
un olor similar en carne de vacuno bio-preservada con bacterias lácticas, pero que
no es rechazable para un panel de expertos. Se describe que las BALs en carne
fresca producen un proceso de fermentación suave que no produce variaciones
organolépticas evidentes, debido al bajo contenido de carbohidratos y fuerte
capacidad de tamponamiento de la carne (Favaro y Todorov, 2017). El tratamiento
con la cepa 252 no presentó dicho aroma, pero tampoco se encontró evidentemente
rancio al día 4.
Además el efecto bio-preservante quedó evidenciado bajo la luz UV, donde
el pollo inoculado con L. sakei nacional y español disminuyen la fluorescencia
atribuible a algunas especies de Pseudomonas, probablemente P. fluorescens y P.
putida (Palleroni, 2007), en comparación con ambos controles negativos
(Lactobacillus 252 y el no inoculado) [Figura 29].
El mayor potencial bio-preservante evidenciado en esta prueba, en
comparación con la prueba realizada sobre pollo esteríl, pudo deberse a múltiples
factores que se discuten a continuación.
En la microbiota de la carne fresca conviven microorganismos que
interactúan entre sí; la competencia por nutrientes esenciales, cambios en el pH por
la producción de ácidos orgánicos o la producción de sustancias antimicrobianas,
por parte de algunas cepas, afectan negativamente la supervivencia o la
multiplicación de otros microorganismos (Huis in't Veld, 1996; Nychas et al., 2008).
En la carne estéril no existe tal factor estresante basal; P. fragi no tiene competencia
que limite su multiplicación, aparte del efecto del tratamiento aplicado
externamente, en cambio, en el pollo fresco, el efecto de la microbiota concomitante
y el efecto de la bacteria láctica, actúan de forma sinérgica para retrasar a
Pseudomonas spp. Esto quedó en evidencia cuando comparamos la velocidad de
multiplicación de la bacteria alterante en el grupo control (sin inocular) de ambos
experimentos; P. fragi en pollo estéril mostró una tasa de multiplicación máxima
mayor (µmax= 0,08), en conjunto con un con un tiempo de generación menor (t=
3,76 horas) que Pseudomonas spp. en el pollo fresco (µmax= 0,06; t= 5,01 horas
respectivamente).
69
9
Log UFC/cm2
5
a c
4 b
3
c
2
1
0
0 2 4
Días
9
Recuento de enterobacterias
8
7
Log UFC/cm2
6
5
a
4
3
a
b
2 b
c
1 c
0
0 2 4
Días
70
10
9
Recuento de Lactobacillus
8
7
Log UFC/cm2
6
5
4
3
2
1
0
0 2 4
Días
T0 252
CECT 63
Figura 29: Fluorescencia emitida por Pseudomonas fluorescens y/o putida en carne
de pollo bio-preservada con diferentes Lactobacillus, a una concentración inicial ≈8
log UFC/cm2, posterior a 4 días de almacenamiento a 8 ºC, observada bajo luz UV.
*T0= control (-),inoculado con suero fisiológico; 252= control (-), inoculado con Lactobacillus
252; CECT= control (+), inoculado con L. sakei CECT 4808; 63= inoculado con L. sakei
nacional 63. UV: ultravioleta.
71
Además en la etapa 2 de esta tesis se demostró in vitro que la actividad
antagonista dependía tanto de la cepa láctica desafiante, como de la sensibilidad
de la Pseudomona desafiada [Figuras 20 y 21]. En la carne fresca conviven varias
especies e incluso varias cepas de Pseudomonas. En la etapa 1 de esta tesis,
demostramos la gran variabilidad, tanto genética como fenotípica, de Pseudomonas
presentes al final de la vida útil [Figuras 10 y 11]; especulamos que esta variablidad
podría ser mayor en pollo fresco. Además la variabilidad de las Pseudomonas
aisladas de pollo también fue demostrado al hacer curvas de crecimiento en TSBYE
a 25 ºC sin agitación, donde P. fragi 1.1 resultó ser una de las más rápida entre 10
cepas seleccionadas [Anexo 17].
P. fragi 1.1 demostró ser una de las más sensibles frente a las bacterias
lácticas en la prueba de spot en doble capa [Figura 20], sin embargo, es probable
que no haya sido la más sensible en las pruebas in situ. La cepa láctica nacional
L.63 seguramente antagonizó con mayor magnitud a otras Pseudomonas de la
microbiota alterante, reflejandose en el recuento total de Pseudomonas spp. y, por
lo tanto, evidenció de mejor manera su potencial bio-preservante, en comparación
con el ensayo en carne estéril.
Lactobacillus sakei es una bacteria psicrotrófica láctica anaeróbica
aerotolerante, heterofermentadora facultativa, que se diferencia del resto de las
bacterias lácticas porque tiene capacidades metabólicas especiales codificadas a
nivel genómico, que reflejan su adaptación evolutiva para persistir en carnes y
pescados (Chaillou et al., 2005; Hammes y Hertel, 2007; Nyquist et al., 2011). L.
sakei metaboliza ribosa, además de nucleosidos y/o arginina como fuente
energética alternativa, cuando se agota la glucosa en el medio (Chaillou et al., 2005;
Rimaux et al., 2012).
L. sakei ha sido tradicionalmente utilizado en productos cárnicos
fermentados como el salame; durante las útimas décadas se ha estudiado su
actividad antagonista sobre patógenos, principalmente L. monocytogenes, y más
recientemente se discute su rol como bio-preservante de productos no fermentados.
(Chaillou et al., 2005). En general se considera de uso seguro en alimentos (GRAS
o QPS) por su historial de inocuidad en productos fermentados, además de haber
sido aislado a partir de heces humana, e incluso, se describe que algunas cepas
producen sustancias beneficiosas para las personas, como los D-aminoácidos
(Chaillou et al., 2005; Kato y Oikawa, 2017)
El efecto antibacteriano evidenciado por múltiples cepas de L. sakei en
productos cárnicos, como cecinas fermentadas, fiambre de pollo, carne de pollo
cocida y carne de vacuno envasados al vacío (Bredholt et al., 2001; Katla, et al.,
2002; Castellano et al., 2010), y probablemente por la utilizada en la presente tesis,
L.63, se puede explicar por la producción de ácidos orgánicos y también por otras
sustancias como diacetilo, acetoína, etanol, peróxido de hidrógeno y/o
bacteriocinas, que actúan sinérgicamente para ejercer el antagonismo (Chaillou et
al., 2005) [Anexo 16].
L sakei, como todas las bacterias lácticas, producen ácido orgánicos. A partir
de la homofermentación de la glucosa (glicógeno en carne), produce ácido láctico,
mientras que a partir de la heterofermentación de la ribosa produce cantidades
equimolares de láctico y acético y menor cantidad de ácido fórmico (Chaillou et al.,
72
2005; McLeod, 2010) [Figura 30]. Montanari et al. (2018) demostraron que cuando
no hay carbohidratos en el medio, la producción de ácido láctico es irrelevante, en
cambio aumentan el acético y el fórmico. La cantidad de ácidos producidos por las
diferentes cepas es variable. Esto puede ser relevante en la selección de cepas bio-
controladoras cuando los diferentes ácidos orgánicos tienen diferente capacidad
biocida, dependiendo de su constante de disociación (pKa); el ácido acético tiene
mayor potencial bio-controlador que el fórmico y que el láctico (pKa 4.75, 3.75 y
3.08 respectivamente) (Hauka et al., 2014).
Cuando existen carbohidratos limitados o nulos en el medio L. sakei
metaboliza aminoácidos y nucleósidos para obtener energía, aumentando el
piruvato en el medio por la depleción de las NADH reductasas (necesarias para la
formación de lactato). La bactería desvía su ruta metabólica hacia la producción de
acetato y ácido fórmico, pero también al diacetilo, acetoína y 2-3 butanodiol, así
produce ATP y regenera NAD [Figura 30]. La o las rutas metabólicas preferidas es
variable entre cepas de L. sakei, por lo tanto, las concentraciones de los respectivos
antimicrobianos liberadas al medio también (Chaillou et al., 2005; McLeod, 2010;
Montanari et al., 2018). Más aún Montanari et al. (2018) evidenciaron que algunas
cepas producen diacetilo y acetoína sólo en presencia de ribosa y que ninguna de
las 6 cepas estudiadas utilizó la ruta del etanol.
La producción de peróxido de hidrógeno es otra ruta que utiliza L sakei para
disipar el exceso de piruvato en la célula en condiciones aeróbicas, donde el
oxígeno activa a la piruvato-oxidasa formando H2O2, CO2 y acetil fosfato. A partir de
este último, la bacteria puede obtener energía formando ácido acético [Figura 30]
(McLeod, 2010).
La producción de bacteriocinas es deseable en las cepas bio-preservantes.
No obstante, aun cuando fuera producida constantemente en la carne fresca, sus
niveles suelen ser mucho más bajos que los alcanzados durante las fermentaciones
in vitro en condiciones ambientales óptimas (Favaro y Todorov, 2017).
McLeod (2010) señala que todas las cepas aisladas a partir de carne
estudiadas (n=19) presentan en su genoma residuos u operones completos de
bacteriocinas, aun cuando no las expresan fenotípicamente. Esto significa que los
genes asociados son, o han sido, importantes en la evolución de la especie,
pudiendo otorgar a las cepas una ventaja competitiva en su entorno.
Woraprayote et al., (2016) señalaron que hasta el 2015 habían 9
bacteriocinas reportadas que podían ser utilizadas en productos cárnicos. La
mayoría tienen espectro de acción sobre bacterias Gram positivas y se recomienda
su uso para bio-controlar a Listeria monocytogenes. En la literatura destacan,
además, algunas activas frente a Gram negativas, como sakacina C2, antagonista
con E. coli ATCC 25922, Salmonella tiphymurium CMCC 47729 y Shigella flexneri
CMCC 51606 (Gao et al., 2010) y sakacina LSJ618 que inhibe a Proteus spp. y E.
coli ECX4 (Jiang et al., 2012).
Aún no se describe alguna cepa de L. sakei que produzca una bacteriocina
con amplio espectro de acción, que abarque la diversidad de Pseudomonas spp.
Sin embargo, es conocido que el espectro de acción de las bacteriocinas aumenta
al aplicar concomitantemente otras sustancias injuriantes de la membrana celular
(De Vuyst y Leroy, 2007).
73
Figura 30: Rutas metabólicas de Lactobacillus sakei para la producción de
metabolitos antibacterianos.
*Enzimas: (1) Adenosina deaminasa, (2) inosina hidrolasas, (3) nucleósido fosforilasas, (4)
fosfopentomutasa, (5) ribokinasas, (6) ribosa-5-fosfato isomerasa, (7) fructosa-1,6-
bisfosfatasa, (8) piruvato fosfodikinasa, (9) metilglioxal sintasa, (10) oxidoreductasa, (11),
aldehído deshidrogenasa, (12) arginina/peptidil-arginina deaminasas, (13) ornitina
transcarbamilasas, (14) carbamato kinasas, (15) lactato deshidrogenasa, (16) piruvato-
formato liasa, (17) piruvato deshidrogenasas, (18) Acetolactato sintasa, (19) piruvato
oxidasa, (20) fosfotransacetilasa, (21) alcohol deshidrogenasa, (22) acetato kinasa.
(Adaptado de McLeod, 2010).
74
La revisión de la literatura dejó en claro los mecanismos que tiene L. sakei
para producir los metabolitos antibacterianos, sin embargo, desconocemos la
cantidad exacta de cada uno, que produce la cepa nacional L.63. No obstante, es
indudable que produce ácidos orgánicos por el descenso de pH en el caldo TSBYE
de la prueba de antagonismo in vitro y diacetilo/acetoína/2-3 butanodiol por el olor
ácido o a mantequilla que presentó la carne tratada al final del ensayo in situ en
carne fresca.
252
ab
Tratamiento
a
CECT 4808
a
63
b
T0
75
3.4. Diferenciación de L. sakei 63 y L. sakei CECT 4808
3.4.1. RAPD
La RAPD demostró que L. sakei nacional fue diferente al español, sólo en
una de las réplicas realizadas [Figura 32]. Además el partidor utilizado sólo
amplificó 1 o 2 bandas evidentes a partir del ADN completo de cada cepa, lo que
genera dudas razonable sobre la confiabilidad de los resultados.
Estos resultados evidencian la baja reproducibilidad de la técnica y que los
resultados son dependientes de los sustratos empleados (Penner et al., 1993).
Probablemente, las diferencias se deben a que el ADN utilizado en las diferentes
réplicas se obtuvo con el mismo kit comercial, pero de diferente número de lote.
También pudo ser porque el ADN de la réplica B se mantuvo congelado por un
tiempo antes de ser utilizado. Williams et al. (1993), evidencian que al utilizar
muestras de ADN antiguo, almacenados previamente en congelación, se pierden
las bandas de mayor peso y sólo se observan las de menor tamaño en el gel.
Por estas razones se decidió realizar un PFGE que permitiera diferenciar
las cepas.
PM 1 2 3 (-) PM 4 5 6 (-) PM
76
L sakei PFGE L sakei PFGE
3.4.2. PFGE
El PFGE demostró que las 3 cepas son diferentes a nivel genético,
considerando un nivel de similitud < al 90% [Figura 33].
% similitud Dice EM 1 2 3 EM
100
40
60
80
46.2
63
63
39.3 ATCC
1552115521
CECT
E 4808
77
CONCLUSIONES
Existe una alta carga y diversidad, tanto intra como inter especies, de
Pseudomonas alterantes en filetes de pechuga de pollo deteriorados a 4 ºC de una
empresa nacional, predominando P. fragi, P. fluorescens y P. lundensis.
78
PROYECCIÓN FUTURA
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96
ANEXOS
97
Anexo 16: Prueba de antagonismo difusión en pocillo con sobrenadantes 116
libre de células (SLC)
Anexo 17: Curva de crecimientos de diferentes Pseudomonas aisladas 118
de pollo deteriorado en TSBYE a 25 ± 2 ºC sin agitación.
Anexo 18: Resumen “Resistencia antibacteriana de Pseudomonas 119
alterantes de pollo”. XXIV Congreso Latinoamericano de Avicultura, 2015
(póster).
Anexo 19: “Phenotypic and genotypic characterization of Pseudomonas 121
spp. present in spoiled poultry fillets sold in retail settings”. Revista LWT –
Food Science and Technology, 2016 (publicación).
Anexo 20: Resumen “Genotypification of spoilage poultry Pseudomonas 127
by RAPD as a simple tool to identify indirectly biofilms in the processing
line”. XXXIX Congreso Chileno de Microbiología, SOMICH, 2017 (póster).
Anexo 21: Resumen “Actividad antibacteriana de Lactobacillus contra 128
Pseudomonas alterantes aisladas de pollo”. XXXVIII Congreso Chileno de
Microbiología, SOMICH, 2016 (póster).
Anexo 22: Resumen “Bacteria láctica chilena antagoniza con 129
Pseudomonas alterantes de pollo in vitro e in situ, pero no logra extender
significativamente la vida útil de la carne para su uso industrial” XL
Congreso Latinoamericano de Microbiología - SOMICH, 2018 (póster).
Anexo 23: “Comparison of in vitro and in situ antagonism assays as tools 130
for the selection of lactic acid bacteria as bio-preservatives in poultry
meat”. Revista LWT – Food Science and Technology, 2019 (publicación
enviada).
98
Anexo 1
99
Exportación de carne de ave no procesada 2009-2017
Broilers valor Pavos valor Total valor
Año
(millones US$) (millones US$) (millones US$)
2009 165,2 35,8 201,1
2010 162,3 39,1 201,4
2011 192,7 53,7 246,6
2012 196,8 54,9 251,8
2013 207,5 46,0 253,6
2014 217,1 67,1 284,2
2015 246,1 148,4 394,6
2016 240,1 138,5 378,7
2017 233,6 40,4 274,1
Var 09/17 (%) 41,4 12,8 36,3
* No se exportan Gallinas ni patos, gansos, avestruces u otros (Servicio Nacional
de Aduana 2018, INE 2013)
100
Anexo 2
101
Anexo 3
Ceftiofur 2 Cefalosporinas 2
Florfenicol 2 Amfenicoles 2
102
Anexo 4
Sulfametoxazol-
Polimixina B Ciprofloxacino Tetraciclina
Trimetoprima
S I R S I R S I R S I R
2 0 11 3 2 8 0 13 0 0
P. fragi 13 0
15,4 0 84,6 23,1 15,4 61,5 0 100 0 0
100% 0%
% % % % % % % % % %
2 0 10 3 11 0 12 0 0
P. fluorescens 9 0 1
16,7 0 83,3 25,0 91,7 0 100 0 0
75% 0% 8,3%
% % % % % % % % %
0 0 2 0 0
P. lundensis 1 1 2 0 0 2 0
0 0 100 0 0
50% 50% 100% 0% 0% 100% 0%
% % % % %
Pseudomona 0 1 0 1 0 0
0 1 1 0 0 0
s spp. 0 100 0 100 0 0
0% 100% 100% 0% 0% 0%
% % % % % %
Total 5 0 23 15 11 26 0 28 0 0
Pseudomona 2 2
17,9 0 82,1 53,6 39,3 92,9 0 100 0 0
s 7,1% 7,1%
% % % % % % % % % %
103
Anexo 5
104
Anexo 6
105
Anexo 7
Diseño experimental
Se evaluó la carga de Pseudomonas spp. en bandejas de cubos de pechuga
de pollo fresco marinados sin piel, de la principal empresa productora de pollo
nacional, adquiridas el primer día que salieron a la venta.
Las muestras fueron transportadas en frío al Laboratorio de Microbiología y
Probióticos y procesadas dentro de la siguiente hora.
Análisis microbiológico
Los recuentos se realizaron mediante cultivo tradicional. Brevemente, 100
gr de cubitos de filetes de pollo fueron stomacheados o lavados con 180 mL de
agua peptonada (0,1%). Se realizaron diluciones seriadas 1:10 utilizando suero
fisiológico y se sembró 100 uL en superficie de agar CFC, hasta la dilución -3. Las
placas se incubaron por 48 horas a 20 ± 2ºC. Los ensayos fueron realizados en
duplicado.
Resultados
La carga inicial de Pseudomonas spp en las muestras de cubos de pechuga
de pollo de una empresa nacional fue de 3,67 ± 0,3 log UFC/g. Esta carga inicial es
similar a la reportada en otros países como Alemania (4.1 log 10 UFC/g; Bruckner y
cols., 2010), China (3,01 UFC/cm 2; Zhang y cols., 2012), Portugal (3,5 UFC/g
aproximadamente; Vasconcelos y cols., 2014), Grecia (4,5 UFC/g; Balamatsia y
cols, 2006).
106
Anexo 8
107
Anexo 9
Diseño experimental
Con el fin de incorporar bacterias lácticas, con capacidad de multiplicación
en frio, en las pruebas de inhibición selectiva en caldo a 8 ºC, se recuperaron
Lactobacillus spp. a partir de las muestras de pollo deterioradas en la etapa 1 de
tesis.
Análisis microbiológico
Se sembró por agotamiento, en agar MRS, las diluciones -3 a la -6 del agua
de lavado de las 12 muestras de carne de pollo deteriorado utilizadas en la etapa
1. Las placas fueron incubadas a 25 ºC por 72 horas. Se seleccionaron las colonias
macroscópicas diferentes de cada placa y fueron replicadas en agar MRS. Cada
aislado fue confirmado como Lactobacillus spp. al presentarse como un bacilo en
empalizada, Gram (+) y catalasa y oxidasa negativo. Los aislados fueron
congelados en leche a -18 ºC hasta su uso (Oct-Nov 2014).
Luego (Jul-2017) las muestras fueron recuperadas en agar MRS a 22 ºC por
48 hrs. Aquellas placas con colonias macroscópicas se les realizó una curva de
crecimiento en caldo MRS a 8 ± 2 ºC, en aerobiosis, sin agitación monitoreados con
lecturas de densidad óptica (DO) a 600 nm. Se utilizó como control a L. sakei CECT
4808.
Las bacterias con capacidad de multiplicación similar a la cepa control, se
caracterizaron genéticamente mediante RAPD, utilizando ADN extraído con
protocolo fenol-cloroformo, partidor Oligo (5`-AGC GGG CCA A-3`) y temperatura
de alineamiento 36ºC. Los perfiles electroforéticos obtenidos fueron evidenciados
en gel de agarosa al 1,8% y electroforesis a 70 V por 90 minutos.
Resultados y discusión
Se aislaron 27 Lactobacillus spp. a partir de las muestras de filetes de pollo
deteriorados a 4 ºC. De ellas sólo 7 fueron recuperadas viables posterior a su
congelación.
Al monitorear la capacidad de crecimiento de los aislados a 8 ± 2 ºC, se
observó que 2 (L.63 y 74) tienen capacidad de multiplicación en frio, con un
comportamiento similar al L. sakei CECT 4808 utilizado como control [figura a].
No obstante lo anterior, mediante RAPD se evidenció que hay altas
probabilidades de que ambos aislados nacionales sean la misma cepa ya que
presentan el mismo perfil electroforético [figura b]. Esto significa que probablemente
108
ambos aislados tienen un origen de contaminación común en la planta procesadora
de pollos, evidenciando biofilms indirectamente. Ibarreche y et al. (2014), han
evidenciado experimentalmente la capacidad de ciertos Lactobacillus a
autoagregarse y formar bio-películas en superficies abióticas.
4
3
2
1
0
0 24 48 72 96
Horas
109
Anexo 10
110
Anexo 11
111
Anexo 12
112
Anexo 13
113
Anexo 14
114
Anexo 15
115
Anexo 16
116
adicional que tiene un efecto menos volátil en el tiempo. Se debe continuar con los
estudios para identificar la sustancia en cuestión.
Tabla b: Halos de inhibición promedios (mm) medidos a las 24 horas de incubación (20 ± 2
ºC) en prueba de difusión en pocillo con sobrenadantes libre de células (SLC), concentrado
o fresco y no ajustado (pH ≈4,2) o ajustado a pH 6.5.
117
Anexo 17
4,5
4,0
3,5 1.1
5.4
3,0
8.4
DO 600
2,5 11.5
2,0 12.1
PF
1,5
4.2
1,0 7.2
0,5 9.1
11.1
0,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tiempo
118
Anexo 18
Introducción:
La rápida aparición de patógenos con resistencia a antibióticos (RA) es una
amenaza importante para salud pública. Tradicionalmente la principal vía de
propagación de RA fue la transferencia horizontal de genes RA entre los patógenos
en un ambiente hospitalario. Sin embargo, estudios sugieren que es más probable
la transmisión horizontal de estos genes entre bacterias comensales y patógenas
en diferentes ecosistemas, que la transferencia directa de un patógeno a patógeno.
Pseudomonas spp son bacterias psicrotrofas alterantes que limitan la vida
útil del pollo refrigerado envasado en aerobiosis. No obstante, por ser conocidas
como inocuas para el humano no se incluyen en el programa HACCP. Usualmente,
la carga inicial de Pseudomonas spp en pollo fresco es baja, sin embargo al final de
su vida útil se incrementa hasta concentraciones de 7-8 log UFC/g.
Se han descrito Pseudomonas spp con genes de resistencia a tetraciclina y
eritromicina en subproductos de cerdo, vacuno y pavo, pero no se encuentran
trabajos relacionados con carne de pollo.
Objetivo:
Evaluar el perfil fenotípico de resistencia antibacteriana de Pseudomonas
spp alterantes aisladas de pollo frente a antibióticos de uso humano.
Materiales y métodos:
Se analizó mediante técnicas microbiológicas tradicionales muestras de 11
bandejas de filetes de pollo vencidos a 4ºC. A partir de agar Pseudomonas CFC, se
aislaron colonias de Pseudomonas predominantes (Gram negativas
predominantes, no fermentadoras y oxidasa positivas).
A diferentes cepas se les evaluó la sensibilidad a ciprofloxacino (Cip;
S=≤1ug/mL;I=2 ug/mL ;R=≥4 ug/mL), tetraciclina (Tet; S=≤4 ug/mL; I=8 ug/mL;
R=≥16 ug/mL), polimixina B (Pol B; S=≤2ug/mL; I=4 ug/mL; R=≥8 ug/mL) y
sulfametoxazol-trimetoprim (S-T; S=≤38/2 ug/mL; R=≥76/4 ug/mL) mediante
Concentración Inhibitoria Mínima en agar.
Resultados
De cada muestra se seleccionaron entre 2 y 4 cepas de Pseudomonas spp
predominantes (n=28).
No se observaron cepas resistentes a Tet. Sólo 2/28 cepas presentaron
resistencia intermedia a Cip y 13 cepas se clasificaron como intermedias (n=2) o
resistentes (n=11) frente a Pol B. La mayor resistencia se observó frente a S-T,
119
donde 23/28 cepas fueron resistentes. Se observó multiresistencia a 3 antibióticos
(Cip, Pol B, S-T) en 1/28 cepas y en 11/28 cepas a 2 antibióticos (Pol B y S-T).
Conclusiones:
Existe una alta tasa de multiresistencia en las cepas de Pseudomonas
alterantes aisladas a partir de pollo.
Existen 7 perfiles diferentes de resistencia a antibióticos, lo que evidencia
la gran diversidad de Pseudomonas alterantes presentes en el pollo.
El uso de antibióticos en producción aviar debe sopesarse frente a los
graves riesgos potenciales para la salud humana que plantea la resistencia
a antibióticos.
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Financiamiento:
Beca Conicyt folio número 21120298
120
Anexo 19
121
122
123
124
125
126
Anexo 20
Background:
Biofilms in poultry industry can be associated to pathogenic and/or spoilage bacteria,
among them Salmonella, Campylobacter or Pseudomonas. These bacteria are a
major source of enteric diseases or major spoilage agents that reduce safety and
shelf life of poultry products.
The globalization of Chilean poultry exportations require lower bacterial loads. To
evaluate the presence of Pseudomonas biofilms we can use a simple molecular
methodology like Random amplification of polymorphic DNA (RAPD). DNA
fingerprinting allow us to identify biofilms showing a similar pattern in bacteria from
different poultry samples.
The aim of this work was to characterize Pseudomonas isolates from poultry
samples with different production dates by RAPD, and compare the resulting DNA
fingerprint as an indicator of bacterial biofilms in the processing line.
Methods:
24 isolates of P. fragi and 14 P. fluorescens from 11 poultry samples were obtained
from a single industry, during different production dates and sampling time. Isolates
were characterized through RAPD using a 10 mer primer (5`-AGCGGGCCAA-3`)
and an annealing temperature of 36 ºC. All Pseudomonas isolates were grouped
into RAPD types which were considered similar (≥85% Dice similarity) based on
DNA patterns.
Results:
24 P. fragi isolates were grouped into 13 RAPD types, from which 8 included two or
more isolates obtained in different sampling times.
14 P. fluorescens isolates generated 12 RAPD types and only 2 isolates from
different poultry samples had the same RAPD types.
Conclusion:
The presence of Pseudomonas isolates with similar RAPD types from different
sampling times, evidences the presence of persistent biofilms in one or more steps
during the poultry processing line.
The results suggest that P. fragi has greater ability than P. fluorescens to persist in
biofilms.
Each enterprises require more research to locate the biofilms and to apply a BPM
solution.
CONYCIT - PhD scholarship Number 21120298
127
Anexo 21
128
Anexo 22
129
ANEXO 23:
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153