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moléculas
Artículo
Perfil de los triterpenos pentacíclicos y su vía de biosíntesis en
Cecropia telenitida como posible suplemento dietético
Gustavo Gutiérrez 1 , Laura Marcela Valencia 1, Deisy Giraldo-Dávila 2, Marianny Y. Combariza 2,
Elkin Galeano 3 , Norman Balcazar 4,5 , Aram J. Panay 6 , Alejandra Maria Jerez 7
y Guillermo Montoya 1,8,*
comprobar Eor
Actualiza
Citación: Gutiérrez, G.; Valencia, L.M.;
Giraldo-Dávila, D.; Combariza, M.Y.;
Galeano, E.; Balcazar, N.; Panay, A.J.;
Jerez, A.M.; Montoya, G. Perfil de
triterpenos pentacíclicos y su vía
biosintética en Cecropia telenitida como
posible suplemento dietético. Molecules
2021, 26, 1064. https://doi.org/10.3390/
molecules26041064
Editora académica: Ana Lourenço
Recibido: 13 de enero de 2021
Aceptado: 9 de febrero de 2021
Publicado: 18 de febrero de 2021
Nota del editor: MDPI se mantiene
neutral con respecto a las reclamaciones
jurisdiccionales en los mapas publicados
y las afiliaciones institucionales.
Copyright: © 2021 por los autores.
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creativecommons.org/licenses/by/ 4.0/).
Moléculas 2021, 26, 1064.https://doi.org/10.3390/molecules26041064https://www.mdpi.com/journal/molecules
1Departamento
de Ciencias Farmacéuticas, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Icesi, Cali 760031,
Colombia;
2Escuela ggutierrezg94@gmail.com (G.G.); lauramarcela.valenciatorres@gmail.com (L.M.V.)
de Química, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga 680003, Colombia;
deisy.giraldo.davila@gmail.com
3Productos
(D.G.-D.); marianny@uis.edu.co (M.Y.C.)
Naturales Marinos, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias
Alimentarias, Universidad de Antioquia, UdeA, Calle 70 # 52-21, Laboratorio 2-131, Farmacéuticas y
Medellín 050010, Colombia; elkin.galeano@udea.edu.co
4Departamento
de Fisiología y Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia,
Carrera 51D Nº 62-29, Medellín 050010, Colombia; norman.balcazar@udea.edu.co
5GrupoGENMOL, Sede de Investigación Universitaria, Universidad de Antioquia, Calle 62 # 52-59, Medellín
050010, Colombia
6Investigador independiente, Calle 28 # 86-70 Apto 712, Cali 760031, Colombia; joelpanay@gmail.com
7Departamento
de Ciencias Biomédicas, Escuela de Salud, Universidad Icesi, Cali 760031, Colombia;
amjerez@icesi.edu.co
8Centro
de Ingredientes Naturales Especializados y Biotecnológicos (CINEB), Facultad de Ciencias Naturales,
Universidad Icesi, Cali 760031, Colombia
*Correspondencia: glmontoya@icesi.edu.co; Tel: +57-317-331-3187
Resumen: Investigaciones prometedoras realizadas en las últimas décadas han demostrado que algunos
tipos de triterpenos pentacíclicos (TP) están asociados a la prevención de la diabetes tipo 2 (T2D),
especialmente los que se encuentran en los alimentos. Las fuentes comestibles más abundantes de TP son las
que pertenecen a los esquemas ursano y oleanano. El principal hallazgo es que Cecropia telenitida contiene
abundantes tipos de TP oleananos y ursanos con patrones de oxigenación similares a los encontrados en las
matrices alimentarias. Estudiamos el perfil composicional de una fracción rica en PT (DE16-R) y realizamos
un test de viabilidad sobre diferentes líneas celulares. La vía biosintética relacionada con los PT aislados en
C. telenitida ofrece un beneficio medicinal específico relacionado con la modulación de la T2D. El presente
estudio sugiere que esta planta puede ensamblar PT isobáricos, isómeros posicionales o epiméricos. Los
andamios de ursano u oleanano con el mismo patrón de oxigenación son siempre compartidos por los TP de
C. telenitida, como se demuestra en su vía biosintética. Las comunidades locales han utilizado durante mucho
tiempo esta planta en la medicina tradicional, y los seres humanos han consumido PTs de ursano y oleanano
en los frutos desde la antigüedad, dos puntos clave que creemos útiles para considerar los beneficios
medicinales de C. telenitida y explicar cómo un grupo de moléculas que comparten un andamiaje
estrechamente relacionado puede expresar su eficacia.
Palabras clave: Cecropia telenitida; triterpeno pentacíclico; diabetes tipo 2; suplemento dietético
1. Introducción
Los informes de investigación de las dos últimas décadas destacan el papel potencial de los
triterpenos en la prevención y eventual tratamiento de la diabetes de tipo 2. Por ejemplo, el
consumo de triterpenos pentacíclicos (TP), presentes en el aceite de oliva, se ha asociado a
beneficios como la mejora de la función endotelial en adultos sanos [1]. También hay una gran
cantidad de investigaciones que describen el potencial de los TP para tratar la prediabetes y la
diabetes. Según Sheng y Sun, los TP son capaces de asociarse con la maquinaria bioquímica de
los sistemas vivos, ya que están preadaptados para interactuar con diferentes redes celulares en
animales y humanos
Moléculas 2021, 26, 2de 14
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de los cuerpos humanos [2]. En el mismo informe, los autores describen 22 dianas moleculares
del metabolismo de la glucosa y los lípidos moduladas por los TP, como los ácidos oleanólico,
ursólico, betulínico y asiático [2]. Sin embargo, también se ha informado de que otros TP, como
los ácidos corosólico, maslínico, arjunólico, hederagénico, serjánico y torméntico, disminuyen los
niveles de glucosa, aumentan la secreción de insulina y la sensibilidad a la insulina, o reducen las
adipokinas inflamatorias en el tejido adiposo [3-6]. Al pasar por alto las propiedades de los TP, el
sistema sanitario mundial corre el riesgo de perder un tratamiento preventivo consistente, eficaz y,
lo que es más importante, asequible, para una de las principales causas de muerte y discapacidad
en todo el mundo.
Los TP mencionados anteriormente presentan un andamiaje estructural común -un oleanilo y
un ursanilo- que, según los informes, modula algunas vías metabólicas humanas y animales. Por
ejemplo, se ha demostrado que la inhibición de la expresión génica de las citoquinas
proinflamatorias mediante el ácido serjánico es crucial para prevenir o mejorar el daño de las
células β del páncreas en un estado diabético, como se ha demostrado en un modelo preclínico
murino [7]. Varios modelos experimentales han demostrado que la inflamación de los islotes
desempeña un papel importante en la patogénesis de los pacientes con insuficiencia de células β. La
desactivación del NF-κB regula positivamente el sustrato del receptor de insulina IRS1/2,
favoreciendo la transloca- ción del transportador de glucosa tipo 4 (GLUT4) a través de la
membrana celular, disminuyendo la resistencia a la insulina y contribuyendo significativamente a
un estado normoglucémico [3,8].
Aunque se ha demostrado clínicamente que otros tipos de triterpenos tetracíclicos, como los
ginsenósidos, no mejoran la función de las células β ni la sensibilidad a la insulina [9], un número
considerable de informes preclínicos sugiere lo contrario [10,11]. Esto podría abrir el debate sobre
la capacidad de los triterpenos pentacíclicos y tetracíclicos para modular los mismos objetivos
biológicos y dependería de sus estructuras y, por tanto, de su vía biosintética. Compuestos de
origen natural como la glicirricina, el ácido glicirrícico y su derivado semisintético carbenoxolona
están estructuralmente relacionados con los TP producidos por la Cecropia telenitida, pero estos
compuestos tienen un patrón de oxigenación diferente y, por tanto, pueden inducir una
hipertensión al reducir las transcripciones tanto de la 11β-HSD2 como de la CYP11B2 en la
vasculatura, lo que provoca una menor producción de aldosterona y una mayor de corticosterona
en los vasos [12]. Es probable que esta decoración específica del andamiaje de triterpenos
proporcione al regaliz una modulación de destino diferente a la descrita para las enfermedades de
base inmunitaria o inflamatoria [13].
Cecropia telenitida, una planta endémica de la región andina de Sudamérica, contiene
abundantes tipos de PT oleananos y ursanos [14]. El género ha sido ampliamente utilizado como
remedio hipoglucemiante y antiinflamatorio en la medicina tradicional [15]. En un informe
anterior, utilizando pruebas in vitro, aislamos una fracción de Cecropia telenitida activa hacia el
objetivo metabólico 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1 (11β-HSD1). La fracción activa
fue codificada como DE16 [16], y parte de nuestro trabajo inicial fue describir su perfil
metabólico PT. Curiosamente, en el mismo estudio, las subfracciones del DE16 fueron
considerablemente menos activas que la fracción completa sobre la diana metabólica
seleccionada (11β-HSD1), lo que sugiere un efecto sinérgico.
Queremos seguir examinando el espacio composicional asociado al perfil de triterpenos
pentacíclicos de la fracción DE16 y evaluar su uso como suplemento dietético para las
condiciones prediabéticas. Con este fin, estudiamos el perfil composicional de triterpenos de la
fracción líder obtenida de otro individuo (DE16-R) a través de análisis MALDI-TOF, LC-MS y
NMR y probamos su viabilidad en diferentes líneas celulares. La desafiante tarea de describir el
perfil metabólico de DE16-R resultó ser un emocionante ejemplo de "volver a las raíces" en la
química de los productos naturales.

2. Resultados
2.1. Recuperación de una fracción química DE16 (DE16-R) de diferentes muestreos
El fraccionamiento automatizado por cromatografía flash de las raíces de Cecropia telenitida
en polvo [16] produjo 86 fracciones. Se llevó a cabo una huella de TLC, utilizando ácido
sulfúrico-vanillina como agente derivador, para determinar las fracciones cuyo perfil
cromatográfico era similar al DE16. Las fracciones 40 a 54 mostraron la mayor similitud del
perfil químico de TLC con la DE16. Estas fracciones se agruparon, se etiquetaron como DE16-R
y se analizaron por espectrometría de masas MALDI-TOF para compararlas con la fracción
original de DE16 (Figura 1).
Figura 1. (A) Espectros de masas de la fracción líder obtenida originalmente (DE16). (B) Espectros de masas de las fracciones
agrupadas (DE16-R). La ionización se realizó por MALDI (-) utilizando DMAN como matriz.

La figura 1 muestra el ion a m/z 487,343 como pico base del espectro MS en ambas
fracciones; en DE16-R se observan algunas especies de baja abundancia en el rango de masas
inferior. Todas las especies observadas en los espectros MALDI (-) corresponden a moléculas
desprotonadas formadas por abstracción de protones, a partir de moléculas ácidas presentes en el
extracto, por la matriz altamente básica DMAN (1,8-bis(dimetilamino)naftaleno) según la teoría
ácido-base de Brønsted- Lowry. La observación de sólo unas pocas especies iónicas en los
espectros MALDI negativos es algo desconcertante, ya que se esperaba que la fracción mostrara
un perfil más complejo. Por lo tanto, se utilizó el modo de iones positivos MALDI MS, utilizando
DHB como matriz, para interrogar a las subfracciones individuales en lugar de la fracción
agrupada. Curiosamente, los espectros de MS MALDI en modo positivo para las subfracciones
mostraron un ion a m/z 511,339 como pico base en todos los espectros. Este ion corresponde al
aducto de sodio de la misma entidad molecular observado a m/z 487,343 en el modo de iones
negativos MALDI.
Al surgir algunas dudas sobre los resultados del MALDI-TOF, se decidió hacer uso de la
dimensión de separación acoplada a la espectrometría de masas en el análisis de las fracciones. Se
realizó un análisis en modo negativo por UPLC-APCI-MS con el objetivo de generar más
información sobre algunos iones moleculares desprotonados en valores cercanos a los más
abundantes, y probablemente ilustrar más claramente la existencia de triterpenos ionizados menos
concentrados o en menor cantidad.
Los resultados en ambas fracciones compartían la alta abundancia de iones 487 y 471 m/z en
modo negativo, como se muestra en la Figura2. Otros iones menos abundantes, cercanos a un
tiempo de retención de cinco minutos en ambas muestras, compartían las mismas relaciones
masa-carga, pero debido a la baja abundancia de iones y a un analizador de baja resolución, no se
tuvieron en cuenta para el análisis.
 Sin embargo, a primera vista, este resultado sugiere que Cecropia telenitida tiene una capacidad
metabólica de ensamblaje de triterpenos que da lugar a un perfil en el que algunas moléculas son
isobáricas, un isómero posicional de los epímeros.

Figura 2. Cromatogramas en modo negativo UPLC-APCI-MS para las fracciones DE16 y DE16-R. Los espectros del cromatograma
de iones totales (TIC) se obtuvieron tras la integración de los picos y la sustracción del ruido del disolvente. Se extrae cada espectro,
designando a cada pico un número consecutivo del 1 al 5.

2.2. Aislamiento clásico molécula por molécula y análisis de RMN

Dado que la tarea principal era identificar el perfil químico de la fracción DC16-R, se optó
por el aislamiento clásico de las moléculas. Fue necesario realizar una cromatografía preparativa
y varias inyecciones para obtener una cantidad suficiente para el análisis espectroscópico. En la
Figura 3 se muestra un cromatograma regular. Todas las moléculas se aislaron como se describe
en la sección de proceso de extracción y cromatografía flash y preparativa. La huella 1D 13C-
NMR para 17,94 min
 es igual a la del ácido isoarúmico previamente reportada [16]. Además, la conectividad se
determinó por completo empleando experimentos de RMN 2D homo y heteronucleares (véase el
material suplementario).

Figura 3. Cromatograma preparatorio obtenido por HPLC-DAD de DE16R. La molécula con un tiempo de retención de 17,94 se
identificó como ácido isoarúmico, la de 23,31 min se identificó como ácido torméntico, la de 27,47 min se identificó como ácido
arjunólico, y
28,27 min se identificó como ácido hederagénico.

La elucidación de la estructura basada en la RMN de la huella 1D 13C-NMR de 23,31 min -a

pesar de presentar una alta homología con la huella 13C-NMR del ácido isoiarúmico- tuvo que
realizarse de novo debido a las diferencias espectrales.
El compuesto de 23,31 min presenta una señal de doblete a 2,74 ppm, el experimento de
HSQC 1H-13C con multiplicidad editada (edited-HSQC) reveló que este protón está unido a una
señal de 82,8 ppm en 13C-NMR y corresponde a un protón de metilina. Los espectros HMBC
indican el acoplamiento con el protón de 3,42 ppm (67,70 ppm) con un protón cuya multiplicidad
y acoplamiento HMBC revela la vecindad del CH2 (0,76-1,75 ppm, fase editada-HSQC-
negativa). En este orden de ideas, ambas señales de protones, 3,42 y 2,74 ppm, se asignaron a las
posiciones 2 y 3 del CH-OH, respectivamente. La doble hidroxilación en las posiciones
mencionadas es ampliamente consistente con la biogénesis de los triterpenos pentacíclicos.
La presencia de una señal de triplete de protones de 5,17 ppm sugiere la presencia de una
olefina (fase editada-HSQC-positiva). La multiplicidad indica la proximidad del CH2, hecho que
se confirma mediante los espectros HMBC y COSY (1,88 ppm, fase editada-HSQC-negativa). La
señal de 5,17 ppm también mostró un fuerte acoplamiento HMBC con el carbono cuaternario de
139,10 ppm (no se observó correlación HSQC); basándose en las características estructurales
biosintéticas, el doble enlace se asignó a la posición C12-C13.
La posición C13 (139,10 ppm) muestra una correlación con el protón singlete de 2,38 ppm
(fase positiva editada-HMBC) que, a su vez, se acopla con el carbono de 179,46 ppm. Teniendo
en cuenta las características estructurales de los triterpenos pentacíclicos, sólo C18 o C19 son las
metinas más cercanas para conseguir un rango de acoplamiento. Sin embargo, debido a la
proximidad del ácido carboxílico C17, en la señal mencionada, el desplazamiento químico 2,38
ppm se asignó a la posición C18. La multiplicidad de la señal de 2,38 ppm también sugiere que la
posición C19 corresponde al carbono cuaternario, sumado al hecho de su acoplamiento con el
carbono altamente desplazado (72,13 ppm, no se observa correlación HSQC) y el singlete 3H
(1,09 ppm, fase editada-HSQC-positiva). Esta diferencia espectral con el compuesto de 23,31 min
del ácido isoarúmico, se debe a un desplazamiento del grupo hidroxilo de la posición C20 a la
C19. La posición adyacente correspondía a un
0,84 ppm (0,84 ppm, fase editada-HSQC-positiva). Esta molécula fue reportada previamente
como ácido torméntico [6,17,18] (Figura4).
Figura 4. Presentación de las estructuras de los triterpenos pentacíclicos (PT) encontrados en Cecropia telenitida. El ácido
isoarúmico, el ácido torméntico, el ácido arjunólico y el ácido hederágeno son moléculas aisladas e identificadas como resultado de
este trabajo. Las masas exactas resaltadas en azul muestran triterpenos isobáricos.

De DE16-R, también se aisló un pico a 27,47 min. El espectro de 1H-NMR revela algunas
características estructurales que diferencian el ácido torméntico del isoarúmico, a pesar de que su
posición de doble enlace permanece inalterada. En lugar de siete señales con integrales 3H
(metilo), la muestra de 27,47 min mostró seis. La presencia de la señal de protón 3,20-3,35 ppm
(69,60 ppm, fase editada-HSQC-negativa) que se acopla con las señales de protón 3,12 y 3,72
ppm (80,58 y 65,37 ppm, fase positiva editada-HSQC) indica la hidroxilación de uno de los
grupos dimetilos en la posición 4, al tiempo que revela la hidroxilación en las posiciones 2 y 3 y
explica la ausencia de la séptima señal de metilo en el espectro 1H-NMR.
La señal del carbonilo (179,04 ppm, posición 28) y del carbono cuaternario olefínico (144,01
ppm, posición 13) se acopla con la señal de 2,92 ppm (43,53 ppm, fase positiva editada-HSQC),
característica de la posición 18 cuya multiplicidad, además, no revela ninguna sustitución de vecindad,
mientras que el acoplamiento COSY permite asignar la señal de 2,20 ppm a la posición 19. En la
mención de la señal de la posición se acoplan dos grupos metilo que aparecen como singletes, lo que
sugiere la doble sustitución en el carbono 20. Estas características estructurales implican que el
compuesto de 27,47 min corresponde al ácido arjunólico [19-21].
 El pico a los 28,57 minutos mostró una señal característica para el CH2-OH, mientras que
las integrales del grupo metilo indican la presencia de seis sustituyentes en lugar de los típicos
siete. Sin embargo, a diferencia del ácido arjunólico, no hay señales para la hidroxilación de la
posición 2. La posición del doble enlace entre C12 y C13, así como en los grupos dimetilos,
permanece inalterada. De acuerdo con estos hechos espectroscópicos, esta muestra corresponde al
ácido hederagénico [22,23]. El pico de área inferior en el tiempo de retención 29,91 se descartó
debido a un error humano, y no se obtuvo ninguna información espectroscópica.

2.3. Viabilidad celular en las líneas celulares HepG2, C2C12 y 3T3-L1

La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT tras el tratamiento con ácido
corosólico y la fracción DC16-R durante 4 h (C2C12), 48 h (HepG2) o siete días (3T3-L1). Estos
tiempos se utilizaron para realizar las pruebas funcionales. La fracción DE16R demostró una
reducción significativa de la viabilidad celular a concentraciones > 62,5 mg mL-1 en células
HepG2, >125 mg mL-1 en células C2C12 y > 31,3 mg mL-1 en células 3T3-L1. El ácido
corosólico es un triterpeno pentacíclico no reportado en Cecropia telenitida, pero que presenta el
mismo andamiaje de moléculas reportado en la fracción, y reduce la viabilidad celular a
concentraciones de 31,3 mg mL-1 en células HepG2, 62,2 mg mL-1 en células C2C12 y
probablemente a concentraciones de 31,3 mg mL-1 en células 3T3-L1 ≥ (Figura5). Los ensayos de
≥≤
viabilidad celular consideran que un compuesto es seguro, a valores superiores al 80% [24].

Figura 5. Citotoxicidad del ácido corosólico (AC) y de la fracción DE16-R en las líneas celulares 3T3-L1,
HepG2 y C2C12. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron durante 48H (HepG2) ( A),
4 h (C2C12) (B) y 7 días (3T3-L1) (C). La citotoxicidad se evaluó mediante el ensayo de metiltiazol
tetrazolio (MTT). Los valores se expresan como media ± SEM. Se realizó un ANOVA con post hoc de
Dunnett para comparaciones múltiples. ****: p < 0,0001; ***: p < 0,001; **: p < 0,01; *: p < 0,05. n = 3.
3. Debate
3.1. Vía biosintética de los triterpenos pentacíclicos y perfil de Cecropia telenitida PT
Con el fin de describir cómo C. telenitida es capaz de biosintetizar los PTs aislados en este
trabajo, es necesario volver al intermedio bioquímico escualeno, que sufre una ciclización
catalizada por enzimas. La amplia diversidad estructural de los PTs obedece a una regla
biogenética del isopreno que es capaz de predecir el resultado metabólico. Una vez que tiene lugar
la ciclización del oxidosqueno en la vía biogenética, los triterpenoides tetracíclicos se ensamblan
para producir dos cationes intermedios diferentes que difieren en la configuración del anillo, como
se muestra en la Figura6. El catión protosteril con una configuración C-B-C que produce
compuestos de esterol, y una configuración de catión dammaneril que es capaz de producir una
gran variedad de triterpenoides, y el anillo D del ciclopentano tiene una configuración semiboja
como se muestra en la Figura6. El catión dammanerilo puede sufrir una expansión del anillo a lo
largo de la migración C16 para formar el catión bacarenilo, que puede sufrir otra expansión del
anillo a partir de la migración C18β para formar el catión lupilo (1). El anillo E de cinco
miembros en el catión lupilo puede sufrir una expansión a través de la migración C18 para dirigir
la ruta biosintética hacia el catión ursanilo (4) o la migración C20 para formar el catión germanilo.
El desplazamiento del metilo y del hidruro1,2 observado, es generalmente antiperiplanar,
preservando la posición estereofónica cuando el desplazamiento tiene lugar. El desplazamiento de
metilo 1,2 en el catión germanicílico dará lugar al catión taraxerílico (3), y el desplazamiento de
hidruro 1,2 dará lugar al catión oleanílico (2). Estos cationes se apagan por desprotonación o por
la adición de un grupo hidroxilo, y posteriormente algunas monooxigenasas del citocromo P450,
familia CYP716 (CYP716A265, CYP716A266) catalizan la oxidación del C-28 a alcohol, a
aldehído y posteriormente a ácido carboxílico [25,26]. La enzima CYP716C55 cataliza la
hidroxilación C-2α, dando lugar a una variedad de compuestos naturales resultantes de cada catión
y que responden a la estereoquímica específica. Las moléculas derivadas de los cationes
mencionados anteriormente se muestran en la Figura6 como sigue: del catión 1: lupeol, lupenona,
ácido betulínico. Del catión 2: ácido oleanólico, ácido maslínico, ácido b-amirino arjunólico,
ácido hederagénico, ácido serjánico, ácido espergulagénico A. Del catión 3: taraxasterol; y del
catión 4: ácido 20-hidroxi-ursólico, ácido ursólico, α-amirina, ácido corosólico, ácido asiático,
ácido torméntico, ácido isoyarumico, ácido yarumico, ácido goreishico I.

3.2. Breve descripción de la relación estructura-actividad de los TP

Algunos TP derivados del catión lupilo, que mantienen parte del patrón oxigenado (en C2,
C19, C20 y el ácido carboxílico en 28), proporcionan a las moléculas un activo específico
relacionado con la modulación de las enfermedades metabólicas y la diabetes de tipo 2. Por
ejemplo, el ácido carboxílico en C28 parece desempeñar un papel importante en la interacción con
Tyr177 de la enzima 11β-HSD1, que participa en la homeostasis del cortisol [18], y al mismo
tiempo, la posición oxigenada C2α puede interactuar con Thr124 de la misma enzima. Todos los
compuestos PT descubiertos a partir de C. telenitida cumplen el requisito estructural del ácido
carboxílico C28 y, a pesar de su baja potencia, el efecto sinérgico cuando se complementan al
mismo tiempo dará resultados sistémicos y reproducibles [27,28]. El hecho de que varias
moléculas que comparten un andamiaje estrechamente relacionado actúen al mismo tiempo sobre
muchas dianas forma parte de las ventajas que ofrece esta fracción controlada, proporcionando
una potencia leve a través de un grupo de moléculas que actúan de forma sinérgica al tiempo que
se reduce la incidencia de efectos secundarios. El principal reto a la hora de convertir estas
sustancias activas en productos fitoterapéuticos o suplementos dietéticos es asegurar su presencia,
lo que requiere un proceso de estandarización de los extractos para garantizar el control químico y
la eficacia farmacológica reproducible.
Figura 6. Vías biosintéticas para producir PTs. Los nombres subrayados se refieren a moléculas aisladas e identificadas por primera vez
en esta planta. Los nombres de las nueve moléculas en negrita y cursiva marcan los nueve PTs reportados.

Del mismo modo, aquellas sustancias que carecen del grupo carboxilo C28 y tienen
posiciones oxigenadas C11 y C12 como las expresadas en la Boswellia serrata o en los PTs
semisintéticos como la carbenoxolona, pueden producir la inhibición de la 11β-HSD2. Dicha
inhibición suele ser perjudicial para la salud debido a la acumulación de la concen- tración local
de cortisol, que provoca síntomas de un aparente exceso de mineralocorticoides como
hipertensión, defectos en el desarrollo fetal y disminución de los niveles de testosterona en los
varones [29,30]. En el caso de otros andamiajes triterpénicos disímiles al catión lupílico derivado,
por ejemplo, los expresados en la raíz del ginseng con un motivo tetracíclico, se han encontrado
otros tipos de usos clínicos [9].
La modificación de las posiciones oxigenadas utilizando otros tipos de grupos
electronegativos, como los cianuros, y la funcionalización en la fracción carboxilo C17, darían
lugar a moléculas interesantes como la omaveloxolona (RTA-408) para la Ataxia de Friedreich
(miopatía mitocondrial), que actualmente se encuentra en las últimas fases de los ensayos
clínicos.
Es evidente que el ser humano ha ingerido triterpenos pentacíclicos desde la antigüedad a
través del consumo de manzanas, aceitunas, peras, mangos, guayabas y muchas otras frutas. Estos
alimentos contienen triterpenos que suelen oscilar entre 0,1 y 10 mg g-1. En una manzana, por
ejemplo, el contenido oscila entre el 0,28-0,34% del peso de la cáscara seca [31], en el aceite de
oliva cerca de 40 mg kg-1 [1], las peras cerca de 5 mg g-1 en peso seco [32]. El hecho más
importante que se observa en su perfil de PT es que los más abundantes son los que conservan la
funcionalización
y los patrones de oxigenación observados en el perfil de PT de C. telenitida. Una persona que
consuma frutas, bebidas, extractos o un suplemento dietético siempre consumirá en términos de
contenido de triterpenos, un grupo de moléculas, que a granel alcanzan las cantidades
mencionadas anteriormente, pero nunca llegan a concentraciones que producirían problemas de
toxicidad [1,33-36]. Con el fin de analizar la toxicidad, se comparó el extracto DE16-R con una
sustancia pura aislada, el ácido corosólico, para entender cómo la C. telenitida se ha utilizado
tradicionalmente durante siglos sin que se conozcan informes de intoxicación.

3.3. Prueba de la célula de viabilidad y consideraciones generales

Las líneas celulares C2C12, HepG2 y 3T3-L1 se utilizan ampliamente para evaluar la
actividad potencial de nuevas moléculas con actividad antidiabética o diferentes alteraciones
metabólicas [37]. En este estudio, los resultados muestran que la fracción DE16-R presenta una
baja citotoxicidad a concentraciones superiores a 62,5 mg mL-1, y el ácido corosólico a una
concentración superior a 31,3 mg mL-1 en células C2C12 y HepG2. En las células 3T3-L1 se
observó una reducción de la viabilidad celular a bajas concentraciones, probablemente porque las
células fueron expuestas a los dos compuestos diferentes durante más tiempo. La fracción DE16-
R es menos tóxica que la molécula de ácido corosólico.
Es importante señalar que estas pruebas son una evaluación preliminar para valorar la
viabilidad y seguridad de los compuestos para la medicación, y que deben realizarse más estudios
para conocer el efecto de estas moléculas en las células sanas y el posible control de la alteración
metabólica asociada a la obesidad y la diabetes mellitus de tipo 2.

4. Materiales y métodos
4.1. Reactivos
Los disolventes de grado HPLC (diclorometano, acetato de etilo y acetonitrilo
LiChrosolv®), los disolventes de grado de espectrometría de masas (acetonitrilo LiChromsolv®
hipergrado) y el acetato de amonio se adquirieron de Merck (Alemania) y se utilizaron sin más
purificación. Las 254placas TLC de gel de sílice 60 F de Merck (Alemania) se emplearon para
realizar la huella cromatográfica preliminar.
Los productos químicos y reactivos utilizados en el cultivo celular fueron PBS 1X (Gibco,
Carlsbad, CA, EE.UU.), medio de Eagle modificado por Dulbecco con bajo contenido en glucosa
(DMEM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.), medio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, EE.UU.), suero fetal bovino (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), penicilina-
estreptomicina (P/S) 10.000 U/Ml (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), glutamina (Gibco,
Carlsbad, CA, EE.UU.), ensayo de metiltiazol tetrazolio (MTT, Amresco, Solon, OH, EE.UU.).

4.2. Tratamiento de la planta

Las raíces de Cecropia telenitida fueron recolectadas en Rionegro, Antioquia (Colombia)
en diciembre de 2017 a una altura de 2254 m.s.n.m. y en la siguiente ubicación geodésica
6◦06j36.7jj N 75◦23j21.2jj W. El material vegetal fue comparado e identificado contra el vale
Alzate-Montoya 5189 almacenado en el herbario de la Universidad de Antioquia. Las raíces se
secaron a 45 ◦C durante siete días y luego se sometieron a una molienda exhaustiva con una
lijadora de disco convencional. El rendimiento final de las raíces pulverizadas fue de 1,4 kg.

4.3. Proceso de extracción y cromatografía flash y preparativa

Las raíces en polvo se extrajeron utilizando un sistema de disolventes compuesto por
diclorometano (1): acetato de etilo (1) a temperatura ambiente (25 ◦C) y bajo agitación constante (90
rpm) durante 14 días, empleando un sistema de extracción semipiloto diseñado y fabricado por
Process
Soluciones y Equipos
replicaron las (Bogotá,
condiciones de la Colombia).
cromatografíaParaflash
realizar el procesode
automatizada deacuerdo
fraccionamiento, se
con lo reportado
procedimiento sin ninguna modificación [16].
Las fracciones de DE16R se sometieron a purificación mediante una HPLC preparativa
Agilent 1100 (California, Estados Unidos). La separación siguió a una longitud de onda de 210
nm y se llevó a cabo en un Gemini 5 µm C6-Phenyl 110 Å (250 × 10 mm), mediante un
gradiente
elución utilizando agua con ácido fórmico 0,1% (A), y acetonitrilo también con ácido fórmico 0,1%
(B) en un gradiente de 0-5 min 40% B, y luego 5-55 min aumentando hasta 95% B.

4.4. Análisis LC-MS y MALDI-TOF

El análisis LC-MS se llevó a cabo utilizando un sistema ACQUITY UPLC H-Class
acoplado a un detector de masas cuadrupolar simple (SQ Detector 2). La fuente de ionización
química a presión atmosférica (APCI, Waters, Massachusetts, Estados Unidos) se operó en modo
de iones negativos con un voltaje de cono de 80 V, una temperatura de fuente de 550 ◦C y una
temperatura de desolvatación de 150 ◦C. La separación se llevó a cabo en una columna
ACQUITY UPLC® BEH C18 (2,1 100 mm) con un tamaño de partícula de 1,7 µm, de Waters
(Massachusetts, ×Estados Unidos) con elución en gradiente utilizando tampón de acetato de
amonio 5 µM pH 9,2 (A) y acetonitrilo (B) de la siguiente manera 40% B 100% B (0-9 min),
100% B 100% B (9-11 min), 100% →→
B →→
40% B (11-15 min), 40% B 40% B (15-18 min).
El análisis MALDI-TOF/TOF se realizó con un espectrómetro de masas Bruker Daltonics
Ultraflextreme (Billerica, MA, EE.UU.). El instrumento está equipado con un láser Nd:YAG
Smart Beam de 1 kHz (355 nm) operado al 60% de la escala de potencia arbitraria del instrumento
(3,92 µJ/pulso). Los espectros de masas de iones negativos, de m/z 200 a 800, se adquirieron en
modo reflectrón con una extracción de iones pulsada fijada en 100 ns y una tensión de aceleración
de 20 kV. La calibración del instrumento se llevó a cabo utilizando 1,5-diaminonaftaleno y una
mezcla de ftalocianinas, compradas a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.), cubriendo todo el
rango de masas de trabajo. Cada análisis reportado corresponde a la suma de 5000 espectros de
masas. El análisis de los datos se realizó con el software Flex Analysis versión 3.4 (Bruker
Daltonics, Billerica, MA, USA).

4.5. Experimentos de resonancia magnética nuclear

Los experimentos de Resonancia Magnética Nuclear se realizaron en un espectrómetro
Bruker Ascend III HD de 600 MHz (BioSpin GmbH, Rheinstetten, Alemania) equipado con una
criosonda-TCI de 5 mm utilizando DMSO-d6como disolvente.

4.6. Cultivos celulares y prueba de viabilidad celular

Las células musculares de ratón C2C12 (ATCCCRL-1772TM), las células fibrosas de ratón
3T3-L1 (CL-173™) y las células de carcinoma hepático humano HepG2 (ATCC HB-8065TM) se
adquirieron en ATCC (Manassas, VA, EE.UU.). Las células se cultivaron y mantuvieron a 37 ◦C y
5% de CO 2en medio de cultivo DMEM con 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de
glutamina, penicilina y 1% de estreptomicina (Sigma). Cuando las células C2C12 alcanzaron una
confluencia de entre el 80 y el 90%, se diferenciaron en miotubos, utilizando un medio DMEM de
baja glucosa (5,5 mM) suplementado con un 5% de suero de caballo (HS) [38].
Las células 3T3-L1 se cultivaron en DMEM con 10% de FBS, 1% de P/S y 25 mM de
glucosa (Medio de Crecimiento 1-GM1). La diferenciación se indujo dos días después de la
confluencia añadiendo un medio GM1 que contenía 0,5 mM de IBMX, 0,25 µM de
dexametasona, 2 µM de Rosigli- tazona y 1 µg/mL de insulina. Tras dos días de incubación, el
medio se cambió a un medio GM1 que contenía 1 µg/mL de insulina. Dos días después, el
medio se sustituyó por GM1 y se incubó durante otros siete días con los diferentes tratamientos. El
ácido corosólico, un compuesto antidiabético, se utilizó como control. Además, el ácido
corosólico tiene el mismo andamiaje PT presente en los triterpenos de Cecropia telenitida, pero no
se ha informado de él en la planta.
Para evaluar la viabilidad celular, se sembraron células 3T3-L1, HepG2 y C2C12 en placas
de 96 pocillos×a razón de 2,5 104 células/pocillo y se cultivaron durante 24 h. Las células se
lavaron con DMEM una vez y luego se incubaron con diferentes concentraciones de ácido
corosólico (CA) y fracción DE16 (250, 125, 62,5, 31,25 µg/mL) en DMEM durante 4 h
(C2C12), 48 h (HepG2) y siete días (3T3-L1). Posteriormente, se eliminó el medio, se lavaron las
células una vez y se añadió MTT 5 mg/mL en DMEM a cada pocillo y se incubó durante 4 h. Se
eliminó el medio de MTT y se añadieron 200 µl de DMSO para disolver el formazán formado. El
 Las densidades ópticas (DO) se midieron con un espectrofotómetro Varioskan Flash (Thermo,
Waltham, MA, USA) a 570 nm [39].

5. Conclusiones
En conclusión, hemos demostrado que Cecropia telenitida puede ensamblar triterpenos
isobáricos, isómeros posicionales o epiméricos pentacíclicos. Los andamios de ursano u oleanano
con el mismo patrón de oxigenación son siempre compartidos por los PTs en C. telenitida, como
se demuestra en su ruta biosintética. Dado que Cecropia telenitida ha sido utilizada en la medicina
tradicional por las comunidades locales, creemos que esta información puede ser útil para explicar
cómo un grupo de moléculas que comparten un andamiaje estrechamente relacionado puede
proporcionar eficacia medicinal.
Como se observa en el ensayo de viabilidad, una fracción de PTs comparada con una pura
evaluada en condiciones y concentraciones similares disminuye la toxicidad potencial. El
panorama normativo en todo el mundo plantea un debate relevante en relación con la
identificación de los componentes tóxicos de los suplementos dietéticos botánicos, y la principal
preocupación se centra principalmente en demostrar la seguridad. Varias décadas de uso humano
tradicional con control químico y toxicidad in vitro sobre los marcadores bioactivos constituyen
los primeros pasos de una larga pero prometedora investigación con esta planta. Estamos
convencidos de que la fitomedicina es un tipo de medicación fiable y segura, pero siempre
mediante un suplemento nutricional o producto fitoterapéutico multicomponente y químicamente
controlado.

Materiales complementarios: Los siguientes están disponibles en línea. Datos de RMN.

Contribuciones de los autores: G.M., A.M.J. y A.J.P. en la conceptualización, diseño y supervisión de
todo el trabajo científico y experimental y en la redacción del manuscrito; M.Y.C. y E.G. apoyaron en la
caracterización espectroscópica de las moléculas y redactaron el manuscrito; G.G., L.M.V., y D.G.-D.
llevaron a cabo todos los experimentos y la metodología, y N.B. supervisó todos los resultados relativos al
ensayo de viabilidad, incluyendo el procesamiento de datos, el análisis y redactó el manuscrito; G.G.
contribuyó a la redacción del manuscrito. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del
manuscrito.
Financiación:
COL0099642-891; Esteel trabajo
Banco defuela apoyado
Repúblicapor las siguientes
(2018) beca 4.181becas: la Universidad
de la Fundación para laIcesi (2018) de
promoción beca
la
Investigación y la Tecnología
y la beca 430-2020 (Cod. 211784467730) del Ministerio de Ciencia, Tecnología y
Innovación (MinCiencias).
Declaración de la Junta de Revisión Institucional: No procede.
Declaración de consentimiento informado: No procede.
Declaración de disponibilidad de datos: No aplicable.
Agradecimientos: Todos los autores desean reconocer y agradecer al Herbario de la Universidad Icesi por
la ayuda en el muestreo de material y la comparación de vales.
Conflictos de intereses: Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Disponibilidad de muestras: No disponible.
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