Prácticas de Laboratorio en Microbiología y Biología

2021-20

Semana 1 - Guía N°1

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

1. Introducción y objetivos

Los medios de cultivo son sustratos en los cuales crecen algunos microorganismos en una condición
artificial conocida como (in vitro) y por lo tanto son observables macroscópicamente. Los medios
pueden ser sólidos, líquidos o semisólidos con diferentes composiciones de nutrientes y por lo tanto
también pueden clasificarse en medios de crecimiento general como el agar PCA (Plate Count Agar)
para bacterias, o el agar PDA (Potato Dextrose Agar) para hongos.

Los medios pueden ser selectivos como el agar MCK (MacConkey) que inhibe el crecimiento de
bacterias que no toleran sales biliares, o los medios generales suplementados con antibióticos como
el cloranfenicol (CHL) que permiten inhibir un amplio espectro de bacterias.

Por otra parte, los medios diferenciales permiten evaluar diferencias metabólicas entre varios
organismos en aspectos como la capacidad de producir pigmentos o de metabolizar algún sustrato
en particular. Ejemplos de ellos son el agar citrato o el medio TSI (Triple azúcar y hierro).
Dependiendo de las características fisiológicas y metabólicas de cada microorganismo, estos
crecerán de diferente manera en cada medio.

La gran mayoría de medios de cultivo son comerciales, por lo tanto, su composición y modo de
preparación se encuentran en la etiqueta de instrucciones que debe ser revisada en detalle. Los
medios sólidos suelen contener un agente gelificante como el agar por lo que son preparados en
agua y calentados hasta que se disuelvan completamente. Para la esterilización de los medios en
general (si no presentan algún detalle que explique la etiqueta), se utiliza calor húmedo mediante
unos equipos conocidos como “autoclaves” que funcionan como ollas a presión. Las condiciones de
esterilización son 121°C y 20 psi. Una vez finalizado el proceso de esterilización, pueden servirse en
cajas de Petri cuando se encuentren a temperatura tolerable al contacto con la piel (~ 55°C), en
condiciones de esterilidad (Figura 1).

~ 55°C

Figura 1. Diagrama para la preparación de medios sólidos

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2021-20

El medio PCA es un medio de cultivo estándar para recuperar bacterias y levaduras, aunque también
pueden crecer microorganismos fúngicos. Por su parte el medio PDA es óptimo para la recuperación
de levaduras y hongos filamentosos, aunque en él también pueden crecer bacterias. Algunos medios
de cultivo se suplementan con compuestos que no pueden ser autoclavados porque pueden
dañarse a altas temperaturas, como algunos antibióticos y vitaminas. Por lo tanto, deben ser
incorporados y homogenizados posteriormente, antes de que el medio sea servido en las cajas de
Petri.

El objetivo de esta práctica es preparar medios de cultivo generales que serán usados para crecer y
aislar microorganismos.

2. Materiales

• Erlenmeyers • Agua destilada • Agar Plate Count (PCA)

• Balanzas • Cajas de Petri • Agar Papa-Dextrosa (PDA)
• Micropipetas • Mecheros • Cloranfenicol (CHL)
• Puntas • Plancha de calentamiento • Etanol

3. Metodología

Cada estudiante preparará 1 caja de PCA pero trabajarán con sus compañeros de mesón.

1) Leer las instrucciones en la etiqueta de preparación de cada medio. Realizar los cálculos
para preparar X cajas de cada medio (x = #de estudiantes en el mesón).
2) Pesar la cantidad del medio calculada, en una hoja de papel en la balanza. Usar las espátulas
provistas y limpiar al finalizar el procedimiento.
3) Disolver el polvo en un Erlenmeyer con el volumen de agua calculado, dejando libre ¼ del
volumen total del frasco.
4) Llevar a hervir en plancha de calentamiento. Homogenizar varias veces de forma manual
durante el proceso.
5) Llevar los medios a autoclavar. Diligenciar los formatos de esterilización.
6) Cuando finalice el proceso de esterilización, servir los medios en las cajas de Petri. Usar los
mecheros para trabajar en condiciones de esterilidad.
7) Cuando hayan solidificado, marcar las cajas de Petri por el borde en la parte de atrás.
Nombre del medio de cultivo (siglas), laboratorio y número de pareja.

Su profesor(a) agregará CHL a un medio de cultivo y ustedes lo servirán individualmente en una caja
de Petri:

1) Preparar el medio de cultivo en un Erlenmeyer y mantenerlo a 50°C en baño María.*

2) Preparar una solución madre de antibiótico CHL 10 mg/mL.*
3) Realizar los cálculos para que la concentración final de CHL en las cajas sea 100 µg/mL.
4) Mezclar antes de servir.

*Nota: Estas actividades serán previamente realizadas por sus monitores.

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2020-10

4. Bibliografía

Maniatis, Tom. & Sambrook, Joseph. & Fritsch, E. F. & Cold Spring Harbor Laboratory. (1982). Molecular
cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y : Cold Spring Harbor Laboratory

Owlcation. (2017). Types of Culture Media. https://owlcation.com/stem/Types-Of-Culture-Media