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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
MANUAL DE LABORATORIO
INOCUIDAD MICROBIANA DE LOS ALIMENTOS
AUTORES:
M. en C. JUAN CARLOS BENITEZ SERRANO.
M.S.P. CARLOS CABRERA MALDONADO.
D en C. ANA MARTA DE LOS ANGELES LOBO SANCHEZ.
M.S.P. JESUS LUZURIAGA GALICIA.
D. en C. FAUSTO TEJEDA TRUJILLO.
M.S.P. CLAUDY LORENA VILLAGRÁN PADILLA.
2013
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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
ÍNDICE
NÚMERO DE TÍTULO PÁGINA
PRÁCTICA
Práctica 1 Fundamentos del Lab. de Inocuidad Microbiana de los
Alimentos 3
Práctica 2 Preparación de medios de cultivo 8
Práctica 3 Preparación de diluciones 11
Práctica 4 Recuento de bacterias mesofílicas aerobias por la técnica 14
vaciado en placa
Práctica 5 Recuento de bacterias coliformes totales por la técnica de 18
vaciado en placa
Práctica 6 Recuento de bacterias lácticas por vaciado en placa 21
Práctica 7 Recuento de hongos y levaduras por vaciado en placa 24
Práctica 8 Recuento de Staphylococcus aureus por la técnica de 27
extensión en superficie
Práctica 9 Cuantificación de Bacillus cereus 30
Práctica 10 Determinación de bacterias coliformes fecales por la 33
técnica del número más probable.
Práctica 11 Investigación de Salmonella spp 36
Práctica 12 Cuantificación der Clostridium perfringens 41
Práctica 13 Investigación de Vibrio cholerae O1 44
Práctica 14 Determinación de Vibrio parahaemolyticus por la técnica 46
de N.M.P.
Práctica 15 Determinación de Listeria monocytogenes 48
Práctica 16 Análisis microbiológico de alimentos enlatados 52
Bibliografía 57
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Práctica No. 1
Fundamentos del laboratorio de Inocuidad Microbiana de los Alimentos
Introducción.
La Inocuidad Microbiana de los Alimentos es una rama de la Ciencia de los Alimentos, cuyo
objetivo es ayudar a la elaboración de alimentos sanos inocuos o de buena calidad sanitaria,
considerando sus características generales, su ecología, su resistencia al medio ambiente, su
capacidad para sobrevivir y desarrollar en los propios alimentos, las consecuencias de ese
desarrollo y los factores que influyen en todo esto. Actualmente son cuatro los grupos de interés
sanitario, los que llenan el campo de acción de la Inocuidad Microbiana de los Alimentos:
a) Microorganismos deterioradores.
b) Microorganismos indicadores.
c) Microorganismos patógenos, y
d) Microorganismos útiles para el hombre
Los microorganismos deterioradores son aquellos que afectan las características organolépticas
de los alimentos, con ellos se estudian los tipos de procesos que tienen lugar, las causas que los
propician y desencadenan y los medios para evitarlos y controlarlos.
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Los microorganismos patógenos, definidos como aquellos que pueden causar algún daño a la
salud. Por razones obvias, en el presente manual se describirán sólo algunas de las bacterias
patógenas vehiculizadas por alimentos.
Los microorganismos útiles para el hombre, son aquellos que se han adicionado intencionalmente
a los alimentos con el propósito de proporcionar alguna característica organoléptica especial.
En el proceso de control la acción primaria que se pone en juego es la inspección. De ella puede
emerger la necesidad de practicar análisis de laboratorio en muestras de alimentos, materias
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primas, especímenes humanos, superficies del equipo, agua, del producto durante su
procesamiento o del medio ambiente.
Agréguese a lo anterior, que desde el punto de vista puramente analítico, los resultados del
laboratorio dependen de:
a) Las condiciones en que se efectúo el muestreo y el transporte de la muestra.
b) La técnica de análisis utilizada.
c) La calidad de los reactivos y medios de cultivo.
d) La destreza del técnico que ejecuta el análisis.
e) El apego que observe el analista a la técnica prescrita.
f) La presencia de sustancias que interfieren con el desarrollo microbiano, y
g) El estado fisiológico de los microorganismos presentes.
Así el resultado es sólo una expresión convencional de la imagen microbiana de un producto,
configurada en función de todos esos factores.
Al interpretar, por otra parte el resultado de un análisis de laboratorio hay que considerar otros
elementos. La flora microbiana de un alimento está fuertemente condicionada por la tecnología
utilizada en su fabricación y por la protección que se le confiera contra el ingreso de
microorganismos y su multiplicación. La abundancia y distribución de esos microorganismos en
el medio ambiente a su vez se encuentra muy afectadas por las condiciones que en él imperen y
5
aún por los hábitos de las comunidades. La falta de objetividad al interpretar el hallazgo y
abundancia de determinados grupos de microorganismos lleva fácilmente a conclusiones
erráticas.
RECUENTOS MICROBIANOS
Con mucha frecuencia es necesario determinar el número de microorganismos que contiene el
agua y los alimentos, durante su fabricación y control sanitario. Entre los objetivos perseguidos
pueden citarse los siguientes:
a) Tendencia a correlacionar la abundancia de ciertos microorganismos en algunos alimentos
y las condiciones sanitarias en las que fueron elaborados y/o conservados: bacterias
mesofílicas aerobias en leche y hongos en mantequilla.
b) Determinar la calidad sanitaria de las materias primas: cuenta microscópica en leche,
hongos en salsa de jitomate, etc.
c) Evaluar la eficiencia de un proceso de desinfección, purificación o pasteurización:
coliformes en aguas negras, coliformes en ostiones, mesofílicos aerobios en equipos y
envases.
d) Determinar el adecuado funcionamiento de cultivos microbianos en la obtención de
alimentos madurados: bacterias lácticas en quesos.
e) La probabilidad de incriminar algunas bacterias como causa de toxiinfección alimentaria:
S. aureus, C. perfringens y B. cereus.
f) Grado de frescura que el alimento guarda: bacterias lácticas en salchichas.
g) Determinación, en algunos casos, de la vida de anaquel de un alimento: bacterias
psicrofílicas en leche cruda.
h) La evaluación de los medios de cultivo y agentes bacteriostáticos que se incluyen en su
formulación.
Dada la gran versatilidad de los microorganismos en cuanto a sus demandas nutricionales y
condiciones para desarrollar (tipo y concentración de nutrientes, acidez, potencial
oxidorreducción, salinidad, estado fisiológico de las células, etc.) y de las condiciones del
material por estudiar (presencia de inhibidores, presencia de flora asociada, humedad, etc.) no es
posible disponer de un solo medio de cultivo que permita la proliferación de todas las variedades,
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y dentro de cada una de éstas, de todas las células viables presentes. Por estas razones más que
recuentos lo que estas técnicas proveen son medios para estimar contenido microbianos.
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Práctica No. 2
Preparación de medios de cultivo
Introducción.
Medio de cultivo es un sustrato que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo de los
microorganismos. Comercialmente se presenta desecado en forma de polvo fino o granular,
aunque puede presentarse también hidratado y preparado. Por su aspecto físico, los medios de
cultivo preparados pueden ser: líquidos, semisólidos y sólidos.
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b) Medios de enriquecimiento: medios líquidos que contienen inhibidores y que por lo tanto
estimulan el desarrollo un microorganismo e inhiben el desarrollo de otros.
c) Medios selectivos y diferenciales: medios sólidos que contienen inhibidores y que por lo
tanto estimulan el desarrollo un microorganismo e inhiben el desarrollo de otros.
d) Medios de transporte: sirven para transportar los especímenes que contienen a los
microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a
efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se altere la proporción original de la
flora microbiana en los especímenes.
Objetivo.
Desarrollo.
1. Leer las cuidadosamente las instrucciones del fabricante, teniendo cuidado principalmente
en las condiciones de esterilización o adición de algún material extra.
2. Hacer los cálculos necesarios para conocer la cantidad de medio de cultivo necesario de
acuerdo al volumen que se va a preparar.
3. Seleccionar un recipiente de por lo menos el doble del volumen a preparar.
4. Medir la cantidad de agua necesaria y depositar una parte de esta en el recipiente
seleccionado.
5. Pesar con ayuda de una balanza granataria o digital.
6. Agregar el medio en el recipiente, agitar suavemente y adicionar el resto del volumen de
agua.
7. En el caso de los agares y de algunos caldos, disolver con ayuda de calor.
8. Ya disuelto, colocar en frascos o tubos.
9. Esterilizar de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Cuestionario.
1. Defina ¿qué es un medio de cultivo?
2. ¿Cómo se clasifican?
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3. ¿Cuál es la característica principal de un medio de pre enriquecimiento?
4. Qué diferencia existe entre un medio de cultivo de enriquecimiento y uno selectivo y
diferencial?
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Práctica No. 3
Preparación de diluciones
Introducción.
Esta práctica está orientada a proporcionar las guías generales para la preparación de diluciones
para el examen microbiológico de alimentos. En vista de la gran cantidad de productos en este
campo de aplicación, estas guías pueden ser inapropiadas para todos ellos en forma detallada y
para otros requerirse otros métodos diferentes. Sin embargo, en todos los casos donde sea
posible se recomienda apegarse a estas guías y modificarse únicamente cuando sea necesario.
La dilución primaria tiene por objeto obtener una distribución lo más uniforme posible de
los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el análisis.
Objetivo:
Realizar las diluciones decimales necesarias para realizar los recuentos de los diferentes
microorganismos de interés sanitario, utilizados para la determinación de su calidad sanitaria.
Desarrollo:
Preparación de la dilución primaria.
Muestras líquidas:
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I. Muestras líquidas como agua, leche, refrescos, etc., en las cuales la distribución de
microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos.
II. Muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo
en baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 min y homogeneizar agitando
vigorosamente.
El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por
ejemplo, aquellos con partículas agudas o constituyentes que no se dispersen fácilmente).
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b) Agitar el tubo 25 veces en un ángulo de 30 cm durante 7 seg, o bien, durante 10 seg con
ayuda de un agitador Vortex.
c) La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular,
dependen de:
d) Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se
hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la
capacidad total de la pipeta.
e) Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad
total, escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en una área de la caja Petri sin
líquido.
f) Mientras sé afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del
cuello del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe
inclinarse lo necesario.
Cuestionario.
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Práctica No. 4
Recuento de bacterias mesofílicas aerobias por la técnica de vaciado en placa
Introducción.
Este grupo de microorganismos indicadores es el que con mayor frecuencia se utiliza en la
Microbiología Sanitaria. El recuento de colonias bacterianas en medios de cultivo con un
adecuado soporte nutricional y libre de agentes inhibidores es ampliamente utilizado con diversos
propósitos en el análisis de alimentos, perecederos o no, agua, equipo y otros productos. Se
pretende contar el máximo número de microorganismos, y cuando la incubación se ha realizado
entre 20-37º se le designa como “recuento de bacterias mesofílicas aerobias”.
El estudio de la flora bacteriana mesofílica aerobia es la prueba más utilizada para todos
aquellos propósitos que tienden a explorar el efecto de diferentes agentes físicos y químicos en la
microbiología de un alimento durante su fabricación o conservación, cuando no existe un
problema concreto que implique el uso de otros grupos indicadores específicos. Solo las bacterias
psicrotrófas la sustituyen o la complementan en el caso de los productos para los que suele
emplearse la refrigeración.
Objetivo:
Realizar el recuento de bacterias mesofílicas aerobias a partir de agua y alimentos e
interpretar su significado sanitario.
Desarrollo:
Preparación de material y de muestras
1. Estimar el número de cajas, pipetas y frascos o tubos de dilución que se vayan a necesitar.
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2. Anota clave, fecha y demás información que permita identificar la caja dentro del estudio.
Hacer las anotaciones en la tapa de la caja procurando reducirlas al mínimo.
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El uso de la licuadora tiene efectos variados sobre los microorganismos y el alimento,
por lo que se recomienda actualmente el uso de un homogenizador (Stomacher).
Se recomienda no exceder de 20 min desde que el producto fue puesto en contacto con
el diluyente hasta su incorporación con el medio de cultivo.
Las mediciones de los volúmenes de muestras, diluciones e inóculos constituyen una
importante fuente de error cuando la maniobra no se realiza en forma correcta.
3. Agitar los frascos o tubos con diluyente y muestra siempre en la misma forma: 25
movimientos en un arco de 30 cm completados durante 7 seg. Si existe una cantidad
excesiva de partículas mayores en suspensión o grasa, dejar sedimentar o flotar y tomar la
alícuota hacia el centro del recipiente.
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Incubación.
La determinación de bacterias mesofílicas aerobias suele requerir de temperaturas y
tiempos de incubación: que dependen del producto en estudio: 24 h en el agua, 48 en la leche y
72 en alimentos desecados.
Recuentos de colonias.
El recuento de las colonias por sí mismo demanda cuidado, habilidad, conocimientos y
responsabilidad a fin de incluir en el todas aquellas que han desarrollado y no más que puedan
resultar por error o confusión.
Para efectuar el recuento es necesario contar con un contador de colonias tipo Quebec que
permite la iluminación adecuada sobre un fondo oscuro, un buen aumento y una guía
cuadriculada que facilita el trabajo.
Cuestionario:
1. ¿Cuál es el fundamento del recuento por la técnica de vaciado en placa?
2. ¿Qué superficie tiene la caja de vidrio?
3. ¿Cómo se agitan los tubos en que se hacen las diluciones?
4. ¿A qué temperatura se mantienen los medios de cultivo ya fundidos?
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Práctica No. 5
Recuento de bacterias coliformes totales por la técnica de vaciado en placa
Introducción.
El concepto de bacterias coliformes, fue aplicado en un principio para referirse a todas
aquellas bacterias semejantes a Escherichia coli. Los coliformes se definen como bacterias
aerobias o facultativamente anaerobias, Gram negativas, no esporuladas, que fermentan la lactosa
con producción de gas dentro de las primeras 48 h de incubación a 35º. De acuerdo con el
desarrollo de las técnicas bacteriológicas, al diseñarse medios como el agar bilis-rojo violeta se
encontró conveniente limitar el período de incubación de las placas a 24 h y por razones de orden
práctico, aquellas colonias que presentan una determinada apariencia al término del periodo de
incubación, se considera como coliformes.
Hay que hacer notar que existen cepas aberrantes (muestran cierta morosidad para
fermentar la lactosa) que no se cuentan como coliformes por su comportamiento en esos medios.
Objetivo.
Realizar el recuento de bacterias coliformes totales a partir alimentos e interpretar su
significado sanitario.
Desarrollo.
Preparación de material y de muestras.
1. Estimar el número de cajas, pipetas y frascos o tubos de dilución que se vayan a necesitar.
2. Anota clave, fecha y demás información que permita identificar la caja dentro del estudio.
Hacer las anotaciones en la tapa de la caja procurando reducirlas al mínimo.
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Preparación, selección y medición de la alícuota.
1. La muestra recolectada de un lote debe suponerse representativa de éste. Esa muestra a su
vez es objeto de un nuevo muestreo cuando se extrae de ella la alícuota que se va a analizar.
Habrá por tanto, de retirarla cuidando de no incurrir en una selección o contaminación.
2. Efectuar la medición o pesada sobre la mesa de trabajo dentro del orden y cuidado
necesarios para evitar contaminaciones. El sobrante de la muestra conviene conservarlo en
refrigeración, en previsión de algún accidente.
3. El retiro de la alícuota obliga al empleo de utensilios estériles y fácilmente manejables.
Para este fin puede hacerse uso de cucharas, cuchillos, espátulas, abatelenguas y pinzas.
4. Cuando el producto es sólido y muy heterogéneo (alimento cocinado) macerar o dividir
finamente una muestra grande (100-500 g) y a partir de ésa obtener la alícuota por analizar.
5. De especial interés es el tamaño de la alícuota. Puede establecerse que la precisión y
exactitud de los resultados mejoran conforme se hace uso de una alícuota de mayor tamaño.
Alícuotas menores a 10 g deben evitarse.
6. Los productos líquidos se miden con pipeta de capacidad conveniente, de preferencia con la
correspondiente al volumen a medir.
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primera dilución hasta la incorporación del medio de cultivo a todas las cajas no excederá de
20 min.
2. Una vez gelificado el medio, agregar una sobrecapa de 3 – 4 mL.
3. Incluir cada día y para cada lote de medio de cultivo y diluyente, cajas control preparadas en
idéntica forma, omitiendo la adición de muestra.
4. El medio de cultivo que se utilice debe corresponder precisamente al que se especifique para
cada caso.
Incubación
La determinación de bacterias coliformes totales se incuban por 24 h a 35°C.
Recuentos de colonias.
Solo se contaran aquellas colonias de color rojo o guinda con o sin halo rosa, redondas o
elipsoidales y que se encuentren dentro del seno de agar.
Cuestionario.
1. ¿A que se debe el color rojo o guinda de las colonias en el agar rojo violeta bilis?
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Práctica No. 6
Recuento de bacterias lácticas, por la técnica de vaciado en placa
Introducción.
En la actualidad se definen como “bacterias Gram positivas, no esporuladas, fermentadoras de
carbohidratos con producción del ácido láctico, tolerantes a los ácido (capacidad para desarrollar
a pH relativamente bajos), catalasa negativa y hábitat no aeróbico”. Todas las cualidades
admiten cierta flexibilidad, a excepción de la tinción de Gram. Entre los lácticos existen especies
psicrófilas, mesófilas y termófilas. El grupo comparte entre sus miembros una característica
significativa: son nutricionalmente exigentes.
Ecología.
a) En vegetales: aunque no se recuperan constantemente a partir del suelo, al parecer esto se
favorece con la participación de insectos.
b) En los alimentos: existen normalmente en una gran variedad de alimentos tanto crudos
(verduras y frutas) como procesados (lácteos y cárnicos) en número variable.
c) En animales y hombre: las bacterias lácticas se localizan en el intestino, cavidad oral y vagina,
donde juegan un papel importante en la salud. Materia fecal del hombre, pollos y cerdos: 300
millones UFC/g. En la cavidad oral pueden originar un efecto patógeno, ya que la dentina es
susceptible a la acción de los ácidos provenientes de las fermentaciones. En la vagina, los
lactobacilos constituyen parte de la flora normal. Su presencia se relaciona con una baja
notable de la acidez de esta zona. Por mucho tiempo se pensó que solo L. acidophilus,
constituía la única especie que colonizaba la vagina, pero estudios recientes han demostrado la
presencia de L. plantar, L. fermenta, L. bullerais y otros.
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Objetivo.
Realizar el recuento e identificación de las bacterias ácido lácticas a partir de productos
fermentados comerciales.
Desarrollo.
Preparación de material y de muestras
1. Estimar el número de cajas, pipetas y frascos o tubos de dilución que se vayan a necesitar.
2. Anota clave, fecha y demás información que permita identificar la caja dentro del estudio.
Hacer las anotaciones en la tapa de la caja procurando reducirlas al mínimo.
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Colocar 1 mL de cada dilución en el fondo de la caja y destapar ésta solo lo suficiente
para introducir la pipeta con una inclinación de unos 45ºC. No soplar.
Incubación.
La determinación de hongos y levaduras se incuban a 30°C por 48 h.
Recuentos de colonias.
Se contaran como bacterias ácido lácticas aquellas colonias de color blanco – amarillento,
de 1 a 3 mm de diámetro.
Cuestionario.
1. ¿Qué características comunes presentan las colonias de bacterias ácido láctico?
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Práctica No. 7
Recuento de hongos y levaduras por la técnica de vaciado en placa
Introducción.
Es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto que al
establecer la cuenta de estos microorganismos, permite su utilización como un indicador de
prácticas sanitarias inadecuadas durante la producción y el almacenamiento de los productos, así
como el uso de materia prima inadecuada.
Objetivo.
Realizar el recuento de hongos y levaduras a partir alimentos e interpretar su significado
sanitario.
Desarrollo.
Preparación de material y de muestras.
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1. Estimar el número de cajas, pipetas y frascos o tubos de dilución que se vayan a necesitar.
2. Anota clave, fecha y demás información que permita identificar la caja dentro del estudio.
Hacer las anotaciones en la tapa de la caja procurando reducirlas al mínimo.
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rotación de la caja alternando con 6 movimientos circulares y 6 rectos de izquierda a derecha.
Evitar el derrame de líquido o contacto con la tapa de la caja. El tiempo transcurrido desde la
preparación de la primera dilución hasta la incorporación del medio de cultivo a todas las cajas
no excederá de 20 min.
2. Incluir cada día y para cada lote de medio de cultivo y diluyente, cajas control preparadas en
idéntica forma, omitiendo la adición de muestra.
3. El medio de cultivo que se utilice debe corresponder precisamente al que se especifique para
cada caso.
Incubación.
La determinación de hongos y levaduras se incuban a 22°C por 3 – 5 días.
Recuentos de colonias.
Se contaran como hongos aquellas colonias de aspecto algodonoso de cualquier color,
mientras que las colonias de levaduras, son de generalmente de color blanco, aunque algunas
llegan a presentar diferentes colores.
Cuestionario.
1. ¿Qué función tiene el ácido tartárico adicionado al agar papa dextrosa?
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Práctica No. 8
Recuento de Staphylococcus aureus por la técnica de extensión en superficie
Introducción.
Las técnicas para el recuento de colonias por inoculación en superficie poseen atributos que para
ciertos propósitos desplazan a las de vaciado en placa. Las técnicas más frecuentemente
utilizadas son: la técnica de la gota de Miles y Misra y la de extensión en superficie. La técnica
es utilizada para la cuantificación de S. aureus.
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temperatura óptima de crecimiento es de 30-37ºC. Frecuentemente son recuperados a partir de
alimentos, polvo y agua. Produce una toxina termoestable causante de intoxicaciones
alimentarias. S. aureus es el típico microorganismo causante de una intoxicación alimentaria. Se
ha estimado que éste microorganismo es el responsable de alrededor de un 13 a 30% de las
enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s) en los Estados Unidos. Algunos autores
marcan que el número en casos de dicho envenenamiento alimentario oscila aproximadamente
entre 1 millón y 2 millones por año. La forma de contaminar a los alimentos es por toser o
estornudar en los mismos, aunque usualmente es cuando se presenta un manipuleo por portadores
asintomáticos.
Objetivo.
Conocer un método alternativo de recuento de bacterias y valorar sus ventajas con
respecto a la técnica de vaciado en placa.
Desarrollo.
Preparación de material, muestras, selección y medición de la alícuota y de las diluciones.
Semejante que en la técnica de vaciado en placa.
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Inoculación de las cajas
Colocar 0.1 mL de cada dilución seleccionada sobre placas con Agar Baird Parker.
Extender con ayuda de una varilla de vidrio, hasta que el inóculo se seque.
Incubación.
Semejante que en la técnica de vaciado en placa.
Recuentos de colonias.
Semejante que en la técnica de vaciado en placa.
Cuestionario.
1. Cite por lo menos 4 ventajas de la técnica de extensión en superficie, sobre la de vaciado
en placa.
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Práctica No. 9
Cuantificación de Bacillus cereus
Introducción.
El interés sanitario por este microorganismo se ha manifestado hasta hace muy pocos años en
América, aunque el primer reporte confirmado de su papel como agente etiológico de
gastroenteritis se remota al año de 1950 en Europa.
Bacillus cereus pertenece al tipo de los bacilos aerobios esporulados, cuyo cuerpo no se
deforma por la espora, es vacuolado y tiene un diámetro mayor de 0.9 micras por 2.9 a 5.2 de
longitud. Forma cadenas cortas o hasta de 10 células y sus esporas son ovales y centrales o
paracentrales. La bacteria es móvil y los extremos de su cuerpo cuadrados o ligeramente
redondos. Es Gram positivo, aerobio, catalasa positiva, hidroliza el almidón, la caseína y
fermenta la glucosa, sacarosa y trehalosa. Es Voges-Proskauer positivo y reduce los nitratos a
nitritos. No fermenta la xilosa, lactosa, sorbitol, inositol, manitol, arabinosa, galactosa, manosa y
dulcitol; no produce H2S ni indol. Produce beta hemolisis. El germen es resistente a la acción de
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alimentos cocinados o procesados, en los cuales el tratamiento antibacteriano aplicado
(fumigación con óxido de etileno o de propileno, o el calor) no es bastante para destruir al
germen presente en los ingredientes utilizados.
Objetivo.
Cuantificar Bacillus cereus a partir de alimentos involucrados en brotes de intoxicación
alimentaria.
Desarrollo.
Preparación de material, muestras, selección y medición de la alícuota y de las diluciones
Semejante que en la técnica de vaciado en placa.
Incubación.
Incubar las placas ya inoculadas, a 30°C por 24 h en condiciones de aerobiosis.
31
Recuentos de colonias.
Serán consideradas colonias sospechosas de ser B. cereus, aquellas de color rosa, planas, con
aspecto de vidrio esmeril y que presenten un halo transparente.
Cuestionario.
1. ¿Mencione las características morfológicas de B. cereus en el medio MYP?
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Practica No. 10
Determinación de bacterias coliformes por la técnica del número más
probable (N.M.P.)
Introducción.
N.M.P. es el valor que resulta de la estimación de un contenido microbiano, con base a la
probabilidad, cuando se aplica una técnica en tubo de dilución múltiple en el análisis de un
producto. Esta técnica se recomienda emplear cuando se estima que el grupo o microorganismos
sometidos a estudio se encuentran en baja concentración ó se encuentran estresados.
Las bacterias coliformes son un grupo heterogéneo compuesto por varios subgrupos.
Existe poca evidencia que indique que estas bacterias pertenezcan a un solo género taxonómico.
La falta de certeza en cuanto a su filiación taxonómica y la imprecisa correlación entre los
métodos recomendados para la detección de coliformes han presentado problemas. El primero, es
que aunque, Escherichia coli es aceptada como bacteria coliforme, la especie contiene variantes
33
que no producen gas de la lactosa o lo hacen después de 48 h, por lo que no se les identifica por
medio de ésta técnica. Segundo, la capacidad de fermentar la lactosa está frecuentemente
asociada a genes localizados en plásmidos. Estos determinantes extracromosomales son
fácilmente transferidos entre otras bacterias Gram negativas no relacionadas a las coliformes, que
pueden, en consecuencia, ser recuperadas en la etapa inicial del análisis. No obstante en la
práctica, la técnica ha demostrado su efectividad. El número de organismos se establece mediante
la cuenta de unidades formadoras de colonias (UFC) o el uso de la técnica del número más
probable. Esta última, también llamada técnica de dilución en tubo, proporciona una estimación
estadística de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos
con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado.
Objetivo.
Conocer una técnica para estimar el número de coliformes, u otros grupos, presentes en
productos alimenticios, por medio del cálculo del número más probable (NMP) después de la
incubación a 35°C en un medio líquido.
Desarrollo.
Este procedimiento puede aplicarse a agua potable, agua purificada, hielo y alimentos
procesados térmicamente, así como a muestras destinadas a evaluar la eficiencia de prácticas
sanitarias en la industria alimentaria. Este procedimiento debe seleccionarse cuando la densidad
esperada es como mínimo de una bacteria con 10 mL de producto líquido y una bacteria por
gramo de alimento sólido.
Cuando la densidad bacteriana sea menor que la aquí citada y si la naturaleza del alimento
lo permite, utilizar el método de filtrado en membrana. Si la densidad microbiana se espera sea
mayor a 100/mL o g de muestra, ampliar el intervalo de diluciones o utilizar el método en placa.
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A partir de la muestra recolectada, separar 10 g de esta y colocarla en un frasco con 90
mL de diluyente. A partir de esta dilución, preparar las diluciones 1:100 y 1:1,000.
a) Prueba presuntiva.
Transferir 1 mL de cada dilución a 3 tubos con 10 mL de caldo lauril sulfato de sodio (se
inoculan un total de 9 tubos). Utilizar una pipeta estéril para cada dilución. Incubación. Incubar
los tubos a 35°C/24 h y observar si hay formación de gas, en caso contrario prolongar la
incubación hasta 48 h.
b) Prueba confirmativa
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y sembrar en un número
igual de tubos con 3 mL de caldo EC Incubar a 44.5°C/24 h.
Interpretación de resultados.
Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas después del
periodo de incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes.
Informe de la prueba.
“Número más probable (NMP) de coliformes por g o mL de muestra” y para el caso de
muestras de agua informar NMP/100 mL.
Cuestionario.
1. ¿Cuándo es recomendable utilizar la técnica del N.M.P.?
35
BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
Practica No. 11
Investigación de Salmonella spp
Introducción:
Son bacilos Gram negativos aerobios o facultativamente anaerobios, móviles por flagelos
perítricos, no esporulados, catalasa positiva, oxidasa negativa, fermentan la glucosa, producen
gas, no fermentan la lactosa ni la sacarosa, no producen indol, no hidrolizan la urea,
descarboxilan la arginina, lisina y ornitina, temperatura mínima de crecimiento 6.6-7.7ºC, con
una temperatura óptima de 37ºC. Los miembros del género Salmonella han sido muy estudiados
como patógenos cuando se encuentran presentes en los alimentos. El control de este
microorganismo, tanto por parte de las autoridades sanitarias, como en las plantas procesadoras
de alimentos, depende en cierta medida del método analítico utilizado para su detección. Las
modificaciones a los métodos consideraron dos aspectos principales, el primero es el
debilitamiento o daño a las células bacterianas presentes en un alimento, debido al proceso a que
está sujeto (por ejemplo: tratamiento térmico, secado, etc.) y segundo, la variabilidad inherente a
la naturaleza del producto bajo estudio.
36
1. Pre enriquecimiento. Es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no
selectivo que permite restaurar las células de Salmonella dañadas a una condición fisiológica
estable.
2. Enriquecimiento. Empleado con el propósito de incrementar las poblaciones de Salmonella e
inhibir otros organismos presentes en la muestra.
3. Aislamiento en medios sólidos. En este paso se utilizan medios selectivos que restringen el
crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y permite el reconocimiento visual de
colonias sospechosas.
4. Identificación bioquímica. Este paso permite la identificación genérica de los cultivos de
Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.
5. Confirmación serológica. Es una técnica que permite la identificación plena del género e
incluso el serotipo de Salmonella. Esta técnica es de gran importancia en el estudio de brotes
de intoxicación alimentaria.
Objetivo.
Investigar la presencia de Salmonella spp a partir de alimentos, mediante la utilización de
pasos de pre-enriquecimiento, enriquecimiento, aislamiento selectivo y diferencial, identificación
bioquímica y confirmación serológica.
Desarrollo.
Preparación de la muestra.
El siguiente método se basa en el análisis de 25 g. de la muestra en una proporción de
1:10 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma
proporción.
Pre enriquecimiento
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril
para trabajar en homogeneizador (Stomacher). Adicionar 225 mL del medio de pre
enriquecimiento estéril (generalmente caldo lactosado) y homogenizar en Stomacher si es
necesario durante 1 min. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente
estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con
37
la tapa bien enroscada. Ajustar el pH si es necesario, a 6.8+0.2 con NaOH 1N o HCl 1N estériles.
Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar 24+2 h. a 35°C.
Enriquecimiento.
Cerrar firmemente el tapón de rosca de los recipientes con los cultivos de pre
enriquecimiento y agitar suavemente, transferir 1 mL de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml.
de caldo tetrationato adicionado de 0.2 mL de yodo y a otro con 10 mL de caldo Rappaport-
Vassiliadis. Incubar de 18-24 h. a 43 y 35°C respectivamente.
Aislamiento de Salmonella.
Al término de la incubación, mezclar los tubos de enriquecimiento, estriar en agar verde brillante
y agar sulfito de bismuto. Incubar las placas por 24-48 h a 35°C, respectivamente.
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella de acuerdo con
las siguientes características:
a) Agar verde brillante: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por un halo
rojo, las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias verdes o verde-amarillas.
b) Agar sulfito de bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras:
con o sin brillo metálico. Generalmente presentan un halo café, tornándose posteriormente
negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro.
Identificación bioquímica.
Seleccionar las colonias típicas de cada medio selectivo que se encuentren bien aisladas.
Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular tubos con: agar triple azúcar hierro (TSI) y
agar hierro lisina (LIA) (por estría en la superficie inclinada y por punción en el fondo), y medio
MIO (por punción). Incubar por a 35°C/24 h.
38
debido a la no fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se
observa coloración negra a lo largo de la punción debido a la producción de ácido sulfhídrico.
b) Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación
de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo
en el fondo del agar. La mayoría de las cepas de Salmonella producen H2S en este medio con
ennegrecimiento a lo largo de la punción.
c) Medio MIO: Se observa un color gris-púrpura debido a la descarboxilación de la ornitina.
Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo
del medio.
Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en
los medios TSI y LIA para las pruebas serológicas.
Identificación serológica.
Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero polivalente O)
Colocar con un asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos.
Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en LIA. Agregar a una
de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el canto del asa o
empleando aplicadores de madera.
Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente 1 min
Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro. Considerar cualquier grado de
aglutinación como positiva
39
Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el
subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser
los más frecuentes). Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y
efectuar la prueba. Si hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la
aglutinación con el antisuero polivalente O.
Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4
a 6 h a 35° hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya
tripticasaína e incubar a 35ºC/24 h (para ensayo al día siguiente). Adicionar 2.5 mL de solución
salina formalizada a 5 mL del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI).
Colocar 0.5 mL del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología
(13x100 mm aproximadamente). Adicionar 0.5 mL del cultivo formalizado. Preparar un control
de solución salina mezclando 0.5 mL de solución salina formalizada con 0.5 mL del antígeno
formalizado. Incubar las mezclas en baño de agua a 48-50°C. Observar a intervalos de 15 min por
espacio de 1 h. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la mezcla de prueba
pero no en el control. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las
mezclas muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba
inespecífica.
Cuestionario.
1. ¿Qué enfermedades producen los miembros del género Salmonella?
2. ¿Qué ventajas y desventajas tiene el ejecutar la etapa de pre-enriquecimiento?
3. ¿Cuál es el límite permitido de Salmonella en alimentos?
4. ¿A qué temperatura debe incubarse el caldo tetrationato?. Justifique su respuesta.
40
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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
Practica No. 12
Cuantificación de Clostridium perfringens
Introducción.
C. perfringens es un microorganismo que normalmente se encuentra en el contenido intestinal del
hombre y de muchos animales, así como en el suelo y en el agua. Es probablemente la bacteria
anaerobia patógena al hombre más extensamente estudiada. Durante los pasados 90 años, esta
bacteria había sido asociada más cercanamente con la gangrena gaseosa.
Objetivo.
Realizar el recuento de una de las bacterias anaerobias más frecuentemente involucrada en
intoxicaciones alimentarias.
Desarrollo.
1. Se recolectan muestras entre 25 y 30 g en frascos estériles y se transportan en enfriamiento
rápidamente para su procesamiento y análisis. En un área estéril, auxiliándose de cubiertos en
las mismas condiciones, se pesan 15 g de la muestra del alimento en el interior del vaso de una
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licuadora previamente tarado. Se adicionan 135 mL de agua peptonada al 1% y sé licuan
durante 1 min (dilución 1:10).
2. Se continúan las diluciones decimales en tubos conteniendo 9 mL de agua peptonada al 1% a
partir de la dilución 1:10, hasta la dilución 1:100,000. Los tubos deberán agitarse 25 veces en
un ángulo de 30 cm durante 7 seg.
3. Se inocula por la técnica de extensión en superficie, 0.1 mL por dilución en una caja de Petri
conteniendo 20 mL de Agar SFP (Shahidi-Ferguson-Perfringens) y en otra con Agar TNS
(Triptosa-Sulfito-Neomicina), se deja que se absorba la muestra en la superficie y se agrega
una sobrecapa de 10 mL de medio basal, estéril y mantenido a 45ºC.
4. Incubar en anaerobiosis a 35ºC/18-24 h.
5. perfringens forma colonias típicas negras de 2-4 mm de diámetro con un halo opalescente. Se
selecciona la placa que contenga entre 50 y 100 UFC sospechosas. Reportar este dato,
considerando la dilución de la muestra, como el contenido presuntivo de C. perfringens/g de
alimento.
6. Confirmar el estudio de la siguiente forma:
Transferir por separado 10 colonias bien aisladas de la placa seleccionada a tubos con caldo
tioglicolato. Incubar a 35ºC/18 a 24 h en anaerobiosis.
Tomar una asada del caldo incubado y realizar un frotis que será tenido por la técnica de
Gram, con la finalidad de comprobar la pureza del cultivo. En caso de estar contaminado,
se hace una resiembra en placas de SFP o de TNS.
Si se cuenta con un cultivo puro, se inoculan tubos con: gelatina-lactosa, leche tornasolada
y movilidad-nitrato. El primer y el tercer tubo se inoculan por picadura y se sellan con una
sobrecapa de aceite mineral. El segundo tubo se inocula con 1 mL de caldo tioglicolato
adicionado con una pipeta Pasteur en el fondo del tubo. Se incuban a 35ºC/18-24 h en
anaerobiosis.
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número de colonias presuntivas contadas en la dilución de la placa seleccionada, calcular en
número de bacterias por gramo de alimento muestreado.
Cuestionario.
1. ¿En qué condiciones de atmosfera, debe incubar las cajas para la investigación de Cl.
perfringens?
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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
Practica No. 13
Investigación de Vibro cholerae O1
Introducción:
Pertenece a la familia Vibrionaceae, filogenéticamente cercana a la familia
Enterobacteriaceae. Mide de 1.5 a 3 de longitud por 0.5 a 0.8 de diámetro, posee cápsula. Se
presenta solo, en parejas o cadenas cortas, que semejan espirilos. Durante el cultivo prolongado
los vibriones pueden convertirse en bacilos rectos, que se parecen a las bacterias intestinales
Gram negativas, estos microorganismos son oxidasa positivos, con excepción de V.
metschnikovii. No son halofílicos pero necesitan trazas de iones sodio para su crecimiento.
Se encuentran en hábitat acuáticos en una gran variedad de salinidad. Son muy comunes
en ambientes marinos, algunas especies se encuentran sobre la superficie y en el contenido
intestinal de animales marinos. También se pueden encontrar en agua dulce donde sobreviven
unas horas y algunas semanas si esta se encuentra contaminada con materia orgánica y tiene un
pH entre 6 y 9. Es susceptible a la desecación, la ebullición, el cloro, otros desinfectantes y a las
tetraciclinas. V. cholerae sobrevive por periodos hasta de 7 días fuera del organismo,
especialmente en ambientes húmedos y templados.
V. cholerae sé subclasifica con base en sus antígenos somáticos (Ag O), en 139 serovares
que se denominan con números, de tal manera que se hace referencia a V. cholerae 01, V.
cholerae 02, etc. Es común referirse a todos los serovares diferentes de V. cholerae 01, como V.
cholerae NO 01. Existen 2 biotipos de V. cholerae 01: el biotipo Clásico y el biotipo El Tor, que
pueden ser considerados como dos variantes de un mismo microorganismo. Para fines de
diagnóstico no se requiere especificar el biotipo y ambos pueden tomarse como similares. A su
vez ambos biotipos pueden subdividirse en los subtipos Inaba, Ogawa e Hikojima.
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Objetivo.
Aislar e identificar a Vibrio cholerae, a partir de agua y productos de origen marino.
Desarrollo.
Agua
Es recomendable utilizar la técnica del Hisopo de Moore o de la torunda, la cual se
expone a la corriente por un periodo de 18-24 h.
a) El hisopo es transportado al laboratorio en frascos que contengan 450 mL de agua peptonada
alcalina, de preferencia con pH 10.0. En ellos mismos se incuban por 18-24 h. a 35ºC.
b) Finalizada la incubación, a partir de la superficie del agua peptonada alcalina, se tomara de
una a tres asadas y se inoculará una placa con agar TCBS. Estas se incuban de 18-24 h a 35ºC.
V. cholerae, produce colonias amarillas, de 3 a 5 mm de diámetro, planas con bordes
regulares.
c) A partir del TCBS, seleccionar las colonias características e inocular tubos con agar TSI, LIA,
MIO y agua peptonada. Incubar a 35ºC por 18-24 h. V. cholerae, acidifica el TSI, es lisina y
ornitina descarboxilasa positiva, es móvil y produce indol.
d) De obtenerse una bioquímica típica de V. cholerae, confirmar serológicamente con antisuero
polivalente O y antisuero específico
Alimentos.
a) Colocar 50 g de muestra en 450 mL de agua peptonada alcalina.
b) Homogeneizar en licuadora por 1 min e incubar a 35ºC por 18 - 24 h.
c) Continuar como se indica en el inciso b para el análisis de V. cholerae en agua.
Cuestionario.
1. ¿Qué tipo de alimentos pueden ser considerados como vehículo de transmisión de V.
cholerae?
2. Describa la morfología colonial de V. cholerae en el agar TCBS??
3. ¿Qué significa TCBS?
4. ¿Cuál es el mecanismo de patogenicidad de esta bacteria?
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Practica No. 14
Determinación de Vibrio parahaemolyticus por la técnica de N.M.P.
Introducción:
V. parahaemolyticus fue conocido primeramente en Japón como patógeno transmitido por
alimentos 15 años antes de que lo fuera en Estados Unidos de Norteamérica. Se sabe que en
Japón provoca de 300 a 500 brotes anuales, ocupando cuando mucho la primera causa de
gastroenteritis de etiología conocida.(5,7)
Objetivo.
Estimar el contenido de Vibrio parahaemolyticus a partir de productos de origen marino,
mediante la técnica de N.M.P.
Desarrollo.
a) Prueba presuntiva.
Transferir 1 mL de cada dilución a 3 tubos con 10 mL de agua peptonada alcalina (se
inoculan un total de 9 tubos). Utilizar una pipeta estéril para cada dilución. Incubación. Incubar
los tubos a 35°C/24 h y observar si hay turbidez.
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b) Prueba confirmativa
De cada tubo que muestre turbidez, tomar una azada y sembrar en un número igual de
placas con Agar TCBS. Incubar a 355°C/24 h.
c) Prueba completa.
De cada placa con Agar TCBS que contenga colonias azules, planas de 3 – 4 mm de
diámetro, inocular un juego de pruebas bioquímicas (TSI, LIA y MIO ajustadas al 3% de sal).
Interpretación de resultados.
Tomar la serie de tubos de la prueba completa y buscar el NMP en los cuadros
correspondientes.
Informe de la prueba.
“Número más probable (NMP) de V. parahaemolyticus por g o mL de muestra”.
Cuestionario.
1. ¿Qué tipo de enfermedad produce V. parahaemolyticus?
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Practica No. 15
Determinación de Listeria monocytogenes
Introducción.
Es una bacilo Grampositivo, no esporulado, movilidad positiva a 25ºC, crecimiento aerobio a
microaerófilo, con metabolismo fermentativo, producción de ácido, pero no de gas a partir de la
glucosa, catalasa positiva, oxidasa negativa, no presenta cápsula. Se encuentran ampliamente
distribuidas (suelo, agua y vegetación). Causan infecciones en peces, aves y mamíferos (aborto
en vacunos y borregos). Por lo tanto es considerada una enfermedad ocupacional. Produce
listeriosis, cuyas manifestaciones clínicas son: meningitis, infección en órganos sexuales
femeninos, infecciones en recién nacidos o sepsis neonatal (desde conjuntivitis hasta neumonías y
por lo tanto la muerte). En adultos produce faringitis febril y daño a nivel de S.N.C. La bacteria
tiene tropismo positivo hacia S.N.C. y placenta. La listeriosis se presenta en pacientes
inmunocomprometidos.
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aplicarla personal inmunocomprometido ya sea por enfermedad o por el uso de medicamentos,
mujeres embarazadas o personas de edad avanzada.
Objetivo.
Aislar e identificar a la actualmente considerada una bacteria más frecuentemente involucradas
en brotes y casos de enfermedades asociadas al consumo de alimentos.
Desarrollo.
Procedimiento de enriquecimiento.
Tomar una muestra representativa del alimento, tanto de la superficie externa como del
interior. Colocar 25 mL o 25 g de la muestra en un recipiente conteniendo 225 mL de medio de
enriquecimiento (EB), homogeneizar e incubar por 48 h a 30ºC. En el caso de muestras en donde
se sospecha que tienen células de Listeria spp dañadas, se recomienda la incubación en un caldo
de enriquecimiento que contenga piruvato de sodio al 0.1 % (p/v) incubado a 30ºC por 6 h sin
suplementos. Después de las 6 h de incubación los suplementos deben agregarse y continuar la
incubación a 30ºC hasta un total de 48 h.
Aislamiento.
Después de 24 y 48 h de incubación en el medio EB, resembrar en los medios LMP y
OXA. Incubar las placas del medio LMP a 30ºC por 24 a 48 h y las de medio OXA a 35ºC por el
mismo periodo. Observar el crecimiento en las placas del medio LMP con luz blanca en un
ángulo de 45º (iluminación de Henry), a simple vista o con la ayuda de una lupa. En este medio
generalmente aparecen las colonias de color blanco o azul iridiscentes. Ver la figura 1. En el
medio OXA las colonias de Listeria son negras, con halo negro. Algunas colonias pueden
aparecer con un tono café oscuro que se define mejor a los siete días de incubación. Seleccionar
cinco o más colonias típicas del medio de OXA o LMP y pasar a placas de medio ASTEL. Este
paso es importante debido a que las colonias aparentemente aisladas en los medios OXA y LMP
pueden estar contaminadas con flora competitiva parcialmente inhibida, invisible a simple vista.
Debido a que puede estar presente más de una especie de Listeria en la muestra, deben
identificarse como mínimo cinco colonias.
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Identificación.
Entre las pruebas bioquímicas utilizadas se encuentran las siguientes:
a) Prueba de movilidad en fresco. Hacer preparaciones en fresco (en gota suspendida o entre
porta y cubreobjetos) utilizando solución salina al 0.85%. La suspensión debe ser densa y
emulsificarse completamente, y observar con objetivo de inmersión en un microscopio de
contraste de fase o microscopio de campo oscuro. Las células de Listeria son bacilos cortos
con movilidad rotatoria o como si brincaran. Los bacilos con movimientos rápidos no son
Listeria.
b) Prueba de catalasa. Las especies de Listeria son catalasa positiva.
Nota: Cualquier contaminación de eritrocitos puede dar pruebas falsas positivas.
c) Tinción de Gram. Hacer una tinción de Gram de cultivos de 16 a 24 h. Todas las especies de
Listeria son bacilos cortos Gram positivo; sin embargo en cultivos viejos pueden presentarse
como formas cocoides.
d) Prueba de hemólisis. Dibujar una cuadrícula de 20 a 25 espacios en el fondo de la placa de
agar sangre de carnero al 5%. Inocular por picadura un cuadro por cada cultivo. Incubar por
48 h a 35ºC. Al inocular, observar la reacción hemolítica en las placas. L. monocytogenes y L.
seeligeri producen una zona ligeramente clara alrededor del punto de picadura.
e) Prueba de reducción de nitratos. Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35ºC
por 5 días. Para la lectura se debe agregar 0.2 mL del reactivo A y 0.2 mL del reactivo B, un
color rojo indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloración no se observa,
adicionar zinc en polvo. El desarrollo de color rojo después de una hora confirma una prueba
negativa (presencia de nitratos). En forma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 0.2
mL del reactivo B y 0.2 mL del reactivo C. Un color naranja indica una prueba positiva
(presencia de nitritos). Si esta coloración no se observa, adicionar 0.2 mL del reactivo de
cadmio, el desarrollo de un color naranja confirma una prueba negativa (presencia de
nitratos). Este procedimiento alternativo elimina el uso del alfa - naftilamina, que es
carcinogénica.
f) Prueba de movilidad en agar. Inocular el medio SIM o MTM, incubar por 7 días a
temperatura ambiente (20-25ºC), observar diariamente. Las especies de Listeria son móviles,
dando un crecimiento típico en forma de paraguas.
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g) Prueba de utilización de carbohidratos. Inocular tubos de caldo púrpura para fermentación de
carbohidratos al 0,5 %: dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa. Incubar 7 días
a 35ºC. Una coloración amarilla indica una prueba positiva. Todas las especies de Listeria
dan positivas las pruebas para dextrosa, esculina y maltosa.
Cuestionario.
1. ¿Defina que es listeriosis?
3. ¿Cuáles son los alimentos más frecuentemente contaminados con Listeria spp?
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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
Práctica No. 16
Análisis microbiológico de alimentos enlatados
Introducción.
Los productos objeto de esta norma por su naturaleza se clasifican en:
1. Alimentos envasados en recipientes de cierre hermético con pH < 4,6.
a) Alimentos sometidos a tratamiento térmico envasados asépticamente.
b) Alimentos ácidos y poco ácidos-acidificados, fermentados, encurtidos, alimentos
elaborados a base de frutas (como jugos, néctares, mermeladas, jaleas, ates, etcétera) y
frutas envasadas en recipientes de cierre hermético y sometidas a tratamiento térmico.
2. Alimentos envasados en recipientes de cierre hermético con pH > 4,6.
a) Vegetales, productos cárnicos, platillos preparados con carne, productos lácteos y
mezclas, envasados en recipientes de cierre hermético y sometido a tratamiento
térmico que asegure su esterilidad comercial.
b) Alimentos sometidos a tratamiento térmico envasados asépticamente.
3. Otros productos con las mismas características y sujetos al mismo proceso.
Objetivo.
Conocer la metodología para llevar a cabo el análisis microbiológico de productos enlatados.
Desarrollo.
Examen microbiológico de latas no alteradas.
Este examen tiene por objeto determinar la presencia de microorganismos viables latentes,
que resistieron el tratamiento térmico debidamente aplicado y que en determinadas circunstancias
pudieran desarrollarse, produciendo alteraciones en el alimento y representando un riesgo para el
52
consumidor. Los envasados, aun los bien procesados, pueden contener esporas de bacilos
termofílicos, las cuales son muy resistentes al calor, pero no se desarrollan en las condiciones
normales de almacenamiento y no producen problemas de descomposición del producto ni
representan un peligro para el consumidor. La prueba de esterilidad comercial, puede efectuarse
por la observación y análisis del contenido del producto, su apariencia, color, olor, pH y examen
microscópico. Estas observaciones se hacen después de la incubación de las latas y siempre
comparándolas con otras no incubadas. Si es necesario efectuar el cultivo o si el producto
después de incubarse presenta cualquier cambio, ya sea en apariencia, olor, color, pH, o bien
presencia de gas o espuma, proceder como se indica en 5.1 o 5.2, dependiendo del pH del
alimento.
53
Observar diariamente los envases. La manifestación de crecimiento es la hinchazón en
diferentes grados y en los envases de vidrio se pueden observar los cambios en el alimento o la
formación de burbujas. En cuanto se detecte hinchazón en el producto o cualquier otra desviación
suspender la incubación.
Al final del periodo de incubación, abrir las latas para descubrir descomposición ácida
(flat sour), por cambios en el color, olor, consistencia y pH del alimento. Preparar extensiones,
teñirlas con azul de metileno o tinción de Gram y observarlas microscópicamente. El hallazgo de
cualquier anormalidad indica que el producto no está comercialmente estéril y se debe proceder
como para los envases alterados.
Área de trabajo.
Se debe trabajar preferentemente en un gabinete de flujo laminar que proporcione un
ambiente ultra-limpio. La desinfección de la superficie de trabajo se puede hacer con alcohol o
sales cuaternarias de amonio a la concentración recomendada por el fabricante. Posteriormente se
debe poner a trabajar el flujo, 30 min antes de efectuar el trabajo. Para controlar la eficacia del
flujo, se deben poner como testigos cajas con medio de cultivo abiertas, a los lados y al centro del
área de trabajo, durante todo el tiempo que dure la operación. Si no se tiene el equipo necesario,
se puede utilizar un cuarto o cubículo perfectamente limpio, lavado con agua y jabón,
desinfectándolo con un agente bactericida apropiado. En este caso se trabajará entre dos
mecheros Bunsen.
Personal.
El personal debe trabajar con bata limpia. Si tiene el pelo largo, debe usar turbante. El uso
de mascarillas quirúrgicas es opcional. El personal enfermo con gripe o cualquier otro problema
infeccioso no debe intervenir en el análisis.
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Preparación de latas o envases normales.
a) Lavar el envase con un cepillo, usando agua caliente y jabón; enjuagar y dejar secar.
b) Remojar con un sanitizante durante 10 a 15 min, la tapa contraria a donde está grabado el
lote. Escurrir el líquido y secar con la flama de un mechero.
c) Destapar con un abridor de latas sanitario estéril.
d) En las latas de cierre de anillo o dispositivos abre fácil, abrir por la cara opuesta.
Frascos de vidrio.
a) Lavar la tapa del frasco y sumergirlo durante 15 min en una solución sanitizante, de
manera que quede cubierta la tapa; esta solución puede ser cloro 100 mg/kg.
b) Colocar un algodón estéril en torno a la tapa y con un punzón estéril hacer un orificio en
el centro, a fin de que se pierda el vacío y pueda abrirse con facilidad.
c) Abrir el frasco sin contaminar los bordes del mismo.
Procedimiento
a) Abrir la lata entre dos mecheros Bunsen o en el gabinete de flujo laminar vertical.
55
b) Tomar porciones tanto del contenido sólido como del líquido; si es posible,
homogeneizar.
c) Utilizando utensilios adecuados a la naturaleza del producto (espátulas, pinzas, tubos de
vidrio, pipetas, etcétera) transferir aproximadamente 2 g o 2 mL del producto a los tubos
con el medio que se va a utilizar, dependiendo del pH del alimento.
d) Conservar una muestra en un frasco estéril, para cualquier aclaración o para efectuar
pruebas biológicas.
e) Hacer una extensión en un portaobjetos del contenido de la lata, ya que muchas veces los
gérmenes causantes del deterioro mueren durante el almacenamiento y sólo el examen
microscópico puede dar una idea de los microorganismos involucrados en la
descomposición.
f) Preparar las extensiones mediante una asa de platino. Si el alimento es sólido o muy
espeso, agregar una pequeña cantidad de agua estéril. Si es muy grasoso, depositar sobre
la extensión una pequeña cantidad de xilol con posterioridad a su fijación por calor.
Una vez tomada la muestra, anotar el estado del alimento: su olor, cambios en su color,
consistencia, etcétera. No debe probarse. Determinar el pH y vaciar el contenido de la lata.
Observar su interior, anotando el estado del barniz, la presencia de manchas, defectos del frasco o
de la tapa, etcétera. Tener cuidado al manipular el producto, incluso cuando provenga de envases
aparentemente normales.
Cuestionario:
1. ¿Qué tipos de enfermedades pueden transmitirse por el consumo de alimentos enlatados
contaminados?
56
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