BIODISPONIBILIDAD DE HIDROCARBUROS

METEORIZADOS EN SUELOS CONTAMINADOS

CON ACEITE DEMOTOR: IMPACTO DELA
BIOAUMENTACIÓN MEDIADA POR
PSEUDOMONAS SPP. EN LA
BIORREMEDIACIÓN

01
 Pseudomona aeruginosa.

Los hidrocarburos de la fracción más

Resumen
pesada (C15-C36) están formados en el
suelo tras la meteorización biótica y
abiótica del aceite de motor son las
continuas limitaciones en la estrategia de
biorremediación, y su biodisponibilidad
siendo un factor regulativo mal
cuantificado. En un estudio de
microcosmos, utilizamos dos cepas de
Pseudomonas, P. putida y P.aeruginosa, en Los datos sobre la actividad de la
estrategias de biorremediación, a saber, la deshidrogenasa confirmaron claramente los
atenuación natural, la bioestimulación y la de las estrategias de biorremediación
bioaumentación, para la remoción de utilizadas, indicando que este ensayo
hidrocarburos totales de petróleo (TPHs) enzimático podría servir como indicador del
potencial de biorremediación del suelo
contaminado con aceite.
Además, los datos de pirosecuenciación 454
Pseudomona putida. coincidían con los de las estrategias de
biorremediación utilizadas en el presente
estudio de microcosmos, lo que sugiere el
posible uso de la pirosecuenciación en el
diseño de enfoques para la biorremediación.

02
 Introducción
La producción, el transporte, el uso y la eliminación de
El envejecimiento, por lo tanto, un proceso natural importante
lubricantes o aceites de motor tienen varios impactos
de contaminantes en el medio ambiente del suelo que afecta su
ambientales.
biodisponibilidad, toxicidad biológica y biodegradabilidad. El
El aceite de motor persiste durante más de seis años en algunos
suelo contaminado con petróleo a largo plazo consiste
ecosistemas, lo que provoca problemas crónicos en la biota.
principalmente en compuestos recalcitrantes de hidrocarburos
Incluso en condiciones controladas, el aceite no puede ser
de alto peso molecular (compuestos NC25) que son más
metabolizado rápida y completamente por los
difíciles de degradar por los microorganismos autóctonos.
microorganismos, y los aceites de motor tardan semanas o
Además, los hidrocarburos meteorizados tienen diferencias
meses en degradarse (Bidoia et al., 2010). La meteorización es
cualitativas y cuantitativas significativas en comparación con
una acción en la que los procesos físicos, químicos y
los productos frescos del petróleo, y estos aún no se consideran
biológicos afectan el tipo de hidrocarburos que quedan en un
en la mayoría de las evaluaciones de riesgo (Jiang et al., 2016).
suelo (Loehr et al., 2001). Además, la meteorización mejora la
absorción de los contaminantes en la matriz sólida del suelo y
su difusión en los poros del suelo con un mayor tiempo de
contacto que conduce a una menor biodisponibilidad de los
contaminantes a los microorganismos (Gao, 2009)

03
 La contaminación del suelo y sedimentos
con hidrocarburos de petróleo es un grave
problema ecológico que justifica la
rehabilitación de los sitios contaminados
con petróleo.
La biorremediación, entre las técnicas de
remediación, es factible porque los
compuestos del petróleo que incluyen
compuestos aromáticos y alifáticos de
cadena ramificada y no ramificada son
susceptibles de proceso de biodegradación
(Chatterjee et al., 2008; Smith et al., 2015).
04
El objetivo principal de este estudio fue
investigar la eficiencia de diferentes estrategias
de biorremediación de suelo recolectado de un
sitio que ha sido contaminado durante mucho
tiempo con aceites de motor y otros productos
derivados del petróleo de automóviles o
mediante cualquier disposición no intencional.
Este estudio es el más reciente, ya que las dos
cepas de Pseudomonas sp., P. putida TPHK-1 y
P. aeruginosa TPHK-4, son capaces de crecer
en hidrocarburos de petróleo, fueron aisladas
de sitios contaminados con petróleo, y su gran
potencial en la degradación de diésel y n-
alcanos ha sido bien establecido (Ramadass et
al., 2016).
 Materiales y
Muestra de suelo y
metodología
aislamientos bacterianos
El contenido de El suelo contaminado con
aceite de motor se recogió
carbono orgánico en un patio de servicio
(OC) del suelo
mediante el método de
oxidación húmeda

La distribución del
tamaño de las La muestra de suelo
partículas del suelo se homogeneizó y se
se determinó pasó por un tamiz de
mediante el método 2 mm
de la micropipeta

El pH y la conductividad
eléctrica se midieron en
una suspensión 1:5
(suelo:agua; p/v)
utilizando Smart CHEM-
Lab
05
 La concentración de nitrato y
amoniaco en el extracto de
agua del suelo se determinó
mediante cromatografía iónica
(IC) con un analizador de iones
Dionex ISC-2000 equipado
con una columna AS18
(Dionex)

P. putida y P. aeruginosa, que El análisis de metales

fueron aisladas anteriormente pesados ​se realizó
del suelo contaminado con
petróleo exhibía un gran
utilizando ICP-MS Agilent
potencial para degradar las 7500c (espectrómetro de
altas concentraciones de masas de plasma acoplado
hidrocarburos inductivamente

La extracción en un
sistema de reacción
acelerada por microondas
(CEM-MARS X®, CEM
Corporation, Matthews ,
NC, EE. UU.) 06
Estudio del microcosmo
del suelo

Los microcosmos del suelo

Los detalles de los diferentes
tratamientos (T2-T7) incluidos en
microcosmos como atenuación
natural, bioaumentación usando
dos Las cepas bacterianas y la
bioestimulación con la aplicación
de fertilizantes inorgánicos (NPK)
consistieron en porciones
(400 g) de suelo contaminado
con aceite de motor,
colocadas en frascos de
vidrio de 1 L

molar de 100: 10: 1: 2,5

de carbono (C), nitrógeno mantenidos al 60% de
(N), fósforo (P) y potasio WHC e incubados
(K), respectivamente, durante 30 semanas a
según lo recomendado. temperatura ambiente
para estudios de
biorremediación
(25 ± 2 ° C)

Se prepararon controles
abióticos (T1) mezclando
muestras de suelo con HgCl2 al
2% . Se utilizaron nitrato de
amonio y dihidrógeno fosfato
de potasio como enmiendas de
nutrientes para proporcionar
una proporción
07
Tratamiento Detalles del tratamiento Propósito
T1 Esterilizado (2% HgCl2) OCS Control abiótico
T2 OCS Atenuación natural
T3 OCS + NPK inorgánico Mejora de la atenuación natural (bioestimulación)
T4 OCS + P. putida TPHK-1 Bioaumentación
T5 OCS + P. aeruginosa TPHK-4 Bioaumentación
T6 OCS + P. putida TPHK-1 + NPK inorgánico Bioaumentación + bioestimulación
T7 OCS + P. aeruginosa TPHK-4 + NPK inorgánico Bioaumentación + bioestimulación

08
 Análisis de muestras de
suelo para hidrocarburos
totales.

Los extractos de disolvente

° C min − 1, y se mantuvo a
esta temperatura durante 5
min. El tiempo de
ejecución total fue de 19,6
min (Risdon et al., 2008).
se analizaron en busca de
hidrocarburos totales
utilizando un cromatógrafo
de gases equipado con un
detector de ionización de
llama (GC-FID Agilent
modelo 6890).

Se aplicó una inyección La cromatografía se

sin división con un realizó en una
volumen de muestra de
columna capilar de
1 μl. La temperatura del
horno se incrementó de
sílice fundida BPX-5 de
50 a 300 ° C con un SGE (15 m x 0,32 mm
gradiente de 25 ° C. de diámetro interno)

recubierta con HP-5 (espesor

de película de 0,10 µm). El
helio se utilizó como gas
portador en 2,5 mL min-1, y la
temperatura del detector FID
se mantuvo a 300 °C.

09
Análisis de concentraciones Técnica de extracción suave
para estimar las fracciones
biodisponibles de biodisponibles de
hidrocarburos en muestras de
hidrocarburos suelo de microcosmos
utilizando hidroxipropil-β-
ciclodextrina acuosa (HPCD)

Se tomaron triplicados de
para la extracción suave de muestras de suelo secas y
hidrocarburos utilizando n- tamizadas (1,25 g) de cada
butanol agregaron 15 ml de n-
microcosmos en tubos de
butanol a porciones de 5 g de
suelo húmedo y luego se centrífuga de Teflón de 40 ml
suspendieron en un mezclador y se añadieron a cada tubo 25
de vórtice durante 2 min ml de solución acuosa 50 mM
de HPCD.

Las fases orgánicas se

deshidrataron pasándolas a
El sobrenadante se extrajo
través de Na2SO4 anhidro, se
líquido-líquido con 10 mL de
combinaron y se concentraron
hasta 1,0 ml bajo una suave DCM
corriente de nitrógeno. 10
Ensayo deshidrogenasa
del suelo

se expresó en términos
de trifenilformazán (TPF)
formado a partir de
cloruro de
trifeniltetrazolio (μg TPF g
− 1 suelo h − 1)
Se determina la influencia de
la contaminación por
hidrocarburos en la actividad
microbiana en suelos
contaminados con aceite de
motor

Se mide la actividad
deshidrogenasa a intervalos
periódicos en muestras de suelos
de microcosmo

11
Amplificación de genes de
El ADN de la comunidad
ARNr 16S y microbiana total se aisló de
1,0 g de muestra de suelo de
pirosecuenciación cada tratamiento utilizando el
kit de extracción de ADN de
suelo MoBio.

Los amplicones de PCR se

454 pirosecuenciación aquí para generaron utilizando
el perfil de diversidad cebadores, mezcla maestra
microbiana antes y después de AmpliTaq Gold 360, Las
la biorremediación del suelo ampliaciones resultantes se
contaminado a largo plazo con midieron por fluorometría, se
hidrocarburos meteorizados. normalizaron y midieron
mediante la PCR

Este conjunto de ampliaciones

un millón de lecturas de se ejecutó luego en la
secuencia de 500 millones de
plataforma GS-FLX usando la
pares de bases de información
química XLR70. Dado que la
de secuencia en una sola
ejecución a un costo pirosecuenciación de Roche
relativamente bajo 454 GS FLX puede 12
proporcionar
Análisis estadísticos

Todas las pruebas

estadísticas se
realizaron con
SPSS versión 17.0.

Se aplicó la prueba de
rango múltiple de
Duncan (DMR) para
determinar la
significación estadística
de los valores medios
(n = 4) a P ≤ 0.05

13
 Resultados
Resultados yy
Biorremediación de suelos contaminados con
hidrocarburos degradados en aceite de motor discusión
discusión
Estas relaciones de C: N y C: P se utilizaron ya que se sabe
que proporcionan la cantidad requerida de N y P para
convertir el 100% de C del petróleo en biomasa celular
(Dibble y Bartha, 1979). Entre los metales pesados, se
encontró que la concentración de Cu (798 mg kg − 1) en
suelos contaminados con petróleo era más alta, seguida de
Zn, Pb, Ni y Cr

El grado de biorremediación en cualquiera de los

tratamientos utilizados no fue del 74%, aunque las muestras
de suelo se incubaron durante un total período de 210 días.

14
15
El impacto negativo de las enmiendas de
nutrientes sobre la biodegradación de los TPH no
es infrecuente.
Del mismo modo el impacto negativo da adición
de nutrientes en las poblaciones de degradadores La bioaumentación de muestras de suelo
de TPH en el suelo. Aunque el propósito de las contaminadas con aceite de motor con P.
enmiendas de nutrientes para la eliminación de aeruginosa TPHK-4 resultó en un 22% más de
contaminantes es estimular las actividades degradación de los hidrocarburos que la que se
metabólicas en los microorganismos, Sarkar et al. produjo en las muestras atenuadas naturalmente
(2005) no notaron ningún beneficio en la tasa de dentro de los 90 días. Por otro lado, P. putida
degradación del TPH con la adición de nutrientes TPHK-1 también se desempeñó mejor al efectuar
debido a la toxicidad del amoníaco en niveles un 18% más de degradación de los hidrocarburos
altos. en comparación con la atenuación natural.

Se observaron muy pocos cambios en la

población de degradadores de TPH en suelos
modificados con nutrientes.
Nuestra observación actual de una clara
inhibición en la biodegradación de TPH en
muestras de suelo contaminadas con aceite que
recibieron fertilizantes NPK sugiere claramente
que el nivel óptimo de contenido de N del suelo
necesario para una biorremediación eficiente
después de la atenuación natural es de alrededor
de 90 mg kg-1 de suelo, que es el nivel de N
presente en el suelo recolectado originalmente, y
cualquier N adicional inhibiría la biodegradación
de los TPH. 16
Biodisponibilidad de hidrocarburos
meteorizados en suelos contaminados
con aceite de motor
la concentración total de
hidrocarburos medida en un suelo
después de una extracción exhaustiva
con solventes no proporcionará una
idea de su fracción potencialmente
biodegradable
Se ha propuesto la extracción no
exhaustiva del suelo contaminado
utilizando extractantes orgánicos
suaves para predecir la
bioaccesibilidad de los HAP y los
plaguicidas para la biodegradación
La mayoría de los estudios de
biodisponibilidad se ocuparon de
hidrocarburos aromáticos individuales
o compuestos de PAH, pero se ha
entendido muy poco sobre la
biodisponibilidad de los hidrocarburos
alifáticos meteorizados en suelos
contaminados

con el porcentaje de degradación Se realizó una comparación del

previsto obtenido después de la
extracción con HPCD o butanol al día 0
en para determinar la extensión de las
porciones biodisponibles de TPH para
la biorremediación de suelos
contaminados con aceite de motor.
porcentaje de degradación medido de
fracciones de hidrocarburos
meteorizados en diferentes
tratamientos después de 210 días
después de una extracción exhaustiva
con una mezcla de DCM y acetona

17
Biodisponibilidad (basada en la degradación prevista y medida) de las fracciones de hidrocarburos meteorizados en suelos contaminados con aceite de motor.

18
 Actividad deshidrogenasa del suelo: un
indicador de la biorremediación de TPH
De acuerdo con la eficiencia de la remediación, la salud del
ecosistema del suelo también debe tenerse en cuenta en la
biorremediación de suelos contaminados con contaminantes como
el aceite de motor.
Por lo tanto, el monitoreo continuo de la actividad microbiana es
imperativo para mantener un ecosistema de suelo sano, así como
para lograr una biorremediación exitosa.
Se utilizó el ensayo de deshidrogenasa en suelos contaminados con
aceite Diesel como un método simple para examinar los posibles
efectos inhibidores de los contaminantes sobre la población
microbiana.
Al igual que con la biodegradación de hidrocarburos, P. aeruginosa
TPHK-4 se desempeñó mejor que P. putida TPHK-1 en la expresión
de deshidrogenasa durante la biorremediación de suelos
contaminados con aceite de motor. Por tanto, la bioaumentación
mediada por esta cepa fue de 2,6 veces en comparación con la
atenuación natural al final de los 90 días. Nuevamente, la adición de
una cepa bacteriana junto con NPK a las muestras de suelo (T6 y
T7) que contienen hidrocarburos erosionados resultó en una
inhibición significativa de la biorremediación.

Hubo un aumento gradual en la actividad de la

deshidrogenasa en la muestra de suelo atenuada naturalmente
(T2) hasta los 30 días de incubación, y luego se inhibió.
La adición de fertilizantes inorgánicos al suelo contaminado
con aceite (T3) inhibió en gran medida la actividad
enzimática.
Claramente, la actividad de la deshidrogenasa se correlacionó
bien con los tratamientos bioaumentados (T4 y T5) que
contenían las cepas bacterianas introducidas hasta por 90 días, 19
y la enzima se inhibió significativamente posteriormente
20
Pirosecuenciación: implicación
para la biorremediación de TPH
La distribución, diversidad y composición de las comunidades
bacterianas en diferentes tratamientos de suelo contaminado
con aceite de motor se exploró a los 0 y 210 días después de la
pirosecuenciación 454 de alto rendimiento, ya que esto
proporcionaría una información detallada sobre la taxonomía y
el potencial metabólico de las bacterias en biorremediación

En particular, el principal objetivo al utilizar la

pirosecuenciación fue determinar el grado de supervivencia y
crecimiento, en términos de abundancia poblacional, de cepas
bacterianas introducidas con el fin de validar los datos
obtenidos sobre su potencial en la biorremediación de suelos
contaminados con aceite de motor.

Los esultados sobre la pirosecuenciación basada en ARN

agruparon las secuencias obtenidas de los seis tratamientos del
suelo (T2-T7) en 13 filos bacterianos diferentes

21
22
 Conclusión
En un estudio de microcosmos, evaluamos el potencial de biorremediación del suelo contaminado a
largo plazo con aceite de motor siguiendo diferentes enfoques, como atenuación natural,
bioestimulación y bioaumentación. Aunque el suelo contenía altas concentraciones de hidrocarburos
meteorizados, la atenuación natural se produjo de forma apreciable; sin embargo, el tratamiento del
suelo con fertilizantes NPK a los niveles recomendados para la bioestimulación resultó en una
inhibición significativa de la atenuación natural. Introducción de cepas bacterianas degradantes de
hidrocarburos, P. putida TPHK-1 o P. aeruginosa TPHK-4 en muestras de suelo contaminadas con
aceite dio como resultado una bioaumentación pronunciada. Sin embargo, un enfoque de
combinación de bioaumentación y bioestimulación inhibió significativamente la biorremediación de
los TPH degradados. Estos resultados sobre biorremediación estuvieron de acuerdo con la respuesta
de la actividad deshidrogenasa en suelos contaminados con aceite, lo que sugiere que el ensayo de
esta enzima podría servir como indicador para evaluar el potencial de biorremediación de suelos
contaminados con hidrocarburos. La extracción de suelo contaminado con aceite para hidrocarburos
meteorizados con HPCD, pero no butanol, predecir mejor su disponibilidad para la biorremediación.
Los datos sobre la pirosecuenciación de ARNr 16S de muestras de suelo con diferentes tratamientos
también coincidieron claramente con su potencial de biorremediación. Sin embargo, en esta
dirección se requieren más investigaciones que involucren un mayor número de suelos
contaminados con una mezcla compleja de hidrocarburos meteorizados.

23
Preguntas

24