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BIOTECNOLOGIA VEGETAL

Isidro E. Suárez, Ph. D.

UNIVERSIDAD DE CORDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRICOLAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA AGRONÓMICA Y DESARROLLO
RURAL
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA APLICADA PARA EL CARIBE - IBAC
2020
MEDIOS PARA CULTIVO
DE TEJIDOS VEGETALES

Isidro E. Suárez, Ph. D.

UNIVERSIDAD DE CORDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRICOLAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA AGRONÓMICA Y
DESARROLLO RURAL
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA APLICADA PARA
EL CARIBE - IBAC
2020
MEDIO DE CULTIVO
– Sustrato: Material del cual las plantas toman agua y nutrientes.
– Medio de cultivo: Fuente de nutrición e hidratación para el
desarrollo de las plantas cultivadas in vitro.
– Brinda soporte de acuerdo con el proceso morfogenético.
– Formulación: Combinación de componentes que varían con las
características del explante y el proceso morfogenético que se
desea inducir.
– Debe contener todas las sustancias requeridas por una planta
intacta para su crecimiento y desarrollo.
COMPONENTES DE UN
MEDIO DE CULTIVO

– Agua.

– Compuestos inorgánicos.

– Compuestos orgánicos.

– Materiales de soporte.
AGUA
• Tejidos vegetales = >90% agua.

• Constituye mas del 95% del medio


de cultivo y es el solvente de todos
los solutos presentes en el medio.

• Agua potable corriente (consumo)


contiene disueltos orgánicos e
inorgánicos, partículas de diversa
naturaleza y microorganismos que
pueden afectar la calidad del medio.

• Necesario utilizar mecanismos que


permitan alcanzar un alto grado de
pureza del agua corriente antes de
ser utilizada para las preparaciones
de medios.
DESTILACIÓN
• Método de purificación de agua
mas común y utilizado.

• Destilador: Equipo relativamente


económico y fácil de manejar.

• Agua destilada y almacenada para


su posterior uso.

• Eficiencia reducida: Solo el 5% del


agua utilizada en el proceso es
usada.

• El equipo requiere de
mantenimiento permanente.
DESIONIZACIÓN
• Remueve contaminantes
capturándolos con base en su carga
eléctrica.
• Agua pasa a través de unas columnas
con resinas con diminutas esferas
plásticas con iones- de hidrógeno (H+)
e hidróxido (OH ), los cuales son
intercambiados por contaminantes
catiónicos o aniónicos presentes en el
agua.
• El proceso es continuo. Agua fluye a
través de las columnas. No hay
necesidad de almacenar agua.
• No elimina contaminantes orgánicos.
• Requiere de mantenimiento
permanente por crecimiento de
hongos y bacterias.
OSMOSIS REVERSA
• Paso del agua a través de
membranas semipermeables.

• Remueve un 100% de sólidos


en suspensión, 99.5% de
bacterias y virus y mas de
90% de contaminantes
orgánicos e inorgánicos.

• Se puede combinar con otros


medios de purificación.
COMPONENTES DE UN
MEDIO DE CULTIVO

– Agua.

– Compuestos inorgánicos.

– Compuestos orgánicos.

– Materiales de soporte.
COMPUESTOS INORGÁNICOS

Los compuestos
inorgánicos son todos
aquellos minerales
importantes para el
desarrollo de la planta,
y se denominan como
los macroelementos y
los microelementos.
COMPUESTOS INORGÁNICOS

• Nitrógeno (N):
– Es un componente de los ácidos nucleicos y aminoácidos y es un regulador del pH en el medio.
– Su deficiencia produce cultivos cloróticos y de tamaño reducido.
– Se suministra al medio en forma de amonio (NH4+) y nitrato (NO3-).

• Fósforo (P):
– Es abundante en zonas meristemáticas y es componente de las moléculas de ADN y ATP.
– Los cultivos deficientes en fósforo tienen tamaño reducido y coloración rojiza.
– Se adiciona al medio en forma de fosfato de potasio (KH2PO4) o fosfato de sodio (NaH2PO4).

• Potasio (K):
– Promueve el crecimiento del tejido meristemático.
– Actúa como osmoregulador y regula el pH.
– Se agrega al medio de cultivo en forma de fosfato de potasio (KH2PO4) o cloruro de potasio (KCl).
COMPUESTOS INORGÁNICOS
• Magnesio (Mg):
– Es un componente de la molécula de clorofila y actúa como activador enzimático.
– Su deficiencia se observa en la clorosis de hojas maduras.
– Se agrega al medio en forma de sulfato de magnesio (MgSO4 7H2O).

• Azufre (S):
– Es componente de algunas proteínas y enzimas.
– Su deficiencia se observa en forma de hojas cloróticas.
– El azufre es suministrado al medio en forma de compuestos a base de sulfatos (SO4).

• Calcio (Ca):
– Es elemento componente de la pared celular y en la planta promueve la formación de raíces.
– En cultivo de tejidos su deficiencia puede causar muerte de meristemos (Ápices caulinares).
– Se agrega al medio de cultivo en forma de cloruro de calcio (CaCl2 + 2H2O) o como nitrato de calcio
(Ca(NO3)2).

• Cloro (Cl):
– Este elemento actúa como un osmoregulador y componente del fotosistema II de la fotosíntesis.
– Es adicionado al medio en forma de compuestos a base de cloruros (Cl2-).
COMPUESTOS INORGÁNICOS
• Manganeso (Mn):
– Este elemento es un componente de la membrana de los cloroplastos y su deficiencia se observa en
plantas adultas en forma de moteados.
– Es suministrado al medio en forma de sulfato de manganeso (MnSO4 H2O).

• Zinc (Zn):
– Tiene diversas funciones, entre ellas la de actuar como activador enzimático de la clorofila.
– Se suministra al medio en forma de sulfato de zinc (ZnSO4 7H2O).

• Boro (B):
– Es un elemento menor que al parecer funciona en el transporte de azucares, la estructura de la
membrana celular y en el metabolismo del ácido fenólico.
– Es suministrado al medio en forma de ácido bórico (H3BO3).

• Cobre (Cu):
– El cobre interviene en la síntesis de clorofila y en la transferencia electrónica.
– Se adiciona al medio en forma de sulfato de cobre (CuSO4 5H2O).
COMPUESTOS INORGÁNICOS
• Sodio (Na):
– Es un elemento que actúa como osmoregulador y confiere tolerancia a la salinidad en algunos tipos de
plantas.
– Se adiciona al medio de cultivo en forma de compuestos a base de sodio (Na+).

• Molibdeno (Mo):
– Se cree que interviene en la fijación del N en amonio.
– Es agregado en el medio como molibdato de sodio (Na2MoO4 2H2O).

• Cobalto (Co):
– Es un elemento componente de la Vitamina B12 e interviene en la síntesis de ácidos nucleicos.
– Es agregado al medio de cultivo en forma de cloruro de cobalto (CoCl2 6H2O).

• Hierro (Fe):
– Está involucrado en la síntesis de clorofila y en las reacciones de óxido/reducción que se suceden en los
cloroplastos y mitocondrias, entre otras observándose su deficiencia en hojas con apariencia clorótica.
– El hierro es adicionado al medio mezclando sulfato ferroso (FeSO4 7H2O) con la sal disódica del ácido
etilendiaminatetraacético (EDTA) formando el quelato de hierro.
COMPONENTES DE UN
MEDIO DE CULTIVO

– Agua.

– Compuestos inorgánicos.

– Compuestos orgánicos.

– Materiales de soporte.
COMPUESTOS ORGÁNICOS

• Compuestos conformados por


moléculas con átomos de carbono
enlazados covalentemente con otro
átomo de carbono o hidrógeno.

• Son usualmente de naturaleza


natural, aunque algunos son
sintetizados en los laboratorios.

• Carbohidratos o fuentes energéticas,


vitaminas, reguladores de crecimiento
y otros suplementos.
COMPUESTOS ORGÁNICOS

• Carbohidratos o fuentes
energéticas

– Las plantas son organismos


autótrofos.

– Luz artificial es insuficiente para


generar fotosíntesis.

– En condiciones in vitro, necesitan de


una fuente externa de carbohidratos
para poder crecer y desarrollarse
(heterótrofos).

– La mayoría de los medios deben ser


suplementados con compuestos que
actúan como fuentes de energía.
CARBOHIDRATOS O
FUENTES ENERGÉTICAS

• Sacarosa:
– Es un disacárido compuesto por fructosa y glucosa (C12H22O12).
– Se adiciona al medio en forma de azúcar común y casi siempre en una
concentración de 30 g L-1.
– Es el mas utilizado por su costo y fácil consecución.

• D-Manitol:
– Azúcar que se utiliza para regular el potencial osmótico del medio.
– Se utiliza frecuentemente cuando se cultivan protoplastos.

• D-Sorbitol:
– No usada frecuentemente como fuente energética.
– Tiene la particularidad de ser transportada a través del floema.
VITAMINAS

• Compuestos necesarios en el metabolismo de ciertos procesos de las plantas.

• Las plantas en condiciones normales producen su propio suplemento


vitamínico.

• Células aisladas, tejidos y plantas cultivadas in vitro requieren de suplementos


externos de vitaminas.

• En los inicios se adicionaban en conjunto con otros nutrientes a partir de


compuestos indefinidos tales como jugos de frutas o ciertos extractos.

• En la actualidad son suplidas en forma individual al medio de cultivo.


VITAMINAS
• Tiamina (Vitamina B1):
– Es un cofactor que actúa en el ciclo de los ácidos orgánicos de la respiración (Ciclo de Krebs).
– Es un componente regular de la mayoría de los medios de cultivo.

• Mio-inositol:
– Es un constituyente del complejo B de vitaminas y componente regular de todos los medios de cultivo.
– Aunque no es estrictamente necesario, los cultivos desarrollan mejor en presencia de éste.

• Acido nicotínico (Niacina o Vitamina B3):


– Es un componente de las enzimas que actúan en la reacciones activadas por la luz.
– Su uso es menos común que la tiamina.

• Acido ascórbico (Vitamina C):


– Es usado mas frecuentemente como un antioxidante en cultivos de especies que producen grandes
cantidades de fenoles in vitro.
– Constituyente de medios de cultivo para plantas leñosas.
REGULADORES DE
CRECIMIENTO VEGETAL (RCV)

• Compuestos naturales (hormonas) o sintéticos, que afectan el crecimiento y


desarrollo de las plantas a concentraciones muy bajas.

• Las plantas completas producen por si mismas las necesidades de hormonas


requeridas; los tejidos y plantas in vitro generalmente no producen las
cantidades necesarias.

• Las hormonas o reguladores de crecimiento mas comúnmente usados en


cultivo de plantas in vitro son las auxinas, citocininas, giberelinas, el ácido
abscísico y, muy pocas veces, el etileno.
AUXINAS
• Estimulan la dominancia apical, el
crecimiento y división celular, desarrollo
meristemático, inducción de raíces
adventicias y formación de embriones
somáticos.
• Hormonas: ácido indolacético (AIA) y
ácido indolbutírico (AIB), producidas en
los ápices foliares y se desplazan en
forma basipétala a la raíz.
• Sintéticos: Acido naftalenoacético (ANA),
ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y
picloram.
• Usos: IBA, ANA (enraizamiento y
organogénesis). 2,4-D y el picloram
(Inducción de tejidos embriogénicos).
• AIA menos utilizado por su facilidad de
ser degradado enzimáticamente y por la
incidencia de luz..
CITOCININAS
• Interrumpen la dominancia apical,
promueven división celular y desarrollo de
yemas (axilares) y retardan la
senescencia de hojas.
• Sintetizadas en los ápices radicales y se
desplazan hacia los ápices en forma
acropétala.
• Hormonas: Zeatina y el 2-isopentenil
adenina (2iP)
• Sintéticos: Benzilaminopurina (BAP o
BA), la kinetina y el tidiazuron (TDZ).
• BAP: Mas utilizada en cultivo in vitro,
especialmente en la multiplicación de
meristemos y organogénesis.
• Tuidiazuron utilizado en desarrollo de
embriones somáticos.
GIBERELINAS
• Promueven el alargamiento de los
entrenudos de la planta mediante la
inducción de la división y elongación
celular.
• La síntesis en plantas completas ocurre
principalmente en las hojas jóvenes.
• Mas utilizado es el ácido giberélico (GA3),
aunque existen mas de 100 compuestos
similares.
• Promueve la elongación de tallos
micropropagados; inhibe la formación de
nuevos tallos y raíces, y la inducción de
tejidos embriogénicos.
• Su estructura es afectada por el calor, por
lo que es mejor esterilizar a través de
filtración.
ACIDO ABSCÍSICO
• Controla la apertura y cierre de
estomas, inhibe la elongación y
división celular, promueve cierto grado
de abscisión de órganos e induce la
dormancia de las semillas.

• Su sitio de origen son las raíces y las


hojas adultas desde donde se
desplaza a sus sitios de acción.

• Inhibe la formación de callo y favorece


la maduración de embriones somáticos
y la formación de estructuras de
reserva (cormos y túberos).

• No es soluble en agua por lo que debe


ser diluido en etanol.
ETILENO
 Es un gas sintetizado a partir de la
metionina.

 Se produce en la mayoría de los tejidos


vegetales por estrés y es autocatalítico.

 Induce la senescencia y abscisión de


hojas y flores, la formación de raíces
adventicias y elimina la dormancia de
semillas y yemas.

 No es necesario ni conveniente su
presencia en condiciones in vitro.

 Intercambio gaseoso y la no generación


de calor en los tejidos es preferible para
evitar su acumulación.
COMPONENTES DE UN
MEDIO DE CULTIVO

– Agua.

– Compuestos inorgánicos.

– Compuestos orgánicos.

– Materiales de soporte.
MEDIO DE CULTIVO
• Compuesto en el cual se encuentran
en solución todos los compuestos
orgánicos e inorgánicos para la
nutrición vegetal.

• Estados del medio:


– Líquido: Formulación del medio disuelta en
agua sin ningún tipo de medio de soporte.

– Semi sólido: Suplementado con agentes


gelatinizantes que proporcionan cierta
dureza para el sostenimiento de las plantas.

– Doble fase: Una fase semisólida adicionado


con una líquida en la parte superior.

• Agentes gelatinizantes: Proporcionan


la dureza a los medios semisólidos
($$$).
AGAR
• Agente gelatinizante mas usado
• Mezcla compleja de polisacáridos
extraídos de algas rojas que se disuelven
a 100 °C y solidifican a 45 °C.
• No es digerido por las enzimas vegetales
y no reacciona con los componentes del
medio.
• Permite sostener los cultivos en su sitio y
el flujo de nutrientes del medio hacia
éstos.
• Conveniente usar agar con alto grado de
pureza y que esté manufacturado para
cultivo de tejidos (TC-Agar).
• Concentración de 0.6 a 0.8% (6 a 8 g L-1)
es suficiente para lograr una consistencia
adecuada.
PHYTAGEL

• Polímero natural derivado de la


fermentación de la bacteria
Pseudomonas elodea.

• Contiene cantidades
significativas de potasio, sodio,
calcio y magnesio, aunque no
son perjudiciales.

• Mayor pureza y mas


transparencia que el agar.
PREPARACION DE MEDIOS DE
CULTIVO
FORMULACIONES DE MEDIO

• Cantidades de componentes (sales) diluidos en proporciones específicas.

• La mayoría de las formulaciones fueron desarrolladas en la década de los 60’s y difieren


básicamente en la concentración de las sales que utilizan.

• Murashige y Skoog (1962): Mas utilizada a nivel mundial. Tiene un contenido alto de sales.

• Gamborg et al. (1968) también conocida como B5; contiene menor concentración de sales y
es utilizada preferiblemente en el cultivo de callos, células y protoplastos.

• White (1963): Cultivo de raíces. Baja concentración de sales.

• Nitsch & Nitsch (1969): Cultivo de anteras. Menos sal que MS pero mas que White.

• WPM (Loyd y McCowns, 1980): Exitoso en plantas leñosas.

• La selección de una determinada formulación de medio de cultivo es resultado de la


experimentación y desarrollo de los explantes.
FORMULACIONES DE MEDIOS
FORMAS DE PREPARACION

– Pesar y agregar todos los componentes de forma individual al momento


de preparar la formulación: (Pequeñas cantidades pesaje complicado).

– Formulaciones premezcladas:
• Cantidades específicas para determinada cantidad de agua.
• Facilidad de preparación.
• Permite manejar concentraciones.

– Preparaciones soluciones madres o stock (Soluciones concentradas).


SOLUCIONES MADRES O STOCK

– Dilución de las sales componentes del medio de cultivo a concentraciones muy


altas.

– Permiten tomar una determinada cantidad, diluirlas en agua hasta completar la


concentración y el volumen total de medio requerido.

– Generalmente se preparan a una concentración 10 a 100 veces (10X a 100X)


mayor a la concentración final del medio.

– 10X = 100 ml de solución stock en 1 L de agua para concentración final.

– 100X 10 ml de solución stock en 1 L de agua para concentración final.


SOLUCIONES MADRES O STOCK

– La preparación es relativamente fácil.

– Disminuye costos.

– Facilita el pesaje de componentes que se agregan en pequeñas


cantidades.

– Permite alterar las concentraciones de los ingredientes.


SOLUCIONES MADRES O STOCK

– Los elementos se agregan en cantidades milimolares (mM), tales como


N, P, K, Na, S, Cl y Ca.

• Se preparan en un stock separado a una concentración 10X

– Microelementos se agregan en cantidades trazas o micromolares (µM),


Mn, B, Cu, Mo, Co y Fe.

• Se preparan a una concentración 100X.


CÁLCULO DE CANTIDADES

– Generalmente, la mayoría de los medios de cultivo expresan las


cantidades de sus componentes en unidades de masa (mg).

– Esto en muchos casos no refleja la diferencia que puede existir entre


compuestos análogos pero que difieren en sus estructuras moleculares.

– Efecto de una sustancia es el resultado del número de moléculas


presentes en el medio y no de su peso.

– Especialmente crítico cuando se comparan efecto de reguladores de


crecimiento.
CALCULO DE CANTIDADES
– Cantidades de ingredientes generalmente se miden en masa (g)

– Para efectos de comparar efectos, cantidades deben ser en términos de


moléculas.

– Mol = peso de masa (g)/Peso molecular.

– 1 Mol de un compuesto es igual a: Número de Avogadro = 6.023 x 1023

– Molaridad: 1 litro de solución que contiene 1 mol de una sustancia se


denomina 1 molar (1M o 1 mol por litro).

– 1 M = 1000 mM, 1 mM = 10-3 M, 1 µM = 10-6 M, 1 mM = 1000 µM.


FORMULAS

– Molaridad (M) = g L-1 / Peso molecular (g).

– Milimoralidad (mM) = mg L-1 / Peso molecular (g).

– Micromolaridad (µM)= µg L-1 / Peso molecular (g).

– Ejemplo: Si quiero comparar el efecto comparativo de 1 mM de Bap


y Kinetina. Cuantos mg de cada uno debo agregar??
pH
• pH del medio es importante por que:
– Condiciona la solución de las sales en el
medio.
– Influye en la toma de los componentes del
medio (Especialmente RCV).
– Afecta la dureza del agar.

• Rango de pH antes de autoclave: 4,5 –


6,0 (Promedio: 5,7).

• Tejidos toman nutrientes a un pH


relativamente ácido.

• pH debe ajustarse antes de someter a


esterilización.

• Esterilización por autoclave altera valor


de pH.
ESTERILIZACION Y pH
ESTERILIZACION Y VOLUMEN
• Esterilización en autoclave: 121° C y 1,05 Kg cm-2.

• Tiempo de esterilización depende del volumen de medio en el


recipiente.
ESTERILIZACION
• Esterilización por filtración
– Compuesto sensibles a
altas temperaturas: GA,
ABA, tiamina, antibióticos.

• Filtros 0,22 µM.

• Filtra bacterias, hongos y


mayoría de partículas
virales.
MECANISMOS DE SOPORTE
• Recipientes
– Medio semisólido
• Tubos de ensayo
• Frascos de vidrio (mayonesa,
compotas, etc).
• Cajas de petri
• Recipientes polipropileno.
• Frascos pequeños ampollas.

– Medio líquido
• Erlenmeyers.
• Cajas de petri.
• Tubos de ensayo (Puentes de
papel filtro).
SELLANTES Y CUBIERTAS

• Tapas o cubiertas
– Papel aluminio.
– Tacos de algodón.
– Plásticas.
– Membrana de intercambio.

• Sellantes
– Parafilm.
– Nescofilm.
– Cristaflex.

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