5 (Ejemplo de Propuesta de Investig) Generación de Dihaploides Dobles en El Cultivo Del Café (2da Versión)

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE HONDURAS
Faculta de Ingeniería
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
“Evaluación del efecto de cinco diferentes compuestos químicos con propiedades anti-microtubulares y
dos diferentes medios de crecimiento en la generación de dihaploides dobles del café en La Fe, Santa
Bárbara en el período 2018-2019”
(Segunda versión)
Presentado por: Ostilio R. Portillo, M.Sc., Ph.D.
Lugar y fecha: Ciudad Universitaria, 22 de enero del 2018.
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I. TABLA DE CONTENIDOS
I. TABLA DE CONTENIDOS ........................................................................................................... 2

II. CARACTERIZACIÓN GENERAL. ............................................................................................... 3
A. Descripción del proyecto. ................................................................................................................ 3
1. Descripción...................................................................................................................................... 3
2. Novedad del proyecto ...................................................................................................................... 3
3. Resultados esperados....................................................................................................................... 4
4. Divulgación y apropiación de resultados ........................................................................................ 4
5. Riesgos y obstáculos (formas de superarlos) ................................................................................... 4
B. Instituciones/organizaciones o dependencias ejecutoras ................................................................. 4
C. Información del proyecto. ............................................................................................................... 4
1. Tipo de beca .................................................................................................................................... 4
2. Nombre del proyecto ....................................................................................................................... 4
3. Ubicación del proyecto y áreas de influencia .................................................................................. 4
4. Departamento, municipio, localidad, zona/región específica .......................................................... 4
5. Eje y tema prioritario ....................................................................................................................... 4
6. Instituciones ejecutoras ................................................................................................................... 4
7. Duración del proyecto ..................................................................................................................... 4
8. Costo total del proyecto ................................................................................................................... 4
9. Aporte institucional ......................................................................................................................... 4
10. Aporte del cooperante(s) ................................................................................................................. 4
11. Aporte de los beneficios y otros aportes.......................................................................................... 5
III. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA................................................................................................... 7
IV. OBJETIVOS.................................................................................................................................... 9
4.1 Objetivo general. ............................................................................................................................. 9
4.2 Objetivos específicos....................................................................................................................... 9
V. JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN. ............................................................................ 10
VI. MARCO TEÓRICO. ..................................................................................................................... 11
6.1 La reproducción sexual de las plantas superiores vs la toti-potencia celular................................. 11
6.2 El mejoramiento de Coffea arabica. ............................................................................................. 13
6.3 Recuperación de genotipos dihaploides ........................................................................................ 13
6.4 Producción de nuevas variedades a través de la generación de dihaploides duplicados ............... 15
VII. METODOLOGÍA. ........................................................................................................................ 16
7.1 Enfoque (Estudios cualitativos vs Estudios cuantitativos). ........................................................... 16
7.2 Naturaleza experimental. ............................................................................................................... 16
7.3 Procedimientos experimentales. .................................................................................................... 17
7.3.1 Determinación de la etapa de desarrollo de las micrósporas. ........................................................ 17
7.3.2 Extracción y purificación de micrósporas. .................................................................................... 17
7.3.3 Inducción de endomitosis y embriogénesis directa. ...................................................................... 18
7.3.4 Corroboración del nivel de ploidía. ............................................................................................... 18
7.4 Población de estudio y procedimiento de muestreo. ..................................................................... 19
7.3 Diseño experimental. ..................................................................................................................... 20
7.9 Matriz de operacionalización. ....................................................................................................... 21
VIII. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES. ....................................................................................... 24
IX. PRESUPUESTO. .......................................................................................................................... 25
CUADRO RESUMEN .................................................................................................................. 25
CUADRO ANALÍTICO ............................................................................................................... 25
X. REFERENCIAS. ........................................................................................................................... 26
ANEXO 1. Convenio marco de cooperación entre la UNAH y el IHCAFE. ................................................... 28
ANEXO 2. Composición química inorgánica del medio Murashige & Skoog (MS) a 100x. .......................... 32
ANEXO 3. Composición química orgánica del medio MS a 1x. ..................................................................... 32
2
II. CARACTERIZACIÓN GENERAL.
A. Descripción del proyecto.
1. Descripción. Este es un estudio citogenético con un diseño estadístico factorial 9 x 4 x 3 x 2, con

una duración de 1.5 años (mayo del 2018 hasta octubre del 2019). El proyecto tiene como finalidad evaluar
la capacidad de varios compuestos anti-microtubulares diferentes a la colchicina que pudieran contribuir a
romper las barreras moleculares que inhiben la producción de dihaploides dobles en el café (Coffea
arabica).
Para tal propósito se evaluará estadísticamente la interacción del efecto dos diferentes medios de
crecimiento in vitro con el efecto de cinco diferentes compuestos químicos de origen sintético con
propiedades anti–microtubulares que han sido usados para inducir la endomitosis en varias especies de
interés comercial (especialmente en cereales) de los cuales solo la colchicina ha sido evaluada en el café
razón por lo cual será usada como testigo.
La eficiencia de los 224 tratamientos bajo estudio se medirá a través del número de dihaploides
duplicados recuperados al final del estudio; datos que serán evaluados a través de un análisis de varianza
(ANAVA) con un α = 5%. El Instituto Hondureño del Café (IHCAFÉ) se ha asegurado que los materiales
de café actualmente cultivados en el país sean tipo arabica o genotipos derivados de los mismos (e.g.,
catimores) en consecuencia los resultados obtenidos serán fácilmente extrapolables a cualquier variedad
tornando la recolección de muestras de material genético provenientes de diferentes zonas del país en una
actividad irrelevante.
Finalmente, aunque los resultados esperados sean de interés y beneficio inmediato a fitomejoradores
del café a la larga esto beneficiaria a los caficultores del país pues ayudaría a reducir el tiempo requerido
en la generación de nuevas líneas experimentales con potencial comercial.
2. Novedad del proyecto. La producción de haploides dobles no es una actividad nueva, de hecho, es
una tecnología usada desde hace muchos años por las compañías fitomejoradoras que actualmente venden
sus semillas en el mercado Latinoamericano. En contraste, aunque al realizar una búsqueda en las diferentes
revistas científicas o meta–buscadores el investigador encuentra una gran cantidad de literatura acerca de
experiencias documentadas en torno a la producción de haploides dobles; también encuentra una marcada
escasez de experiencias documentadas provenientes de los países productores de café de la región
Centroamericana y el Caribe.
Por otro lado, las experiencias documentadas respecto al cultivo del café per se son muy escazas debido
a que es una especie recalcitrante es decir una especie en la que la producción de dihaploides dobles a partir
de la gameto-embriogénesis es ineficiente lo cual a su vez dificulta la adopción de dicha tecnología en los
programas de mejoramiento públicos y privados por lo que se requiere de mayor investigación.
La investigación básica desarrollada hasta el momento explora el fenómeno de la generación artificial
de dihaploides dobles del café con un enfoque citogenético y basa sus conclusiones en el simple conteo del
número de genotipos recuperados sin el uso de estadística avanzada que permita identificar diferencias
significativas entre los tratamientos y demás fuentes de variación que afectan los resultados.
Por otro lado, invariablemente cuando se trata del cultivo del café la duplicación del material genético
siempre se realiza a través del alcaloide colchicina sin existir, hasta el momento, experiencias documentadas
del uso de otras moléculas con propiedades anti-microtubulares o el efecto sinérgico de las mismas cuando
estas son aplicadas juntamente con la colchicina.
La novedad de este estudio en parte es incremental ya que el tema de estudio ya ha sido explorado
anteriormente por otros investigadores; Sin embargo, a diferencia de los anteriores, este estudio se
conducirá en Honduras (por primera vez) y evaluará las diferencias encontradas entre los tratamientos (si
hubiese alguna) a través de un modelo factorial 9 x 4 x 3 x 2 que controlará las siguientes fuentes de
variación: el agente diploidizante, la concentración de los agentes diploidizantes, la interacción entre los
agentes diploidizantes, el tiempo de inducción & los medios de crecimiento.
3
Además, la novedad de este estudio también es radical ya que a diferencia de estudios anteriores
evaluaremos 4 agentes diploidizantes adicionales (e.g., pronamide, trifluralin, oryzalin & amiprofos–metil)
los cuales nunca han sido evaluados en el cultivo del café. Finalmente, también se medirá el efecto sinérgico
de cada uno de ellos cuando se usan juntamente con la colchicina a diferentes concentraciones y tiempos
de inducción.
3. Resultados esperados. Aumentar la taza de recuperación de dihaploides dobles del café por encima
del 5% reportado en previas publicaciones.
4. Divulgación y apropiación de resultados. Ya que el financiamiento será proporcionado a través de

fondos públicos la base de datos obtenida estará disponible a otros investigadores a fin de corroborar
los resultados de ser así necesario. La divulgación de los resultados será en el idioma ingles en una
revista científica indexada a nivel internacional.
5. Riesgos y obstáculos (formas de superarlos). Debido a la carencia, en Ciudad Universitaria, de un

laboratorio de cultivos de tejidos debidamente equipado la investigación se desarrollará en el
laboratorio de cultivo de tejidos del IHCAFÉ ubicado en el centro de investigación y capacitación
Jesús Aguilar Paz localizado en la Fe, Santa Bárbara. Para tal efecto, el IHCAFÉ proporcionará las
instalaciones, equipos (instrumentos y cristalería) además del alojamiento para el investigador.
Esta acción está amparada en el convenio marco de cooperación entre la Universidad Nacional
Autónoma de Honduras (UNAH) y el Instituto Hondureño del Café (IHCAFÉ) y el cual aún está
vigente (ver Anexo 1).
B. Instituciones/organizaciones o dependencias ejecutoras. UNAH y el IHCAFÉ.
C. Información del proyecto.
1. Tipo de beca. Beca básica de investigación.

2. Nombre del proyecto. Evaluación de cinco diferentes compuestos químicos con propiedades anti-
microtubulares en la generación de dihaploides dobles del café en La Fe, Santa Bárbara en el período
2018-2019.
3. Ubicación del proyecto y áreas de influencia. Centro de investigación y capacitación Jesús Aguilar
Paz.
4. Departamento, municipio, localidad, zona/región específica. La Fe, Santa Bárbara.
5. Eje y tema prioritario. Eje de investigación No. 4: Ambiente, biodiversidad y desarrollo.
Tema prioritario No. 12: Seguridad alimentaria y nutricional (Biotecnología y desarrollo de nuevas
tecnologías de producción).
6. Instituciones ejecutoras. UNAH (Facultad de Ingeniería) y el IHCAFÉ.
7. Duración del proyecto. 1.5 años (mayo del 2018 hasta octubre del 2019).
8. Costo total del proyecto. L 75,000.00
9. Aporte institucional. La Dirección de Investigación Científica y Post-grado (DICYP) proporcionará
el financiamiento necesario para el desarrollo de la investigación el cual será usado en la compra de
materiales/insumos (ver Presupuesto) requeridos para conducir la experiencia.
10. Aporte del cooperante(s). El IHCAFÉ proporcionará el laboratorio de cultivo de tejidos (espacio,
equipos y cristalería), servicio de Internet, personal de campo para la recolección de muestras
biológicas, personal de laboratorio para agilizar el procesamiento de muestras recolectadas y
alojamiento del investigador primario.
Además, el IHCAFE también hará el siguiente aporte de materiales:
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No. Concepto Presentación Costo unitario Costo total (L)
Equipos: (L)
– –
1. Cámara de flujo laminar. 3 – –
2. Cámara de crecimiento. 1 – –
3. Autoclave. 1 – –
4. Balanza analítica. 1 – –
5. Centrifugadora. 1 – –
6. Microscopios de luz. 2 – –
7. Frasco Erlenmeyer de 10 ml. 128 – –
8. Frasco Erlenmeyer de 2000 ml. 1 – –
9. Tubos de ensayo. 10 – –
10. Fórceps. 3 – –
11. Escalpelos. 3 – –
12. Agitador de muestras. 2 – –
Materiales:
1. Phytagel (agente solidificante). 500 g – 0,00
2. Etanol 95%. Galón 183.44 183,44
3. Papel toalla. – – 0,00
4. Detergente líquido. – – 0,00
5. Papel aluminio. – – 0,00
6. Hipoclorito de calcio [Ca(ClO)2]. 500 g 1,311.92 1.311,92
7. Hipoclorito de sodio (NaClO). 2.5 l 2,624.00 2.624,00
8. NaOH. 1 kg 900.00 900,00
9. NH4NO3. 500 g 2,272.00 2.272,00
10. KNO3. 500 g 1,760.00 1.760,00
11. MgSO4 7H2O 500 g 2,464.00 2.464,00
12. MnSO4 4H2O 1 kg 3,680.00 3.680,00
13. ZnSO4 7H2O 1 kg 2,176.00 2.176,00
14. CuSO4 5H2O 500 g 2,720.00 2.720,00
15. CaCl2 2H2O 1 kg 1,472.00 1.472,00
16. KI (Granular). 1 kg 6,156.56 6.156,56
17. CoCl2 6H2O 100 g 5,600.00 5.600,00
18. KH2PO4 1 kg 2,048.00 2.048,00
19. H3BO3 1 kg 2,720.00 2.720,00
20. Na2MoO4 2H2O 1 kg 12,512.00 12.512,00
21. FeSO4 7H2O 1 kg 2,240.00 2.240,00
22. Na2–EDTA. 500 g 5,440.00 5.440,00
23. Glicina. 1 kg – 0,00
24. Mioinositol. 250 g 3,680.00 3.680,00
25. Ácido nicotínico. 100 g 1,632.00 1.632,00
26. Piridoxina–HCl. 10 g 9,184.00 9.184,00
27. Tiamina–HCl. 25 g 3,200.00 3.200,00
Total: 75.975,92
11. Aporte de los beneficios y otros aportes. El viernes 22 de diciembre del 2000 el Congreso Nacional
de la Republica mediante el decreto No. 213 reformo la ley orgánica del IHCAFE el cual en su
artículo No. 3 establece lo siguiente (ver anexo 2):
“El Instituto Hondureño del Café (IHCAFÉ), tendrá los fines y objetivos siguientes:
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1) Ejecutar las políticas y medidas de políticas aprobadas por el Consejo Nacional del Café, que sean de
su competencia; y proporcionar servicios de generación y transferencia de tecnología a los productores,
beneficiadores, torrefactores, industriales y exportadores de café y aplicar las normas y resoluciones
tendentes a mejorar técnicas de producción agrícolas;……”
En base a lo anterior, la ley le confiere a esta entidad jurídica y privada la potestad de generar y trasferir
tecnología lo cual implica que está facultada para realizar investigación científica relacionada al cultivo del
café. Por esta razón, aunque los derechos de autor de la publicación generada a través de esta investigación
sean adjudicados a la UNAH el beneficiario inmediato de los resultados obtenidos será el programa de
investigación del IHCAFÉ, pero a la larga también los caficultores del país serán beneficiados a través de
la generación de nuevas y mejoradas variedades de café.
6
III. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA.
Existen dos especies de importancia económica usadas en la producción de café: Coffea arabica L. (café
arábica) & Coffea canephora Pierre ex A. Forehner var. Robusta, siendo el 65 y 35% de la producción
mundial atribuida a C. arabica L. & C. canephora P. respectivamente [1-5]. Sin embargo, a diferencia de
Vietnam y Brasil los cuales son grandes exportadores de café tipo robusta, en Honduras el 100% de las
variedades cultivadas son derivadas de C. arabica (cultivares tipo Bourbon y Típica) además de algunos
genotipos (e.g., catimores) producto de su cruzamiento con otras especies.
Por otro lado, la diversidad genética de C. arabica ha sido evaluada a través de características agro–
morfológicas y el uso de marcadores genéticos lo que ha permitido la identificación de tres fuentes genéticas
de las cuales se derivan las actuales variedades cultivadas en la mayor parte de Latinoamérica: a) las
variedades tipo Bourbon las cuales fueron descubiertas en la isla Reunión (al este de Madagascar) e
introducidos en Sudamérica de donde posteriormente fueron llevados a África con el nombre de variedad
Bourbon [6], b) las variedades tipo Típica las cuales se originaron a partir de una sola planta que fue sustraída
del Yemen, en la península arábica por parte de los holandeses y fue cultivada en el jardín botánico de
Ámsterdam [7]. En 1700, la variedad fue transferida de la isla de Java hasta las Antillas de donde sirvió de
base para establecer las plantaciones en Latinoamérica y el caribe [6,8] & c) las variedades producto del
cruzamiento de las anteriores [9].
Paradójicamente, el gran número de variedades de café existentes producto del esfuerzo de múltiples
programas de mejoramiento en todo el mundo dan la impresión de una amplia diversidad genética la cual,
a nivel molecular, no está justificada debido a un bajo nivel de polimorfismo entre dichas variedades [1,6,10,11]
como consecuencia de la población reducida de la cual fueron seleccionadas originalmente [12].
De acuerdo con Lashermes et al [12], históricamente las poblaciones originales de C. arabica se
desarrollaron a partir de unas pocas plantas que sobrevivieron los esfuerzos por diseminarlas desde el
Yemen (sur de Arabia) hacia Latinoamérica, el este de África y Asia. Ya que solo pocas plantas
constituyeron el fundamento sobre el cual se desarrolló la población base, la diversidad genética de la
población original de la cual dichas plantas fueron sustraídas se redujo sustancialmente puesto que no todos
los genes y genotipos estaban presentes en la muestra sustraída.
Esto sumado a la presión de selección durante el proceso de desarrollo de líneas mejoradas y el
mecanismo preferencial de auto–polinización de C. arabica el cual promueve la sistemática reducción de
la heterocigosidad en todos los locuses explicaría la documentada uniformidad genética existente entre las
variedades cultivadas de café [13] razón por la cual la variación observada respecto a características
agronómicas1 es atribuida al surgimiento y lenta acumulación de mutaciones (moleculares o puntuales)
[6,7,10]
a lo largo de un ciclo de vida relativamente largo (~20–30 años) [14].
Por otro lado, aunque la uniformidad de características fenotípicas, condicionada por la carencia de
polimorfismo, es considerada como una ventaja pues facilita el manejo agronómico de la plantación en
realidad es todo lo contrario ya que al surgir factores adversos (bióticos o abióticos) estos afectan, en igual
medida, a todos los miembros de una población tal es el caso de la Roya del café (Hemileia vastatrix).
Por esta razón, es importante la constante generación de nuevas y mejoradas variedades de café
resistentes a los problemas fitosanitarios que más afectan a la caficultura nacional. Por desgracia, C. arabica
es una especie perenne y su mejoramiento genético está en desventaja respecto a cultivos anuales ya que la
generación de nuevas líneas a partir de la F2 es un proceso de selección, en base a pedigrí o a la descendencia
derivada a partir de una sola semilla, y requiere ~25 a 28 años (Ilustración 2) para completarse lo cual
encarece los costos de investigación y desarrollo (I+D).
No obstante, existen otros factores que también desaceleran el desarrollo de nuevas líneas
experimentales entre los cuales podemos mencionar: un ciclo de generación largo2, una baja variabilidad
1 Características agronómicas del café: habito de crecimiento [determinado o indeterminado], conformación de planta [abierta o
compacta], madurez fisiológica, precocidad [días a antesis], días a la cosecha, resistencia a plagas y enfermedades, número de
flores por nudo floral, tamaño de grano, peso de 100 de granos, calidad de taza, etc.
2 Un ciclo de generación es el tiempo requerido desde el trasplante hasta la primera cosecha y este, en el café, oscila entre 4 a 5
años.
7
genética, la ausencia de líneas homocigóticas entre las especies diploides, la variación ploidica existente
entre las especies del género Coffea, el poco conocimiento sobre la genética del café, la baja disponibilidad
de marcadores moleculares y la poca investigación en café desarrollada en la mayoría de los países
productores [6] de los cuales Honduras no es la excepción.
Afortunadamente, existen alternativas de solución al problema de la generación de nuevas variedades
de café las cuales involucran la implementación de técnicas citogenéticas tales como la generación de
haploides dobles o dihaploides dobles a través de la cual se puede reducir significativamente el tiempo
requerido para el desarrollo de nuevas líneas experimentales.
Curiosamente, aunque esta técnica es ampliamente usada por las compañías fitomejoradoras para
acortar el tiempo requerido en el desarrollo de nuevas y mejoradas variedades de cultivos anuales (e.g.,
cebolla, tomate, chile, etc.), la literatura científica contemporánea reporta escasas experiencias del uso de
las mismas en los programas de mejoramiento genético del café en todo el mundo; Además, las pocas
experiencias documentadas se basan en el uso de la colchicina un compuesto con capacidad anti-
microtubular, pero con un potencial altamente genotóxico.
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IV. OBJETIVOS.
4.1 Objetivo general.
1. Evaluar el efecto de cinco diferentes agentes anti-microtubulares y dos diferentes medios de

crecimiento en la generación in vitro de dihaploides dobles del café en el laboratorio de cultivos de
tejidos del IHCAFÉ localizado en el centro de investigación y capacitación Jesús Aguilar Paz en la Fe,
Santa Bárbara en el período comprendido entre el 2018-2019.
4.2 Objetivos específicos.
1. Describir la efectividad de cinco diferentes agentes anti–microtubulares [e.g., colchicina(control),

pronamide, trifluralin, oryzalin & amiprofos–metil] en la generación in vitro de dihaploides dobles del
café a través de la duplicación cromosómica de sus micrósporas.
2. Determinar las diferencias significativas entre cuatro diferentes agentes anti–microtubulares [e.g.,
pronamide, trifluralin, oryzalin & amiprofos–metil] y la colchicina en base al número de genotipos
dihaploides dobles recuperados.
3. Describir la eficiencia de dos diferentes medios de crecimiento (e.g., MS 0.5X modificado I & MS
0.5X modificado II) en la generación in vitro de dihaploides dobles del café.
4. Determinar las diferencias significativas entre dos diferentes medios de crecimiento (e.g., MS 0.5X
modificado I & MS 0.5X modificado II) en base al número de genotipos dihaploides dobles
recuperados.
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V. JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN.
En la actualidad, existe una serie de problemas que afectan la caficultura nacional entre los cuales figuran:
la fluctuación de los precios en el mercado internacional, la roya del café (Hemileia vastatrix Berk. & Br.),
la broca del café (Hypothenemus hampei), el mal estado de las carreteras, la falta de mano de obra para la
cosecha y una limitada asistencia técnica y crediticia.
No obstante, el mayor problema de todos es el desarrollo de nuevas variedades con resistencia a los
problemas fitopatológicos más comunes pues es un proceso caro y lento por las razones antes discutidas.
En consecuencia, se han explorado otros métodos para la generación de nuevos genotipos mejorados del
café basados en la totipotencia celular es decir la capacidad de la célula vegetal de regenerar somáticamente
toda la planta.
En el caso particular del café, esta técnica citogenética se basa en la duplicación cromosómica de
células reproductivas masculinas (microsporas) seguido por la inducción in vitro de la división celular
somática bajo condiciones asépticas recuperando así una planta completamente homocigótica en un tiempo
relativamente corto.
No obstante, a pesar de los comentarios positivos expresados por aquellos que han explorado este
fenómeno anteriormente; En realidad, los resultados documentados revelan una baja tasa de recuperación
de genotipos dihaploides (esporofitas) y dihaploides dobles razón por la cual el café ha sido clasificado
como una especie recalcitrante es decir una especie en la cual la embriogénesis gamética es difícil de
inducir.
Por ejemplo, Herrera et al. (15) luego de aislar y purificar micrósporas del café estas fueron incubadas
por 48 h logrando así inducir la androgénesis y duplicación de los sets cromosómicos como resultado de su
exposición a la colchicina. Desafortunadamente, solo un 5% de las plantas regeneradas eran
autotetraplodies mientras que el 95% restante correspondían a genotipos dihaploides los cuales son estériles
y en consecuencia sin valor comercial alguno.
Asimismo, Neuenschwander et al. (16) reporto un incremento significativo en el número de respuestas
androgénicas cuando las micrósporas del café fueron incubadas en un solución acuosa inductora con un
15% de agua de coco. Desgraciadamente, pese al aumento en el número de respuestas androgénicas los
resultados reportados no indican si las plantas recuperadas correspondían a genotipos dihaploides o
dihaploides dobles. No obstante, ya que no se adiciono ningún agente anti-microtubular se puede especular
que la mayoría de los genotipos corresponderían a plantas dihaploides dada la naturaleza recalcitrante de la
especie y la baja frecuencia de endoreduplicaciones espontaneas.
Por otro lado, en las escasas experiencias documentadas la androgénesis y la duplicación del material
genético se obtuvo a través de la colchicina un alcaloide con capacidad anti-microtubular, pero con un
potencial altamente genotóxico por lo que el uso de equipos de protección y técnicos especializados es
obligatorio.
El efecto sinérgico de una baja tasa de recuperación de dihaploides dobles característico de las especies
maderables sumado al alto costo y propiedades genotóxicas de la colchicina contribuye a ralentizar la
adopción de esta tecnología en los programas de mejoramiento genético del café.
Todo ello justifica el continuar la investigación en el campo de la androgénesis del café tomando en
consideración los cambios realizados por otros investigadores a los actuales protocolos de inducción (e.g.,
medios modificados de inducción y crecimiento) y sometiendo a prueba otros factores que contribuyan a
aumentar la tasa de recuperación de dihaploides dobles, así como también reducir los costos de
investigación y desarrollo (I + D) tales como la evaluación de otros agentes anti-microtubulares más baratos
y menos genotóxicos (e.g., oryzalin, pronamide, trifluralin & amiprophos–methyl).
Finalmente, aunque los beneficiarios inmediatos de esta investigación serán los fitomejoradores y
citogenetistas de los programas de mejoramiento del café (domésticos y extranjeros) a la larga también los
pequeños, medianos y grandes caficultores serán beneficiados a través de la rápida generación de nuevas y
mejoradas variedades de café.
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VI. MARCO TEÓRICO.
6.1 La reproducción sexual de las plantas superiores vs la toti-potencia celular. En las angiospermas,
la formación del saco embrionario inicia con cuatro células haploides ordenadas de manera lineal y
denominadas megaesporas de las cuales, en la mayoría de los casos, tres se degeneran y la que permanece
aumenta significativamente de tamaño convirtiéndose en el saco embrionario técnicamente conocido como
el megagametofito.
El megagametofito inicialmente contiene un núcleo haploide, pero este sufre tres divisiones mitóticas
(endomitosis) en ausencia de citocinesis resultando en un saco embrionario con ocho núcleos haploides
flotando en el citosol. Posteriormente, tres de estos núcleos haploides terminan, cada uno, en el interior de
tres células separadas las unas de las otras por sus respectivas paredes celulares y localizadas en el polo
microfilar es decir en dirección del microfilo el cual es una pequeña abertura (poro) a través de los
integumentos.
Por lo general, de estas tres la célula central se convierte en la célula huevo u oósfera mientras que las
dos que la rodean se les denomina células sinérgidas (Ilustración 1) las cuales no parecen tener función
alguna. Por otro lado, otros tres núcleos haploides terminan en el interior de tres células localizadas en el
polo opuesto conocidas como células antípodas las cuales posterior a la fertilización se degeneran.
En contraste, los dos núcleos haploides restantes también conocidos como cuerpos polares permanecen
en el citosol del saco embrionario adyacentes el uno al otro o terminan fusionándose formando así un núcleo
diploide. Esta es la condición en que se encuentra el megagametofito antes de la doble fertilización.
Ilustración 1. Representación esquemática de la doble fertilización en las angiospermas. A. Polinización, B & C.

Crecimiento del tubo polinífero & D. Doble fertilización.
El proceso de fertilización inicia con la polinización la cual por definición es transferencia mecánica (e.g.,
entomófila, anemófila, etc.) de la micróspora al estigma de la flor. Con la germinación de la micróspora el
tubo polinífero emerge y se prolonga atravesando el estilo hasta cruzar a través del microfilo.
Una vez que el tubo polinífero atraviesa el microfilo ambos cuerpos polares presentes en el grano de
polen son transportados a través del tubo polinífero y uno de ellos (el núcleo espermático) se fusiona con
el núcleo de la oósfera lo que resulta en la formación de una célula diploide (el zigoto) la cual después de
una serie de divisiones mitóticas se transformara en el embrión (Ilustración 1); llegando este a medir entre
3 a 4 mm de longitud [17,18].
11
Mientras tanto, el otro cuerpo polar (el núcleo vegetativo) se fusiona con el núcleo de la célula diploide
produciendo así un núcleo triploide es decir un núcleo con un genoma heredado del padre y dos heredados
de la madre. Eventualmente, esta célula se dividirá mitóticamente muchas veces formando miles de células
que conformaran el endospermo del grano el cual es de color gris verdoso, está constituido por células vivas
de reserva y presenta una ranura longitudinal en el plano ventral [19] además de ocupar la mayor parte del
volumen de la semilla (~99 %) [18].
Por otro lado, en el café el saco embrionario es de carácter bispórico por esa razón el ovario contiene
dos óvulos los cuales después de la doble fertilización se desarrollan en semillas individuales dentro de sus
respectivos lóculos.
En contraste, la reproducción asexual constituye un mecanismo alternativo y eficiente a través del cual
algunas especies vegetales son capaces de multiplicarse, de manera espontánea o inducida, a través de
algunas de sus partes gracias a la capacidad regenerativa de célula. Aunque la discusión detallada de los
diferentes mecanismos de reproducción asexual en el reino vegetal va más allá del enfoque de este ensayo
podemos citar los siguientes: la reproducción vía rizomas (bananos y plátanos), estolones (frezas),
tubérculos (papas), injertaciones (árboles frutales) y la apomixis (la producción de semilla viable sin que
se produzca la fertilización) entre otras.
No obstante, en las especies superiores (angiospermas) con un mecanismo de reproducción sexual bien
definido la diferenciación de los tejidos provoca una drástica restricción de la totipotencia celular es decir
la capacidad de la célula de regenerar completamente la planta. Por esta razón, en ciertas especies anuales
y perennes los tejidos y órganos especializados (e.g., hojas, flores, micrósporas, etc.) son incapaces de
regenerar la planta de una manera espontánea, aunque las condiciones ambientales (e.g., humedad,
temperatura y suelo) sean favorables.
Empero, pese a su grado de diferenciación la totipotencia de las células somáticas y reproductivas
permanece presente, pero en dormancia y puede ser inducida cuando estas son cultivadas bajo ciertas
condiciones que favorecen su expresión logrando en el proceso regenerar completamente la planta, además
de recuperar clones del material parental (en el caso de las células somáticas) y genotipos haploides y
dihaploides en el caso de células reproductivas (micrósporas) de especies diploides y poliploides
(tetraploides) respectivamente.
La presente propuesta de investigación explora en la inducción de la totipotencia celular de células
reproductivas en las angiospermas (e.g., café) como mecanismo alterno para su reproducción al ser estas
cultivadas bajo condiciones asépticas a fin de regenerar la planta entera y en el proceso recuperar genotipos
dihaploides y dihaploides dobles siendo estos últimos homogéneos y homocigóticos.
12
6.2 El mejoramiento de Coffea arabica. En la actualidad, los métodos empleados en el mejoramiento
del café incluyen la técnica del retro–cruce, el método Pedigrí y la descendencia derivada de una sola
semilla. El retro–cruce consiste en el cruzamiento de un progenitor donante y un progenitor recurrente
produciendo así la semilla híbrida de la filial 1 mejor conocida como la F1.
El progenitor donante es la fuente de una o más características fenotípicas/fisiológicas de importancia
económica la cual deseamos transferir al progenitor recurrente. Tres o cuatro años después de la primera
cruza, la F1 se retro–cruza con el progenitor recurrente produciendo así la semilla RC1–F1. Los retro–cruces
se repiten por tres generaciones para recuperar el genotipo y fenotipo del progenitor recurrente. El proceso
es prolongado pues requiere entre 15–20 años para completarse (Ilustración 2, A) y el producto final es una
serie de líneas isogénicas que difieren del progenitor recurrente en una o más características.
En contraste, el método de descendencia derivada de una sola semilla consiste en dos progenitores que
se cruzan para producir la semilla F1 híbrida. Tres o cuatro años después, la F1 se autopoliniza a fin de
producir la semilla F2. Es en la F2 donde observamos el mayor nivel de segregación genética y fenotípica
razón por la cual la descendencia de cada semilla de la F2 representa en sí una nueva línea experimental que
en la sexta generación de autopolinización deberá ser evaluada a través de pruebas de rendimiento y
adaptación (Pruebas estadísticas de estabilidad tipo Genotipo x Ambiente).
Las líneas experimentales que satisfagan las evaluaciones de adaptación, características agronómicas
y organolépticas son usadas como líneas parentales para la producción de nuevos híbridos o pueden ser
liberadas en el mercado nacional como opciones para el caficultor. No obstante, al igual que la técnica del
retro–cruce y el método Pedigrí, una de las desventajas del método de descendencia derivada de una sola
semilla es que es bastante prolongado ya que requiere entre 18–24 años para completarse (Ilustración 2, B).
6.3 Recuperación de genotipos dihaploides. La embriogénesis gamética es el método a través del cual
se logra la recuperación de euhaploides tales como los dihaploides del café a través de dos rutas diferentes:
la androgénesis y la ginogénesis. La androgénesis es el proceso a través del cual se produce un embrión
haploide a partir de una micróspora (grano de polen); mientras que la ginogénesis es el proceso a través del
cual se produce un embrión haploide a partir de un ovulo no fertilizado (e.g., partenogénesis) o cuando en
un ovulo fertilizado el juego cromosómico masculino es eliminado por lo que el embrión resultante solo
tiene el juego cromosómico materno.
No obstante, en el café la ginogénesis es menos usada debido a la facilidad de recuperar abundante
cantidad de micrósporas, la presencia de apenas dos óvulos por flor y por causa de su naturaleza autógama
[2,6,9,10]
y cleistogamica [19,24-26] lo que dificulta la recuperación de óvulos no fertilizados a excepción de
aquellos genotipos con esterilidad masculina citoplasmática [8,27].
En las angiospermas diploides, las micrósporas son células haploides (n = x) y la doble fertilización
resulta en un zigoto diploide (2n = 2x) y un endospermo triploide (2n = 3x); En contraste, C. arabica es el
único tetraploide del género Coffea (2n = 4x = 44) [2,6,9,10] por lo que sus micrósporas tienen dos juegos
cromosómicos (2n = 2x = 22) y se les llama células dihaploides. Además, la doble fertilización resulta en
el desarrollo de un embrión tetraploide (2n = 4x = 44) y un endospermo hexaploide (2n = 6x = 66).
Sin embargo, la doble fertilización no siempre resulta en el desarrollo de embriones tetraploides ya
que existe evidencia de otros poliploides tales como: los triploides (2n = 3x = 33), pentaploides (2n = 5x =
55), hexaploides (2n = 6x = 66) y octaploides (2n = 8x = 88) [28,29].
En el café, los genotipos dihaploides ocurren de forma natural y espontanea en baja frecuencia y
generalmente son derivados de las variedades tipo Típica [19], pero sí la androgénesis es artificialmente
inducida, ya sea a través del cultivo de anteras o micrósporas, se pueden recuperar genotipos dihaploides
los cuales se caracterizan por tener un fenotipo diferente, i.e. hojas angostas y alargadas, una mayor
densidad estomática, altura promedio más baja y estructura compacta; con ramas delgadas flexibles y
colgantes [19].
13
Ilustración 2. Esquema de producción de nuevas líneas experimentales de café a través de: (A) la técnica del
retro–cruce y (B) el método de descendencia derivada de una sola semilla. ♂ = masculino, ♀ = femenino, X =
cruzamiento & ⊗ = autopolinización.
Desde el punto de vista del fitomejoramiento, una de las ventajas de las genotipos haploides o monospermas
es que los genes recesivos y algunas mutaciones, que normalmente permanecen ocultas por la acción de
algún gen dominante, son expresados fenotípicamente permitiendo así identificarlos y seleccionarlos sí
tuvieran algún valor comercial.
Sin embargo, se debe tener presente que a través de la androgénesis inducida se pueden recuperar
genotipos tetraploides que pudieran ser heterocigóticos u homocigóticos para todos los locuces siendo estos
producto del cultivo de pequeños fragmentos de tejidos somáticos cuando se cultivan anteras [30] o por la
fusión espontanea de dos células dihaploides respectivamente.
Los genotipos dihaploides del café florecen abundantemente, pero presentan un alto grado de
esterilidad (~2 % de polen viable) y si se encuentra algún fruto en ellos estos suelen ser pequeños, angostos
14
y no contienen semillas [19]. La esterilidad es causada por una meiosis atípica causada por anormalidades
después de la primera división meiótica y tienen un desarrollo lento respecto a sus contrapartes tetraploides
[30]
. Finalmente, estos materiales pese a ser una curiosidad genética carecen de importancia económica [19].
6.4 Producción de nuevas variedades a través de la generación de dihaploides duplicados.

Por otro lado, la duplicación del material genético (en ausencia de una cariocinesis y citocinesis) y la
embriogénesis gamética constituyen de manera conjunta otra alternativa para el mejoramiento del café y la
cual, en comparación con las anteriores, contribuye a reducir significativamente el tiempo requerido para
producir líneas experimentales completamente homocigóticas.
Desafortunadamente, el desarrollo de haploides dobles como método de mejoramiento de especies con
un ciclo reproductivo prolongado (e.g., café, cacao, marañón, pimienta, mango, aguacate) es limitado pues
son consideradas especies recalcitrantes es decir que a través de la gametogénesis inducida el número de
dihaploides duplicados recuperados es limitado [15] constituyéndose en uno de los mayores obstáculos para
el uso de los dihaploides duplicados en los programas de mejoramiento genético de tales especies.
En el café, sí la androgénesis es inducida y luego las células polihaploides (dihaploides) recuperadas
son arrestadas en la metafase mitótica, a través del alcaloide colchicina o cualquier otro agente antimitótico
(e.g., oryzalin, trifluralin, cafeína, etc.), entonces se produce una duplicación cromosómica y la célula
resultante es una dihaploide duplicada. Lo que sigue es la embriogénesis directa en medios de crecimientos
mediante el uso de hormonas vegetales que da lugar al desarrollo del embrión o brotes adventicios.
Los dihaploides duplicados del café tienen cuatro juegos de cromosomas (2n = 4x = 44) y son
completamente homocigóticos para todos los locuses; por esta razón, las autopolinizaciones no son
necesarias y el tiempo requerido para producir nuevas líneas experimentales se reduce a aproximadamente
14 años (Ilustración 3).
Aprovechando este conocimiento este estudio evaluará la efectividad de diferentes compuestos con
propiedades anti-microtubulares en el proceso de duplicación del material nuclear previo a la embriogénesis
gamética del café.
Ilustración 3. Esquema de producción de dihaploides duplicados del café. Tiempo promedio requerido para
producir, evaluar y liberar una nueva variedad ~11–14 años.
15
VII. METODOLOGÍA.
7.1 Enfoque (Estudios cualitativos vs Estudios cuantitativos). Los estudios cualitativos se

caracterizan por su naturaleza exploratoria además de no tener una hipótesis definida. Por otro lado,
presentan un diseño experimental emergente es decir que está sujeto a cambios durante la investigación y
la herramienta de investigación es el investigador per se.
Además, la investigación cualitativa se enfoca en la observación de los fenómenos estudiados en el
campo y los organiza en diferentes temas consumiendo en el proceso una cantidad de tiempo indefinida.
Por otro lado, el informe final se caracteriza por ser narrativo y la interpretación de los datos es realizada
desde el punto de vista del investigador por lo que son considerados subjetivos.
En contraste, los estudios con un enfoque cuantitativo se caracterizan por tener una hipótesis definida
es decir que se predice el resultado antes de realizar el estudio. Además, pretenden determinar si existe una
conexión entre los parámetros estudiados es decir si las variables evaluadas están de alguna forma
relacionadas a través del análisis de los datos recolectados auxiliándose de la estadística. Posteriormente,
en el informe final los resultados obtenidos son presentados de manera numérica o grafica e interpretados
a la luz de las teorías o paradigmas existentes dentro del campo de estudio respectivo por lo que son
considerados objetivos.
En base a lo anterior, la presente propuesta de investigación se basa en el desarrollo de un estudio con
un enfoque cuantitativo pues presenta una hipótesis claramente definida, el diseño experimental propuesto
no está sujeto a cambios durante la investigación, las herramientas de investigación son una serie de equipos
de laboratorio usados para el establecimiento del experimento y la recolección de datos, el tiempo para el
desarrollo de la experiencia está claramente definido (18 meses), la base de datos será analizada
estadísticamente y los resultados interpretados con un enfoque citogenético.
7.2 Naturaleza experimental. Los cuasi-experimentos se parecen mucho a los experimentos

verdaderos, pero usualmente no son considerados como tal pues no satisfacen todos los requerimientos del
método científico. No obstante, pese a esta condición los cuasi-experimentos son implementados en
aquellas situaciones en las cuales los experimentos verdaderos no pueden ser desarrollados.
Estos presentan un diseño experimental en el cual las variables independientes (tratamientos) no son
asignadas a las unidades experimentales de manera aleatoria debido a la incapacidad de controlar ciertas
condiciones ligadas a las mismas (e.g., sexo de los individuos, coeficiente intelectual, estado anímico,
condición de salud, etc.).
Además, los cuasi-experimentos carecen de un control es decir un tratamiento que sirve como
referencia de comparación debido a razones éticas. El ejemplo típico de esta limitación lo representa la
evaluación de un nuevo fármaco para el tratamiento de trastornos cardio vasculares. La inclusión de un
control al cual se le administraría un placebo pondría inmediatamente en una condición de riesgo a todos
aquellos participantes de la investigación que padecen de dicha patología.
En contraste, los experimentos verdaderos presentan un alto grado de control ya que las variables
independientes son asignadas a las unidades experimentales de manera aleatoria. Además, también cuentan
con la inclusión de un control es decir un tratamiento que sirve como referencia de comparación.
Tomando en consideración todo lo arriba descrito la presente propuesta de investigación se basa en el
desarrollo de un experimento verdadero por su alto grado de control de las fuentes de variación. Esto se ve
reflejado en el hecho de que los tratamientos (5 agentes anti-microtubulares + 2 medios de crecimiento) son
asignados de manera aleatoria a las unidades experimentales.
Por otro lado, el diseño experimental propuesto no está sujeto a cambios durante el desarrollo de la
experiencia además de incluir un control (colchicina) el cual será sometido a las mismas variaciones
(concentraciones y tiempos de inducción) que el resto de los tratamientos y los resultados obtenidos serán
usados como punto de referencia para efectos de comparación.
Finalmente, la variable dependiente es decir los datos numéricos almacenados en la matriz operacional
(hoja de MS Excel) serán usados para realizar la evaluación estadística y así poder determinar las diferencias
significativas entre los tratamientos sí existiese alguna.
16
7.3 Procedimientos experimentales.
7.3.1 Determinación de la etapa de desarrollo de las micrósporas. El análisis citológico de las

micrósporas se hace para determinar su etapa de desarrollo. Por lo general, existe una sincronización
respecto al grado de madurez de las micrósporas de tal manera que a través del estudio de los granos de
polen de una antera se puede estimar el grado de desarrollo de las demás.
Además, la evidencia indica que los mejores resultados se obtienen con micrósporas aisladas de las
primeras flores de la planta, así como a través del análisis de micrósporas uninucleadas. La determinación
del grado de desarrollo (micrósporas uninucleadas, dinucleadas, etc.) se hará usando una de la siguiente
técnica:
1. Sumergiendo anteras en una solución de acetocarmín3 o propiono–carmín para luego observar las
micrósporas bajo un microscopio óptico de baja resolución. Según Rodrigues et al. (31), una de las
ventajas del acetocarmín es que nos permite distinguir entre el núcleo generativo del vegetativo, pero
tiene la desventaja que también tiñe el tejido necrótico por lo que no se puede distinguir las células
vivas de las muertas.
2. Los botones florales se dejan toda la noche inmersas en una solución de 3:1 de EtOH y ácido acético.
3. Con un escalpelo remover las estructuras florales (cáliz, corola, estambres) para luego diseminar los
granos de polen sobre la superficie del porta–objetos.
4. Agregar una gota de tinte sobre las micrósporas y proceder a calentar el porta objetos en el mechero a
fin de provocar la evaporación del tinte. Repetir el proceso varias veces a fin de que el material nuclear
absorba el tinte.
5. Dejar reposar las muestras por 5–10 min y luego cúbralas con el cubre porta objetos.
6. Envolviendo los porta objetos con papel toalla presione los contenidos a fin de macerarlos sin que se
rompa el cubre objetos.
7. Observe las muestras bajo el microscopio usando un lente de aumento de 40x (400 veces su tamaño) y
100x (1,000 veces su tamaño) sumergiendo la muestra en aceite.
7.3.2 Extracción y purificación de micrósporas. Las flores seleccionadas son recolectadas a razón de
una flor por botón floral para luego ser envueltas en papel toalla ligeramente humedecido siendo estas
introducidas en bolsas de tipo Ziploc para facilitar su transporte.
En laboratorio, las flores son esterilizadas por inmersión en EtOH al 70% por 1 min y luego inmersas
en una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) o calcio [Ca(ClO)2] al 1%4 por espacio de 10–15 min con
agitamiento constante. Luego enjaguar las flores rápidamente en agua destilada y estéril, dos veces, a fin
de remover los desinfectantes.
Posteriormente, en el interior de una cabina de flujo laminar esterilizada y el auxilio de un
estereoscopio las flores son manipuladas con fórceps removiendo los filamentos de las anteras y las anteras
son abiertas con un escalpelo previamente esterilizado.
El aislamiento y purificación de las micrósporas se hará removiéndolas de las anteras usando el
protocolo modificado de Herrera et al. (15) a través del cual las anteras son maceradas al interior de un
filtro de acero inoxidable de 400 µm de Ø previamente esterilizado usando una barra de cristal mientras el
material macerado es expuesto a una solución Murashige & Skoog 0.5X modificada5 (i.e., MS 0.5X;
manitol a 6.4% & HCl–Cisteína a 0.06%) que facilita el paso de las micrósporas a través del filtro.
Posteriormente, el extracto recuperado es filtrado una vez más en un filtro de acero inoxidable de 45
µm de Ø previamente esterilizado, usando la misma solución, ya que este permite el libre paso de las
3 Preparar el acetocarmín en un beaker de 100 ml agregar 45 ml de ácido glacial acético para luego hervirlo. Mientras este hierve
agregar 0.5–1 g de Carmín y dejarla hervir por 5 min removiéndola hasta que la solución se torne rojo-oscura. Luego filtrar la
solución, guardar en frasco oscuro y bajo refrigeración.
4 Diluir 10 g de hipoclorito de sodio o calcio en 1 l de agua.
5 La concentración de auxina y citoquinina se mantendrá a 1X, pero no se agregará el agar o agarose.
17
micrósporas pues su Ø promedio oscila entre 30–38 µm6 [32]. Finalmente, el extracto recuperado es
centrifugado a 1,000 rpm por espacio de 5 minutos y re–suspendido en 2 ml de la misma solución.
Sin embargo, a efecto de recuperar un extracto de micrósporas libre de residuos vegetales se realizará
una purificación a través de Percoll Plus. Las micrósporas en suspensión son depositadas suavemente en la
superficie de una columna de separación formada por tres gradientes de Percoll Plus (10, 20 y 30% de
Percoll Plus diluido en MS 0.5X modificado) y centrifugada a 1,000 rpm por 3 min.
Posteriormente, las micrósporas viables libres de contaminantes son removidas de la banda
correspondiente usando una pipeta y trasladadas a un filtro de acero inoxidable de 20 µm de Ø previamente
esterilizado donde son enjuagadas dos veces en la solución MS 0.5X modificada a fin de remover los restos
de Percoll Plus y transferidas a un tubo de ensayo estéril.
7.3.3 Inducción de endomitosis y embriogénesis directa. Seguidamente, las micrósporas serán

incubadas a 27 oC bajo constante agitación por espacio de 24, 48, 72, & 96 h en dos soluciones inductoras:
a) MS 0.5X modificado + 0, 30, 60, 120 mg l-1 de 5 agentes antimitóticos [colchicina7, oryzalin,
pronamide, trifluralin & amiprophos–methyl].
b) MS 0.5X modificado (Murashige & Skoog 0.5X, 15% de agua de coco8 (v/v), 6.4% de manitol & 0.06%
de HCl–Cisteína) + 0, 25, 50, 100 mg l-1 de 5 agentes antimitóticos [colchicina, oryzalin, pronamide,
trifluralin & amiprophos–methyl].
Posteriormente, las micrósporas son centrifugadas a 1,000 rpm por 3 min y el precipitado recuperado es
lavado dos veces en agua desionizada y destilada a fin de remover los restos de los agentes antimitóticos.
Seguidamente, las micrósporas serán cultivadas en capsulas plásticas de Petri (60 mm x 15 mm) en dos
medios de crecimiento semisólidos: MS 1X (Anexos 2 & 3) & MS 1X + 15% de agua de coco (v/v).
Se calculará la densidad de micrósporas por mm2 de superficie del medio de crecimiento y estas se
incubarán en la oscuridad a 27 oC hasta observar el crecimiento de colonias. Cuando las colonias alcancen
entre 400 a 800 µm se trasladarán a nuevas capsulas con ambos medios de crecimiento semisólidos y frescos
a fin de inducir la embriogénesis directa.
Cuando los embriones hayan alcanzado aproximadamente 6–8 mm de longitud se trasladarán a nuevas
capsulas con un medio de crecimiento semisólido fresco a base de MS 1X, pero en ausencia de hormonas
vegetales a fin de estimular el desarrollo (germinación) de los embriones. Finalmente, cuando los embriones
estén completamente desarrollados se trasladarán al invernadero en pequeños maceteros con tierra negra
fin de promover su crecimiento y desarrollo.
7.3.4 Corroboración del nivel de ploidía. Para verificar el nivel de ploidía de cada planta recuperada se
evaluarán parámetros morfológicos y moleculares tales como: la densidad de los estomas en la superficie
abaxial o el envés de la hoja (i.e., número de estomas por mm2), la longitud de las células guarda expresada
en µm y el número de cromosomas en células somáticas.
Para el cálculo de la densidad de los estomas en la superficie abaxial se examinaran 3 hojas maduras
de cada supuesto dihaploide duplicado usando un lente de aumento de 40x (un aumento de 400 veces su
tamaño) en un microscopio de luz. Asimismo, las células guarda de los genotipos dihaploides por lo general
son más pequeñas que las presentes en los dihaploides dobles por lo que para distinguirlos se medirá la
longitud de 10 células guarda de 3 hojas maduras de cada planta desarrollada usando un lente de aumento
de 40x en un microscopio de luz.
El conteo del número de cromosomas de células somáticas es la técnica más precisa para distinguir los
genotipos dihaploides de los dihaploides dobles, pero es una tarea intensa. Esta se realizará usando células
6 https://goo.gl/FfohgV
7 la colchicina debe ser manejada con precaución pues es tóxica y carcinogénica en los seres humanos. Siempre use guantes de
látex cuando manipule la colchicina o tejidos tratados con estas.
8 Esterilizar el agua de coco en el auto clave por espacio de 15 min a 120 oC a fin de provocar la precipitación de las proteínas y
luego dejar enfriar toda la noche. Luego, en la mañana filtrar la solución y refrigerar a -20 oC.
18
somáticas extraídas de tejidos meristemáticos en estado mitótico, arrestadas y fijadas en la Metafase. Estos
tejidos pueden ser extraídos de las yemas apicales o de las puntas de las raíces de los dihaploides duplicados
en crecimiento.
Para sincronizar los estados de división celular los tejidos meristemáticos serán inmersos en una
solución de 8–hidroxiquinolina9 al 0.5% por espacio de 2–3 h a 15–16°C. La 8–hidroxiquinolina es muy
útil al trabajar con especies con cromosomas pequeños (e.g., café) ya que tiene la propiedad de aumentar la
resolución de las estructuras nucleares (constricciones primarias y secundarias).
Fijar el material en una solución de Carnoy y refrigerar a 8 ± 2oC por lo menos por 24 h. Para preparar
la solución de Carnoy mezclar EtOH al 96% con ácido glacial acético 100% en una proporción de 3:1.
Seguidamente, con el propósito de degradar las paredes celulares de los tejidos meristemáticos estos
serán sometidos a una doble digestión (acida y enzimática). La digestión acida se realizará exponiendo los
tejidos a una solución de HCl (0.1 N)10 a temperatura ambiente por espacio de 15 min. Después, la digestión
enzimática se realizará en base al protocolo detallado por Herrera P. et al. (30) es decir los tejidos
meristemáticos serán expuestos a celulasas (SIGMA C1184 al 4% & Onozuka R–10 al 1%), una pectoliasa
(SIGMA P3026 al 1%) y una pectinasa (SIGMA P4716 al 3 % en buffer citrato) por espacio de 45 a 60 min
a 40oC.
Posteriormente, los tejidos digeridos extendidos sobre un porta objetos serán teñidos con una o dos
gotas de acetocarmín para luego dejarlos en reposo por unos minutos; Luego cubrirlos con una laminilla y
presionar a fin de extraer el exceso de tinte el cual se limpiará con papel toalla. Observar y foto registrar
con el auxilio de una cámara digital acoplada al microscopio. A fin de corroborar el número de
cromosómico de cada dihaploide duplicado 1 muestra por planta será analizada.
7.4 Población de estudio y procedimiento de muestreo. La población de estudio estará constituida

por todos los genotipos dihaploides y dihaploides dobles identificados a través del procedimiento de
muestreo, es decir, el conteo de los cromosomas de cada plántula generada a través de la implementación
del protocolo anteriormente descrito.
Además, la base de datos para fines de evaluación estadística estará constituida por el registro
electrónico, en MS Excel, de los genotipos identificados claramente distribuidos en los tratamientos
correspondientes los cuales estarán definidos por el agente diploidizante aplicado y la concentración del
mismo, el tiempo de inducción y el medio de crecimiento utilizado. Para una descripción más detallada de
los tratamientos ver la matriz de operacionalización.
9
Disolver 0.5 g de 8–hidroxiquinolina en 1 l de agua destilada a temperatura ambiente revolviendo constantemente usando un
agitador magnético por 24 h. Luego filtrar y guardar en frasco oscuro bajo refrigeración.
10 Es decir 3.64 g de HCl disueltos en un litro de agua.
19
7.3 Diseño experimental. El análisis estadístico se hará a través de un análisis de varianza (ANAVA)
con un nivel de significancia (α) del 5% con el paquete estadístico SPSS versión 15 bajo un diseño factorial
9 x 4 x 3 x 2 con el siguiente modelo estadístico:
yijkl= µ + αi + βj + γk + + δl + (α*β)ij + (α*γ)ik + (α*δ)il + (α*γ*δ)ijk + ɛijkl donde:
yijkl: es la respuesta de la unidad experimental recibiendo el nivel i del factor α, el nivel j del factor β, el
nivel k del factor γ y el nivel l del factor δ.
µ: es el intercepto o la media de la población.
α: es el efecto del agente antimitótico (i: colchicina, oryzalin, pronamide, trifluralin, amiprofos–metil,
colchicina+oryzalin, colchicina+pronamide, colchicina+trifluralin & colchicina+amiprofos–metil).
β: es el efecto del intervalo de tiempo (j: 24, 48, 72 & 96 h).
γ: es el efecto de la concentración del agente antimitótico (k: 30, 60 & 120 mg).
δ: es el efecto del medio de crecimiento (l: MS 1X & MS 1X+15% de agua de coco).
(α*β)ij: es el efecto de la interacción del nivel i del agente antimitótico con el nivel j del intervalo de tiempo.
(α*γ)ik: es el efecto de la interacción del nivel i del agente antimitótico con el nivel k de su concentración.
(α*δ)il: es el efecto de la interacción del nivel i del agente antimitótico con el nivel l del medio de
crecimiento.
(α*γ*δ)ikl: es el efecto de la interacción del nivel i del agente antimitótico con el nivel k de su concentración
con el nivel l del medio de crecimiento.
ɛijkl: el efecto del error experimental aleatorio que deberá satisfacer los siguientes requisitos ɛ: ~ N (0, σε2).
Por otro lado, el análisis de la base de datos recolectada se hará para para corroborar la validez de la hipótesis
nula (Ho) o de la hipótesis alternativa (Ha) descritas a continuación:
Ho: no existen diferencias significativas entre los tratamientos.

Ha: al menos un tratamiento es diferente.
Además, se corroborará la normalidad de los errores experimentales a través de la prueba de Shapiro–Wilk

cuando N ≤ 50 o la prueba de Kolmogorov–Smirnov cuando N > de 50 bajo la siguiente hipótesis:
Ho: X = normalmente distribuido.

Ha: X ≠ normalmente distribuido.
También se verificará la homogeneidad de varianzas a través de la prueba de Levene bajo la siguiente

hipótesis:
Ho: σ1 = σ2 = σ3 = ………….= σ128.

Ha: σ1 ≠ σ2 ≠ σ3 ≠ ………….≠ σ128.
Finalmente, la separación de medias se realizará con la prueba de rango múltiple de Duncan.
20
7.9 Matriz de operacionalización.
Variable. Definición conceptual. Definición operacional.

Es la proporción entre la cantidad de los compuestos anti-microtubulares (e.g., pronamide,
Concentración. Se describe en términos de miligramos (mg)
trifluralin, colchicina, oryzalin & amiprofos–metil) y la cantidad del disolvente empleado.
Es el período determinado durante el cual se induce la embriogénesis gamética de las
Tiempo. Se describe en cuatro intervalos medidos en términos de horas (h)
microsporas del café.
Variables Indicadores (#) Variables Indicadores (#)

Tratamiento Tratamiento
mg h Dihaploides Dihaploides dobles mg h Dihaploide Dihaploides doble
Pronamide + MS 1X 30 24 Oryzalin + MS 1X 30 24
Trifluralin + MS 1X 30 24 Amiprofos-metil+MS 1X 30 24
Colchicina + MS 1X 30 24 MS 1X - 24
Colchicina + MS 1X 60 24 Colchicina+Pronamide+MS 1X 30 24
21
Colchicina+Pronamide+MS 1X 120 24 Pronamide+MS 1X+Agua de coco 30 24
Colchicina+Trifluralin+MS 1X 30 24 Pronamide+MS 1X+Agua de coco 60 24
Colchicina+Trifluralin+MS 1X 120 24 Trifluralin+MS 1X+Agua de coco 30 24
Colchicina+Oryzalin+MS 1X 30 24 Trifluralin+MS 1X+Agua de coco 60 24
Colchicina+Oryzalin+MS 1X 30 24 Colchicina+MS 1X+Agua de coco 30 24
Colchicina+Amiprofos–metil 30 24 Colchicina+MS 1X+Agua de coco 60 24
Colchicina+Amiprofos–metil 120 24 Oryzalin+MS 1X+Agua de coco 30 24
MS 1X+agua de coco - 24 Oryzalin+MS 1X+Agua de coco 60 24
Oryzalin+MS 1X+Agua de coco 120 24 Amiprofos–metil+MS 1X+Agua de coco 60 24
22
Amiprofos–metil+MS 1X+agua de coco 30 24 Amiprofos–metil+MS 1X+Agua de coco 120 24
23
VIII. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES.
Meses
No. ACTIVIDAD
I II III IV V VI VII
Realizar cotizaciones de productos a comprar/tramite de
1. X
exoneración del ISV.
2. Compra de equipos y materiales. X
3. Determinación del grado de maduración de las micrósporas. X
4. Extracción y purificación de micrósporas. X X
5. Inducción de la endomitosis. X X
6. Inducción de la embriogénesis directa en medios de crecimiento. X X X X
7. Traslado de muestras a medios de crecimientos frescos. X X
8. Elaboración y entrega del 1er informe de avance técnico y financiero X X
9. Elaboración y entrega del 2do informe de avance técnico y financiero. X
10. Crecimiento y desarrollo de plántulas en cámara de crecimiento. X X
Meses
No. ACTIVIDAD
VIII IX X XI XII XIII
10. Crecimiento y desarrollo de plántulas en cámara de crecimiento. X X X X X X
Meses
No. ACTIVIDAD
XIV XV XVI XVII XVIII
11. Crecimiento y desarrollo de plántulas en cámara de crecimiento. X X
12. Corroboración del nivel de ploidía. X X X
13. Traslado y crecimiento de plántulas en el invernadero. X X
14. Recolección y evaluación estadística de la base de datos. X
15. Escritura y publicación del artículo científico. X X
Nota aclaratoria: el cronograma de actividades arriba descrito fue modificado a fin de incluir la entrega del
primer y segundo informe de avance técnico y financiero 2.5 & 5 meses después de haber iniciado la investigación
respectivamente.
Por otro lado, aunque el tiempo máximo permisible para el desarrollo de las becas básicas de investigación
es de 5 meses las actividades arriba descritas requieren de no menos de 18 meses para ser desarrolladas, esto es,
colectar y analizar los datos, así como publicar el articulo a través de una revista indexada en el idioma inglés.
Todo ello obedece a que no se puede hacer nada para acelerar la tasa de crecimiento de los tejidos ya que el
cultivo del café es una especie perenne y estas se caracterizan por su lento metabolismo. Además, ya que la
floración del café en la Fe, Santa Bárbara inicia en mayo entonces la investigación se extendería desde mayo del
presente año hasta finales de octubre del 2019.
24
IX. PRESUPUESTO.
CUADRO RESUMEN:
No. CONCEPTO MONTO (L.)

1 Servicios personales. -
2 Servicios no personales. -
3 Materiales y suministros. 74,918.95
4 Bienes especiales (Capitalizables). -
SUMA TOTAL (L.) 74,918.95
CUADRO ANALÍTICO:
No. CONCEPTO CANTIDAD Costo unitario (L) Costo total (L)

3 Materiales y suministros.
1. Capsulas Petri (60 mm x 15 mm). 500 2,400.00 2,400.00
2. Bolsas de tipo Ziploc. 400.00 400.00
3. Ácido glacial acético. 2.5 l 1,200.00 1,200.00
4. Carmín. 100 ml 703.20 703.20
5. Orcein. 5g 3,808.00 3,808.00
6. Filtro de acero inoxidable de 400 µm de Ø. 3 487.06 487.06
9. Manitol (Polvo). 500 g 744.57 744.57
10. Colchicina. 1g 7,296.00 7,296.00
11. Oryzalin. 100 mg 3,552.00 3,552.00
12. Pronamide. 100 mg 2,112.00 2,112.00
13. Trifluralin. 250 mg 2,752.00 2,752.00
14. Amiprophos–methyl. 50 mg 8,768.00 8,768.00
15. 8–hidroxiquinolina. 250 mg 1,952.00 1,952.00
16. SIGMA C1184 al 4% (celulasa). 5000 unit 3,040.00 3,040.00
17. Onozuka R–10 al 1% (celulasa). 1g 9,056.00 9,056.00
18. SIGMA P3026 al 1% (pectoliasa). 100 mg 7,968.00 7,968.00
19. SIGMA P4716 al 3% en buffer citrato 5000 unit 3,360.00 3,360.00
20. (pectinasa)
Percoll Plus. 250 ml 11,904.00 11,904.00
21. KOH. 500 g 581.88 581.88
22. Ácido índolacético. 100 g 11,104.00 11,104.00
23. Quinetina. 1g 3,488.00 3,488.00
Monto total por concepto. 74,918.95
Suma total beca. 74,918.95
25
X. REFERENCIAS.
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27
ANEXO 1. Convenio marco de cooperación entre la UNAH y el IHCAFE.
28
29
30
31
ANEXO 2. Composición química inorgánica del medio Murashige & Skoog (MS) a 100x.
Masa molecular Cantidad

Solución de Reservaa Compuesto Tipo de nutriente
g mol-1 mg g
NH4NO3 80.04 Macro–nutriente 165,000 165
1
KNO3 101.10 Macro–nutriente 190,000 190
MgSO4 7H2O 246.47 Macro–nutriente 37,000 37
MnSO4 4H2O 223.06 Micro–nutriente 2,230 2.23
2
ZnSO4 4H2O 233.50 Micro–nutriente 860 0.86
CuSO4 5H2O 249.68 Micro–nutriente 2.50b 0.0025
CaCl2 2H2O 147.00 Macro–nutriente 44,000 44
3 KI 166.00 Micro–nutriente 83.0 0.083
CoCl2 6H2O 237.92 Micro–nutriente 2.50c 0.0025
KH2PO4 136.08 Macro–nutriente 17,000 17
4 H3BO3 61.83 Micro–nutriente 620 0.62
Na2MoO4 2H2O 241.97 Micro–nutriente 25.0 0.025
FeSO4 7H2O 278.01 Macro–nutriente 2,780 2.78
5d
Na2–EDTA 336.21 Macro–nutriente 3,730 3.73
a
a cada solución de reserva agregar una etiqueta con la siguiente información:
Solución nitrogenada (100x).

Murashige & Skoog, 1962.
Use 10 ml por litro de solución.
Fecha de preparación.
Nombre de quien la preparo.
b
Preparar la solución de reserva diluyendo 25 mg de CuSO4 5H2O en 100 ml de agua destilada y desionizada
agitando la solución constantemente con un agitador magnético. Posteriormente, agregar 10 ml de dicha
solución a la solución de reserva No. 2.
c
Preparar la solución de reserva diluyendo 25 mg de CoCl2 6H2O en 100 ml de agua destilada y desionizada
agitando la solución constantemente con un agitador magnético. Posteriormente, agregar 10 ml de dicha
solución a la solución de reserva No. 3.
d
Combinar el FeSO4 7H2O y el Na2–EDTA y calentar hasta que la solución se torne de color naranja.
Protegerlo de la luz almacenándolo en un frasco oscuro o envolver el frasco en papel aluminio.
ANEXO 3. Composición química orgánica del medio MS a 1x.
Masa molecular Cantidad

Compuesto Tipo de nutriente
g mol-1 mg g
Sacarosa. 342.30 Carbohidrato 30,000 30
Glicinaa. 75.07 Aminoácido 2.0 0.002
Ácido índolacéticob. 175.2 Auxina 1–30 –
Quinetinac. 215.2 Citoquinina 0.04–10 –
Agar. – Polisacárido 10,000 10
Mioinositold. 180.16 Vitamina B 100 0.1
Ácido nicotínicoe. 123.11 Vitamina B3 0.5 0.0005
f
Piridoxina–HCl . 205.64 Vitamina B6 0.5 0.0005
Tiamina–HClg. 337.26 Vitamina B1 0.1 0.0001
a
Preparar la solución de reserva diluyendo 100 mg de glicina en 100 ml de agua destilada y desionizada,
agitando la solución constantemente con un agitador magnético. Al preparar 1 l de solución MS agregar 2
ml de la solución de reserva antes de su esterilización.
32
b
Preparar la solución de reserva diluyendo 5.61 g de KOH en 100 ml de agua destilada y desionizada,
agitando la solución constantemente con un agitador magnético. Después, diluir 3,000 mg de ácido
índolacético en los 100 ml de agua agitando la solución constantemente.
El ácido índolacético es fotosensible por lo que se debe almacenar en un frasco oscuro o envolver el frasco
en papel aluminio. Además, al preparar 1 l de solución MS agregar 1 ml de la solución de reserva antes de
su esterilización.
c
Preparar la solución de reserva diluyendo 5.61 g de KOH en 100 ml de agua destilada y desionizada,
agitando la solución constantemente con un agitador magnético. Después, diluir 1,000 mg de quinetina en
los 100 ml de agua, agitando la solución constantemente. La quinetina es fotosensible por lo que se debe
almacenar en un frasco oscuro o envolver el frasco en papel aluminio y una vez preparada, guardar la
solución de reserva en el refrigerador.
Al preparar 1 l de solución MS agregar 1 ml de la solución de reserva antes de su esterilización.
d
Preparar la solución de reserva diluyendo 1,000 mg de Mioinositol en 100 ml de agua destilada y
desionizada agitando la solución constantemente con un agitador magnético. Una vez preparada, guardar
la solución de reserva en el refrigerador.
Después, agregar 10 ml de dicha solución a 1 l de solución MS antes de su esterilización.
e
Preparar la solución de reserva diluyendo 50 mg de ácido nicotínico en 100 ml de agua destilada y
f
Preparar la solución de reserva diluyendo 50 mg de Piridoxina–HCl en 100 ml de agua destilada y
g
Preparar la solución de reserva diluyendo 10 mg de Tiamina–HCl en 100 ml de agua destilada y
Protocolo de preparación de 1 l de MS:
1. Los compuestos inorgánicos se diluyen en 0.5 l de agua destilada y desionizada agregando 10 ml de

cada solución de reserva y agitando la solución constantemente con un agitador magnético mientras se
le aplica calor para asegurar la disolución de los compuestos. Nota: usar un frasco Erlenmeyer de dos
litros.
2. Después, agregar los compuestos orgánicos agitando la solución constantemente con el agitador
magnético.
3. Seguidamente completar el volumen con agua destilada y desionizada hasta alcanzar un litro.
4. Seguidamente ajustar el pH de la solución entre 5.4–5.8 usando HCl 1 N o NaOH, KOH agitando la
solución constantemente con el agitador magnético. Nota: siempre ajustar el pH de la solución antes de
agregar el agar.
5. Agregar el agar o agarose (e.g., TC agar, Difco–Bacto agar o Gelrite) agitando la solución
constantemente con un agitador magnético mientras se le aplica calor para asegurar la disolución de los
compuestos.
6. Cubrir la abertura del recipiente (e.g., beaker o frasco Erlenmeyer) con papel aluminio y esterilizar en
el autoclave por espacio de 15 a 20 min a 120–121oC a 15 p.s.i.
33

5 (Ejemplo de Propuesta de Investig) Generación de Dihaploides Dobles en El Cultivo Del Café (2da Versión)

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5 (Ejemplo de Propuesta de Investig) Generación de Dihaploides Dobles en El Cultivo Del Café (2da Versión)

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE HONDURAS

Presentado por: Ostilio R. Portillo, M.Sc., Ph.D.

Lugar y fecha: Ciudad Universitaria, 22 de enero del 2018.

I. TABLA DE CONTENIDOS ........................................................................................................... 2

A. Descripción del proyecto.

1. Descripción. Este es un estudio citogenético con un diseño estadístico factorial 9 x 4 x 3 x 2, con

4. Divulgación y apropiación de resultados. Ya que el financiamiento será proporcionado a través de

5. Riesgos y obstáculos (formas de superarlos). Debido a la carencia, en Ciudad Universitaria, de un

B. Instituciones/organizaciones o dependencias ejecutoras. UNAH y el IHCAFÉ.

C. Información del proyecto.

1. Tipo de beca. Beca básica de investigación.

4.1 Objetivo general.

1. Evaluar el efecto de cinco diferentes agentes anti-microtubulares y dos diferentes medios de

4.2 Objetivos específicos.

1. Describir la efectividad de cinco diferentes agentes anti–microtubulares [e.g., colchicina(control),

Ilustración 1. Representación esquemática de la doble fertilización en las angiospermas. A. Polinización, B & C.

6.4 Producción de nuevas variedades a través de la generación de dihaploides duplicados.

7.1 Enfoque (Estudios cualitativos vs Estudios cuantitativos). Los estudios cualitativos se

7.2 Naturaleza experimental. Los cuasi-experimentos se parecen mucho a los experimentos

7.3.1 Determinación de la etapa de desarrollo de las micrósporas. El análisis citológico de las

7.3.3 Inducción de endomitosis y embriogénesis directa. Seguidamente, las micrósporas serán

7.4 Población de estudio y procedimiento de muestreo. La población de estudio estará constituida

yijkl= µ + αi + βj + γk + + δl + (α*β)ij + (α*γ)ik + (α*δ)il + (α*γ*δ)ijk + ɛijkl donde:

Ho: no existen diferencias significativas entre los tratamientos.

Además, se corroborará la normalidad de los errores experimentales a través de la prueba de Shapiro–Wilk

Ho: X = normalmente distribuido.

También se verificará la homogeneidad de varianzas a través de la prueba de Levene bajo la siguiente

Ho: σ1 = σ2 = σ3 = ………….= σ128.

Finalmente, la separación de medias se realizará con la prueba de rango múltiple de Duncan.

Variable. Definición conceptual. Definición operacional.

Variables Indicadores (#) Variables Indicadores (#)

No. CONCEPTO MONTO (L.)

No. CONCEPTO CANTIDAD Costo unitario (L) Costo total (L)

1. Lashermes P, Combes MC, Hueber Y, Severac D, Dereeper A. Genome rearrangements derived

Masa molecular Cantidad

Solución nitrogenada (100x).

ANEXO 3. Composición química orgánica del medio MS a 1x.

Masa molecular Cantidad

Protocolo de preparación de 1 l de MS:

1. Los compuestos inorgánicos se diluyen en 0.5 l de agua destilada y desionizada agregando 10 ml de

También podría gustarte

yijkl= µ + αi + βj + γk + + δl + (αβ)ij + (αγ)ik + (αδ)il + (αγ*δ)ijk + ɛijkl donde: