Informe de prueba

M TK -2018-001342

Material de injerto óseo, origen animal

(jeringa)

Test de citotoxicidad (Test sobre

extractos)

Presidente de KTR
Esquema de prueba

Título del estudio: Prueba de citotoxicidad (Prueba sobre extractos)

Número de estudio: MTK-2018-001342

Patrocinador

Nombre: Purgo Biologics Inc.

Dirección: E-607, 700, Pangyo-ro, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi- do, Korea,

13516

Representante: Ho-Chang, Kang

Instalación de prueba

Nombre: Instituto de Investigación y Pruebas de Corea

Dirección: 98, Gyoyukwon-ro, Gwacheon-si, Gyeonggi-do, Corea

2018.11.15

Choun, Jae-Hee, M.S. Fecha

Director de estudios

Dispositivo médico-Instituto de investigación biológica, KTR

2018.11.15

Cho, Jin-Sik, M.S. Fecha

Gerente técnico

Dispositivo médico-Instituto de investigación biológica, KTR

Este informe se presenta para el artículo enviado por el patrocinador.

15 de noviembre de 2018
 Resumen
Como una serie de pruebas de biocompatibilidad para el dispositivo médico, el artículo
de prueba, Material de injerto óseo, fuente animal (jeringa) (Modelo: TG-AS10) se
sometió a una prueba de citotoxicidad in vitro. Sobre la base de la norma ISO 10993-5:
2009 (Evaluación biológica de dispositivos médicos, Parte 5: Pruebas de citotoxicidad
in vitro), se realizó una prueba con extractos en el artículo de prueba para evaluar la
citotoxicidad potencial.
Se preparó un solo extracto del artículo de prueba utilizando medio esencial mínimo
de concentración simple (1 × MEM) con suero al 10%. Después de la extracción, el
extracto se colocó en tres monocapas confluentes separadas de fibroblasto de ratón L-
929. Simultáneamente, se colocaron triplicados de control de reactivo, control
negativo y control positivo sobre las monocapas confluentes de L-929.
Todas las monocapas se incubaron a (37 ± 1), (5 ± 1)% de CO ℃ 2 durante 48 horas.
Posteriormente, se examinó al microscopio el cambio morfológico de la célula para
evaluar la reacción biológica y se contaron las células viables.
En las condiciones de este estudio, el extracto MEM del artículo de prueba mostró una
citotoxicidad leve y se evaluó como grado 2 (levemente citotóxico) según los criterios
ISO 10993-5. El control de reactivo, el control negativo y el control positivo se
realizaron según lo previsto.
 Contenido
Portada del reporte
Esquema de prueba···········································································································
I Resumen ··························································································································
II Contenido ·······················································································································
III
1. Introduccion ················································································································ 1
1.1. Calendario de Pruebas·······························································································
1 2. Material y metodos
······································································································ 2 2.1. Articulo de
prueba y control ····················································································· 2 2.2. Articulo
de prueba y preparación del control···························································· 2 2.3.
Sistema de test·········································································································· 3
2.4. Metodos ··················································································································· 3
2.5. Criterio de evaluacion································································································
4 3. Resultados
··················································································································· 5 4. Discusion
y conclusiones······························································································ 6 5.
Referencias ·················································································································· 7
6. Tablas ···························································································································
8 Tabla 1. Resultado de análisis cualitativos
······································································· 8 Tabla 2. Resultado de análisis
cuantitativos ··································································· 9
Introducción
Como pruebas iniciales de biocompatibilidad para los materiales, la prueba de
citotoxicidad in vitro se llevó a cabo generalmente en varios dispositivos médicos y
productos químicos por su carácter más simple y fácil que la de otra prueba de
biocompatibilidad relativa.
Esta prueba se realizó para evaluar si el artículo de prueba causaría citotoxicidad al
fibroblasto de ratón (NCTC Clon 929 (L-929)) en las condiciones de cultivo. Sobre la
base de la norma ISO 10993-5: 2009 (Evaluación biológica de dispositivos médicos,
Parte 5: Pruebas de citotoxicidad in vitro), la muestra de prueba se preparó mediante
extracción con MEM de concentración única con suero al 10% para aplicar la prueba
sólida. artículo a la celda adherente en forma líquida. Las células que se habían puesto
en contacto directamente con la muestra de prueba se observaron y registraron bajo
el microscopio para determinar la citotoxicidad. El MEM se seleccionó como vehículo
de extracción para simular la condición en la que se aplicó el artículo de prueba al
cuerpo humano.
Calendario de pruebas
Fecha de inicio 2018-11-05
Fecha de finalización 2018-11-08
Materiales y métodos
2.1 Artículo de prueba y control
2.1.1 Información del artículo de prueba
Modelo: TG-AS10
Nombre: Material de injerto óseo, origen animal (jeringa)
Lote no. : -
2.1.2 Medio y vehículo
Nombre: 1 × MEM (medio esencial mínimo) con suero al 10%
Proveedor: Gibco
Lote No: 1963696
Condición de almacenamiento: (2 ~ 8) ℃
2.1.3 Suero
Nombre: suero de caballo
Proveedor: Gibco
Lote No: 1783309
Condición de almacenamiento: (-15 ~ -20) ℃
2.1.4 Control negativo
Nombre: Película de polietileno de alta densidad
Proveedor: Instituto de Investigación Hatano (Centro de Seguridad de Alimentos y
Medicamentos)
Lote No: C-161
Condición de almacenamiento: temperatura ambiente
2.1.5 Control positivo
Nombre: Película de poliuretano ZDEC
Proveedor: Instituto de Investigación Hatano (Centro de Seguridad de Alimentos y
Medicamentos)
Lote No.: A-173K
Estado de almacenamiento: temperatura ambiente

2.2 Artículo de prueba y preparación de control

El artículo de prueba se sumergió en MEM con suero de caballo al 10% en una
proporción de 20 ml por 4 g. El artículo de prueba se extrajo en MEM con suero de
caballo al 10% a (37 ± 1) ℃ en presencia de (5 ± 1)% de CO2 durante 24 horas
utilizando técnicas asépticas.
En el caso del control de reactivo, una única alícuota de MEM sin material de prueba se
sometió a la misma condición de extracción que se describe para el artículo de prueba.
El control negativo y el control positivo se extrajeron en una proporción de 1 g: 10 mL,
con base en la certificación del Instituto de Investigación Hatano. La preparación del
control negativo MTK-2018-001342 Página 3 de 9 y del control positivo se sometió a
las condiciones de extracción a (37 ± 1) ℃ en presencia de (5 ± 1)% CO2 durante 24
horas, respectivamente. Todos los extractos se utilizaron en la prueba dentro de las 24
horas posteriores a la finalización de la preparación.
2.3 Sistema de prueba
2.3.1 Línea celular
Nombre: NCTC Clone 929 (L-929)
Proveedor: ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo, EE. UU.)
2.3.2 Motivo de la selección de la línea celular
Las células L-929 se utilizan comúnmente para la prueba de citotoxicidad y tienen
muchos datos relacionados con la prueba de citotoxicidad. Estas células también son
conocidas por su alta sensibilidad a las sustancias químicas tóxicas.

2.3.3 Gestión
Medio: Medio esencial mínimo (pH 7,4) suplementado con 10% de suero de caballo y
1% de antibióticos [Penicilina (100 Unidades / mL) / Estreptomicina (100 g / mL µ)]
Cultivo: las células L-929 se mantuvieron en un ambiente gaseoso de CO2 al 5% a 37ºC.
℃ Estas células se subcultivaron posteriormente cada 3-4 días.
2.4 Métodos
2.4.1 Evaluación cualitativa
Para esta prueba, las células de monocapa confluentes se eliminaron de las placas de
cultivo mediante digestión enzimática (tripsina / EDTA) y se centrifugó la suspensión
celular. A continuación, las células se resuspendieron en medio de cultivo y se
ajustaron a una densidad de 1 x 105 células / ml y se añadieron 2 ml a pocillos
individuales de 10 cm2 (placas de 35 mm). Los pocillos se incubaron a (37 ± 1) en (5 ±
1)% ℃ CO2 durante 24 horas para obtener una monocapa de células medio
confluente. Se seleccionaron pocillos de cultivo por triplicado y se etiquetaron con el
nombre de la muestra. El medio de crecimiento se descartó de los pocillos y se
reemplazó con 2 mL de la muestra de prueba. Del mismo modo, los cultivos por
triplicado se reemplazaron con 2 mL del reactivo control, control negativo y control
positivo con etiqueta. Los pocillos se incubaron a (37 ± 1) en (5 ± 1)% CO2 durante 48
horas. Después de la incubación, los cultivos se examinaron microscópicamente (100x)
para evaluar las características celulares y la lisis.
2.4.2 Evaluación cuantitativa Después de la observación del cambio morfológico y la
lisis de la célula con un microscopio, las células se retiraron de las placas de cultivo
mediante digestión enzimática (tripsina / EDTA) y se suspendieron, luego se contó el
número de células vivas.
2.5 Criterios de evaluación
La confluencia de la monocapa se registró como (+) si estaba presente y (-) si no
estaba. El grado de cambio morfológico y degeneración celular se registró como
porcentaje. Además, se observó el color del medio de prueba y se comparó con el
medio de control negativo. Un cambio de color hacia el amarillo se asoció con un rango
de pH ácido y un cambio de color hacia el púrpura se asoció con un rango de pH
alcalino. Se evaluó la citotoxicidad de cada cultivo utilizando los siguientes criterios en
ISO 10993-5, 8.5 Determinación de la citotoxicidad.

Calificación Reactividad Condiciones de todas las culturas

0 Ninguno Gránulos intracitoplasmáticos discretos, sin lisis
celular, sin reducción del crecimiento celular

1 Leve No más del 20% de las células son redondas, poco

adheridas y sin gránulos intracitoplasmáticos, o
muestran cambios en la morfología; hay presencia
de células lisadas ocasionales; sólo se observa una
ligera inhibición del crecimiento.

2 Leve No más del 50% de las células son redondas, sin

gránulos intracitoplasmáticos, sin lisis celular
extensa; no más del 50% de inhibición del
crecimiento observable

3 Moderado No más del 70% de las capas de células contienen

células redondeadas o están lisadas; las capas de
células no se destruyeron completamente, pero se
 observó una inhibición del crecimiento de más del
50%.

4 Grave Destrucción casi completa o completa de las capas

celulares.

Para que la prueba sea válida, el control reactivo y el control negativo deben haber
tenido reactividad nula (Grado 0) y el control positivo debe haber sido mayor que leve
(> Grado 2). La prueba se habría repetido si los controles no se desempeñaron como se
anticipó y / o si todos los pozos de prueba no arrojaron la misma conclusión.
3. Resultados
El grado de cambio morfológico y lisis celular se describió en la Tabla 1. Aunque los
cultivos tratados con extracto del artículo de prueba mantienen sus monocapas
celulares confluentes, se observó una inhibición del crecimiento de aproximadamente
un 25%. Por lo tanto, la reactividad del extracto de prueba se consideró leve. Además,
la reactividad del extracto de prueba, que era una reactividad leve a las células viables,
se confirmó mediante análisis cuantitativo a través del recuento de células viables
(Tabla 2).
El control de reactivo, el control negativo no mostró citotoxicidad y el control positivo
mostró citotoxicidad en más del 75% de las células como se anticipó.
4. Discusión y conclusión
En las condiciones de esta prueba, el extracto MEM de material de injerto óseo, fuente
animal (jeringa) (modelo: TG-AS10) no mostró evidencia de causar un cambio de pH,
pero se observó una leve inhibición del crecimiento en las células de fibroblastos de
ratón (Tabla 1, 2). ). Por lo tanto, el extracto de prueba se consideró de citotoxicidad
leve y se evaluó como grado 2 (levemente citotóxico) según los criterios ISO 10993-5.
Sin embargo, el artículo de prueba cumplió con los requisitos de la prueba general para
dispositivos médicos, ya que el grado de citotoxicidad fue inferior a 2 (levemente
citotóxico). El control de reactivo, el control negativo y el control positivo se realizaron
como se anticipó mostrando la validez de esta prueba.
El resultado de la prueba del artículo de prueba solo debe aplicarse sobre este
informe. Debe especificarse como responsabilidad del solicitante si necesita
interpretar y solicitar los otros productos.
5. Referencias
Aviso de MFDS No. 2014-115, Los estándares para el dispositivo médico sobre
seguridad biológica
Aviso MFDS No. 2017-16, Los estándares para el dispositivo médico
ISO 10993-12 (2012), Evaluación biológica de dispositivos médicos - Parte 12:
Preparación de muestras y materiales de referencia.
ISO 10993-5 (2009), Evaluación biológica de productos sanitarios. Parte 5: Ensayos de
citotoxicidad in vitro.
USP 39 (2016), Pruebas de reactividad biológica, in vitro
6. Tablas

Table 1. Results of qualitative analysis

Bien % % % Células % % Reactividad Grado

confluencia Inhibición sin Redondeo Lisis
Monocapa del granulación
crecimient intracelular
o
Test (1) (+) 25 25 25 25 Leve 2
Test (2) (+) 25 25 25 25 Leve 2
Test (3) (+) 25 25 25 25 Leve 2
Control de (+) 0 0 0 0 Ninguno 0
Reactivo (1)
Control de (+) 0 0 0 0 Ninguno 0
Reactivo (2)
Control de (+) 0 0 0 0 Ninguno 0
Reactivo (3)
Control (+) 0 0 0 0 Ninguno 0
Negativo (1)
Control (+) 0 0 0 0 Ninguno 0
Negativo (2)
Control (+) 0 0 0 0 Ninguno 0
Negativo (3)
Control (-) 100 100 100 100 Severo 4
Positivo (1)
Control (-) 100 100 100 100 Severo 4
Positivo (2)
Control (-) 100 100 100 100 Severo 4
Positivo (3)
(+): presente, (-): ausente
Tabla 2. Resultados del análisis cuantitativo

Linea Resultado del recuento celular (células / mL)

Grupo
Grupo de prueba Control de reactivo Control negativo Control positivo

1 5.4 X 105 7.0 X 105 6.7 X 105 0

2 5.3 X 105 7.3 X 105 6.8 X 105 0
3 5.4 X 105 7.1 X 105 6.7 X 105 0
Promedio 5.4 X 105 7.1 X 105 6.7 X 105 0
RCC (%) 76.1 100.0 94.4 0.0

RCC (Recuento relativo de células,%) = Número de células del grupo de prueba X100

Número de células del grupo de control de reactivos

El informe de prueba lo emite el Instituto de Investigación y Pruebas de Corea (KTR). Al

utilizar sus resultados en el exterior, debe asegurarse de declarar que los resultados de
las pruebas antes mencionados son realizados por KTR.
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