FORMULARIO DE GUÍAS PRÁCTICAS DE APLICACIÓN Y EXPERIMENTACIÓN DE

LOS APRENDIZAJES

I. INFORMACIÓN GENERAL
ASIGNATURA ENZIMOLOGÍA NIVEL QUINTO
Unidad de ABRIL -
CICLO
organización FORMACIÓN PROFESIONAL SEPTIEMBRE
ACADEMICO
Curricular 2020
DOCENTE DR. MARIO GARCÍA
II. INFORMACIÓN SOBRE LAS ACTIVIDADES PRÁCTICAS
Tema:
Análisis estructural de enzimas y preparación de ilustraciones para publicación.
Objetivo:
Identificar el concepto de sitio activo, la relación entre estructura y función de una
enzima, y el manejo de herramientas tecnológicas para el análisis de la estructura
tridimensional de proteínas y enzimas.
Modalidad:
Presencial
Tiempo de Duración: 3 horas
Instrucciones:
- Lea la hoja guía antes de presentarse a la práctica.
- Verifique que su computador tiene conexión a internet.
- De ser posible, trabaje individualmente. Caso contrario trabaje en parejas.

El estudio de la estructura tridimensional de las enzimas es clave para poder entender

su mecanismo de reacción, regulación e inhibición. Existen varios métodos para
determinar la conformación tridimensional de macromoléculas, incluyendo las enzimas.
Entre ellos destacan la resonancia magnética nuclear (NMR), la cristalografía de rayos
X y la crio microscopia electrónica. Las estructuras 3D obtenidas mediante estos
métodos no tendrían valor alguno si no se dispone de herramientas para interpretarlas
gráficamente. Por tal motivo, el análisis bioinformático de datos estructurales es clave
en el proceso de análisis estructural de una enzima. Los programas PyMol y Coot son
programas sencillos y de gran utilidad para este fin.

Listado de equipo, materiales y recursos:

- Computador
- Internet
- Programas PyMol y WinCoot.

Actividades por desarrollar:

Análisis estructural del complejo Proteasa del virus del VIH – ritonavir.
1. Diríjase a la página web del Protein Data Bank (www.rcsb.org) y busque el
código 3NDW.
2. Descargar el archivo que incluye las coordenadas de la estructura tridimensional
de 3NDW (extensión .pdb)
3. Abrir el archivo .pdb en mediante el programa PyMol.
 4. Construya una ilustración de 3NDW estilo cartoon y muestre al fármaco ritonavir
(inhibidor) con una representación sticks.
5. Muestre la conformación del inhibidor mediante una representación ball and
stick. Ajustar los parámetros con los siguientes comandos.
6. Muestre las interacciones no covalentes mas importantes para la unión del
inhibidor ritonavir a la proteasa del virus del VIH.
7. Realice una representación gráfica de la superficie de la proteína.

A1. Representación del esqueleto de la proteína.

Para poder estudiar la estructura tridimensional de una enzima, es necesario
representarla gráficamente siguiendo parámetros internacionales de ilustración. Uno de
ellos es la representación del esqueleto de la proteína en forma de una cinta o lazo
(cartoon). Esta es una representación muy sencilla que permite conocer aspectos de la
estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de la enzima en estudio.
Primeramente, seleccione todos los átomos de 3NDW. Navegue en el menú derecho S
(Show) y escoja la opción cartoon. El esqueleto de la proteína debe mostrarse en forma
de cinta. Sin embargo, las cadenas laterales de los aminoácidos y las moléculas de
agua permanecen presentes saturando la ilustración. Navegue en el menú derecho H
(Hide) y esconda las cadenas laterales mediante la opción Lines. Esconda las
moléculas y cualquier otro átomo de agua de forma similar. Cambie el color de la
estructura para darle un efecto artístico.
Coloque la estructura de 3NDW de tal forma que se pueda obtener información sobre
su conformación tridimensional y realice una imagen mediante la opción ray ubicada en
el panel superior derecho o mediante una captura de pantalla.

A2. Representación del inhibidor presente en la estructura.

Ahora seleccione con el cursor únicamente al inhibidor ritonavir. Represente al inhibidor
en forma de palillos mediante la opción sticks del menú derecho S. Cambie el color del
inhibidor de tal forma que se identifique los átomos de carbono, oxigeno, nitrógeno, y
otros. Coloque al inhibidor de tal forma que se pueda obtener información sobre su
conformación tridimensional y su mecanismo de unión con la enzima y realice una
imagen mediante la opción ray ubicada en el panel superior derecho o mediante una
captura de pantalla.

A3. Realice el mismo proceso indicado en A8, pero represente el inhibidor mediante un
esquema de palillos y esferas (ball and sticks).
Utilice los siguientes comandos para redefinir el diámetro de los palillos y de las
esferas.
Set stick_radius = “a value”
Set sphere_scale = “a value”
Realice una imagen mediante la opción “Ray” ubicada en el panel superior derecho o
mediante una captura de pantalla. Copie y pegue la figura en PowerPoint. Adicione
etiquetas para identificar lo mas representativo de la figura. Explique la figura en un par
de líneas.

A4. Representación de las interacciones entre el inhibidor y la enzima.

Encuentre Asp25 en las dos cadenas de polipéptido que conforman la proteasa del
virus del VIH usando la secuencia. Estos residuos son muy importantes en la catálisis y
para la unión del inhibidor. Seleccione estos dos residuos y represéntelos en forma de
sticks. Use la función del menú Winzard>Measurment para medir las distancias entre
los átomos que forman puentes de hidrogeno entre el inhibidor ritonavir y la enzima. Los
puentes de hidrogeno tienen una distancia típica entre 2.1 y 3.2 Å.
Haga una figura en la cual se remarque los puentes de hidrogeno entre el inhibidor y la
enzima. Esta figura debe ser un zoom-in para compararla con la primera imagen.
Realice un ray o una captura de pantalla y coloque la imagen en un archivo de
PowerPoint para etiquetar apropiadamente la imagen.

A5. Representación gráfica del aspecto superficial de la proteína.

Primero, cambie el color del fondo (background) sobre el cual se encuentra la proteína.
El programa muestra por default el color negro. Cambie el fondo a color blanco
mediante el menú Display>Background>White.
Seleccione todos los aminoácidos que conforman 3NDW. A continuación, navegue por
el menú derecho. Presione S (show) y luego la opción Surface (superficie). Cambie los
colores de los átomos que conforman 3NDW mediante el menú C (color). Mueva la
proteína de tal forma que se aprecien sus características tridimensionales y se pueda
entender/aprender sobre su estructura-función. Genere una imagen de alta calidad de
sus ilustraciones.
Resultado de Aprendizaje:

Los estudiantes identifican el concepto de sitio activo, inhibición enzimática, y son

capaces de elaborar ilustraciones graficas de enzimas para publicación mediante el uso
de herramientas digitales para el análisis estructural de macromoléculas.

Conclusiones:
El estudiante deberá presentar un informe de la práctica según el formato que se
explicará durante la misma.
Cuestionario:
1. ¿Cuáles son las principales características de la unión del inhibidor ritonavir en
la proteasa del virus del VIH?
2. ¿Qué tipo de interacciones no covalentes pudo identificar como criticas para la
unión del inhibidor ritonavir a la proteasa del virus del VIH?
Recomendaciones:
Leer con atención el instructivo y seguir las indicaciones del ayudante de laboratorio o
el profesor.
Bibliografía:

Notas:
VALIDACIÓN DE LAS GUÍAS DE PRÁCTICAS

Fecha de elaboración: 16 de marzo de 2018

Ing. Mg. Juan Espinoza Mg. Marlene Ortiz

COORDINADOR UNIDAD DE
DOCENTE PLANIFICADOR UTA ORGANIZACIÓN CURRICULAR

M.Sc. Carlos Santiago Moreno Miranda

COORDINADOR DE CARRERA