COMISIÓN FEDERAL DE ELECTRICIDAD

DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN UNA

MUESTRA DE AGUA POR EL MÉTODO DE FILTRAClÓN POR MEMBRANA

GUÍA
CFE 10100-14

AGOSTO 1997

MÉXICO
 GUÍA
DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN UNA MUESTRA
DE AGUA POR EL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA CFE 10100-14

P R E F A C I O

Esta guía ha sido elaborada de acuerdo con las Bases Generales para la Normalización en CFE. La propuesta
inicial fue preparada por la Gerencia de Estudios de Ingeniería Civil.

Revisaron y aprobaron la presente guía las áreas siguientes:

COORDINACIÓN DE PROYECTOS TERMOELÉCTRICOS

GERENCIA DE ESTUDIOS DE INGENIERÍA CIVIL

GERENCIA DE LAPEM

GERENCIA DE PROTECCIÓN AMBIENTAL

SUBDIRECCIÓN DE GENERACIÓN

El presente documento normalizado entra en vigor a partir de la fecha abajo indicada y será actualizado y revisado
tomando como base las observaciones que se deriven de la aplicación del mismo. Dichas observaciones deben
enviarse a la Gerencia de LAPEM, cuyo Departamento de Normalización coordinará la revisión.

Esta guía revisa y sustituye a todas las relacionadas con determinación de coliformes totales y fecales en una
muestra de agua por el método de filtración por membrana que se hayan publicado dentro del campo de aplicación
de la presente.

AUTORIZO:

:
DR. RAÚL FUENTES2AMANIEGO
SUBDIRECTOR TÉCNICO

NOTA: Entra en vigor a partir de: 970930

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0 INTRODUCCIÓN

La Comisión demanda dentro de sus programas de control y vigilancia de las fuentes de abastecimiento de agua
en sus instalaciones y proyectos, determinar la calidad física, química y bacteriológica de la misma.

El presente documento establece la metodología para determinar las condiciones bacteriológica del agua por el
método de filtración en membrana de los parámetros coliformes totales y fecales.

1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta especificación establece la determinación de coliformes totales y fecales en una muestra de agua por el
método de filtración por membrana, aplicándose en los estudios de control y vigilancia de las fuentes de
abastecimiento, aguas de operación y residuales de los proyectos y centrales de generación eléctrica de la
Comisión.

2 NORMAS QUE SE APLICAN

NMX-AA-102-1987 Calidad del Agua-Detección y Enumeración de

Organismos Coliformes, Termotolerantes y Escherichia
Colipresuntiva-Método de Filtración en Membrana.

3 REQUISITOS

Los requisitos necesarios para la aplicación de esta especificación, comprende contar con equipo especializado
y con el personal capacitado adecuadamente. Estos puntos se cubren de la forma siguiente:

3.1 Equipo Necesario

La técnica de filtración en membrana requiere de equipo especializado, con la ventaja de ser de fácil transportación,
lo que hace factible realizar la determinación de estos parámetros en cualquier punto del país respetando el factor
tiempo toma de muestra-análisis lo que permite obtener mejores resultados. El equipo necesario para la aplicación
de ese método es:

3.1 .1 Incubadoras bacteriológicas

Se consideran de dos tipos, de campo y laboratorio, la primera debe tener la característica de utilizar opcionalmente
corriente directa y alterna.

Para esta determinación se utilizan 2 incubadoras, una calibrada a 35°C para coliformes totales y otra calibrada a
44,5ºC para coliformes fecales.

En el caso de coliformes fecales en el laboratorio, es posible utilizar también un baño maría bacteriológico con
agitación a 44,5ºC protegiendo cada caja Petri de prueba con una bolsa de plástico sellada.

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3.1.2 Sistema de filtración

El sistema de filtración de esta técnica comprende las siguientes piezas.

a) Bomba de vacío manual o mecánica.

b) Soporte de vacío matraz Kitasato o tren de filtrado.

c) Soporte de membrana de acuerdo al modelo del embudo de filtración, con una superficie igual
o mayor a 48 mm.

d) Embudo de filtración equivalente al modelo del soporte de membrana, puede ser de acero
inoxidable, plástico o vidrio.

e) Mechero de gas o lámpara de alcohol.

f) Botellas o tubos con agua de dilución.

g) Membranas bacteriológicas cuadriculadas, estériles 47 mm de diámetro y poro de 0,45 µm.

h) Pinzas bacteriológicas de acero inoxidable.

i) Caja Petri desechable o vidrio de 50 mm individual o 120 mm múltiple.

j) Marcador para señalar en cada caja Petri, la identificación de la muestra y las condiciones de
volumen filtrado.

k) Formato de control para señalare1 punto de toma de muestra, fecha de siembra, volumen filtrado
y resultados obtenidos.

3.2 Personal Capacitado

La capacitación del personal que desarrolla esta técnica comprende.

a) Identificación del equipo y materiales utilizados.

b) Dominar el desarrollo de la técnica, con la experiencia para determinar el volumen o dilución a

filtrar en cada tipo de muestra.

c) Identificar y contar las colonias típicas obtenidas.

d) Aplicar correctamente el factor volumen y dilución utilizados, para dar el resultado final.

4 DEFINICIONES

4.1 Análisis o Examen Bacteriológico del Agua

Con este análisis se detecta la presencia de microorganismos en el agua, y su alcance puede llegar hasta el
aislamiento e identificación de algunas especies en particular. Para Comisión lo anterior se limita a la determinación
de los organismos indicadores de contaminación más utilizados como son coliformes totales y de origen fecal.

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4.2 Microorganismos Indicadores

La gran variedad de bacterias patógenas que pueden encontrarse en una muestra de agua, así como la complejidad
de la mayor parte de las técnicas de enriquecimiento y aislamiento, hace inviable el control rutinario de todos
aquellos microorganismos con importancia sanitaria. Esto ha hecho necesario elegir unos microorganismos
indicadores, que deben cumplir los requisitos siguientes:

a) Ser fáciles de aislar y cultivar en el laboratorio.

b) Ser relativamente inocuos para el hombre y animales.

c) Su presencia en el agua debe estar relacionada, cualitativa y cuantitativamente, con la de otros

microorganismos, patógenos y/o de aislamiento más difícil.

4.3 Coliformes Totales y Fecales

Los coliformes son grupos de bacterias habitantes de la región intestinal de los mamíferos y aves. Este grupo de
microorganismos, perteneciente ala familia de las enterobacterias, se caracteriza por su capacidad de fermentación
de la lactosa a 35 a 37°C. Los géneros que componen el grupo de los coliformes son: Escherichia, Klebsiella,
Enterobacter, Serratia, Citrobactery Edwardsiella. Todos los coliformes pueden existircomo saprófitos independientes
o como microorganismos intestinales, excepto el género Escherichia, que sólo puede tener origen fecal. Esto ha
hecho necesario distinguir entre coliformes totales (grupo que incluye a todos los coliformes de cualquier origen)
y coliformes fecales (término que designa a los coliformes de origen exclusivamente intestinal, es decir, al género
Escherichia). De entre todos los coliformes, sólo el género Escherichia, y ocasionalmente Klebsiella, tienen la
capacidad de fermentar la lactosa no sólo de 35 a 37ºC, sino también a 44,5ºC. Así, sólo la presencia de coliformes
fecales, cultivados a 44,5ºC nos confirma la existencia de una contaminación microbiológica de origen fecal,
mientras que la presencia de coliformes totales cultivados a 35ºC, sólo nos indica la existencia de contaminación
sin informar sobre su origen.

4.4 Filtración por Membrana

Consistente en hacer pasar por una membrana estéril regularmente de celulosa y con un tamaño de poro de
0,45 µm utilizando vacío, un volumen estimado de muestra o de dilución de la misma, que permita obtener
resultados con una mayor precisión. Este punto indica que si los resultados que se esperan son bajos, al aumentar
el volumen de muestra a filtrar, aumenta la probabilidad de atrapar los organismos presentes en el agua. Al trabajar
con dilución, los volúmenes obtenidos para la filtración, no se limitan a un volumen determinado, sino que también
es posible seleccionarlo y así utilizar de una mejor forma la dilución obtenida.

Es importante mencionar que la técnica de filtración por membrana se habla siempre de números reales. La técnica
tiene un alto grado de reproducibilidad, permite analizar muestras relativamente mayores que los tubos múltiples
(método NMP=número más probable) y proporciona resultados definitivos con mayor rapidez que éstos.

1 Otras ventajas que se tienen al utilizar este método son:

a) Tiene mayor grado de precisión.

b) Permite la filtración de muestras en el campo y el traslado de las membranas al laboratorio en

medios de conservación.

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c) Es de utilidad en situaciones de emergencia, para informar en un plazo no mayor de 24 h y poder

aplicar con rapidez los tratamientos correctivos.

d) Esta especialmente indicando en las aguas mineralizadas que provocan falsas reacciones en
la colimetría en medios liquidos.

e) A diferencia de otros métodos de análisis bacteriológicos, el método de filtración por membrana

permite seleccionar el volumen de muestra que proporcione una mayor seguridad en los
resultados obtenidos.

El costo de los análisis es menor y además hay ahorro de material, personal y espacio en el
laboratorio.

4.5 Organismo 0 Colonia

Normalmente, las unidades utilizadas para expresar resultados bacteriológicos, son organismos/100 ml, el utilizar
la unidad colonias/100 ml, es 100% equivalente. En la técnica de membrana, se obtienen lecturas de número de
colonias, pero si observamos que cada colonia obtenida tiene su origen en un organismo atrapado durante el
proceso de filtración, resulta que cada organismo forma una colonia con lo cual resulta equivalente dar una unidad
u otra.

4.6 Incubadoras

Equipo diseñado para que permita mantener una temperatura deseada en forma constante, permitiendo elegir las
condiciones de ambiente adecuadas para realizar la selectividad portemperatura en el crecimiento de las diferentes
clases de microorganismos estudiados.

4.7 Medio Bacteriológico

Se puede considerar como un reactivo formulado con elementos orgánicos alimenticios como azúcares, elementos
indicadores y ajustadores de pH, que permiten dar selectividad al permitir sólo el desarrollo de algunas especies
de organismos.

4.8 Estéril

Indica que el material o reactivos que se utilizan, se encuentran libres de organismos de cualquier especie.

Las técnicas de esterilización varían desde el uso de autoclave, calor seco, gases como óxido de etileno hasta el
uso cada días más generalizado de luz ultravioleta.

5 CARACTERÍSTICAS

Se aplica el método de filtrado por membrana de acuerdo a la norma NMX-AA-102.

5.1 Toma de Muestras

La muestra para el análisis bacteriológico, se colecta en un frasco o bolsa estéril, con un volumen aproximado de

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Es necesario cuidar que la toma se lleve a cabo en condiciones aséptica, evitando la contaminaciónãel recipiente
utilizado, con las manos o cualquier objeto no estéril. El análisis de la muestra tomada, debe realizarse dentro de
las siguientes 6 h para asegurar un mejor resultado, la muestra debe mantenerse en refrigeración de 4 a 10°C
durante su traslado.

5.2 Calibración de Incubadoras

Para esta determinación, se utilizan 2 incubadoras bacteriológicas, la primera se utiliza para coliformes totales que
requiere una temperatura de incubación de 35ºC, la segunda para coliformes de origen fecal se estabiliza a 44,5ºC,
se recomienda en este caso abrir la incubadora antes de introducir las pruebas para reducir la temperatura y evitar
al máximo un shock térmico.

5.3 Reparación de Medios bacteriológico

En la tabla 1 se puede observar la formulación de los medios bacteriológicos utilizados para estas determinaciones:

M-ENDO coliformes totales

M-FC Coliformes fecales

Estos medios se pueden adquirir en el mercado ya formulados para su preparación de la forma siguiente.

5.3.1 Medio M-ENDO coliformes totales

Preparación de 100 ml para 45 a 50 caja Petri a 50 mm.

a) Se pesan 4,8 g de medio M-Endo preparado.

b) Se agregan 100 ml de agua.

c) Se agrega 2,0 ml de alcohol etílico.

d) Se agrega 1,5 g de agar bacteriológico.

e) Se calienta casi a ebullición para disolver el agar.

f) Se enfria y se vierte sobre cada caja Petri individual el equivalente a 2 ml se deja enfriar hasta
la solidificación, se cierran y se cubren con papel aluminio y se colocan en refrigeración de 4 a
10°C.

5.3.2 Medio M-FC coliformes fecales

Preparación de 100 ml para 45 a 50 cajas Petri de 50 mm.

a) Se pesan 3,7 g de medio M-CF preparado.

b) Se agregan 100 ml de agua.

c) Se agrega 1 ml de solución de ácido rosólico al 1, 0 % en NaOH 0,2 N.

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d) Se agrega 1,5 g de agar bacteriológico.

e) Se calienta casi a ebullición para disolver el agar.

f) Se enfría y vierte sobre cada caja Petri individual el equivalente a 2 ml, se deja enfriar hasta la
solidificación, se cierran y se cubren con papel aluminio, colocándose en refrigeración de 4ºa
10°C.

TABLA 1 - Formulación de medios bacteriológicos para la determinación de coliformes totales y fecales

Medio M-Endo

I Triptosa o polipeptona I 10,00 g I

Tiopeptona o totona 5,00g
Casitona 0 tripcasa 5.00 g

I Extracto de levadura 1 1,5g

Lactosa 12,5 g

Cloruro de sodio, NaCI 5,0 g

I Fosfato de hidrógeno potasio, k2 HPO4 I 4,375 g 1

Fosfato de dihidrógeno potasio, kH2 PO4 1,375 g

Lauril de sodio 0,05 g

I Desoxicolato de sodio I 0,10 g

Sulfito de sodio, Na2 SO3 2,10 g

Fuscina básica 1,05 g

Medio M-Fc

Triptosa o biosate 10,0 g

Proteosa peptona número 3 0 polipeptona 5,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Cloruro de sodio NaCI 5,0 g
Lactosa 12,5 g

I Sales biliares número 3 mezcla de sales biliares I 1,5 g

Azul anilina 0,1 g
I

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5.4 Selección de Volumen a Filtrar

Un punto importante en el desarrollo de este método es la selección del volumen a filtrar, de acuerdo a las
condiciones observadas del punto en estudio, se define el tamaño de muestra que se va ha utilizar.

En la tabla 2 se presentan los volúmenes recomendados para filtrar, según el tipo de muestra, para coliformes
totales y coliformes fecales.

TABLA 2 - Volumenes de agua recomendados para filtración según el punto en estudio

Origen del agua

Origen del agua

residuales efluente secundario

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5.5 Filtración de las Muestras

Una vez preparadas las cajas Petri y seleccionando el volumen a filtrar se aplican los siguientes pasos.

a) Se marca en cada caja Petri el número de muestra y el volumen filtrado.

b) Se esteriliza el embudo de filtración, en el caso de usar autoclave o calor directo, debe esperarse
a que este se enfríe.

c) Se coloca la membrana en el porta filtros utilizando la pinza bacteriológico estéril.

d) Se coloca el embudo de filtración.

l e) Se vacía el volumen de muestra y se Aplica el vacío.

f) Se retira el embudo de filtración.

g) Se toma la membrana con las pinzas, con las puntas estériles y se coloca sobre el medio
bacteriológico, se cierra la caja Petri.

5.6 Incubación

Las cajas Petri con las muestras procesadas, son introducidas en las incubadoras, cuidando colocarlas con el medio
y membrana en la parte superior, eso facilita la alimentación por capilaridad del medio a la membrana.

Las cajas con las pruebas de coliformes totales, son colocadas en incubación a 35°C durante 24 a 48 h
permitiéndose lecturas a las 24 horas.

Las cajas con las pruebas de coliformes fecales, se colocan en incubación a 44,5ºC durante las 24 horas.

5.7 Conteo de Resultados

En cada caso se cuentan las colonias típicas en cada medio.

a) Colonias obscuras con brillo metálico en el caso de coliformes totales, medio Endo.

b) Colonias azules en el caso de coliformes de origen fecal, medio MFC.

c) Para obtener el resultado final en cada caso, se aplica la siguiente formula.

COLONIAS DE COLIFORMES/100 ml = COLONIAS CONTADAS X 100

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ml DE MUESTRA FILTRADOS

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5.8 Hoja de Control

El formato 1 de control presentará la siguiente información para cada muestra.

a) Número de muestra.

b) Descripción del punto.

c) Fecha.

d) Volumen filtrado para las dos membranas.

e) Resultados en colonias/100 ml o organismos/100 ml.

Proyecto: Hoja : de:

Analizó: Fecha de elaboración:
ml muestra
utilizados
Coliformes Coliformes
Punto de Muestreo
No. fecales
(observaciones)
COL1100 ml COL/100 ml

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FORMATO 1 - Hoja de control

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