Guía de Laboratorio de Bioquímica y Microbiología PI721-A UNI FIQT DAIQ

Práctica N◦ 1

DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE
CARBOHIDRATOS

1.1 OBJETIVO:
Es estudiar el comportamiento (físico y químico) de una serie de carbohidratos (simples y
complejos) mediante pruebas cualitativas, y en base a estas observaciones, identificar el o los
tipo(s) de carbohidratos presentes en una muestra.

1.2 INTRODUCCIÓN:
Los carbohidratos (llamados comúnmente como glúcidos, sacáridos o azúcares) son compo-
nentes esenciales de alimentación para los seres vivos, que se encuentran principalmente en
azúcares, almidones y fibra, constituyendo las moléculas biológicas más abundantes en el
mundo vegetal. Es una de las sustancias principales que necesita nuestro organismo, junto a
las grasas y proteínas. Su función principal es de aporte energético para las funciones vitales
del organismo.
Químicamente, son considerados como aldehídos o cetonas polihidroxiladas o productos
derivados de ellos por reacciones de oxidación, reducción, esterificación, sustitución o polimeri-
zación. Su composición química presenta la siguiente fórmula elemental Cn (H2 O)n (donde
n es un número entero > 3). Se clasifican en:

• Monosacáridos: o azúcares simples, son las unidades básicas de los carbohidratos, los
cuales no se pueden hidrolizar para producir otros más simples. Estos pueden ser al-
dosas o cetosas, según tengan un grupo aldehído o cetona, respectivamente. De acuerdo
al número de átomos de carbono, se clasifican en: triosas como D(+)-gliceraldehído,
tetrosas como D(+)-eritrosa, pentosas como D(-)-ribosa y hexosas como D(+)-glucosa,
D(-)-fructosa, D(+)-galactosa, principalmente.

• Disacáridos: son carbohidratos que por hidrólisis producen dos moléculas de monosacári-

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dos iguales o diferentes. Como por ejemplo la sacarosa, la cual proporciona por hidróli-
sis una molécula de glucosa y la otra de fructosa.

• Oligosacáridos: son carbohidratos de masa molar relativamente alta que contiene entre
3 a 9 unidades de monosacáridos. Un ejemplo es la rafinosa, C18 H32 O16 , trisacárido
que por hidrólisis genera glucosa, fructosa y galactosa.

• Polisacáridos: son sustancias de alto peso molecular (polímeros naturales) por diez
o más unidades de monosacáricos, como por ejemplo almidón, glucógeno, celulosa,
quitina.

Existen diferentes tipos de reacciones químicas que sirven para determinar cualitativamente
la presencia de carbohidratos (monosacáridos, disacáridos y polisacáridos). Siendo estos los
siguientes:

a. Prueba de Molisch: Es una prueba general que sirve para identificar la presencia de
carbohidratos en una muestra. Consiste en la aparición de un anillo de color púrpura
(o violeta) en la interfase entre la muestra y el reactivo, producto del compuesto de
condensación formado en la reacción, el cual indica que la reacción es positiva.

b. Prueba de Lugol: Es una prueba específica para reconocer polisacáridos, particularmente

el almidón en una muestra. Si se forma un complejo de inclusión, de color azul-violeta
intenso, indica la presencia de almidón en la muestra y si la formación es de color rojo
indica presencia de glucógeno.

c. Prueba de Fehling: Sirve también para identificar azúcares reductores (mono y disacári-
dos), de una manera general. Los azúcares reductores, en medio alcalino, son capaces de
reducir el ion Cu2+ de color azul a Cu+ de color rojo, formando un precipitado de color
rojo-ladrillo, indicando que la reacción es positiva.

d. Prueba de Barfoed: Esta prueba sirve para identificar y diferenciar monosacáridos de

disacáridos reductores. Los monosacáridos se reducen muy rápidamente en el tiempo
de 5 a 7 minutos, generando un precipitado de color rojo. En cambio, los disacáridos se
reducen en un tiempo mucho más lento o no aparece el precipitado de color rojo, indicando
que esta prueba es específica para identificar monosacáridos reductores.

e. Prueba de Seliwanoff: Sirve para diferenciar aldosas de cetosas. Consiste en la formación

de un complejo de color rojo, producto del compuesto de condensación formado en la
reacción, indicando la presencia de cetosas, y no habrá cambios en la coloración si es una
aldosa.

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f. Prueba de hidrólisis para sacarosa: Esta prueba hidroliza a los disacáridos, oligosacáridos
y polisacáridos con ácidos o algunas enzimas específicas, el cual conduce al rompimiento
del o los enlace(s) glicosídico(s) dando por resultado las unidades de monosacáridos res-
pectivas. Como la sacarosa es un disacárido no reductor, por tener los dos carbonos
anoméricos formando enlace glicosídico, esta prueba sirve para identificar la presencia
de sacarosa en una muestra mediante la hidrólisis y la prueba de Fehling. Esta prueba
consiste primero en hidrolizar la muestra con ácido, para producir los monosacáridos
glucosa y fructosa que contiene la sacarosa, para luego, identificarlos con la prueba de
Fehling. Si da positivo (precipitado rojo) indica presencia de sacarosa.

1.3 PARTE EXPERIMENTAL:

1.3.1 MATERIALES

• 10 tubos de ensayo 150 x 15 mm • 01 plancha eléctrica.

• 02 vasos de precipitado 50, 150, 600 ml

• 01 pinza para tubos
• 01 pipeta graduada de 10 ml
• 01 gotero o pipeta Pasteur
• 01 pipeta graduada 5 ml
• 01 bagueta
• 01 pro-pipeta

• 01 gradilla para tubos de ensayo • 01 piceta

1.3.2 REACTIVOS

• Reactivo de Molisch • Almidón 1.0%

• Reactivo de Lugol • Glucosa 1.0%

• Reactivo de Fehling
• Fructosa 1,0%
• Reactivo de Barfoed
• Maltosa 1,0%
• H2 SO4 (cc)

• HCl 10% • Lactosa 1,0%

• NaOH 10% • Sacarosa 1,0%

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1.3.3 MUESTRAS

• Bebida gaseosa normal, light o zero • Yuca

• Bebida hidratante • Zanahoria

• Frugos • Manzana

• Papa • Uvas

1.3.4 PROCEDIMIENTO
Prueba de Molisch (demostrativo).

• Colocar 08 tubos de ensayo rotulados (para el control de reactivo, soluciones patrones

y muestras problemas) en una gradilla.

• Adicionar 2 ml en cada tubo de: (1) agua destilada, (2) glucosa, (3) lactosa, (4)almidón,
(5-8) muestra problema: M1, M2, M3 y M4.

• Añadir a todos los tubos 2 gotas de reactivo Molisch (solución α-naftol disuelto al 5%
en etanol). Mezclar completamente con la varilla.

• Luego, añadir a cada tubo, 1 ml de H2 SO4 concentrado (o hasta que aparezca el anillo
en la interfase del reactivo y la muestra), lentamente, inclinando el tubo y dejando
resbalar cuidadosamente el ácido por las paredes (hacerlo en la campana de extracción).
NO AGITAR. Tomar en cuenta que el tubo se calienta.

• La reacción es positiva cuando aparece en la interfase un anillo de color púrpura o

violeta.

• Anotar las observaciones en la Tabla 1 (cambio de color e intensidad del color, diseñe
su escala).

Prueba de Lugol.

• Colocar 6 tubos de ensayo rotulados (solución patrón de almidón y muestras problemas)

en una gradilla.

• En dos tubos adicionar 2 ml de solución de almidón 1% y agregar 1 gota de reactivo

de Lugol (mezcla acuosa de I2 y KI) a cada uno. Mezclar con la bagueta. Observar y
anotar el color obtenido.

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• Enseguida, calentar un tubo en baño maría (ebullición). Dejar enfriar y observar que
pasa con la coloración durante el calentamiento y después de éste. Volver a calentar y
enfriar. Anotar los resultados en la Tabla 2.

• Para las muestras problemas, preparar pequeños trozos de muestra (o jugo concen-
trado) de papa, zanahoria, yuca, manzana, etc. y colocar las muestras en diferentes
tubos de ensayo previamente rotulados. Agregar a cada muestra 1 gota de reactivo Lu-
gol. Observar los cambios de color, los colores similares a la muestra patrón contienen
almidón.

• Anotar las observaciones en la Tabla 2 (cambio de color e intensidad del color, diseñe
su escala).

Prueba de Barfoed.

• Colocar 8 tubos de ensayo rotulados (para el control de reactivo, soluciones patrones

y muestras problemas) en una gradilla.

• Adicionar 2 ml de reactivo de Barfoed (mezcla acuosa de acetato de cobre en ácido

acético) en la serie de tubos preparados. Luego, agregar 2 ml de solución de carbo-
hidrato y muestra problema a cada uno de los tubos. Mezclar con la bagueta.

• Calentar los tubos en baño maría a ebullición por 3 minutos. Sacar los tubos y dejar
reposar.

• Observar si hay formación de precipitado y su color. Anotar el tiempo de aparición

del precipitado y registrarlo en la Tabla 3.

Prueba de Fehling.

• Colocar los tubos rotulados (para el control, solución patrón y muestra problema) en
una gradilla.

• Adicionar 2 ml de las muestras en el tubo de ensayo correspondiente.

• Añadir 1 ml de Reactivo Fehling A (sulfato de cobre) y 1 ml de Reactivo Fehling B

(mezcla de tartado de K/Na con NaOH al 40%). Mezclar con la bagueta

• Colocar los tubos en baño maría a ebullición por 3 minutos. Dejar enfriar los tubos a
temperatura ambiente (NO enfriar con agua).

• La reacción es positiva si se forma un precipitado de color rojo-ladrillo. La reacción

es negativa si la muestra queda azul o cambia a un tono azul-verdoso. Anotar las
observaciones en la Tabla 4.

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Prueba de la sacarosa

• Colocar los tubos rotulados (para el control, soluciones patrones y muestras problema)
en una gradilla.

• Adicionar 2 ml de las muestras a estudiar en el tubo de ensayo correspondiente.

• Añadir gotas de ácido clorhídrico al 10 y mezclar bien con la bagueta

• Colocar los tubos en baño maría a ebullición por 10 minutos.

• Sacar los tubos y en caliente, adicionar 0,5 ml del reactivo Fehling A y 0,5 ml del
reactivo Fehling B.

• Luego, adicionar gotas de hidróxido de sodio (NaOH) al 10% hasta color azul y calentar
nuevamente al baño maría.

• La reacción es positiva si se forma un precipitado de color rojo-ladrillo. La reacción es

negativa si la muestra queda azul. Anotar las observaciones en la Tabla 5.

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1.4 ANÁLISIS Y OBSERVACIONES

Table 1.1: Reconocimiento de Carbohidratos - Prueba de Molisch

Muestra Procedimiento Observación

Añadir 2 gotas de reactivo Molisch.
Luego, con cuidado y lentamente agre-
2 ml de muestra
gar H2 SO4 (cc) por las paredes del tubo
(en campana).
Formación de un anillo
color púrpura en la
interfase del reactivo y la
muestra, indica positivo.

Muestra Observaciones Resultado

Control

Sol. Patrón 1

Sol. Patrón 2

Sol. Patrón 3

Sol. Patrón 4

M1

M2

M3

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Table 1.2: Reconocimiento de azúcares complejos - Prueba de Lugol

Muestra Procedimiento Observación

Añadir 1 gota del reactivo de Lugol.
2 ml de muestra
Mezclar y observar. Luego, calentar Formación de un color azul
o pequeños
a ebullición y dejar enfriar. Observar intenso, indica presencia de
trozos (azúcar
que pasa con la coloración en el calen- almidón.
no reductor).
tamiento y después.

Muestra Observaciones Resultado

Control

Sol. Patrón 1

Sol. Patrón 2

Sol. Patrón 3

Sol. Patrón 4

M1

M2

M3

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Table 1.3: Reconocimiento de azúcares simples reductores – Prueba de Fehling

Muestra Procedimiento Observación

Formación de un
Añadir 1 ml reactivo de Fehling A y B.
precipitado rojizo-ladrillo,
2 ml de muestra Mezclar. Llevar a baño maría caliente.
indica la presencia de
Dejar enfriar y observar.
azúcar reductor

Muestra Observaciones Resultado

Control

Sol. Patrón 1

Sol. Patrón 2

Sol. Patrón 3

Sol. Patrón 4

M1

M2

M3

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Table 1.4: Reconocimiento de azúcares simples reductores – Prueba de Barfoed

Muestra Procedimiento Observación

Añadir 2 ml de reactivo de Barfoed.
Formación de precipitado
2 ml de muestra Calentar en baño maría a ebullición por
rojo (tiempo 5-7 min) es
(azúcar 3 minutos. Sacar los tubos y Dejar en
monosacárido y mayor a 7
reductor) reposo. Anotar el tiempo del precipi-
min, disacárido reductor.
tado formado.

Muestra Observaciones Resultado

Control

Sol. Patrón 1

Sol. Patrón 2

Sol. Patrón 3

Sol. Patrón 4

M1

M2

M3

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Table 1.5: Reconocimiento de un azúcar no reductor - Prueba de la sacarosa

Muestra Procedimiento Observación

Añadir gotas de HCl 10% y agitar. Ca-
lentar en baño maría a ebullición por
10 minutos. En caliente adicionar los Formación de un
reactivos de Fehling. Luego, adicionar precipitado rojo-ladrillo
2 ml de muestra
gotas de NaOH 10% hasta coloración (azúcar reductor) indica
azul y calentar nuevamente en baño resultado positivo.
maría. Dejar reposar y anotar las ob-
servaciones.

Muestra Observaciones Resultado

Control

Sol. Patrón 1

Sol. Patrón 2

Sol. Patrón 3

M1

M2

M3

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