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ÁREA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO PROGRAMA ACADÉMICO DE QUÍMICA ESPECIALIDAD TECNOLOGIA AMBIENTAL GRUPO

ÁREA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO PROGRAMA ACADÉMICO DE QUÍMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGIA AMBIENTAL

GRUPO

QU- 304

MATERIA

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

TÍTULO

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

DE LA MATRIZ AMBIENTAL: AGUA

ASESORA

Dra. ROSA RICO MATA

DATOS DE IDENTIFICACIÓN DE LOS ANALISTAS

Fecha de inicio del análisis: 1 de Julio del 2015

Fecha de termino: 9 de Julio de 2015

Nombre

Cargo

María Guadalupe Regina Salas Padilla

Responsable

Víctor Manuel Guadalupe Piña Cardona

Administrador

Andrés Ramírez Sánchez

Laboratorista 1

Noé Miguel Ángel Pedroza Díaz

Laboratorista 2

Jorge Rentería Aldana

Laboratorista 3

GENERACIÓN: 2014-2016

M I C R O B I O L O G Í A A M
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DATOS DEL SITIO EN ESTUDIO

1.- Breve descripción del estatus ambiental del sitio de estudio: La muestra para el análisis microbiológico se tomó de la planta tratadora de aguas residuales de la Universidad Tecnológica de León, en la cual llegan descargas de aguas a diario, las mismas que después del proceso en el que se someten son utilizadas para las áreas verdes y para el drenaje de la misma universidad, de esta manera haciendo de esta una simbiosis ambiental.

SITIO DE

MUESTREO

Nombre

Ubicación

/coordenadas GPS

Imagen de mapa satelital

Planta Tratadora de agua residual de la UTL

21.062997,-

101.582700.

Tratadora de agua residual de la UTL 21.062997,- 101.582700. 2. Evidencia fotográfica del sitio Fecha: 30

2. Evidencia fotográfica del sitio

Fecha:30 de Junio del 2015 Hora:10:40 a.m.

Fecha:30 de Junio del 2015 Hora:10:45 a.m.

10:40 a.m. Fecha: 30 de Junio del 2015 Hora: 10:45 a.m. DATOS DE LAS MUESTRAS A
10:40 a.m. Fecha: 30 de Junio del 2015 Hora: 10:45 a.m. DATOS DE LAS MUESTRAS A

DATOS DE LAS MUESTRAS A ANALIZAR

1. Identificación

Matriz ambiental:Agua

Hora de toma de muestra:10:40 a.m.

Hora de siembra:11:00 a.m.

Punto de Muestreo (ubicación /coordenadas GPS):

Tiempo de exposición (aplica solo para muestra de aire)

Nombre del/ los analistas que tomaron la muestra:Noé Miguel Ángel Pedroza Díaz

Nombre del/ los analistas que sembró la muestra:Andrés Ramírez Sánchez

2.Parámetros Fisicoquímicos

Color:Café

Temperatura ( o C) ambiental:

20 º CpH:5

Olor: Materia orgánica en descomposición y heces fecales.

Describir condiciones climatológicas:Soleado

3. Evidencia fotográfica del sitio de toma de muestra

y heces fecales. Describir condiciones climatológicas: Soleado 3. Evidencia fotográfica del sitio de toma de muestra
y heces fecales. Describir condiciones climatológicas: Soleado 3. Evidencia fotográfica del sitio de toma de muestra

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fotográfica del sitio de toma de muestra M I C R O B I O L

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

1. Justificación del proceso para la identificación bacteriana La identificación de una bacteria que interviene
1. Justificación del proceso para la identificación bacteriana
La identificación de una bacteria que interviene en un ciclo biogeoquímico es de suma importancia ya que se
estudia su proceso metabólico, que nos permite conocer la manera en la que asimila los nutrientes
proporcionados por el micromedió ambiente en donde se encuentre, sobre todo a conocer que mecanismos
metabólicos utiliza para degradar o transformar sustancias orgánicas o inorgánicas que se encuentran disueltas
en el agua y cuya función del microorganismo es retirarlas de dicha matriz como un proceso de depuración de
agua, y por lo tanto se debe de aislar en un medio selectivo para poder hacer las pruebas correspondientes
para su identificación, para después poder implementar el microorganismo en un proceso de Biorremediación
si es que sus propiedades metabólicas pudiesen favorecer al mismo.
2. Dos medios de siembra (Nombre y Composición)
Agar Triple Azúcar de Hierro
Agar Kliger de Hierro
gr/lt
gr/lt
1.- Peptona de Carne . 13 g
1.- Extracto de Carne . 30 g
3.- Cloruro de Sodio
4.- Lactosa
2.- Pluripeptona
20 g
2.- Cloruro de Sodio .
5 g
5 g
10 g
3.-Lactosa
.10 g
5.- Sacarosa . 10 g
g
7.- Sulfato de Hierro y amonio .0.2 g
6.- Glucosa
1
4.-Tripteina
10 g
8.- Tiosulfato de Sodio
9.- Rojo de Fenol
0.2
g
5.-Glucosa
1 g
0.025 g
Morfología Colonial (Medio 1)
Morfología Colonial (Medio 2)
Descripción
Descripción
Crecimiento de colonias de una forma
puntiforme, con bordes ondulados, y una
superficie convexa lisa y cremosa.
Crecimiento de colonias de una forma
puntiforme, con bordes ondulados, y
una superficie convexa lisa y cremosa.
Imagen
Imagen

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superficie convexa lisa y cremosa. Imagen Imagen M I C R O B I O L
3. Dos Medios selectivos de resiembra (Nombre y composición) Agar Triple Azúcar de Hierro (medio
3. Dos Medios selectivos de resiembra (Nombre y composición)
Agar Triple Azúcar de Hierro
(medio 1)
gr/ litro
Agar Mac Conkey (medio 2)
gr/ litro
1.- Extracto de Carne . 30 g
1.- Peptona
1.5 g
2.- Pluripeptona
20 g
2.- peptona de
gelatina.
.17.0 g
3.- Cloruro de Sodio
5 g
3.-Lactosa
10 g
4.- Lactosa
10 g
4.- Mezcla de sales biliares .1.5 g
5.- Sacarosa . 10 g
5.- Cloruro de Sodio . 5 g
Morfología Colonial (Medio 1)
Morfología Colonial (Medio 2)
Descripción
Descripción
Colonias incoloras con bordes regulares de 1,5 mm
aproximadamente de Shigella Flexneri
Colonias incoloras con bordes regulares de 1,5 mm
aproximadamente, regreso en Shigella flexneri
Imagen
Imagen

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regreso en Shigella flexneri Imagen Imagen M I C R O B I O L O
 

4. Procedimiento de Aislamiento (describir detalladamente la cantidad de materiales y los pasos a seguir)

 

Materiales y equipo

2

charolas de pesado

1 parrilla de calentamiento

 

1 agitador de vidrio

1

espátula

2 matraces Erlenmeyer 250 mL

Agua destilada

2 vasos de precipitado 250 mL

3 cajas Petri

Mecheros Bunsen

Reactivos y medios de cultivo

Asas metálicas

Agar triple azúcar de hierro

Preparación de medios de cultivo:

Pesar 6.25 g de Agar Triple Azúcar de Hierro y disolverlo en 100 mL de agua destilada y calentarlo durante 1 minuto o hasta que el medio se disuelva completamente en el agua, después llevar a esterilizar durante 15 minutos a 120 º C, en condiciones estériles distribuir el medio en las placas Petri (Aproximadamente 33. 33 mL en cada caja), se necesitan 3 cajas; una para la siembra, otra para la resiembra y una tercera de control. Una vez que se repartió el medio se dejan solidificar.

Pasos para el aislamiento del microorganismos (siembra, selección de la colonia y resiembra):

Siembra: Una vez que se distribuyó el medio en las placas, se toma la muestra de agua de la planta de tratamiento de aguas residuales de la UTL ya previamente recolectada, con ayuda del mechero se esteriliza el asa metálica de nicromo y se toma un poco de la muestra, después esta se distribuye en el medio por el método de estriado, como se muestra en las siguientes imágenes y se pone a incubar a 37 ° C de 18 a 24 horas.

imágenes y se pone a incubar a 37 ° C de 18 a 24 horas.  
imágenes y se pone a incubar a 37 ° C de 18 a 24 horas.  
 

Selección de la colonia: Después del periodo de incubación se observa el crecimiento que hubo en el mismo y verificar que la morfología de las colonias sean las que se pretenden identificar puesto que en un medio de cultivo pueden crecer diferentes tipos de bacterias, ya que se verificó que la colonia que se busca identificar se elige la que haya quedado aislada de las demás, de esta manera lograr un cultivo selectivo para su resiembra.

Resiembra: Se hace una división en la placa seleccionada para la resiembra, esta se marca por debajo de la misma con ayuda de un marcador, para poder hacer dos estriados y aislar dos colonias previamente seleccionadas, cada una en su respectiva zona de la caja Petri con su crecimiento, con ayuda del mechero se esteriliza el asa y se toman dos colonias y se siembran mediante el método ya mencionado, se incuban a 37 ° de 18 a 24 horas.

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mencionado, se incuban a 37 ° de 18 a 24 horas. M I C R O
5. Esquema del Perfil bioquímico (metabólico ) para la identificación del microorganismo seleccionado Tinción de
5. Esquema del Perfil bioquímico (metabólico )
para la identificación del microorganismo seleccionado
Tinción de Gram
(-)
(+))
Prueba de Motilidad
Cápsula
Catalasa
Degradación de la Caseína (-)
Producción de Indol (-)
Prueba Rojo de Metilo (-)
Vogues Proskauer (-)
Producción de Gas (-)
Producción de ácido Sulfhídrico (-)
Degradación de Citratos (-)

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Sulfhídrico (-) Degradación de Citratos (-) M I C R O B I O L O

RESULTADOS DEL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

1. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO DE LA MUESTRA (SIEMBRA) Agar triple azúcar de hierro Agar
1. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO DE LA MUESTRA (SIEMBRA)
Agar triple azúcar de hierro
Agar triple azúcar de hierro
2. MORFOLOGÍA COLONIAL OBSERVADA
Tipo de colonia 1: Descripción
FOTO 1
Crecimiento abundante en el medio de cultivo,
las colonias son incoloras y con una morfología de
bordes regulares y con una elevación convexa.
Tipo de colonia 2: Descripción
FOTO 2
La colonia seleccionada tiene un borde
ondulante, es incolora y tiene una superficie
opaca.
Tipo de colonia 3: Descripción
FOTO 3
.
Su transmisión de luz es opaca y tiene
una consistencia cremosa.

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de luz es opaca y tiene una consistencia cremosa. M I C R O B I

3. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO PURO ( RESIEMBRA)

FOTO 1

FOTO2

Agar Mac Conkey

Agar Mac Conkey

FOTO 1 FOTO2 Agar Mac Conkey Agar Mac Conkey 4. MORFOLOGIA COLONIAL OBSERVADA Descripción La resiembra
FOTO 1 FOTO2 Agar Mac Conkey Agar Mac Conkey 4. MORFOLOGIA COLONIAL OBSERVADA Descripción La resiembra

4. MORFOLOGIA COLONIAL OBSERVADA

Descripción

La resiembra resultó muy favorable, esto quiere decir que el medio de cultivo seleccionado para la resiembra si fue el correcto para la bacteria que se deseaba aislar. En la foto 1 se puede observar las colonias aisladas en las dos partes del medio, se puede identificar claramente el estriado que se realizó de una manera correcta, las colonias están un poco pequeñas porque aún les falta crecimiento, esta foto se tomó después de 12 horas de incubación.

En

colonias que ya crecieron un poco más,

pues el estriado claramente.

se alcanza a distinguir

2 se puede observar que las

la

foto

La foto 3 se tomó después de 24 horas de incubación que necesitan este tipo de bacterias para su crecimiento por lo tanto las bacterias aisladas se alcanzan a ver perfectamente.

FOTO 1

de bacterias para su crecimiento por lo tanto las bacterias aisladas se alcanzan a ver perfectamente.

FOTO 2

de bacterias para su crecimiento por lo tanto las bacterias aisladas se alcanzan a ver perfectamente.

FOTO 3

de bacterias para su crecimiento por lo tanto las bacterias aisladas se alcanzan a ver perfectamente.

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a ver perfectamente. FOTO 1 FOTO 2 FOTO 3 M I C R O B I
5. EVIDENCIA FOTOGRÁFICA DEL RESULTADO DEL PERFIL BIOQUÍMICO Nombre de la prueba Medio de cultivo
5. EVIDENCIA FOTOGRÁFICA DEL RESULTADO DEL PERFIL BIOQUÍMICO
Nombre de la
prueba
Medio de cultivo
utilizado
Resultado obtenido
(positivo/negativo)
Evidencia fotográfica
1.
Tinción de
Gram
Negativo
Fundamento de la prueba
Es un tipo de tinción diferencial empleada en la microbiología para la visualización de bacterias.
Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre
daño de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la
retención o el escape del colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente:
El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o
la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con
mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gram negativas, los lípidos de la
pared (más abundantes que en las células gram positivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el
escape del complejo de cristal violeta con yodo.
2.
Prueba de
1.- Agar SIM
Motilidad
Positivo en el área
anaerobia
Fundamento de la prueba
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde más allá de la línea
de inoculación. Esto se debe a la presencia de flagelos que le permiten desplazarse por el medio en busca de
alimento. Puede ser en medio aeróbico o anaeróbico.

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Puede ser en medio aeróbico o anaeróbico. M I C R O B I O L
3.- Prueba de Cápsula Negativo La cápsula es una cubierta de grosor variable formada habitualmente
3.- Prueba de Cápsula
Negativo
La cápsula es una cubierta de grosor variable formada habitualmente por unidades de polisacáridos, proteínas o
ambos. Si está bien estructurada y se encuentra bien adherida a la célula, se le denomina cápsula; si por el
contrario, tiene estructura mal definida y su adhesión es débil, se le conoce como glicocálix. De acuerdo a su
estructura química, puede ser flexible o rígida. La rigidez le confiere la característica de una matriz impermeable.
Determina la adhesión a superficies (biopelículas), constituye una barrera de protección contra la fagocitosis y los
anticuerpos e impide la desecación y la acción de otros agentes.
1.- Agua
4.- Prueba de Catalasa
oxigenada
Positivo
Fundamento de la prueba
La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. Descompone el peróxido de
hidrógeno en agua y oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que el
microorganismo posee dicha enzima.
H2O2 + catalasa ------------------- H2O + O2
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1.- Agar leche descremada 5.- Degradación de la caseína Negativo Fundamento de la prueba Las

1.- Agar leche

descremada

5.- Degradación de la caseína

Negativo

Fundamento de la prueba

Las proteasas son excretadas al medio para la degradación de proteínas, la caseína es la proteína de la leche que le da el color blanco, cuando la caseína es hidrolizada por las proteasas o enzimas que degradan esta proteína, desaparecerá el color blanco alrededor del crecimiento bacteriano.

6.- Producción de Indol

1.- Agua de Peptona

Negativo

6.- Producción de Indol 1.- Agua de Peptona Negativo Fundamento de la prueba El indol es

Fundamento de la prueba

El indol es un compuesto que se genera mediante la desaminación reductiva del triptófano y esta reacción es llevada a cabo por algunas bacterias que poseen las enzimas denominadas en su conjunto triptofanasas. Para detectar la producción de indol se utiliza el medio Caldo triptófano y la lectura de la prueba se realiza con el reactivo de Kovac s, con el que el indol producido reacciona generando una coloración rosa intensa.

C11H12N2O2+ triptofanasa ---------- C8H7N + NH3 + C3H4O3 + energía

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C 8 H 7 N + NH 3 + C 3 H 4 O 3 +

7.-Prueba RM-VP

1.-Caldo RN-VP

Negativo

7.-Prueba RM-VP 1.-Caldo RN-VP Negativo
 

Fundamento de la prueba

 

La prueba de rojo de metilo detecta la fermentación acido-mixta, donde se acumulan acido relativamente fuertes (acético, fórmico, láctico, etc.) bajando así el pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta añadiendo un indicador (rojo de metilo) al medio de cultivo

C6H12O6 + fermentación + rojo de metilo ------

ácidos + cambio de color

8.- Vogues

1.- Caldo RM- VP

Negativo

8.- Vogues 1.- Caldo RM- VP Negativo

Proskauer

 

Fundamento de la prueba

 

Detecta la fermentación butanodiólica. En esta fermentación se producen menor cantidad de ácidos que en la fermentación ácido-mixta, y una gran cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo (alfa-naftol y KOH) se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoÍna). La acetoÍna en presencia de oxigeno se oxida a diacetilo. El diacetilo origina una coloración roja al reaccionar con los restos guanidÍnicos de algunos aminoácidos de la peptona del medio

C 6 H 12 O 6 ---->C 4 H 10 O 2 + C 10 H 8O + KOH ----> C 3 H 6O + O 2 -- C 4 H 6 O 2 + aminoácidos -- coloración roja

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O 2 + aminoácidos -- coloración roja M I C R O B I O L
9.- Producción de 1.- Caldo Negativo gas CO 2 y H 2 Lactosado Fundamento de

9.- Producción de

1.- Caldo

Negativo

gas CO2 y H2

Lactosado

Fundamento de la prueba

El extracto de carne y la peptona son la fuente de carbono y nitrógeno mientras que la lactosa es el hidrato de carbono a fermentable. Por la fermentación de la lactosa se produce ácido y gas (CO2 y H2) , el cual se evidencia al utilizar campanas Durham).

C6H12O6 C3H4O3 + NADH + H+ C3H3O3 + CO2

10.- Producción

de Ácido

Sulfhídrico

1.- Agar Kliger de Hierro

Negativa

de Ácido Sulfhídrico 1.- Agar Kliger de Hierro Negativa Fundamento de la prueba En el medio

Fundamento de la prueba En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance asmótico. Por fermentación de azucares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio acido. El Tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrogeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionado el típico sulfuro de hierro de color negro.

Na 2 S2O3 + Tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa H2S + FeSO4 (sal de hierro) Fe2S3 Azucares + rojo de fenol Ácidos + color amarillo

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+ rojo de fenol Ácidos + color amarillo M I C R O B I O

11.- Prueba

1.- Agar Citrato de Simmons

   
11.- Prueba 1.- Agar Citrato de Simmons      
 

de

Negativo

degradación

 

de Citrato.

 

Fundamento de la prueba

 

En esta prueba se determina si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de Carbono para su metabolismo y crecimiento. El medio de cultivo Citrato de Simmons incluye; citrato de Sodio, un anión como única fuente de Carbono y Fosfato de Amonio como fuente de Nitrógeno. La citrato permeasa permiten el transporte de citrato al interior de las células y la enzima citrasa convierte el citrato en ácido pirúvico y CO 2 . El CO 2 liberado se combina con el sodio y agua y forman carbonato de sodio que es alcalino cambiando el bromotimol de verde a azul intenso.

 

Citrato ---------------- Oxalacetato + Acetato

 
 
 

Piruvato + Acetato

 

Reacción en pH ácido

 

2 Piruvato -----------------

Acetato + CO2 + Lactacto

 

2 Piruvato -- ---------------- Acetoína

+ 2 CO2

Reacción en pH básico

Citrato -------------------

CO2 + Ácido Fórmico + 2 Ácido Acético

 

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+ Ácido Fórmico + 2 Ácido Acético   M I C R O B I O

IDENTIFICACIÓN DEL MICROORGANISMO AMBIENTAL

EN LA MATRIZ DE ESTUDIO: AGUA

1.- Nombre científico del microorganismo identificado de acuerdo a los resultados del perfil bioquímico planteado ( genero y especie)

Shigella flexneri

2. Taxonomía del o los microorganismo identificados

Son Bacterias Anaerobias y Anaerobias facultativas.

Dominio: Bacteria

Filo: Proteobacteria

Clase: Grammproteobacteria

Orden: Enterobacteriales

Familia: Enterobacteriaceae

Género: Shigella

Especie: S.flexneri

3. Características generales

Shigella es un género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, integrado por bacterias de forma bacilar, no esporulados, inmóviles, pero animados de movimiento pendular (oscilación) in situ.

Son gram negativos, aerobios-anaerobios facultativos. Citocromo-oxidasa negativos. Fermentan la glucosa sin producción de gas; no obstante, se han encontrado algunos biotipos que producen gas de la glucosa. No descarboxilan la lisina. No fermentan la lactosa. No utilizan el citrato como única fuente de carbono. No crecen en el medio cianuro potásico. Su actividad bioquímica es muy reducida.

4. Conclusión parcial sobre las interacciones bacterianas en la matriz estudiada y la importancia de la microbiología en el área ambiental

El perfil bioquímico de la bacteria que fue aislada de la muestra de la planta tratadora de aguas residuales de la Universidad Tecnológica de León UTL, corresponde a una bacteria patógena (Shigella Flexneri), esta es una entero bacteria Gram negativa, no esporulada, sin cápsula en su estructura celular, tiene una baja actividad bioquímica,. Sus enzimas son muy específicas, pues bajo esta serie de pruebas sólo fue identificada la catalasa pues pudo descomponer el peróxido en agua más oxígeno, no hacen fermentaciones, algunas de ellas como lo es la fermentación de lactosa, y la fermentación ácido-mixta, motivo por el cual las pruebas de RM-VP resultaron negativas, por otro lado tampoco asimila el citrato como única fuente de carbono lo cual indica que no posee la enzima que degrada el citrato en su batería metabólica.

La identificación de bacterias nos ayuda a entender cómo se lleva a cabo la purificación de un efluente contaminado al entender el metabolismo catabólico de dichos microorganismos identificados y que se encuentran en un efluente contaminado es muy importante ya que ellos son los que se encargan de degradar la materia orgánica disuelta en el agua, como sabemos cuando hablamos de materia orgánica nos referimos a las biomoléculas como son proteínas, carbohidratos y lípidos que serian la fuente de energía y los nutrientes que necesita la bacteria para mantenerse viva y multiplicarse, al degradar esta biomoléculas e incorporarlas a su estructura celular, hace una limpieza al efluente convirtiéndose la materia orgánica disuelta en biomasa

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la materia orgánica disuelta en biomasa M I C R O B I O L O
bacteriana que así ves puede ser el alimento de protozoarios que se encuentran en los
bacteriana que así ves puede ser el alimento de protozoarios que se encuentran en los lodos activados y que
entran en contacto con el efluente contaminado, realizando una interacción microbiana benéfica para el
tratamiento de aguas contaminadas.
Al identificar a un microorganismo nativo de una matriz ambiental ( suelo, el agua y el aire ) y entender su
metabolismo catabólico estamos generando conocimientos que nos pueden ayudar posteriormente a una
aplicación biotecnológica en el área ambiental y así poder proponer nuevos tratamientos innovadores de
biorremediación.
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