RECUENTO DE MICROORGANISMOS CARACTERÍSTICOS DEL YOGUR.

MÉTODO DE RECUENTO DE COLONIAS A 37 ºC

Procedimiento basado en la Norma ISO 7889:2003

A. Introducción

El yogur es el producto de leche coagulada obtenida por fermentación láctica de la leche o mezcla de esta con derivados lácteos, mediante la acción
de bacterias lácticas Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus. En Bolivia las especificaciones se detallan en la
Norma Bolivia NB/NA 0078 de Leches Fermentadas - Requisitos.

«Yogur» o «yoghourt»: es el producto de leche coagulada

obtenido por fermentación láctica mediante la acción de
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus
thermophilus a partir de leche o de leche concentrada,
desnatadas o no, o de nata, o de mezcla de dos o más de
dichos productos, con o sin la adición de otros ingredientes
lácteos, que previamente hayan sufrido un tratamiento
Yogur térmico u otro tipo de tratamiento, equivalente, al menos, a la
pasterización.

El conjunto de los microorganismos productores de la

fermentación láctica deben ser viables y estar presentes
en la parte láctea del producto terminado en cantidad
mínima de 1x107 unidades formadoras de colonias por
gramo o mililitro (UFC/g o mL).

«Yogur pasterizado después de la fermentación»: es el producto obtenido a partir del yogur que, como
consecuencia de la aplicación de un tratamiento térmico posterior a la fermentación equivalente a una
pasterización, ha perdido la viabilidad de las bacterias lácticas específicas y cumple todos los requisitos
establecidos para el yogur en esta norma, salvo las excepciones indicadas en ella.
Yogur pasteurizado después de la
En definitiva, tal y como se indica en esta Norma de Calidad el "Yogur pasteurizado después de la
fermentación
fermentación" es un producto que se elabora igual que el yogur por fermentación de la leche (con Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus), pero que se pasteuriza tras la fermentación, lo que
destruye ambos tipos de microorganismos. Por lo tanto, es un producto que no necesita refrigeración y puede
conservarse a temperatura ambiente. Sin embargo, no tendrá los posibles efectos beneficiosos derivados del
consumo de fermentos lácticos vivos.
Es importante analizar el yogur para comprobar que contiene un mínimo de 107 microorganismos característicos vivos por gramo. Si no los tiene, aparte
de no cumplir la legislación, será un producto que puede no tener la acidez adecuada lo que puede favorecer la multiplicación de microorganismos
alterantes, en particular hongos.
El método de análisis que vamos a ver en este ejercicio consiste en determinar el número de unidades formadoras de colonias por gramo de alimento (UFC/g) de
los microorganismos productores de la fermentación láctica: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus. Para comprobar que, en la
parte láctea del producto terminado, existe una cantidad mínima de 1x107 UFC/g.
Ambos métodos de recuento se realizan en placa (en los agares MRS y M17, respectivamente) y requieren confirmación/identificación de las colonias
sospechosas.

B. Medios de cultivo y reactivos

- Diluyente: Agua de triptona al 0,1%.

- Agar MRS acidificado (Man, Rogosa y Sharpe)

Preparación: Rehidratar el medio, hervir, enfriar, ajustar el pH con ácido acético a 5,4 ± 0,1. Autoclavar en frascos (121ºC/15 minutos)
- Agar M17
Preparación: Rehidratar el medio base, hervir, enfriar, ajustar el pH a 6,8 ± 0,1 (añadiendo NaOH y HCl). Autoclavar en frascos (121ºC/15 min.)

Añadir por cada 95 mL de medio base, 5 mL de solución estéril de lactosa al 10%. (algunas casas comerciales incorporan la lactosa en el medio
deshidratado, en cuyo caso no es necesario añadir esta solución)

C. Preparación de la muestra y diluciones decimales

Preparación de la muestra

Yogur sin frutas

Mezclar cuidadosamente el contenido del yogur con una cuchara o espátula estéril.

Pesar, en condiciones asépticas, 10 gramos de muestra en una bolsa de Stomacher,

previamente tarada. Añadir 90 ml de agua de triptona al 0,1% y homogeneizar la mezcla
en el Stomacher durante 2 minutos. Esta es la dilución primera o dilución inicial (10-1 ó
1/10).
 Yogur con frutas

En primer lugar, se vierte el contenido completo del envase de yogur en una bolsa de
stomacher y se homogeneiza en el mismo durante 1 minuto. Todo ello en condiciones
asépticas.

Posteriormente, para preparar la dilución inicial, se procede exactamente igual que con el
yogur sin frutas. Es decir, se pesan 10 gramos en condonéis asépticas, se añaden 90 mL de
diluyente estéril y homogeneiza la mezcla en un Stomacher durante 2 minutos.

Preparación de diluciones decimales seriadas

A partir de la primera dilución (10-1 ó 1/10), se preparan diluciones de 1 en 10 sucesivas.
Con una pipeta o punta estéril, tomar 1 mL de la dilución inicial y añadirlo a 9 mL de agua
de triptona al 0,1%. Tendremos la dilución 10-2.

Para obtener las diluciones siguientes hay que tomar 1 mL de la dilución anterior y
añadirlo a otro tubo con 9 mL de diluyente, así hasta obtener las diluciones necesarias.
Mezclar cada dilución en un agitador mecánico tipo Vortex.

El número de diluciones que se necesita hacer depende del número aproximado de

microorganismos que estimamos que puede haber en el alimento. En este caso, puesto que
se trata de un alimento fermentado que debería contener un alto número de
microorganismos (del orden de al menos 107 por gramo), haremos diluciones hasta la 10-8.

Recuento de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

D. Siembra e Incubación

Siembra placas de agar MRS.

En esta etapa, se utiliza el medio de cultivo agar MRS en el que las colonias de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus crecen con un
aspecto característico.
Partiendo de las diluciones decimales, sembrar, por duplicado, en agar MRS
mediante siembra en homogeneización en masa. Es decir, transferir, con una
pipeta estéril, 1 mL de cada dilución a placas de Petri vacías y estériles por
duplicado.

En este caso sembraremos placas a partir de las diluciones 10-5 ,10-6 ,10-7 y 10-8

Agregar a cada una de las placas unos 15- 20mL de Agar MRS fundido
mantenido a 47-50ºC. No deberá transcurrir un tiempo mayor de 15 minutos
entre la dilución de la muestra y la adición de agar a las placas.

Inmediatamente mezclar la muestra diluida y el agar mediante agitación

manual suave, imprimiendo movimientos circulares y de vaivén, durante un
lapso de tiempo igual o superior a un minuto, evitando mojar los bordes de la
placa;

Dejar solidificar manteniéndolo a temperatura ambiente sobre una superficie

plana y horizontal.

Incubación de las placas.

Invertir las placas de Petri e incubar en condiciones de anaerobiosis a 37 ºC durante 72 horas. Para ello, podemos utilizar una estufa de
anaerobiosis o si no disponemos de ella podemos utilizar el sistema "ANAEROGEN™" o algún sistema similar (jarra de anaerobiosis).
Sistema ANAEROGEN™

Fundamento:

Consiste en una bolsita de plástico impermeable a los gases y un saquito de

papel generador de gas. El saquito de papel contiene ácido ascórbico y carbón
activado que reaccionarán en contacto con el aire. El oxígeno se absorbe
rápidamente y se produce anhídrido carbónico. Cuando el saquito se coloca en
la bolsa de plástico y esta se cierra, la reacción creará unas condiciones
atmosféricas ideales para el crecimiento de anaerobios.

Procedimiento:

Introducir las placas invertidas en la bolsa de plástico.

Abrir el envoltorio de aluminio del saquito de papel y retirar el saquito de su

interior.

Inmediatamente introducirlo en la bolsa de plástico.

Expeler el exceso de aire de la bolsa y cerrarla con el cierre de autosellado.

 Llevar a incubar a 37ºC durante 72 horas.

Después de la incubación, examinar las placas para ver la presencia de colonias sospechosas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus.
Nota: en ocasiones, y según la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus que haya utilizado el fabricante del yogur, es posible
que en dichas condiciones de incubación no se desarrollen colonias sobre el agar MRS. En ese caso se recomienda incubar hasta 6 días y/o
utilizar atmósfera enriquecida en CO2 en lugar de atmósfera anaerobia.

E. Lectura de las placas y recuentos de colonias

Crecimiento característico de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus sobre agar MRS

El aspecto de las colonias sospechosas de Lactobacillus delbrueckii subsp.

bulgaricus sobre agar MRS es el siguiente: colonias de blanquecinas de 2-3
mm de diámetro, de bordes lisos o rugosos, lenticulares, redondas,
lanceoladas o en forma de estrella, convexas, suaves y opacas sin pigmento.

Nota: Es importante no confundir los posibles restos de alimento con las

colonias. Los restos de yogur son siempre mucho más pequeños que las
colonias y, habitualmente sin forma definida.

COLONIAS SOSPECHOSAS
Recuento de colonias sospechosas
Seleccionar las placas de dos diluciones sucesivas donde al menos, una placa
de las seleccionadas, contenga un mínimo de 15 colonias características o
 sospechosas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Dilución Dilución Dilución Dilución
10-5 10-6 10-7 10-8
Contar las colonias sospechosas de las placas seleccionadas. Obtenemos la Número de >300 295 25 3
suma de todas las colonias contadas en todas las placas seleccionadas para el Colonias >300 >300 28 5
recuento (ΣC).
Seleccionaremos dos diluciones consecutivas, en este
A continuación, debemos hacer confirmación/identificación de las colonias caso las diluciones 10-7 y 10-8
sospechosas contadas.

Para confirmar estas colonias es necesario hacer la tinción de Gram y la prueba

de la catalasa.

F. Confirmación de colonias sospechosas

Confirmación de las colonias

Para asegurarnos de que estas colonias son de L. delbrueckii subsp. bulgaricus es necesario hacer confirmación/identificación
comprobando que son:

- Bacilos gram positivos no formadores de esporas (haciendo la tinción de Gram), y

- Catalasa negativos (haciendo la prueba de la catalasa)

Estas pruebas se hacen sobre un número representativo de colonias (el 10% de las colonias de la placa que hemos elegido para contar, o un
mínimo de cinco).
Resembrar cinco colonias sobre placas de agar nutritivo e incubarlas
a 37ºC en anaerobiosis hasta que haya crecimiento. A partir de cada
una de estas placas hacer la tinción de Gram y la prueba de la
catalasa.

Tinción de Gram

L. delbrueckii subsp. bulgaricus es un bacilo gram positivo no

esporulado. Presenta forma de bastoncillo relativamente largo con
tendencia a formar cadenas.

Al observar una tinción de gram al microscopio presenta una imagen

similar a la foto que vemos a la derecha.

Prueba de la catalasa
El test de la catalasa se lleva a cabo de la siguiente forma: sobre cada una de las placas de agar nutritivo, una vez que haya habido
crecimiento, se añade una gota de agua oxigenada (peróxido de hidrógeno) al 3% y se observa el resultado de la reacción.
La reacción es catalasa positiva cuando se producen burbujas de La ausencia de burbujas tras añadir el agua oxigenada se considera
oxígeno de forma inmediata al añadir el agua oxigenada. como catalasa negativa.
 L. delbrueckii subsp. bulgaricus es catalasa negativa. Por lo tanto, para confirmar las colonias, estas deben ser catalasas negativas.
Nota importante: cuando la confirmación de las colonias mediante estas pruebas sea dudosa es necesario hacer una batería
completa de pruebas de metabolismo de hidratos de carbono, por ejemplo mediante la Galería API 50CH

G. Cálculo y expresión de resultados.

Cálculo de resultados
Del número de colonias características/sospechosas que se resiembran (A), las colonias que son bacilos gram positivos no esporulados y han dado
negativo en la prueba de la catalasa son las colonias que responden a los criterios de identificación (b) y, por tanto, se confirman como L.
delbrueckii subsp. bulgaricus.

A partir de los resultados de la confirmación/identificación, se calcula el número de colonias después de la identificación/confirmación (Σa), según
la siguiente expresión:
Donde:

Ejemplo:

El número de colonias características que se someten a confirmación (A); generalmente es 5

El número de colonias que responden a los criterios de identificación (b) es, por ejemplo:

Si para confirmar las colonias sospechosas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus debe realizarse la tinción de Gram y la prueba de la catalasa y el
resultado característico de este tipo de microorganismos es que son bacilos gram positivos no esporulados y catalasa negativos. El número de
colonias que responden a los criterios de identificación serán el número de colonias resembradas que dan como resultado ambos criterios de
identificación (bacilos Gram positivos no esporulados, catalasa negativos). Por ejemplo: 3 colonias bacilos Gram positivos no esporulados, catalasa
negativos de las 5 colonias resembradas.

Ejemplo:

Dilución Dilución Dilución Dilución

10-5 10-6 10-7 10-8
La suma de todas las colonias contadas en todas las placas seleccionadas para el
>300 295 25 3
recuento (ΣC). Número de Colonias
>300 >300 28 5
En este ejemplo, selecciono para el recuento las diluciones 10-7 y
10-8
El ΣC:
Siguiendo con el ejemplo,
Ejemplo:
Resiembro 5 colonias; A=5 Dilución Dilución Dilución Dilución
10-5 10-6 10-7 10-8
Solamente 3 son confirmadas; b=3 Número de >300 295 25 3
Colonias >300 >300 28 5
ΣC
Aplicando la expresión citada,

 
Calcular el número de Unidades Formadoras de Colonias por gramo o mililitro, según la siguiente expresión:

Esta fórmula es similar a la de la expresión de resultados que hemos visto en el ejercicio "Métodos generales de recuento en placa, cálculo y
expresión de los resultados" pero sustituyendo la suma de colonias contadas en todas las placas por la suma de colonias calculadas después de la
identificación.
Recordamos:

El volumen del inóculo aplicado a cada placa depende del método de siembra utilizado:

 Siembra mediante homogenización en masa, volumen inoculado a cada placa: 1mL

 Siembra mediante extensión en superficie, volumen inoculado a cada placa: 0,1mL

El número de placas seleccionado, siguiendo con el ejemplo, será n1 = 2 y n2 = 2, porque he seleccionado dos placas de cada dilución.

El nivel de dilución depende de las diluciones que hayamos seleccionado para contar y será:

d=1, cuando la dilución menor seleccionada para el recuento se trata de muestra sin diluir (sólo para productos líquidos)
d=10-1, cuando la dilución menor seleccionada para el recuento sea la primera dilución, dilución 1/10 ó 10-1
d=10-2, cuando la dilución menor seleccionada para el recuento sea la segunda dilución, dilución 1/100 ó 10-2
Y así sucesivamente.
Expresión de resultados
Expresar el número de unidades formadoras de colonia (UFC) por mililitro o por
gramo, expresado como un número comprendido entre 1,0 y 9,9 multiplicado por Por ejemplo, si el redondeo obtenido es: 120.000
la potencia de 10 adecuada, es decir un entero y un decimal multiplicado por la
potencia de 10. Expresión de resultados: 1,2 x 105

Recuento de Streptococcus thermophilus

H. Siembra e Incubación
Siembra placas de agar M17.
En este caso, se utiliza el medio de cultivo agar M17 en el que las colonias de Streptococcus thermophilus crecen con un aspecto característico.

Partiendo de las diluciones decimales preparadas anteriormente (ver Apartado C),

sembrar, por duplicado, en agar M17 mediante siembra por homogeneización en masa. El
procedimiento es el mismo que hemos visto para la siembra de agar MRS;transferir, con
una pipeta estéril, 1 mL de cada dilución a placas de Petri vacías y estériles, agregar a
cada una de las placas unos 15- 20mL de Agar MRS fundido mantenido a 47-50ºC y
mezclar mediante agitación manual suave. Dejar solidificar sobre una superficie plana y
horizontal.

También, en este caso, sembraremos a partir de las diluciones 10-5 ,10-6 ,10-7 y 10-8

Incubación de las placas.

Invertir las placas de Petri e incubar en condiciones de aerobiosis a 37ºC durante 48

horas.

Después de la incubación, examinar las placas para ver la presencia de colonias

sospechosas de Streptococcus thermophilus.
I. Lectura de las placas y recuentos de colonias

M17 crecimiento característico de las colonias

El aspecto de las colonias sospechosas de Streptococcus thermophilus sobre agar M17 es

el siguiente: colonias de de 1 a 2 mm de diámetro, de bordes lisos, redondas,
lenticulares o ligeramente lanceoladas.

También en este caso es importante no confundir los posibles restos de alimento con las
colonias. Los restos de yogur son siempre mucho más pequeños que las colonias y,
habitualmente, sin forma definida.

COLONIAS SOSPECHOSAS
Recuento de colonias sospechosas
Seleccionar las placas de dos diluciones sucesivas donde al menos, una placa de las
seleccionadas, contenga un mínimo de 15 colonias características o sospechosas de
Streptococcus thermophilus.

Contar las colonias sospechosas de las placas seleccionadas. Obtenemos la suma de todas
las colonias contadas en todas las placas seleccionadas para el recuento (ΣC).

A continuación, debemos hacer confirmación/identificación de las colonias sospechosas

contadas.

Para confirmar estas colonias es necesario hacer la tinción de Gram y la prueba de la

catalasa.

J. Confirmación de colonias sospechosas

Confirmación de las colonias

Para asegurarnos de que estas colonias son de Streptococcus thermophilus es necesario hacer confirmación/identificación comprobando
que son:
 - Cocos gram positivos que se agrupan en pares y en cadenas más o menos largas (haciendo la tinción de Gram), y
- Catalasa negativos (haciendo la prueba de la catalasa)

Para ello, resembrar un número representativo de colonias sospechosas (cinco como mínimo), sobre agar nutritivo e incubar el agar
nutritivo a 37ºC hasta que haya crecimiento. A partir de esta placa hacer la tinción de Gram y la prueba de la catalasa.
Tinción de Gram

Streptococcus thermophiluses es un coco gram positivo con tendencia a

agruparse en pares o cadenas.

Prueba de la catalasa

Streptococcus thermophiluses catalasa negativo. Por lo tanto, para

confirmar las colonias, estas deben ser catalasa negativas.

K. Cálculo y expresión de resultados.

Unidades Formadoras de Colonias de Streptococcus thermophilus por gramo de muestra

Si las colonias que hemos tomado para confirmar son cocos gram positivos y catalasa negativos ya podemos hacer el cálculo de los
resultados. Lo haremos como hemos visto en el Apartado G; con las fórmulas:
L. Supuesto práctico

Ud. trabaja en un laboratorio y le llega una muestra de yogur para que compruebe si el conjunto de los microorganismos fermentadores viables
(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus) están presentes en cantidad mínima de 1x107 unidades formadoras de
colonias por gramo (UFC/g). Para ello, realizará:

1. el recuento de colonias sospechosas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en agar MRS y el de colonias sospechosas de
Streptococcus thermophilus en agar M17.
2. la confirmación colonias sospechosas tanto de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus como de Streptococcus thermophilus mediante la
tinción de Gram y la prueba de la catalasa.
Resultados obtenidos en el recuento de colonias sospechosas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en agar MRS. Observe las
placas y después conteste a las preguntas.
Dilución Duplicado A Duplicado B

10-6
10-7

10-8
Preguntas

1. Para realizar el recuento de las colonias sospechosas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus seleccionamos las placas de la/las
dilución/nes:

a) 10-6 . b) 10-6 y 10-7 c) 10-7 y 10-8

2. El ΣC es:

a) 163 . b) 15 c) 74

Resultados obtenidos en el recuento de colonias sospechosas de Streptococcus thermophilus en agar M17. Observe las placas (haga clic
en las imágenes para verlas más grandes) y después conteste a las preguntas.
Dilución Duplicado A Duplicado B

10-5
10-6

10-7
10-8

Preguntas

3. Para realizar el recuento de las colonias sospechosas de Streptococcus thermophilus seleccionamos las placas de la/las
dilución/nes:

a) 10-5 y 10-6 b) 10-6 y 10-7 c) 10-6

4. El ΣC es:

a) 200 b) 236 c) 21

Resultados obtenidos en la confirmación colonias sospechosas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus:

 Resultados de la Tinción de Gram.

 Resultados de la prueba de la catalasa. Tras añadir peróxido de hidrógeno al 3%
 Colonia #1 Colonia #2 Colonia #3 Colonia #4 Colonia #5

Tinción de
Gram

Prueba
catalasa

Preguntas

5. Respecto a la confirmación de las 5 colonias resembradas:

a) se trata de bacterias gram negativas, catalasa negativas

b) se trata de bacterias gram positivas, no esporuladas, catalasa negativas
c) se trata de bacterias gram positivas, esporuladas, catalasa positivas

6. Según lo anterior, las colonias sospechosas:

a) han sido confirmadas

b) no han sido confirmadas
c) el resultado es dudoso por lo que es necesario realizar pruebas bioquímicas adicionales

7. El resultado final del recuento de L. delbrueckii subsp. bulgaricus es:

 a) 7,4 x 103 UFC de L. delbrueckii subsp. bulgaricus por gramo de muestra
b) 10 x 106 UFC de L. delbrueckii subsp. bulgaricus por gramo de muestra
c) 7,4 x 107 UFC de L. delbrueckii subsp. bulgaricus por gramo de muestra

Resultados obtenidos en la confirmación colonias sospechosas de Streptococcus thermophilus:

 Resultados de la Tinción de Gram.

 Resultados de la prueba de la catalasa. Tras añadir peróxido de hidrógeno al 3%

Colonia #1 Colonia #2 Colonia #3 Colonia #4 Colonia #5

Tinción de
Gram

Prueba
catalasa

Preguntas
 8. El número de colonias que responden a los criterios de identificación (b) son:

a) 4 b) 5 c) 1

9. El resultado final de este supuesto es:

a) 1,1 x 107 UFC de Streptococcus thermophilus por gramo de muestra

b) 4,7 x 107 UFC de Streptococcus thermophilus por gramo de muestra
c) 8,6 x 106 UFC de Streptococcus thermophilus por gramo de muestra

Pregunta sobre cumplimiento de requisitos de calidad

10. Teniendo en cuenta que (como hemos explicado al principio de este ejercicio) la norma de Calidad para el yogur, que dice
textualmente: "Los microorganismos productores de la fermentación láctica deben ser viables y estar presentes en el
producto terminado en cantidad mínima de 1 por 107 colonias por gramo o mililitro". Podemos afirmar que la muestra que
hemos analizado en este supuesto práctico:

a) no cumple lo especificado en la legislación vigente

b) cumple lo especificado en la legislación vigente
c) se necesitan pruebas complementarias para poder afirmar si la muestra cumple o no la legislación vigente