Regeneración de plantas por cultivo in vitro

de anteras de Desmanthus virgatus (Leguminosae)

Forlin, Sebastián M. - Seijo, Guillermo - Rey, Hebe Y. - Mroginski, Luis A.

Trabajo parcialmente financiado por el CONICET y por la SGCyT (UNNE)

IBONE - CC 209 - Facultad de Ciencias Agrarias - UNNE.
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INTRODUCCION

El género Desmanthus (Leguminosae) presenta 24 especies (Luckow, 1993; Elias, 1981), que se
distribuyen en las zonas tropicales y subtropicales de todo el continente americano. D. virgatus fue citada como
un componente importante de las pasturas naturales en las regiones del Chaco, con cierta tolerancia a las heladas
y rebrote vigoroso en invierno y primavera (Glatzle, 1999). El desarrollo de un sistema in vitro que permita la
regeneración de plantas, así como la obtención de haploides constituiría una herramienta valiosa para el
mejoramiento de esta especie.
Con esta finalidad, en este trabajo se da a conocer un procedimiento que permite la obtención de plantas
regenerantes mediante el cultivo in vitro de anteras en D. virgatus.

MATERIALES Y METODOS

Se utilizaron plantas de D. virgatus (L.) Willdenow, cuyo testigo se halla depositado en el herbario del
Instituto de Botánica del Nordeste (S. 2347, CTES). Se emplearon botones florales, conteniendo anteras con
células madres de polen en estado de tétrade, polen uninucleado y polen binucleado. El estadío de la antera fue
determinado por tinción con orceína acética. Los botones florales fueron desinfectados por inmersión en etanol
al 70% durante 1 min, y luego en una solución de NaOCl al 1,1% conjuntamente con 1 gota de Tween 20
durante 8 min. Finalmente, fueron lavados 3 veces con agua destilada estéril.
El medio de cultivo utilizado fue el sugerido por Murashige & Skoog (8) suplementado con 1 mg/L de
ácido naftalenacético (ANA) y 3 ó 6 mg/L de bencilaminopurina (BAP), antes del agregado de 0,7% de agar . El
pH de los medios fue ajustado a 5,8. Los medios contenidos en tubos de vidrio de 11 mL (a razón de 3 mL de
medio/tubo) fueron obturados con papel de aluminio y esterilizados en autoclave a 0,101MPa durante 20 min.
Luego de su extracción, se cultivaron 8 anteras por tubo; los que se obturaron con Resinite AF 50 y se
colocaron en un cuarto climatizado a 27 ± 2°C y 14 h de fotoperíodo (116 µm.m-2.s-1). Los experimentos fueron
repetidos por lo menos tres veces.
El recuento cromosómico se realizó en meristemas radicales de plantas madres y regeneradas, las que
fueron pretratadas con 8-hidroxiquinoleína 0.002 M y fijadas en etanol: ácido láctico (5:1) (Fernández , 1973).
La tinción fue hecha con la técnica de Feulgen.

RESULTADOS Y DISCUSION

Luego de 60 días de cultivo, se observó que entre el 10 y el 80 % de las anteras generaron callos (Fig.
1). Los porcentajes de inducción de callos en ambos medios fueron variables, dependiendo del estado de la
antera en el que fue incubada y del medio de cultivo; resultando ser el mejor medio el compuesto por MS + 1
mg/L ANA + 3 mg/L BAP.
Los callos fueron subcultivados a medios frescos con los mismos reguladores (Fig. 2). A los 60 días,
solamente en el medio compuesto por MS + 1 mg/L ANA + 3 mg/L BAP se observaron diferentes porcentajes
de callos, callos + yemas (C+Y) y callos + yemas + vástagos (C+Y+V), mientras que en MS + 1 mg/L ANA + 6
mg/L BAP se observó únicamente callos. La regeneración de vástagos en el subcultivo dependió del tipo de
antera, lográndose entre 15 y 18% de vástagos en callos provenientes de anteras en estado de tétrade y de polen
uninucleado, mientras que solamente 2% en callos provenientes de anteras en estadio de polen binucleado (Fig.
2). Además, los cultivos de los tres tipos de anteras formaron entre el 5 y 30% de callos + yemas. Este tipo de
callos es también importante para la obtención de plantas, ya que cada yema constituye un vástago potencial
(Fig.2).
Todos los vástagos obtenidos fueron enraizados en MS + 0,1 mg/L ANA. El análisis cromosómico de
las plantas regeneradas in vitro mostró que éstas eran diploides, con 2n=2x=28 igual que las plantas madres.
Por lo tanto, el procedimiento utilizado demostró ser útil para obtener plantas regenerantes diploides de
D. virgatus por organogénesis, sin embargo, no se regeneraron plantas haploides. Estos resultados coinciden con
trabajos anteriores (Bajaj, et al 1981, Mroginski & Fernández, 1979, 1980; Willcox et al 1991) en cuanto a la
dificultad que presentan las leguminosas para la obtención de plantas haploides a partir de cultivo in vitro de
anteras.

Fig. 1 Inducción de callos por cultivo de anteras de Desmanthus virgatus de diferentes estadíos en el
establecimiento en medios conteniendo MS + 1 mg/L ANA y 3 ó 6 mg/L BAP. (Resultados a los 60 días
de cultivo).
Tétrade Uninucleado Binucleado
100 100 100
Respuestas (%)

80
Respuestas (%)

Respuestas (%)
80 80

60 60 60

40 40 40

20 20 20

0 0
ANA1+BAP3 ANA1+BAP6 mg/L 0
ANA1+BAP3 ANA1+BAP6 mg/L ANA1+BAP3 ANA1+BAP6 mg/L

Referencias: Sin respuestas Con callos Callos + Yemas Callos+Yemas+Vástag os

Fig. 2 Respuestas morfogénicas a los 60 días del subcultivo de los callos originados de las anteras (en diferentes
estadíos) en medios conteniendo MS + 1mg/L ANA y 3 ó 6 mg/L BAP.

Tétrade Uninucleado Binucleado

100 100 100
Respustas (%)

80
Respuestas (%)

Respuestas (%)

80 80

60 60 60

40 40 40

20 20 20

0 0 0
ANA1+BAP3 ANA1+BAP6 mg/L ANA1+BAP3 ANA1+BAP6 mg/L ANA1+BAP3 ANA1+BAP6 mg/L

Referencias: Con callos Callos+Yemas Callos+Yemas+Vástagos

BIBLIOGRAFIA

1. Bajaj, Y.P.S.; A.K. Ram; K.S. Labana & H. Singh (1981) Plant Sci. Lett. 23: 35-39
2. Elias, T.S. 1981. Tribe: Parkieae En: Advances in Legume Systematics, Part 1, ed. R.M. Polhill & Raven pp
153-168.
3. Fernández, A. 1973. Bol. Soc. Argent. Bot., 15 (2-3): 283- 290
4. Glatzle, A.1999. Compendio para el Manejo de Pasturas en el Chaco. Ed. El Lector. Asunción (Paraguay) pp.
188.
5. Luckow, M. 1993. Monograph of Desmanthus (Leguminosae- Mimosoideae) Systematic Botany
Monographs. 38:1 - 166.
6. Mroginski, L.A. & A. Fernández (1979). Oléagineux 34:243-248
7. Mroginski, L.A. & A. Fernández (1980) Oléagineux 35:89-92
8. Murashige, T. & Skoog, F. (1962). Physiol. Plant. 15: 473-497
9. Willcox, M.C.; S. M. Reed; J.A. Burns & J.C. Wynne (1991) Plant Cell Tissue & Organ Culture 24: 25-28