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NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
Departamento de Formación Básica
Disciplinaria
Academia de Bioquímica Médica I
MANUAL DE LABORATORIO
DE
BIOQUÍMICA MÉDICA I
SEMESTRE: ENERO-JUNIO
C I U D A D D E M É X I C O
E n e r o d e 2 0 1 7
PROFESORES
LABORATORIO:
LABORATORIO:
LABORATORIO:
Vo. Bo.
No. PRÁCTICA FECHA
PROFESOR (A)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
PROFESORES DE LA ACADEMIA
Alfredo Montiel Márquez
Argentina Hernández Ramos
Arturo Díaz Martínez
Carlos Castañeda González
Cristina López Gloria
Elizabeth Huerta García
Eunice Dalet Farfán García
Feliciano Tamay Cach
Francisco Javier Castañeda Ibarra
Jessica Elena Mendieta Wejebe
José Guadalupe Trujillo Ferrara
Juan Guillermo Ordorica Vargas
Julio César Quintana Pérez
Leticia Araceli Ramírez Durán
Luz María Chirino Castillo
María De La Luz Velázquez Monroy
Miguel Ángel Ordorica Vargas
Mónica Ordorica Morales
Mónica Yosefit Hernández Hinojosa
Reyna Elizabeth Barbosa Cabrera
Sandra Gissela Márquez Ramírez
MISIÓN
La Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional es una institución de educación médica,
pública, laica y gratuita, con un legado histórico identificado con las necesidades de salud de la población
más desprotegida; cuenta con una planta de destacados profesores, instalaciones físicas y campos clínicos,
que garantizan una sólida formación médica. Forma médicos generales de alta calidad, creativos y eficientes;
con compromiso social, humanitario, de equidad, ético, ecológico y crítico, tanto en el sector público como
en el privado, contribuyendo a mejorar las condiciones de salud y de desarrollo social de la población.
Realiza investigación científica, genera y difunde el conocimiento y fomenta la educación médica continua y
el posgrado. Apoya al Sistema Nacional de Salud y participa en el desarrollo científico, tecnológico y social
del país.
VISIÓN
La Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional, mantendrá su carácter de institución
pública de educación médica con sólidas bases en el conocimiento científico y tecnológico, en constante
actualización e innovación, en un marco de calidad, equidad y servicio. Incrementará desarrollo de la
investigación científica, el posgrado y la educación médica continua, manteniendo una vinculación con los
procesos formativos de los profesionales de la salud de alto nivel, para destacar dentro de las Escuelas y
Facultades de Medicina del país por la formación de médicos generales de alta calidad que conforme al
panorama epidemiológico sean competentes para atender los problemas de salud y la emergencia de nuevas
patologías, básicamente en el primer nivel de atención, contribuyendo así a mejorar la salud y el desarrollo
social de la población en constante interacción con todos los sectores de la sociedad. Continuará participando
en la rectoría de la educación médica en el país, en el desarrollo científico y reafirmando su compromiso con
la población más desprotegida, guiada siempre por un desarrollo basado en la calidad humana, la ética y la
excelencia académica.
CALENDARIO DE ACTIVIDADES
CURSO DE BIOQUÍMICA MÉDICA I
SEGUNDO SEMESTRE 2016-2017 (17-2)
ENERO-JUNIO 2017
FECHA DE INICIO: Lunes, 30 de enero de 2017
FECHA DE TERMINACIÓN: Viernes, 23 de junio de 2017
EXÁMENES
Primer Examen Parcial: Viernes, 10 de marzo de 2017
Temas de teoría: 1. Composición Química del Organismo Humano
2. Agua, Soluciones, Ácidos, Bases, pH y Soluciones Reguladoras
3. Estructura y Función de Proteínas
Prácticas de laboratorio: 1. Introducción 13 al 17 de febrero de 2017
2. Soluciones 20 al 24 de febrero de 2017
3. Electrólitos y pH 27 de febrero al 3 de marzo de 2017
Segundo Examen Parcial: Martes, 2 de mayo de 2017
Temas de teoría: 4. Termodinámica, Catálisis y Enzimas
5. Estructura, Función y Metabolismo de Glúcidos
Prácticas de Laboratorio: 4. Soluciones reguladoras 13 al 17 de marzo de 2017
5. Proteínas 27 al 31 de marzo de 2017
6. Cinética Química 3 al 7 de abril de 2017
7. Cinética Enzimática 17 al 21 de abril de 2017
Tercer Examen Parcial: Viernes, 16 de junio de 2017
Temas de teoría: 6. Bioenergética y Ciclo del ácido Cítrico
7. Estructura Función y Metabolismo de Lípidos.
8. Estructura y Función de Ácidos Nucleicos y Genética Molecular.
Prácticas de Laboratorio: 8. Glúcidos 8 y 16 al 19 de mayo de 2017
9. Oxidaciones Biológicas 22 al 26 de mayo de 2017
10. Lípidos 29 de mayo al 2 de junio de 2017
11. Ácidos Nucleicos 5 al 9 de junio de 2017
Examen Extraordinario: Jueves, 22 de junio de 2017
Temas: Todo el curso
Examen a Título de Suficiencia: Viernes, 30 de junio de 2017
Temas: Todo el curso
SIMBOLOS DE SEGURIDAD
FLAMABLE VENENO
EXPLOSIVO RADIOACTIVO
CORROSIVO IRRITANTE
DAÑO AMBIENTAL
VENENO
ÍNDICE
No. Páginas
1. INTRODUCCIÓN……………………………………... 1
2. SOLUCIONES…………………………………………. 8
3. ELECTRÓLITOS y pH……………………………...... 14
4. SOLUCIONES REGULADORAS………………......... 17
5. PROTEÍNAS…………………………………………… 21
6. CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS………………. 30
7. CINÉTICA ENZIMÁTICA…………………………… 39
8. GLÚCIDOS…………………………………………….. 46
9. OXIDACIONES BIOLÓGICAS……………………… 53
10. LÍPIDOS………………………………………………... 59
11. ÁCIDOS NUCLEICOS………………………………... 64
DEPTO. DE FORMACIÓN BÁSICA DISCIPLINARIA ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA, IPN
PRÁCTICA No. 1
INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO
Se revisarán conceptos y procedimientos de importancia para el trabajo en el laboratorio. El alumno deberá
previamente haber leído y sujetarse al Reglamento de la Academia de Bioquímica I.
Las actividades de laboratorio constituyen una parte importante del aprendizaje de la materia de
Bioquímica Médica I, complementando las actividades de la materia impartidas en el aula.
Es obligación del alumno la asistencia puntual, así como participar de forma activa, obtener resultados de
los experimentos y entregar el reporte del mismo.
Es obligación del alumno registrar los resultados de cada experimento que obtiene durante el desarrollo
de cada práctica y de la sección de “Evidencias de aprendizaje”, siendo este último apoyo
complementario de los resultados.
Será de suma importancia cumplir de forma obligatoria con las medidas de seguridad, comportamiento,
uniforme y accesorios como: guantes, anteojos de protección o caretas transparentes, cubre bocas y bata larga.
a. Antes de entrar al laboratorio, todos los alumnos deberán portar, debidamente abotonada la bata de
laboratorio y tener listo su material de trabajo.
b. Cuando el profesor lo indique, los alumnos colocarán su mochila en el lugar que les sea asignado.
c. Siguiendo las instrucciones de su profesor, localizar la mesa de trabajo de su equipo, dirigirse a ella e
inmediatamente antes de realizar cualquier actividad, deberán colocarse los gogles y guantes de forma
obligatoria. No podrán permanecer durante la sesión del laboratorio si no cumplen con este requisito.
d. En la mesa de trabajo, localizar la toma de corriente, desagües, tuberías y sitios donde puede trabajar.
e. Observar y ubicar la mesa de trabajo con respecto a la campana de extracción, regadera, extintores, zonas
de seguridad y rutas de evacuación.
f. Identificar el uso de cada una de las tuberías que encuentre en la mesa de trabajo y marcarlas con masking
tape. Esperar a que su profesor confirme que el etiquetado es correcto.
Evidencias de aprendizaje
1. Ilustrar la mesa de trabajo señalando la posición de las tomas de corriente, desagües y válvulas de
flujo.
2. Ilustrar la distribución del laboratorio e indique las zonas de seguridad, posición del equipo de
seguridad y la ruta de evacuación desde la mesa.
a) Localizar en la charola el vale de resguardo del material de laboratorio (documento que enlista el
material para realizar cada práctica) seguidamente revisar cuidadosamente cada una de las piezas,
indicando en el vale cualquier defecto en el material. Bajo ninguna circunstancia se deberá desplazar la
charola de la mesa de trabajo a ningún otro sitio.
b) Etiquetar con masking tape cada pieza que lo identifique. Reunir en la charola el material que desconozca y
preguntar a su Profesor. Para esta Práctica y las posteriores, favor avisar al Profesor o Profesores para
para que le revisen el ejercicio o experimento, en caso de no avisar y se desecha el ejercicio o
experimento, no se podrá incluir en el Reporte de Laboratorio.
c) Al terminar de revisar todo el material, completar los datos solicitados en el vale, (fecha, grupo, equipo,
responsable, etc.) y entregarlo al personal técnico de laboratorio. En las siguientes prácticas, el vale se
entregará al inicio de cada sesión con tolerancia de 10 minutos.
d) Al terminar cada práctica el equipo tiene la obligación de ordenar el material limpio dentro de la charola,
limpiar la mesa y solicitar al personal técnico que tendrá que revisar y levantar el material de su mesa de
trabajo, quienes les tendrán que devolver el vale que se entregó al inicio de la práctica.
Evidencias de aprendizaje
Reóforos Cristalizador
Tubos para centrífuga clínica Tubos Falcón
EJERCICIO 3. MANEJO DEL MECHERO.
b) Conectar el tubo de látex del mechero a la llave de gas, la que debe estar completamente cerrada, con la manija
en posición transversal respecto de la salida del gas. No olvidar que la tubería de gas es de color amarillo.
c) Verificar que el tornillo de control de flujo de gas esté abierto más o menos a la mitad de su capacidad
total. El flujo de gas se puede disminuir girando el tornillo en el sentido de las manecillas del reloj y
aumentar en sentido contrario.
d) Encender el mechero aproximando la flama de un cerillo o encendedor al borde de la parte superior del
mechero e inmediatamente abrir la llave de gas, lo cual debe hacerse lentamente, avanzándola hasta que
esté aproximadamente a 45 grados con el tubo del gas. Tener cuidado de no acercar su rostro, pelo u
objetos inflamables al mechero al momento de encender, ni cuando esté encendido. Al usar el mechero no
deberá portar guantes clínicos hechos de látex o polietileno, tener cuidado, ya que son inflamables.
e) Ajustar la cantidad de aire que entra, usando el arillo de control de flujo de aire, hasta que la flama tenga
una zona central de color azul claro rodeada de otra de color azul oscuro o violeta. La parte más caliente
se encuentra en la punta de la zona interna. Cuando la combustión es incompleta, por falta de oxígeno, la
flama presenta color amarillo.
Evidencias de aprendizaje
1) En el esquema siguiente, indicar el tipo de mechero, así como las partes que se indican.
1
a
c 3
b
a) Agregar a un tubo de ensayo agua de la llave hasta un 20% de su capacidad y sujetarlo con pinzas
para tubo de ensayo.
c) Colocar el tubo sobre la flama del mechero, inclinar aproximadamente a 70 oC. Nunca calentar un
tubo de ensayo en el fondo o en posición vertical debido a que se puede proyectar su contenido.
d) Mover el tubo cuidadosamente casi sobre la flama de arriba hacia abajo, para que el líquido se
caliente de manera uniforme.
e) Durante el calentamiento dirigir la boca del tubo hacia un lugar donde no se encuentre ninguna
persona o material que se pueda dañar.
f) No observar de ninguna manera directamente la boca de un tubo de ensayo que se está calentando,
aunque esté fuera de la flama del mechero.
h) PROHIBIDO calentar tubos de ensayo con solventes orgánicos directamente a la flama del
mechero. Hacerlo siempre en baño María.
Evidencias de aprendizaje
a) Identificar y reunir el siguiente material: soporte universal, anillo de hierro, rejilla de asbesto, mechero de
Fischer o Bunsen y un vaso de precipitados de 600 mL.
b) Ensamblar el anillo en el soporte a la altura adecuada para que la parte más caliente de la flama del
mechero quede a nivel del anillo. Colocar la rejilla de asbesto sobre el anillo.
c) Llenar el vaso con agua de la llave a la mitad y colocarlo sobre la rejilla. Agregar pequeños trozos de
papel en el vaso con agua a modo de “cuerpos de ebullición”.
Evidencias de aprendizaje
a) Usar siempre la pre-pipeta, nunca pipetear con la boca para manejar con seguridad los reactivos líquidos.
b) Al abrir un frasco de reactivo, colocar el tapón sobre la mesa en posición invertida, para evitar
contaminación. Vaciar la cantidad necesaria en un vaso de precipitados y de ahí usar el reactivo.
c) Para extraer el líquido utilizar una pipeta o un gotero limpio. Nunca vaciar reactivos directamente del
frasco para evitar escurrimiento.
d) Usar una pipeta de 10 mL, para transferir 5 mL de agua de un vaso de precipitados a un tubo de ensayo en
su mesa y en la campana de extracción. Repetir hasta que pueda realizarlo con seguridad.
Evidencias de aprendizaje
2) Utilizar las técnicas que se aprendió para medir los volúmenes de los utensilios que le solicite su
profesor.
b) Agregar en el tubo 1 la cantidad de 2.5 mL de agua. En el tubo 2 la cantidad de 1.25 mL de agua. En tanto
que en el tubo tres deposite 8 mL de agua y en el tubo 4, deposite 0.6 mL de agua.
c) Utilizar para cada tubo de ensayo una pipeta de capacidad adecuada. Repetir este ejercicio hasta que pueda
realizarlo con seguridad y precisión.
Evidencias de aprendizaje
2. Describir que pipetas utilizó para cada uno de los volúmenes indicados.
a) Reunir el material siguiente: Soporte universal, pinza para bureta (Lincoln), bureta, matraz
Erlenmeyer.
b) Instalar la pinza para bureta sobre el soporte a una altura conveniente para colocar adecuadamente la
bureta.
c) Armar la bureta colocando la llave del lado derecho de la escala, la cual debe quedar
correctamente orientada (escala de 0 arriba y escala de 25 abajo).
d) Sujetar la bureta con las pinzas teniendo cuidado que este bien sujeta, con la escala hacia el
observador y a la altura adecuada por arriba del matraz Erlenmeyer.
e) Emplear siempre un vaso de precipitados de 100 mL para llenar la bureta, teniendo cuidado que la
llave se encuentre cerrada. Como precaución, colocar un vaso de precipitados debajo de la bureta.
f) Para “purgar” la bureta abrir completamente la llave para que el líquido salga rápidamente y pueda
arrastrar las burbujas de aire. Posteriormente, aforar al volumen total y colocar el matraz Erlenmeyer.
g) Abrir la llave lentamente y dejar salir el líquido (agua) de la bureta en cantidades fijas de: 1 mL, 5
mL, 6 mL, 10 mL hasta 25 mL, agitando constantemente el matraz Erlenmeyer. Aprender a leer con
precisión la escala de la bureta. Manejar con soltura y seguridad la llave de la bureta y el matraz.
Evidencias de aprendizaje
a) Preparar un sobre de papel encerado, el cual será proporcionado por su Profesor de Laboratorio. Escribir
en el sobre el nombre y cantidad de reactivo que se le asignó, número de equipo y grupo.
b) Encender la balanza y esperar a que se estabilice la lectura. Colocar el sobre en el plato de la balanza.
Cuando se estabilice, presione el botón de tarar, para llevarlo a cero.
c) Abrir el recipiente del reactivo y colocar la tapa sobre la mesa, boca arriba, para evitar la contaminación.
d) Con una espátula retirar el reactivo del recipiente y pesar la cantidad de NaCl (cloruro de sodio)
depositándolo en el sobre. Si se rebasa la cantidad deseada, regresar el exceso de reactivo al respectivo
recipiente usando la espátula. Nunca regresar al recipiente original un reactivo que caiga fuera del sobre o
por encima de la mesa.
e) Al terminar de pesar la cantidad deseada, cerrar el sobre con cinta masking tape y conservar para utilizar
en la siguiente práctica.
f) Cerrar inmediatamente el frasco de reactivo para evitar que se hidrate o contamine. Asegurarse que la
mesa y la balanza queden limpias.
Evidencias de aprendizaje
1) Ilustrar la balanza, señalando la posición del botón de encendido-apagado y del botón de tara.
b) Añadir a dos tubos Falcon de capacidad de 15 mL la cantidad de 5 mL de agua de la llave como marca la
escala del propio tubo.
c) Colocar en dos frascos gerber cada tubo y mantenerlos a la mano cuando se requiera en la balanza.
d) Ajustar las pesas de medición en la posición de cero en una balanza de dos platillos. Asegurarse de que la
aguja o fiel de la balanza esté en posición cero. Si no lo está, girar cuidadosamente las pesas de ajuste en
el sentido que sea necesario hasta lograr el equilibrio.
e) Retirar los tubos de los frascos gerber, colocar cada frasco en cada platillo, cuidando que el más pesado
quede del lado izquierdo.
f) Deslizar las pesas de medición de la balanza hasta lograr que el fiel vuelva a la posición de equilibrio,
posteriormente colocar los tubos nuevamente en cada frasco y observar que se encuentren balanceados.
g) De no estar en equilibrio, use una pipeta y añadir agua de la llave al tubo más ligero hasta lograr que el
fiel de la balanza regrese al equilibrio. Al equilibrar los tubos ya puede centrifugar.
Evidencias de aprendizaje
1) Ilustrar la balanza de platillos señalando la posición de las pesas de ajuste y las de medición.
PRÁCTICA No. 2
SOLUCIONES
Una solución es un sistema homogéneo, formado por dos o más sustancias químicas. Está formada
por un solvente en el cual se dispersan uno ó más solutos. Cuando ambos son líquidos miscibles, se
acostumbra nombrar solvente al que se encuentra en mayor cantidad. En las soluciones acuosas siempre se
considera el agua como solvente.
La relación que existe entre las cantidades de soluto y solvente en una solución se llama
concentración.
Existen varias formas de expresar la concentración de una solución. Las de uso más frecuente son:
MOLARIDAD (M). Número de moles de soluto en un litro de solución. Un mol se define como el
peso molecular en gramos de una sustancia, o sea la masa de una sustancia que contiene el mismo
número de átomos o moléculas que hay en 12 g de 12C. (6.022 x 1023 o Número de Avogadro).
MOLALIDAD (m). Número de moles de soluto en 1000 g de solvente.
NORMALIDAD (N). Número de equivalentes químicos de soluto en un litro de solución. Si
dividimos los gramos de un mol entre la valencia del compuesto se obtiene el peso equivalente
químico.
OSMOLARIDAD (OsM): Número de osmoles en un litro de solución. Un osmol es la cantidad de
soluto en gramos que proporciona el número de Avogadro de partículas en solución.
PORCENTUAL (%). Expresa el porcentaje de soluto en una solución. Existen diferentes tipos:
Porciento en peso (% p/p). Número de gramos de soluto en 100 g de solución. Esta es la forma
como se expresa la pureza de los reactivos químicos.
Porciento en volumen (% v/v). Número de mililitros de soluto en 100 mL de solución.
Porciento en peso-volumen (% p/v). Número de gramos de soluto en 100 mL de solución. Si no se
indica expresamente la relación de porcentaje, esta es la concentración porcentual que se debe
usar.
FRACCIÓN MOLAR (xi). Número de moles de una sustancia en una solución entre la suma de
los moles de todos los componentes de la misma.
DIÁLISIS
Ejemplos de membranas dialíticas son el celofán y el colodión. La base del tratamiento de pacientes
renales descompensados es la diálisis, la cual es útil también para eliminar sustancias nitrogenadas,
medicamentos en exceso o exceso de acidez en sangre. Médicamente se refieren diversos tipos de diálisis de
los cuales mencionaremos la hemodiálisis y la diálisis peritoneal.
Evidencia de aprendizaje:
1) Describa detalladamente los cálculos que hizo para conocer la cantidad de agua destilada que es
necesario añadir al NaCl del sobre para que la solución sea al 5%.
2) Al considerar que la solución de NaCl es al 5%, calcule las concentraciones siguientes y detalle los
cálculos correspondientes. Molaridad, Normalidad, mEq/mL, mg/mL, moles%, Osmolaridad.
EXPERIMENTO 2. DIÁLISIS
a) Humedecer por inmersión en agua destilada durante 10 minutos el tubo de colodión o celofán de
aproximadamente 6 cm de largo por 2.5 cm de diámetro.
b) En el tiempo de 5 minutos, preparar una solución de NaCl al 5% que le indique su profesor,
considerar la pureza del reactivo al 100%.
c) Preparar dos tubos de ensayo limpios. Añadir en uno de ellos 2 mL de NaCl al 5% y 5 gotas de
AgNO3 (Nitrato de Plata). Al otro tubo agregar 2 mL de solución de almidón al 1% y 2 gotas de
solución de lugol. Agitar y observar la reacción que ocurre en cada tubo. Etiquetar como testigo de
cloruros y testigo de almidón respectivamente.
d) Pasado los 10 minutos, cerrar un extremo del tubo de colodión con un hilo de algodón para obtener un
saco. Desechar el agua destilada utilizada, enjuagar el vaso y llenar con agua destilada nueva a un
tercio de su volumen.
e) Llenar el saco con una mezcla de 1 mL de solución de NaCl al 5% y 10 mL de solución de almidón al
1%.
f) Cerrar cuidadosamente el otro extremo del saco, enjuagar con agua destilada y sumergir en un vaso de
precipitados con agua destilada, cuidando de no tocar las paredes.
g) Determinar la presencia de almidón y de cloruros en el líquido que rodea al saco del vaso de
precipitados, a tiempo 0 (inmediatamente después de sumergir el saco), 15, 30, 45 y 60 minutos.
Evidencias de aprendizaje:
1) Describir detalladamente los cálculos que hizo para conocer la cantidad de agua destilada que es necesario
añadir al NaCl del sobre para que la solución sea al 5%.
2) Calcular las concentraciones siguientes y detalle los cálculos correspondientes del NaCl al 5%: Molaridad,
Normalidad, mEq/mL, mg/mL, moles%, Osmolaridad.
3) Ilustrar el montaje del experimento.
4) Explicar los resultados de la diálisis.
El osmómetro consiste en un recipiente que contiene una solución de sacarosa 1 M teñida con rojo
neutro conectado a un capilar de polietileno por el cual asciende el nivel del líquido (ver esquema de la
tabla). El recipiente es el cuerpo de una jeringa hipodérmica de 5 mL que presenta dos bandas de hule; la del
extremo inferior permite la fijación de una membrana de celofán humedecido previamente durante 5 minutos
en agua destilada. La banda superior sirve para sellar el orificio de llenado de la cámara. Por la parte
correspondiente al pivote, se le agrega el trocar metálico de un catéter el cual se introduce en el extremo de
un capilar de polietileno. El extremo inferior de la jeringa se sumerge en un vaso de precipitados con agua
destilada. El dispositivo lo instala el personal técnico del laboratorio. Nota: cualquier error en el montaje del
osmómetro se manifestará por salida de solución coloreada del dispositivo.
a) Cuando el Profesor le indique, en el osmómetro marcar el nivel de la solución de sacarosa contenido en el
tubo capilar, el cual será el tiempo cero.
b) Medir cada 15 minutos el nivel ascendido hasta los 90 minutos.
c) Registrar sus resultados en la tabla siguiente:
Tiempo Altura π
min. mm Atm
15
30
45
60
75
90
Evidencias de aprendizaje:
1. Graficar el tiempo en las abscisas (eje x) y la altura en milímetros en las ordenadas (eje y).
2. Calcular la presión osmótica en atmosferas y complete la tabla.
3. ¿Cuándo deberá detenerse el proceso osmótico?
4. ¿Depende sólo de la altura la presión osmótica? Explique.
5. ¿Influye el radio del capilar en la presión osmótica? Explique.
6. ¿La sacarosa y el colorante dializan? Explique.
7. Identificar en el esquema de la tabla de resultados todas las partes del osmómetro.
Prepare 50 mL de solución 0.5 M de CH 3COOH (Ácido Acético) tomando como base los siguientes
datos: El CH3COOH tiene un peso molecular de 60 g/mol, la pureza del reactivo es de 99.7% y la densidad a
20°C es de 1.06 g/mL. Una vez preparada consérvela para utilizarla en el experimento siguiente.
Evidencia de aprendizaje:
1) Describa detalladamente los cálculos que hizo para conocer el volumen de CH3COOH
concentrado que utilizó para preparar los 50 mL de dicha solución. R = _________ mL.
2) Considerando que la solución es 0.5M calcule las concentraciones siguientes detallando los
cálculos:
% (p/v) =
Normalidad =
mmoles/L =
gramos/L =
mEq % =
Osmolaridad =
Evidencia de aprendizaje:
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MÉDICA I
ENERO-JUNIO 2017
= =
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DEPTO. DE FORMACIÓN BÁSICA DISCIPLINARIA ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA, IPN
Llene casi completamente una probeta de 100 mL con agua de la llave y luego espolvoree, con un
aplicador de madera, unos granitos de azul de metileno sobre la superficie del agua y observe que ocurre.
Anote sus observaciones.
A continuación caliente con sus manos la probeta en la parte media y nuevamente observe que ocurre
al agregar calor. Anote sus observaciones. Una vez homogeneizado el colorante, la difusión se ha
efectuado.
Evidencia de aprendizaje:
1) Ilustre el experimento.
2) ¿Es uniforme el descenso del colorante por la columna de agua?
3) ¿Qué sucede al calentar la parte media de la probeta?
4) ¿Qué es disolución, convección y difusión?
PRÁCTICA No. 3
ELECTRÓLITOS y pH
Las sustancias que permiten el paso de la corriente se conocen como electrólitos y a los que no
manifiestan esta propiedad como no electrólitos. A esta capacidad de dar paso a la electricidad se le
conocecomo conductancia, propiedad que se debe a la movilidad de los iones.
Los electrólitos de clasifican en fuertes y débiles según la facilidad con que conducen la corriente
eléctrica.
Los electrólitos fuertes se disocian completamente como las sales minerales, los hidróxidos de
metales alcalinos, y los ácidos fuertes. En los líquidos del organismo encontramos ejemplos de
electrolitos fuertes: NaCl, KCl y CaCl2, entre otros.
Son electrólitos débiles la mayor parte de los compuestos orgánicos como los ácidos láctico, pirúvico,
urea y otros compuestos nitrogenados.
Disueltos en el agua corporal hay ejemplos de compuestos no electrólitos como glucosa y glicerol.
CONDUCTIVIDAD
Evidencias de aprendizaje:
a) Anote las reacciones que se llevan a cabo en cada uno de los electrodos, incluida la del indicador.
b) Ilustre el proceso de la electrólisis del agua.
Lámpara
Fuente
Observe también la intensidad luminosa con relación a la distancia entre los electrodos, sin ponerlos
en contacto.
Repita el experimento usando CH3COOH (Ácido Acético) 0.5M.
Evidencias de aprendizaje:
1) Anote sus resultados valorando por medio de cruces la intensidad luminosa y la variación
observada.
Con base en los cálculos previamente hechos prepare 100 mL del par de soluciones que le indique su
profesor, consérvelas para el siguiente experimento.
De HCl al 37% de pureza y densidad de 1.18 g/mL. De pH = 1.4, 1.7 y 2.0
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MÉDICA I
ENERO-JUNIO 2017
= =
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DEPTO. DE FORMACIÓN BÁSICA DISCIPLINARIA ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA, IPN
De CH3COOH al 99.7% de pureza, densidad de 1.06 g/mL y pKa = 4.74. De pH = 3.07, 3.22 y 3.37
Prepare 50 mL de una dilución 1:10 de cada una de las soluciones asignadas.
Evidencia de aprendizaje:
1) Detalle los cálculos de todas las soluciones indicadas en el experimento.
2) Calcule la concentración y el pH de las diluciones preparadas.
3) Explique porqué se le asignaron ese par de soluciones para preparar.
Determine con papel indicador el pH de cada una de las soluciones que preparó en el experimento
anterior.
A continuación determine el pH potenciométrico de cada una de ellas.
En un matraz Erlenmeyer tome una alícuota de10 mL de cada una de las soluciones preparadas y
titule con NaOH 0.1N y añada 2 gotas de fenolftaleína como indicador.
Evidencia de aprendizaje:
1) Con los datos obtenidos llene la tabla
TITULACIÓN
N teórica pH Gasto de NaOH
Solución Concentración
0.1N mL
Teórico Colorimétrico Potenciométrico Teórico Experimental N real
HCl
HCl 1:10
CH3COOH
CH3COOH 1:10
PRÁCTICA No. 4
SOLUCIONES REGULADORAS
A las soluciones reguladoras se les pueden añadir cantidades relativamente grandes de
ácidos o álcalis sin alterar de manera significativa su pH. Esta acción amortiguadora se debe a la
presencia en la solución de un sistema formado por un ácido o una base débil y su sal
correspondiente.
Si se toma como ejemplo una solución que contenga un ácido débil, al que representaremos por HA y
su sal, representada por BA los hidrogeniones existentes en ella procederán únicamente de las moléculas
ácidas, que se disocian como sigue:
Donde Ka es la constante de disociación del ácido. De esta ecuación se deduce que la concentración
de hidrogeniones es:
La relación entre estas dos constantes es, sin embargo, tan sensiblemente constante en condiciones
ordinarias que podemos afirmar que la concentración de A- es igual a la concentración de la SAL.
Sustituyendo una expresión por otra en la ecuación anterior tenemos:
Ahora bien, si -log [H+] es igual a pH, por analogía podemos decir que –log de K a es igual a pKa por
lo que:
Por otra parte por las leyes de los logaritmos, las expresiones –log de ([Ácido]/[Sal]) y + log de
([Sal]/[Ácido]) son iguales y la segunda puede reemplazar a la primera, de tal modo que hechas todas las
modificaciones la ecuación queda finalmente como sigue:
Esta ecuación se conoce con el nombre de Ecuación de Henderson–Hasselbalch y nos indica que el
pH de una solución que contenga un ácido débil y su sal está determinado por el valor de pK a (constante para
cada ácido) y por el logaritmo del cociente que resulta de dividir la concentración de la sal entre la
concentración del ácido.
Por ejemplo, el valor de la constante de disociación K a del ácido acético es de 1.8 x10-5. El valor de
su pKa es por lo tanto igual a 4.74. Si tenemos una solución reguladora que posea iguales cantidades de
CH3COOH y CH3COONa en concentración 0.1N, el pH de esa solución sería de:
Además de servir para la preparación de soluciones de pH conocido, las soluciones reguladoras tienen
dentro del organismo un papel de importancia capital que es el de evitar que aumente o disminuya de manera
importante la concentración de iones hidrógeno, ya que la vida humana es posible en límites muy estrechos
de pH, es decir, para la sangre arterial un pH de 7.40 y para sangre venosa y líquidos intersticiales 7.35.
Este último es menor por tener mas CO2 y por lo tanto mas H2CO3 producido metabólicamente. Se
sabe que los límites máximos de pH en los que por algunos minutos puede permanecer el organismo sin
sufrir muchas alteraciones son de 7.0 a 7.8. En los líquidos donde existen y actúan al mismo tiempo varios
sistemas amortiguadores, como sucede en la sangre, el ácido o la base que entra es amortiguado por todos los
sistemas presentes de manera proporcional a la eficacia de cada uno de ellos.
La regulación fisicoquímica tiene lugar en todos los medios que contienen reguladores, constituidos
principalmente por ácidos o bases débiles y sus sales. Por ejemplo el de fosfatos H 2PO4-/HPO4= con un pKa2
de 7.2 (o de 6.8 a la temperatura corporal), es el principal amortiguador intracelular.
El principal amortiguador extracelular en la sangre y líquidos intersticiales es el sistema bicarbonato
H2CO3/HCO3- con un pKa de 6.1.
En el interior del eritrocito, además del bicarbonato, el amortiguador de mayor importancia es el de
hemoglobina reducida / oxihemoglobinato (HHb/HbO2). Otros sistemas son los de proteínas y aminoácidos.
Todos estos sistemas funcionan de manera inmediata cuando existen excesos de álcali ó ácido ya que
un cambio del pH afecta la estructura y la actividad de las proteínas, la distribución de otros iones entre las
células y el líquido extracelular, la actividad de hormonas y fármacos, etc.
Comportamiento ácido-base de la glicina. Existen sustancias de mucha importancia en bioquímica
como son los aminoácidos y las proteínas los cuales tienen grupos ácidos y básicos, por lo que actúan como
anfolitos. En ésta práctica se determinarán las curvas de titulación de la glicina con HCl y con NaOH.
La glicina es un aminoácido que tiene un carboxilo cuyo pka se denomina pka1 y un grupo amino cuyo
pka se denomina pka2. Una propiedad conocida de los aminoácidos es el punto isoeléctrico (pI) que es el pH
en que el aminoácido tiene carga neta 0 en solución, y en éste caso se calcula con la siguiente fórmula:
Preparar 50 mL de las soluciones amortiguadoras con los valores de pH que le indicará su profesor (7.0,
7.2, 7.4 y 8.0), emplear KH2PO4 (fosfato diácido de potasio) 0.01 M y Na2HPO4 (fosfato monoácido
disódico) 0.01 M (pKa2 = 7.2).
Preparar 50 mL de las soluciones amortiguadoras con los valores de pH que le indicará su profesor (7.2, 7.4
y 8.0), emplear KH2PO4 0.1 M y Na2HPO4 0.1 M (pKa2 = 7.2).
Medir el pH potenciométrico y colorimétrico de las soluciones anteriores y anotar los resultados en la tabla.
Armar dos dispositivos de titulación (llenar, purgar y aforar), uno será para titular con HCl (ácido clorhídrico)
las soluciones amortiguadoras preparadas previamente y el otro dispositivo será para titular con NaOH
(hidróxido de sodio).
Añadir una alícuota de 10 mL de la solución amortiguadora que preparó en un matraz Erlenmeyer de
250 mL, medir con una pipeta volumétrica de 10 mL. Añadir 5 gotas de azul de timol y titular con HCl
0.1 N hasta observar el cambio de color a rojo. Repetir la titulación para cada solución amortiguadora
preparada por duplicado.
Agregar una alícuota de 10 mL de la solución amortiguadora que preparó en otro matraz Erlenmeyer de
250 mL, medir con una pipeta volumétrica de 10 mL. Añadir 5 gotas de azul de timol y titular con NaOH
0.1 N hasta observar el cambio de color a azul. Repetir la titulación para cada solución amortiguadora
preparada por duplicado.
Evidencias de aprendizaje.
1) Describir detalladamente los cálculos que realizó para cada uno de los pH solicitados.
2) Con los datos obtenidos y las de todo el grupo llenar la tabla siguiente:
pH pH Gasto de Gasto de
Concentración
teórico Colorimétrico Potenciométrico HCl 0.1 N NaOH 0.1 N
7.2 0.01
7.2 0.1
7.4 0.01
7.4 0.1
8.0 0.01
8.0 0.1
3) Explicar la coincidencia o no, entre sus resultados y el cálculo teórico.
4) Explicar los resultados con base en la teoría.
Añadir 30 mL de solución de glicina 0.1 N en un vaso de precipitados de 150 mL, con la ayuda de su
Profesor agregar una barra magnética y colocar sobre una placa de agitación, medir el pH y sin retirar el
electrodo titular con NaOH 0.1 N como se encuentra indicado en la tabla y registrar sus resultados.
Añadir 30 mL de solución de glicina 0.1 N en otro vaso de precipitados de 150 mL, con la ayuda de su
Profesor agregar una barra magnética y colocar sobre el agitador, medir el pH y sin retirar el electrodo
titular con HCl 0.1 N, como se encuentra indicado en la tabla y registrar sus resultados.
Evidencias de aprendizaje:
1) Graficar los valores acumulativos de HCl signo negativo y a los de NaOH signo positivo, en el eje de las
abscisas (X) y el pH en el eje de las ordenadas (Y).
2) Identificar en la gráfica los valores de pK1 y pK2.
3) Calcular el punto isoeléctrico (pI).
PRÁCTICA No. 5
PROTEÍNAS
Su nombre deriva del griego proteios que significa “primordial” o fundamental; contienen en su molécula C,
H, O, N y en ocasiones P y S. El nitrógeno constituye en promedio el 16%. Por hidrólisis dan aminoácidos,
los cuales varían en número, cantidad y posición en cada proteína. La actividad de una proteína depende de
su conformación espacial, por lo que agentes físicos y químicos que alteran los diferentes enlaces son
capaces de anularla. Algunos de los agentes desnaturalizantes más comunes son ácidos o bases, detergentes,
metales pesados, solventes orgánicos, alcaloides, calor, radiaciones ultravioleta, rayos x, ondas ultrasónicas,
sales inorgánicas, sustancias orgánicas como urea, guanidina, agentes reductores, agentes oxidantes, etc. Las
proteínas desnaturalizadas pierden su actividad, modifican su solubilidad y precipitan. Tal como existen en la
naturaleza se denominan proteínas nativas. Las propiedades fisicoquímicas y biológicas características de las
proteínas se deben a los aminoácidos que las constituyen y las reacciones coloridas que se utilizan para su
análisis en realidad detectan la presencia de un aminoácido específico. Muchas de las propiedades químicas
de las proteínas son comunes a varias especies por que contienen el mismo tipo de aminoácidos, por lo que
para caracterizar una proteína es necesario estudiar sus propiedades fisicoquímicas las cuales dependen del
peso molecular, de su carga eléctrica neta y de la conformación que adopte la molécula.
REACCIONES QUÍMICAS.
REACCIÓN DE MILLÓN: Es específica para el grupo fenólico y por lo tanto, la dan positiva todas las
sustancias que poseen esta función, como el fenol, ácido salicílico, timol, tirosina y todas aquellas
proteínas que contengan tirosina.
REACCIÓN DEL BIURET: Todas las moléculas que contengan dos o más uniones peptídicas, por lo
tanto todas las proteínas y péptidos no menores de 3 unidades, dan positiva la reacción del biuret. El
nombre se debe al compuesto biurea (NH2-CO-NH-CO-NH2) el cual da positiva la prueba. Cuando una
proteína o un polipéptido se hacen reaccionar con sulfato CuSO4 en solución alcalina se produce un color
característico púrpura o violeta. El color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los
átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Esta reacción nos sirve para diferenciar las proteínas y
péptidos de los aminoácidos y su utilidad principal es la de seguir el proceso de hidrólisis, la reacción será
negativa cuando la hidrólisis sea completa.
REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS: Las proteínas que contengan los aminoácidos cisteína
y cistina cuando se tratan con álcalis concentrados, desprenden H2S, el cual se puede reconocer por su olor
desagradable y característico, o bien, por la formación de un precipitado negro de PbS al reaccionar con
(CH3COO)2Pb.
REACCIÓN XANTOPROTÉICA: Esta reacción se debe a la formación de nitroderivados aromáticos por
reacción del ácido nítrico sobre grupos aromáticos que poseen algunos aminoácidos como la fenilalanina,
la tirosina y el triptófano. Por lo tanto, la dan positiva todas aquellas proteínas que tengan aminoácidos
aromáticos en su molécula.
REACCIÓN DE LA NINHIDRINA: Es una de las reacciones más sensibles para identificar aminoácidos
en general, ya que detecta una parte de aminoácido en 1 500 000 partes de agua. Aminoácidos y muchas
aminas primarias dan un color violeta característico. La prolina da coloración amarilla. Por su sensibilidad
esta reacción se emplea para valoración cuantitativa de aminoácidos por colorimetría.
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS.
DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS: Cuando la estructura altamente ordenada de una proteína se
somete a la acción de agentes fisicoquímicos desnaturalizantes, queda reducida al llamado polímero
estadístico o cadena de aminoácidos y además pierde toda actividad biológica. Algunos de los agentes
desnaturalizantes más importantes son los metales pesados, los ácidos fuertes y el alcohol.
PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR METALES PESADOS: Las proteínas cuando se encuentran en
solución a pH superiores a su punto isoeléctrico son capaces de reaccionar con diferentes metales pesados
formando los correspondientes proteinatos insolubles. Tomaremos como ejemplo dos proteínas, la
peptona y la gelatina y observaremos su reacción, en forma simultánea frente a los metales pesados: Fe,
Ag, Hg, y Pb.
PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR EFECTO DE ÁCIDOS FUERTES: Los ácidos fuertes son
capaces de desnaturalizar a las proteínas formando productos de desnaturalización insolubles conocidos
como metaproteínas.
PUNTO ISOELÉCTRICO: Las proteínas al igual que los aminoácidos son moléculas anfóteras. Es decir,
pueden reaccionar con ácidos o con álcalis. En medio ácido las proteínas se combinan con los iones hidrógeno
y quedan con carga positiva. En medio alcalino liberan protones y quedan con carga negativa. El pH en el cual
una proteína no posee carga eléctrica neta se denomina punto isoeléctrico, a este pH la proteína presenta su
mínima solubilidad y generalmente precipita, teniendo además una viscosidad máxima.
Evidencias de aprendizaje
1) Escribir la composición del reactivo de Millón y explicar cuál es el mecanismo propuesto para esta
reacción.
2) Ilustrar sus resultados.
Evidencias de aprendizaje
1) ¿Se puede considerar la reacción de Biuret como característica para todas las proteínas? ¿Por qué?
2) Escribir la reacción.
3) Ilustrar sus resultados.
Tubo Soluciones
1 Agua destilada
2 Peptona al 2%
3 Caseína al 2%
4 Gelatina al 2%
5 Albúmina al 2%
Evidencias de aprendizaje
1) Escribir la reacción química que se ha efectuado.
2) ¿Qué sustancias pueden interferir en esta reacción?
3) Ilustrar sus resultados.
6 Albúmina al 2%
Evidencias de aprendizaje
1) Describir el aspecto de la reacción.
2) Escribir la reacción química que se ha efectuado.
3) ¿Qué sustancias dan positiva la reacción de la Ninhidrina, además de las proteínas, péptidos y
aminoácidos?
4) Ilustrar sus resultados.
Evidencias de aprendizaje
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MÉDICA I
ENERO-JUNIO 2017
= =
26
DEPTO. DE FORMACIÓN BÁSICA DISCIPLINARIA ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA, IPN
1) ¿Tiene alguna influencia el pH en el efecto de los metales pesados sobre las proteínas?
2) ¿Tienen todos los metales pesados el mismo efecto precipitante sobre las proteínas?
3) Ilustrar sus resultados.
Añadir a cada tubo 2 mL de CCl 3COOH (Ácido Tricloroácetico) al 5%, estratificando por las paredes
del tubo.
Observar y registrar sus resultados valorando el grado de turbidez de cero a tres cruces en la siguiente
tabla:
Sustancia CCl3COOH
Agua destilada
Peptona al 2%
Caseína al 2%
Gelatina al 2%
Albúmina al 2%
Evidencias de aprendizaje
1) ¿Cómo puede explicar el efecto desnaturalizante del CCl3COOH y en general de cualquier ácido?
2) Ilustrar sus resultados.
Sustancia CH3CH2OH
Agua
Peptona al 2%
Caseína al 2%
Gelatina al 2%
Albúmina al 2%
Evidencias de aprendizaje
1) ¿Observa turbidez en todos los tubos?
2) Ilustrar y describir lo que sucede en cada tubo.
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Agua destilada mL 8.4 7.8 8.8 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4
Ácido acético 1N mL - - - - - - - - 1.6
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MÉDICA I
ENERO-JUNIO 2017
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DEPTO. DE FORMACIÓN BÁSICA DISCIPLINARIA ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA, IPN
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Observación al tiempo cero
Observación a los 15´
Observación a los 30´
pH teórico
Evidencias de aprendizaje
1) Calcule el pH teórico de cada tubo, aplicando la ecuación de Henderson-Hasselbalch y regístrelo en
la tabla.
2) ¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína? Calcule y discuta sus resultados comparando con el teórico.
3) Ilustrar los resultados.
PRÁCTICA No. 6
CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS
De acuerdo con la Ley de Acción de Masas, la velocidad de una reacción química depende de la
concentración de las sustancias que intervienen en la reacción. Esta Ley establece que: “La magnitud de
una reacción es proporcional a la masa activa de las sustancias reaccionantes presentes en ese
momento”. El término masa activa significa la concentración molecular o sea, la cantidad presente por
unidad de volumen. Si reaccionan:
La velocidad V1 con que reaccionan A y B para producir C y D depende de la concentración de cada reactivo
y de la afinidad que tengan para reaccionar entre sí, pero como esto se puede considerar constante, podemos
decir que: V1 = k1[A][B].
Como el cociente de dos constantes es siempre igual a una constante podemos decir que:
Que es la expresión matemática de la Ley de Acción de Masas y keq se conoce como Constante de Equilibrio.
Donde t1/2 es el período de vida media, es decir, el tiempo necesario para que se descomponga la mitad de
una cantidad dada de material reaccionante.
Desde hace muchos años se sabía en forma empírica que la velocidad de muchas reacciones aumenta al
aumentar la temperatura. Arrhenius encontró una relación que expresa matemáticamente la forma como la
temperatura afecta la velocidad de una reacción, la cual está dada por la siguiente ecuación:
La cual indica que el cambio en el logaritmo natural de la constante de velocidad de una reacción es inversamente
proporcional al cuadrado de la temperatura absoluta multiplicada por la constante de los gases. E es la energía de
activación. Actualmente se considera que para que las moléculas puedan reaccionar deben ser primero activadas,
es decir, requieren una cantidad de energía E. Integrando entre límites la ecuación de Arrhenius:
Esto quiere decir que por cada 10°C de aumento la velocidad de la reacción se duplica. En la mayor parte de
las reacciones se observa este aumento bajo ciertas temperaturas límites.
Se sabe que muchas reacciones químicas son afectadas por el pH del medio o el aumento de [H+], sobre todo
aquellas en las que participan ácidos. Actualmente se acepta que las moléculas deben ser activadas antes de
que puedan reaccionar. Aparentemente el pH ácido favorece la ionización y el estado iónico se puede
considerar como un estado activado.
La velocidad de una reacción química frecuentemente es afectada por la presencia de “sustancias extrañas”
que permanecen inalteradas al terminar la reacción. Cualquier sustancia que sea capaz de acelerar una
reacción química y que no sea consumida por ellas, se denomina catalizador y el proceso se conoce con el
nombre de catálisis. La función de un catalizador es disminuir la energía de activación, por lo que las
moléculas son activadas con menor cantidad de energía produciéndose reacciones más rápidas. En un
principio se supuso que los catalizadores actuaban por “presencia”. Es decir, que no intervenían en los
procesos que catalizaban. Sin embargo, actualmente se acepta que el catalizador se combina con el sustrato
formando un complejo intermediario inestable y altamente reactivo. Supongamos la reacción: A + B AB.
Esta reacción en condiciones normales se efectúa muy lentamente pero si se añade un catalizador C
apropiado, tenemos: A + B + C (AC) + B AB + C. Estas reacciones son rápidas y el catalizador
puede ser usado una y otra vez. Estas sustancias pueden ser de naturaleza inorgánica o bien sustancias
orgánicas complejas producidas por las células y son denominadas enzimas. La sacarosa es un disacárido no
reductor, pero al hidrolizarse, cada molécula libera una molécula de glucosa y una de fructosa, ambas
reductoras. Basándose en esto es posible visualizar y cuantificar la hidrólisis de la sacarosa midiendo la
concentración de azúcares reductores con algún reactivo apropiado. Una característica importante entre los
catalizadores inorgánicos y las enzimas es que ambos solo son capaces de acelerar un proceso que ya está en
marcha. Para esta práctica emplearemos como enzima la sacarasa, también conocida como invertasa o
fructofuranosidasa; la cual, es una de las enzimas mejor conocidas y estudiadas. Actúa hidrolizando los
azúcares que contienen fructosa. Así hidroliza la estaquiosa (tetrasacárido), la rafinosa (trisacárido), y
alcanza su máxima velocidad con la sacarosa (disacárido). Se puede medir la hidrólisis observando el cambio
en la rotación óptica o valorando el poder reductor de los productos obtenidos.
Tubo 1 2 3 4 5
Solución
HI mL 5 5 5 5 5
Na2S2O3 (Tiosulfato de Sodio) mL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
0.02N
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DEPTO. DE FORMACIÓN BÁSICA DISCIPLINARIA ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA, IPN
1) Trazar una gráfica con el 1/tiempo en segundos en las ordenadas y la concentración de H+ en las abscisas.
Evidencias de aprendizaje
1) ¿Se puede considerar al H2SO4 como un catalizador? ¿Por qué?
Evidencias de aprendizaje
1) Comparar este experimento con el anterior y explique qué sucede.
PRÁCTICA No. 7
CINÉTICA ENZIMÁTICA
FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
La vida depende de una serie de reacciones químicas cuyo curso y velocidad están determinados por la
presencia de diversos catalizadores orgánicos denominados enzimas: (del griego en = en, zymo = fermento).
La mayor parte de las reacciones biológicas serían cinéticamente insignificantes si no fuera por las enzimas.
Las enzimas desde el punto de vista químico son compuestos que pertenecen al grupo de las proteínas
(aunque algunas solo funcionan asociadas a un grupo no proteico, grupo prostético o coenzima). Debido a su
carácter proteínico, las enzimas son muy sensibles a cualquier cambio físico, químico, o fisicoquímico. Así,
cualquier cambio en la temperatura, en el pH, en la fuerza iónica, la adición de sales, la presencia de agentes
oxidantes o reductores, la presencia de metales pesados, etc., producen modificaciones profundas en su
actividad. En general, cualquier factor que sea capaz de desnaturalizar a las proteínas será capaz de alterar su
actividad.
NATURALEZA QUÍMICA DE LAS ENZIMAS
Estructuralmente todas las enzimas son proteínas simples o complejas. La parte proteínica de las enzimas se
denomina apoenzima, la parte no proteínica puede ser coenzima, si se separa fácilmente de la proteína. Las
coenzimas pueden ser comunes a varias enzimas y no actúan como catalizadores ya que se transforman en la
reacción que catalizan y requieren de otra enzima para regenerar su actividad. La mayor parte de las
coenzimas están relacionadas con las vitaminas. Si la parte no proteínica se encuentra firmemente unida a la
proteína por enlace covalente y no es posible separarla por diálisis, se denomina grupo prostético. Hay
varios factores que afectan la velocidad de una reacción catalizada por enzimas. Algunos de ellos son:
temperatura, pH, concentración de sustrato, concentración de enzima e inhibidores.
Temperatura. La velocidad de las reacciones químicas aumenta al incrementar la temperatura, originando
aumento en la energía cinética y en las velocidades medias de las moléculas con el resultado de una mayor
probabilidad de colisiones efectivas. Sin embargo, las enzimas se inactivan y desnaturalizan a temperaturas
elevadas. La mayor parte de las enzimas tienen una temperatura óptima, en la cual catalizan con una
velocidad máxima.
pH. La actividad de la mayoría de las enzimas depende del pH debido a la participación de iones [H +] o iones
[OH-] en las reacciones, además que se afecta la de los grupos funcionales. La mayoría de las enzimas tienen
un pH óptimo en el cual su actividad es máxima.
S + E [ES] P + E
La velocidad de formación (Vf) del complejo [ES] depende de V1 mientras que la velocidad de degradación
(Vd) depende de V2 + V3. Por lo tanto en el equilibrio tenemos:
Vf = Vd es decir: V1 = V2 + V3
Sustituyendo sus valores nos queda: K1[E – ES] [S] = K2[ES] + K3[ES]. Dividiendo ambos miembros entre
K1 y [ES] nos queda:
Simplificando:
Constante de Michaelis-Menten
La constante de Michaelis-Menten se utiliza como una medida de la afinidad entre la enzima y el sustrato,
aunque no es propiamente la constante de afinidad. La constante de Michaelis-Menten (Km) se define como la
concentración de sustrato cuando la reacción adquiere la mitad de su velocidad máxima. Cuando esto sucede:
[E – ES] = [ES]. Y por lo tanto, sustituyendo: Km = [S]. Si en una reacción enzimática se mantiene constante
la concentración de la enzima y todos los demás factores que pueden modificar la actividad, se observa
experimentalmente que al aumentar la concentración del sustrato, aumenta progresivamente la velocidad de
la reacción hasta llegar a un máximo (velocidad máxima) después del cual ya no se afecta la velocidad
aunque se trabaje a concentraciones más altas de sustrato. En algunas enzimas se observa incluso una
disminución en la actividad si se aumenta demasiado la concentración de sustrato.
Durante mucho tiempo se pensó que los catalizadores eran sustancias que actuaban por presencia debido a las
concentraciones tan pequeñas y a que podían recuperarse inalterados al final de la reacción. Sin embargo, se
sabe que la velocidad de reacción de acuerdo a la Ley de Acción de Masas depende de su concentración de
tal manera que la velocidad es directamente proporcional a la concentración de enzima, lo que se expresa
como: V = K[E]. Así que la gráfica que se obtiene al expresar la velocidad de reacción en función de la
concentración de enzima es una recta con pendiente positiva.
Tubo
s 1 2 3 4 5 6 7
Reactivos
Sustrato almidón 8 mg/mL en Buffer
mL --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
de fosfatos 0.02M, pH=7
Buffer de fosfatos 0.02M, pH = 7 mL --- 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
Agua destilada mL 5.5 3 3 3 3 3 3
Preincubar 5 minutos a 25°C 5°C 25°C 40°C 50°C 60°C 90°C
Posterior a este tiempo, agregar la enzima conservada en hielo, como se indica en la tabla siguiente:
Tubo
s 1 2 3 4 5 6 7
Reactivos
Enzima (solución de amilasa) mL --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Agitar todos los tubos y colocar nuevamente cada tubo en su respectivo baño como se indicó en la
primera tabla, incubar durante 15 minutos.
Agregar a todos los tubos, 1 mL del reactivo de ácido 3,5 dinitrosalicílico (este reactivo desarrolla un
color rojo caoba en presencia de azúcares reductores).
Agitar bien y colocar en baño María a ebullición durante 10 minutos.
Retirar y enfríar en baño de hielo.
Leer en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm, empleando el tubo 1 como blanco.
Registrar sus resultados en la tabla siguiente.
5 50 °C
6 60 °C
7 90 °C
Evidencias de aprendizaje
1) Trazar una gráfica con los datos obtenidos, donde la absorbancia serán las ordenadas y la To las abscisas.
Tubos
Reactivos
1 2 3 4 5 6
Sustrato (sol. de almidón 8 mg/mL) --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
mL
Buffer de fosfatos al pH indicado 7 5 6 7 8 9
m 5 4 4 4 4 4
L
Preincubar a 40ºC por 5 minutos
Tubos
Reactivos
1 2 3 4 5 6
Enzima (sol. de amilasa) --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
mL
Agitar los tubos e incubar nuevamente en el baño María a 40oC, durante 15 minutos.
Agregar a todos los tubos, 1 mL del reactivo de ácido 3,5 dinitrosalicílico.
Agitar bien y colocar en baño María a ebullición durante 10 minutos.
Retirar y enfríar en un baño de hielo.
Leer en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm, empleando el tubo 1 como blanco
Registrar sus resultados en la tabla siguiente.
4 7
5 8
6 9
Evidencias de aprendizaje
1) Trazar la gráfica correspondiente donde las absorbancias serán las ordenadas y el pH las abscisas.
2) Basándose en sus resultados diga ¿Cuál es el pH óptimo de la amilasa?
3) ¿Cuál es el azúcar que se libera en la hidrólisis de este polisacárido?
Agitar todos los tubos e incubar nuevamente en el baño María a 40oC, durante 15 minutos.
Agregar a todos los tubos, 1 mL del reactivo de ácido 3,5 dinitrosalicílico.
Agitar bien y colocar en baño María a ebullición durante 10 minutos.
Retirar y enfriar en un baño de hielo.
Leer en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm, empleando el tubo 8 como blanco
Registrar sus resultados en la tabla siguiente.
Reactivos Tubos 1 2 3 4 5 6
Sustrato almidón 8 mg/mL en Buffer de fosfatos 0.02M, pH=7 mL --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Buffer de fosfatos 0.02M, pH=7 mL 1 1 1 1 1 1
Agua destilada mL 5.5 4.9 4.8 4.6 4.2 3.4
Preincubar a 40°C durante 5 minutos
Agregar la enzima conservada en hielo, como se indica en la tabla siguiente:
Tubos 1 2 3 4 5 6
Reactivos
Solución de enzima (amilasa) mL --- 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6
Agitar todos los tubos e incubar nuevamente en baño María a 40oC, durante 15 minutos.
Agregar a todos los tubos, 1 mL del reactivo de ácido 3,5 dinitrosalicílico.
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MÉDICA I
ENERO-JUNIO 2017
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DEPTO. DE FORMACIÓN BÁSICA DISCIPLINARIA ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA, IPN
Evidencias de aprendizaje
1) Trazar una gráfica con base en sus resultados con los valores de absorbancia en las ordenadas y la
concentración de enzima expresada en mg/mL en las abscisas e interpretar la gráfica obtenida.
PRÁCTICA No. 8
GLÚCIDOS
Los glúcidos o carbohidratos se definen como derivados aldehídicos o cetónicos reales o en potencia de
alcoholes polivalentes que poseen en su molécula uno o más carbonos asimétricos. Estos compuestos se
encuentran presentes en todos los seres vivos, en cantidades variables, desempeñando importantes funciones
estructurales y energéticas. Debe recordarse que todas las propiedades químicas de los glúcidos dependen
de sus grupos funcionales, o sea, grupos alcohol y grupo carbonilo (aldehídico o cetónico). Los glúcidos se
clasifican, según el número de compuestos hidrocarbonados simples que los constituyen, en 3 grupos;
monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Los monosacáridos no se pueden desdoblar por hidrólisis en
compuestos más sencillos. A su vez se subdividen, según el número de carbonos que contengan, en: triosas,
tetrosas, pentosas, hexosas, etc. Los oligosacáridos, por hidrólisis, dan pocas moléculas de monosacáridos.
En la naturaleza existen varios disacáridos (sacarosa, lactosa, maltosa etc.) y unos cuantos trisacáridos,
tetrasacáridos y pentasacáridos libres. Se pueden obtener por síntesis química en el laboratorio o por
degradación hidrolítica de polisacáridos. Los oligosacáridos poseen propiedades físicas similares a las de los
monosacáridos. Los polisacáridos, por hidrólisis dan muchas moléculas de monosacáridos. Desde el punto
de vista fisiológico se dividen en dos grupos; polisacáridos estructurales y polisacáridos de reserva. Entre
los primeros tenemos en vegetales: la celulosa, los ácidos pecticos y las hemi celulosas. En animales los más
importantes son los llamados mucopolisacáridos, tales como el ácido hialurónico y el condroitin sulfato,
abundantes en varios tejidos y líquidos como el cuerpo vítreo del ojo, el cordón umbilical, el líquido sinovial,
tendones, cartílagos, etc. Entre los polisacáridos nutrientes o de reserva los más importantes son, en
vegetales, los almidones e inulina y en animales, el glucógeno.
Los glúcidos reciben este nombre debido a que la mayor parte de ellos se caracterizan por tener sabor dulce.
Sin embargo, esta propiedad la presentan solamente los mono y oligosacáridos, ya que los polisacáridos son
generalmente insípidos. Otras propiedades que nos permiten diferenciar glúcidos de bajo peso molecular
(monosacáridos y oligosacáridos) de los de elevado peso molecular (polisacáridos), son su solubilidad en
agua y su capacidad para cristalizar.
Las propiedades químicas de los glúcidos dependen de sus grupos funcionales. Todos los glúcidos poseen en
su molécula grupos alcohol y grupos carbonilo, ya sean aldehídicos o cetónicos. Sin embargo, en algunos
glúcidos estos grupos pueden estar bloqueados y por lo tanto, su reactividad química estará ausente. Una
característica química de los aldehídos y cetonas es su carácter reductor, todos los monosacáridos u
oligosacáridos que tengan libre el grupo aldehídico o cetónico serán reductores, mientras que los
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polisacáridos y oligosacáridos que tengan bloqueados estos grupos serán no reductores. Todos los glúcidos
formados por varios azúcares (oligo o polisacáridos) se pueden hidrolizar por acción enzimática o de ácidos
dando como producto final los monosacáridos y liberando los grupos reductores bloqueados. Existen varias
reacciones químicas que se utilizan para la identificación de los glúcidos, algunas son generales y otras son
específicas para determinar tipo o incluso específicas para cada azúcar. Entre las más utilizadas tenemos: la
formación de osazonas, esta reacción es una de las de mayor utilidad para la identificación de azúcares por
ser específica para cada azúcar. La dan positiva tanto los monosacáridos como los disacáridos reductores
sirviendo para identificarlos el tiempo que tardan en formar la osazona correspondiente, la forma cristalina de
ellas, la solubilidad en caliente o en frío y los puntos de fusión.
Existen métodos para la determinación de las propiedades de los glúcidos. Molish-Udranski es una reacción
general para todos los glúcidos, debido a que el ácido sulfúrico concentrado que contiene el reactivo hidroliza y
deshidrata a los azúcares obteniéndose furfural o hidroximetil furfural como producto final y estas sustancias
son capaces de reaccionar con el alfa naftol formando un compuesto colorido (violeta): Esta prueba es una de
las más sensibles, la dan positiva soluciones de glucosa al 0.001%. Sin embargo, la reacción no es específica,
ya que la dan positiva los aldehídos, las cetonas, y algunos ácidos orgánicos tales como el fórmico, oxálico,
cítrico, etc. La reacción de Fehling, se emplea para el análisis cualitativo y cuantitativo de azúcares se basan
en su propiedad reductora, aunque esta propiedad no sea específica de ellos. Se sabe que los azúcares
reductores son capaces de reducir diversos iones metálicos como el cobre, bismuto, mercurio, plata, etc.,
cuando se encuentran estos en solución alcalina. Este tipo de reacciones son muy empleadas porque los
reactivos son estables, existe poca interferencia con otras sustancias, las reacciones son sensibles y puede usarse
la misma reacción para un análisis cualitativo o cuantitativo. El mecanismo de reacción se lleva a cabo debido
a que algunos compuestos orgánicos que contienen uno o más grupos alcohólicos en su molécula, en este
caso el tartrato de sodio, reaccionan en solución alcalina con los hidróxidos metálicos, formando un complejo
soluble, el cual se disocia muy poco, pero los iones que deja en libertad son suficientes para que produzcan
las reacciones de coloración. La formación de este complejo es esencial para que se produzca un precipitado
con la mayor parte de los metales pesados. El reactivo de Barfoed es una solución de acetato cúprico en ácido
acético y una vez más, se determina la capacidad de los azúcares para reducir el ión cúprico a cuproso (Cu2O).
Esta reacción sirve para diferenciar un monosacárido de un disacárido, ya que los primeros a los tres minutos
reducen el reactivo y los disacáridos necesitan más tiempo para que se lleve a cabo la reacción de reducción,
más o menos unos 15 minutos. La reacción de Bial, sirve para diferenciar pentosas de hexosas, el reactivo
consiste en una solución de orcinol en ácido clorhídrico (HCl) concentrado con una pequeñísima cantidad de
cloruro férrico (FeCl3). El fundamento de esta reacción, igual que la reacción de Molisch, Seliwanoff y otras, se
basa en la producción de furfural o hidroximetil furfural cuando se calienta con ácidos concentrados y la
reacción de estos con otras sustancias dando productos coloridos, en este caso las pentosas dan color azul y
las hexosas dan color amarillo o café. La reacción de Seliwanoff sirve para diferenciar aldosas de cetosas.
Las cetosas reaccionan rápidamente mientras que las aldosas lo hacen lentamente. El reactivo es una
solución de resorcinol 0.05% en HCl 1:3 recién preparado. Este compuesto es el que se condensa con el
furfural o sus derivados dando productos coloridos. El reactivo de lugol es una solución de yodo en yoduro
de potasio. Este reactivo reacciona con algunos polisacáridos como los almidones, glucógeno y ciertas
dextrinas formando un complejo de inclusión termolábil que se caracteriza por ser colorido, dando un color
diferente según las ramificaciones que presenta la molécula.
Evidencias de aprendizaje
1) ¿Cuáles de estos glúcidos tienen estructura cristalina? ¿Por qué?
Evidencias de aprendizaje
1) ¿Por qué la glucosa, la manosa y la fructosa dan la misma osazona?
2) Escribir la reacción que se efectúa.
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Tubo Solución
1 Formaldehído
2 Glucosa
3 Fructosa
4 Arabinosa
5 Sacarosa
6 Almidón
Agregar a todos los tubos 2 gotas del reactivo de Molisch-Udransky (solución de alfa-naftol al 5% en
alcohol) y agitar para mezclar.
Añadir a todos los tubos en la CAMPANA DE EXTRACCIÓN 1 mL de H 2SO4 (Ácido Sulfúrico)
¡PRECAUCIÓN!, estratificando (inclinando el tubo y dejando resbalar el ácido LENTAMENTE por las
paredes). La reacción es positiva si aparece en la interfase un anillo de color violeta.
Registrar sus resultados en la tabla siguiente.
Evidencias de aprendizaje
1) Diga por qué la solución de formaldehído da positiva la reacción.
2) ¿Se puede considerar como una reacción útil para diferenciar un glúcido de otro? ¿Por qué?
3) ¿Qué utilidad puede tener la reacción de Molisch-Udransky?
4) Escribir la reacción que se efectúa.
Tubo Solución
1 Glucosa
2 Fructosa
3 Arabinosa
4 Sacarosa
5 Almidón
Colocar los tubos en baño María a ebullición durante 5 minutos.
Dejar enfriar a temperatura ambiente.
Observar y registrar sus resultados en la tabla siguiente.
Resultado Clasificación:
Propiedad de monosacárido, disacárido o
Tubo Solución (precipitado rojo o color
reductor o no reductor polisacárido
azul)
1 Glucosa
2 Fructosa
3 Arabinosa
4 Sacarosa
5 Almidón
Evidencias de aprendizaje
1) ¿Qué azúcares dan positiva la reacción de Fehling?
2) Explicar por qué algunos azúcares dan negativa la reacción.
3) Mencionar 3 sustancias que usted considere puedan dar positiva la reacción de Fehling y no sean azúcares.
4) Escribir la reacción que se efectúa.
Tubo Solución
1 Glucosa
2 Arabinosa
3 Lactosa
4 Maltosa
Colocar los tubos en baño María a ebullición.
Observar y registrar el tiempo que tarda en aparecer el precipitado rojo de óxido cuproso durante la
incubación.
Registrar los resultados en la tabla siguiente.
Evidencias de aprendizaje
1) Explicar las diferencias observadas.
Resultados Clasificación
Tubo Solución
color minutos (aldosa o cetosa)
1 Glucosa
2 Fructosa
3 Agua
Evidencias de aprendizaje
1) ¿Observar alguna diferencia en las soluciones?
2) Escribir la reacción que se efectúa.
Evidencias de aprendizaje
1) ¿Por qué el complejo almidón-yodo es termolábil?
2) ¿Se puede considerar la reacción del lugol característica para cualquier polisacárido?
PRÁCTICA No. 9
OXIDACIONES BIOLÓGICAS
La Bioenergética es la manera en que el ser vivo, utiliza y transforma la energía del medio ambiente. A estos
procesos químicos y físicos se les denominaba respiración. Sin embargo para evitar ambigüedades con el proceso de
la entrada y salida de aire de un compartimiento a otro, se aplica el concepto bioquímico de bioenergética,
incluyendo este término los procesos fotosintéticos. Todos los procesos químicos que constituyen la respiración
conducen a la oxidación de sustancias denominadas metabolitos, hasta CO2 y H2O. Por regla general todas las
reacciones de oxidación son exergónicas, es decir, liberan energía cuando se efectúan; en ocasiones toda la energía
se libera en forma de calor, como cuando se quema u oxida un pedazo de madera. Sin embargo un organismo
viviente no es una máquina térmica y, por tanto, debe poseer un mecanismo enzimático que le permita capturar y
almacenar la energía liberada en los procesos de oxidación. La utilización o captura de la energía involucra la
participación de enzimas específicas capaces de catalizar la conversión del ADP en ATP (reacción endergónica).
Siempre que se efectúa una oxidación, simultáneamente se efectúa una reducción. Es decir, cuando un compuesto
se oxida, otro forzosamente debe reducirse. Como son fenómenos que ocurren simultáneamente se denominan
fenómenos de óxido reducción o reacciones REDOX.
La acción de una sustancia reductora como el hidrosulfito de sodio (NaHSO3), forma leucobases (incoloras)
cuando actúa sobre colorantes oxidados como el azul de metileno (indicador de óxido-reducción). El proceso
inverso (oxidación por pérdida de hidrógeno) se puede realizar en diferentes condiciones y determinar el tiempo de
reacción.
La mayor parte de la energía que utilizan los seres vivos deriva de los procesos de oxidación, y en cada
oxidación se desprende una determinada cantidad de energía que el organismo aprovecha para realizar las
funciones vitales y para efectuar fenómenos sintéticos endergónicos. Todas las oxidaciones biológicas se
caracterizan por su rapidez y por la suavidad con que se realizan, todas se llevan a cabo en medio acuoso, a pH
generalmente neutro y a bajas temperaturas. Esto hace pensar que todos estos procesos están catalizados por
enzimas. Warburg fue uno de los primeros investigadores que trató de explicar las oxidaciones biológicas
suponiendo una activación del oxígeno. Actualmente se sabe que en los tejidos existe un sistema de enzimas
que contienen hierro, mediante el cual el oxígeno molecular se activa y actúa como un agente oxidante. Wieland
Consideraba que el proceso básico en la oxidación de los metabolitos es la activación del hidrógeno por la
acción de enzimas denominadas deshidrogenasas, las cuales transportan el hidrógeno a diferentes aceptores
que pueden ser el oxígeno u otros agentes oxidantes. Szent Györgyi concilió las dos teorías al suponer que es
necesaria la activación del hidrógeno y también la del oxígeno. Keilin supuso que interviene como eslabón
intermediario el citocromo. Sin embargo, las oxidaciones biológicas no son tan sencillas, pues se ha
comprobado que en la oxidación de cada metabolito interviene una gran cantidad de aceptores de hidrógeno. La
glucosa es el más común de los metabolitos debido a que es una molécula altamente reducida. Cuando se oxida
y pierde sus hidrógenos, la liberación de energía de oxidación no se realiza en forma brusca, sino que intervienen
varios transportadores de hidrógeno y se inicia por la acción de una deshidrogenasa específica que no reacciona
directamente con el oxígeno sino que requiere de intermediarios como el NAD+, flavoproteínas y
citocromos. La DESHIDROGENASA SUCCÍNICA (DHS) cataliza la siguiente reacción:
Por otro lado para la obtención de la fracción mitocondrial del hígado de ratón, se tiene que conocer que
el tejido hepático se dispersa en soluciones isotónicas, el núcleo y las mitocondrias permanecen relativamente
inalterados y pueden separarse con facilidad por centrifugación diferencial.
La citocromo-oxidasa es la última enzima de la cadena respiratoria y es la responsable de la “activación del
oxígeno” para oxidar a los citocromos. Tanto los citocromos como la citocromo-oxidasa son metaloproteínas
(porfirinas). La citocromo-oxidasa se caracteriza por su elevada sensibilidad al cianuro (CN) y al monóxido de
carbono (CO). En el año de 1885 Ehrlich reportó la reacción del indofenol. Observó que inyectando alfa naftol y
dimetil-para-fenilendiamina en animales se formaba en los tejidos una sustancia azul llamada azul de indofenol. La
enzima se denominó indofenol-oxidasa, pero posteriormente se ha podido comprobar que esta enzima sólo oxida al
citocromo c, el cual a su vez oxida al indofenol; por lo cual ahora se le conoce como citocromo-oxidasa.
Para comprobar el paso de sal ferrosa a sal férrica, repetir las reacciones con K3[Fe(CN)6] al 0.5% y
KSCN al 0.5% en los cuadrantes inferiores del mosaico.
Registrar los resultados (positivo, si observa presencia de sales ferrosas o férricas o negativo si no
observa nada) en la tabla siguiente.
Evidencias de aprendizaje
1) Escribir la reacción química que se ha efectuado en cada caso.
REACCIONES BIOLÓGICAS DE OXIDO-REDUCCIÓN
EXPERIMENTO 3. OBTENCIÓN DE LA FRACCIÓN MITOCONDRIAL DEL TEJIDO
HEPÁTICO
Sacrificar un ratón, extraer el hígado y depositar en un mortero frío.
Macerar hasta obtener una masa homogénea.
Añadir gradualmente 7 volúmenes de KCl (Cloruro de Potasio) 0.15 M frío.
Vaciar el contenido del mortero en un tubo Falcon de 15 mL.
Centrifugar a 500 rpm durante 15 minutos a 4oC.
Separar el sobrenadante a otro tubo Falcon limpio, aforar a 7 mL con KCl 0.15M y nuevamente centrifugar
a 3000 rpm durante 15 minutos a 4oC.
Durante este tiempo de centrifugación, preparar un tubo de ensaye con la etiqueta de “SOBRENADANTE
DE HÍGADO” y otro tubo de ensaye con la etiqueta de “SUSPENSIÓN DE HÍGADO” y mantenerlos en
frío. Estos serán utilizados más adelante.
Terminado el centrifugado, separar el sobrenadante en el tubo de ensaye con la etiqueta de
“SOBRENADANTE DE HÍGADO” y conservar en frío.
Posteriormente, el residuo o pellet que quede en el Tubo Falcon añadir 7 mL de KCl 0.15M para resuspender
y vaciar en el tubo de ensaye con la etiqueta de “SUSPENSIÓN DE HÍGADO”. Conservar en frío.
Reactivo 1 2 3 4 5 6
Tubo
Azul de metileno 0.002M mL 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
Succinato de sodio 0.1M mL --- 0.5 0.5 --- 0.5 0.5
Malonato de sodio 0.1M mL --- --- 0.5 --- --- 0.5
Agua destilada mL 1.5 1.0 0.5 1.5 1.0 0.5
Suspensión de hígado mL 0.5 0.5 0.5 --- --- ---
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15 min.
Evidencias de aprendizaje
1) Escribir la reacción de formación del azul de indofenol.
2) Explicar por qué no se usó vaselina en este experimento.
3) Explicar sus resultados sobre la base del análisis del contenido de cada tubo.
PRÁCTICA No. 10
LÍPIDOS
Este es un conjunto heterogéneo de moléculas orgánicas cuyas propiedades comunes son su insolubilidad en
agua y solubilidad en solventes no polares como el benceno, cloroformo, éter, etc. Por lo que este grupo
incluye sustancias de muy diversa estructura. Suelen ser moléculas de número relativamente alto de átomos
de carbono e hidrógeno y bajo en átomos de oxígeno; ciertos lípidos también poseen átomos de fósforo,
nitrógeno y azufre en su molécula. Cualquier clasificación presenta sus limitaciones y la nomenclatura puede
producir falsas interpretaciones ya que idéntica terminología ha sido empleada por diferentes autores para
denominar a distintos grupos de lípidos. Los lípidos son los compuestos más recientemente estudiados por
ejemplo: prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, etc., ya que este tipo de sustancias hace poco se
consideraban complejas y de poco interés. Las funciones de los lípidos son muy variadas y las más aceptadas
actualmente son las siguientes:
a) Función estructural, principalmente en las membranas celulares,
b) Actúan como material energético y de reserva,
c) Intervienen en el transporte de compuestos energéticamente activos,
d) Componentes protectores de la pared celular de ciertas bacterias, plantas, insectos y vertebrados,
e) Sustancias de gran actividad biológica como vitaminas y hormonas; las cuales se consideran como
verdaderos reguladores metabólicos,
f) Actúan como aislante térmico y protección alrededor de determinados órganos
Una de las formas de identificación en la práctica es la reacción de Hanus a través del grado de insaturación
de los ácidos grasos que forman parte de un lípido es uno de los factores determinantes de sus propiedades
físicas, químicas y fisiológicas. Se ha observado que aparecen más dobles enlaces en los triacilgliceroles de
almacenamiento y en los lípidos estructurales cuando la temperatura ambiente disminuye. Los dobles
enlaces disminuyen el punto de fusión por lo que se cree que sea un mecanismo del organismo para impedir
la cristalización de los lípidos en los tejidos. El reactivo de Hanus es una solución de yodo y bromo que
nos permite determinar el grado de insaturación de un lípido midiendo la capacidad que tiene para fijar
halógenos en su molécula. Una de las reacciones más usadas para la identificación de acilglicéridos es la
formación de acroleína o aldehído acrílico, el cual se puede obtener por deshidratación del glicerol o de
cualquier glicérido y se reconoce fácilmente por su fuerte olor acre característico.
En esta práctica de lípidos no podemos dejar de mencionar a las membranas ya que hacen posible la
existencia de organismos complejos porque separan las células en el interior de los tejidos y los organelos
celulares, formando compartimientos con propiedades fisicoquímicas diferentes, lo que permite una diferente
organización; y cada compartimiento se vuelve una parte individual de un conjunto más complejo. Se ha
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comprobado que las membranas son complejos lipoprotéicos que contienen de 60% a 75% de proteína y
de 25% a 40% de lípidos. En este experimento se usarán monocapas lipídicas como modelos de membrana.
Al estratificar butanol sobre agua y agregar un lípido, éste se situará en la interfase, orientandose la parte
polar lipídica a la fase acuosa, y la parte hidrofóbica a la fase orgánica. Si ahora se coloca un colorante
se puede observar la difusión pasiva a través de la membrana.
La reación de LIEBERMANN-BURCHARDS, es a través de que el anhídrido acético se puede condensar
con los grupos –OH en posición 3 de los esteroles como en el colesterol y dar los correspondientes ésteres. Si
el esterol tiene un doble enlace en posición 5, se produce además una epimerización y una deshidratación
en presencia de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado, dando como resultado una serie de compuestos de
estructura desconocida que se caracterizan por tener colores que van del rojo al azul y del azul al verde.
Esta reacción es por lo tanto específica para todos los esteroles que contengan un OH en posición 3 y un
doble enlace en posición 5.
Macerar completamente la muestra de cerebro en un mortero, hasta obtener una consistencia homogénea.
En este paso NO AGREGAR NINGÚN TIPO DE SOLUCIÓN, hasta obtener la consistencia deseada.
Agregar gradualmente 20 mL de una mezcla 200:100:1 de cloroformo-metanol-ácido clorhídrico y con
el pistilo del mortero mezclar perfectamente bien.
Agregar 2 mL de HCl 1N (NO OLVIDAR), mezclar y vaciar el contenido en tubo Falcon para
posteriormente centrifugar a 2000 rpm durante 10 minutos.
Después de centrifugado el tubo, separar la fase metanólica, el paquete celular y la clorofórmica.
Desechar el paquete celular. La fase Clorofórmica se usará para la identificación del colesterol,
(separación cromatográfica de fosfolípidos y la formación de membranas) y la Metanólica servirá para la
identificación de cerebrósidos.
Registrar sus resultados.
Evidencias de aprendizaje
1) ¿Se puede considerar esta reacción general para cualquier lípido? ¿Por qué?
2) Escribir la reacción que se ha efectuado.
Evidencias de aprendizaje
1) Describir los cambios de coloración que se llevaron a cabo.
Reactivo Tubo 1 2 3 4
Agua destilada mL 5 5 5 5
Azul de metileno más monoestearato de glicerilo en butanol mL 2 --- --- ---
Azul de metileno más fosfolípidos en butanol* (VER NOTA) mL --- 2 --- ---
Evidencias de aprendizaje
1) ¿Observó el paso del colorante en todos los tubos? Explique a qué se debe esa diferencia.
PRÁCTICA No. 11
ÁCIDOS NUCLEICOS
El control de todos los procesos vitales en la forma tan ordenada que realiza una célula, como son la
transformación de energía en sus diferentes formas, la síntesis de moléculas propias, la degradación de los
metabolitos, el transporte de diferentes materiales a través de sus membranas, la formación de nuevas células, la
diferenciación celular, la creación de nuevos seres, etc.; se puede explicar debido a la existencia de proteínas
específicas, fundamentalmente enzimas. Sin embargo, para la biosíntesis de proteínas las moléculas que
poseen la información necesaria son el ácido desoxirribonucléico (DNA) y el ácido ribonucléico (RNA). Estas
moléculas son los llamados ácidos nucléicos. Rompiendo la máxima bioquímica de que todas las enzimas son
proteínas, se descubrió que algunos RNA pueden funcionar como catalizadores. Los ácidos nucléicos reciben
este nombre debido a que en el año de 1871 el químico suizo Friedrich Miescher logró aislar del núcleo
celular una sustancia que llamó nucleína, la cual debido a su carácter ácido se denominó posteriormente ácido
nucleico.
Sin embargo, existen otros tipos de ácidos nucléicos. El ácido desoxirribonucléico se encuentra
fundamentalmente en el núcleo y es el que posee la información genética y la transmite al citoplasma y por ser
capaz de replicarse puede transmitir la información de padres a hijos. En la célula, fuera del núcleo,
normalmente existen tres tipos de ácidos ribonucléicos que son: el ácido ribonucléico ribosomal (RNAr), el
ácido ribonucléico mensajero (RNAm), y el ácido ribonucléico soluble o de transferencia (RNAt). El RNAr se
encuentra en los ribosomas y su peso molecular es de 2 000 000. El RNAm tiene un peso molecular de 300 000,
se forma en el núcleo y lleva la información al citoplasma. El RNAt tiene un peso molecular de 25 000 a 30
000 y se encuentra disuelto en el citoplasma. El DNA es una de las biomoléculas más grandes que se conocen
hasta ahora y su peso molecular es mayor a un billón.
Tanto el DNA como el RNA se encuentran asociados con proteínas fuertemente básicas (histonas o
protaminas) formando las llamadas nucleoproteínas. La estructura química es similar en todos los ácidos
nucléicos, todos están constituidos por bases púricas, bases pirimídicas, pentosa y ácido fosfórico. El DNA
tiene como bases púricas adenina y guanina, como bases pirimídicas, citosina y timina, como pentosa la 2-
desoxiribosa y ácido fosfórico H3PO4. Los ácidos ribonucléicos tienen como bases púricas la adenina y
guanina y como bases pirimídicas uracilo y citosina, como pentosa la D–ribosa y H3PO4.
Los ácidos nucléicos son macromoléculas formadas por la unión de varios nucleótidos. Un nucleótido se puede
considerar como un éster fosfórico de un nucleósido, que es la unión de una base púrica o pirimídica con
una pentosa. Los mononucleótidos se unen entre sí por medio de un enlace fosfodiester 3’- 5’, formando los
polinucleótidos.
Por otro lado cuando se desea purificar una sustancia se deben seleccionar las células o tejidos que se van a
utilizar como materia prima. En el caso del DNA esta selección es en especial importante porque el contenido
de DNA es pequeño en la mayor parte de las células. La célula ideal será aquella que tenga una relación
núcleo/citoplasma alta, como en los linfocitos y células del tumor ascítico de Ehrlich. Sin embargo, no es
fácil obtener este tipo de células por lo que frecuentemente se usan órganos típicamente linfoides como el timo
y el bazo. El primer paso en la extracción del DNA es la homogeneización del tejido. Este paso puede
degradar en parte la molécula del DNA si no se toman las precauciones necesarias, la solución reguladora es de
citrato 0.01M y NaCl 0.14M, a pH de 7.2 a 7.4; la fuerza iónica de esta solución hace insoluble a la
desoxirribonucleoproteína. Si se centrifuga este homogeneizado, en el residuo quedarán los restos celulares y
las desoxirribonucleoproteínas insolubles. En el sobrenadante se encuentran compuestos solubles como la
mayor parte de los ácidos ribonucléicos.
Al homogeneizar el tejido se liberan las enzimas de los lisosomas, entre ellas la DNAasa, la cual hidroliza el
DNA. Se sabe que el Mg++ es indispensable para la actividad de esta enzima; si en la solución existe citrato,
éste se une al Mg++ e impide la acción de la DNAasa. Otra forma de evitar la acción hidrolítica de la enzima
es trabajar a temperaturas bajas (0°C a 2°C). El siguiente paso en la purificación está basado en que las
desoxirribonucleoproteínas y el DNA son solubles en soluciones salinas concentradas, mientras que la
mayor parte de las proteínas precipitan en estas condiciones. Si el residuo se suspende en solución de NaCl
2.6M y se centrifuga, el residuo insoluble estará formado fundamentalmente por proteínas, mientras que el
DNA permanecerá en solución. Este DNA se puede precipitar selectivamente por la adición selectiva de 2
volúmenes de alcohol etílico al 95% formándose un precipitado blanco fibroso, el cual se puede recoger por
rotación de un agitador de vidrio con pequeños salientes.
Existen varios métodos para identificar y cuantificar a los ácidos nucléicos. El método más utilizado es el
espectrofotométrico, el cual está basado en que tanto el DNA como el RNA absorben a 260 nm. La
absorbancia es proporcional a la concentración del ácido, por lo tanto, el medir la absorbancia es un método
cuantitativo muy sensible y sencillo, pero no distingue entre DNA y RNA. Es de gran utilidad cuando las
muestras están puras. Una reacción muy utilizada para identificar y cuantificar DNA es la llamada reacción de
Dische, la cual está basada en que el reactivo de difenilamina reacciona específicamente con el DNA dando
una coloración azul cuya intensidad es proporcional a la concentración de DNA. En realidad, la
especificidad de esta reacción no es absoluta, ya que la difenilamina es un reactivo específico para las 2-
Agregar 300 mL de solución reguladora de Citrato 0.01M-NaCl 0.14M, pH=7.2 fría, en un vaso de
licuadora previamente enfriado.
Hacer funcionar la licuadora a baja velocidad y añadir los trozos de bazo de todos los equipos, esperar a
que se homogenice completamente el primero antes de añadir el segundo y así sucesivamente.
Terminada la adición, continuar homogeneizando por 30-60 segundos más.
Vaciar a tubos Falcon de 50 mL teniendo cuidado de tarar perfectamente los tubos opuestos
¡PRECAUCIÓN! (CONSULTE A SU MAESTRO).
Centrifugar a 5000 rpm durante 15 minutos.
Agitar el tubo hasta obtener un completo homogenizado. El DNA es soluble en esta solución mientras que
la mayor parte de las proteínas son insolubles.
Centrifugar a 8000 rpm durante 30 minutos.
Evidencias de aprendizaje
1) Explicar por qué se utilizó bazo como materia prima y no otro órgano cualquiera.
2) ¿Sería conveniente utilizar solución reguladora de fosfatos para la extracción del DNA? ¿Por qué?
3) ¿Por qué es conveniente trabajar durante toda la extracción a baja temperatura?
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[DNA]
Tubo Absorbancia
mg/mL
1 1
2 0.5
3 0.25
4 0.125
5 -------- Blanco
6 Problema
Evidencias de aprendizajes
1) Construir la curva tipo con los datos de la tabla, donde las absorbancias serán las ordenadas y los mg de
DNA las abscisas.
2) Interpolar la absorbancia del tubo No. 6 para encontrar la concentración de DNA (mg/mL) y calcular la
cantidad total de DNA en su problema.
1) Construir la curva tipo con los datos de la tabla, donde las absorbancias serán las ordenadas y los mg de
RNA las abscisas.
2) Interpolar los valores de absorbancia de su problema y determinar la concentración real en mg/mL.
Tubo
Reactivo 1 2 3 4 5 6
Buffer de acetato 0.1M pH 4.0 mL 7 7 7 7 8 8
Reactivo molibdato al 2.5% mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Solución de vitamina C al 1% reciente mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Agua destilada mL 2
Solución tipo 1 M/mL 2
Solución tipo 2.5 M/mL 2
Solución tipo 5 M/mL 2
Problema DNA 1
Problema RNA 1
1) Construir la curva tipo para fosfato con los datos de la tabla, donde las absorbancias serán las ordenadas y
los M/mL de las soluciones tipo las abscisas.
2) ¿Cómo afecta el medio ácido al enlace 3’-5´diéster fosfato?
3) ¿Cómo afecta el medio alcalino al enlace 3’-5´diéster fosfato?