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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

PSEUDOMONAS
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Ingeniería Bioquímica
ING. BIOQUIMICA ITTG QFB. AURA FLORES
EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

INSTITUTO TECNOLOGICO
DE TUXTLA GUTIERREZ

MICROBIOLOGIA
2

PSEUDOMONAS
(EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA)

ALUMNOS:

DOMINGUEZ FLORES LAURA PATRICIA

GUTIERREZ SARMIENTO WILBERT

QFB. AURA FLORES

TUXTLA GUTIERREZ, CHIAPAS A 8 DE NOVIEMBRE DEL 2011

INDICE

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

I. INTRODUCCION…………………………………………………………………… 5
….

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II. OBJETIVO…………………………………………………………………………… 6

III. MARCO 7
TEORICO…………………………………………………………………….
III.I PSEUDOMONAS
III.I.I CULTIVO
III.I.II HABITAT
III.I.III.CARACTERISTICAS GENERALES
III.I.IV.GRUPOS DE BACTERIAS DE Pseudomonas ssp
III.I.V PATOGENIA
a. Patógenos animales
b. Patógenos de plantas
4
III.I.VI IMPORTANCIA DE PSEUDOMONAS
a. Su actividad como patógeno de animales
b. Su actividad como patógeno de vegetales
c. Su actividad como agentes alterantes de alimentos
d. Su actividad como agentes descontaminantes
ambientales

III.II.AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE
PSEUDOMONAS
III.II.I CARACTERISTICAS MINIMAS DE IDENTIFICACION
III.II.III IDENTIFICACION CON PRUEBAS BIOQUIMICAS
III.II.IV IDENTIFICACION POR PCR
III.I.V ESPECIES DE PSEUDOMONAS
a. P. aeruginosa
b. P. fluorescens
c. P. putida
d. P. maltophilia
e. P. cepacia
f. P. stutzeri
g. P. alcaligenes y P. pseudoalcalagenes
h. P. mallei
i. P.pseudomallei

III.III HIDROCARBUROS
III.III.I CLASIFICACION
III.III.II CONTAMINACION DE HIDROCARBUROS
III.III.III DEGRADACION DE HIDROCARBUROS
III.III.IVCATABOLISMO DE LOS COMPUESTOS
AROMATICOS
a. Catabolismo aerobio
b. Catabolismo anaerobio

III.IV.PETROLEO
III.IV.I CARACTERISTICAS
III.IV.III FORMACION
III.IV.IV PRINCIPALES FUENTES DE CONTAMINACION

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III.IV.V PSEUDOMONAS DEGRADADORAS DE PETROLEO


IV. METODOLOGIAS…………………………………………………………………… 25
….
*Aislamiento de la diversidad microbiana de la rizosfera del suelo
*Identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas
*Identificación de Pseudomonas spp. mediante pruebas bioquímicas
 Prueba de oxidasa
 Prueba de triple azúcar hierro (TSI)
 Prueba de Fluoresceína
 Prueba de Piocianina:
 Prueba de Nitrato (MMM)
*Extracción de ADN de las Pseudomonas spp.aisladas para análisis de PCR
*Identificación de Pseudomonas spp. por5análisis de PCR
*Determinación cualitativa de la capacidad de biodegradación de hidrocarburos
aromáticos por Pseudomonas spp. aisladas
*Determinación cuantitativa de la capacidad de biodegradación de hidrocarburos
alifáticos por Pseudomonas spp. aisladas
*Descripción para la identificación de Pseudomonas spp.

V. RESULTADOS……………………………………………………………………… 32
……
VI. DISCUSION DE 40
RESULTADOS…………………………………………………………
VII. CONCLUSION……………………………………………………………………… 41
…..
VIII. BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………………… 42
….
IX. ANEXOS……………………………………………………………………………… 43

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I. INTRODUCCION

El estudio de las Pseudomonas ssp en las ultima décadas se debe que tiene
ciertas características importantes; ya que es capaz de utilizar compuestos
orgánicos como fuentes de carbono y energía. Esto ha permitido mediante su
estudio la comprobación de la capacidad de inhibir los coliformes, siendo los
indicadores de contaminación de agua más usados en el mundo, pero no solo
esa área ha sido de gran interés,6 puesto que en los últimos años se ha
encontrado que es capaz de biorremediar el medio contaminado con ciertos
hidrocarburos presentes en el petróleo.

El petróleo es una mezcla homogénea de compuestos orgánicos,


principalmente hidrocarburos insolubles en agua, estos compuestos están
conformados de hidrógeno y carbono, en su mayoría parafinas, naftenos y
aromáticos.
Los hidrocarburos de este tipo llegan a se de gran problema para los
ecosistemas, ya que contaminan fuentes de agua y suelos, ocasionando un
gran impacto ecológico. Por tanto es la gran importancia que adquieren las
Pseudomonas ssp para lograr la remoción de estos contaminantes del
ambiente.

Es por ello la importancia de poder aislar este tipo de bacterias presentes en el


suelo El manejo inadecuado de los materiales y residuos peligrosos ha
generado a escala mundial, un problema de contaminación de suelos, aire y
agua. Entre las más severas contaminaciones se destacan las que se
produjeron y todavía se producen a causa de la extracción y el manejo del
petróleo en todos los países productores de hidrocarburos.

Las Pseudomonas ssp son una un grupo de bacterias que se encuentran


constituido por bacilos aerobios gran negativos y móviles, algunos de los
cuales producen pigmentos solubles en agua. Las especies de este género se
identifican sobre la base de varias características fisiológicas. El aislamiento de
esta bacteria nos permitirá un mayor análisis de su capacidad degradadora de
los hidrocarburos.

Es por ello que en la realización de este trabajo, aislaremos a Pseudomonas


ssp a partir de muestras de la tierra llevándolas a un crecimiento selectivo,
para de esta manera poder separarlas debido a sus características
taxonómicas , trabajado con ciertas pruebas bioquímicas además de PCR
(Reacción de Cadena Polimerasa), y así ya una vez identificadas poderlas poner
a prueba en la minimización de los hidrocarburos policíclicos y heterocíclicos,
con esto poder medir su potencial biodegradativo que presentan las bacterias
Pseudomonas ssp. a fin de seleccionar cepas bacterianas con una amplia
capacidad degradadora, que garanticen de esta forma la remoción de los
hidrocarburos complejos presentes en el suelo.

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II. OBJETIVO

General:

 Aislar e identificar la bacteria pseudomonas a partir de la extracción de


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una muestra del medio

Específicos:

 Diferenciar la familia de pseudomonas en una muestra de fuente natural


(tierra), según las características que se presentan
 Diferenciar a partir de técnicas de taxonómicas la presencia de la
bacteria pseudomonas ssp.
 Utilizar la técnica de PCR para una clara y concisa diferenciación de la
bacteria pseudomonas ssp, según su ADN.
 Aislar la bacteria pseudomonas obtenida de la muestra
 Permitir el crecimiento de la bacteria a partir de igualar las condiciones
necesarias de la misma

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III. MARCO TEORICO

III.I PSEUDOMONAS

Los organismos de este género son bacilos gran negativos o esporulados, de


unos 3 Mm x 5 Mm, que se mueven mediante flagelos polares, que pueden
producir un pigmento fluorescente, son oxidasa positivos, utilizan glucosa
oxidativamente y no forman gas.

Se hallan corrientemente en el suelo8 y el agua. Algunas especies se identifican


como patógenas para el hombre y animales pero algunos otros, considerados
al principio como saprofitos y comensales, se han implicado como patógenos
oportunistas en infecciones adquiridas en hospitales y han llegado a colonizar
aportes de agua destilada, jabones, desinfectantes, infusiones intravenosas y
otros productos farmacéuticos. Las especies que colonizan las piscinas se han
incriminado en infecciones del oído.[ CITATION Col89 \l 2058 ]

III.I.I CULTIVO

Las Pseudomonas crecen en medios simples (Tabla 1). En caldo crecen


abundantemente formando un anillo y un sedimento de color verde azulado. En
agar simple forman colonias brillantes, confluentes, de borde continuo y a
veces ondulado con un centro opaco. El pigmento (piocianina) se difunde en el
medio dándole una tonalidad verdosa. Este pigmento tiene cualidades
bactericidas sobre otras bacterias Gram positivas y Gram negativas.

III.I.II HÁBITAT

Las especies del género Pseudomonas son organismos ubicuos, bacterias


gram negativas que se encuadran dentro del grupo γ de las proteobacterias.
Se han aislado bacterias de este género tanto en suelos limpios como en
suelos contaminados por productos biogénicos y xenobióticos. También son
microbiota predominante en la rizosfera y en la filosfera de plantas; del mismo
modo, se han aislado de ambientes acuáticos, tanto de agua dulce como de
aguas marinas. En general inocuas para el hombre también existen: patógenos
oportunistas como P.aeruginosa; patógenos de animales y patógenos de
plantas como P.syringae.

Este género es uno de los más proclives a la degradación de compuestos


orgánicos, especialmente cepas de la especie Pseudomonas putida. El amplio
potencial catabólico de los componentes del género viene dado en muchos
casos por la presencia de determinantes plasmídicos y transposones
autotransmisibles. La ubicuidad de las bacterias del género Pseudomonas y su
capacidad para explotar una amplia variedad de nutrientes refleja un sistema
de adaptación al medio ambiente que no encuentra parangón en las bacterias
de otros géneros.

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Las cepas del género Pseudomonas son capaces de procesar, integrar y


reaccionar a una amplia variedad de condiciones cambiantes en el medio
ambiente, y muestran una alta capacidad de reacción a señales físico-químicas
y biológicas. Se han descrito cepas capaces de adquirir resistencia a metales
pesados, disolventes orgánicos y detergentes, lo cual les permite explotar una
amplia gama de fuentes de carbono como nutrientes, así como colonizar
ambientes y nichos que difícilmente son colonizables por otros
microorganismos. Por ello no es sorprendente que se considere a las bacterias
del género Pseudomonas un paradigma de versatilidad metabólica, y
microorganismos claves en el reciclado de materia orgánica en los
compartimentos aeróbicos de los ecosistemas, jugando, por tanto, un papel
esencial en la mejora y el mantenimiento de la calidad medioambiental.
Además de su uso en biodegradación 9 las especies del género Pseudomonas se
emplean en distintos procesos industriales, tales como la fabricación de
bioplásticos o en técnicas de biocontrol. La posición taxonómica de las distintas
especies del género se encuentra sujeta a revisión.

III.I.III CARACTERÍSTICAS GENERALES

Las pseudomonas son bacilos rectos o curvados pero no vibroides, son


bacterias Gram negativas con flagelos polares , normamente aislados, no
envainadas o con yemas, constan de un tamaño de 0,5 -1,0 Mm por 1,5-4,0
Mm, sin esporas.

Dentro de su metabolismo respiratorio, nunca fermentativo aunque pueden


producir cierta cantidad de acido a partir de glucosa en condiciones de
aerobiosis; utilizan compuestos orgánicos de bajo peso molecular pero no
polímeros; algunos son quimilitrotofos, utilizando H 2 o CO como único donador
de electrones en anaerobiosis, algunos pueden utilizar arginina
anaeróbicamente[ CITATION mad08 \l 2058 ][ CITATION mad08 \l 2058 ]

III.I.IV. GRUPOS DE BACTERIAS DEL GÉNERO PSEUDOMONAS

El grupo de bacterias relacionadas con el género Pseudomonas es muy amplio


y comprende especies patógenas para humanos Pseudomonas cepacia
(patógeno oportunista que puede causar infecciones muy serias con alta tasa
de mortalidad en pacientes comprometidos, especialmente han aumentado los
datos de infecciones producidas en los pulmones de pacientes con fibrosis
cística) y Ps. aeruginosa. Hay especies patógenas vegetales como Ps.
solanacearum que produce marchitación, Ps. syringae causante de manchas
cloróticas en ciertas plantas y Ps. marginalis causante de pudriciones blandas
en las raíces de las plantas.

Por otra parte, existen varios géneros bacterianos estrechamente relacionados


con el de Pseudomonas que también tienen una importancia especial: el
género Xanthomonas comprende varias especies patógenas vegetales que
producen necrosis del follaje. El género Zooglea comprende varias especies
capaces de producir agregados celulares de gran tamaño que intervienen de

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forma importante en la digestión de las aguas orgánicas de ciudades e


industrias, y los géneros Acetobacter y Gluconobacter, de los que hablaremos
más adelante, que son capaces de oxidar alcoholes y tienen importancia
industrial en la fabricación de vinagre

III.I.V PATOGENIA

a. Patógenos animales

P. aeruginosa es un patógeno oportunista humano, más comúnmente afecta a


los inmunosuprimidos, tales como aquellos con fibrosis quística o sida. Estas
infecciones pueden afectar a muchas 10 partes del cuerpo, pero típicamente
afectan las vías respiratorias, causando 50 % de las pulmonías bacterianas
nosocomiales. [ CITATION Sal54 \l 2058 ] El tratamiento de dichas infecciones puede
ser difícil debido a la frecuente y repetitiva resistencia antibiótica.

P. oryzihabitans puede también ser un patógeno humano, aunque las


infecciones son raras. Puede causar peritonitis, endoftalmitis, septicemia y
bacteremia. Síntomas similares, aunque poco frecuentes, pueden ser vistos
con P. luteola.

P. plecoglossicida es una especie patógena de peces, causando ascitis


hemorrágica en los peces Ayu (Plecoglossus altivelis). P. anguilliseptica es
también un patógeno en los peces.

Debido a su actividad hemolítica, las especies que no son patógenas pueden


ocasionalmente causar problemas clínicos, en particular en la infección de
transfusiones de sangre.

Las Pseudomonas, por ser bacterias hidrófilas, han estado involucradas en


otitis externa en particular asociada al agua, como es el caso del oído de
nadador crónico o aquellas provocadas por la inserción de objetos penetrantes
en el oído.

b. Patógenos de plantas

P. syringae es un patógeno prolífico de plantas. Existe en más de 50 variantes,


muchas de las cuales muestran un alto grado de especificidad en las plantas.
Hay numerosas especies de otras Pseudomonas que pueden actuar como
patógenos de las plantas, aunque la P. syringae es la más distribuida y mejor
estudiada.

Aunque no es un patógeno estrictamente de plantas, P. tolaasii puede ser un


gran problema agrícola, debido a que causa manchas bacterianas de setas
cultivadas. Similarmente, P. agarici puede causar laminillas gotosas en ciertos
setas.

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III.I.VI. IMPORTANCIA DE LAS PSEUDOMONAS

La importancia aplicada de las bacterias del grupo de Pseudomonas se debe a


una serie de factores entre los que destacan:

a. Su actividad como patógenos de animales

Las patologías asociadas a Pseudomonas suelen presentarse en animales


afectados por algún tipo de disminución, permanente o transitoria, del sistema
de defensa inmune. Por esto, se denominan patógenos oportunistas. El
11 ser difícil debido a la alta resistencia de
tratamiento de estas infecciones suele
estas bacterias a la mayoría de los antibióticos usados normalmente en clínica.
Desde el punto de vista humano, el patógeno principal es Ps. aeruginosa. La
especie Ps. mallei es la causante de la enfermedad conocida como muermo en
los caballos y Ps. pseudomallei es causante de la melioidosis humana.

b. Su actividad como patógenos vegetales

La especie Ps. syringae es un verdadero parásito vegetal. Las especies del


género Xanthomonas también son todas patógenos vegetales.

c. Su actividad como agentes alterantes de alimentos

Las Pseudomonas son el grupo de bacterias más frecuente en los alimentos


frescos. Debido a su gran potencial metabólico, las bacterias de estos grupos
son agentes importantes en la alteración de alimentos. Sin considerar los
aspectos de deterioro de vegetales producidos por especies antes citadas, las
Pseudomonas son uno de los principales grupos responsables de la alteración
de productos cárnicos almacenados incorrectamente en condiciones de
aerobiosis. Algunas bacterias del grupo son psicrófilas por lo que la alteración
de los alimentos que producen también tiene lugar durante la conserva en
refrigenración. Cuando piezas de alimentos cárnicos son conservadas en
refrigeración en ambientes impermeables al gas o en vacío, las Pseudomonas
pueden producir H2S que reacciona con la hemoglobina dando lugar a la
aparición de manchas verdes.

d. Su aplicación como agentes descontaminantes ambientales

La gran versatilidad metabólica de las bacterias del género Pseudomonas las


han hecho candidatas para el tratamiento de contaminaciones ambientales
producidas por la acumulación de metales pesados o por la acumulación de
compuestos xenobióticos.

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Varias especies del Pseudomonas contienen plásmidos en los que se


encuentran codificadas enzimas capaces de degradar, al menos parcialmente,
compuestos orgánicos derivados del petróleo o compuestos organoclorados u
organofosfatados. Estas enzimas suelen ser inducibles y la selección de las
cepas adecuadas puede permitir reducir los niveles de contaminación por estos
compuestos xenobióticos.

La biodegradación de hidrocarburos y de otros compuestos orgánicos es


realizada con eficiencia variable dependiendo de la estructura del hidrocarburo
(lineal o ramificado, alifático o aromático) y de la presencia de átomos
sustituyentes. Algo similar ocurre con la biodegradación de compuestos
12y emulgentes.
insecticidas, herbicidas y detergentes

Por otra parte, el tratamiento de la contaminación originada por la acumulación


de metales pesados también es posible mediante la utilización de bacterias de
este género. El efecto tóxico de los metales pesados suele estar asociado a la
presencia de formas ionizadas (cationes) de los metales en cuestión. Ciertas
bacterias de este género presentan enzimas capaces de reducir los cationes
metálicos a las formas neutras que son mucho menos tóxicas. Los operones
que controlan la producción de estos enzimas reductores suelen ser inducibles
por la presencia del metal pesado.

Otra forma de intervención en la eliminación de metales pesados por bacterias


de este grupo la desarrollan las bacterias del género Zooglea que son capaces
de acumular los metales pesados y formar agregados de gran tamaño que
precipitan mediante floculación.

La utilización dirigida de bacterias para la descontaminación de ambientes


naturales se denomina biorremediación.

III.II. AISLAMIENTO E IDENTIFICACION

Se siembran en agar nutritivo, en McConkey, agar nutritivo con 0,1% de


cetrimida o algunos de los medios para pseudomonas y se incuban a 20-25 °C
(materiales animales).

Las colonias en agar nutritivo son generalmente grandes (2-4 mm),


desarrollándose planas y pigmentadas. Pueden difundirse en el medio un
pigmento fluorescente amarillo verdoso o amarillo azulado. En ocasiones se
encuentran cepas melanogenicas. Se forma un pigmento pardo alrededor de
las colonias. Se hallan a veces cepas mucoides (encapsuladas) en material
clínico y puede confundirse con klebsiellas.

Se hace la prueba de la oxidasa, reacción en el medio de Hugh y Leifson,


siembras en caldo de arginina de Thornely (el método de Moeller es demasiado
anaerobio), agar de McConkey y prueba de licuación de la gelatina(incubación

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durante cinco días). Se siembran caldos de nutritivos y se incuban a 4 y 42 °C.


se utiliza para esta prueba de subcultivo de una cepa lisa.

Las pseudomonas son móviles (en ocasiones pueden hallarse cepas inmóviles),
oxidativas, no reaccionan y producen álcali en medio de Hugh y Leifson. La
reacción de la oxidasa es positiva, excepto posiblemente con P.maltophilia. La
reacción de arginina de Thornley es positiva salvo para P.maltophilia, P.
cepacia, P. stutzeri y P. alcaligensis, que no son frecuentes. Aquellas
pseudomonas que dan positivas a la arginina lo hacen mas rápidamente que
otros bacilos Gram negativos y esta prueba es muy útil para identificar las
cepas no pigmentadas. Alcaligenses, Achromobacterium y Vibrio ssp. no
13
hidrolizan la arginina. Las pseudomonas varían en su capacidad para licuar la
gelatina y crecen a 4 y 42 °C (véase tabla 2), pueden ser útiles para las
pruebas de sensibilidad a discos de penicilina.[ CITATION Col89 \l 2058 ]

La formación de pigmento se observa mejor en un medio sintético basal con


4% de gluconato cálcico o en un medio comercial para pseudomonas.

Algunas cepas fluorescentes producen una opalescencia (reacción yema de


huevo) en el medio de Willis y Hoob y también una lipasa (capa perlada). Para
demostrar la última, se inunda la placa con solución saturada de sulfato de
cobre; los ácidos grasos liberados por lipolisis forman un precipitado azul
verdoso de jabones de cobre.

Algunas variedad se relacionada con la alteración de alimentos son psicrofilas y


pueden ser lipoliticas. No son raras las cepas tolerantes a la salmuera y las
cepas fosforescentes

III.II.I CARACTERÍSTICAS MÍNIMAS PARA LA IDENTIFICACIÓN

Gran negativas, bacilos rectos o ligeramente curvados, sin esporas, siempre


móviles por flagelos polares; metabolismo oxidativo en medio para oxidación-
fermentación con glucosa, el tubo sin vaselina produce acido(amarillo) y el
tubo sin vaselina no produce acido (neutro); no se produce gas de la glucosa
(se distinguen fácilmente de las bacterias entéricas y de Aeromona); la oxidasa
es casi siempre positiva (las entéricas son negativas); la catalasa siempre es
positiva no presentan pigmentos fotosintéticos (lo distingue de las bacterias
rojas no del azufre); el indol y el rojo de metilo son siempre negativos[ CITATION
Col89 \l 2058 ].

IIII.II.II.IDENTIFICACION POR PRUEBAS BIOQUIMICAS

Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a


medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar
distintos microorganismos presentes.

 Prueba de oxidasa

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El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo


C oxidasa, esto a partir de que el citocromo óxido acepte electrones artificial:
tetrametil (o dimetil) – p – fenilendiamina.

Las colonias oxidasa positivas en agar pueden detectarse sumergiendo la placa


en un reactivo y buscando colonias azuladas o marrones, da positivo para
Pseudomonas.

 Oxidación-Fermentación (O-F)
Se evalúa la capacidad de las bacterias para oxidar o fermentar produciendo
acido que se detecta gracias al azul de bromotinol (pH), da positiva para
pseudomonas. (Anexo 2) 14
 Reducción de Nitrato

Las Pseudomonas son positivos a estas pruebas, que trata acerca de la


reducción de nitrato a nitrito.(Anexo 3).

 Gelatina

Se usa para valorar la licuefacción o licuación de la gelatina por acción de las


gelatinasas bacterianas producidas. La reacción positiva hace que el medio
permanezca líquido después de la incubación aún después de dejarse en
refrigeración durante media hora. La reacción negativa permite nuevamente la
solidificación; da positivo para pseudomonas.

III.II.III. IDENTIFICACION POR PCR

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas


para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas
temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas
entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a
unirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios


repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3
pasos a diferentes temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que
tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están
precedidos por un choque térmico (llamado "hold") a alta temperatura (>
90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de
producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo
aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Éstos
incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones
divalentes y de los dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de los
cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar.

III.II.IV. IDENTIFICACION DE ESPECIES DE PSEUDOMONAS

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a. P. aeruginosa

Las colonias en medio agar, 18-24 horas a 25-30 °C, son grandes de superficie
plana e irregular, de coloración verde grisacea. El pigmento verdoso se difunde
en el medio. Los cultivos en caldo son de color azul verdoso. Se forman dos
pigmentos, piocianina y fluorescencia: ambos son hidrosolubles,aunque
solamente la piocianina es soluble al cloroformo. Laarginina es hidrolizada
rápidamente. Licuan la gelatina. El crecimiento tiene lugar a 42°C pero no a
5°C.la reacción de la yema de huevo es negativa. Los organismos son muy
resistentes a los antibióticos, salvo a la polimixina, gentamicina y cabernicilina.

Es un saprofito, que se halla en el suelo


15 y en el agua, producen alteraciones de
los alimentos, entre ellas las “leche azul”, es patógeno para el hombre y los
animales (“pus azul”), a menudo como infección secundaria y se halla con
frecuencia ne material clínico. Esta frecuentemente asociada a infecciones de
los tractos respiratorios y urinario en humanos. Las infecciones por
Pseudomona aeruginosa son frecuentes en grandes quemados u otros
traumatismos severos que afecten a amplias zonas de la piel o bien en
pacientes con fibrosis quística. Sin embargo, no es un parasito estricto, sino un
oportunista típico, iniciando una infección cuando el individuo se encuentra
bajo de defensas. También pueden causar infecciones sistemáticas, de nuevo
con individuos con amplias lesiones de piel. Este microorganismo es
naturalmente resistente a muchos de los antibióticos utilizados rutinariamente
de modo que la quimioterapia es difícil. Frecuentemente la resistencia se debe
a la transferencia de plásmidos R, que es un plásmido que se lleva genes para
la descodificación de diversos antibióticos. Pseudomona aeruginosa se aísla
fundamentalmente en medios hospitalarios y pueden enfermar a pacientes que
están en tratamiento por otras causas. la polimixina, es un antibiótico poco
utilizado en la terapia humana debido a su toxicidad, es sin embargo efectivo
frente a Pseudomona aeruginosa, y puede utilizarse con precaución por los
efectos laterales severos.

b. P. fluorescens

Las colonias sobre el agar y sus propiedades bioquímicas son similares a las de
P. aeruginosa, pero produce solamente un pigmento (flourescencia). El
crecimiento tiene lugar a 5°C pero no a 42°C. la reacción de yema de huevo es
positiva. Este organismo es un saprofito que se hallan frecuentemente en el
suelo, agua y en vertidos de alcantarillado. Es alterante de los alimentos.
Pueden gelificar la leche UTH si se conserva por encima de 5°C.

c. P. putida

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Las colonias recuerdan a las de P. aeruginosa, pero únicamente forman


fluorescencia. Es un psicrotofo que puede no crecer a 37 °C, pero crece a 22
°C. hay dos biotipos: uno crece a 4 °C y el otro no; los dos hidrolizan la
arginina. Es negativa la reacción de la yema de huevo, no licua la gelatina y los
cultivos viejos tiene un marcado olor a trimetilamina (a pescado podrido). Es
un organismo patógeno importantes para los peces y alterante del pescado y
ha sido aislado de materiales humanos.

d. P. maltophilia
16
Las colonias recuerdan a las de P. aeruginosa, aunque pueden producir
pigmento difusible amarillo o pardo. Esta especie se ha señalado como
oxidasa-negativa por Gilardi, quien utilizo discos de oxidasa de Difco, aunque
Snell observo cepas oxidasa-positivas cuando se hizo la prueba con clorhidrato
de tatrametil-1-fenilendiamina. Parece importante para agar cetrimida. Es la
única pseudomona que da una reacción lisina descarboxilasa positiva. Se ha
aislado de una gran diversidad de fuentes y parece un organismo patógeno
oportunista.

e. P. cepacia

Las colonias producen un pigmento amarillo, hidrosoluble, no fluorescente, que


en ocasiones puede ser purpura o pueden ser no pigmentadas. Se ha señalado
crecimientos a 42°C.esta ampliamente distribuido en la naturaleza
presentándose como “infección hospitalaria”.

f. P.stutzeri

Las colonias son duras, secas y rugosas y pueden extraerse enteras del medio.
Las colonias viejas se vuelven pardas. Pueden no hidrolizar arginina y pueden
crecer o no a 4 o a 42°Co en un medio de cetrimida. Se ha hallado en
materiales clínicos

g. P.alcaligenes y P.pseudo-alcaligenes

Se ha indicado que estos organismos crecen a 42°C pero no a 4°C. no licuan la


gelatina y pueden o no crecer en agar cetrimida. P.alcaligenes no hidrolizan
arginina.

h. P. mallei

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Estos organismos pueden aparecer en los exudados de aspecto granuloso


perlado y pueden presentar tinción bipolar. Forma colonias de 1mm, brillante,
lisas, convexas, amarillo verdosa, cremosas o ligeramente viscosas, que
pueden ser adherentes en agar nutritivo, no hemolizan el agar sangre y no
crecen en agar McConkey en cultivo primario. El crecimiento en el aislamiento
primario puede ser pobre. Crece a temperatura ambiente, no lo hace en el
medio de Hugh y Leifson, no producen acido en los carbohidratos, es nitrato
positivo, da reacción variable a la ureasa y pueden crecer o no en medio con
KCN. La prueba de la oxidasa da resultados variables. Es el agente causal de
muermo.

i. P.pseudomallei 17

Los cultivos en agar sangre o en agar nutritivo a 37°C dan colonias mucoides o
rugosas, secas, en 1-2 diasy pueden producir un pigmento anaranjado. No hay
crecimiento en agar cetrimida. Este organismo no se identifica fácilmente.
Debe diferenciarse de cepas no pigmentadas de P.aeruginosa, P.stutzer y
P.mallei.

Es un patógeno importante el hombre (meliodosis)y de los animales


domésticos en el SE de Asia, en donde es endémico en los roedores y se halla
en la mayoría de los suelos, sobre las verduras y frutas.

III.III HIDROCARBUROS

Son los compuestos orgánicos más simples y pueden ser considerados como
las sustancias principales de las que se derivan todos los demás compuestos
orgánicos. Los hidrocarburos se clasifican en dos grupos principales, de cadena
abierta y cíclicos. En los compuestos de cadena abierta que contienen más de
un átomo de carbono, los átomos de carbono están unidos entre sí formando
una cadena lineal que puede tener una o más ramificaciones. En los
compuestos cíclicos, los átomos de carbono forman uno o más anillos cerrados.
Los dos grupos principales se subdividen según su comportamiento químico en
saturados e insaturados.

III.III.I CLASIFICACIÓN

De acuerdo al tipo de estructuras que pueden formar, los hidrocarburos se


pueden clasificar como:

 Hidrocarburos acíclicos, los cuales presentan sus cadenas abiertas. A


su vez se clasifican en:
o Hidrocarburos lineales a los que carecen de cadenas laterales
(Ramificaciones).
o Hidrocarburos ramificados, los cuales presentan cadenas
laterales.

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 Hidrocarburos cíclicos ó cicloalcanos, que se definen como


hidrocarburos de cadena cerrada. Éstos a su vez se clasifican como:
o Monocíclicos, que tienen una sola operación de ciclización.
o Policíclicos, que contienen una sola operación de ciclización.

Los sistemas policíclicos se pueden clasificar por su complejidad en:

o Fusionados, cuando al menos dos ciclos comparten un enlace


covalente. (Imagen 1)

o Espiroalcanos, cuando al menos dos ciclos tienen un sólo


carbono en común.(Imagen 2)
18
o Puentes o Estructuras de von Baeyer, cuando una cadena
lateral de un ciclo se conecta en un carbono cualquiera. Si se
conectara en el carbono de unión del ciclo con la cadena, se
tendría un compuesto espiro. Si la conexión fuera sobre el
carbono vecinal de unión del ciclo con la cadena, se tendría un
compuesto fusionado. Una conexión en otro carbono distinto a los
anteriores genera un puente.(Imagen 3)

o Asambleas, cuando dos ciclos indepencientes se conectan por


medio de un enlace covalente.

o Ciclofanos, cuando a partir de un ciclo dos cadenas se conectan


con otro ciclo.(imagen 4)

Según los enlaces entre los átomos de carbono, los hidrocarburos se clasifican
en:

 Hidrocarburos alifáticos, los cuales carecen de un anillo aromático,


que a su vez se clasifican en:
o Hidrocarburos saturados, (alcanos o parafinas), en la que todos
sus carbonos tienen cuatro enlaces simples (o más técnicamente,
con hibridación sp3).
o Hidrocarburos no saturados o insaturados, que presentan al
menos un enlace doble (alquenos u olefinas) o triple (alquino o
acetilénico) en sus enlaces de carbono.

 Hidrocarburos aromáticos, los cuales presentan al menos una


estructura que cumple la regla de Hückel (Estructura cíclica, que todos
sus carbonos sean de hibridación sp 2 y que el número de electrones en
resonancia sea par no divisible entre 4).

Los hidrocarburos extraídos directamente de formaciones geológicas en estado


líquido se conocen comúnmente con el nombre de petróleo, mientras que los
que se encuentran en estado gaseoso se les conoce como gas natural. La
explotación comercial de los hidrocarburos constituye una actividad económica
de primera importancia, pues forman parte de los principales combustibles

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fósiles (petróleo y gas natural), así como de todo tipo de plásticos, ceras y
lubricantes.

Según los grados API, se clasifican en:

Si es:

 > 40 - condensado
 30-39.9 - liviano 19
 22-29.9 - mediano
 10-21.9 - pesado
 < 9.9 - extrapesado

Los hidrocarburos sustituidos son compuestos que tienen la misma estructura


que un hidrocarburo, pero que contienen átomos de otros elementos distintos
al hidrógeno y el carbono en lugar de una parte del hidrocarburo. La parte de la
molécula que tiene un ordenamiento específico de átomos, que es el
responsable del comportamiento químico de la molécula base, recibe el
nombre de grupo funcional.

III.III.II CONTAMINACION POR HIDROCARBUROS

La creciente utilización de hidrocarburos en actividades cotidianas deriva en un


constante problema de contaminación. Sin embargo existen microorganismos
que han desarrollado la capacidad de degradar este tipo de compuestos,
siendo este un método práctico que pudiera ser eficaz para disminuir el
problema en los sitios contaminados. En este trabajo se pretende marcar la
atención a la biorremediación, dando especial atención a un grupo de genes
catabólicos capaces de remover hidrocarburos aromáticos bajo condiciones
aerobias y anaerobias.
La extraordinaria versatilidad de las bacterias para utilizar diferentes
hidrocarburos como única fuente de carbono y de energía se evidenció debido
a su potencial por oxidar diferentes compuestos xenobióticos. Estos
compuestos son de origen natural o químicamente sintetizados por las
actividades humano-industriales, sin embargo, estos compuestos diariamente
son descargados al medio ambiente, generando un gran problema de
contaminación. Para tratar de disminuir la contaminación de estos compuestos
aromáticos se han utilizado bacterias, estas bacterias contienen una amplia
variedad de rutas catabólicas. Sin embargo, hay limitaciones para aislar
microorganismos con capacidad de crecer en diferentes compuestos orgánicos
y en la comprensión acerca de los genes que codifican para las proteínas
relacionadas con la degradación de los compuestos xenobióticos.

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Diferentes estudios han determinado el efecto de la contaminación con


hidrocarburos en la germinación y crecimiento vegetativo de diferentes
especies de pastos sometidos a diferentes concentraciones de hidrocarburo,
concluyendo que hay una inhibición en la germinación del trébol común y un
marcado retrasó en el crecimiento de todas las plantas evaluadas.

Así mismo, otros estudios evaluaron el efecto de los hidrocarburos


poliaromáticos (PHA) en ecosistemas forestales y plantas madereras,
demostrando un efecto de necrosis foliar y reportando que aproximadamente
3200 hectáreas son afectadas por los derrames y el 90% de estos son
pantanos o zonas inundables aledañas a plantas con tuberías corroídas por
tener mas de 50 años de antigüedad, al igual que se emplean pozos sin crudo
para almacenamiento de los cuáles 20
un 30% están contaminados con desechos
aceitosos.

Sin embargo, lo que complica la problemática actual de los sitios contaminados


con hidrocarburos, es que hasta hace pocos años, prácticamente no existía una
conciencia del grado de dificultad y del enorme costo de la remediación de
suelos, cuerpos de agua y atmósfera contaminados, lo que representa hoy para
la sociedad un gran costo económico. Dicha contaminación esta ocasionando el
deterioro progresivo de la calidad del medio ambiente y genera una amenaza
real a la salud publica, así como la extinción de gran cantidad de especies
vegetales y animales.

III.III.III DEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS

La presencia de los compuestos aromáticos en la biosfera a través de la


historia, explica por qué los microorganismos han desarrollado diferentes vías
metabólicas usando estos compuestos como un sustrato y una fuente de
energía para su crecimiento, consiguiendo así que una gran variedad de
microorganismos puedan mineralizar los compuestos de interés. Las primeras
investigaciones acerca de este tema se enfocaron en el medio ambiente que
rodeaba a los microorganismos que se localizaban en los depósitos de petróleo
(Chakraborty y Coates, 2004).
Diferentes procesos han sido diseñados para la remoción de compuestos
aromáticos, como: métodos físicos (adsorción por carbono activado), químicos
(por extracción con solventes, oxidación química) y biológicos (utilizando
microorganismos aerobios y/o anaerobios. Siendo, los procesos
microbiológicos, por su versatilidad bioquímica y molecular, así como por
razones de protección ambiental, la mejor alternativa para la remoción de los
compuestos aromáticos, ya sea en condiciones aerobias o anaerobias (Cuadro
1) (Kleerebezem y cols., 1999).

III.III.IV CATABOLISMO DE LOS COMPUESTOS AROMÁTICOS

a. CATABOLISMO AEROBIO.

En los procesos aerobios, la remoción de los compuestos aromáticos puede


llevarse a cabo por hongos, actinomicetos y bacterias que contienen mono o

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

di-oxigenasas, utilizando el oxígeno para la activación y ruptura del anillo


aromático. El oxígeno sirve también como aceptor final de electrones para la
oxidación completa de estos compuestos. Sin embargo, la disminución del
oxígeno disuelto de los sitios contaminados limita la biodegradación del
Benceno, Tolueno, Etilbenceno y Xileno (BTEX).

Los estudios por la vía aerobia para el catabolismo de los compuestos


aromáticos han demostrado que estas enzimas (mono-oxigenasas y di-
oxigenasas), llevan a cabo el primer paso que es la activación para la
conversión de los compuestos aromáticos. Posteriormente, los compuestos son
transformados a un número ilimitado de productos intermedios como son el
protocatecuate y catecol. La ruptura del catecol es catalizada por la 1, 2
dioxigenasa y la del protocatecuate 21 por la 3,4 di-oxigenasa, convirtiéndolos en
piruvato o acetaldehído. Cuando el anillo del catecol o protocatecuate se
rompe en su posición meta u orto, se convierten a β-Cetoadipato. Dos pasos
adicionales completan la conversión de β-Cetoadipato a productos intermedios
del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Si el anillo se rompe en su posición para,
se convierte en piruvato o acetaldehído y entran directamente al ciclo de los
ácidos tricarboxílicos (Heinaru y cols., 2000). Los estudios filogenéticos de la
secuencia de aminoácidos de las proteínas relacionadas con la biodegradación
de los BTEX demostraron una alta similitud en sus secuencias, lo cual indica
que estas proteínas provienen de un gen ancestral común.

b. CATABOLISMO ANAEROBIO

La biodegradación anaerobia es un simple pero efectivo proceso biológico para


el tratamiento de diferentes residuos orgánicos y la producción de energía en
forma de biogás CH4 (Karakashev y cols., 2005). Además es un proceso
mediado por la asociación sintrófica (consorcios) de grupos de bacterias (tabla)
como las:

1) fermentativas (Acidogénicas y Acetogénicas)


2) Desnitrificantes (BD)
3) Sulfato Reductoras (BSR)
4) Metanogénicas (BM)

III.IV PETROLEO

Es un líquido oleoso bituminoso de origen natural compuesto por diferentes


sustancias orgánicas. Se encuentra en grandes cantidades bajo la superficie
terrestre y se emplea como combustible y materia prima para la industria
química. El petróleo y sus derivados se emplean para fabricar medicinas,
fertilizantes, productos alimenticios, objetos de plástico, materiales de
construcción, pinturas o textiles y para generar electricidad.

III.IV.I CARACTERÍSTICAS

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Todos los tipos de petróleo se componen de hidrocarburos, aunque también


suelen contener unos pocos compuestos de azufre y de oxígeno. El petróleo
contiene elementos gaseosos, líquidos y sólidos. La consistencia varía desde un
líquido tan poco viscoso como la gasolina hasta un líquido tan espeso que
apenas fluye.
Existen categorías de petróleos crudos los de tipo parafínico, los de tipo
asfáltico y los de base mixta.

III.IV.II FORMACIÓN

El petróleo se forma bajo la superficie terrestre por la descomposición de


organismos marinos. Los restos de animales minúsculos que viven en el mar se
mezclan con las arenas y limos que 22 caen al fondo en las cuencas marinas
tranquilas. Estos depósitos, ricos en materiales orgánicos, se convierten en
rocas generadoras de crudo. El proceso comenzó hace muchos millones de
años, cuando surgieron los organismos vivos en grandes cantidades, y
continúa hasta el presente. Los sedimentos se van haciendo más espesos y se
hunden en el suelo marino bajo su propio peso. A medida que van
acumulándose depósitos adicionales, la presión sobre los situados más abajo
se multiplica por varios miles, y la temperatura aumenta en varios cientos de
grados. El cieno y la arena se endurecen y se convierten en esquistos y
arenisca; los carbonatos precipitados y los restos de caparazones se convierten
en caliza, y los tejidos blandos de los organismos muertos se transforman en
petróleo y gas natural.
Una vez formado el petróleo, éste fluye hacia arriba a través de la corteza
terrestre porque su densidad es menor que la de las salmueras que saturan los
intersticios de los esquistos, arenas y rocas de carbonato que constituyen dicha
corteza. El petróleo y el gas natural ascienden a través de los poros
microscópicos de los sedimentos situados por encima. Con frecuencia acaban
encontrando un esquisto impermeable o una capa de roca densa: el petróleo
queda atrapado, formando un depósito. Sin embargo, una parte significativa
del petróleo no se topa con rocas impermeables sino que brota en la superficie
terrestre o en el fondo del océano. Entre los depósitos superficiales también
figuran los lagos bituminosos y las filtraciones de gas natural.

III.IV.III PRINCIPALES FUENTES DE CONTAMINACIÓN

Una investigación realizada en 1981 por el Instituto Americano de Petróleo


(API) identifico entre las principales fuentes de contaminación:

a. Lodos de perforación de tipo inversa y recortes


Estos lodos contienen un tipo de aceite muy similar a diesel en
concentraciones de aproximadamente 10% y son sumamente arcillosos. Este
material se deposita en presas, las cuales anteriormente eran construidas con
materiales permeables y filtraban los hidrocarburos al medio ambiente.

b. Suelo contaminado por derrames de tuberías corroídas


Existen campos petroleros con alrededor de cincuenta de 50 años de
antigüedad, ubicados enzonas pantanosas, manglares u otras selvas inúndales.

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Los ductos de estos se instalaron conectando los pozos individuales a baterías


de separación y desde ahí hasta las petroquímicas y refinería, generándose
corrosión anaerobia, debido principalmente a bacterias reductoras de sulfato
dando como resultado ductos corroídos y derramamientos. Los tipos de suelos
afectados son de zonas bajas con altos contenidos de materia orgánica y arcilla
y los menos afectados, son por lo general los más aptos para la agricultura por
poseer texturas menos finas y alta fertilidad. Los sitios que se encuentren en la
planicie costera, son los que más preocupan en caso de contaminación por el
impacto que puede tener sobre los acuíferos, debido a su alta permeabilidad.

c. Tiraderos de desechos aceitosos semisólidos


Se utilizan pozos que nunca produjeron petróleo o un pozo antiguo que no
produce y esta tapado, puesto que nunca
23 fueron diseñados para dicho fin y son
construidos de materiales impermeables, muchas veces se termina el espacio
disponible y se sigue depositando el relleno sobre la plataforma lo que resulta
en escurrimientos e infiltraciones de hidrocarburos al medio ambiente cercano.

d. Sitios contaminados por descargas petroquímicas y refinerías


Estos tienen sistemas antiguos de tratamiento de aguas residuales, las cuales
generalmente contienen sales de los yacimientos de petróleo, lo que puede
afectar los pantanos y cuerpos de agua.

III.IV.IV PSEUDOMONAS DEGRADADORAS DE PETROLEO

Las bacterias del género Pseudomonas poseen la habilidad para utilizar


diversos substratos, incluyendo aquellos creados por el petróleo. Las
Pseudomonas son bacterias Gram negativas, obicuas, que pertenecen a la
subclase gamma de las Proteobacterias.
Las Pseudomonas son bacterias productoras de biosurfactantes como los
ramnolipidos involucrados en procesos de remoción de aceites y productos
relacionados, Bushnell y Hass fueron de los primeros en describir bacterias
productoras de biosurfactantes, como el Corynebacterium simplex y cepas de
Pseudomonas.
Algunos microorganismos productores de biosurfactantes extracelulares que
solubilizan y facilitan la penetración de los hidrocarburos a través de la pared
celular hidrofílica; contienen además enzimas degradadoras de hidrocarburos
en la membrana citoplasmática. La Pseudomonas aeruginosa, es otro de los
microorganismos más usado y estudiado en biorremediación y presenta una
serie de actividades naturales sobre xenobióticos. Lamentablemente, también
es conocida por ser un patógeno oportunista en
humanos y causante de complicaciones graves en personas inmunosuprimidas,
con quemaduras severas o con fibrosis quística. Por estas razones existe
mucho interés en el estudio de las relaciones filogenéticas entre serotipos
clínicos y ambientales.
Estudios con relación al desempeño metabólico de la Pseudomonas aeruginosa
ha permitido identificarla como degradadota de gran cantidad de sustratos

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como el n-hexadecano, mineralización de compuestos alifáticos en condiciones


anaerobias, y degradadora de hidrocarburos aromáticos y poli aromáticos, así
como del pireno en estudios in vitro.

La P. aeruginosa tiene la capacidad de sintetizar ramnolipidos cuando se


encuentra en la fase estacionaria de su crecimiento, por tal razón esto sólo se
puede realizar en la primera fase del proceso de biorremediacion y
contribuyendo así con la movilización y solubilización de los contaminantes
durante la fase siguiente de mineralización. Al mismo tiempo que pueden
tranformarse bajo microcosmos en el suelo con un tratamiento físico o químico
especifico, carácter ística que comparte con el Agrobacterium tumefasciens.
La Pseudomona putida es un saprofito del suelo ,oportunista, cosmopolita,
metabólicamente versátil, por poseer 24 una dioxigenasa inicial, una tolueno
dioxigenasa, aunque no presenta la dioxigenasa específica para los PAHs por lo
cuál es una buena candidata para las aplicaciones biotecnológicas, tales como
agricultura, biocatálisis, biorremediación, biocontrol en protección de las
plantas y producción de bioplásticos.

La P. putida posee la capacidad de colonizar la rizosfera de plantas de cosecha


y una gran capacidad metabólica que facilita el desarrollo de biopesticidas y
promotores de crecimiento de la planta. La degradación de los alcanos por
Pseudomona putida se ha estudiado por secuenciación en el plásmido OCT que
codifica una enzima dioxigenasa que convierte alcanos a aldehídos a través del
hidroperoxidasa del n-alkyl sin un intermediario del alcohol, conocido como la
vía de Finnerty; un proceso similar lo presentan los géneros Acinetobacter sp y
Nocardiodes sp. aunque ellos no poseen este plásmido.

La Pseudomonas fluorescens es degradadora de naftaleno y fenantreno,


ventaja que tiene frente a las otras Pseudomonas, que solo metabolizan
naftaleno y asfaltenos. Estudios realizados demuestran que Flavobacterium y
Pseudomonas son los microorganismos más aislados en la fase de degradación
de los TPH (Hidrocarburos Totales). La Pseudomonas stutzeri es una
degradadora de PHA‘s.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

25

IV. METODOLOGIAS

Aislamiento de la diversidad microbiana de la rizosfera del suelo

Suspender
1 gr. de muestra en 99 ml de agua destilada estéril.
de la rizosfera. Inocular 1ml de la última dilución sobre medio ag
Realizar diluciones en serie

Aislamiento
Determinación de coloniasIncubar
puras. porpor
a 20-25°C diferente morfología colonial
24 horas. Analizaren medio
todas las agar nutritivo.
colonias Incubar
resultantes.
a 20-25°C por 24 horas.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

Descripción
macroscópica de las
bacterias aisladas.

Identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas

26

Fijación de cada una de las muestra de bacterias. Descripción microscópica de las bacterias aisla
Tinción de Gram

Identificación de Pseudomonas spp. mediante pruebas bioquímicas

 Prueba de la Oxidasa

Colocar un disco OX sobre portaobjeto y humedecer con


Agregar agua
una esteril.de cultivo sobre el disco Analizar los resultados
muestra

 Prueba de Triple azúcar y hierro (TSI)

Agar Siembra
TSI solidopor estría sobre superficie inclinada y picadura
inclinado Incubaren la columna.
a 37°C por 24 horas. Analizar los resultados.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

 Prueba de Fluoresceína

27

Análisisdesarrolladas.
bajo luz UV de colinas fluorescentes.
Siembra por estría de colonias puras en
Incubar
medioa King B. Análisis
20-30°C por 72 bajo luz visible de colinas
horas.

 Prueba de Piocianina

Siembra por estría de colonias puras en


Incubar
medioa King
20-30°C Determinación
A. por 72 horas. de la producción de piocina.

 Prueba de Nitrato (MMM)

Medio Glucosa Nitrato asa. a 37°C por 24 Agregar


Incubar
Inoculacion directa por horas. reactivos Griess A yAnalizar
B resultados
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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

28

Extracción de ADN de las Pseudomonas spp.aisladas para análisis de PCR

Medio Centrimide agar tras 18 horas de inoculo


Tomar puro.
200 μl de suspensión
Agregar
bacteriana. Centrifugar por 2min a 10,000 rpm.
a un tubo eppendorf esterilizado.

Vortexear la mezcla. Vortexear


Agregar 3 μl de Proteinasa K. la Agregar Resuspender
mezcla. 30 μl de SDS alel10%.
pelletRetirar
con 0.567
el sobrenadante
ml de TE buffer.
con una micropipe

ING. BIOQUIMICA ITTG QFB. AURA FLORES

Agregar MezclarAgregar
perfectamente.
80 μl de CTAB 10%Vortexear
y NaCl 0.7laM.
mezcla.
Incubar a 65°C por 10 min.
Incubar a 37°C por una hora. 1000 μl d NaCl 5 M.
EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

29
Agregar a un tubo nuevo eppendorf
Extraer el sobrenadante
esterilizado. que contiene el ADN. Agregar 40 μl de fenol y 40 μl de cloroform
Centrifugar por 7 min a 10,000 rpm
Vortexear la mezcla

Mezclar perfectamente. Extraer el sobrenadante que contiene


Agregar a un tuboel nuevo
ADN. eppendorf esterilizad
Agregar 50 μl de alcohol isoamilico. Centrifugar por 5 min a 10,000 rpm

Mantener a temperatura ambiente por 30 min.Drenar el sobrenadante y dejar secar por 30 min.
Agregar 200 μl de isopropanol. Centrifugar por 7 min a 12,000 rpm Disolver en TE (10mM Tris-HCl, 1 mM EDTA

Identificación de Pseudomonas spp. por análisis de PCR

Realizar la mezcla PCR 15 muestras de DN


Agregar 20 μl de H2OAgregar
mQ. 2 μl de 10X buffer. Agregar 0.2mM de dNTP´s.
Agregar 2mM de MgCl2.

ING.
Agregar 5 μlBIOQUIMICA
de ADN a cada tubo. ITTG QFB. AURA FLORES
Tubos eppendorf con carga para PCR. Agregar 1μl de
Distribuir la mezcla en tubos pequeños.taq Agregar 1μl de primer específico.
polimerasa.
EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

Cada producto de PCR mezclar con colorante.


Productos de PCR
30
Programar al termociclador.

Revelar gel con bromuro


Observar al transiluminador. Programar
de etidio.
la cámara de electroforesis.Agregar a cada pozo.

Determinación cualitativa de la capacidad de biodegradación de hidrocarburos aromáticos por


Pseudomonas spp. aisladas

Placas de MMM y agar al


Rociar Incubar
1.5%las placas con hidrocarburos. Inoculación
por 24 hr. Para eliminar de las
solvente porcepas aisladas sobre placas con hidrocarb
evaporación.

Incubar a 37°C por 15 dias.


Observar la presencia de halos que confirmen la biodegradación de hidrocarburos.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

Determinación cuantitativa de la capacidad de biodegradación de hidrocarburos alifáticos por


Pseudomonas spp. aisladas

CETomar
z Erlenmeyer con hidrocarburos vialExtraer
GC 8000 TOP cromatografía
en uncomo una
únicalos
de gases
muestra
fuente mediante
gases equipado
alde
principio
carbono.yjeringa
con una
al final Hamilton
llama detector
del e inyectar
de al espectrofotómetro
ionización y
experimento. para analizar.
un 0,75 mm x 30 m de vidrio capilar columna (ZB-Cer

31

ztraz Klett con hidrocarburos como única fuente de carbono.


delColocarlo
Tomar
Descripción para la 1ml caldo
identificación delaPseudomonas
muestra
inoculado endia.
a cada una
Medir celda de 5mmy/o
la transmitancia
spp. para fotómetrootometro.
absorbancia cada día a 550nm para determin

AISLAMIENTO

Tinción de Gram

+ -

Gram positivas Bacilos Gram negativas

Prueba de Oxidasa
+ -

Aeromonas, Pseudomonas, Vibrio Enterobacterias

Prueba de TSI
Acido (+) Acido (-)

Pseudomonas
Vibrio spp., Aeromonas spp.
Prueba de fluoresceína
+ -

Otras especies de Pseudomonas


P. aeruginosa, P. chlororaphis, P. cichorii, P. fluorescens, P. putida, P. syringae
ING. BIOQUIMICA ITTG QFB. AURA FLORES

Prueba de piocianina
P. aeruginosa
EXAMEN TAXONOMIAP.BACTERIANA
chlororaphis, P. cichorii, P. fluorescens, P. putida, P. syringae
PSEUDOMONAS

Prueba reducción del nitrato


- +

P. chlororaphis, P. fluorescens
P. cichorii, P. putida, P. syringae

32

V .RESULTADOS
IDENTIFICACIÓN TAXONOMICA DE Pseudomonas spp.

Aislamiento de la diversidad bacteriana de la rizosfera del suelo:

Fig. 1. Desarrollo de las diversas bacterias que componen la rizosfera del suelo.
Fig. 2. Desarrollo de colonias puras ais

Tinción de Gram:

Fig. 3. Pseudomonas spp. Bacilos cortos, Gram negativos, rectos o ligeramente curvado

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

33la Oxidasa:
Prueba de

Fig. 4. Prueba positiva de la Oxidasa para Pseudomonas spp.

Prueba de fermentación de azucares (TSI):

Fig. 5. Pseudomonas spp. no fermenta ninguno de los tres azucares presentes en la prueba, tampoco produce ácido sulfúrico, y

Prueba de Fluoresceína en King B

Fig 7. Fluoresceína
Fig 6. Desarrollo de colonias puras de Pseudomonas spp. identificada bajo luz UV producida por

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

Prueba de Piocianina en King A agar:

34Fig 8. Producción de Piocianina por Pseudomonas aeruginosa.

Prueba Reducción del Nitrato:

Fig 9.(Tubo a la izquierda) Resultado positivo con Pseudomonas putida, (Tubo a la derecha) Resultado negativo c

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

35

PCR de cepas identificadas por pruebas bioquímicas como Pseudomonas spp.

DmZ11 DZ12 DZ13 DNA marker


SQ2aSQ2bDmZ16DBP1 DBP2 DBP3
Fig 10. Perfiles de PCR-
BOX de Pseudomonas
spp. aisladas. Carriles 1-9:
cepas aisladas DmZI1,
DZI2, DZI3, SQ2a, SQ2b,
DmZI6, DBP1, DBP2,
DBP3. Carril 10 Marcador
molecular de ADN.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

36

Comparación de huella genética de una Pseudomonas aeruginosa con dos


cepas problemas.

Fig 12. HaeIII patrones de restricción.


Carriles: 1. Marcador molecular
(GeneRuler 100bp ADN); 2. SQ2a; 3.
SQ2b; 4. P. aeruginosa ATCC 27583;
RsaI patrones de restricción. Carriles:
5. SQ2a; 6. SQ2b; 7. P. aeruginosa ATCC
27583; AluI patrones de restricción.
Carriles: 8. SQ2a; 9. SQ2b; 10. P.
aeruginosa ATCC 27538

Fig 13. DdeI patrones de restricción.


Carriles: 1. Marcador molecular
(GeneRuler 100bp ADN); 2. SQ2a; 3.
SQ2b; 4. P. aeruginosa ATCC 27583;
MspI patrones de restricción. Carriles:
5. SQ2a; 6. SQ2b; 7. P. aeruginosa ATCC
27583; HinfI patrones de restricción.
ING. BIOQUIMICA ITTG Carriles: 8. SQ2a; 9. SQ2b; 10. QFB.
P. AURA FLORES
aeruginosa ATCC 27538
EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

37

Fig 14. NotI patrones de restricción.


Carriles: 1. Marcador molecular
(GeneRuler 100bp ADN); 2. SQ2a; 3.
SQ2b; 4. P. aeruginosa ATCC 27583;
Sau3AI patrones de restricción.
Carriles: 5. SQ2a; 6. SQ2b; 7. P.
aeruginosa ATCC 27583; CfoI patrones
de restricción. Carriles: 8. SQ2a; 9.
SQ2b; 10. P. aeruginosa ATCC 27538

cia del gen 16S rDNA afiliados dentro del grupo de Pseudomonas spp. construido con el método de máximas verosimilitud y un filtro (50%

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

38

Determinación de la capacidad de degradación de Hidrocarburos alifáticos:

Figoctadecano,
e crecimiento de Pseudomonas spp. sobre 17. Tazas dedodecano
crecimiento de Pseudomonas
y octano, como únicaspp. sobre
fuente de hexano,
carbonocatecol
a 30° C.y fuel oil, como única fue

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Fig 19. Comparación en los tiempos de desarrollo de Pseudomonas spp en los difere
crecimiento de Pseudomonas spp. sobre ciclohexano, heptano y pentano, como única fuente de carbono a 30° C.

EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

39

Fig 21. Perfil de cromatografía de gases de hidrocarburos después de la biodegradación por P


20. Perfil de cromatografía de gases de hidrocarburos antes de la biodegradación por Pseudomonas spp.

Determinación de la capacidad de degradación de Hidrocarburos aromáticos:

g . Crecimiento de cepas de Pseudomonas spp. en hidrocarburos aromáticos policíclicos y heterocíclicos como única fuente de carbono y e
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40

Fig . Crecimiento de cepas de Pseudomonas spp. en hidrocarburos aromáticos policíclicos y heterocíclicos como única fuente de carbono

VI.DISCUSION DE RESULTADOS

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41

V. CONCLUSION

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

42

BIBLIOGRAFÍA

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prentice hall.

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Trop. [online]. 54). SALASAR RODRIGUEZ, Daniel, G Susceptibilidad antimicrobiana y serotipaje de
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[online]. 54.

Karakashev, D., D. J. Batstone, y I. Angelidaki. 2005. Influence of Environmental Conditions on


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BIOREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS DERIVADOS DEL


PETRÓLEO: 82 – 90
www.unicolmayor.edu.co 84 NOVA - PUBLICACIÓN CIENTÍFICA ISSN:1794-2470 VOL.4 No. 5
ENERO - JUNIO DE 2006:1-116
43
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http://www.itescham.com/Syllabus/Doctos/r1985.PDF

http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/17-bacterias%20gram-
positivas%20aerobias.htm

ANEXOS

Anexo 1.

Fermentación de la lactosa (Mc Conkey)

El agar Mc Conkey es un medio sólido, diferencial y


selectivo. Se usa para la discriminación de bacterias
con capacidad de fermentar la lactosa (Lac + y
-).Composición g/l :

- Peptona 20.0 : fuente de nitrógeno y carbono para


las Lac -.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

- Lactosa 10.0 : fuente de carbono para las Lac +.

- Sales biliares 2.5 : le confiere carácter selectivo,


inhibiendo el crecimiento de Gram +.

- Cloruro sódico 5.0 : para mantener la tonicidad del


medio (evitar osmosis).

- Rojo neutro 0.05 : indicador que va hacer que el


medio vire de coloración. Si las bacterias son Lac +,
producirán ácidos derivados44de la fermentación que
darán al medio un aspecto rosáceo; si por el
contrario son Lac -, el medio se basificará por el uso
de la peptona y se tornará amarillo.

- Cristal violeta 0.001 : interfiere junto con las sales


biliares en la selectividad del medio.

- Agar-agar 15.0: da consistencia al medio.

Anexo 2. OXIDACIÓN-FERMENTACIÓN (PRUEBA DE HUGH Y LEIFSON)

Esta prueba realiza para la determinación del metabolismo oxidativo o


fermentativo de los carbohidratos.

MEDIO DE CULTIVO

Medio base de Hugh y Leifson

Triptona 10,0 g
Extracto de levadura 1,0 g
Púrpura de Bromocresol 0,04 g
Agar 2,0 g
Agua destilada 1000,0 mL

Ajuste el pH a 7,2. Esterilice a 121°C (15 libras de presión) por 15 minutos.


Dispense en tubos 9 mL por tubo.

 Agregue la solución de glucosa al 10% esterilizada


por filtración

En el caso de los cocos gram positivos su forma de metabolizar la glucosa es


una característica importante para su identificación, por eso en este caso el
glúcido añadido al medio base es la glucosa.

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

PROCEDIMIENTO

Para cada microorganismo a identificar,se inoculan por punción dos tubos de


medio. En uno de los dos tubos se cubre la superficie con parafina estérilpara
crear condiciones de anaerobiosis. Se incuba a 35°C hasta por 14 días.

RESULTADOS

La producción de ácido se evidencia por el cambio de color de púrpura a


amarillo. Los microorganismos fermentadores producen ácido en ambos tubos,
los microorganismos oxidadores (respiradores) sólo lo producen en el tubo sin
45
parafina.

Anexo 3.

Reducción de Nitratos

Va a poner de manifiesto la capacidad de transformar los


Nitratos en Nitritos. Para esto inoculamos tres tubos en el
medio para dicha prueba y los incubamos 24, 49 y 72 horas
respectivamente. Tras 24 h. añadimos 2 o 3 gotas del reactivo
"A-B", si aparece coloración rojo cereza indica que es positivo,
si no aparece coloración es un presunto negativo, para
confirmarlo basta con añadir una punta de espátula de Zinc y
si realmente es negativo se tornara rojo. Si el ultimo día (72 h.)
la bacteria da negativo, entonces podemos decir con seguridad
que no tiene capacidad para reducir los nitratos.

Anexo 1.

Fermentación de la lactosa (Mc Conkey)

El agar Mc Conkey es un medio sólido, diferencial y selectivo.


Se usa para la discriminación de bacterias con capacidad de
fermentar la lactosa (Lac + y -).Composición g/l :

- Peptona 20.0 : fuente de nitrógeno y carbono para las Lac -.

- Lactosa 10.0 : fuente de carbono para las Lac +.

- Sales biliares 2.5 : le confiere carácter selectivo, inhibiendo

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el crecimiento de Gram +.

- Cloruro sódico 5.0 : para mantener la tonicidad del medio


(evitar osmosis).

- Rojo neutro 0.05 : indicador que va hacer que el medio vire


de coloración. Si las bacterias son Lac +, producirán ácidos
derivados de la fermentación que darán al medio un aspecto
rosáceo; si por el contrario son Lac -, el medio se basificará
por el uso de la peptona y se tornará amarillo.
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- Cristal violeta 0.001 : interfiere junto con las sales biliares en
la selectividad del medio.

- Agar-agar 15.0: da consistencia al medio.

Anexo 2. OXIDACIÓN-FERMENTACIÓN (PRUEBA DE HUGH Y LEIFSON)

Esta prueba realiza para la determinación del metabolismo oxidativo o


fermentativo de los carbohidratos.

MEDIO DE CULTIVO

Medio base de Hugh y Leifson

Triptona 10,0 g
Extracto de levadura 1,0 g
Púrpura de Bromocresol 0,04 g
Agar 2,0 g
Agua destilada 1000,0 mL

Ajuste el pH a 7,2. Esterilice a 121°C (15 libras de presión) por 15 minutos.


Dispense en tubos 9 mL por tubo.

 Agregue la solución de glucosa al 10% esterilizada


por filtración

En el caso de los cocos gram positivos su forma de metabolizar la glucosa es


una característica importante para su identificación, por eso en este caso el
glúcido añadido al medio base es la glucosa.

PROCEDIMIENTO

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EXAMEN TAXONOMIA BACTERIANA PSEUDOMONAS

Para cada microorganismo a identificar,se inoculan por punción dos tubos de


medio. En uno de los dos tubos se cubre la superficie con parafina estérilpara
crear condiciones de anaerobiosis. Se incuba a 35°C hasta por 14 días.

RESULTADOS

La producción de ácido se evidencia por el cambio de color de púrpura a


amarillo. Los microorganismos fermentadores producen ácido en ambos tubos,
los microorganismos oxidadores (respiradores) sólo lo producen en el tubo sin
parafina.

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Anexo 3.

Reducción de Nitratos

Va a poner de manifiesto la capacidad de transformar los


Nitratos en Nitritos. Para esto inoculamos tres tubos en el
medio para dicha prueba y los incubamos 24, 49 y 72 horas
respectivamente. Tras 24 h. añadimos 2 o 3 gotas del reactivo
"A-B", si aparece coloración rojo cereza indica que es positivo,
si no aparece coloración es un presunto negativo, para
confirmarlo basta con añadir una punta de espátula de Zinc y
si realmente es negativo se tornara rojo. Si el ultimo día (72 h.)
la bacteria da negativo, entonces podemos decir con seguridad
que no tiene capacidad para reducir los nitratos.

 TABLAS

Reacción Oxidasa Hidrólisis Licuacion Crecimiento Motilidad


HL Arginina gelatina en McConkey
P.mallei Ox v + V - -
P.pseudomallei Ox + + + + +
Pseudomonas Ox
ssp o ninguna + v v + +
Tabla 1.Clave para pseudomonas que crecen en agar nutritivo.

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Pigmento Prueba Hidrólisis Licuación Crecimient


fluoresce HL arginina gelatina oa
nte 4°C/42°C
P.aeruginosa + Ox + + -/+
P.fluorescens + Ox + + +/-
P.putida + Ox + - v/-
P.alkaligenes - Alk - - -/+
P.pseudo- - Alk + - -/v
alkaligenes
P.maltophilia - Alk - + -/-
P.cepacia - Ox - + -/v
P.mallei - Ox48 + V -/-
P.pseudomalle - Ox + + -/+
i
P.stutzeri - Ox V - v/v
Tabla 2. Pseudomonas ssp[ CITATION Col89 \l 2058 ]

*Todos estos organismos son oxidasa positivos. (Ox, oxidativos; Alk, reacción alcalina: v, variable)

 CUADROS

Cuadro 1. Comparación de los procesos aerobios y anaerobios en la


degradación de compuestos aromáticos.

AEROBIO ANAEROBIO
Activación del anillo O2 CH3, H2O, COOH
aromático
Aceptador final de O2 NO-3, SO2-4 , Fe (III) y
electrones CO2-3
Producción de Mayor producción Menor producción
biomasa
Requerimientos Menor Mayor
nutricionales
Productores Catecol, protocatecuate Benzoil CoA,
intermedios Floroglucinol, resorcinol

Enzimas Mono, di-oxigenasas CoA ligasa, Benzoil CoA

Productos finales CO2, H2O CH4, CO2, H2S/N2

 IMAGENES

Imagen 1. Cicloalcano bicíclico de fusión

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Imagen 2. Cicloalcano bicíclico espiro

Imagen 3. Cicloalcanos tipo puente ("Bridged


cycloalkanes")

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Imagen 4. Ciclofanos

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