La microscopía virtual es un sistema que contempla:

• La observación microscópica de un preparado histológico. Generalmente se

emplea un microscopio automatizado para recorrer el preparado y facilitar la
operación.

•Las imágenes son de muy alta resolución. La captura se realiza a diferentes

aumentos y se obtienen varias imágenes que luego son ensambladas mediante
programas de computación para formar lo que se conoce como una mega-imagen,
reconstruida a partir de imágenes seriadas (158). Puede ser de una imagen
completa o solo una parte de ella.

La microscopía virtual se utiliza notablemente en el diagnóstico patológico a

distancia y otras aplicaciones derivadas (24, 25, 159, 160, 161). Muchas
universidades y otras instituciones de diversos países poseen sitios web con
microscopios virtuales (162, 163, 164, 165).

Figura 7-7.-Una vez digitalizada la muestra A mediante un microscopio y

almacenada en la computadora B es enviada al servidor C. Generalmente se
realiza el escaneado o digitalización a varios aumentos, en este caso se realiza a
20x y 40x. Las imágenes son catalogadas y almacenadas mediante el uso de
programas adecuados que permiten al usuario acceder a la base de datos D y
visualizar la micrografía en el monitor E de su computadora y así discutir con los
colegas. Tomado de Teodorovica I y col. (161).

En el microscopio óptico la muestra es iluminada mediante luz visible. Esto

significa que existe un foco de luz apuntando hacia la muestra. Esa misma luz es
conducida a través del objetivo y del ocular hasta llegar a formar la imagen en el
ojo del observador. Este es el tipo de microscopio más habitual pero su resolución
está limitada por la difracción de la luz. El aumento máximo que se puede obtener
con este tipo de microscopio alcanza alrededor de 1500x.

2. clases de microscopia

microscopio de luz polarizada, microscopio de fluorescencia y microscopio

confocal.

Microscopio electrónico de transmisión (MET)

La principal característica del microscopio electrónico de transmisión es que se

utilizan los electrones que atraviesan la muestra.
En primer lugar los electrones son conducidos hacia la muestra mediante las
lentes electromagnéticas. Cuando los electrones impactan contra la muestra,
algunos de ellos consiguen atravesarla y otros son dispersados. Los electrones
que pueden pasar al otro lado de la muestra son capturados por un detector dando
lugar así a una imagen.
La cantidad de electrones que atraviesa la muestra sin desviarse varía en función
de las características internas de la muestra. Dicho de otro modo, hay partes de la
muestra que presentan más transparencia a los electrones que otras. Esto da
lugar a zonas más oscuras (menos electrones atraviesan la muestra y llegan al
detector) y zonas más claras (más electrones atraviesan la muestra y llegan al
detector).
Para utilizar esta técnica es necesario preparar la muestra para que sea muy
delgada (espesor inferior a 2000 ángstroms). De lo contrario, demasiado espesor
impide que los electrones puedan atravesarla.

Microscopio electrónico de barrido (MEB)

En el microscopio electrónico de barrido también es necesario que los electrones

impacten contra la muestra. En este caso, los electrones no iluminan toda la
muestra simultáneamente, sino que se hace un escaneado recorriendo los
distintos puntos de la muestra.
Cuando los electrones impactan con la muestra estos pierden parte de su energía
debido a distintas interacciones. Parte de su energía inicial se transforma en calor
o en emisiones de rayos X. Además, se produce también la emisión de electrones
que se desprenden de la superficie de la muestra. Estos electrones se conocen
como electrones secundarios.

El proceso histológico comienza con la obtención del tejido objeto de estudio. En

el caso de los tejidos vegetales directamente se toman muestras de los distintos
órganos que componen el cuerpo de la planta, mientras que para los tejidos animales
podemos optar por dos opciones: coger una porción del tejido u órgano y procesarla o
procesar primero el animal completo y luego extraer la muestra que nos interese. En
cualquier caso las muestras son habitualmente fijadas con unas soluciones líquidas
denominadas fijadores, las cuales se usan para mantener las estructuras celulares y
moleculares inalterables durante el procesamiento posterior y con una organización lo
más parecida posible a como se encontraban en la muestra viva. También podemos
fijar las moléculas de los tejidos por congelación rápida. Fijar un tejido es como hacer
una fotografía de dicho tejido, su estructura se mantendrá hasta su observación. La
fijación por congelación se emplea cuando la fijación química o los procesos
histológicos posteriores alteran las características de la muestra que queremos
estudiar, por ejemplo una molécula sensible a dichos tratamientos.

Normalmente, tras la fijación se procede a incluir el tejido para posteriormente

obtener secciones. Cuanto más delgada queramos que sea nuestra sección más
tenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se consigue embebiendo el tejido con
sustancias líquidas que posteriormente polimerizarán (resinas) o se volverán
consistentes (ceras). También se puede conseguir el mismo efecto mediante
congelación rápida. Cortes más gruesos de 40 µm se pueden cortar sin necesidad de
inclusión usando el vibratomo o microtomos de congelación. Los medios de inclusión
no son normalmente hidrosolubles por lo que tendremos que sustituir el agua de los
tejidos por solventes orgánicos liposolubles y posteriormente sustituirlos por el medio
de inclusión.

Tras la inclusión o la congelación se procede a cortar los tejidos, es decir, obtener

secciones. Existen diferentes aparatos de corte que permiten conseguir secciones de
distinto grosor: ultrafinas (del orden de nm), semifinas (de 0.5 a 2 µm), finas (entre
unas 3 y 10 µm) y gruesas (mayores a 10 µm). Habitualmente las secciones se
procesan para poder observarlas y estudiarlas, aunque ciertos tipos de microscopía,
por ejemplo con contraste de fase, permiten observar secciones de tejidos sin
procesar. Normalmente las secciones se tiñen con colorantes que son hidrosolubles,
por lo que hay que eliminar el medio de inclusión para que los colorantes pueden
unirse al tejido. Las secciones ultrafinas (observadas con el microscopio electrónico) o
semifinas (observadas con el microscopio óptico) se pueden contrastar con metales
pesados o con colorantes, respectivamente, sin necesidad de eliminar el medio de
inclusión.

Los tejidos procesados se observan con los microscopios. Existen dos tipos

básicos de microscopios: óptico y electrónico. Los primeros ofrecen una gran
versatilidad en cuanto a modos de observar los tejidos: campo claro, fluorescencia,
contraste de fase, polarización o contraste de interferencia diferencial, mientras que los
segundos permiten un gran poder de resolución, pudiéndose observar características
ultraestructurales como membranas celulares o incluso complejos moleculares.
 Como dijimos al comienzo existen múltiples variaciones sobre este esquema
general de procesamiento histológico. Por ejemplo, se pueden observar tejidos con el
microscopio electrónico de barrido sin necesidad de incluir ni cortar, pero sólo
observaremos superficies. En las siguientes páginas veremos con cierto detalle
algunas de las técnicas más empleadas para la observación de los tejidos.

METODO DE TINCION HEMATOXILINA-EOSINA: Método de laboratorio común en el que

se usan dos tintes llamados hematoxilina y eosina para observar mejor las diferentes partes de la
célula al microscopio. La hematoxilina tiñe de violeta azulado intenso los ribosomas, la
cromatina (material genético) dentro del núcleo y otras estructuras. La eosina tiñe de rosa
anaranjado o rojizo el citoplasma, la pared celular, el colágeno, el tejido conjuntivo y otras
estructuras que rodean y sostienen la célula. La tinción con hematoxilina y eosina ayuda a
identificar diferentes tipos de células y tejidos, y a obtener información importante sobre las
características, la forma y la estructura celular de una muestra de tejido. Se usa para el
diagnóstico de enfermedades como el cáncer. También se llama tinción H y E.

TINCION TRICOMICO DE MASSON: Como su nombre indica esta tinción emplea tres
colorantes. Son la hematoxilina, la fucsina y el verde luz. Esta tinción es muy útil para poner de
manifiesto las fibras de colágeno, y el conectivo en general, en comparación células musculares
o epitelios. Se emplea mucho en la diagnosis de procesos tumorales. Hay muchas variantes de
esta tinción adaptadas a las necesidades particulares de cada laboratorio.

La tinción de PAS (ácido periódico de Schiff) es uno de los métodos químicos más
utilizados en histología. En la tinción de PAS el material se trata con ácido periódico, y
es durante este proceso, que los 1,2-glicoles son oxidados a grupos aldehído. Los
aldehídos del reactivo de Schiff producen un color rojo brillante. La tinción de PAS
produce una reacción de color específico con polisacáridos no sustituidos,
mucopolisacáridos neutros, muco-y glicoproteínas, glico-y fosfolípidos. Combinando la
tinción de PAS con azul alcián, a un pH de 2,5 para la solución de azul álcian, permite la
identificación adicional de mucosustancias ácidas (glicosaminoglicanos). A un pH 1,0 se
tiñen las mucosustancias sulfatadas. La tinción de PAS se utiliza para cortes de parafina
y frotis.

Resorcina-fucsina: utiliza solución de resorcina fucsina, cloruro férrico, alcohol

95%, ácido clorhídrico. Resultados: fibras elásticas (azul negruzco), núcleos (azul
pálido), fibras colágenas (rosa o rojo). Ésta técnica es específica para fibras elásticas e
inespecíficamente tiñe fibras colágenas. La fucsina (también llamada Violeta Ácida 191
y C.I. 426851) es un colorante acídico magenta cuya fórmula química es
C20H17N3Na2O9S3. La fucsina se utiliza para decir que es una comida basura,
refiriéndose a friturilla y demás, inventada por las hermanas Gómez Lopez de Utrera.
Llamadas María Dolores, Isabel y Ana. histología, en las tinciones de Van Gieson,
de Gram -2 y en el Tricrómico de Mallory3. Este método se utiliza frecuentemente en
secciones de tejidos animales para distinguir entre el músculo y el colágeno.