Técnicas de fluorescencia para

observaciones en cultivos

Dra. Graciela Calderón Mendoza

Biotecnología Molecular
Investigación científica en Embriología y
Andrología

Ciudad de México, 2016

 Microscopia: balance entre
contraste y resolución

Microscopio de camplo claro: detalles las estructuras permanecen invisibles a

pesar de la resolución

Objetivo: Incrementar el contraste para obtener imágenes de células vivas con más
detalles y evaluar procesos vitales celulares en pleno desarrollo
 Microscopía de Fluorescencia.

Fluorescencia: propiedad que poseen determinadas sustancias

(fluorescentes)de emitir, bajo la acción de radiaciones de onda
corta, otras radiaciones de longitud de onda más larga.

Espectro Electromagnético

Ultravioleta Infrarrojo
Rayos
RayosX Visible Microondas
Gamma

Longitud 0.1 1 180 340 750 400 . 103

de onda

Fluorocromo: marcador colorante fluorescente empleado en la investigación para crear

contraste en zonas determinadas de las muestras a estudiar.
 Fluorocromo Longitud de onda de Longitud de onda de
absorción (nm) emisión (nm)
Cascada blue 374-403 422-430

Floeresceína (FITC) 494 520

Rodamina (TRICT) 540 570

Naranja de acridina 460-502 526-650

Yoduro de propidio 536 617

Nucleótidos de nicotina reducidos (NADH, NADPH), núcleotidos

de flavina oxidados, clorofilas,
Fluorocromo intracelulares Proteínas fluorecentes: (GFP) Aequorea victoria
naturales EGFP mejorada, EYFP
azul (BFP), ciano (CFP) y amarillo (YPF)
pCMV-GFP, pRSV-βgal
DsRED naranja y roja
Hoescht: a. nucleicos

❖ Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación. Estudios inmunológicos,

Mineralogía.
 Tipos de Microscopía de Fluorescencia

❖ Primaria. La propia muestra posee fluorescencia (autoflorescencia).

❖ Secundaria: muestra marcada con colorantes fluorescentes.

❖ Inmunofluorescencia: la fijación del colorante fluorescente se realiza

con un anticuerpo marcado.
 Aplicaciones de la microscopia de fluorescencia
✓ Visualizar partes de la célula: membrana plasmática, núcleo, vacuolas,
retículo endoplásmico, etc.

✓ Estudiar procesos celulares: división celular, muerte celular, cambios en el

potencial de membrana, endocitosis y exocitosis.

✓ Observar determinados iones, cambios de pH, etc.

✓ Diferenciar partículas muy pequeñas que por contraste de fases no se

resolverían.

✓ Localizar moléculas específicas: proteínas, lípidos, etc

✓ Estudiar la interacción entre moléculas in vivo.

Microscopio convencional
de fluorescencia
Fluorocromos para evaluar la viabilidad

Figura 1 Tinción de Escherichia coli, bacterias teñidas con yoduro de propicio (en
rojo) y bacterias teñidas con SYTO 9 (en verde). Microscopía de fluorescencia
(100x). Tomada de Thermo Fisher Scientific 2012.
Marcaje con múltiples fluorocromos

Figura 2 Células en división. DAPI, GFP y rodamina.

Fluorescence Applications (2006).
 CTC para evaluar el estado fisiológico de los espermatozoides
(a) (b) (c) Figura 3. Fluorescencia de
Sin MP y ACRO espermatozoides con clortetraciclina
(CTC) (40x). (a y d): espermatozoides sin
ACRO C
R.E tratamient con detergentes, se observan
MP
SARC 4% PM MP y ACRO intactos (b): con
tratamiento de SARC 4% adherido en la
cabeza espermática, pieza media (PM) y
MP ACRO (d) (e)
R.E
(f)
cola (C), (e): con tratamiento de SDS 5%
SDS 5%
en cabeza, y (c y f) espermatozoides
lavados sin MP y ACRO con reacción
Sin MP y ACRO
acrosomal, caracterizada por la
presencia de la región ecuatorial (RE) la
cual se observa como una línea
Figura 1. Fluorescencia de espermatozoides con clortetraciclina (40x). (a y d): espermatozoides sin tratamiento fluorescente
con que divide la cabeza
espermática. MP: membrana plasmática,
detergentes, se observan MP y ACRO intactos (b): con tratamiento de SARC 4% adherido en la cabeza espermática, pieza
media (PM) y cola (C), (e): con tratamiento de SDS 5% en cabeza, y (c y f) espermatozoides lavados sin MP y ACRO con

ACRO: acrosoma y RE: reacción

reacción acrosomal, caracterizada por la presencia de la región ecuatorial (RE) la cual se observa como una línea fluorescente
que divide la cabeza espermática.

acrosomal. Calderón et al. (2009)

Tinción de espermatozoides con Hoescht para
microinyección de ovocitos

Figura 4. ICSI de ovocitos con espermatozoides de

bovino teñidos con Hoechst. ZP: zona pelúcida. MP:
membrana plasmática y C: citoplasma. Observaciones
40X. Calderón et al.(2010)
FIgura 5. Embriones fertilizados con espermatozoides transfectados con ADN exógeno (pCMV-GFP) (a y e) 12
horas post-fertilización, (b y f) embriones de 4 células, (c y g) 8 células y (d y h) 16 células y otros embriones
degenerados tratados con SARC 4% y SDS 5% respectivamente. 40X. Microscopico de fluorescencia. Degradación
de la fluorescencia conforme avanza el desarrollo embrionario. (Calderón et al. (2012)
Fig. 6. Embriones de humano (día 4) Fig. 7. Embrión ( 2 células) de cerdo producido
Imagen de contraste por interferencia por la microinyección espermática conicubado
diferencial. 2013. con EGFP. Obsrvado bajo luz azul (488 nm).
Garcia et al. (2009)

Figura 8. Ovocito maduro

metafase II. 40X. Hoescht-
CMEB-UMSNH. 2010
Microscopio
confocal
 Microscopio confocal: Microscopio láser de barrido

✓ Es un instrumento que permite realizar cortes ópticos finos a muestras de tejidos más o menos
gruesos y realizar reconstrucciones en tres dimensiones a partir de cortes seriados.

✓ Permite enfocar únicamente un plano determinado del espécimen, eliminando la luz

(fluorescencia) procedente de las regiones que no están en el plano de enfoque.

✓ Alta calidad de las imágenes que proporciona a partir de especímenes preparados con las
técnicas de laboratorio habituales para la microscopía de fluorescencia.

✓ Monitoriza los movimientos de las moléculas dentro de las céulas.

✓ Investigación biomédica
Fig. 9 Colecciones de secuencias seriadas. Laser Scanning Confocal Microscopy.
Figura 10
Reconstrucciones tridimensionales a
partir de cortes ópticos obtenidos
con el microscopio confocal.
(a) grano de polen, (b) muestra de
hígado de ratón, (c) corte grueso de
corteza cerebral de rata. Se
emplearon varios marcadores
fluorescentes. (d) auto fluorescencia
de una porción de raíz de helecho.
Las reconstrucciones fueron
realizadas a partir de series de 30-45
cortes ópticos. Claxton N, Fellers T,
Davidson M. (2008). Laser Scanning
Confocal Microscopy.
Figura 11 A) Imagen de microscopia óptica de fluorescencia de una laga (Spyrogira), B) Imagen del
mismo tipo de muestra (Spyrogira) obtenida con el microscopia confocal. Fluorescence Applications
(2006).
Marcaje con múltiples fluorócromos

Figura 12 (a) Porción de cerebro de un ratón con

dos neuronas fluorescentes de colores diferentes.
Los ratones se obtienen mediante el
apareamiento de animales transgénicos cuyas
neuronas se marcan con una u otra proteína
fluorescente. (b) Micrografía con fluorescencia de
porciones de dos neuronas, una marcada con YFP
y otra marcada con CFP.
 Marcaje con múltiples fluorocromos

Figura 13.-Micrografías comparativas entre las técnicas de fluorescencia con iluminación

convencional o de campo amplio. Las muestras de la izquierda (hipotálamo de ratón) y centro
(músculo liso de rata) fueron marcadas con diversos fluorocromos (dobles y triples marcajes). Las
imágenes de la derecha corresponden a un grano de polen de girasol el cual es
autofluorescente. Claxton N, Fellers T, Davidson M. (2008). Laser Scanning Confocal Microscopy.
 Marcaje con dobles fluorócromos

Figura 14. Comparación entre dos micrografías de una célula en mitosis, contrastada
con un doble marcaje fluorescente, tanto para los cromosomas (verde) y la actina
(rojo). Laser Scanning Confocal Microscopy. The Imaging Technology Group.
 Inmunofluorescencia

El fundamento de la técnica radica en la

capacidad que muestran algunos elementos o
compuestos fluorescentes (fluorocromos), en
fijarse a los anticuerpos mediante un enlace
químico estable que no puede romperse
durante el curso de la reacción inmunológica
(Held et al; 2015).
 Inmunofluorescencia

(Held et al. (2015).

 Inmunofluorescencia directa Inmunofluorescencia indirecta

MUESTRA: fijación de la célula, permeabilización y lavados

(Held et al. (2015).
Fluorescence in situ Hibridizatión (FISH)
Funcionamiento
Inmunofluorescencia directa Inmunofluorescencia
indirecta
Immunofluorescence Microscopy
 Inmunofluorescencia

✓ Fluorocromos FIJAN Anticuerpos= reacción inmunológica

✓ F. naturales: vitaminas, esteroides y porfirinas.

✓ F. fluorescen –rodamina, auramina, fluoresceína, colorantes de acridina– se utilizan en distintas

técnicas de tinción, como la tinción de microorganismos ácido-resistentes con
auraminarodamina en muestras de tejido y esputo.

✓ Inmunofluorescenica: gérmenes vivos o muertos.

✓ Requiere pequeñas cantidades de Ag.

✓ Permite identificar un Ag con la ayuda de un inmunosuero conocido e investigar y titular un Ac

con la ayuda de un AG conocido.
 Immunofluorescent Staining
Immunofluorescent staining makes use of antibodies to locate and
identify patterns of protein expression in cells.

Primary antibody binds to antigen.

Antibody-antigen complex is bound by a secondary antibody

conjugated to a fluorochrome.

Upon absorption of high energy light, the fluorochrome emits light at

its own characteristic wavelength (fluorescence) and thus allows
detection of antigen-antibody complexes.

Suitable for: 1. frozen, non-fixed tissues and ethanol fixed tissues

2. paraformaldehyde-fixed or methanol/acetone-fixed
cells
 Microscopia: balance entre
contraste y resolución

Aplicaciones
MONITOREO AMBIENTAL: aire, agua, ecosistemas

CALIDAD DE LOS ALIMENTOS: microorganismo en alimentos

DIÁGNOSTICO: enfermedades

NEUROCIENCIA: estudiar la organización del sistema nervioso

BIOLOGIA CELULAR: células vivas (procesos vitales en pleno desarrollo)

Figura 1 Micrografía en campo claro de una célula epitelial de la mucosa
bucal antes (izquierda) y después (derecha) de modificación digital para
mejorar el contraste. Modificada de Wegerhoff R, Weildich O, Kassens
M. (2005).
Los principios básicos de estas técnicas especiales de microscopía se basan en:

La modificación de la manera como incide la luz sobre el espécimen: Empleo de

condensadores y filtros:
- Microscopio de campo oscuro.
- Microscopio de contraste de fase.
- Microscopio de luz polarizada, Microscopio petrográfico y metalúrgico.
- Contraste por interferencia diferencial (Differential Interference Contrast) Nomarski.

La modificación de la fuente emisora de luz: Cambiando la luz blanca por luz ultravioleta o
rayos láser:
- Microscopio de luz ultravioleta.
- Microscopio de fluorescencia.
- Microscopio confocal.
 Aplicaciones de la Microscopía de fluorescencia

MONITOREO AMBIENTAL: aire, agua, ecosistemas

CALIDAD DE LOS ALIMENTOS: microorganismos en

alimentos

DIÁGNOSTICO: enfermedades

QUMICA: exitar los átomos

NEUROCIENCIA: esudiar la organización del sistema

nervioso

BIOTECNOLOGÍA: líneas celulares, células vivas

Principio de la microscopía confocal

Figura 4.-Esquema que muestra de manera

simplificada el principio del microscopio confocal
y el trayecto de la luz. Modificado de Olschewski
F. (2000). Software in confocal microscopy.
 Figura 5 Iluminación Rheinberg. nematodo
iluminado con la técnica de Rheinberg Campo
obscuro.

Figura 4 Iluminación Rheinberg. Micrografías de

la superficie de una hoja que muestran el aspecto
obtenido con la iluminación Rheinberg. Campo
obscuro.
 Aplicaciones del microscopio de contraste de fases
✓ Observación de células y tejidos vivos.

✓ En estudios de diversas disciplinas como por ejemplo fisiología, parasitología, farmacología

(procesos celulares, identificación y cuantificación de microorganismos y parásitos en fluidos
y tejidos, efecto de medicamentos y otras sustancias en las células y sus procesos de
motilidad, ciclosis, digestión, entre otros).

✓ Estudio de alimentos y medicinas.

✓ Análisis de materiales industriales (metales, cristales, fibras sintéticas, plásticos, pigmentos,

emulsiones y suspensiones minerales).

✓ Estudios geológicos (minerales).

Microscopio de fluorescencia
Inmunofluorescencia directa (izquierda) e indirecta (derecha)
 Bibliografía consultada
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Calderón M. G, Cajero J.M, Olivo Z. I y Toscano I. 2012. Transfección de espermatozoides usando detergentes iónicos para la producción de embriones bovinos transgénicos por ICSI. Centro
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GRACIAS