UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN DE TACNA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE AGRONOMÍA
ASIGNATURA: BIOTECNOLOGÍA (PRÁCTICA)

PRÁCTICA N°3: PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO Y SOLUCIONES STOCK

(CÁLCULOS)
INTRODUCCIÓN
Los componentes de los medios para el cultivo de tejidos incluyen macronutrientes,
micronutrientes, un suplemento de hierro, vitaminas, una fuente de carbono y usualmente,
reguladores de crecimiento. Aparte del carbono, hidrógeno y oxígeno los constituyentes esenciales
requeridos en relativamente grandes cantidades (macros) son el nitrógeno (N), fósforo (P), potasio
(K), calcio (Ca), magnesio (Mg) y azufre (S). Trazas de ciertos elementos (micros) minerales son
requeridos por todas las células vegetales, se incluyen el hierro (Fe), manganeso (Mn), zinc (Zn),
boro (B), cobre (Cu), molibdeno (Mo), cobalto (Co), níquel (Ni) y Cloruro.

Las vitaminas tienen funciones catalizadoras en ciertos sistemas enzimáticos por lo que también son
necesarias en pequeñas cantidades. La tiamina es la única vitamina esencial para todos los cultivos
pero el ac. nicotínico y la piridoxina pueden también estimular el crecimiento. El ac. ascórbico (vit.
C) en combinación con el ac. cítrico es utilizado como antioxidante.

Todos los medios de cultivo requieren la presencia de una fuente de carbono y energía. Una
respuesta óptima de crecimiento es determinante cuando se utiliza sacarosa o d-glucosa como
fuente de carbón en el medio de cultivo, mientras que con otros sacáridos la respuesta es
considerablemente variable. El myo-inositol es adicionado en algunos suplementos vitamínicos
como un factor de crecimiento. Aunque este compuesto es un carbohidrato, tiene funciones
especiales principalmente en la formación de fosfoinosítidos y fosfatidilinositol. Los reguladores de
crecimiento son utilizados en el medio de cultivo cuando se desea forzar la dirección de la
morfogénesis o bien potenciar la multiplicación de tejido. Las Auxinas son compuestos que
estimulan la elongación de las células de brotes- Son usadas para estimular la formación de raíces
adventicias, inhibir la formación de yemas y juegan un rol importante en la embriogénesis. Las
principales son el ácido indol-acético, ácido indolbutírico y ácido naftalenacético. El ácido 2,4-D es
un regulador sintético que cumple funciones sobresalientes substituyendo auxinas, principalmente
en la formación de tejido de callos, sin embargo, suprime la organogénesis, y no deben ser usados
en medios que involucren la formación de brotes o raíz. Las citocininas promueven la división
células de los tejidos bajo ciertas condiciones de ensayo. En el cultivo de callo estimulan la
formación de brotes e inhiben la formación de raíz. Las citocininas son principalmente derivados de
amino purinas. La combinación axino-citocininas regulan la división, elongación y diferenciación
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celular así como la formación de órganos. Otro grupo de reguladores de crecimiento son las
giberelinas las cuales son usadas raramente, como en el caso de cultivos de meristemos. Debido a la
facilidad de manejo, los constituyentes de los medios de cultivos son preparados como soluciones
stock de cada grupo, los cuales pueden variar desde concentraciones 10x para los macros, 100x para
los micros y 1000x para las vitaminas. Para la preparación de un medio en particular que se deberán
utilizar alícuotas de las soluciones stock en la cantidad necesaria para alcanzar la concentración de
cada constituyente. Es recomendable mantener las soluciones stock en refrigeración hasta su uso.

El medio de cultivo de tejidos vegetales más utilizado, son las sales de Murashige y Skoog (MS)
(1962).

OBJETIVO

El alumno conocerá la función que tienen los distintos componentes del medio de cultivo en el
desarrollo de inóculos vegetales, así como su preparación.

INVESTIGACIÓN REQUERIDA

Función individual de los componentes macro-nutrientes, micro-nutrientes, vitaminas y

aminoácidos en el desarrollo vegetal.

MATERIALES
• Material de cristalería
• Reactivos • Espátula
• Balanza analítica
• Placa de agitación y calentamiento
• Autoclave
• Agar
• Sacarosa
• Agitador magnético
• Agua destilada
• Recipientes para el medio de cultivo y soluciones stock.
DESARROLLO
Para la preparación de las soluciones stock se deberán disolver las sales indicadas en las
proporciones marcadas.
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1. Preparar para 150 ml de medio MS

Sales y vitaminas (4.4 g/L) = 0.66 g.
Sacarosa (30g/L)= 4.5 g.
Agar (7 g/L) = 1.05 g.
2. Preparar para 150 ml de medio MS+0.5 mg/L BA (Benciladedina) RCP
Sales y vitaminas (4.4 g/L) = 0.66 g
Sacarosa (30g/L)= 4.5 g.
BA (concentración 0.1mg/mL) = 0.75ml.
Agar (7 g/L) =1.05 g
3. Se debe preparar 1255 recipientes (15 ml c/u) con un medio de cultivo que contenga las
siguientes cantidades de sustancias y soluciones:
a.- Sulfato de magnesio hidratado al 2%
b.- 0.035 M de fosfato de potasio
c.- Cloruro de sodio al 3.3%
d.- Como fuente de carbono solución molar de sacarosa al 0.05 M
e.- Aplicar Agar-agar para solidificar (1.5%)
f. ¿Qué cantidad de cloro líquido sería necesario para esterilizar por el método químico el
material de vidrio (pipetas, cajas Petri, fiolas) usado en biotecnología, si solo tenemos los 2
fregaderos para realizarlo. Usando 100 ppm de cloro?
g. ¿Qué cantidad de ácido clorhídrico (15%) es necesario para preparar 125.5 ml de
solución esterilizadora de tejido vegetal en micropropagación?
Solución:
1255 ml* 15 mL = 18 825 mL de MS (volumen total)

a. 18 825 ml MS-----------------100%
X-------------------2% MgSO4
X= 376.5 ml de sulfato de magnesio

b. 0.035 M de fosfato de potasio KH2PO4 PM=174.2 g/mol

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g
M= -----------------
PM* V(L)

g= M*PM*V(L)

g= 0.035 M* 174.2 g/mol*18.82 L

g= 114.74 gr de fosfato de potasio

c. Cloruro de sodio al 3.3%

18 825 ml-----------100%
X --------------- 3.3%
X= 621.22 g NaCl

d. Peso molecular de la sacarosa: C12H22O11 =342.3 g/mol

g= 0.05 M*342.3 g/mol*18.82 L =322.10 gr de sacarosa

e. Agar para solidificar = 1.5%

18 825 ml --------------100%
X----------------------- 1.5% Agar Agar
X= 282.37 g de agar agar

f. Fregadero = tiene un volumen de 25 L

100 ppm se debe diluir en un millón de medio
100 ppm ---------------- 1000 000 ml
cc
ml
gr
Entonces 100 ppm-------------------1 000 L
X-------------------------- 25 L
X= 2.5 ml de cloro líquido

g. 125.5 ml ------------- 100%

X ----------------- 15% HCl
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X=18.825 ml de HCl
125.5 ml de volumen total -18.82 ml de HCl =106.675 ml de agua destilada.

4. Preparar medio MS acorde al siguiente diseño de experimento; 3 fiolas que contengan los
insumos señalados a continuación:
a) 300 mL MS
b) La cuarta parte de la primera +0.75 M de glucosa (75 ml)
g
M= -------------------
PM * Vol (L)

g= 0.75M*180.15 g/mol * 0.075L= 10.13 g de glucosa

c) La quinta parte de la primera +1.8% de NaCl +0.5 M de sacarosa (60 ml)

1.08 gr de NaCl
10.27 gr de Sacarosa

¿Cuántos gramos de MS necesitaría pesar y cuantos g-cc-ml de los demás insumos?

MEDIO MS (Murashige y Skoog, 1962)

Solución Compuesto Conc. Final Conc. Vol. De solución

concentrada (mg/L) Solución concentrada para
concentrada preparar 1 L de
(mg/L) medio
NH4NO3 1,650 16,500
A KNO3 1,900 19,000 100
CaCl2. 2H2O 440 4,400
MgSO4. 7H2O 370 3,700
KH2PO4 170 1,700
CaCl2. 6H2O 0,025 25
H2BO3 6,200 6.200
B MnSO4. 1H2O 16,900 16.900 1
ZnSO4. 7H2O 8,600 8.600
Kl 0,830 830
Na2MoO4. 5H2O 0,250 250
CuSO4. 5H2O 0,025 25
C FeSO4. 7H2O 27,85 2.785 10
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Na2. EDTA 37,25 3.725
Glicina 2 200
Mio-inositol 100 10.000
D Tiamina-HCl 0,1 10 10
Acido nicotínico 0,5 50
Piridoxina-HCl 0,5 50

Macronutrientes
Compuesto Conc. Final
(mg/L)
NH4NO3 1,650
KNO3 1,900
CaCl2. 2H2O 440
MgSO4. 7H2O 370
KH2PO4 170

Micronutrientes
mg/L
CaCl2. 6H2O 0,025
H2BO3 6,200 Vitaminas
MnSO4. 1H2O 16,900 mg/L
ZnSO4. 7H2O 8,600 Glicina 2
Kl 0,830 Mio-inositol 100
Na2MoO4. 5H2O 0,250 Tiamina-HCl 0,1
CuSO4. 5H2O 0,025 Acido nicotínico 0,5
FeSO4. 7H2O 27,85 Piridoxina-HCl 0,5
Na2. EDTA 37,25

g/L
Sacarosa 30
Agar 7.5

Actividades de evaluación

1. Realice una reseña histórica de los medios de cultivo empleados en trabajos de

investigación.
2. ¿Por qué el medio de cultivo de Murshige y Skoog es uno de los más empleados en la
actualizad pese a ver sido desarrollado en 1962?
3. Función individual de los componentes macro-nutrientes, micro-nutrientes, vitaminas,
aminoácidos, reguladores de crecimiento y espesantes en el desarrollo vegetal.