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Práctica 04. Inhibidores DE Cadena Respiratoria

Fisiología (Universidad César Vallejo)

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Fundamentos Bioquímicos, Enzimología, Carbohidratos y Bioenergética

- INHIBIDORES DE CADENA RESPIRATORIA --

INTRODUCCION:

La cadena transportadora de electrones es un proceso que se produce en la membrana interna mitocondrial, que mediante
reacciones bioquímicas de la Fosforilación Oxidativa producen adenosín trifosfato (ATP), que es el compuesto energético
que utilizan los seres vivos mediante reacciones de óxido-reducción. Las fuentes de energía como la glucosa son
inicialmente metabolizados en el citoplasma y los productos obtenidos son llevados a la matriz mitocondrial donde continua
el metabolismo en el ciclo de Krebs. Los electrones se transportan desde moléculas poco oxidantes como el NADH Y
FADH2 hasta el oxígeno. Una vez que los electrones son entregados al oxígeno, se forma agua. Debido a que la cadena
sólo transporta electrones, los protones son bombeados hacia el espacio entre las membranas, lo que crea un gradiente
de protones con una carga muy positiva fuera de la matriz y una carga muy negativa adentro. Este gradiente obliga a los
protones a volver a entrar a la mitocondria por una enzima llamada ATP sintasa que, con la fuerza de entrada de los
protones, forma ATP y agua metabólica.

Los inhibidores de la respiración son sustancias que inhiben el transporte de electrones en la cadena respiratoria, y de
acuerdo al lugar donde actúan pueden reunirse en cuatro grupos principales; aquellos que bloquean el paso de electrones
a nivel del complejo I (NADH-deshidrogenasa) como los barbitúricos, piericidina A (antibiótico), rotenona (insecticida); los
que bloquean el complejo II (Succinato-deshidrogenasa), el malonato; los bloqueadores del complejo III (citocromo b y
c1) como la Antimicina y los que impiden el paso de electrones del complejo IV (Citocromo-oxidasa) con el oxígeno, como
el cianuro, monóxido de carbono. Existen otros compuestos denominados desacopladores de la fosforilación oxidativa.
Estos agentes debilitan o destruyen completamente el firme acoplamiento normal entre oxidación y fosforilación. Con el
desacoplamiento aumentan las velocidades de oxidación mientras que la fosforilación disminuye, quiere decir que
disminuye la producción de ATP, lo cual da como resultado la producción de calor extra que puede manifestarse en forma
de calor, afectando de forma indirecta a muchos procesos celulares como el transporte de iones y la permeabilidad de la
membrana. Los agentes desacopladores aumentan la permeabilidad de las membranas mitocondriales internas frente a
los protones. Entre los desacopladores comunes se cuentan el 2,4-dinitrofenol, la termogenina, entre otros.

PROCEDIMIENTO:

1. Sacrifique un cobayo y separe el hígado colocándolo en un vaso de precipitación con solución salina a 0ºC y córtelo
en trozos pequeños.
2. Coloque los trozos de hígado en un mortero conteniendo aproximadamente 1 gramo de arena y 5 mL de buffer fosfato
pH 7,0. Homogenícelo hasta obtener una pasta fina y vuelva a agregar 5 mL del mismo buffer.
3. Centrifugue el homogenizado a 4000 rpm por 5 minutos, luego separe el sobrenadante y consérvelo en un tubo de
ensayo sumergido en hielo. Rotúlelo como HH (homogenizado de hígado).

Arme el siguiente esquema de trabajo:

Tubo I II III IV V

Homogenizado de Hígado (HH) mL 1 1 1 1 1

Succinato de sodio (mL) 1 - 1 1 1
Malonato de sodio (mL) - - 1 - -
Cianuro de potasio (mL) - - - 1 -
Bicloruro de mercurio (mL) - - - - 1
Azul de metileno (mL) 1 1 1 1 1
Agua destilada (mL) 1 2 - - -

4. Agitar los tubos y añadir 0,5 mL de aceite mineral suavemente por las paredes de cada tubo.
5. Incubar a 37°C durante 30 minutos.
6. Observar e interpretar los resultados obtenidos.

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Fundamentos Bioquímicos, Enzimología, Carbohidratos y Bioenergética

I II III IV V

CUESTIONARIO:
1) ¿Cuál es la estructura de la cadena respiratoria y explique su funcionamiento?
2) ¿Explique el fundamento de la Teoría quimiosmótica de Mitchel?
3) Fundamente porque se usó el succinato de sodio en la práctica.
4) Explique los mecanismos de inhibición que ejercen el malonato, bicloruro de mercurio y cianuro.
5) ¿Explique el funcionamiento de la fosforilación oxidativa y cómo actúan los desacopladores?

REFERENCIAS:

1) Rodwell V, Bender D, Botham K, Kenelly P, Weil A. Harper Bioquímica ilustrada, 30 ed. Mc Graw Hill
2016. Cap.11, 12,13. Pg 113-138
2) Chávez E, Martínez F, Flores O. Oxidaciones biológicas y bioenergética: Martinez F, Pardo J, Riveros H. eds.
Bioquímica de Laguna y Piña 8 ed, 2018; 393-416
3) Da Poian A, Castanho M. Integrative Human Biochemistry. A texbook for Medical Biochemistry. New York.
2015; pg 194-216

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