UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS GONZAGA DE ICA

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA “DR. DANIEL ALCIDES CARRIÓN”

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

MICROBIOLOGIA
PRACTICA N.º 10

- GARAYAR TAMBRA, BRYAN DAVID

- GARCIA VARGAS, AMMY NICOLL AMPARO

- GAVILAN GAMBOA, JEYMI JHOAN

- GOMEZ AROTOMA, JEAN PIERRE

Lima – Perú
 PRÁCTICAS N° 10

PRUEBAS BIOQUIMICAS METABOLICAS CONVENCIONALES

Y RAPIDAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS.

El cultivo y la identificación de patógenos específicos a partir de muestras tomadas de

pacientes con una presunta infección es el método más confiable, aunque no es el más
rápido, para el diagnóstico. Sin embargo, hasta que las técnicas de la biología
molecular hayan avanzado hasta el punto de que los microorganismos responsables de
enfermedades infecciosas pueden ser identificadas mediante marcadores genéticos
totalmente individuales, el diagnóstico definitivo de la mayoría de las infecciones
continuará exigiendo el aislamiento e identificación del agente etiológico. En el capítulo
anterior se trató sobre las características morfológicas básicas (colonias) en este
capítulo trataremos las pruebas enzimáticos y bioquímicas que se emplean para
identificar estos patógenos, una vez que han sido aislados.

I. Pruebas Bioquímicas o Enzimáticos Extremadamente Rápidas.

II. Todas las pruebas que se describen aquí pueden ser realizados directamente con
inóculo obtenido de colonias desarrolladas en las placas de aislamiento primario.
Los resultados se obtienen rápidamente, estas pruebas permiten avanzar otro paso
en la caracterización de un germen de morfología conocida y orientar la elección
de procesos adicionales necesarios para la identificación.
III.
• Prueba para Catalasa.- Esta prueba es útil para la identificación de muchas
bacterias. Por ejemplo, los estreptococos no poseen la enzima Catalasa que
cataliza la liberación de agua y oxígeno a partir del peroxido de hidrógeno, un
producto final del metabolismo, pero todos los estafilococos son Catalasa
positivos.
•
• Material:
− Cultivo de staphylococcus y streptococcus
− Peroxido de hidrógeno
− Láminas portaobjetos
− Asa bacteriológica
−

Procedimiento
Colocar una porción de la colonia en estudio en la lámina portaobjetos, y agregar
una gota del peroxido de hidrógeno. La reacción se observa de inmediato.

Resultado:
Catalasa + : Se observa el burbujeo
Catalasa - : No hay reacción.

• Prueba para coagulasa

• Se puede determinar coagulasa unida, denominado factor de agregación y se
realiza en lámina, leyéndose a los pocos segundos. La coagulasa libre se
realiza en tubo y se lee después de 4 horas. La coagulasa es un enzima que
 poseen ciertos microorganismos como S. aureus, esta enzima es capaz de
aglutinar el plasma tratado con oxalato, citrato o etilendiaminotetracético o
heparina en presencia de un factor contenido en el suero.
•

Material:

− Cultivo de S. aureus
− Plasma citratado o oxalatado
− Tubo de ensayo
− Asa bacteriológica

Procedimiento:
En un tubo ensayo colocar 0.5 ml de plasma, e inocular la cepa microbiana, incubar
en baño maría, y observar la reacción a las 4 horas a más.

Resultado:
Coagulasa + : si se observa que el plasma es coagulado
Coagulasa - : No se observa coagulación.

• Prueba para la oxidasa.

• Esta prueba indica la presencia de la enzima citocroma oxidasa y se aplica en
la identificación de bacterias como Neisseria, Vibrio Cholevae, Psedomonas ,
etc. Actualmente se usan tiras de p apel de filtro embebido con el reactivo o
ampollas de vidrio conteniendo el reactivo y son comparables con las pruebas
convencionales.
•
Materiales.
− Cultivo de Pseudomonas
− Tiras reactivas de oxidasas
− Palitos mondadientes
−
Procedimiento.
Colocar una porción de la colonia en el extremo reactivo de la tira, esperar unos
segundos y observar la reacción

Resultados
Oxidasa + : la colonia se oscurece a violeta oscuro o negro
Oxidasa - : no se observa tal reacción

Información miscelánea
Así como la morfología de la colonia, también la producción de pigmento
(Pseudonomas), difusividad (proteus) , reacciones hemolíticas en Agar sangre y
otras , son muy útiles para ir acotando las posibilidades de identificación
II. Pruebas bioquímicas metabólicas conv encionales
Una fraccion relativamente pequeña de la información genética de las bacterias
esta implicada en la producción de enzimas que metabolizan diversos sustratos.
Estas enzimas han sido usadas tradicionalmente como marcadores para diferenciar
grupos de especies. Si un microorganismo posee una enzima dada y es capaz de
utilizar unsustrato, podrá formar un producto final capaz de modificar el pH. Las
pruebas pueden ser de oxidación y fermentación, de hidrólisis, degradación de
amonoacidos, utilización de un único sustrato, reacciones para intratos.etc.

• Reacción de agar triple azúcar hierro (TSI)

• Esta prueba permite la orientación en la identificación de los bacilos
gramnegativos, en especial de los miembros de la familia Enterobacteriaceae.
Este medio puede detectar tres características principales de una bacteria: La
capacidad de generar gas en su proceso de fermentación de azúcares, la
formación de sulfuro de hidrogeno gaseoso (que se visualiza por la formación
de un precipitado negro que contiene hierro) y la capacidad de fermentar
lactosa, sacarosa, glucosa.

Material
− Cultivos de E.coli, Salmonella, Proteus
− Medio de cultivo TSI
− Asa bacteorológica
Procedimiento
Inocular la cepa por puntura y estría TSI, incubar por 18 -24 hrs. A 35-37°C
Resultado
Observar y anotar las diferentes reacciones. Presencia o ausencia de gas,
hidrogeno sulfurado y fermentación de azúcares.

Regradación de aminoácidos: descarboxilacion de la lisina

Ciertas enzimas formadas por los microorganismos pueden desaminar, dehidroliza r
o descarboxilar aminoácidos, degradándolos en componentes más pequeños. En
esta ocasión trataremos sobre la descarboxilación del aminoácido lisina, en una
amina (cadaverina) y amoniaco, productos alcalinos lo cual eleva el PH del medio,
observándose un viraje de su color original.

Material
− Cultivo de E.coli, Shigella, Citrobacter
− Medio de cultivo LIA
− Asa bacteriológica

Procedimiento
Inocular a cepa por pontura y estrías, incubar por 18 -24 hrs a35-37°C.

Resultado
Observar si se ha presentado descarboxilación o no por la apreciación del color.

• Prueba para INDOL

• Los microorganismos que producen la enzima triptofanasa son capaces de
degradar al aminoácido triptofano y dar ácido pirúbico, amoniaco e indol. Este
último se detecta por su combinación con el aldehído indicador que forma un
producto final coloriado.

Material
− Cultivo de E-coli y Klebsiella o Salmonella
− Caldo peptonado
− Reactivo de Kowac’s
− Asa bacteriológica
−
Procedimiento
Sembrar la cepa por agitación en el caldo peptonado, incubar a 35 -37°C por 18.24
hrs.

Resultado
Indol + : Formación del anillo rojo
Indol - : Formación de un anillo incoloro o amarillo

• Prueba de hidrólisis: hidrólisis de la Urea

• Una enzima que disocia un sustrato incorporando los componentes del agua en
ciertos uniones de la molécula de este ultimo se denomina enzima hidrolitica.
Los productos se determinan mediante alguna reacción visual.

Material
− Cultivo de E.coli, Proteus, Vulgaris o Klebsiella Preumoniae
− Medio de cultivo Agar urea
− Asa bacteriológica

Procedimiento
Sembrar la cepa por estrías, incubar a 35-37°C por 18-24 hrs.

Resultado
Urea + : Viraje a rojo púrpura o fucsia
Urea - : Amarillo

• Utilización de un único sustrato: Citrato

• Muchos microorganismos pueden ser reconocidos por su capacidad para crecer
en presencia de un único compuesto que satisface todos sus requerimientos
nutricionales.

Material
− Cultivo de E.coli y Klebsiella preunoniae
− Medio citrato
 − Asa bacteriológica
−
Procedimiento
Se siembra por estría en el medio citrato, se incuba a 35 -37°C por 18-24 hrs.
Resultado
Citrato (+) : vira al calor azul y se observa colonias
Citrato (-) : verde, sin desarrollo de colonias

CUESTIONARIO:

1. Mencione otros 2 microorganismos de importancia clínica que son Catalasa

positivo.
− Genero bacillus
− Neisseria gonorrhoeae

2. ¿Qué reacción ocurre al observarse la coloración lila en la prueba de

descarboxilación de la lisina?
− la descarboxilación del aminoácido lisina en la diamina cadaverina.
3. Qué tipo de ácidos se forman en la degradación de los carbohidratos por los
microorganismos?
− Ácido sulfhídrico
− Alfa cetoácido
4. Indicar que pruebas son mayormente usadas para la identificación de entero
bacterias.
− Prueba movilidad ornitina
− Prueba de la Ureasa
− Prueba del Rojo de Metilo/y Voges-Proskauer
− Prueba de la Oxidasa
 METABOLISMOBACTERIANO
EL METABOLISMO:
Es el conjunto de reacciones químicas que se producen en la célula tanto
procariotas como eucariota y tienen tres funciones específicas la primera
función:
• Obtener energía química del entorno y almacenarla para luego usarla en
diferentes funciones celulares
• Convertir los nutrientes exógenos, aquellos que provienen del exterior, en
unidades precursoras de los componentes macromoleculares de la célula
bacteriana
• Formar y degradar moléculas necesarias para cumplir con funciones
celulares específicas, por ejemplo la motilidad y la captación de nutrientes

EL ANABOLISMO:
• Es el proceso en el cual la bacteria va a sintetizar sus propios
componentes
• Se da la producción de un nuevo material celular, se conoce como
biosíntesis.
• Requiere de energía
CATABOLISMO:
• Son reacciones degradativas de los nutrientes para obtener energía o
unidades más simples
• Habrá liberación de energía
La energía liberada como resultado de las reacciones de oxidación reducción del
catabolismo es almacenada y transportada. Una de las moléculas más
importantes de almacén de energía se llama ATP (adenosín trifosfato), son
adeninas como base que van a estar unidas por grupos fosfato o los grupos
fosfatos van a estar unidas a estas adeninas.
Se le llama trifosfato cuando se le añaden tres grupos fosfato a la adenina o se
llama adenosín trifosfato cuando solamente están unidos dos grupos fosfato a la
molécula de adenina. También existe la adenina monofosfato, pero en el caso
de moléculas energéticas solamente están interactuando la ATP y la ADP como
moléculas que al convertirse en una o en otra liberan o atrapan energía, a través
de la unión o la ruptura de grupos fosfato, entonces vamos a tener muy presente
que esta molécula al unirse o desunirse de los grupos fosfato, va a liberar o
atrapar esa energía.
En los seres vivos la utilización de la energía potencial que está contenida en los
nutrientes se va a producir por reacciones de oxidación reducción
LA OXIDACIÓN: Pérdida de los electrones.
REDUCCIÓN: Ganancia de los electrones.
Esta molécula que tiene sus dos electrones se le puede llamar agente reductor
y la molécula que no tiene esos electrones se le va a llamar agente oxidante.
Estas reacciones frecuentemente incluyen también la transferencia de átomos
enteros de hidrógeno, por lo tanto se conocen también como reacciones de
deshidrogenación, en las reacciones de este tipo de sustancias que ceden
electrones que se llaman dadoras y otros que los aceptan que se llaman
aceptoras.
Metabolismo
Que se da en la célula tanto eucariota como la procariotas.
• Etapa 1: Las moléculas más complejas como las proteínas los
carbohidratos en forma de polisacáridos y los lípidos, van a desdoblarse
en componentes más simples.
Estos tres componentes ahora sí pueden interactuar con las células
eucariotas o procariotas.

• Etapa 2: Estos 3 componentes pueden ingresar en las rutas metabólicas

para converger en un precursor de otra serie de reacciones o en un
intermediario metabólico (componentes que están entre las rutas
metabólicas) como el ácido pirúvico o piruvato, que es uno de los
intermediarios metabólicos más importantes que pueden transformarse
en múltiples compuestos; entonces de los aminoácidos, monosacáridos,
ácidos grasos y glicerol podemos obtener piruvato que se va a transformar
en acetil CoA para ingresar al ciclo de Krebs.

La entrada al ciclo de krebs va a generar una gran cantidad de moléculas

y de ATP que nos van a servir después para entrar a la cadena de
transporte de electrones y después generar ATP. “El ciclo de krebs y la
cadena de transporte de electrones en la célula eucariota es muy similar
al proceso que ocurre en las bacterias”, nada más que en el caso de la
célula eucariota tiene mitocondrias, entonces el proceso que se realiza es
una respiración aeróbica (con presencia de oxígeno); en el caso de las
bacterias la mayoría realiza la respiración anaeróbica, no tiene
mitocondrias, pero si tiene en su membrana interna una cadena de
transporte de electrones similar a la célula eucariota con la que puede
también generar energía del ATP.

• Etapa 3: Estos componentes que ya están más simples van a pasar por
el proceso de fosforilación oxidativa, respiración y finalmente van a liberar
compuestos que son de desecho; por ejemplo el amonio en el caso de las
células eucariotas de los animales se va a liberar amonio y por medio del
ciclo de la urea se va a convertir en urea para que se pueda excretar ya
que el amonio es un componente tóxico.
Ciertas células eucariotas tienen también respiración anaeróbica, es decir en
ausencia de oxígeno, ahí el producto final va a formar el lactato o ácido
láctico, en la cual las bacterias también tienen ese tipo de producto final.
La cadena de transporte de electrones no va a estar en una mitocondria,
puesto que las bacterias no tienen mitocondrias, pero sí va a estar acoplada
a una membrana de la bacteria entonces este pues es importante saber que
si hay respiración aerobia, pero también la respiración anaeróbica en donde
los receptores son diferentes a los del oxígeno en este caso pues son
 compuestos inorgánicos, como ciertos iones de nitrógeno, de azufre, de
dióxido de carbono o también pueden utilizar electrones orgánicos como el
fumarato.

METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS

Los hidratos de carbono en las bacterias se van a oxidar para liberar energía o
van a proporcionar fuente de carbono para la síntesis de nuevos componentes
celulares, se definen por las vías glucolíticas, se va dividir en tres etapas
principales:
•
✓ Primera fase:
Fase preparativa
No hay reacciones de oxidación reducción
No hay liberación de energía
Solo hay la formación de intermediarios metabólicos de tres átomos
de carbono.
✓ Segunda fase:
Hay reacciones redox (reacciones óxido reducción)
Si hay liberación de energía en forma de ATP
Van a obtener 2 piruvato
✓ Tercera fase
Hay reacciones óxido reducción
Se obtiene los productos finales de la fermentación.

•
✓ Liberar energía
✓ DEGRADACION DE HEXOSAS, PENTOSAS Y OTRAS HIDRATOS
DE CARBONO
✓ Importante para el catabolsto 6 fosfato

•
✓ Via para la degradación de glucosa en bacterias aerobias ESTRICTAS
✓ 1 ATP POR CADA GLUCOSA
FERMENTACION:
➢
➢ La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado
por las levaduras y algunas clases de bacterias. Estos
microorganismos transforman el azúcar en alcohol etílico y
dióxido de carbono. La fermentación alcohólica, comienza
después de que la glucosa entra en la celda. La glucosa se
degrada en un ácido pirúvico.
➢
➢ La fermentación láctica es una ruta metabólica anaeróbica que
ocurre en la matriz citoplásmica de la célula, en la cual
se fermenta la glucosa (se oxida parcialmente) para obtener
energía metabólica y un producto de desecho que principalmente
es el ácido láctico (fermentación homoláctica). Además de otros
ácidos (fermentación hetero láctica). Se trata de un proceso
biológico en el que los azúcares presentes en el medio
(generalmente monosacáridos como son
la glucosa, galactosa y fructosa) se transforman en ácido láctico.
La presencia de ácido láctico como metabolito en los alimentos
provoca la desactivación de los procesos de descomposición, y
por lo tanto la fermentación láctica es tradicionalmente empleada
como un método de conserva de alimentos.
Las bacterias capaces de promover este proceso biológico se
denominan bacterias lácticas.
➢
➢ En este tipo de fermentación se produce ácido láctico y otros
compuestos tales como ácidos acético y fórmico, dióxido de
carbono y etanol. Las bacterias son hetero fermentadoras.

➢
➢ Es la fermentación de azúcares en acido propionico y pertenecen
al filo Actinobacteria. Son Gram positivas y la mayoría de las
especies crecen en condiciones anaerobias, pero también
existen algunas microaerotolerantes
➢
➢ Fermentación ácido mixta: Origina etanol y una mezcla compleja
de ácidos, en particular los ácidos acético, láctico, succínico y
fórmico. El fórmico se puede convertir en hidrógeno y dioxido
carbónico. Presente en Escherichia, Salmonella, Proteus y otros
géneros.
➢
➢ Fermentación de butanodiol: Varias bacterias como Enterobacter,
Serratia y Bacillus producen 2-3 butanodiol durante
la fermentación de la glucosa. Este deriva de la condensación de
 2 moléculas de piruvato en una molécula neutra de acetona que
luego es reducida a 2-3 butanodiol.
➢
➢ Es la conversión de los glúcidos en ácido butírico por acción de
bacterias de la especie Clostridium butyricum en condiciones
anaerobias absolutas (ausencia de oxígeno). ... Es característica
de las bacterias del género Clostridium y se caracteriza por la
aparición de olores pútridos y desagradables.

CATABOLISMO DE LIPIDOS :
➢ FUENTE DE ENERGIA: Triglicerol, glicerol y acidos grasos.
➢ Hidrolizados a glicerol y acidos grasos por lipasas microbianas
➢ Glicerol es fosforilado y oxidado dihidroxiacetona fosfato
➢ Catabolizado por via glucolítica

CATABOLISMO DE PROTEINAS Y AMINOACIDOS:

BACTERIAS Y PROTEASA ELIMINACION DE UNA
HONGOS S GRUPO AMINO DE UN
AMINOACIDO

TRANSAMINACION; EL GRUPO
AMINO ES TRANSFERIDO DESDE EL
AMINOACISO A UN ACEPTOR ALFA-
CETOACIDO