Kourani Mendez Omar

Universidad Autónoma de Madrid
Facultad de Medicina
Departamento de Bioquímica
Papel del sistema del glutatión en

la adaptación y resistencia de los
tumores linfoides al estrés oxidativo
Tesis Doctoral
Omar Kourani Méndez
Madrid, 2019
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
FACULTAD DE MEDICINA
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
TESIS DOCTORAL
Papel del sistema del glutatión en la adaptación y resistencia de
los tumores linfoides al estrés oxidativo
Memoria de Tesis Doctoral presentada por

Omar Kourani Méndez
Licenciado en Bioquímica y Biología
Para optar al grado de Doctor por la Universidad Autónoma de Madrid
Director de Tesis
Miguel R. Campanero García
Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols

CSIC-UAM
Esta tesis doctoral se ha desarrollado bajo la dirección del Dr. Miguel R. Campanero García
en el Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”, centro mixto CSIC-UAM y ha
sido financiada por el Ministerio de Economía y Competitividad y posteriormente por el
Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades mediante un contrato predoctoral para la
formación de doctores; así como por la Comunidad de Madrid mediante un contrato para
personal investigador de apoyo.
A mis padres
Agradecimientos
En primer lugar me gustaría agradecer a mi director de tesis, Miguel Campanero, por

haberme dado la oportunidad de realizar este trabajo en su laboratorio. Por su ayuda, guía y
consejo y por la confianza depositada en mí a lo largo de estos años.
A mis compis de labo por toda su ayuda y por los buenos momentos que hemos pasado
juntos. Especialmente a Alberto y Patri, agradeceros toda la ayuda que me habéis dado
durante estos dos últimos años y por el buen ambiente que hemos tenido en el labo. Un
agradecimiento especial para Yuri, que tan bien me recibió cuando llegue al laboratorio. No
me olvido de todos los estudiantes que han pasado por el labo y de los que tanto he
aprendido. En especial quiero mencionar a Henar y a Gonzalo por su ayuda durante la
realización de este proyecto y por supuesto a Manuela, con la que he compartido muchas
risas, confidencias y algún batido de chocolate.
A Teresa Iglesias por toda la ayuda, consejos y ánimo que me ha dado durante estos años. A
todos los miembros actuales y pasados de su laboratorio, con los que tantos momentos de
risas hemos compartido: Julia, Lucia, Ana, Álvaro, Ana Simón, Marina, Andrea y todos los
estudiantes que han pasado por allí… (Incluida la estudiante fantasma de la cámara de
seguridad…).
A todos los jefes de laboratorio y sus equipos que en mayor o menor medida me han echado
una mano cuando lo he necesitado, ya sea con consejos, dejándome usar algún equipo o
material o simplemente interesándose por mi progreso. En particular me gustaría
agradecérselo a Ricardo Sánchez, Alberto Muñoz, María Jesús Larriba, Gema Domínguez,
Benilde Jiménez, Luis del peso y Miguel Quintanilla. Por supuesto también a mis tutores
Jaime Renart e Isabel Sánchez por las firmas y validaciones de última hora.
Al personal de recepción por su sonrisa, simpatía y amabilidad. A todo el personal de los

diferentes servicios (administración, cultivos, medio de cultivo, imagen, genómica,
animalario…), sin los cuales el trabajo diario sería prácticamente imposible, además de
aburrido. En particular tengo muchísimo que agradecer, no solo por toda la ayuda que me
han prestado en sus respectivas áreas, sino también por su simpatía y amabilidad durante
todos estos años a Leti, nuestra técnico de animalario, y a Laura, responsable del servicio de
citometría de flujo de la Facultad de Medicina de la UAM.
A todos los profesores que durante mi formación académica me han ido guiando por este
camino. En particular a Pepe Almendral, Ángeles Juarranz y al Dr. Regadera (espero que no
se enfade por referirme al resto de investigadores y profesores por su nombre de pila…).
A todos los compañeros que han ido pasando por los laboratorios y con los que he
compartido muchos momentos de risas y buen rollo: Elvira, María Tiana, María Gómez,
Laura Deguiz, Javi, Jorge, Anuska, Carmen, Patricia…
A Lucia, mi compañera de fatigas durante estos dos últimos años. Siempre con una sonrisa y
unas palabras de ánimo.
A mis amigas Olga y Gemma, con las que las largas jornadas en el laboratorio se hacían
mucho más llevaderas, compartiendo meriendas-casi-cenas. Gracias también por toda la
ayuda y consejos que me habéis dado durante estos años.
A mis amigos de la carrera: Miguel, Antonio y Silvia. Aunque nos veamos prácticamente de
año en año, cuando nos reunimos por navidad para comer sushi y agua del grifo, es como si
realmente no hubiese pasado el tiempo.
A mi vieja amiga Silvia (no lo digo por la edad), una de las personas que mejor me conoce y
me entiende. Gracias por ser mi confidente y estar siempre dispuesta a ayudarme.
A toda la gente maravillosa que he conocido en este último año, de la que tanto he
aprendido, con la que tan buenos ratos paso y con la que espero construir una fuerte
amistad.
A Javi y su familia, por estar siempre cerca, apoyándome y confiando en mí.
A mi madre y a mi padre, las personas más importantes de mi vida. Gracias a vosotros soy lo
que soy. Gracias por habérmelo dado todo. Os quiero.
Resumen/
/Abstract
Resumen
La transformación tumoral es un proceso complejo que implica varios cambios en el
funcionamiento normal de la célula. Entre las habilidades que adquiere una célula en su
transición a un estado maligno se encuentra la capacidad de crecimiento independiente de
anclaje, íntimamente relacionada con los mecanismos que permiten evadir la muerte celular
inducida por pérdida del anclaje a un sustrato rígido. El ensayo más empleado para
determinar la capacidad de crecimiento independiente de anclaje es el de formación de
colonias en agar blando. Mientras que los linfomas, tumores sólidos resultado de la
malignización de células linfoides, forman colonias en agar blando, los linfocitos inmortales
no tumorales no crecen. Los linfocitos normales requieren de anclaje a sustratos y a otras
células para llevar a cabo sus funciones biológicas. Sin embargo, en este trabajo hemos
observado que, in vitro, tanto las líneas celulares linfoides tumorales como las inmortales no
tumorales son capaces de proliferar en ausencia de interacción directa con otras células o
con el sustrato rígido. El estudio en profundidad del papel restrictivo que ejerce el cultivo en
agar blando sobre las líneas inmortales, pero no sobre las líneas tumorales, reveló que es
capaz de inducir estrés oxidativo en las células a través del aumento de los niveles de
especies reactivas de oxígeno (ROS). Las células linfoides tumorales, a diferencia de las
inmortales no tumorales, son capaces de hacer frente al estrés oxidativo inducido por el
cultivo en agar gracias al incremento en los niveles de glutatión reducido (GSH), uno de los
principales mecanismos de defensa antioxidante de la célula. La pérdida de la producción de
GSH en células tumorales, mediante la inhibición farmacológica o mediante el silenciamiento
de la expresión de la subunidad catalítica de la enzima limitante en su síntesis (GCLC),
aumentó el estrés oxidativo e inhibió drásticamente el crecimiento de las células tumorales
en agar blando. El silenciamiento de GCLC también inhibió el crecimiento de linfomas en un
modelo de xenotrasplante subcutáneo en ratones inmunodeficientes NOD-SCID. Los tejidos
linfoides tumorales de un modelo de ratón que sobre-expresa MYC en linfocitos B (lambda-
MYC) muestran mayores niveles de GSH que los tejidos linfoides de ratones sanos y el
tratamiento de los ratones lambda-MYC con un inhibidor farmacológico de GCLC previno la
linfomagénesis en este modelo animal, lo que junto con el resto de resultados obtenidos en
este trabajo sugiere la posibilidad de dirigir futuros tratamientos contra los mecanismos
responsables de proporcionar resistencia al estrés oxidativo de las células tumorales.
Abstract
Tumor transformation is a complex process that involves several changes in cell physiology.
Among the abilities that a cell acquires in its transition to a malignant state is the capacity for
anchorage-independent growth, a capacity intimately related to the mechanisms that
prevent cell death induced by loss of anchorage to a rigid substrate. Colony formation in soft
agar hydrogels is the gold-standard assay for anchorage-independent growth. While
lymphomas, solid tumors resulting from malignancy of lymphoid cells, form colonies in soft
agar, immortal non-tumor lymphocytes do not grow. Lymphocytes anchor to the
extracellular matrix and other cells while carrying out their biological function. However, we
have observed that both tumor lymphoid and immortal non-tumor cells proliferate in the
absence of direct interaction with other cells or with a rigid substrate. Research of the
mechanisms involved in the restrictions imposed by soft agar on the growth of immortal
lymphoid cell lines, but not on that of lymphoid tumor cell lines, revealed that of the culture
in soft agar induces oxidative stress through of the increase of reactive oxygen species (ROS).
Tumor lymphoid cells, unlike non-tumor immortal lymphoid cells, are able to cope with
oxidative stress induced by culture in soft agar through the increase in reduced glutathione
levels (GSH), one of the main antioxidant defense mechanisms of cells. The loss of GSH
production in tumor cells, through pharmacological inhibition or by silencing of the catalytic
subunit of the limiting enzyme of its synthesis (GCLC), markedly inhibited their growth in soft
agar. Moreover, GCLC knockdown also inhibited lymphoid tumor growth in a model of
subcutaneous xenograft in immunodeficient NOD-SCID mice. Lymphoid tumor tissues in the
lambda-MYC mouse model, that overexpresses MYC in B-lymphocytes, show higher GSH
levels than lymphoid tissues from wild-type littermates, and pharmacological inhibition of
GCLC in lambda-MYC mice prevented lymphomagenesis. Together, our results strongly
encourage directing lymphoid tumor treatments against mechanisms responsible for
oxidative stress resistance in tumor cells.
Índice
Abreviaturas ........................................................................................................................................ 1
Introducción ........................................................................................................................................ 5
1. Cáncer.............................................................................................................................................. 7
1.1. Transformación tumoral .......................................................................................................... 7
1.2 Crecimiento independiente de anclaje ................................................................................... 10
1.3 la teoría de las CSC: situación actual ....................................................................................... 11
1.4 Investigación del cáncer: ensayo de tumorigenicidad ............................................................ 13
2. Neoplasias linfoides....................................................................................................................... 14
2.1 clasificación ............................................................................................................................. 14
2.2 Linfoma no-Hodgkin ................................................................................................................ 16
2.3 Aspectos moleculares y genéticos del NHL ............................................................................. 17
2.4 Tratamiento e investigación del NHL ...................................................................................... 18
3. Estrés oxidativo ............................................................................................................................. 19
3.1. Especies Reactivas de Oxígeno: funciones fisiológicas .......................................................... 19
3.2 Estrés oxidativo: daño celular, enfermedad y cáncer ............................................................. 21
3.3 Mecanismos de defensa antioxidante .................................................................................... 22
3.4 Glutatión.................................................................................................................................. 22
Objetivos............................................................................................................................................. 25
Materiales y Métodos ..................................................................................................................... 29
1. Líneas celulares ............................................................................................................................. 31
2. Ensayo de formación de colonias en agar blando ......................................................................... 31
3. Recuperación de células sembradas en agar ................................................................................ 32
4. Ensayos de impedimento de anclaje ............................................................................................. 32
4.1 Poly-HEMA............................................................................................................................... 32
4.2 Metilcelulosa ........................................................................................................................... 33
4.3 Bloqueo con anticuerpos y tratamiento con compuesto A-286982 ...................................... 33
4.4 Ensayo clonogénico ................................................................................................................. 34
5. Análisis de proliferación y ciclo celular ......................................................................................... 34
6. Extracción de RNA y qPCR ............................................................................................................. 35
7. Western blot.................................................................................................................................. 35
8. Tratamiento con BSO, NAC y Z-VAD .............................................................................................. 36
9. Análisis de viabilidad celular ......................................................................................................... 36
10. Detección de ROS y GSH por citometría de flujo ........................................................................ 37
11. Generación de vector de expresión de GCLC ............................................................................. 37
12. Transfección celular y producción de lentivirus .......................................................................... 37
13. Transducción lentiviral ................................................................................................................ 38
14. Xenotrasplante en ratones NOD-SCID ......................................................................................... 38
15. Detección de ROS en tejidos de ratones λ-MYC .......................................................................... 39
16. Tratamiento con BSO de ratones λ-MYC ..................................................................................... 39
17. Generación de la línea híbrida de ratón LXG ............................................................................... 40
18. Genotipado de ratones ................................................................................................................ 40
19. Elaboración de figuras y análisis estadístico. .............................................................................. 41
Resultados .......................................................................................................................................... 43
1. Las líneas celulares linfoides, tanto inmortales no tumorales como tumorales, son capaces de
proliferar en ausencia de anclaje a sustrato rígido ........................................................................... 45
2. El bloqueo de la interacción LFA1-ICAM1, principal responsable de las interacciones
intercelulares entre linfocitos, no afecta a la capacidad proliferativa de estos ............................... 47
3. las líneas celulares linfoides inmortales proliferan en ausencia total de anclaje ......................... 49
4. El cultivo celular en agar blando induce muerte celular ............................................................... 53
........................................................................................................................................................... 57
5. El cultivo celular en agar blando induce estrés oxidativo ............................................................. 58
6. Las líneas linfoides tumorales incrementan la síntesis de glutatión en respuesta al cultivo en agar
blando ................................................................................................................................................ 61
7. Glutatión es fundamental para la viabilidad de las líneas linfoides tumorales ............................. 62
8. NAC protege a las células del estrés oxidativo inducido por agar blando de forma independiente
a GSH ................................................................................................................................................. 64
9. La expresión de GCLc en células de linfoma de Burkitt y de Leucemia T aguda es necesaria para
el mantenimiento de su fenotipo tumoral ........................................................................................ 70
10. Aumento de ROS y GSH en un modelo múrido de linfoma de Burkitt ....................................... 74
11. La inhibición farmacológica de GCLC previene la formación de linfomas ................................... 76
Discusión ............................................................................................................................................. 77
1. Requisitos de anclaje de las líneas linfoides inmortalizadas y tumorales ..................................... 79
2. Utilidad del cultivo en agar blando para el estudio de los tumores linfoides ............................... 81
3. Indicios de la presencia de CSC en los tumores linfoides .............................................................. 83
4. Adaptación y resistencia al estrés oxidativo en los tumores linfoides .......................................... 84
5. Mecanosensibilidad y estrés mecánico en las líneas linfoides ...................................................... 87
6. Perspectivas de nuevos tratamientos frente al linfoma ............................................................... 88
Conclusiones ..................................................................................................................................... 91
Bibliografía.......................................................................................................................................... 96
Abreviaturas
1
2
Abreviaturas
ACS: Sociedad Americana Contra el Cáncer (EEUU)
BL: Linfoma de Burkitt
BSO: L-Butionina-(S, R)- sulfoximina
CHOP: Ciclofosfamida, Hidroxidaunorubicina, Oncovin, Prednisona.
CSC: Célula troncal de cáncer
DCFDA: 2´,7´-Diclorofluoresceina diacetato
DHE: Dihidroxietidio
DLBCL: Linfoma difuso de células B grandes
DNA: Ácido desoxirribonucleico
EBV: Virus de Epstein-Barr
EdU: 5-ethynyl-2´-deoxyuridine
FBS: Suero fetal bovino
GCL: Glutamil cisteína ligasa
GS: Glutatión sintasa
GSH: Glutatión
GSSG: Glutatión disulfuro
HIF: Factor inducible por hipoxia
HL: Linfoma de Hodgkin
ICAM1: Molécula de adhesión intercelular 1
IP: Ioduro de propidio
LCL: línea celular linfoblastoide B
LFA1: Antígeno de función linfocitaria 1
LM: Lamda-MYC/ λ-MYC
mBCI: Monoclorobimano
MEC: Matriz extracelular
NAC: N-acetil cisteína
NCI: Instituto Nacional del Cáncer (EEUU)
NHL: Linfoma no Hodgkin
NOD-SCID: Diabético no obeso con inmunodeficiencia combinada severa
OMS: Organización Mundial de la Salud
PI3K: Fosfoinositol 3-quinasa
REAL: Clasificación revisada de linfomas europeo-americana
RNA: Ácido ribonucleico
3
Abreviaturas
ROS: Especies reactivas de oxígeno
RTq-PCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real
SA: Agar blando
SOD: Súper óxido dismutasa
TEM: Transición epitelio-mesénquima
TGF-β: Factor de crecimiento transformante β
VEGF: Factor de crecimiento de endotelio vascular
VHC: Virus hepatitis C
VIH: Virus inmunodeficiencia humana
WHO: Organización Mundial de la Salud
λ-MYC: Lamda-MYC/ LM
Z-VAD: Z-Val-Ala-DL-Asp-fluorometilcetona
4
Introducción
5
6
Introducción
1. Cáncer
El término cáncer engloba un conjunto heterogéneo de enfermedades que se caracterizan

por la proliferación incontrolada de células que han sufrido un proceso de transformación
maligna. Potencialmente, cualquier tipo celular puede sufrir transformación, siendo cada
tipo de cáncer una entidad patológica con características, causas, evolución y tratamiento
diferente al resto.
1.1. Transformación tumoral

La conversión de una célula normal en una célula de cáncer es un proceso de varias etapas
en las que esta adquiere las características típicas de una célula maligna a través del
acúmulo de mutaciones en oncogenes y genes supresores de tumores, cambios epigenéticos
y aberraciones cromosómicas. Ninguno de estos eventos es suficiente por sí mismo para el
desarrollo del fenotipo maligno (Hanahan and Weinberg 2000, Hanahan and Weinberg 2011)
(figura 1).
Figura 1. Características de la transformación tumoral. El proceso de transformación tumoral

requiere del acumulo de varias alteraciones que proporcionan a las células diferentes
habilidades. (Adaptado de Hanahan y Weinberg, 2011).
Al contrario que las células normales, las células transformadas no dependen de señales de
crecimiento externas, sino que generan señales proliferativas de forma autosuficiente
mediante, por ejemplo, la activación constitutiva de las rutas moleculares implicadas en el
7
Introducción
control de la proliferación, como la de las MAPK o la de PI3K (Sever and Brugge 2015,
Hanahan and Weinberg 2000). Puesto que muchas de estas vías dependen de la
transducción de señales mediada por moléculas de adhesión a sustrato, como las integrinas
(Schwartz 1997), la capacidad de autosuficiencia proliferativa de las células tumorales se
relaciona con su capacidad de crecimiento independiente de anclaje, tema que se tratará
con más detalle en el siguiente apartado.
El mantenimiento de la homeostasis en un individuo adulto requiere que la mayoría de las

células permanezcan en un estado no proliferativo o quiescente, lo que se consigue
mediante señales supresoras de la proliferación, como la mediada por la vía de TGF-β. Sin
embargo, durante la transformación tumoral, las células adquieren la capacidad de evadir
dichas señales (Hanahan and Weinberg 2000, Hanahan and Weinberg 2011). De igual modo,
el mantenimiento de la homeostasis requiere un ajuste fino de la proliferación celular en su
contexto tisular, lo que se consigue mediante mecanismos de inhibición de contacto entre
células. Las células tumorales adquieren la capacidad de abolir estos mecanismos, lo que les
permite proliferar de forma aberrante e indiscriminada (Hanahan and Weinberg 2011,
Ribatti 2017).
Una de las propiedades más relevantes del cáncer es su capacidad de invasión y metástasis,
pudiendo colonizar y crecer en regiones y tejidos diferentes a su lugar de origen. En esto
juega un papel fundamental la transición epitelio-mesénquima (TEM), un proceso normal
durante el desarrollo embrionario, que el tumor es capaz de activar de forma transitoria o
estable (Mittal 2018). Otras alteraciones bien caracterizadas implicadas en invasión y
metástasis son la pérdida de expresión de E-cadherina y la ganancia de función de N-
cadherina (Cavallaro and Christofori 2004, Hanahan and Weinberg 2011, Berx and van Roy
2009, Onder et al. 2008).
Normalmente, ante alteraciones en el funcionamiento normal de la célula se activan

mecanismos de muerte celular inducida, mediados por caspasas. Sin embargo, las células
transformadas son capaces de evadir estas señales de diversas formas, por ejemplo
mediante la pérdida de función del supresor tumoral TP53, sensor de daño de DNA, o
modulando los niveles de expresión de moléculas pro y anti-apoptóticas, principalmente
miembros de la familia BCL-2 (Hanahan and Weinberg 2011).
8
Introducción
Otra característica típica del cáncer es la adquisición de inmortalidad replicativa, es decir, la
capacidad de dividirse de forma indefinida evitando el programa celular que limita y regula
los ciclos de división de una célula normal mediante inducción de senescencia y de muerte
celular. En la adquisición de esta capacidad juegan un papel fundamental los telómeros,
estructuras que protegen el extremo de los cromosomas y que se van acortando con cada
división celular. Mientras que en células normales el acortamiento de los telómeros define el
número de veces que la célula puede dividirse, las células inmortalizadas son capaces de
mantener la longitud e integridad de estos mediante la acción de la enzima telomerasa
(Hanahan and Weinberg 2011).
Los tumores adquieren también la capacidad de inducir la formación de nuevos vasos

sanguíneos, garantizando así el aporte de oxígeno y nutrientes. La construcción de esta red
vascular aberrante se consigue mediante el equilibrio entre señales inductoras y señales
inhibidoras, entre las que destacan las reguladas por el factor de crecimiento de endotelio
vascular A (VEGF-A) y trombospondina 1 (TSP-1) respectivamente. La expresión del inductor
VEGF-A es promovida tanto por hipoxia, habitual en el foco tumoral primordial, como por
señalización oncogénica, como la llevada a cabo por RAS o MYC (Hanahan and Weinberg
2011).
En los últimos años ha recobrado especial importancia el concepto de reprogramación o

desregulación del metabolismo energético como un factor clave en la iniciación y progresión
de ciertos tipos de tumores. Mientras que las células normales basan su metabolismo
energético en la oxidación aeróbica del piruvato (en la mitocondria), muchos tipos de células
de cáncer obtienen energía en un proceso de glicólisis anaerobia, aun en presencia de
oxígeno, lo que implica altas tasas de consumo de glucosa (Hanahan and Weinberg 2011).
Otro aspecto de la biología del cáncer que está recibiendo especial atención es la capacidad
que pueden adquirir las células transformadas de evadir al sistema inmune, el cual podría
potencialmente reconocerlas y eliminarlas. Existe evidencia de que esta evasión ocurre tanto
a nivel de respuesta adaptativa como de respuesta innata. Los mecanismos implicados son
complejos y no totalmente conocidos, pero todos ellos parecen converger en la exclusión del
infiltrado de células T y otras células inmunitarias del microambiente tumoral, así como en la
pérdida de inmunogenicidad, lo que dificultaría su reconocimiento por parte del sistema
inmunitario (Hanahan and Weinberg 2011).
9
Introducción
1.2 Crecimiento independiente de anclaje
Como se ha comentado anteriormente, una de las habilidades que debe adquirir una célula
en su transición a un estado maligno es la de crecimiento independiente de anclaje
(Schwartz 1997, Guadamillas, Cerezo and Del Pozo 2011). Las células normales requieren
anclaje a un sustrato para proliferar y sobrevivir y para ello se unen a la MEC y a otras células
a través de las integrinas y otras moléculas de adhesión, como los miembros de la
superfamilia de las inmunoglobulinas. Esto no consiste en un simple anclaje mecánico, sino
que además forma parte de las complejas redes de transducción de señales a través de las
cuales las células reciben información sobre su localización, el ambiente que las rodea y su
estado adhesivo, mediante señales y estímulos procedentes de la MEC y de otras células.
Estas señales desencadenan respuestas apropiadas como migración, diferenciación,
proliferación y supervivencia (Assoian 1997, Okayama 2012).
En células epiteliales se ha demostrado que la pérdida de anclaje y, por tanto, de las señales
de supervivencia principalmente mediadas por integrinas, lleva a la activación de una serie
de mecanismos que resultan en un tipo particular de muerte programada denominada
anoikis. Esto constituye un mecanismo esencial para mantener a las células en su correcto
contexto tisular (Taddei et al. 2012, Ishikawa et al. 2015) (Figura 2). Como excepción a esto,
las células del linaje hematopoyético pueden sobrevivir en ausencia de anclaje, tal como
ocurre durante su circulación por el torrente circulatorio; pero su actividad biológica sigue
siendo dependiente de la unión a otras células o a la MEC. Así por ejemplo, la diferenciación,
maduración y proliferación de las células linfoides ocurre en tejidos sólidos, en los que las
células están en estrecho contacto unas con otras. Su función biológica depende de la
interacción directa con diferentes tipos celulares, como la adhesión a células endoteliales
durante la extravasación, a células presentadoras de antígenos o a células diana dañadas
que deben ser eliminadas (Abbas, Litchman and Pillai 2014).
La capacidad de crecimiento independiente de anclaje adquirida durante la transformación

tumoral requiere que las células sean capaces de adaptarse a la pérdida de la señalización
mediada por el anclaje de las integrinas y otras moléculas de adhesión a la MEC, de forma
que sean capaces de sobrevivir y proliferar en su ausencia. Entre las estrategias que se han
descrito para tal fin, se encuentra la activación constitutiva de la señalización mediada por
integrinas o la activación de vías de señalización independientes de integrinas. También
10
Introducción
requiere esquivar los mecanismos inductores de muerte celular que se activan por la
ausencia de anclaje (Schwartz 1997, Guadamillas et al. 2011) (Figura 2).
Figura 2. Las células tumorales adquieren la capacidad de supervivencia y crecimiento

independiente de anclaje. En ausencia de anclaje a la MEC, una célula normal sufre muerte
programada (anoikis). Las células tumorales adquieren la capacidad de sobrevivir en estas
condiciones, lo que le permite invadir regiones distales y metastatizar. (Adaptado de Taddei et al,
2012).
Estudios recientes indican que la adquisición de la capacidad de crecimiento independiente

de anclaje por parte de las células tumorales requiere de adaptaciones metabólicas. Así por
ejemplo, el metabolismo oxidativo de la glucosa, sustrato fundamental del metabolismo
celular, es reemplazado por un metabolismo reductor de la glutamina en células de cáncer
de pulmón y por la oxidación de ácidos grasos en células cancerosas de epitelio mamario.
Esto ocurriría porque la incorporación de glucosa es altamente dependiente de la
señalización mediada por anclaje (Schafer et al. 2009, Stalnecker, Cluntun and Cerione 2016,
Jiang et al. 2016, Yang et al. 2018).
La capacidad de crecimiento independiente de anclaje se ha correlacionado clásicamente

con el potencial tumorigénico evaluado in vivo (xenotrasplante en ratones
inmunodeficientes) e in vitro (formación de colonias en agar) (Borowicz et al. 2014, Shin et
al. 1975).
1.3 la teoría de las CSC: situación actual

Las células troncales de cáncer (cancer stem cells, CSC) son una subpoblación de células
dentro de la masa tumoral que comparten características con las células madre normales y
11
Introducción
que actualmente se consideran mediadoras de la iniciación y progresión tumoral, así como
responsables de las metástasis, la recidiva tras tratamiento debido a su resistencia a drogas y
de la heterogeneidad de los tumores (Nassar and Blanpain 2016, Yu et al. 2012). Las CSC
fueron descritas por primera vez en leucemia mieloide aguda como una subpoblación de
entre el 0.1 y 1% de la población tumoral total (Bonnet and Dick 1997). Estas presentaban
marcadores típicos de precursores hematopoyéticos pero, a diferencia de estos, eran
capaces de promover la iniciación tumoral al ser inoculadas en ratones inmunodeficientes,
propiedad actualmente considerada característica de las CSC (Bonnet and Dick 1997). Desde
entonces son muchos los tipos de cáncer en los que se han identificado subpoblaciones CSC,
cada una de ellas caracterizada por la presencia de marcadores de superficie celular
específicos (Yu et al. 2012).
Actualmente se desconoce si las CSC se originan a partir de células madre normales que han
sufrido un proceso de transformación o si por el contrario provienen de células diferenciadas
y transformadas que han adquirido capacidad de auto renovación (Mohiuddin, Wei and Kang
2019). De cualquier forma, al igual que en las células madre normales, en las CSC actúan las
vías de señalización responsables de sustentar la troncalidad, como Wnt, Hedgehog y Notch;
expresándose también marcadores clásicos como los factores de transcripción NANOG,
OCT4 y MYC (Wang, Sullenger and Rich 2012, Koury, Zhong and Hao 2017, Yu et al. 2012).
Actualmente se está investigando el papel del nicho tumoral en el mantenimiento y

reposición de la población CSC a partir de células no CSC, concepto denominado plasticidad
celular; la importancia de la TEM en la adquisición de un fenotipo migratorio que permite a
células epiteliales invadir y colonizar nuevos tejidos; los cambios en el metabolismo que
permiten la adaptación de las CSC y el papel de los cambios epigenéticos sobre la regulación
de estas (Zhao et al. 2018).
De forma general, la terapia empleada actualmente en el tratamiento del cáncer se basa en

la administración de fármacos quimioterapéuticos anti proliferativos, frente a los que las CSC
parecen ser resistentes. Esto explicaría el fenómeno de relapso tras un tratamiento
aparentemente efectivo (Dawood, Austin and Cristofanilli 2014). Los mecanismos descritos
como responsables de la resistencia a fármacos son principalmente la sobre regulación de
las bombas y transportadores de expulsión, la capacidad de reparación del DNA, mayor
resistencia frente al estrés oxidativo y capacidad de entrar en quiescencia (Zhao et al. 2018,
Koury et al. 2017). No es de extrañar por tanto que actualmente se estén investigando y
12
Introducción
desarrollando nuevos fármacos encaminados a destruir selectivamente a las CSC. Entre estas
terapias destacan las encaminadas a inhibir las vías de señalización maestras de las CSC (Wnt
y Notch), la eliminación selectiva de las CSC mediante conjugados droga-anticuerpo, capaces
de reconocer los marcadores de superficie específicos de las CSC, la terapia epigenética, la
eliminación selectiva de CSC en quiescencia y la terapia dirigida al nicho tumoral, con el
objetivo de impedir la reposición de las CSC (Koury et al. 2017, Zhao et al. 2018).
1.4 Investigación del cáncer: ensayo de tumorigenicidad

El estudio del cáncer se basa en el entendimiento a nivel celular y molecular de los
mecanismos subyacentes a la transformación tumoral, que le permiten adquirir sus
capacidades fenotípicas y funcionales. Conocer estos mecanismos en profundidad permitirá
desarrollar terapias cada vez más específicas y eficaces.
La tumorigenicidad es definida oficialmente por la Organización Mundial de la Salud (OMS-

WHO, World Health Organization) como la capacidad de una población celular inoculada en
un modelo animal de producir un tumor por proliferación celular en el sitio de inoculación
y/o en un sitio distal mediante metástasis (2013, WHO 2013). Se hace, sin embargo,
extensible a modelos in vitro como el ensayo de formación de colonias en agar blando y más
recientemente los ensayos de formación de esferoides tumorales. El interés de este tipo de
ensayos in vitro radica en la posibilidad de usarlos, no solo como test de potencial
tumorigénico, sino también para evaluar el efecto terapéutico de diversos fármacos (Rotem
et al. 2015, Horibata et al. 2015). Es además un ensayo requerido para evaluar la calidad y
seguridad de productos terapéuticos derivados de células (WHO 2013).
El ensayo de formación de colonias en agar blando fue desarrollado en 1964 por

Macpherson y Montagnier tras proponer que células transformadas por infección viral
podrían adquirir la capacidad de formar colonias en agar y que esa habilidad podría ser
usada como base de un ensayo selectivo (Macpherson and Montagnier 1964).
Posteriormente se demostró correlación entre el crecimiento independiente de anclaje en
agar de células transformadas por infección viral con la tumorigenicidad al ser inoculadas en
ratones inmunodeficientes (Shin et al. 1975). Desde entonces ha sido ampliamente
empleado, aceptándose además de forma general que este ensayo evalúa el potencial
tumorigénico de las células a través de su capacidad de crecimiento independiente de
anclaje a un sustrato (Borowicz et al. 2014, Horibata et al. 2015, Rotem et al. 2015). Un
estudio reciente mostró que mientras que células linfoides tumorales son capaces de
13
Introducción
proliferar en agar blando, células inmortalizadas no son capaces (Jiménez-P et al. 2018)
(Figura 3). Pese a la evidencia ampliamente observada de que solo una pequeña parte de la
población celular tumoral sembrada en agar es capaz de proliferar dando lugar a colonias, no
ha sido hasta hace poco que se ha comenzado a aceptar que esa subpoblación se
correspondería con células CSC (Morata-Tarifa et al. 2016).
Figura 3. Ensayo de siembra en agar blando. Líneas celulares linfoides inmortalizadas (JY y X50-7)
no son capaces de proliferar cuando son sembradas en agar blando, mientras que las líneas
tumorales DG-75 y Toledo si lo son, dando lugar a la formación de colonias. (A) Observación a
simple vista de pocillos de placa de 6 pocillos. (B) Observación por microscopia de contraste de
fase. Barra escala, 200 μm. (Adaptado de Jiménez et al. 2018)
2. Neoplasias linfoides
Los linfomas son un tipo de cáncer producto de la transformación maligna de células

linfoides. A diferencia de la leucemia, que afecta a los mismos tipos celulares pero se origina
en la medula ósea o directamente en la sangre, el linfoma se origina en el sistema linfático,
pudiendo aparecer en cualquier región del cuerpo donde exista tejido linfoide, pero
principalmente en los nódulos linfoides, bazo, médula ósea, timo y tracto digestivo. El
linfoma es por tanto considerado un tumor sólido (Shankland, Armitage and Hancock 2012).
2.1 clasificación
Existe consenso en aceptar la clasificación de las neoplasias linfoides propuesta por la OMS,
basada en la clasificación REAL (Revised European-American Lymphoma), que en su última
revisión, publicada en 2016, los clasifica como linfoma o enfermedad de Hodgkin (HL,
Hodgkin lymphoma), neoplasias de células B maduras, neoplasias de células T y NK maduras,
14
Introducción
neoplasias histocíticas y dendríticas y desordenes linfoproliferativos postrasplante (Figura 4).
Cada una de estas categorías engloba a su vez diferentes entidades patológicas (Swerdlow et
al. 2016). Las neoplasias linfoblásticas de precursores de células B y T se incluyen dentro de
la clasificación de la OMS de neoplasias mieloides y leucemia aguda (Arber et al. 2016).
Figura 4. Clasificación de las neoplasias linfoides según la OMS. La agrupación en linfoma no

Hodgkin (NHL) no está establecida por la OMS, pero es de consenso general.
El HL representa entre el 10% y el 20% de todos los linfomas y se caracteriza por la presencia
de una masa tumoral-inflamatoria de localización ganglionar con un bajo porcentaje de
células propiamente malignas, denominadas células Reed-Sternberg. Los ganglios más
frecuentemente afectados son los de cuello, axilas o ingles. La causa del HL es desconocida,
sin embargo son factores de riesgo la infección por el virus Epstein-Barr (EBV), sistema
inmunitario debilitado por enfermedad o tratamiento farmacológico y antecedentes
familiares. EL HL es un cáncer relativamente agresivo que puede diseminarse rápidamente a
otras regiones del cuerpo, sin embargo, detectado a tiempo presenta altas tasas de curación
y supervivencia. El principal tratamiento es la quimioterapia, complementada
ocasionalmente con radioterapia (Ansell 2015a, Ansell 2018, Gobbi et al. 2013, NCI 2019).
El resto de linfomas se conocen en su conjunto como linfomas no Hodgkin (NHL, Non-

Hodgkin lymphoma). Estos representan el 3% de todos los canceres y ocupan la 8º y 10º
posición en frecuencia a nivel mundial en hombres y mujeres respectivamente. Las
estimaciones para el año 2018 mostraron unos 509590 nuevos diagnósticos de NHL a nivel
mundial (55 % hombres y 45% mujeres) y 248724 muertes (58% hombres y 42% mujeres)
(NCI 2019, Miranda-Filho et al. 2019, Bray et al. 2018).
15
Introducción
2.2 Linfoma no-Hodgkin
Los NHL se pueden clasificar en base a su agresividad o velocidad de crecimiento como
linfomas indolentes o de bajo grado y linfomas agresivos o de alto grado. Los primeros se
caracterizan por la habitual ausencia de los síntomas típicos de NHL, típicamente llamados
sintomatología B (nódulos linfáticos agrandados, fiebre, sudoración nocturna, pérdida de
peso inexplicable y fatiga), con la excepción de linfoadenopatía de lenta evolución. Entre los
más frecuentes se encuentra el linfoma folicular, el linfoma linfoplasmocítico, el linfoma
marginal y los linfomas cutáneos. Los linfomas de alto grado se caracterizan, además de por
su elevada agresividad, por la presencia de la sintomatología característica. Entre estos
últimos destacan como especialmente agresivos el linfoma difuso de células B grandes
(DLBCL, Diffuse Large B Cell Lymphoma) y el linfoma de Burkitt (BL, Burkitt Lymphoma) (NCI
2019, Ansell 2015b, Shankland et al. 2012).
El DLBCL es el NHL más frecuente a nivel mundial (25% de todos los NHL). Aunque puede
originarse a cualquier edad, el riesgo aumenta con esta. Existen varios subtipos atendiendo a
características morfológicas, inmunohistoquímicas y moleculares, siendo estas últimas las
que aportan información de mayor valor de cara al tratamiento y pronóstico. En este sentido
se pueden clasificar como de tipo centro germinal o de tipo célula B activada (ACS 2018, NCI
2019) .
El BL es una neoplasia relativamente infrecuente que afecta principalmente a pacientes

jóvenes. Se clasifica en 3 subtipos con características clínicas diferentes. La variante
endémica es característica de África ecuatorial, afecta sobre todo a niños y se asocia a
infección por EBV. La variante asociada a inmunosupresión afecta a individuos con sistemas
inmunitarios deficientes. La variante esporádica, siendo la forma más habitual de LB a nivel
mundial, solo representa el 2% de todos los NHL (Velasco et al. 2018, ACS 2018, NCI 2019).
De forma general podemos hablar de diversos factores de riesgo para el desarrollo del NHL
como la edad (más de la mitad de los pacientes son mayores de 65 años en el momento del
diagnóstico), el sexo (mayor frecuencia en hombres que en mujeres), etnicidad (más
frecuente en población blanca de países desarrollados), historial familiar (se considera factor
de riesgo tener un familiar de primer grado con NHL, no necesariamente por motivos
genéticos), ambiente (exposición a ciertos químicos, fármacos y radiación), estado
inmunitario (sistema inmunitario debilitado de forma hereditaria o adquirida) e Infecciones,
incluyendo aquellas que directamente están implicadas en transformación de linfocitos
16
Introducción
(HTLV-1, EBV, HHV-8), las que debilitan el sistema inmunitario, como VIH; y las que
estimulan de forma crónica el sistema inmunitario (Helicobacter pylori, Chlamydophila
psittaci, Campylobacter jejuni, VHC) (ACS 2018).
2.3 Aspectos moleculares y genéticos del NHL

En los NHL son frecuentes mutaciones en proto-oncogenes, alteraciones epigenéticas y
anormalidades cariotípicas. Como se ha comentado anteriormente, NHL comprende un
grupo heterogéneo de enfermedades malignas.
El DLBCL puede originarse de novo o progresar a partir de un linfoma B de bajo grado. En

prácticamente el 100% de los DLBCL el gen BCL-6, que codifica un represor transcripcional
imprescindible para la formación del centro germinal, presenta alguna mutación o
reordenamiento. Así por ejemplo, el reordenamiento que deja a BCL-6 bajo el control de
regiones promotoras de genes de inmunoglobulinas, desregula su expresión, contribuyendo
al desarrollo del linfoma al bloquear la diferenciación de los linfocitos B (Pratap and Scordino
2019, Freedman and Nadler 2003).
El BL se caracteriza por la translocación del gen MYC desde su posición normal en el

cromosoma 8 a otros cromosomas, donde queda yuxtapuesto a genes de inmunoglobulinas.
La translocación resulta en la expresión desregulada de este gen, lo que se traduce en una
síntesis aumentada o inapropiada de la proteína que codifica, MYC. Esta es una proteína de
unión a DNA encargada de regular la expresión de diferentes genes implicados en el control
de la proliferación celular y por tanto su expresión alterada conduce a una proliferación
acelerada e incontrolada. La translocación más habitual, presente en el 80% de los casos de
LB, es la que sitúa a MYC en el cromosoma 14, en el locus del gen de la cadena pesada de las
inmunoglobulinas. Otras variantes implican a los cromosomas 2 o 22. Esto lleva a considerar
a MYC como un oncogén (Hecht and Aster 2000, Nguyen, Papenhausen and Shao 2017).
La translocación del oncogén BCL2 desde el cromosoma 14 hasta la región

transcripcionalmente activa del gen de inmunoglobulina en el cromosoma 18 está presente
en el 85% de los linfomas foliculares y en el 30% de los LNH difusos. El producto del gen BCL2
es un inhibidor de apoptosis y por tanto, su expresión incontrolada y aberrante proporciona
a las células la capacidad de esquivar el programa de muerte celular, que de otra manera
funcionaría como barrera frente a la transformación tumoral (Freedman and Nadler 2003,
Pratap and Scordino 2019).
17
Introducción
La translocación del gen BCL1 desde el cromosoma 11 hasta el cromosoma 14 provoca la
expresión desregulada de su producto, la ciclina D1. Esta participa en el control de la
transición G1/S del ciclo celular. Aunque esta alteración se emplea como marcador
molecular de linfoma de células del manto, probablemente son necesarias mutaciones
adicionales en otros genes, como P53 y P21, para dar origen a este tipo de linfoma
(Freedman and Nadler 2003).
Otras translocaciones implicadas en el desarrollo de NHL son las que afectan a los genes
PAX5, BCL10 y AP12. PAX5, localizado en el cromosoma 9 y susceptible de ser translocado al
cromosoma 14 (bajo control del promotor de inmunoglobulina H), codifica la proteína BSAP,
implicada en la diferenciación y proliferación de linfocitos B. la translocación de BCL10 desde
el cromosoma 1 al 14 causa la sobreexpresión de su producto, una proteína reclutadora de
caspasas, bloqueando la cascada apoptótica. De forma análoga y con igual resultado, la
transposición de AP12 desde el cromosoma 11 hasta el 18 resulta en la sobreexpresión de
un inhibidor de apoptosis (Freedman and Nadler 2003, Pratap and Scordino 2019).
2.4 Tratamiento e investigación del NHL

El tratamiento de elección dependerá del tipo y subtipo de NHL, así como del estadio de la
enfermedad. Es por esto que resulta fundamental un correcto diagnóstico. Este se basa
principalmente en el estudio de muestras de biopsia e incluye generalmente análisis de
inmunofenotipo, análisis citogenético y perfiles de expresión génica (Ansell 2015b, ACS
2018).
Clásicamente, el tratamiento del NHL ha consistido en el uso de quimioterapia,

complementada en ocasiones con radioterapia. Es común el uso de regímenes
quimioterapéuticos en los que se combinan fármacos con diferentes dianas celulares, de
modo que se intenta atacar a la célula tumoral proliferativa desde diferentes frentes con el
objetivo de incrementar el éxito del tratamiento. Las dianas a las que se suele dirigir la
terapia son la replicación del DNA y la polimerización de los microtúbulos; todo ello
necesario para la división celular. Estos tratamientos suelen ser bastante agresivos y generan
numerosos efectos secundarios puesto que son muchos los tipos celulares no transformados
que también se ven afectados. Entre los regímenes más empleados en el tratamiento de NHL
destacan CHOP y CVP, en los que drogas quimioterapéuticas (3 y 2 respectivamente) se
combinan con prednisona, un fármaco esteroideo (NCI 2019, Ansell 2015a, Ansell 2015b, LLS
2013).
18
Introducción
Cuando el tratamiento es efectivo, habitualmente se consigue prolongar el periodo libre de
progresión tumoral en el paciente, pero no la erradicación completa del tumor. Actualmente
se están dedicando grandes esfuerzos a determinar e investigar eventos o mecanismos que
ocurran en el tumor y que permitan dirigir la terapia de forma aún más directa y específica,
logrando la completa remisión de la enfermedad. En este sentido cabe destacar la
importancia que ha adquirido el estudio del microambiente tumoral como diana terapéutica
(LLS 2013). Existe evidencia de que el nicho en el que el tumor se encuentra participa
activamente en su origen y desarrollo, proporcionando un ambiente inmunosupresor que
permite a las células malignas evadir la respuesta inmunitaria, y aportando factores de
supervivencia y crecimiento, los cuales emplean estas células en su beneficio (Spranger
2016, Binnewies et al. 2018).
Actualmente se encuentran bajo desarrollo clínico nuevos fármacos, combinaciones y

regímenes de aplicación. Otras modalidades terapéuticas en desarrollo son los trasplantes
de células madre y la terapia biológica, que engloba a la terapia con anticuerpos
monoclonales, la inmunoterapia, el desarrollo de vacunas terapéuticas, la terapia
antiangiogénica y la terapia génica (ACS 2018, NCI 2019, LLS 2013).
3. Estrés oxidativo
El estrés oxidativo consiste en el desequilibrio, en un sistema vivo, entre los niveles de

especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxygen Species, ROS) y los sistemas antioxidantes de
defensa, a favor de los primeros. Esto puede ocurrir bien por una sobreproducción de ROS, o
bien por un fallo en la capacidad de neutralizarlos o de reparar el daño causado. Cabe
destacar que además de las ROS de origen endógeno, existen fuentes exógenas como
contaminantes del aire y agua, tabaco, alcohol, metales pesados, drogas y diferentes tipos
de radiación. Las ROS, tanto endógenas como exógenas causan daño, mediante
modificaciones oxidativas, a nivel de carbohidratos, lípidos, proteínas y DNA (Schieber and
Chandel 2014, Sies 2015).
3.1. Especies Reactivas de Oxígeno: funciones fisiológicas

Las ROS, en el contexto de su origen endógeno, son moléculas químicamente reactivas
derivadas de la reducción del oxígeno molecular (O2), molécula estable y poco reactiva.
19
Introducción
Entre las principales ROS se encuentran el anión superóxido (•O2-), el oxígeno singlete (1O2),
el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (•OH). La principal fuente de ROS es la
mitocondria, el orgánulo responsable del metabolismo respiratorio aerobio celular. El anión
superóxido, precursor de la mayoría de ROS restantes, se produce como resultado de la
reducción del oxígeno molecular por parte de las NADPH oxidasas, mediante la transferencia
de un electrón. Esto tiene lugar principalmente en el complejo III de la cadena respiratoria. El
anión superóxido es posteriormente convertido en su práctica totalidad a peróxido de
hidrógeno por acción de las superóxido dismutasa 1 y 2 (SOD 1 y 2), de localización citosólica
o mitocondrial respectivamente. El peróxido de hidrógeno no es un radical libre en sí mismo
ya que no presenta electrones desapareados, pero a través de la reacción de Fenton es
capaz de dar lugar al ion hidroxilo, una ROS altamente reactiva que oxida y daña de forma
indiscriminada lípidos, proteína y DNA (Nickel, Kohlhaas and Maack 2014, Angelova and
Abramov 2016).
Las ROS se generan como productos normales del metabolismo aerobio y además de los
efectos potencialmente nocivos derivados de su inestabilidad reactiva, que pueden llegar a
comprometer la viabilidad celular; también cumplen importantes funciones fisiológicas,
principalmente de adaptación a situaciones de estrés celular. El efecto fisiológico o dañino
de las ROS depende por tanto de los niveles acumulados en la célula. Mientras que niveles
bajos y controlados son necesarios para el mantenimiento de la homeostasis y la adaptación
a estrés, niveles elevados son responsables de daño celular. El H2O2 es la especie
principalmente responsable de las funciones fisiológicas. Así, en una situación de hipoxia
(tensión de O2 por debajo del 3%), se induce la producción de ROS con el objetivo de activar
a HIF, la molécula responsable de organizar la respuesta transcripcional que permite la
adaptación a hipoxia. El mecanismo por el que las ROS activan HIF es mediante la inhibición
de su hidroxilación. A nivel transcripcional las ROS también regulan la expresión de VEGF,
una de las dianas de HIF, responsable de inducir la formación de nuevos vasos sanguíneos.
Las ROS participan en el control de la autofagia, un mecanismo celular que permite el
mantenimiento de la homeostasis mediante el continuo reciclado de estructuras celulares
dañadas, así como el reciclado de nutrientes en una situación de privación de los mismos,
mediante la oxidación e inactivación de la cisteín proteasa Atg-4. Las ROS participan también
en los mecanismos de inmunidad innata siendo el mecanismo más conocido el de la
destrucción oxidativa directa de patógenos, mediada por NADPH oxidasas, que tiene lugar
20
Introducción
en los fagosomas. También participan como transductores de señales de receptores Toll Like
(TLRs), receptores RIG-1 Like (RLRs) y de citoquinas inflamatorias. Estudios en los que se
redujeron los niveles endógenos de ROS en células madre mostraron que la diferenciación
de estas se veía inhibida o retrasada, lo que sugiere que las ROS también juegan un papel
fundamental en este proceso. (Angelova and Abramov 2016, Hamanaka and Chandel 2009,
Sena and Chandel 2012, Bartosz 2009, Schieber and Chandel 2014, Dayem et al. 2010)
3.2 Estrés oxidativo: daño celular, enfermedad y cáncer

Como hemos visto, es el acumulo excesivo de ROS en la célula lo que genera estrés
oxidativo. Este puede resultar en daño a nivel de DNA, proteínas y lípidos de membrana.
Este daño en las células y tejidos se ha relacionado con numerosas enfermedades en
humanos incluyendo enfermedades cardiovasculares, metabólicas, desordenes cognitivos,
enfermedades neurodegenerativas y diferentes tipos de cáncer; así como con el proceso de
envejecimiento, tanto normal como precoz, a través de la inducción de senescencia celular
(Ghezzi et al. 2017, Liguori et al. 2018).
Existe abundante literatura sobre la relación entre estrés oxidativo y cáncer, pero lejos de
llegar a un consenso parece ser que las implicaciones del estrés oxidativo en cáncer son tan
amplias como tipos diferentes de cáncer existen. El estrés oxidativo se relaciona con el
cáncer de forma directa e indirecta. El estrés oxidativo podría inducir transformación celular
de forma directa a través del daño oxidativo en el DNA y su modificación química. Este daño
en el material genético resultaría en el bloqueo de la transcripción, inducción de errores e
inestabilidad genómica. De forma indirecta se relaciona a través de otros mecanismos como
el envejecimiento y la inflamación, mecanismos estrechamente relacionados con el cáncer y
en los que el estrés oxidativo también juega un papel fundamental. Se sabe que las ROS en
particular activan el factor de transcripción NFκB, que induce la expresión de genes
implicados en proliferación celular, apoptosis y carcinogénesis. Las ROS, producto de la
inflamación crónica, también pueden activar los factores de transcripción c-fos y c-jun,
implicados en transformación neoplásica e inducción de angiogénesis, de vital importancia
para el foco tumoral, a través de factores angiogénicos (FGF, VEGF, prostaglandinas E1 y E2).
El material genético dañado, especialmente los residuos 8-oxodG y 8-nitroguanina, se
consideran biomarcadores de carcinogénesis inducida por inflamación (Moloney and Cotter
2018).
21
Introducción
3.3 Mecanismos de defensa antioxidante
Para garantizar el correcto funcionamiento de la célula son necesarios mecanismos que
permitan mantener el fino ajuste en los niveles de ROS que aseguren la eficacia e inocuidad
de la señalización redox. Estos mecanismos se pueden entender como defensas
antioxidantes en cuanto que evitan el acúmulo y acción potencialmente dañinos de las ROS.
La célula tiene diferentes mecanismos de defensa antioxidante que se suelen clasificar como
enzimáticos y no enzimáticos. Dentro de los enzimáticos destacan el sistema superóxido
dismutasa (SOD), que como se ha mencionado anteriormente convierte al anión superóxido
en peróxido de hidrogeno; La catalasa (CAT), que descompone el peróxido de hidrogeno en
agua y oxígeno molecular; y glutatión peroxidasa (GSH-Px) que convierte peróxidos y
radicales hidroxilo en formas no tóxicas mediante la oxidación del glutatión (GSH) reducido.
Entre los no enzimáticos, presentes principalmente en sangre y plasma, encontramos
bilirrubina, α-tocoferol, β-carotenos, albúmina y ácido úrico. Además de estos antioxidantes,
llamados en su conjunto endógenos, existen antioxidantes exógenos, incorporados
principalmente a través de la dieta o como parte de un tratamiento farmacológico. Entre
estos encontramos vitamina C, α-tocoferol, compuestos fenólicos (resveratrol, flavonoides) y
minerales (zinc, selenio) (Liu et al. 2018, Snezhkina et al. 2019).
3.4 Glutatión
El glutatión es considerado uno de los principales sistemas antioxidante y detoxificante de la
célula. Se encuentra de forma ubicua en todos los tipos celulares del organismo y está
ampliamente distribuido en el reino vegetal y animal. Es un tripéptido no proteico de
cisteína, glutamina y glicina, sintetizado en el citoplasma en dos pasos dependientes de ATP.
En primer lugar L-glutamato y cisteína se combinan para dar lugar a la glutamil-cisteína en
una reacción catalizada por la enzima γ-glutamil-cisteína-ligasa (GCL), siendo esta la etapa
limitante. En una segunda etapa, la enzima glutatión-sintasa (GS), cataliza la unión de
glutamil-cisteína y glicina para dar lugar al glutatión en su forma reducida (GSH) (Forman,
Zhang and Rinna 2009) (Figura 5).
22
Introducción
Figura 5. Biosíntesis, actividad y

regeneración celular del glutatión. El
glutatión en su forma reducida se genera a
partir de cisteína, glutamato y glicina en un
proceso de dos etapas catalizadas por las
enzimas γ-glutamil-cisteína ligasa (GCL) y
glutatión sintasa (GS) respectivamente. GSH
en su forma reducida es capaz de reducir al
peróxido de hidrogeno a agua mediante la
acción de la enzima glutatión peroxidasa
(GPX) pasando así a un estado oxidado. La
forma oxidada es reciclada nuevamente
mediante la acción de la glutatión reductasa
(GR).
GSH es capaz de donar un equivalente de reducción a moléculas reactivas, como ROS,

mediante la enzima peroxidasa GSH-Px. De esta forma el glutatión se convierte en una forma
reactiva que es rápidamente neutralizada mediante su unión a otra molécula de glutatión
reactivo, dando lugar al disulfuro de glutatión (GSSG). La enzima glutatión reductasa (GR)
cataliza la regeneración de GSH a partir de GSSG. En condiciones normales más del 90% del
glutatión presente en la célula se encuentra en su forma reducida (GSH), y menos del 10% se
encuentra en forma neutralizada (GSSG). El análisis de sus niveles relativos se emplea para
evaluar el estado redox de la célula. Además de neutralizar directamente a las ROS por el
mecanismo descrito, GSH es capaz de regenerar antioxidantes exógenos como las vitamina C
y E. También actúa como detoxificante al conjugarse con agentes xenobióticos (Forman et al.
2009).
GSH regula sus propios niveles intracelulares por un proceso de retroalimentación negativa
de la enzima GCL de forma que frente a una situación de altos niveles de ROS o de
sobrecarga de xenobióticos se estimula su síntesis. La deficiencia de GSH es características
de varios estados patológicos (Forman et al. 2009).
Se conocen varias moléculas capaces de modular la síntesis de GSH cuando son

administradas de forma exógena. Así pues la N-acetil-cisteína (NAC) es un precursor de la
síntesis de GSH (Aldini et al. 2018), mientras que la L-butionina (S-R) sulfoximina (BSO) es
una molécula que inhibe de forma irreversible a la enzima GCL, bloqueando por tanto la
síntesis de GSH en su etapa limitante (Drew and Miners 1984).
23
Introducción
24
Objetivos
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26
Objetivos
Las células linfoides circulan por el torrente sanguíneo en ausencia de anclaje a un sustrato
rígido. Sin embargo, su diferenciación y proliferación ocurren en órganos sólidos,
potencialmente en contacto con la matriz extracelular y con otras células. Su actividad
biológica también requiere la interacción directa con otras células. El ensayo de crecimiento
en agar blando, clásicamente empleado para evaluar in vitro la capacidad de crecimiento
celular independiente de anclaje, y por extensión su potencial tumorigénico, muestra que
las líneas linfoides tumorales son capaces de proliferar en agar blando, mientras que las
líneas linfoides inmortalizadas (pero no tumorales) no crecen en este medio semisólido.
En base a estos antecedentes nos planteamos como objetivo de este trabajo:
- Determinar los requerimientos de anclaje intercelular y/o a sustratos rígidos de

células linfoides inmortalizadas y de líneas de linfoma e identificar los mecanismos
moleculares implicados.
Los inesperados pero interesantes resultados obtenidos nos llevaron a reenfocar el
proyecto, estableciendo un objetivo adicional:
- Investigar el papel del estrés oxidativo en el crecimiento de los tumores linfoides.
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28
Materiales y
Métodos
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30
Materiales y Métodos
1. Líneas celulares
Las líneas celulares DG-75 y BL2 (BL), Toledo (DLBCL) y Jurkat (leucemia linfoblástica T
aguda), así como las líneas linfoblastoides B inmortalizadas no tumorales JY y X50-7; y los
linfocitos primarios (PBLs, Peripheral blood lympocytes,) extraídos de sangre de donantes
sanos (procedente del Centro de Transfusiones de la Comunidad de Madrid) y estimulados
con 5 µg/ml de leucoaglutinina y 50 U/ml de interleuquina 2, se cultivaron en medio RPMI
1640 (Gibco, Life Technologies). Las líneas celulares NIH/3T3 (fibroblastos embrionarios de
ratón), HeLa (adenocarcinoma de cérvix) y HEK-293T (células embrionarias de riñón humano)
se cultivaron en medio DMEM (Gibco, Life Technologies). Ambos medios se suplementaron
al 10% con suero bovino fetal (Gibco, Life Technologies), 2 mM glutamina (Gibco, Life
Technologies), 100U/ml de penicilina (Penilevel, Laboratorios ERN) y 100 μg/ml de
estreptomicina (Laboratorio Reig Jofré). Las células se mantuvieron en condiciones de cultivo
estándar (37ºC, 5% CO2) y se testaron de forma periódica para descartar contaminación por
micoplasma.
2. Ensayo de formación de colonias en agar blando
Estos ensayos se llevaron a cabo en diferentes soportes plásticos en función de su duración.

Para el ensayo cásico o de tiempo largo (3-4 semanas) empleamos placas de 6 pocillos
(MW6), mientras que para los ensayos de tiempo corto (24-72h) se emplearon tubos de
polipropileno de 15 ml. Se preparó un stock inicial de agar (Agar noble, Difco) al 5% en agua
miliQ mediante disolución a alta temperatura (microondas, máxima potencia a intervalos de
15 segundos). Tras esterilización mediante autoclavado, se prepararon soluciones al 0.5% y
al 0.33% en medio RPMI (20% FBS, 2mM glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de
estreptomicina) y se mantuvieron a una temperatura entre 37 y 40ºC en baño para evitar su
pronta gelificación. Se recubrió cada pocillo de la placa de cultivo con 2 ml de agar al 0.5%,
generando una capa que impide el contacto de las células con la superficie plástica. Tras
permitir su gelificación a temperatura ambiente, se depositó sobre ella 2 ml de agar al 0.33%
conteniendo 5 x104 células (densidad de siembra: 2.5 x104 células/ml). Una vez gelificada la
capa superior, las placas se mantuvieron en condiciones normales de cultivo celular. De
forma periódica se añadió sobre la capa superior un pequeño volumen de medio RPMI para
prevenir el desecado del gel. Para los experimentos de corta duración se puso a punto una
31
versión del ensayo en la que 1 ml de agar al 0.33%, conteniendo 10 x104 células, es
directamente depositado en un tubo de polipropileno de 15 ml. Para facilitar la rápida
gelificación del agar, los tubos se incubaron durante 5 minutos en hielo. Los tubos se
mantuvieron en condiciones normales de cultivo con el tapón parcialmente desenroscado
para permitir el correcto intercambio de gases.
3. Recuperación de células sembradas en agar
Para recuperar las células sembradas en el agar blando se siguieron dos aproximaciones.
Para los ensayos de citometría de flujo, en los que es necesario preservar la viabilidad
celular, se recurrió a diluir el gel de agar 0.33% con PBS 1X en una proporción 1:1. Se
procedió entonces a incubar con las correspondientes sondas durante el tiempo necesario y
bajo las condiciones adecuadas para cada una de ellas, asegurándonos su correcto mezclado.
Para la determinación de proliferación, ciclo celular, extracción de proteína y extracción de
RNA, en los que la presencia de agar impide el procesamiento habitual, se puso a punto un
método alternativo que permite la recuperación de la población total de células, pero no
permite determinar su viabilidad. El gel de agar al 0.33% se diluyó con PBS 1X y se incubó a
85ºC durante 3 min, tiempo suficiente para licuar el agar, permitiendo la sedimentación
celular tras centrifugación a 1300 RPM durante 5 min a 40ºC. Tras lavado con PBS 1X, el
pellet celular se procesó de forma normal según el tipo de análisis.
4. Ensayos de impedimento de anclaje

4.1 Poly-HEMA
Se recubrieron las superficies de cultivo plástico con Poly-HEMA (Poli (2-hidroxietil
metacrilato), Sigma-Aldrich-Merk), un polímero de metacrilato biológicamente inerte que
impide la adhesión celular al plástico de las placas de cultivos. Se preparó a una
concentración de 15 mg/ml en etanol 95%, manteniéndolo en agitación a 37ºC hasta su
completa disolución. Se recubrieron pocillos de placas MW96 y MW24 con 30 µl o 200 µl
respectivamente y se permitió su secado durante la noche en cabina de flujo laminar con
tapa abierta, lámpara UV apagada, flujo apagado y cabina cerrada. Al día siguiente, con la
cabina aun apagada y cerrada, la placa se irradió con luz UV durante 30 minutos. Se realizó
posteriormente un lavado de los pocillos con PBS en condiciones de esterilidad. Finalmente,
las células se sembraron en su medio de cultivo correspondiente a la densidad celular
requerida para cada experimento.
32
4.2 Metilcelulosa
Se empleó metilcelulosa (1500 cps, R&D Systems) como agente viscosizante del medio de
cultivo celular con el objetivo de limitar la movilidad celular e impedir las interacciones
intercelulares. El stock original (3%) se diluyó al 1% en medio RPMI o DMEM conteniendo las
células a una densidad de 1000 células/ml. Se sembró 1 ml de esta preparación por pocillo
de placas MW24 previamente recubiertos con Poly-HEMA. La capacidad proliferativa se
estimó como capacidad de formación de colonias.
4.3 Bloqueo con anticuerpos y tratamiento con compuesto A-286982

Células sembradas en pocillos de placa MW96 a una densidad de 10x105 células en un
volumen de 100 μL, se incubaron en presencia de anticuerpos monoclonales frente a
diferentes moléculas de membrana, esto es, integrinas y miembros de la familia de las
inmunoglobulinas. Estos anticuerpos fueron producidos como sobrenadantes de cultivo de
hibridomas por el grupo del Dr. Sánchez Madrid (Hospital de la Princesa, Madrid). En la tabla
1 se indican los anticuerpos utilizados y las moléculas que reconocen. Los resultados se
evaluaron por observación al microscopio de contraste de fases al cabo de 1 y 6 horas, en
función de la cinética de agregación de las diferentes líneas celulares.
El compuesto A-286982 (Sigma-Aldrich-Merk), inhibidor especifico de la interacción entre la

integrina α1 e ICAM-1 (miembro de la familia de las inmunoglobulinas), se preparó en DMSO
a una concentración de 10 mM. Células sembradas a una densidad de 2.5 x105 células/ml en
500 μl por pocillo de placas MW24, recubiertos o no con Poly-HEMA, se incubaron en
presencia del compuesto A-286982 a una concentración final de 2 µM. Tras 72h se evaluó su
efecto funcional mediante observación al microscopio, así como su efecto sobre la capacidad
proliferativa de las células.
33
Anticuerpo hibridoma Molécula reconocida

X63 No reconoce ninguna molécula
W6/32 HLA clase I
Lia3/2.1 Cadena β2 de LFA-1
TP1/40 Cadena αL de LFA-1
TS1/11 Cadena αL de LFA-1
RR1/1 ICAM-1
HP2/1 Cadena α4 de VLA-4
TS2/16 Integrina β1 Tabla 1. Anticuerpos
empleados y moléculas
TP1/24 ICAM-3 reconocidas.
4.4 Ensayo clonogénico

Se sembraron células de forma aislada en pocillos de placas MW96 (1 célula/pocillo),
recubiertos o no con Poly-HEMA, empleando un equipo de separación FACS Vantage
(Becton Dickinson). Al cabo de 3 semanas se evaluó la capacidad proliferativa de las células
aisladas mediante observación al microscopio de contraste de fases y conteo de los pocillos
en los que hubo proliferación. La eficacia de la siembra individual de linfocitos se comprobó
previamente mediante siembra de células marcadas con la sonda fluorescente CFSE (éster
de carboxifluoresceína succinimidil, Thermo Fisher Scientific) a una concentración final de 1
μM.
5. Análisis de proliferación y ciclo celular
La capacidad proliferativa de las células se evaluó tras los diferentes tratamientos empleados
mediante tinción con azul tripán (Sigma-Aldrich-Merk) y conteo en hemocitómetro o
mediante análisis por citometría de flujo de la incorporación de EdU, un análogo de la
timina. Para ello las células se incubaron en medio completo con EdU 10 μM durante 2h a
37ºC empleando el kit “Click-iT EdU Alexa fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit” (Life
technologies, Invitrogen) y siguiendo las instrucciones proporcionadas por la casa comercial.
Para el análisis de ciclo celular, las células se fijaron con etanol frio al 70% y se tiñeron con
una solución 38 mM de citrato sódico, 69 μM de ioduro de propidio (IP) y 100 μg/ml de
ARNasa durante 30 minutos a 37ºC. Los perfiles de ciclo celular se obtuvieron mediante
34
análisis por citometría de flujo empleando el equipo FACS-Canto II (Becton Dickinson). Los
datos se analizaron con el programa ModFit LT (Verity Software).
6. Extracción de RNA y qPCR
El RNA total de las líneas celulares se obtuvo empleando el kit “RNeasy mini Kit” (Quiagen),
siguiendo las instrucciones de la casa comercial, o mediante extracción con trizol (Tri
Reagent solution, Applied Biosystems). La concentración de RNA se midió con el
espectrofotómetro Nanodrop1000 (Thermo Fisher Scientific) y su integridad se determinó
mediante electroforesis utilizando RNA Nano Chips en el equipo 2100 Bioanalyzer (Agilent
Technologies). El RNA se retrotranscribió a cDNA mediante RT-PCR empleando el kit
comercial “High-CapacitycDNA Reverse Transcription Kit” (Applied biosystems). El cDNA
obtenido se empleó como substrato de la qPCR, la cual se llevó a cabo empleando sondas
Taqman específicas para cada gen de interés (Applied Biosystems) y la master mix
“TaqMan™ Universal Master Mix II” (Applied biosystems). Se empleó el equipo 7900HT Fast
Real-Time PCR System (Applied biosystems). La reacción de qPCR se inició con un paso de
desnaturalización a 95ºC durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a
95ºC durante 15 segundos y alineamiento y elongación a 60ºC durante 1 minuto. Los valores
de expresión de ARNm se normalizaron con respecto a la expresión del gen de referencia
GUSB, expresado de forma constitutiva, mediante comparación de los valores CT. Se
emplearon las sondas para los genes PGK1, GYS1, NANOG, OCT4 y CDCA7.
7. Western blot
Se obtuvieron extractos de proteína mediante lisis de pellets celulares con tampón de lisis 2X
(125 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% glicerol). La concentración de proteína obtenida se
determinó mediante el método de Lowry (DC Protein Assay Reagent kit, Bio-Rad 500-0116).
Las proteínas se separaron en geles de poliacrilamida al 7% en condiciones desnaturalizantes
(SDS-PAGE), cargando 50 μg de proteína por pocillo. Posteriormente se realizó transferencia
a membrana de nitrocelulosa (AmershamTM ProtranTM 0,45 μm NC; GE Health Care Life
Science) durante 30 min. La membrana se bloqueó con una solución de leche desnatada al
5% en TBS a temperatura ambiente durante 30 minutos. La incubación con anticuerpos
primarios se realizó durante la noche a 4ºC. Tras lavado con TBS, las membranas fueron
finalmente incubadas con el anticuerpo secundario durante una hora a temperatura
35
ambiente. Las membranas se revelaron empleando la tecnología Li-COR Odyssey (LI-COR
Biosciences). Los anticuerpos primarios empleados fueron anti-YAP/TAZ (1:1000, Cell
Signaling Technology) y anti GAPDH (Sigma-Aldrich). Como secundario se empleó el
anticuerpo anti-conejo conjugado con IR 680 (1:140000, LI-COR Biosciences).
8. Tratamiento con BSO, NAC y Z-VAD
Se preparó un stock inicial del inhibidor específico e irreversible de GCL, L-Butionina-

sulfoximina (BSO, Sigma-Aldrich-Merk), a 10 mM en medio RPMI. Para el tratamiento de las
células se añadió al medio de cultivo a una concentración final de 50 μM. La N-acetil-L-
cisteína (NAC, Sigma-Aldrich-Merk), antioxidante precursor de la síntesis de glutatión, se
preparó en medio RPMI a una concentración de 180 mM, ajustando el pH a 7,4. Se empleó
en tratamiento a una concentración final de 5 mM. El inhibidor de caspasas Z-Val-Ala-DL-
Asp-fluorometilcetona (Z-VAD, Bachem) se preparó a una concentración de 20 mM en DMSO
y se añadió a las células en cultivo a una concentración final de 80 μM.
9. Análisis de viabilidad celular
Para determinar la viabilidad de células sembradas en agar blando, con o sin tratamientos,
se siguieron dos aproximaciones diferentes. Por un lado, se marcaron las células recuperadas
del agar blando, así como sus respectivos controles en medio líquido con el marcador
fluorescente de viabilidad celular calcina-AM (Thermo Fisher Scientific) a una concentración
final de 0.025 μM. Tras incubación de 30 minutos a temperatura ambiente y oscuridad, se
analizó mediante citometría de flujo la intensidad de fluorescencia de la sonda en las células.
La otra aproximación consistió en estimar la viabilidad celular mediante citometría de flujo
en base a las diferencias en tamaño y complejidad que presentan las células viables con
respecto a las células muertas. Para ello se establecieron previamente las regiones
correspondientes a células vivas y a células muertas. Se realizó una cotinción de calceína-AM
y anexina V-PE (BD Biosciences) en células normales, en células sometidas a choque térmico
(65ºC, 10 minutos) y en una mezcla al 50% de las anteriores. Tras analizar la incorporación
de ambas sondas mediante citometría de flujo, los datos se volcaron sobre un plot tamaño-
complejidad.
36
10. Detección de ROS y GSH por citometría de flujo
Los niveles intracelulares de ROS se evaluaron mediante el uso de la sonda DCFDA (diacetato
de 2′,7′-dichlorodihydrofluoresceina, Abcam). Dentro de la célula, las esterasas escinden el
compuesto liberando el fragmento DCF, que es oxidado por las ROS intracelulares emitiendo
fluorescencia. Las células se incubaron, a una densidad de 1x106 células/ml en 500 μl por
pocillo de una placa MW24, con DCFDA 50 μM en ausencia de FBS a 37ºC, durante 30
minutos y en oscuridad. A continuación las células se sembraron a una densidad de 105
células/ml en medio líquido completo (control) o en agar blando al 0.33% durante 24 horas.
Las células se recogieron como se ha indicado anteriormente y se analizaron por citometría
de flujo (Cytomics FC500 MPL, Beckman Coulter).
Los niveles intracelulares de GSH se detectaron empleando la sonda fluorescente mBCI

(monoclorobimano, Sigma-Aldrich-Merk). Este compuesto difunde dentro de las células,
donde se conjuga a GSH, emitiendo fluorescencia. Células sembradas en agar, con o sin
tratamientos adicionales, y recuperadas como se ha descrito anteriormente, se incubaron
con mBCI a una concentración final de 10 µM durante 30 minutos a 37ºC y en oscuridad. Las
células se analizaron por citometría de flujo (FACSCanto II, Becton Dickinson).
11. Generación de vector de expresión de GCLC
Mediante retrotranscripción de RNA total extraído de células HuVEC, se obtuvo cDNA a

partir del cual se amplificó, mediante PCR, la región codificadora de GCLC. Se emplearon
oligonucleótidos específicos para GCLC y se introdujeron sitios de restricción AgeI y MluI,
necesarios para el posterior clonaje de la secuencia en el vector de expresión pRRL. La
secuencia de los oligonucleótidos empleados es GGTCAGACGCGTATGGGGCTGCTGTCCCAG
(directo) y GGTCAGACCGGTCTAGTTGGATGAGTCAGTTTTACTTCCAC (reverso).
12. Transfección celular y producción de lentivirus
Se usaron células HEK-293T como empaquetadoras de partículas lentivirales. Para ello

células al 70-80% de confluencia fueron transfectadas mediante el método de fosfato cálcico
(Campanero and Flemington 1997) con 15 μg del plásmido de empaquetamiento Pax2, 45 μg
37
del vector VsVG, codificante de proteínas de la envuelta viral; y 60 μg del plásmidos de
interés. En la tabla 2 se indican los plásmidos empleados. 16 h tras la transfección se realizó
un lavado con PBS 1X para eliminar los precipitados de fosfato cálcico. Se realizó una
primera recogida de sobrenadante viral a las 48 horas tras la transfección y una segunda
recogida 24 h después. Los sobrenadantes virales se almacenaron en alícuotas de 1 ml a -
80ºC.
Nombre Origen Función Marcador

pRRL-empty Generado Control expresión GFP
pRRL-GCLc Generado Expresión GCLC GFP
pLKO-shctrl Generado Control silenciamiento puro-R
pLKOshGCLc62 Comercial Silenciamiento sh GCLC puro-R
Tabla 2. Plásmidos empleados en la transfección de células para la producción de partículas

lentivirales. Los plásmidos comerciales corresponden al producto MISSION shRNA Plasmid DNA
(Sigma-Aldrich-Merck).
13. Transducción lentiviral
Los sobrenadantes virales se añadieron al cultivo celular (106 células en 1 ml de medio) en

una proporción 1:1 (en volumen) y en presencia de los coadyuvantes sulfato de protamina
(RPMI) o polibreno (DMEM) a una concentración de 8 μg/ml. 24 h tras la infección se realizó
un lavado y 24 h después se evaluó la eficacia de infección de las partículas que portan el
plásmido pRRL mediante detección de GFP por citometría de flujo. 48 h tras el lavado se
pusieron en selección con puromicina, durante 72-96 horas, las células infectadas con
partículas que portan el plásmido pLKO.
14. Xenotrasplante en ratones NOD-SCID
Se emplearon hembras de ratones inmunodeficientes NOD-SCID de entre 6 y 8 semanas de

edad procedentes de la producción propia del animalario del instituto de Investigaciones
Biomédicas Alberto Sols (CSIC-UAM, Madrid). En el flanco izquierdo de cada ratón se
inocularon subcutáneamente células DG-75 transducidas con sh-ctrl (control), mientras que
38
en el flanco derecho se inocularon células en las que se había silenciado la expresión de
GCLC mediante los shRNA shGCLc65 o shGCLc86. Se inocularon 2x106 células por flanco en
100 μl de PBS 1X. Al cabo de 3 semanas los ratones fueron sacrificados para extirpar las
masas tumorales. Este mismo procedimiento se llevó a cabo empleando la línea celular
Jurkat. Durante todo el tratamiento se mantuvieron las condiciones de estabulación
requeridas por su estado inmunitario y con libre disposición de agua y alimento.
15. Detección de ROS en tejidos de ratones λ-MYC
Como modelo de BL se emplearon ratones λ-MYC (colonia propia), hemicigotos para

inserción del oncogén MYC. Animales que desarrollaron masas tumorales fueron sacrificados
para extraer los tumores y los bazos. Como control se empleó el bazo de ratones wild type
(wt). Se utilizaron 3 parejas de ratones hermanos λ-MYC/wt procedentes de camadas
diferentes. Los tumores y bazos extraídos se disgregaron en PBS 1X frio, empleando para ello
filtros celulares de 100 μM de tamaño de poro (cell strainer, Thermo Fisher). A continuación
se incubaron las suspensiones celulares con el anticuerpo anti CD-19, así como con las
sondas DHE (dihidroetidio, Thermo Fisher Scientific) y mBCI a las mismas condiciones
previamente descritas. Inmediatamente tras la incubación, las muestras se analizaron
mediante citometría de flujo.
16. Tratamiento con BSO de ratones λ-MYC
Se trataron ratones λ-MYC (machos y hembras) recién destetados (3-4 semanas de edad)
con BSO (Abcam) suministrado en el agua de bebida a una concentración de 20 mM. Como
controles se emplearon ratones λ-MYC hermanos de camada sin tratamiento. El BSO se
preparó de forma semanal y se testó para comprobar su funcionamiento (disminución
niveles de GSH en cultivo liquido e inducción de muerte en cultivo de agar) y la ausencia de
toxicidad en cultivo líquido. Para confirmar el funcionamiento del tratamiento in vivo, se
evaluaron los niveles de GSH en sangre. Para ello se obtuvieron muestras de sangre de cada
ratón antes de comenzar el tratamiento, y después de iniciado el mismo (2, 6 y 8 semanas
dependiendo del grupo de animales) mediante punción del seno venoso submandibular.
Para ello se recolectaron 2-3 gotas de sangre en un tubo de polipropileno de 1.5 ml con 30 μl
de enoxaparina sódica 4000 UI (Clexane, Sanofi). Dicho volumen se diluyó con 1 ml de PBS
1X. 250 μl de esta dilución se incubaron durante 30 minutos a 37ºC y oscuridad con la sonda
39
fluorescente mBCI. De forma previa a la evaluación de los niveles de GSH por citometría de
flujo, se diluyó cada muestra en 2 ml adicionales de PBS 1X para garantizar el correcto flujo
de células a través del citómetro. Los animales se mantuvieron bajo observación durante
todo el tratamiento siendo sacrificados en el momento en el que desarrollaron masas
tumorales palpables. Se registró el periodo de vida de los ratones así como el peso de los
tumores y bazos.
17. Generación de la línea híbrida de ratón LXG
Para generar la línea hibrida LXG (λ-MYC;Gclm-/-), se cruzaron hembras λ-MYC con machos
Gclm-/- (proporcionados por los doctores Ying Chen y Vasilis Vasiliou; Yale University, New
Heaven). Individuos descendientes (F1) de diferentes parejas reproductoras, heterocigotos
para la deleción de Gclm y hemicigotos para el transgén MYC, se cruzaron entre sí. De la
descendencia obtenida (F2) se seleccionaron para estudio los ratones homocigotos para la
deleción de Gclm y portadores del transgén MYC. Debido a la alta mortalidad de las hembras
λ-MYC, se mantuvo una colonia de ratones nodriza CD1 (Producción propia animalario IIBm)
para garantizar la viabilidad de las camadas en caso necesario.
18. Genotipado de ratones
Para el genotipado de los ratones por PCR, se aisló DNA genómico de biopsias de oreja. La
extracción se realizó mediante el método de lisis alcalina con NaOH 50mM durante 10
minutos a 95ºC, seguido de neutralización con Tris-HCl 1M pH8 y posterior recogida del
sobrenadante. Para genotipar los ratones de la línea λ-MYC se emplearon de forma conjunta
los oligonucleótidos M17 (5´-CTGCTGGTGGTGGGCGGTGTCTC-3´) y M18 (5´-
TGTCCAAAGGGGGTGAAAGGGTGCTC-3´); para la línea Gclm se emplearon de forma conjunta
los oligonucleótidos Gclm-OL183 (5´-AACGTTGCAAGCTACTGC-3´), Gclm-OL184 (5´-
ATATGCGAAGTGGACCTG-3) y Gclm-OL187 (5´-CAAATCCTGGTTAAAGGCTA-3´). Las
condiciones de la PCR son las que se indican en la tabla 3.
40
Etapa Línea λ-MYC Línea GCLm (-/-)

Desnaturalización inicial 94ºC 4 min 94ºC 4 min
Desnaturalización 94ºC 1 min 94ºC 30 seg
Alineamiento x35 65ºC 2 min 57ºC 30 seg
Elongación 72ºC 1 min 72ºC 30 seg
Elongación final 72ºC 10 min 72ºC 8 min
Conservación 4ºC Indefinido 4ºC indefinido
Tabla 3. Programas de PCR empleados para el genotipado de los ratones.
19. Elaboración de figuras y análisis estadístico.
La representación gráfica y el análisis estadístico de los datos se realizó con el programa

GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc.), considerando significativamente estadísticos los
resultados con un p-valor <0.05. Los test empleados fueron 1way-ANOVA, 2way-ANOVA,
ambos con posterior test de Bonferroni; así como t-Student. Para el análisis de curvas de
supervivencia se empleó el test de Mantel-Cox. Todos los ensayos se realizaron por
triplicado (n=3) a no ser que se indique lo contrario en el correspondiente pie de figura.
41
42
Resultados
43
44
Resultados
1. Las líneas celulares linfoides, tanto inmortales no tumorales como

tumorales, son capaces de proliferar en ausencia de anclaje a sustrato
rígido
Partiendo de que las líneas de células linfoides tumorales son capaces de proliferar en agar
blando, mientras que las líneas de células linfoides inmortales no tumorales no lo son
(Jiménez-P et al. 2018) (Ver figura 3 en Introducción), y de que el cultivo en agar blando
impide tanto el anclaje al sustrato rígido como a otras células, nos propusimos investigar
cuales son los requisitos de anclaje que las células tumorales consiguen evadir. Para ello
seleccionamos las líneas linfoides inmortales no tumorales JY y X50-7 y las líneas linfoides
tumorales DG-75, BL2 y Toledo, así como cultivos de linfocitos primarios extraídos de sangre
de donantes sanos (PBLs). Como controles de células adherentes empleamos las líneas de
adenocarcinoma de cérvix HeLa y de fibroblastos inmortales no tumorales NIH/3T3.
Estudiamos su capacidad proliferativa sobre pocillos recubiertos con poly-HEMA, un
polímero biológicamente inerte que impide la adhesión celular al sustrato plástico
(Fukazawa et al. 1996). La observación 24 horas tras la siembra reveló que las líneas
adherentes empleadas como control, son incapaces de anclarse al plástico de la placa de
cultivos (sustrato rígido), formando agregados celulares en suspensión (Figura 6). Este efecto
se mantuvo a tiempos más largos (no mostrado). Una proporción variable de células
linfoides formaba agregados celulares en cultivo en medio líquido mientras que el resto de
células se encontraban adheridas al plástico, siendo las células inmortales no tumorales JY y
X50-7 las que presentaban mayor tendencia de adhesión al plástico (figura 6). Las células
Toledo no se adherían ni al plástico ni entre ellas (Figura 6).
45
Resultados
Figura 6. El tratamiento de la superficie de cultivo plástico con Poly-HEMA impide el anclaje de las
células al plástico de las placas de cultivo. Imágenes representativas de microscopía de contraste de
fases de los cultivos en medio líquido de las células indicadas en placas de cultivo tratadas como se
indica. Barra de escala: 100 μm.
La capacidad proliferativa se evaluó mediante conteo con hemocitómetro 72h tras la

siembra sobre poly-HEMA. A diferencia de las líneas celulares empleadas como controles de
adhesión a sustrato, ninguna línea linfoide mostró diferencias significativas con respecto a
sus respectivos controles en ausencia de poly-HEMA (Figura 7A). En el caso de HeLa se
observó una disminución de en torno al 40% en la capacidad proliferativa, mientras que en
la línea NIH/3T3 disminuyó hasta en un 95% (Figura 7A). De forma complementaria, el
análisis de proliferación celular mediante incorporación de EdU mostró que la capacidad
proliferativa de las líneas linfoides no se ve afectada por la incapacidad de anclaje al sustrato
rígido (Figura 7B). La evaluación de la viabilidad celular por incorporación de IP tampoco
mostró diferencias significativas en ninguna de las líneas linfoides estudiadas (Figura 7C). Por
el contrario, la mayor incorporación de IP en las líneas HeLa y NIH/3T3 sembradas sobre
Poly-HEMA confirmó su pérdida de viabilidad (Figura 7C).
46
Resultados
Figura 7. La privación de anclaje al sustrato

rígido ejercida por Poly-HEMA no afecta a la
proliferación ni a la viabilidad de células
linfoides. (A) Evaluación de la capacidad
proliferativa mediante conteo en
hemocitómetro. (B) Evaluación de capacidad
proliferativa mediante incorporación de EdU.
(C) Evaluación de viabilidad celular por
incorporación de IP. Los datos son la
media+sem (n=3). ***P<0.001; 2-way ANOVA
con post-test de Bonferroni.
2. El bloqueo de la interacción LFA1-ICAM1, principal responsable de las

interacciones intercelulares entre linfocitos, no afecta a la capacidad
proliferativa de estos
Puesto que las células linfoides consiguen proliferar de forma normal cuando se impide su
anclaje al sustrato rígido y en base a la observación de una mayor tendencia a la agregación
celular en estas mismas condiciones, al menos en las líneas de linfocitos inmortales no
tumorales; nos planteamos la posibilidad de que las células linfoides, viéndose privadas de la
capacidad de establecer interacciones con el sustrato, potencien las interacciones
intercelulares como mecanismo para garantizar su capacidad proliferativa.
Para determinar el papel que juegan dichas interacciones intercelulares en la capacidad de

crecimiento independiente de anclaje, en primer lugar, se determinó que moléculas de
superficie celular son las principalmente implicadas en las líneas linfoides. Para ello se
empleó un panel de anticuerpos frente a cada una de las moléculas candidatas,
principalmente miembros de la familia de las integrinas y de la superfamilia de las
inmunoglobulinas, lo que nos permitió observar su efecto sobre la agregación espontanea en
cada una de las líneas celulares linfoides. Los anticuerpos que presentaron un mayor efecto
47
Resultados
anti agregación fueron TP1.40 y RR1 (Figura 8), que bloquean de forma específica LFA1 e
ICAM1, respectivamente. Puesto que ambas moléculas interaccionan entre ellas,
confirmamos que la adhesión entre células linfoides está mediada en gran parte por la
interacción de ambas moléculas.
Para bloquear dicha interacción de forma mantenida y específica, empleamos el compuesto

A-286982, un inhibidor de la interacción de LFA1 con ICAM1. El tratamiento con este
inhibidor impidió notablemente la agregación intercelular (Figura 9 A), aunque no
completamente porque en el cultivo permanecían algunos grumos de pequeño tamaño (no
mostrado). Estos resultados sugieren que, aunque de forma minoritaria, deben de existir
otras moléculas mediando adhesiones entre linfocitos.
El análisis de proliferación celular no reveló ninguna diferencia significativa entre las células
control y las células tratadas con el compuesto A-286982, a excepción de la línea tumoral
Toledo, que si mostró una ligera disminución en su capacidad proliferativa (Figura 9B). No la
consideramos, sin embargo, biológicamente significativa puesto que precisamente Toledo es
la única línea que en condiciones de cultivo normal no forma agregados celulares, creciendo
en forma de suspensión de célula única (Figura 6). Estos datos sugieren que la adhesión
intercelular, mediada principalmente por la interacción entre LFA1 y ICAM1, no es necesaria
para la capacidad proliferativa de las células linfoides in vitro
48
Resultados
Figura 8. ICAM1 y LFA1 median de forma mayoritaria las interacciones intercelulares de los
linfocitos. Imágenes representativas de microscopía de contraste de fase de cultivo de las líneas
celulares (A) JY, (B) X50-7 y (C) DG-75 tras 4 horas de cultivo en presencia con los anticuerpos
indicados. Barra de escala: 100 μm.
3. las líneas celulares linfoides inmortales proliferan en ausencia total

de anclaje
Puesto que ni el bloqueo de la interacción célula-sustrato ni de las interacciones

intercelulares tiene ningún efecto por separado sobre la capacidad de proliferación celular,
decidimos bloquear de forma conjunta ambos tipos de interacciones. Para ello se trataron
células sembradas sobre Poly-HEMA con el compuesto A-286982. Una vez más los resultados
49
Resultados
no mostraron ninguna diferencia en cuanto a la capacidad proliferativa de las células no
tumorales en tratamiento con respecto a sus controles (Figura 9 C).
Figura 9. El compuesto A-286982, empleado de forma aislada o en combinación con Poly-HEMA

bloquea la interacción intercelular sin afectar a la capacidad proliferativa de las células. (A)
Imágenes representativas de microscopía de contraste de fase del cultivo de las líneas celulares
indicadas tratadas o no con el compuesto A-286982 (Comp.A/ C.A) y cultivadas sobre plástico
recubierto o no con poly-HEMA [P(H)]. (B) Evaluación de la proliferación celular relativa tras
tratamiento con compuesto A-286982. (C) Evaluación de la proliferación celular relativa tras
tratamiento combinado con compuesto A-286982 y Poly-HEMA. Los datos son la media+sem
(n=3). **P<0.01. ***P<0.001; 2-way ANOVA con post-test de Bonferroni.
50
Resultados
Dado que el compuesto A-286982 no impedía la formación de grumos de células de
pequeño tamaño, decidimos emplear una aproximación experimental adicional para impedir
la adhesión intercelular. Para ello, sembramos las células a baja densidad celular
combinando recubrimiento del plástico de cultivos con Poly-HEMA y suplementación del
medio líquido con metilcelulosa, un agente viscosante que a una concentración apropiada
impide el libre movimiento de las células sembradas, de forma que se consigue ausencia de
interacciones intercelulares. Tanto las líneas linfoides inmortales como las tumorales fueron
capaces de proliferar formando focos o colonias (Figura 10). Mientras que las células HeLa
(carcinoma) proliferaron y formaron colonias, la línea de fibroblastos inmortalizados
NIH/3T3 no proliferó (Figura 10).
Figura 10. La inhibición simultanea de la adhesión al sustrato rígido y a otras células no previene
selectivamente la proliferación de los linfocitos no tumorales. Las líneas celulares indicadas
fueron suspendidas en medio de cultivo suplementado con 1% de metilcelulosa (1000 células/ml)
y sembradas en placas de cultivo recubiertas con Poly-HEMA. (A) Imágenes representativas de
microscopía de contraste de fases de las colonias formadas y (B) número relativo de colonias
observadas 3 semanas después de la siembra. (C) Imagen representativa de microscopía de
contraste de fases del cultivo de células JY 6 horas tras la siembra. Los datos son la media+sem
(n=3). ***P<0.001; 2-way ANOVA con post-test de Bonferroni. Escala: 100 μm.
51
Resultados
Por último se realizó un ensayo de siembra de célula única sobre pocillos recubiertos con
Poly-HEMA, mediante aislamiento de células individuales por citometría de flujo. En estas
condiciones las células no son capaces de anclarse al plástico de la placa de cultivos ni de
interaccionar con otras células. De forma previa a la siembra se confirmó la eficacia del
equipo de citometría para aislar células individualmente, de modo que no exista más de una
célula por pocillo (Figura 11 A) empleando células marcadas con CFSE. Se observó que el
85.9% de los pocillos contenían 1 única célula, el 12.4% de los pocillos no contenía ninguna
célula y solo el 1.7% de los pocillos contenía más de 1 célula. Tras 3 semanas en cultivo se
determinó el número de pocillos en los que hubo proliferación y, por lo tanto, formación de
colonias. No se observó ninguna diferencia en cuanto al porcentaje de pocillos positivos
entre las placas recubiertas con Poly-HEMA y las placas control no recubiertas (Figura 11 B).
Este resultado, junto con los anteriores, muestra que las células linfoides inmortales y
tumorales son capaces de proliferar en ausencia total de interacciones.
Figura 11. Las células linfoides proliferan en ausencia de anclaje. Células de las líneas celulares
indicadas fueron aisladas mediante citometría de flujo y sembradas en placas de MW96 (1
célula/pocillo) recubiertas o no (Plástico) con Poly-HEMA. (A) Imagen representativa de
microscopía de fluorescencia de una sección de un pocillo mostrando la única célula presente
(señalada con la cabeza de flecha). (B) Cuantificación del número de colonias formadas en pocillos
recubiertos de Poly-HEMA relativo al cultivo en Plástico. 2-way ANOVA con post-test de
Bonferroni. Escala: 50 μm.
52
Resultados
4. El cultivo celular en agar blando induce muerte celular
Los resultados anteriormente descritos muestran que todas las líneas linfoides empleadas
son capaces de proliferar en ausencia de anclaje a sustrato rígido o a otras células; sin
embargo el ensayo de crecimiento en agar blando, tradicionalmente empleado para evaluar
el potencial tumorigénico a través de la capacidad de crecimiento independiente de anclaje
(Rotem et al. 2015, Borowicz et al. 2014), muestra que solo las líneas transformadas son
capaces de proliferar, formando colonias en un plazo de entre 3 y 4 semanas. Esto sugiere
que, al menos en las líneas celulares linfoides, la capacidad tumorigénica no se relaciona con
la capacidad de crecimiento independiente de anclaje y que el cultivo en agar blando no solo
impide la proliferación de las células no tumorales evitando el anclaje de las células sino
también a través de otros medios.
Nos propusimos investigar qué papel juega el cultivo en agar blando en la limitación al
crecimiento de las líneas inmortales pero no de las tumorales. En primer lugar analizamos el
perfil de ciclo celular de las células sembradas en agar blando con el objetivo de determinar
si la incapacidad de proliferar de las líneas celulares inmortales era debida a una parada en
alguna de las fases del ciclo. Los resultados no mostraron acumulo de población en ninguna
de las fases activas del ciclo celular, pero si en la fase sub-G0/G1 (Figura 12), indicativo de
muerte celular, en todas las líneas estudiadas. Tras 24 horas de cultivo en agar blando se
observó un marcado incremento de la población sub-G0/G1 en las líneas linfoides inmortales
JY y X50-7, que apenas se observó en las células tumorales DG-75 y Toledo (Figura 12).
Empleamos calceína-AM, una sonda que solo emite fluorescencia en células viables. Las 2
líneas de linfocitos inmortales no tumorales mostraron una brusca pérdida de viabilidad tras
24 horas de cultivo en agar blando, que fue completa tras 48h (Figura 13). Las líneas de
linfocitos tumorales mostraron diferentes comportamientos; mientras que las líneas DG-75
Y Jurkat mantenían una viabilidad superior al 40% tras 48h de cultivo en agar blando, las
líneas BL2 y Toledo mostraron una tasa de viabilidad celular similar al de las líneas
inmortales (Figura 13).
53
Resultados
Figura 12. El cultivo en agar blando induce muerte celular. El ciclo celular de las líneas celulares
indicadas fue analizado mediante citometría de flujo tras 24 horas de cultivo en medio líquido
(0h) o en agar blando (24 horas). Se muestra la cuantificación del porcentaje de células en las
distintas fases del ciclo celular de un experimento representativo.
El empleo combinado de las sondas fluorescentes calceína-AM y anexina V-PE nos permitió
establecer un método para determinar la viabilidad de células extraídas del agar, basado en
las diferencias de tamaño y complejidad entre células viables y células muertas, mostrando
claramente que células vivas (positivas para calceína-AM) y muertas (positivas para anexina
V-PE) ocupan regiones diferentes no solapantes en los gráficos de tamaño-complejidad
obtenidos mediante citometría de flujo (Figura 14). Empleando este tipo de análisis
comprobamos que la viabilidad celular disminuye a medida que aumenta la concentración
de agar en el gel (Figura 15 A). La observación de que el agar es un compuesto inerte que en
cultivo en suspensión no tiene ningún efecto sobre la viabilidad y capacidad proliferativa de
ninguna línea celular (Figura 15 B), sugiere que el efecto nocivo se relaciona con la rigidez
que adquiere el agar al gelificar y no con el agar en sí.
54
Resultados
Figura 13. El cultivo en agar blando reduce la viabilidad celular. Las líneas celulares indicadas,
cultivadas en medio líquido o en agar blando (SA) durante los tiempos indicados, fueron teñidas
con la sonda vital calceína-AM y analizadas mediante citometría de flujo. Los datos muestran la
media+sem del porcentaje de células viables (n=3). *P<0.05, ***P<0.001; 1-way ANOVA con post-
test de Bonferroni.
55
Resultados
Figura 14. Análisis de la viabilidad celular mediante la determinación del tamaño y complejidad
de las células. Las células DG-75 cultivadas en medio líquido fueron teñidas con anexina-V y
calceína-AM después de ser incubadas 10 minutos a 37ºC (vivas) o 10 minutos a 64ºC (muertas).
Ambas poblaciones fueron analizadas por separado o mezcladas al 50% (vivas-muertas). Se
muestran gráficos representativos del análisis de intensidad de fluorescencia emitida por Anexina
y Calceína (panel superior) y de la posición de las células teñidas con estas sondas en los gráficos
de tamaño (FSC) frente a complejidad (SSC).
Puesto que el acumulo en fase sub-G0/G1 se asocia frecuentemente a apoptosis,

empleamos el inhibidor de caspasas Z-VAD para determinar el peso que tiene este tipo de
muerte celular en nuestro sistema de cultivo en agar. El tratamiento con Z-VAD de células
sembradas en agar durante 48 horas, protegió a las distintas líneas celulares del efecto
nocivo del agar blando en diferentes grados, con la excepción de la línea DG-75, en la que Z-
VAD no tuvo ningún efecto significativo (Figura 16). En ningún caso la protección fue total, lo
que podría indicar que la muerte inducida por agar ocurriría por apoptosis solo de manera
parcial, pudiendo existir otros mecanismos implicados.
56
Resultados
Figura 15. El nivel de muerte inducido por el cultivo en agar blando correlaciona con la
concentración de agar empleado. La viabilidad celular fue determinada en función del tamaño y
complejidad de las células indicadas cultivadas (A) en medio líquido o en hidrogeles preparados
con las concentraciones de agar blando (SA) indicadas o (B) en medio líquido suplementado o no
con 0.5% de agar en suspensión. Los datos muestran el porcentaje de células viables (media+sem;
n=3). *P<0.05, ***P<0.001; ns, no significativo; 2-way ANOVA con post-test de Bonferroni.
Figura 16. El tratamiento con Z-VAD protege a las células de la muerte inducida por agar blando
de manera parcial. La viabilidad celular fue determinada en función del tamaño y complejidad de
las células indicadas cultivadas en medio líquido o en hidrogeles de agar en ausencia o presencia
de Z-VAD 80 µM. Los datos muestran la media+sem del porcentaje de células viables (n=3).
**P<0.01, ***P<0.001; 2-way ANOVA con post-test de Bonferroni.
57
Resultados
5. El cultivo celular en agar blando induce estrés oxidativo
Pese a que solo las líneas linfoides tumorales son capaces de proliferar en el ensayo clásico
de agar blando (Jiménez-P et al. 2018), los resultados muestran que la siembra a tiempos
cortos en agar blando provoca muerte celular en todas las líneas linfoides, incluidas, en
mayor o menor medida, las tumorales. Estos datos sugieren que el cultivo celular en agar
blando induce algún tipo de estrés que desencadena la muerte celular y que solo una
subpoblación presente en las líneas tumorales es capaz de hacer frente. En un primer
momento investigamos la posibilidad de que se estuviera induciendo una situación de
hipoxia, presentando además las subpoblaciones resistentes características de troncalidad.
Se realizó un ensayo preliminar para evaluar la expresión de PGK1 (fosfoglicerato quinasa 1)
y GYS1 (glicógeno sintasa 1), ambos genes inducidos por HIF1 en situación de hipoxia
(Pescador et al. 2010, Semenza et al. 1994), por parte de células recuperadas de agar al cabo
de 3 semanas. Como control se obtuvo el RNA de células JY sometidas a hipoxia durante 16
h. El análisis de expresión relativa por qPCR mostró que no existen diferencias entre las
células crecidas en agar y células control crecidas de forma rutinaria en medio líquido (Figura
17 A). De forma similar se analizó la expresión de NANOG y OCT4, marcadores clásicos de
troncalidad. NANOG resultó estar unas 13 veces más expresado en las células DG-75
recuperadas tras 3 semanas de crecimiento en agar blando que en las células control
crecidas en medio líquido, mientras que en el caso de las células Toledo no se observó
aumento de expresión (Figura 17 A). Referente a OCT4, tanto las células DG-75 como Toledo
recuperadas del agar blando mostraron niveles más elevados que sus respectivos controles
en medio líquido (Figura 17 A). Esto sugería la posibilidad de que efectivamente el ensayo de
agar blando estuviese funcionando como un mecanismo de enriquecimiento o selección de
las subpoblaciones tumorales con capacidad de troncalidad. Para determinar si la expresión
de OCT4 era consecuencia del enriquecimiento en la subpoblación de las líneas tumorales
con supuesto potencial de troncalidad o si por el contrario era una característica inducida
por la siembra en agar blando, evaluamos la expresión de OCT4 en células tanto inmortales
como tumorales sembradas en agar blando durante 16 horas. A modo de control se evaluó
la expresión de CDCA7, una molécula cuya expresión sabemos que es mayor en las líneas
linfoides tumorales que en las inmortales (Osthus et al. 2005, Jiménez-P et al. 2018). El
resultado reveló que la expresión de OCT4 aumenta de forma temprana en todas las líneas,
58
Resultados
tanto inmortales como tumorales, descartando su uso como marcador de troncalidad en
nuestro modelo de estudio (Figura 17 B).
Figura 17. El cultivo en agar blando no induce marcadores de hipoxia o de troncalidad

selectivamente en células linfoides tumorales. (A) Análisis de la expresión de genes marcadores
de hipoxia (PGK1 y GYS1) y de potencial de troncalidad (NANOG y OCT-4) en las células indicadas
cultivadas en líquido sin tratamiento adicional, en hipoxia durante 16h o en hidrogeles de agar
blando (SA) durante 3 semanas. (B) Análisis de la expresión de OCT-4 y CDCA7 tras diferentes
tiempos de cultivo en líquido (N) o en agar blando (SA). (C) Inmunoblot de YAP-TAZ en las células
indicadas cultivadas en medio líquido (Ctrl y 85ºC) o en agar blando (SA) durante 24 o 48 horas.
Las células cultivadas en agar y en una de las condiciones de cultivo líquido fueron calentadas a
85ºC para extraer las proteínas. Estos ensayos preliminares se realizaron una sola vez (n=1).
59
Resultados
OCT4 se ha relacionado con el sistema molecular YAP/TAZ, nodo central de la vía Hippo,
implicada en diversos aspectos de la transducción mecánica de señales durante el desarrollo
de órganos y tejidos, así como del mantenimiento del potencial de troncalidad (Varelas
2014, Chen et al. 2019, Lian et al. 2010, Panciera et al. 2017). Puesto que la expresión de
OCT4 es regulada por YAP/TAZ, considerado un sistema efector de estrés mecánico (Guo and
Zhao 2013), planteamos la posibilidad de que OCT4 se estuviera induciendo en respuesta al
posible estrés mecánico generado por la rigidez del gel de agar sobre las células. Para
profundizar en esta idea decidimos evaluar, mediante inmunoblot, la expresión a nivel de
proteína de YAP/TAZ en diferentes líneas linfoides en cultivo líquido y en cultivo de agar
blando. Mientras que la línea de cáncer de mama MDA-MB-231, empleada como control,
expresa YAP/TAZ, en ninguna de las líneas celulares linfoides se detectó (Figura 17 C). De
cualquier modo, este resultado no permite descartar que el cultivo celular en agar blando
esté provocando estrés mecánico en las células.
La privación de anclaje de células epiteliales normales a un sustrato rígido induce un

aumento en los niveles de ROS, lo que lleva a un estado de estrés oxidativo y al
desencadenamiento de mecanismos de muerte celular (Li et al. 1999). Aunque hemos
demostrado que las células linfoides sobreviven e incluso crecen en ausencia de anclaje,
investigamos si el cultivo en agar blando induce estrés oxidativo en las células linfoides y si
éste podría ser el responsable de la muerte celular a tiempos cortos. Para ello, las células se
pre-incubaron con la sonda fluorescente DCFDA, sensible a diferentes ROS, tras lo cual
fueron sembradas en agar blando. Los niveles basales de ROS de las diferentes líneas,
evaluados en cultivo líquido, no mostraron diferencias significativas entre sí, con la única
excepción de Jurkat, que resultó tener niveles basales de ROS mayores que el resto (Figura
18 A), Los resultados obtenidos por citometría de flujo tras 24 horas en cultivo muestran un
incremento significativo en los niveles de ROS de las células sembradas en agar con respecto
a sus controles en cultivo líquido en todas las líneas celulares, a excepción de la línea Jurkat,
que de cualquier modo presenta una tendencia a aumentar (Figura 18 B). La menor
inducción en Jurkat podría deberse al mayor nivel basal de ROS que presenta. Comprobamos
que el agar es un compuesto inerte que no induce aumento de los niveles de ROS, y por
tanto de estrés oxidativo, cuando es empleado en cultivo líquido (Figura 18 C), lo que
relaciona su capacidad de inducir estrés oxidativo con la rigidez que proporciona al formar
un hidrogel.
60
Resultados
Figura 18. El cultivo en agar blando induce

estrés oxidativo. Evaluación de los niveles ROS
en las células indicadas cultivadas (A) en medio
líquido; (B) en medio líquido o en hidrogeles de
agar blando (SA) 24 horas; o (C) en medio
líquido suplementado o no con 0.3% de agar en
suspensión. (B-C) Los datos se muestran
relativos al cultivo en medio líquido no
suplementado. *P<0.05, ***P<0.001; ns, no
significativo; 1-way ANOVA con post-test de
Bonferroni.
6. Las líneas linfoides tumorales incrementan la síntesis de glutatión en

respuesta al cultivo en agar blando
Entre los mecanismos que tiene la célula para hacer frente a un incremento en los niveles de
ROS y evitar por tanto el estrés oxidativo, se encuentra el ejercido por el sistema de defensa
antioxidante de GSH (Forman et al. 2009). La evaluación mediante citometría de flujo de los
niveles de GSH en células cultivadas en medio líquido no mostró diferencias sustanciales
entre células inmortales no tumorales y tumorales (Figura 19 A). Los niveles de GSH en
células viables aumentaron significativamente en las líneas linfoides tumorales tras 24 horas
de siembra en agar blando con respecto al cultivo líquido (Figura 19 B). Por el contrario, en
las líneas inmortales los niveles de GSH no solo no aumentaron, sino que incluso en el caso
de X50-7, disminuyeron (Figura 19 B).
61
Resultados
Figura 19. El cultivo en agar blando induce un incremento en los niveles de GSH en las líneas
linfoides tumorales, pero no en las inmortales. Evaluación de los niveles de GSH en las células
indicadas cultivadas (A) en medio líquido o (B) en medio líquido o en hidrogeles de agar blando
(SA) 24 horas. Los datos se muestran relativos al cultivo en medio líquido.. *P<0.05, **P<0.01,
***P<0.001; ns, no significativo; 1-way ANOVA con post-test de Bonferroni.
7. Glutatión es fundamental para la viabilidad de las líneas linfoides

tumorales
Con el objetivo de profundizar en la importancia de GSH sobre la viabilidad a largo plazo de

las líneas tumorales sembradas en agar blando, decidimos estudiar el efecto del bloqueo de
su síntesis empleando BSO, un inhibidor de GCL, la enzima limitante en su ruta de síntesis.
En primer lugar evaluamos su funcionamiento en cultivo líquido en las líneas inmortalizadas
JY y X50-7 y en las líneas tumorales DG-75 y Toledo. Tras 24 horas de cultivo en medio
líquido en presencia de BSO, los niveles celulares de GSH, detectados por citometría de flujo
con la sonda fluorescente mBCI, se reducían significativamente en todas las líneas celulares
(Figura 20 A). A su vez se produjo un incremento moderado pero significativo en los niveles
de ROS en todas las líneas celulares (Figura 20 B). Sin embargo, ni el descenso en los niveles
de GSH ni el aumento de ROS comprometió la viabilidad de las células en cultivo líquido
(Figura 20 C).
62
Resultados
Figura 20. BSO bloquea la síntesis de

GSH. Evaluación mediante citometría de
flujo de los niveles de (A) GSH; (B) estrés
oxidativo y (C) viabilidad celular (tamaño
/complejidad) en las líneas celulares
indicadas tras 24 horas de tratamiento
con BSO en cultivo líquido. **P<0.01,
***P<0.001; ns, no significativo; 2-way
ANOVA con post-test de Bonferroni.
A continuación se evaluó el efecto del tratamiento con BSO en células sembradas en agar
blando. Tras 24 horas de tratamiento no se recuperaron prácticamente células viables de
ninguna de las líneas celulares (Figura 21). Como era de esperar, el tratamiento a tiempo
largo con BSO impidió la formación y recuperación de colonias celulares de las líneas
linfoides tumorales sembradas en agar blando (Figura 22).
Figura 21. El tratamiento con BSO induce muerte celular en todas las líneas celulares linfoides
cultivadas en agar blando. Evaluación mediante citometría de flujo de la viabilidad celular
(tamaño/complejidad) en las líneas celulares indicadas tras 24 horas de cultivo en medio líquido o
en agar blando en ausencia (SA) o presencia de BSO (SA + BSO). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001;
2-way ANOVA con post-test de Bonferroni.
63
Resultados
Figura 22. El tratamiento con BSO impide la

formación de colonias en las líneas celulares
tumorales sembradas en agar blando. Imagen
representativa de una placa de cultivo de las líneas
celulares indicadas en agar blando en ausencia (Ctrl) o
presencia de BSO 3 semanas post-siembra.
8. NAC protege a las células del estrés oxidativo inducido por agar
blando de forma independiente a GSH
Decidimos estudiar el efecto de NAC, un precursor de la síntesis de glutatión, con el objetivo

de determinar si era capaz de proteger a las líneas inmortales del estrés inducido por
siembra en agar blando al inducir la síntesis de GSH. En primer lugar comprobamos el
funcionamiento de NAC en condiciones de cultivo líquido. En contra de lo esperado, los
niveles de GSH disminuyeron o se mantuvieron con respecto a los controles sin tratar, pero
en ninguna línea celular aumentaron (Figura 23 A). Sin embargo, el tratamiento con NAC
redujo de manera significativa los niveles basales de ROS en todas las líneas celulares (Figura
23 B). Se comprobó que el tratamiento a la dosis empleada no comprometió la viabilidad de
ninguna de las líneas celulares (Figura 23 C).
Pese a no observar un incremento en los niveles de GSH que pudiésemos asociar con
protección frente a estrés oxidativo, la disminución en los niveles de ROS nos llevó a evaluar
el efecto de NAC sobre el cultivo en agar blando. La evaluación de viabilidad celular por
citometría de flujo mediante incorporación de calceína-AM mostró que el tratamiento con
NAC es capaz de proteger de manera parcial y mantenida en el tiempo a las células, tanto
inmortales como tumorales, sembradas en agar blando (Figura 24).
64
Resultados
Figura 23. NAC reduce los niveles de estrés oxidativo en cultivo líquido sin inducir los niveles de
GSH. Evaluación mediante citometría de flujo de los niveles de (A) GSH; (B) estrés oxidativo y (C)
viabilidad celular (tamaño/complejidad) en las líneas celulares indicadas tras 24 horas de
tratamiento con NAC o NAC + BSO en cultivo líquido. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; ns, no
significativo; 2-way ANOVA con post-test de Bonferroni.
65
Resultados
Figura 24. NAC previene parcialmente la mortalidad inducida por el cultivo en agar blando.
Evaluación mediante citometría de flujo de la viabilidad celular en las líneas celulares indicadas
cultivadas en medio líquido o tras 24/72 horas de cultivo en agar blando (SA) en ausencia (Ctrl) o
presencia de NAC. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; 1-way ANOVA con post-test de Bonferroni.
66
Resultados
Mediante la licuación del cultivo de agar blando a 85ºC durante 3 minutos, adquirimos la
posibilidad de determinar el número total de células presentes en un momento dado,
aunque sin la posibilidad de discernir entre células viables y células muertas. Esto nos
permitió observar que el tratamiento con NAC de células sembradas en agar blando no solo
inhibía la muerte celular sino que incluso facilitaba la proliferación celular tanto de las líneas
de linfocitos tumorales como de las de linfocitos inmortales no tumorales (Figura 25).
Figura 25. NAC facilita la proliferación de los linfocitos no tumorales en agar blando.
Cuantificación del número de células de las líneas indicadas tras 24 y 48 horas de cultivo en agar
blando en ausencia (Ctrl) o presencia de NAC. Oh muestra el número de células sembradas.
***P<0.001; ns, no significativo; 2-way ANOVA con post-test de Tukey.
El tratamiento con NAC redujo los niveles de ROS en todas las líneas celulares cultivadas en
agar blando hasta alcanzar niveles similares al de las células cultivadas en medio líquido
(Figura 26). En cuanto al efecto de NAC sobre los niveles de GSH en células recuperadas del
agar blando, los resultados mostraron discrepancias entre las líneas celulares. Mientras que
en BL2 y Toledo, NAC no provocó ningún cambio en los niveles de GSH, en las líneas DG-75 y
Jurkat, hubo un descenso significativo (Figura 27). Estas discrepancias se mantuvieron en las
células de las líneas inmortales recuperadas del agar blando. Mientras que en JY, NAC no
tuvo ningún efecto sobre los niveles de GSH, en X50-7, a diferencia del resto de líneas, los
niveles de GSH aumentaron significativamente (Figura 27).
67
Resultados
El tratamiento combinado NAC+BSO en agar blando provocó la caída de los niveles de GSH
en todas las líneas al estar bloqueada la ruta de síntesis de GSH por efecto de BSO (Figura
27).
Figura 26. NAC reduce los niveles de estrés oxidativo en las líneas celulares linfoides cultivadas
en agar blando. Cuantificación de los niveles de ROS mediante citometría de flujo en las líneas
celulares indicadas cultivadas en medio líquido o en agar blando (SA) durante 72 horas en
ausencia (Ctrl) o presencia de NAC. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; 1-way ANOVA con post-test
de Bonferroni.
68
Resultados
Figura 27. NAC no induce la producción de GSH en la mayoría de las células linfoides.
Cuantificación de los niveles de GSH mediante citometría de flujo en las líneas celulares indicadas
cultivadas en medio líquido o en agar blando (SA) durante 24 horas en ausencia (Ctrl) o presencia
de NAC o NAC más BSO. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; ns, no significativo; 1-way ANOVA con
post-test de Bonferroni.
Estos resultados, junto con el efecto protector de NAC observado anteriormente en todas las
líneas celulares sembradas en agar blando, sugieren que NAC podría estar actuando como
un antioxidante en sí mismo, de forma independiente a la síntesis de GSH. El ensayo DPPH
de potencial reductor confirmó que NAC es en sí mismo un potente agente antioxidante,
mostrando a una concentración de 1 mM un poder reductor del 70% sobre la medida radical
libre de una solución DPPH 400 µM (Figura 28).
69
Resultados
Figura 28. NAC tiene actividad reductora propia.
Evaluación del potencial reductor de NAC 1mM mediante el
ensayo DPPH. Se evalúa la capacidad de un determinado
compuesto para reducir una solución 400 µM de DPPH
consistente en radicales libres y que absorbe a 517 nm. La
medida se realiza por espectrofotometría.
9. La expresión de GCLc en células de linfoma de Burkitt y de Leucemia

T aguda es necesaria para el mantenimiento de su fenotipo tumoral
En vista de los resultados anteriores procedimos a silenciar en la línea de linfoma de Burkitt

DG-75, mediante RNA de interferencia, la expresión de la subunidad catalítica de la enzima
GCL (GCLc), responsable del primer paso en la síntesis de GSH. Para ello se infectaron las
células con partículas lentivirales que contenían plásmidos codificantes para un shRNA
control (sh-ctrl) o para shRNA específicos de GCLC (sh-62, sh-65 y sh-86). Tras selección con
puromicina de las células transducidas, se analizó el silenciamiento mediante RTq-PCR. Los
shRNAs de GCLc disminuyeron la expresión del RNAm de GCLc en más de un 60% con
respecto al interferente control (Figura 29 A). A continuación, se evaluó el efecto del
silenciamiento sobre los niveles de GSH tanto en cultivo líquido como en agar. En cultivo
líquido se observó una disminución en los niveles de GSH en torno al 40% (Figura 29 B). En
células sembradas en agar esta disminución llegó hasta el 60% (Figura 29 C). El análisis de
viabilidad celular mediante citometría de flujo mostró que el silenciamiento de GCLC no
compromete la viabilidad celular en medio líquido (Figura 29 D). Por el contrario, tras 24
horas de la siembra en agar blando, la viabilidad se redujo un 90% en DG-75 con respecto a
las células con sh-ctrl (Figura 29 E). El ensayo de formación de colonias en agar blando
mostró que las células portadoras del shRNA control formaban colonias de forma eficiente,
mientras que las células silenciadas disminuyeron notablemente su capacidad de formar
colonias (Figura 29 F y 29 G).
70
Resultados
Figura 29. La producción de GSH por GCLC es crítica para la supervivencia y el crecimiento en
agar blando de las células DG-75. Las células DG-75 transducidas con lentivirus codificadores de
los shRNA indicados fueron seleccionadas con puromicina durante más de 5 días. Cuantificación
de (A) la expresión del mRNA de GCLC mediante qPCR tras normalización con ACTB y relativa a sh-
ctrl; (B) niveles de GSH; y (C) viabilidad celular determinada mediante citometría de flujo (en
función del tamaño y complejidad de las células) en células cultivadas en medio líquido.
Cuantificación de (D) niveles de GSH y (E) viabilidad celular determinada mediante citometría de
flujo (en función del tamaño y complejidad de las células) en células cultivadas en agar blando
durante 24 horas. (F) Imagen macroscópica representativa de pocillos con cultivos de estas
células 3 semanas después de la siembra en agar blando y (G) cuantificación del número de
colonias tras este tiempo. Los datos (media+sem, n=3 transducciones independientes) se
muestran relativos a los de las células transducidas con sh-ctrl. ***P<0.001; ns, no significativo; 2-
way ANOVA con post-test de Bonferroni.
71
Resultados
Figura 30. La producción de GSH por GCLC es crítica para la supervivencia y el crecimiento en
agar blando de las células Jurkat. Las células Jurkat transducidas con lentivirus codificadores de
los shRNA indicados fueron seleccionadas con puromicina durante más de 5 días. Cuantificación
de (A) la expresión del mRNA de GCLC mediante qPCR tras normalización con ACTB y relativa a sh-
ctrl; (B) niveles de GSH; y (C) viabilidad celular determinada mediante citometría de flujo (en
función del tamaño y complejidad de las células) en células cultivadas en medio líquido.
Cuantificación de (D) niveles de GSH y (E) viabilidad celular determinada mediante citometría de
flujo (en función del tamaño y complejidad de las células) en células cultivadas en agar blando
durante 24 horas. (F) Imagen macroscópica representativa de pocillos con cultivos de estas células
3 semanas después de la siembra en agar blando y (G) cuantificación del número de colonias tras
este tiempo. Los datos (media+sem, n=3 transducciones independientes) se muestran relativos a
los de las células transducidas con sh-ctrl. ***P<0.001; ns, no significativo; 2-way ANOVA con
post-test de Bonferroni.
72
Resultados
Para investigar si el papel de GCLC en tumorigénesis no es exclusivo de las células DG-75,
silenciamos su expresión en la línea de leucemia T Jurkat. Observamos que la transducción
de estas células con los shRNA específicos de GCLC sh-62, sh-65 y sh-86 reducía la expresión
de mRNA (Figura 30 A) y disminuía la producción de GSH (Figura 30 B) en células cultivadas
en medio líquido sin afectar sustancialmente a su viabilidad (Figura 30 C). Al igual que en DG-
75, el silenciamiento de GCLC en Jurkat, disminuía drásticamente la producción de GSH
(Figura 30 D) y la viabilidad (Figura 30 E) en las células cultivadas 24 horas en agar blando y
bloqueaba la formación de colonias en agar blando (Figuras 30 F y 30 G).
Para determinar el papel de GCLc, y por tanto de GSH, en la capacidad tumorigénica de las
células linfoides tumorales in vivo, se inocularon células DG-75 transducidas con sh-ctrl en un
flanco de ratones inmunodeficientes NOD-SCID y células transducidas con shGCLc-65 o
shGCLc-86 en el flanco contrario (Figura 31 A). Todas las inoculaciones con células sh-ctrl
dieron lugar, al cabo de 4 semanas, a la formación de tumores subcutáneos consistentes en
masas solidas de aspecto encapsulado y gran tamaño (Figura 31 B) y con un peso medio de
0.85 gramos (Figura 31 A). En cambio, las células transducidas con shGCLc-65 o shGCLc-86
produjeron tumores notablemente más pequeños o incluso indetectables (Figuras 31 B y C).
Figura 31. GCLc es un mediador crítico del crecimiento in vivo de las células de linfoma DG-75.
Las células DG-75 transducidas con un shRNA control (sh-ctrl) o específicos de GCLC (sh-65 y sh-
86) fueron inoculadas subcutáneamente en los flancos de ratones inmunodeficientes NOD-SCID.
(A) Imagen representativa de un ratón inoculado con células transducidas con los shRNA
indicados. (B) Imagen representativa y (C) peso de los tumores formados 4 semanas después de la
inoculación de células transducidas con los shRNA indicados. ***P<0.001; ns, no significativo; test
t de Student.
73
Resultados
10. Aumento de ROS y GSH en un modelo múrido de linfoma de Burkitt
Dado que el crecimiento en agar blando induce estrés oxidativo y producción de GSH en las
líneas de tumores linfoides, decidimos investigar si el proceso de linfomagénesis también
cursaba con incremento de ROS y GSH. Para ello, empleamos un modelo múrido de linfoma
de Burkitt, el ratón λ-MYC, un ratón transgénico en el que la expresión de MYC humano es
forzada por el promotor de la cadena lambda de las inmunoglobulinas (Kovalchuk et al.
2000). La supervivencia libre de tumores media de estos ratones está cercana a los 4 meses
de edad y es similar en machos y hembras (Figura 32 A). El crecimiento tumoral de linfocitos
B se produce principalmente en nódulos linfáticos y bazo (Kovalchuk et al. 2000) y,
consecuentemente, el tamaño de estos órganos es muy superior al observado en ratones wt
hermanos de camada (Figuras 32 B y C). El análisis por citometría de flujo mostraba que las
células de los tumores de los ratones LM y de sus correspondientes bazos producían niveles
marcadamente superiores de anión superóxido (Figura 32 D) y GSH (Figura 32 E) que las
células de los bazos de ratones wt hermanos de camada.
74
Resultados
Figura 32. Aumento de ROS y GSH en los tumores de un modelo múrido de BL. (A)
Representación de Kaplan-Meier de la supervivencia libre de tumores de los ratones lambda-MYC
(LM) machos (m; n=30) o hembras (h; n=30) y de los ratones wt hermanos de camada (WT; n=12:
6 machos y 6 hembras). Las líneas marcan la supervivencia libre de tumores media. (B) Imagen
macroscópica representativa y (C) peso (media+sem) de los órganos indicados. (D) Análisis por
citometría de flujo de los niveles de anión superóxido y (E) GSH en los órganos indicados. *P<0.05,
***P<0.001; ns, no significativo; en (A) test de Mantel-Cox, en (C) test t de Student y en (D) y (E)
1-way ANOVA con post-test de Bonferroni.
75
Resultados
11. La inhibición farmacológica de GCLC previene la formación de

linfomas
En vista de que los ratones λ-MYC presentan tumores con niveles elevados de ROS y GSH y
de que la inhibición farmacológica de GCLC induce la muerte de las células tumorales
cultivadas en agar blando, decidimos comprobar la eficacia de BSO como potencial agente
terapéutico en los ratones λ-MYC. Un grupo de 11 ratones λ-MYC (6 hembras y 5 machos)
fueron tratados desde el momento del destete con BSO suministrado a una concentración
de 20 mM en el agua de bebida, mientras que un grupo de 9 ratones λ-MYC (5 hembras y 4
machos), hermanos de camada del grupo anterior, no fue tratado. Para determinar la
eficacia de la administración oral de BSO analizamos los niveles de GSH en leucocitos de
sangre periférica de los ratones. El análisis mediante citometría de flujo mostró que los
niveles de GSH en leucocitos de los ratones tratados con BSO eran inferiores a los del grupo
control 14 y 57 días después del inicio del tratamiento (Figura 33 A). A lo largo de las 12
semanas transcurridas desde el inicio del tratamiento hasta la fecha de depósito de esta
Tesis Doctoral, 5 ratones del grupo control (1 macho y 4 hembras) han desarrollado
linfomas, mientras que solo 1 ratón del grupo tratado con BSO (1 hembra) lo ha hecho
(Figura 33 B). En conjunto, nuestros resultados sugieren fuertemente que la inhibición
farmacológica de GCLC podría ser de gran utilidad para el tratamiento de los tumores
linfoides.
Figura 33. La inhibición farmacológica de GCLC previene la linfomagénesis en un modelo animal

de linfoma de Burkitt. (A) Análisis por citometría de flujo de los niveles de GSH en leucocitos de
sangre periférica de ratones LM tras 14 y 57 días de tratamiento con 20 mM de BSO en el agua de
bebida o en hermanos de camada sin tratamiento. (B) Representación de Kaplan-Meier de la
supervivencia libre de tumores de los ratones lambda-MYC tratados con 20 mM de BSO en el
agua de bebida (n=11) y los hermanos de camada no tratados (Control, n=9)). *P<0.05,
***P<0.001; ns, no significativo; en (A) 2-way ANOVA con post-test de Bonferroni y en (B) test
Mantel-Cox.
76
Discusión
77
78
Discusión
Tradicionalmente, el estudio de los eventos implicados en la tumorigénesis, se ha llevado a
cabo comparando células transformadas con células normales de su respectivo linaje. De
esta forma se han identificado numerosos genes y proteínas cuya desregulación es
responsable, en parte, del proceso de transformación tumoral. La mayoría de estos genes y
proteínas están implicados en la regulación de la proliferación celular, siendo esta una de las
principales características diferenciadoras entre células normales y tumorales, aunque no la
única. La mayoría de regímenes quimioterapéuticos se basan por tanto en el empleo de
drogas que actúan contra eventos necesarios para la proliferación celular como la
replicación del DNA o la citocinesis, siendo así mismo responsables, al afectar también a
células normales, de muchos de los efectos secundarios de dichas terapias.
Nuestro laboratorio se ha centrado en estos últimos años en la búsqueda y estudio de genes

y moléculas implicadas en la transformación tumoral más allá de la mera adquisición de
inmortalidad replicativa, cualidad que debe adoptar una célula en su transición a un estado
maligno pero que por sí sola no es suficiente para tal fin. Nuestro modelo de estudio ha
consistido en la búsqueda de diferencias de expresión génica entre líneas celulares linfoides
transformadas y líneas inmortalizadas no tumorales del mismo linaje. Estos genes
diferencialmente expresados se podrían relacionar de forma específica con las células de
cáncer y serian por tanto susceptibles de convertirse en futuras dianas terapéuticas que
funcionarían de forma mucho más dirigida y con menos efectos secundarios.
1. Requisitos de anclaje de las líneas linfoides inmortalizadas y

tumorales
El ensayo de crecimiento en agar blando ha sido considerado durante décadas el ensayo de

referencia para estudiar tumorigénesis in vitro a través de la evaluación de la capacidad de
crecimiento en ausencia de anclaje, propiedad característica de las células que han sufrido
transformación tumoral. Datos previos de varios laboratorio, incluyendo el nuestro,
muestran que las líneas celulares de linfoma son capaces de crecer en agar blando,
formando colonias; mientras que las líneas de linfocitos inmortalizados, pero no
transformados, no son capaces (Jiménez-P et al. 2018), sugiriendo que requieren algún tipo
de anclaje.
Las células del linaje linfoide pueden circular por el torrente sanguíneo en ausencia de
anclaje a un sustrato rígido; sin embargo, su actividad biológica es dependiente de la
79
Discusión
interacción con otras células y componentes de la matriz extracelular. En sistemas de
experimentación in vitro, las células linfoides pueden ser estimuladas para inducir su
proliferación y, entonces, se mantienen como cultivos en suspensión en los que la mayor
parte de las células se encuentran flotando en el medio de cultivo interaccionando entre
ellas. Esto no implica, sin embargo, que las células no puedan establecer interacciones
esporádicas con el plástico de la placa de cultivo (sustrato rígido). De hecho, es
relativamente sencillo observar al microscopio una pequeña proporción de células adheridas
a la superficie de cultivo, especialmente en las líneas inmortalizadas JY y X50-7, así como en
los PBLs. Estos datos podrían sugerir que las líneas inmortalizadas requieren anclaje a un
sustrato rígido o a otras células para proliferar. Existe literatura clásica en la que se sugiere
que la presencia de sustratos inertes (no mitogénicos) favorece la proliferación celular de
linfocitos extraídos de sangre (Sundqvist and Wanger 1981) y en la que se demuestra que
estos linfocitos adquieren actividad motil de forma espontánea in vitro (Wanger, Otteskog
and Sundqvist 1985).
En base a esto, se propuso como objetivo principal de esta tesis doctoral identificar los
requisitos de anclaje de las células linfoides inmortales, así como los mecanismos mediante
los cuales las células transformadas son capaces de evadirlos, y cuyos componentes
constituirían potenciales dianas terapéuticas. Para cumplir con ese objetivo inicial se diseñó
una batería de experimentos encaminados a profundizar en el concepto de necesidad de
anclaje reflejado por el ensayo de agar blando, “diseccionándolo” en dos aspectos: anclaje a
un sustrato rígido y anclaje a otras células.
Sorprendentemente, los resultados obtenidos muestran que todas las líneas celulares
linfoides, tanto tumorales como inmortales, así como los linfocitos primarios obtenidos de
sangre de donantes sanos, son capaces de proliferar en condiciones de privación de anclaje a
sustrato rígido o a otras células. Incluso tras bloquear de manera conjunta el anclaje al
sustrato rígido y la unión intercelular, empleando Poly-HEMA y el compuesto A286982, pero
sin alterar las propiedades reológicas del cultivo líquido, las líneas celulares linfoides
proliferaron a la misma tasa que en cultivo liquido normal. El impedimento de interacciones
intercelulares mediante el aumento de la viscosidad del medio ocasionado por metilcelulosa,
junto con el impedimento de anclaje a sustrato rígido ejercido por Poly-HEMA también
permitió la proliferación de todas las líneas linfoides. El ensayo de siembra de célula única
mediante aislamiento por citometría de flujo, en combinación con el recubrimiento del
80
Discusión
plástico con Poly-HEMA, también mostró niveles de proliferación similares entre linfocitos
tumorales y linfocitos inmortales no tumorales en condiciones de privación simultánea de
anclaje a sustrato rígido y a otras células. Estos datos indican que la incapacidad de los
linfocitos inmortales no tumorales para proliferar en agar blando no se debe a limitaciones
de anclaje a un sustrato rígido o a otras células.
2. Utilidad del cultivo en agar blando para el estudio de los tumores

linfoides
CDCA7 es una molécula de función relativamente desconocida que se ha relacionado con

tumorigénesis, troncalidad, migración e invasividad de células linfocitarias (Martín-Cortázar
et al. 2019, Guiu et al. 2014, Goto et al. 2006, Osthus et al. 2005, Gill et al. 2013). Nuestro
laboratorio mostró que era fundamental para el crecimiento en agar blando de líneas
linfoides tumorales las cuales, a diferencia de las líneas inmortales, expresan altos niveles de
esta molécula (Jiménez-P et al. 2018). Su silenciamiento inhibía drásticamente la capacidad
de las células tumorales de proliferar en agar blando, mientras que su sola expresión no
resultaba suficiente para permitir el crecimiento de las líneas inmortalizadas (Jiménez-P et
al. 2018). Basado en el concepto clásico del ensayo de agar blando como forma de evaluar la
capacidad de crecimiento celular independiente de anclaje, se concluyó que la expresión de
CDCA7 era necesaria, aunque no suficiente, para el crecimiento independiente de anclaje de
las líneas linfoides tumorales.
Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que todas las líneas celulares linfoides
empleadas son capaces de sobrevivir y proliferar en ausencia de anclaje a un sustrato rígido
y a otras células y, por tanto, nos llevan a rechazar la utilidad del ensayo de agar blando
como prueba para evaluar la capacidad de crecimiento independiente de anclaje de las
células linfoides. Puesto que todas ellas son capaces de dicho crecimiento,
independientemente del nivel de expresión de CDCA7, parece ser que esta molécula no
estaría regulando la capacidad de crecimiento independiente de anclaje.
La utilidad del cultivo en agar blando como ensayo de transformación tumoral sigue siendo
relevante, puesto que permite únicamente la proliferación de células transformadas,
correlacionando con el ensayo de xenotrasplante en ratones inmunodeficientes,
considerado como ensayo de tumorigénesis de referencia. Esto nos llevó a investigar qué
81
Discusión
propiedad de las células tumorales es la que les permite sobrevivir y proliferar cuando son
sembradas en agar blando.
Determinamos que la siembra en agar blando no provoca parada de ciclo celular, sino la
muerte en un corto plazo de tiempo de la totalidad de las células inmortales. En el caso de
las líneas tumorales el comportamiento es variable, ya que Toledo y BL2 resultan más
sensibles que DG-75 y Jurkat, mostrando un comportamiento a tiempo corto aparentemente
similar al de las líneas inmortales. Sin embargo, al cabo de varias semanas de cultivo todas
las líneas tumorales consiguen proliferar dando lugar a la formación de colonias.
Estos resultados nos llevaron a pensar que, en estas condiciones de cultivo, las células deben
estar sometidas a una fuerte presión a la que solo es capaz de hacer frente una subpoblación
dentro de las líneas tumorales. Más allá de su papel en la adaptación a hipoxia, el factor de
transcripción HIF se considera un nodo central en la respuesta general de la célula al estrés.
Se han descrito numerosas moléculas, tanto inductoras de estrés celular como producto del
mismo, capaces de regular de un modo u otro la expresión o función de HIF (Majmundar,
Wong and Simon 2010). El análisis de los niveles de expresión de los genes PGK1 y GYS1,
bajo control transcripcional de HIF, no mostró ningún indicio de la utilidad de este como
marcador de estrés celular.
Existe abundante literatura sobre la relación entre impedimento de anclaje de células

adherente a un sustrato rígido y estrés oxidativo (Campos et al. 2007, Jiang et al. 2016,
Schafer et al. 2009, Stalnecker et al. 2016), así como sobre el papel de la rigidez de la MEC y
el estrés oxidativo en numerosas enfermedades, principalmente cardiovasculares (Urbano,
Swaminathan and Clyne 2019, Massaro et al. 2019). El hecho de que el cultivo en agar
blando impida el anclaje a un sustrato rígido, junto con el incremento de la rigidez del medio
semisólido respecto al medio líquido, nos llevó a investigar la posibilidad de que el agar
blando indujera estrés oxidativo.
Nosotros demostramos en este trabajo que el agar noble no gelificado, compuesto inerte, no
afecta a la capacidad proliferativa de las células ni induce en ellas estrés oxidativo; sin
embargo, en su forma gelificada induce estrés oxidativo en las células embebidas en él,
siendo únicamente resistentes, capaces de proliferar y dar lugar a colonias, las células de las
líneas tumorales.
82
Discusión
Estos datos sugieren la posibilidad de que el silenciamiento de CDCA7 sensibilice a las células
tumorales al estrés oxidativo inducido por el agar blando, lo que haría de CDCA7 un factor de
resistencia a estrés oxidativo, así como una potencial diana terapéutica que permitiría
sensibilizar a las células tumorales. El mecanismo por el que la expresión de CDCA7
proporcionaría resistencia frente al estrés oxidativo podría ser a través de su actividad de
establecimiento y mantenimiento de metilación en determinadas regiones
pericentroméricas del genoma, actividad descrita durante la caracterización molecular del
síndrome de inmunodeficiencia, inestabilidad de la región centromérica y anomalías faciales
(IFC)(Velasco et al. 2018, Wu et al. 2016, Jenness et al. 2018, Thijssen et al. 2015). La
hipometilación de ciertas de estas regiones se ha asociado a sensibilidad al estrés oxidativo
en determinados tipos celulares como fibroblastos humanos (Lewinska et al. 2018). En
conjunto estos resultados muestran que los hidrogeles de agar blando podrían funcionar
como medio de selección de resistencia a estrés oxidativo.
3. Indicios de la presencia de CSC en los tumores linfoides
Del total de células tumorales sembradas en agar blando, solo un pequeño porcentaje es
capaz de proliferar y dar lugar a colonias (Pavelic et al. 1980), lo que actualmente se
interpreta como resultado de la actividad proliferativa de una subpoblación de células
tumorales con potencial de troncalidad (Rajendran and Jain 2018, Puglisi et al. 2009, Morata-
Tarifa et al. 2016). Nosotros proponemos que la capacidad de resistencia a estrés oxidativo
es una propiedad de esta subpoblación celular presente en las líneas linfoides tumorales. En
este sentido se ha descrito en cáncer de mama triple negativo la existencia de CSCs
caracterizadas por la expresión de altos niveles de GSH, lo que las haría más resistentes al
estrés oxidativo (Miran et al. 2018).
Pese a que las primeras CSC se identificaron en leucemia, patología cancerosa íntimamente
relacionada con el linfoma (Lapidot et al. 1994), no ha sido posible aun identificar una
población similar en linfoma (Kim 2011, Martinez-Climent et al. 2010). Proponemos emplear
el ensayo de agar blando como herramienta para aislar y estudiar la subpoblación celular
seleccionada positivamente, candidata a ser CSC. La complejidad de esto radica en la
dificultad metodológica de recuperación de células cultivadas en agar blando. El agar, una
vez gelificado forma una estructura reticular no soluble en condiciones normales de cultivo,
lo que imposibilita la separación y recuperación de células viables. No obstante, durante el
83
Discusión
desarrollo de esta tesis hemos desarrollado un método para separar células del agar basado
en la licuación a alta temperatura del gel, lo que permite diferentes tipos de análisis; así
como un método no descrito anteriormente que permite ciertos tipos de análisis celular por
citometría de flujo. El desarrollo de estas técnicas podría permitir el aislamiento y estudio de
dicha subpoblación celular en los tumores linfoides. Otra cuestión a tener en cuenta es el
modelo de división celular asimétrica propuesto para las CSC, en la que cada célula daría
lugar a una CSC hija idéntica a sí misma y a una célula hija en mayor o menor medida
diferenciada. Esto supone la dilución progresiva de la subpoblación CSC dentro de la
población celular total, lo que estaría dificultando su caracterización. En los últimos años se
han desarrollado procedimientos que permiten el enriquecimiento de poblaciones CSC en
cultivos celulares procedentes de diferentes tipos de cáncer para lo que se requieren
combinaciones complejas y específicas de factores celulares (Lombardo et al. 2015, Ishiguro
et al. 2017). Por el momento no se ha desarrollado ningún método de enriquecimiento
selectivo de células de linfoma con potencial de troncalidad.
4. Adaptación y resistencia al estrés oxidativo en los tumores linfoides
En este trabajo mostramos que el cultivo en agar blando, además de un aumento de los
niveles de ROS, provoca un aumento significativo de los niveles de GSH en las líneas
celulares tumorales, aquellas que son capaces de formar colonias en este medio, pero no en
las inmortales no tumorales. Mostramos, además, que los linfomas que se generan en el
modelo múrido de linfoma de Burkitt (ratón λ-MYC) también producen niveles de ROS y GSH
más elevados que los tejidos linfoides de los hermanos de camada sanos.
BSO es un inhibidor farmacológico de la síntesis de GSH. En células en cultivo líquido el

tratamiento con BSO disminuyó los niveles celulares de GSH en un 45-60%. Esto se
acompañó de un incremento en los niveles de ROS, pero no tuvo ningún efecto sobre la
viabilidad celular. Esto indica que un aumento moderado en los niveles de ROS no resulta
nocivo para la célula, que es capaz de tolerarlo. Esto está en consonancia con el concepto de
umbral fisiológico de ROS, según el cual existe un rango de concentraciones de ROS, más o
menos amplio, en el que ejercen sus funciones fisiológicas. Solo cuando el umbral es
superado se desencadenaría una situación de estrés oxidativo (Angelova and Abramov 2016,
Ghezzi et al. 2017, Sena and Chandel 2012, Bartosz 2009, Schieber and Chandel 2014).
84
Discusión
El tratamiento con BSO de células sembradas en agar blando supuso la completa pérdida de
viabilidad de todas las líneas celulares linfoides, tanto inmortales como tumorales,
impidiendo por tanto la formación de colonias de estas últimas. De igual modo, el
silenciamiento de la expresión de GCLc mediante shRNAs provocó la pérdida de viabilidad de
las líneas tumorales sembradas en agar, limitando también la formación de colonias. La
inoculación en ratones NOD-SCID de células linfoides tumorales con expresión silenciada de
GCLc condujo a la formación de masas tumorales significativamente más pequeñas que las
originadas por células control no silenciadas. En estas condiciones experimentales en las que
las células están sometidas a estrés, la abolición del sistema glutatión implicaría el acumulo
de ROS más allá del nivel que la célula es capaz de manejar sin comprometer su viabilidad.
Estos resultados demuestran el papel fundamental del sistema GSH en la capacidad de
resistencia y adaptación al estrés oxidativo de las líneas linfoides tumorales.
Dado que las líneas de linfocitos tumorales producen más GSH que las de linfocitos
inmortales no tumorales, sería de gran interés comprobar el efecto de la expresión forzada
de GCLc en éstas últimos sobre la capacidad de crecimiento en agar blando y la
linfomagénesis en ratones inmunodeficientes. Para ello estamos trabajando en la generación
de vectores virales que nos permitan sobre-expresar GCLc en las líneas inmortales.
Los datos preliminares mostrados en este trabajo sugieren que la inhibición farmacológica
de GCLc previene el crecimiento tumoral, no solo de líneas celulares, sino también de los
linfomas en el modelo múrido de linfoma de Burkitt. Para obtener también evidencia
genética de la implicación de GCL en la formación de linfomas, también estamos trabajando
en la generación y estudio de ratones λ-MYC deficientes en Gclm, la subunidad reguladora
de la enzima GCL (ratones λ-MYC-Gclm-/-). Los ratones Gclm-/- son viables, fértiles y no
presentan problemas de salud ni de comportamiento pese a presentar en sus tejidos entre
un 9 y un 16 % de los niveles normales de (Yang et al. 2002). Sin embargo, tal y como cabría
esperar, fibroblastos obtenidos de embriones Gclm-/-resultaron mucho más sensibles a la
inducción de estrés oxidativo con H2O2 (Yang et al. 2002). El ratón Gclc-/-, en el que se
deleciona la subunidad catalítica de GCL, resulta letal durante el desarrollo embrionario (Shi
et al. 2000, Yang et al. 2002). Esto sugiere que, en condiciones normales de estabulación, en
ausencia de estrés ambiental y de enfermedad, niveles bajos de glutatión son suficientes
para mantener la viabilidad de estos ratones. Los ratones λ-MYC, hemicigotos para el
transgén MYC, desarrollan tumores linfoides y presentan una vida media libre de tumores de
85
Discusión
4 meses (muerte por el desarrollo de tumores o sacrificio siguiendo la normativa vigente),
independientemente del sexo. Ambos sexos son fértiles, sin embargo la alta tasa de fracaso
en las últimas etapas de la gestación hace necesario el uso de ratones nodriza CD1 para
sacar adelante las camadas de hembras λ-MYC. En base a la evidencia obtenida en los
experimentos in vitro e in vivo, esperamos observar una mejora en el pronóstico de los
ratones λ-MYC;Gclm-/-, bien por retraso en la formación de los tumores o por abolición de la
misma. Esperamos que los bajos niveles de GSH permitan la viabilidad y correcto
funcionamiento de todos los sistemas orgánicos suponiendo, al mismo tiempo, un
impedimento para el desarrollo de los tumores, que verían alterada su capacidad de hacer
frente a los elevados niveles de ROS presentes en el ambiente tumoral. A fecha de depósito
de esta tesis doctoral, no es posible descartar la posibilidad de un escenario completamente
opuesto en el que bajos niveles de GSH, inocuos para un animal en condiciones óptimas de
mantenimiento y sin patologías, supongan un debilitamiento general en un organismo
predispuesto al desarrollo de tumores linfoides. Sin embargo, los datos obtenidos por el
momento con ratones λ-MYC tratados con BSO, invitan a pensar que la deficiencia de Gclm
no generará tal debilitamiento.
El tratamiento con NAC, precursor de la síntesis de GSH, no solo protegió a las células del
estrés oxidativo generado por su cultivo en agar blando, sino que incluso permitió el
crecimiento de algunas de las líneas inmortales a una tasa similar a la del cultivo en medio
líquido. En este trabajo mostramos que pese a la importancia del sistema GSH frente a un
insulto oxidativo, NAC ejerce una actividad antioxidante por sí misma y no necesariamente a
través de la síntesis de GSH. Esta capacidad vendría dada por su naturaleza tiólica (Aldini et
al. 2018). Se ha descrito que las ROS susceptibles de ser neutralizadas de forma directa por
NAC en sistemas biológicos son en particular HO(X) y NO2 (Aldini et al. 2018). Sin embargo,
entre las ROS inducidas por agar blando y neutralizadas por NAC en nuestro sistema
biológico in vitro se encuentran H2O2 y •O2-, tal como muestran las sondas DCFDA y DHE.
Esto parece indicar que el potencial antioxidante propio que presenta NAC es incluso mayor
del que inicialmente se planteó.
En las últimas décadas se ha venido considerando beneficioso el consumo de antioxidantes

como suplementos dietéticos para el mantenimiento de la salud, apelando a su capacidad de
neutralizar radicales libres y, por tanto, eficaz en la prevención y tratamiento de patologías
en los que las ROS ejercen algún papel, incluido el cáncer, pues de esta forma se estaría
86
Discusión
limitando el potencial daño del material genético por parte de las ROS. Sin embargo, en los
últimos años han surgido nuevas evidencias que sugieren una revisión de este concepto y
proponen que, mientras el consumo razonable de suplementos antioxidantes podría ayudar
a prevenir el acúmulo de daño oxidativo, y por tanto de cáncer en individuos sanos, en
pacientes con un foco tumoral iniciado pero no detectado podría suponer una desventaja, ya
que las células malignas podrían usar las ROS en beneficio propio para estimular su propio
crecimiento (Wiel et al. 2019). Estudios en ratón han mostrado que el tratamiento con
antioxidantes acelera la progresión de tumores primarios de pulmón (Sayin et al. 2014). Otro
estudio mostró que el tratamiento con NAC o con un análogo de la vitamina E promovía la
metástasis, migración e invasividad en un modelo endógeno de melanoma en ratón (Le Gal
et al. 2015). De igual forma se ha relacionado el consumo de β-carotenos en forma de
suplemento con el desarrollo de cáncer de pulmón en personas fumadoras (Tanvetyanon
and Bepler 2008). Otro meta-análisis concluyó que la suplementación dietética con vitamina
E aumentaba de forma significativa el riesgo de padecer cáncer de próstata en hombres
sanos (Klein et al. 2011). Nuestros resultados apoyan esta hipótesis y ponen de manifiesto la
necesidad de profundizar en el estudio del papel de los antioxidantes en la prevención y
tratamiento del cáncer.
5. Mecanosensibilidad y estrés mecánico en las líneas linfoides
La observación de que una mayor concentración de agar en el gel, y por tanto una mayor
rigidez del mismo, se relaciona con una menor viabilidad celular nos lleva a plantear que la
rigidez del gel de agar provoca en la célula un estrés mecánico que se traduce en un
incremento en los niveles endógenos de ROS. Este desequilibrio oxidativo conduciría a la
muerte de las células sembradas. El estrés mecánico se ha relacionado con pérdida de
viabilidad celular, reorganización del citoesqueleto, alteraciones mitocondriales e inducción
de senescencia en varios tipos celulares como fibroblastos (Hu et al. 2017).
Quedaría pendiente determinar de qué modo son las células capaces de detectar o sentir su
posición en un medio inerte como el agar. Entre las posibilidades que hemos planteado y en
las que actualmente estamos trabajando, se encuentra la posibilidad de que las células
fueran capaces de interaccionar con la matriz de agar a través de integrinas u otras
moléculas de membrana. Planteamos que moléculas como fibronectina, colágeno,
vitronectina o laminina, presentes en el FBS, podrían quedar depositadas sobre la estructura
87
Discusión
reticulada del gel de agar, permitiendo su interacción con las moléculas de membrana de los
linfocitos. La hipótesis que actualmente está cobrando más fuerza en las investigaciones de
nuestro grupo es la de que mecanosensores de membrana sean capaces de sentir la rigidez
del gel de agar y medien la señalización intracelular que desencadena una situación de
estrés oxidativo en las células. Muchas de las moléculas propuestas como
mecanorreceptores son moléculas de membrana que requieren de la interacción con
ligandos presentes en la MEC o en otras células para desencadenar una respuesta al
estímulo mecánico, en lo que se conoce como mecanosensibilidad mediada por receptores
(Chen et al. 2017). Existen, sin embargo, otras moléculas que no necesitarían interaccionar
con ligandos, sino que desencadenarían la transducción de señales al activarse por simple
deformación mecánica, entre los que se encuentran, por ejemplo, los canales iónicos PIEZO
(Chen et al. 2017). Se ha demostrado que el silenciamiento de Piezo1 permite el crecimiento
en agar blando de células epiteliales bronquiales, lo que los autores identifican como
capacidad de crecimiento independiente de anclaje (McHugh et al. 2012).
6. Perspectivas de nuevos tratamientos frente al linfoma
Considerando la utilidad del cultivo celular en agar blando como ensayo de tumorigénesis in
vitro, con correlación con el ensayo de xenotrasplante in vivo, planteamos que el bloqueo
del sistema antioxidante GSH mediante tratamiento farmacológico con BSO podría tener el
mismo efecto in vitro que en los ratones λ-MYC, evitando o retrasando la aparición de
tumores. La existencia de mayores niveles de ROS y GSH en los tejidos de ratones λ-MYC con
respecto a hermanos de camada wt justificaba iniciar el tratamiento con BSO. Los resultados
preliminares de nuestro experimento son prometedores ya que el tratamiento con BSO está
manteniendo a los ratones libres de tumores por más tiempo que los ratones control.
Estos resultados apoyan los de otro estudio en el que comprobó que la inhibición temprana
de la síntesis de GSH mediante tratamiento con BSO limitaba el desarrollo de tumores en un
modelo múrido de cáncer de mama (Harris et al. 2015).
Mediante el estudio de la línea híbrida de ratón λ-MYC;Gclm-/- generada, esperamos poder

determinar el efecto que tendría la depleción no patológica de los niveles de GSH en
animales predispuestos a desarrollar tumores linfoides. La ausencia de patología en los
ratones Gclm-/- sugiere que existe una compensación a través de otros sistemas de defensa
88
Discusión
antioxidante que permiten mantener las ROS dentro de su margen de funcionamiento
fisiológico.
Los resultados obtenidos son prometedores en cuanto al desarrollo de nuevas posibilidades

terapéuticas en el tratamiento del linfoma, sin embargo es fundamental estudiar la posible
participación de otros sistemas celulares de defensa antioxidante en el desarrollo tumoral.
Esto permitiría diseñar aproximaciones terapéuticas más completas así como hacer frente a
posibles mecanismos de compensación.
89
90
Conclusiones
91
92
Conclusiones
De los resultados obtenidos en este trabajo se extraen las siguientes conclusiones:
1. las células linfoides, tanto tumorales como inmortales no tumorales, son capaces
de proliferar en ausencia de anclaje a un sustrato rígido y a otras células.
2. El aumento del estrés oxidativo inducido por el cultivo de las células linfoides en
agar blando produce muerte celular.
3. Las células linfoides tumorales producen más glutatión reducido que las células
linfoide inmortales no tumorales en agar blando.
4. La inhibición del estrés oxidativo mediante el uso de N-acetil-cisteína facilita el

crecimiento de los linfocitos no tumorales en agar blando.
5. La inhibición farmacológica de la síntesis de glutatión impide el crecimiento de las

células linfoides tumorales en agar blando
6. La inhibición farmacológica de la síntesis de glutatión impide el crecimiento de las

células linfoides tumorales injertadas subcutáneamente en ratones
inmunodeficientes.
7. Los tejidos linfoides tumorales del modelo múrido de linfomagénesis lambda-MYC

muestran mayores niveles de GSH que los tejidos linfoides de ratones sanos.
8. El tratamiento de los ratones lambda-MYC con un inhibidor farmacológico de GCLC

previene la linfomagénesis.
93
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Kourani Mendez Omar

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En base a estos antecedentes nos planteamos como objetivo de este trabajo:

- Determinar los requerimientos de anclaje intercelular y/o a sustratos rígidos de

- Investigar el papel del estrés oxidativo en el crecimiento de los tumores linfoides.

2. Ensayo de formación de colonias en agar blando

Estos ensayos se llevaron a cabo en diferentes soportes plásticos en función de su duración.

3. Recuperación de células sembradas en agar

4. Ensayos de impedimento de anclaje

4.3 Bloqueo con anticuerpos y tratamiento con compuesto A-286982

El compuesto A-286982 (Sigma-Aldrich-Merk), inhibidor especifico de la interacción entre la

Anticuerpo hibridoma Molécula reconocida

4.4 Ensayo clonogénico

5. Análisis de proliferación y ciclo celular

6. Extracción de RNA y qPCR

8. Tratamiento con BSO, NAC y Z-VAD

Se preparó un stock inicial del inhibidor específico e irreversible de GCL, L-Butionina-

9. Análisis de viabilidad celular

10. Detección de ROS y GSH por citometría de flujo

Los niveles intracelulares de GSH se detectaron empleando la sonda fluorescente mBCI

11. Generación de vector de expresión de GCLC

Mediante retrotranscripción de RNA total extraído de células HuVEC, se obtuvo cDNA a

12. Transfección celular y producción de lentivirus

Se usaron células HEK-293T como empaquetadoras de partículas lentivirales. Para ello

Nombre Origen Función Marcador