Microscopía de Fluorescencia para detección de moléculas de interés

Por: Emily Johanna Arévalo Cárdenas y Pedro Arango

Objetivos:

● Familiarizarse con el funcionamiento del microscopio de fluorescencia.

● Preparar y observar muestras de nanopartículas fluorescentes.
● Preparar y analizar una muestra de células marcada con 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)

Procedimientos, resultados y análisis

1. Observación del cambio de color en la fluorescencia de dos pruebas de CarbonDots procedentes de

dos mecanismos diferentes de obtención.

Imagen 1. Solución de CarbonDots procedente de investigadores de la Universidad EIA.

Imagen 2. Solución de CarbonDots procedentes de investigadores de la Universidad Nacional.

Se puede ver diferencias en la coloración de las dos muestras, viéndose en la primera imagen una
coloración más azul verdosa y en la segunda una fluorescencia más azulada.
Esta diferencia en la coloración se da debido a la diferencia en el proceso de obtención de los
CarbonDots. Los CarbonDots de la primera imagen se obtuvieron de un árbol de palma de aceite y la
segunda muestra de CarbonDots se obtuvieron de manera diferente. En ambas muestras se está
iluminando con la misma fuente lumínica y con una misma longitud de onda, al ser la procedencia
diferente ambas soluciones van a tener diferentes longitudes de onda de excitación.

2. Preparación de solución de CarbonDots a 1000 ppm.

● Se parte de una solución madre de CarbonDots a 5000 ppm.

C 1 ×V 1=C 2 ×V 2 Ecuación 1.
mg
ppm= Ecuación 2.
L

● Utilizando las ecuaciones 1 y 2 determinamos los volúmenes de solución madre y agua Miliq
necesarios para la preparación de la solución a 1000 ppm.

Reemplazando en Ecuación 1.
mg mg
5000 ×V 1=1000 × 1 ml
L L
Despejamos V1 y encontramos que V1=0.2ml

Pero las pipetas del laboratorio se encuentran en microlitros→ V 1=200 μ l

1000 μl−200 μ l=800 μ l AguaMiliq
Entonces se prepara una solución compuesta por 200 μde soluto (Madre) y 800 μ lde
Solvente (AguaMiliq).

Imagen 3. Solución a 1000 ppm en tubo de microcentrífuga.

3. Observación y comparación de la intensidad de fluorescencia a diferentes concentraciones en
microscopio de fluorescencia.
● Colocación de las soluciones a diferentes concentraciones en el portaobjetos. Se debe usar
cubreobjetos ya que el microscopio es invertido.

Imagen 4. Soluciones puestas sobre portaobjetos. Cuadrante 1, solución a 5000 ppm.

Cuadrante 2, solución a 1000 ppm. Cuadrante 3 Solución a 200 ppm

● Observación en microscopio de fluorescencia.

Solución a 200 ppm.

Imagen 5. Análisis muestra del cuadrante 3.

Imagen 6. Observación en el microscopio de fluorescencia

Solución a 1000 ppm.

Imagen 7. Análisis muestra del cuadrante 2.

Imagen 8. Observación en el microscopio de fluorescencia.

Solución a 5000 ppm.

Imagen 9. Análisis muestra del cuadrante 2.

 Imagen 10. Observación en el microscopio de fluorescencia.

De las imágenes anteriores se puede observar que una mayor concentración de solución de
CarbonDots se traduce en una mayor intensidad en la fluorescencia.

4. Frotis de la mucosa Yugal y marcación de los núcleos de las células.

● Se realizó un raspado suave de la cara interna del carrillo bucal.
● Se dispersó el material recogido sobre un portaobjetos.
● Se tiñó el material con DAPI y se colocó un cubreobjetos.

● Observaciones en el microscopio

Imagen 11. Observación de células, en este caso vivas, resultantes del frotis.

Éstas células no fueron teñidas por el DAPI, por lo tanto concluimos que estaban vivas y el
método de tinción no pudo penetrar en su núcleo.
 Imagen 12. Observación de núcleos de células muertas teñidos por el DAPI.

Preguntas

1. Existen diferentes tipos de colorantes fluorescentes utilizados para la tinción celular como
Fucsina ácida, Pararosanilina (cloruro), Rodamina B, Auramina O, entre otros.

Las imágenes de arriba muestran cómo los diferentes colorantes se ven en un microscopio de
fluorescencia. Las imágenes corresponden al orden en los que fueron mencionados los
colorantes respectivamente.

2. Un grupo de investigadores del Instituto de Ciencia de Materiales de Barcelona han

desarrollado un nuevo tipo de sondas fluorescentes: nanopartículas orgánicas fluorescentes.
Se basan en los quatsomes, nano vesículas producidas por una tecnología sostenible que están
cargadas con fluoróforos. Estas nanopartículas tienen un diámetro medio de 120 nm y han
demostrado buena biocompatibilidad y una elevada estabilidad por lo que constituyen un
nuevo material para la bioimagen.

Además, estas nanopartículas experimentan la transferencia de energía de resonancia de

Förster, la cual ayuda a mejorar la adquisición de bioimagenes, dado a que se reduce
significativamente la autoabsorción, también permite monitorear la integridad de la
nanopartícula, una gran ventaja para aplicaciones biomédicas donde se necesita saber cuando
la nano vesícula se mantiene entera o si desintegra.

3. Existen alternativas para el uso del marcador fluorescente DAPI como distintas
nanopartículas como los Carbon Dots. Estas nanopartículas deben de tener propiedades
luminosas o fluorescentes, buena biocompatibilidad, grupos funcionales que se puedan
modificar y un método sencillo de síntesis, aparte de que aportan una buena calidad de
bioimagen.
Bibliografía
● https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780081025093000225
● https://www.agenciasinc.es/Noticias/Nuevas-nanoparticulas-fluorescentes-para-ver-el-
interior-celular
● https://www.merckmillipore.com/CO/es/search/-/browse?
SynchronizerToken=c5fe48470568cc2970b84a1d741011234fc03285f73339ec180048e8de5f9
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● https://www.upo.es/upotec/catalogo/salud/nanoparticulas-metalicas-funcionalizadas-
fluoresce/