METODOS DE CONSERVACION DE

MATERIAL VEGETAL (IN VITRO)

NEHEMIAS MORALES ROBLERO

Métodos de conservación
de material vegetal (in
vitro).
• Metodología
• Crioconservacion
• Medios de cultivo
 Métodos para la conservación de
germoplasma.
La estrategia a seguir para la conservación
de germoplasma, depende de la naturaleza
del material vegetal:
• Duración de su ciclo de vida.
• El modo de reproducción .
GERMOPLASMA: organo de la planta que
• El tamaño de sus individuos. sera conservadas, y que nos puede
generar una nueva planta. (semillas)
alternativas de conservación:
• El tradicional banco de semillas
• mantenimiento de áreas de reservas.
Los métodos de conservación de
germoplasma
se pueden dividir en:
Métodos de Métodos de
Conservación in situ Conservación ex situ.

• se basan en la conservación de las • se basan en el mantenimiento del

plantas en sus hábitats naturales e material biológico en bancos de
incluyen la conservación en Parques semillas, bancos de cultivo in vitro,
Nacionales y en Reservas Ecológicas. colecciones de plantas (en campo,
• Conservación en su lugar de origen. viveros, jardines botánicos).
• Fuera del lugar.
 Bancos de semillas
la International Plant Genetic
Resouces Institute (IPGRI) Este protocolo de conservación es el
recomienda: más recomendado para especies que se
propagan por semillas y cuyas semillas
• su desecación hasta un 3-
resisten la desecación sin que ello
7% de humedad
implique pérdida de viabilidad.
• almacenamiento a bajas
temperaturas (-18ºC).

VIABILIDAD: estodo activo de las

semillas, es decir, que aun pueden
germinar en el momento que se
den las condiciones adecuadas.
Tipos de semillas
Semillas ortodoxas
semillas resisten la desecación sin que
ello implique pérdida de viabilidad.
como por ejemplo las semillas de arroz,
trigo, avena, tabaco, tomate y lechuga.
Semillas recalcitrantes
La especie se propaga, en la práctica, vegetativamente
(como la mandioca, papa, caña de azúcar, plátanos y
bananos) o bien porque sus semillas pierden
rápidamente la viabilidad cuando son sometidas a
procesos de desecación.
No se pueden esterilizar en laboratorios, debe ser en
campo
• Las semillas de numerosas especies que viven en
zonas tropicales o subtropicales se incluyen en esta
categoría, como por ejemplo las de coco, cacao,
frutales tropicales perennes y diversas palmeras.
 Otro método de conservación de germoplasma
ex situ, es mediante el cultivo in vitro de tejidos.

Lo que llevo al cultivo in vitro:

• La totipotencia: ha permitido pensar en el establecimiento de bancos
de germoplasma utilizando el cultivo de tejidos vegetales.

• El mantenimiento de los recursos fitogenéticos mediante los métodos del

cultivo in vitro se logra haciendo cambios en el ambiente de cultivo para
desacelerar el crecimiento de las células y de los tejidos.
• El objetivo es aumentar al máximo el período de transferencia del cultivo.
 Técnicas del cultivo in vitro

• bajo condiciones de asepsia, de órganos o fragmentos de órganos

(meristemas, semillas, embriones somáticos, embriones cigóticos, hojas,
tallos, raíces, yemas, polen, anteras, callos o protoplastos).
• condiciones ambientales controladas:
• reducir la temperatura
• reducir las condiciones de luminosidad
• modificar el medio de cultivo
• adicionar al mismo inhibidores osmóticos o retardantes del crecimiento.
• deshidratadores de tejido o modificar la fase gaseosa del recipiente de
cultivo.
Métodos de conservación in vitro
Limitación de Supresión del
crecimiento crecimiento
• El crecimiento rápido de los cultivos a tasas
normales exige mas mano de obra y aumenta la
• Disminuye el riesgo de inestabilidad
posibilidad de perdidas. citogenética.
• Es necesario reducir al mínimo la frecuencia de los
subcultivos.
• Utilizando tejidos organizados
(meristemos, yemas).
• Puede controlarse los siguientes factores:
1. Temperatura • Temperatura -150°.
2. Nutrimentos inorgánicos y orgánicos
3. Reguladores de crecimiento
4. Concentración osmótica del medio.
 Limitaciones de crecimiento.

• Temperatura: la reducción de la temperatura ha sido el

recurso mas comúnmente utilizado para disminuir el
crecimiento de los cultivos.
• la mayoría de los cultivos in vitro son mantenidos entre 20 °C
y 30 °C.
• A temperaturas mas bajas el crecimiento disminuye.
 Limitaciones de crecimiento.

• Concentración de nutrimentos: la relación entre la

concentración de carbohidratos y los componentes
nitrogenados del medio nutritivo puede tener efectos sobre
las tasas de crecimiento y morfogénesis en los cultivos in
vitro.
• la sacarosa tiene igualmente un efecto en la viabilidad de los
cultivos:
• Concentraciones muy altas o muy bajas de ese azúcar
resultan nocivas para la conservación de tejidos in vitro.
 Limitaciones de crecimiento.
• Concentración de reguladores de crecimiento:
• Citoquininas
• Inhibidores de crecimiento (ac. abscisico)
Interaccionan con la sacarosa y temperatura de reserva: afectan la
viabilidad de los cultivos in vitro.

Reguladores de crecimiento empleados:

• ABA
• Cloruro de fosfonio
• Acido acetil salicílico.
 Limitaciones de crecimiento.

• Concentración osmótica: la limitación del crecimiento

por causa de la concentración osmótica se debe,
posiblemente, posiblemente a la reducción de absorción de
agua y de nutrimentos del medio.
Técnicas del cultivo
in vitro

Estas técnicas de
almacenamiento se realizan:
• a mediano plazo, es decir, se
basan en reducir el
metabolismo celular y con ello
reducir el crecimiento y el
número de subcultivos durante
meses hasta un año, sin que
ello afecte la viabilidad de los
cultivos.
Figura 1: Estrategias para la conservación de germoplasma de
paraíso (Melia azedarach L.), desarrolladas en el Laboratorio de
Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales. IBONE. Facultad de
Ciencias Agrarias. UNNE
Tipos de conservación in vitro en los
bancos genéticos.
Banco genético in vitro
activo
• Los cultivos se mantienen en
crecimiento lento.
• Esta desarrollado, en alto grado, para
las especies de yuca, papa, batata,
banano y caña de azúcar.
• Constituye una gran colección de
trabajo.
Banco genético in vitro
básico.
• Los cultivos son crioconservados.
• Constituye una colección básica:
conservada en plazos largos y no
activa o de trabajo.
• Permite un mantenimiento total de la
estabilidad genotípica del
germoplasma.
 e l a
es d
t a n t .
p o r v it r o
s i m n in
e c t o c i ó
As p e r va
n s
co
 Regeneración

• Es a menudo el paso que limita la aplicación de técnicas de

cultivo in vitro a especies vegetales que no se pueden
propagar mediante meristemas preformados.

REGENERACION ADVENTICIA (embriogénesis somática).

• Ofrece altas tasas de multiplicación y produce propágulos que
poseen ejes de raíz y yema.
 Viabilidad

Se debe realizar sistemáticamente. Las características mas

importantes que se evalúan en el almacenamiento de crecimiento
lento son:
• Contaminación
• Senescencia de la hoja (la razón hojas verdes/hojas muertas).
• Numero de brotes verdes (para micro propagación adicional).
• Numero de nudos viables (verdes).
• Presencia o ausencia de raíces.
 Control de la viabilidad de las
semillas
• El objetivo: detectar la pérdida de viabilidad durante el almacenamiento, antes de
que se reduzca por debajo del umbral para la regeneración (85%). Para el caso de
especies locales se puede establecer un umbral más bajo, como el 70%.
• Pruebas iniciales de viabilidad de las semillas, a fin de conocer la calidad de las
mismas, a excepción de aquellas muestras en las que se dispone de pequeñas
cantidades de semillas, ya que éstas se dedican en su totalidad a la regeneración.
• las semillas se someten a pruebas de viabilidad antes de su almacenamiento, a fin
de detectar problemas durante el proceso de multiplicación y acondicionado.
• Para las pruebas de germinación se utiliza para cada especie, o grupo de especies,
los protocolos normalizados de la Asociación Internacional de Análisis de Semillas
(ISTA).
 Estabilidad genética

• El material recuperado de la conservación in vitro debe

representar genéticamente al material utilizado.
 Sistematización de la información
Un banco genético in vitro debe mantener y actualizar continuamente una base de
datos computarizada que contenga información relacionada con todos los aspectos de
conservación in vitro con las áreas de investigación asociadas.

La base de datos contiene información como:

• Pasaporte
• Caracterización genotípica
• Indización de enfermedades
• Micropropagacion
• Intercambio internacional
• Equipo y suministros
• Entre otros.
 CRIOCONSERVACION

La Crioconservación consta de seis pasos:

1.- Selección del material a crioconservar:
Cuando se realiza la selección del material a crioconservar, se
debe tener la absoluta seguridad de que a partir del mismo se
obtienen plantas completas. El explante seleccionado depende
del objetivo de conservación y está estrechamente
relacionado con el tipo de propagación de la especie.
2.-Deshidratación:
La deshidratación del explante es un paso crucial para el éxito
de la crioconservación, ya que es necesario eliminar toda el
agua libre presente en el tejido vegetal, minimizando así las
posibles pérdidas por congelación. La deshidratación del tejido
puede realizarse en una cámara a 0ºC o en cámaras
herméticamente cerradas.
3.- Aclimatación:
La aclimatación se puede realizar en forma rápida o lenta. La
aclimatación rápida consiste en colocar el explante
directamente en el nitrógeno líquido, con o sin la adición
exógena de crioprotectores; mientras que la aclimatación lenta
se realiza bajando gradualmente la temperatura (00.1-
3ºC/min.).
4.- Almacenamiento:
De acuerdo al material vegetal que se utilice,se presenta dos
grandes sistemas:
-Sistemas Secos: comprende todos aquellos tejidos
vegetales endógenamente resistentes y tolerantes a las bajas
temperaturas y a la deshidratación.
-Sistemas Hidratados : son todos aquellos tejidos vegetales
no tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratación por
lo que se requiere una protección exógena.
5.- Descongelamiento y Rehidratación:
Cuando se desea recuperar al explante del nitrógeno líquido,
se puede realizar un descongelamiento rápido a Baño María
(generalmente 1-2 min. a 30 ó 40 ºC) o en forma lenta
sometiendo al explante a temperatura de laboratorio o a una
corriente de aire en el flujo laminar de aire estéril.
6.- Test de viabilidad:
Los test de viabilidad nos permiten comprobar las zona/s del
tejido que ha/n muerto y cual/es ha/n sobrevivido al frío.
En la última década, han surgido numerosas técnicas que
combinan el uso de crioprotectores y de soluciones de vitrificación
con técnicas de deshidratación y encapsulación, las cuales
básicamente pueden resumirse en técnicas de:
- Encapsulación-Deshidratación
-Vitrificación
-Encapsulación-Vitrificación
- Desecación
- Precultivo
- Precultivo-Desecación
- Gotita Congelada.