Manual de Prácticas Del Laboratorio de Biorreactores

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE BIORREACTORES
MANUAL DE PRÁCTICAS
M. EN C. DYNORA VÁZQUEZ GURROLA

M. EN C. CARLOS OROZCO ÁLVAREZ
M. EN C. LEOBARDO ORDAZ CONTRERAS
DR. SERGIO GARCÍA SALAS
AGOSTO, 2007.
Laboratorio de Biorreactores. Manual de Prácticas
PRESENTACIÓN
La Biotecnología, concebida como la aplicación del conocimiento para la obtención de

productos y servicios mediante el uso de seres vivos o enzimas, hace necesaria la
participación de profesionales que posean capacidades y habilidades para la operación
y control de biorreactores. En ellos es en donde los seres vivos o enzimas llevan a cabo
las transformaciones de materias primas a productos.
Este manual de prácticas del Laboratorio de Biorreactores se centra en el desarrollo de

habilidades de los alumnos para el manejo de equipos auxiliares e instrumentos
necesarios para la operación y control de biorreactores, mediante la descripción
funcional de los equipos, así como de la calibración y uso de instrumentos. También, el
manual se enfoca en que el alumno reconozca las diferencias del funcionamiento de
diversos tipos de biorreactores, mediante la determinación experimental y comparación
de sus parámetros hidrodinámicos, de transferencia de masa y de calor. Así mismo, el
manual está diseñado para que el alumno distinga el funcionamiento de cultivos en lote,
lote alimentado y continuo.
Este manual consta de diez prácticas de laboratorio. Cada práctica tiene una
introducción, objetivos e instrucciones paso a paso para que el alumno alcance los
objetivos planteados. También, tiene instrucciones para la recopilación, análisis y
discusión de los resultados obtenidos, así como para que el alumno haga un reporte
escrito del trabajo práctico realizado.
La práctica 1 está diseñada para que los alumnos conozcan y distingan los diferentes
tipos de biorreactores que existen en la industria biotecnológica. La práctica 2 tiene el
propósito de que los alumnos manejen sistemas de medición y control de variables de
Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 2

operación de biorreactores. En la práctica 3 se revisarán los servicios auxiliares que son

necesarios para la operación de biorreactores. En la práctica 4 se determinarán
parámetros hidrodinámicos como el tiempo de mezclado y el tiempo de circulación en
biorreactores. La práctica 5 está diseñada para que los alumnos aprendan a determinar
la velocidad de transferencia de oxígeno en biorreactores. La práctica 6 servirá para
que los alumnos conozcan y aseguren la operación aséptica de biorreactores. En la
práctica 7 los alumnos llevarán a cabo un ciclo de esterilización de un medio de cultivo.
En las prácticas 8, 9 y 10 los alumnos realizarán diferentes formas de operar un
biorreactor con base en la alimentación y descarga del medio de cultivo.
La apropiación del conocimiento práctico de este curso por parte de los alumnos, les
facilitará la comprensión y el análisis de los contenidos temáticos de la asignatura de
Ingeniería de Biorreactores, situada un nivel adelante del Laboratorio de Biorreactores
en el plan de estudios de la carrera de Ingeniería Biotecnológica.

CONTENIDO
Práctica 1. Presentación de biorreactores diversos ......................................................... 5
Práctica 2. Instrumentación para el seguimiento y control de la biorreacción ............... 10
Práctica 3. Servicios auxiliares ...................................................................................... 26
Práctica 4. Tiempo de mezclado en biorreactores......................................................... 38
Práctica 5. Transferencia de oxígeno en biorreactores agitados y neumáticos ............. 48
Práctica 6. Mantenimiento de asepsia en biorreactores ................................................ 57
Práctica 7. Esterilización del sistema de biorreacción ................................................... 64
Práctica 8. Producción de biomasa en cultivo por lote .................................................. 75
Práctica 9. Producción de biomasa en cultivo por lote alimentado ................................ 85
Práctica 10. Producción de biomasa en cultivo continuo ............................................... 98

PRÁCTICA 1
Práctica 1. Presentación de biorreactores diversos
Presentación de
biorreactores
diversos
INTRODUCCIÓN
Cualquier proceso biotecnológico de nivel industrial tuvo que haber pasado por las
siguientes escalas de operación: laboratorio, planta piloto e industrial (en ese orden
temporal).
Cada escala tiene sus propias características y objetivos, mismos que serán tratados en
otra asignatura (Ingeniería de Bioprocesos), sin embargo, al hablar de biorreactores,
habrá que hacer la distinción entre tamaños, forma de operación y configuración
geométrica.
El biorreactor puede considerarse como el corazón de todo proceso biotecnológico, ya

que en él se lleva a cabo la transformación de la materia prima al producto de interés y
su operación deberá garantizar la maximización en la conversión, por lo que su

funcionamiento es de vital importancia en la rentabilidad del bioproceso, sobre todo en

aquellos catalogados como de “altos volúmenes de producción y bajo valor agregado”.
Entre las características que debe reunir un biorreactor se encuentran las siguientes:
1. Calidad de mezclado; incluyendo tiempo de mezcla y patrones de flujo que
favorezcan tanto la distribución de la materia prima en el biorreactor como su
conversión a producto.
2. Altas velocidades de transferencia de masa, momento y calor, a bajo costo o con
economía aceptable.
3. Factibilidad técnica y económica en la construcción de unidades de gran
volumen.
4. Bajos costos de operación y mantenimiento.
5. Operación aséptica.
Los biorreactores pueden clasificarse de la siguiente forma:
Agitado
Biorreactores Columna
Propelas
Circulación Airlift
Jet
A continuación se describe cada tipo de biorreactor.
Biorreactores agitados
Este tipo de biorreactor es muy empleado, en todas las escalas de producción, en

laboratorios de investigación o en la industria de fermentaciones, pueden utilizarse
incluso para fermentaciones de reología compleja y en procesos en los que se exigen

altas velocidades de transferencia de masa y de calor. Consisten de un cuerpo cilíndrico

con tapas elipsoidales, semiesféricas o toriesféricas. Generalmente su relación
altura/diámetro es menor a 3 y más comúnmente menor a 2. Cuentan con un motor al
que se acopla la flecha de transmisión que contiene a su vez los impulsores que
agitarán el líquido. Dependiendo del tamaño del reactor, el motor puede colocarse en la
tapa superior o en la inferior, pero invariablemente se requiere de sellos mecánicos para
garantizar el trabajo aséptico. Generalmente la “aireación” se realiza a través de tubos
(o placas) perforados, efectuándose la dispersión del aire en las zonas cercanas a los
impulsores.
A pesar de su versatilidad, sus costos de construcción, operación y mantenimiento son

muy onerosos. Por limitaciones técnicas referentes a la transmisión de potencia y a los
problemas de sostenimiento del conjunto “flecha de transmisión – impulsores”, no es
posible construir unidades mayores a los 300 m3.
Biorreactores de columna
Este tipo de biorreactores carece de sistema de transmisión mecánica para mezclar el

caldo de cultivo. El mezclado se realiza por la inyección de aire en el líquido desde el
fondo del recipiente, al dispersarse el aire en burbujas y al ascender causan la
turbulencia del líquido. Generalmente la relación altura/diámetro es mayor a 3. Si las
columnas son grandes se pueden emplear platos perforados colocados en posiciones
intermedias de las mismas para “redispersar” las burbujas de gas.
Al carecer de partes “móviles” tanto la construcción, operación y mantenimiento de este

tipo de biorreactores son más económicos que cualquier otro tipo. Quizá el mayor gasto
de operación sea el de compresión de aire, en razón de los altos flujos requeridos.
Generalmente se emplean para fermentaciones de baja viscosidad.

Biorreactores de circulación
La denominación de esto tipo de reactores se debe al patrón de circulación definido del

líquido en el reactor. Se clasifican en dos grandes grupos: de circulación externa o
interna. Externa si el líquido es inducido a circular por un brazo lateral conectado al
cuerpo principal del biorreactor en su parte inferior y superior, mientras que es interna si
el líquido circula en forma definida sin salir del cuerpo principal del reactor. Los primeros
solo se han empleado a nivel experimental, mientras que los segundos se han llegado a
utilizar a nivel industrial, generalmente en el tratamiento de aguas residuales,
alcanzando volúmenes de hasta 13,600 m3.
OBJETIVOS
Dado que uno de los aspectos formativos de los alumnos de la carrera de Ingeniería
Biotecnológica se relaciona con el diseño, construcción, implementación, operación y
mantenimiento de biorreactores industriales, en la presente práctica se propone como
objetivo que el alumno identificará y describirá los diferentes tipos de biorreactores y
sus partes accesorias. Así mismo, describirá de que forma se operan, se controlan,
esterilizan, cargan y descargan, etc.
PROCEDIMIENTO
Para la sesión de introducción de esta práctica el alumno deberá haber consultado en

todas las fuentes posibles el tipo de biorreactores que se emplean a nivel laboratorio,
planta piloto e industrial.
Se mostrarán a los alumnos los diversos tipos de biorreactores de nivel laboratorio y

planta piloto de la Unidad para el estudio de sus componentes.

También se propone visitar la planta de tratamiento “Aguas de San Juan Ixhuatepec, S.

U.”, o la planta de FERMIC, ambas ubicadas en la Ciudad de México.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El alumno realizará un informe detallado de los biorreactores presentados en el que

deberá reportar los siguientes puntos:
Tipo de biorreactor. Capacidad. Características geométricas (incluyendo esquema del

biorreactor). Sistema de carga y descarga. Sistema de agitación del líquido de reacción.
Patrones de flujo. Sistema de aireación. Sistemas de control (incluyendo el sistema de
enfriamiento). Método o forma de esterilización de: medios de cultivo, reactor
(incluyendo su limpieza), aire, aditivos de fermentación (ácidos, álcalis, antiespumante,
etc.). Métodos de Cultivo (Lote, Lote Alimentado o Cultivo Continuo) que se lleva a cabo
en el biorreactor. Producción. Dispositivo de toma de muestra y de Inoculación.
BIBLIOGRAFÍA
1. Bull, D.N., Thoma, R.W., Stinnett, T.E. 1983. Bioreactors for submerged culture. Adv.
Biotech. Process. 1: 1-30.
2. Charles, M. 1985. Fermentation scale-up: problems and possibilities. Trends in
Biotech. 3: 80-84.
3. Schüegerl, K. 1982. New biorreactors for aerobic processes. Int. Chem. Eng. 22:
591-610.
4. Schüegerl, K. 1985. Nonmechanical agitated biorreactor systems. En:
Comprehensive Biotechnology, 2: 99-118. Ed. M. Moo-Young, Pergamon Press.
5. Sitting, W. 1983. Fermentation reactors. Chem. Tech. 13: 606-613.
6. Zlokarnik, M. 1985. Tower-shaped reactors for aerobic biological waste water
treatment. En: Biotechnology. 2: 537-569. Edited by Rehm, H. J. y G. Reed.

PRÁCTICA 2
Práctica 2. Instrumentación para el seguimiento y control de la biorreacción
Instrumentación para el
seguimiento y control
de la biorreacción
INTRODUCCIÓN
Los biorreactores están equipados con distintos instrumentos. Estos se utilizan para
facilitar el registro y análisis de variables de operación y de parámetros específicos que
sirven para mantener, dentro de ciertos intervalos de valores, las condiciones de
operación de la biorreacción con fines de maximizar la productividad y garantizar el
éxito de la biorreacción. La instrumentación ha sido definida como “una ventana al
proceso” y su objetivo es mantener al mínimo la diferencia entre el valor medido y un
valor deseado. El control de un parámetro particular se lleva a cabo a través de un
sistema que consta de un sensor (o electrodo), un medidor y un controlador: el sensor
es un dispositivo que transforma una magnitud de una propiedad que se quiere medir,
en otra que facilita su medida. El medidor recibe la medida del valor de la propiedad que
emite el sensor. El controlador compara dicha medida con un valor fijo. Del resultado de
la comparación, el controlador toma una decisión enviando una señal (generalmente

eléctrica) a algún dispositivo que ajustará el valor medido de la propiedad hasta el valor
predeterminado o de control (“set point”). La señal implica usualmente la modificación
del estado de una válvula, el encendido o apagado de una bomba dosificadora, la
modificación de la velocidad de giro de un motor de algún equipo, etc. Si, por ejemplo,
se hace necesario el uso de una determinada fuerza para modificar el estado de una
válvula, se requerirá de un “transductor” y de un “actuador”. El transductor es un
dispositivo que convierte un tipo de energía en otro tipo de energía, mientras que los
actuadores son dispositivos capaces de generar una fuerza a partir de energía eléctrica,
gaseosa o líquida. Existen tres tipos de actuadores:
1. Hidráulicos
2. Neumáticos
3. Eléctricos
Los actuadores eléctricos son usados pera manejar aparatos electrónicos o

mecatrónicos. Los hidráulicos se usan cuando lo que se necesita es potencia, mientras
que los neumáticos son simples posicionamientos.
Los sensores pueden estar conectados directamente al biorreactor (en contacto directo
con la masa líquida o sólida de fermentación), en cuyo caso se dice que están “en
línea”, si no están conectados directamente al biorreactor entonces se dice que están
“fuera de línea”.
Debido a la naturaleza de la biorreacción, se requiere que la gran mayoría de los

“sensores en línea” reúnan, entre otros, los siguientes requisitos: i) que sean capaces
de resistir el proceso térmico al que se somete el caldo de cultivo en el biorreactor
(esterilización con calor húmedo); ii) que sean capaces de resistir las presiones de
operación; iii) que sean de fácil calibración; iv) que muestren valores estables; v) que su
mantenimiento sea fácil y económico y vi) que tengan una adecuada vida media útil.
Estos sensores (en línea), se utilizan, básicamente, para medir propiedades físicas o
variables de operación tales com temperatura, presión, intensidad de agitación o
velocidad de giro de los impulsores, velocidades de flujo de líquidos y gases, y para

medir ciertas propiedades químicas como pH, concentración de oxígeno disuelto y

gaseoso, concentración de dióxido de carbono disuelto y en el gas, concentración de
azúcares disueltos, concentración de algunos productos celulares, etc.
Para conocer el estado de una variable de operación o de un parámetro específico con

sensores “fuera de línea”, se deberá tomar asépticamente una muestra para que en ella
se mida la propiedad.
Por los tiempos y necesidades de los Bioprocesos, es fácil concluir que los sensores en
línea son mucho más adecuados para controlar el valor de una propiedad en una
biorreacción.
Entre las propiedades más comunes que se miden en un biorreactor están las
siguientes:
1. Temperatura
2. pH
3. Flujo de aire
4. Presión
5. Intensidad de agitación
6. Nivel o Volumen de medio de cultivo
7. Espuma
8. Concentración de oxígeno disuelto
9. Concentración celular
10.Concentración de sustrato
11.Concentración de producto

Medición y control de pH
El pH es una medida de la actividad de los iones hidronio (H+) en una disolución acuosa
y está definida por la siguiente ecuación:
pH = - log10 [H+] (1)
Para la medición y control del valor de pH, se utiliza un electrodo de vidrio colocado, en
forma aséptica, en el biorreactor y que está directamente en contacto con el caldo de
fermentación. El electrodo, normalmente esterilizable, se conecta directamente a un
medidor-controlador de pH, con el cual se puede establecer el valor de control (Set
Point) o ajustar el valor de la lectura que proporcione el electrodo de medición.
Un electrodo de pH consiste de dos celdas: un elemento sensor del pH y un elemento

de referencia. El elemento sensor consiste de un alambre de plata cubierto con cloruro
de plata inmerso en una solución buffer (usualmente de pH 7), en un tubo sellado que
termina con un fino bulbo de vidrio sensible al pH. El elemento de referencia consiste de
otro alambre de plata cubierto con cloruro de plata inmerso en una solución buffer
saturada de cloruro de potasio y un diafragma poroso que comunica con la sustancia a
la que se medirá el pH. Dicho electrodo comúnmente se construye como una sola
unidad, con el sensor de referencia construido en una parte anular del elemento sensor,
tal como puede apreciarse en la figura 1.
El método se fundamenta en la existencia de una diferencia de potencial entre las dos

caras de la membrana de vidrio, expuestas a disoluciones acuosas que difieren en su
valor de pH. A temperatura constante, la magnitud de esta diferencia de potencial es
directamente proporcional a la diferencia de pH entre dichas disoluciones.

Figura 1. Esquema de un electrodo de pH
Debido a que el electrodo de vidrio y los electrodos de referencia comerciales tienen un

comportamiento imperfecto, es preciso calibrar el dispositivo de determinación del pH
con dos disoluciones patrón antes de usarlos en los biorreactores. Para ello, se
sumergen los electrodos sucesivamente en dos disoluciones patrón con valor conocido
denominados P1 y P2, a la misma temperatura que la disolución problema y
seleccionadas de forma que el valor de pH de la disolución problema esté comprendida
entre los valores de pH P1 y P2.
Como el valor del pH del caldo de fermentación puede cambiar después de ser
esterilizado, por causas del drástico tratamiento térmico, se recomienda recalibrar el
electrodo. Para esto, se hace necesario tomar asépticamente una muestra del caldo de
fermentación y medirle, con un medidor y un electrodo “fuera de línea”, su valor de pH.
En caso de que el valor que muestre el electrodo “en línea” sea distinto del que marca
el “fuera de línea”, se ajustará el valor de aquél con el equipo de medición empleado en
el biorreactor.

Una vez realizado todo lo anterior, se está en posibilidades de medir y controlar el valor
del pH de una biorreacción en un biorreactor. Si el valor medido del pH es diferente al
valor del Set Point, entonces el controlador emitirá una señal eléctrica con la cual se
podrá activar alguna bomba para adicionar “ácido” o “álcali”, dependiendo de la
diferencia entre el valor medido y el Set Point.
En la figura 2 se puede observar la disposición de un sistema de medición y control del

valor de una variable cualquiera de un caldo de cultivo contenido en un biorreactor.
ELEMENTO
DE CONTROL
E = VM -VSP
VSP CONTROLADOR
COMPARADOR
BIORREACTOR
MEDICION
VM V
Figura 2. Diagrama de bloques de un sistema de control
Medición y control de temperatura
Aunque no existe un consenso para establecer cual de todas las variables de operación
es la más importante de mantener y controlar en una biorreacción, la temperatura se
cuenta entre las más importantes. El control, la medición precisa y adecuada de la
temperatura resultan esenciales para la biorreacción. Un sistema de medición de la

temperatura debe presentar una precisión menor a los 0.5 °C respecto a la temperatura
de medición y en muchos casos, una variación de 1 a 1.5 °C durante la biorreacción,
puede dar lugar a grandes pérdidas económicas en el bioproceso, por lo que se
recomienda que la diferencia entre el valor medido y el de control se encuentre entre
0.5 y 1.5 °C. Generalmente, la temperatura en un bioproceso se mide con sensores
RTD (resistance temperature devices) ya que estos son los que presentan las mejores
características antes mencionadas. Consta de un elemento metálico cuya resistencia
eléctrica cambia con la temperatura, hecho en el que se basa la medición de la misma.
Generalmente se utiliza platino por sus mejores características lineales de cambio
respecto a la temperatura, aunque también se utiliza níquel, cobre y aleaciones de
níquel. Una desventaja es su precio moderamente alto.
La resistencia es medida con un dispositivo y convertida por un transductor a valores de

temperatura (en °C o K). El valor medido de la temperatura es comparado con el de
control y de la diferencia entre los valores, el controlador emitirá una señal que servirá
para realizar una acción de control de la misma.
La acción puede consistir en hacer pasar agua de enfriamiento o vapor, a través de un

serpentín inmerso en el caldo de biorreacción o a través de la “chaqueta” del
biorreactor, para ajustar la temperatura al punto de control.
Para sensores RTD la relación entre la temperatura y la resistencia está descrita por la
siguiente ecuación:
RT ⎡ ⎛ T ⎞⎛ T ⎞⎤
= 1 + α ⎢T − σ ⎜ − 1⎟⎜ ⎟⎥ (2)
R0 ⎣ ⎝ 100 ⎠⎝ 100 ⎠⎦
Ecuación en la que:
RT = resistencia a la temperatura T [=] Ω
R0 = resistencia a 0°C [=] Ω

α = una constante (0.00382 – 0.00393 para Platino)

T = temperatura [=] °C
σ = una constante (1.48 – 1.51 para Platino)
Dicha ecuación aplica para intervalos de temperatura comprendidos entre 0 y 630 °C.
Medición y control del oxígeno disuelto
El oxígeno disuelto es muy importante para el desarrollo de una biorreacción aeróbica,

por lo que su medición y control es un parámetro importante para el desarrollo y
producción económicamente rentable de bioproductos.
El oxígeno disuelto generalmente proviene del aire que es introducido en el fondo del
caldo de biorreacción. Una parte del oxígeno contenido en el aire se disuelve en el
caldo y otra parte sale tal cual con el aire agotado. El oxígeno disuelto es el que
utilizarán los microorganismos para vivir y para realizar el proceso de transformación de
la materia prima a producto. Por esta razón es importante distinguir entre “oxígeno
disuelto” y “oxígeno en el gas”.
La medición del oxígeno disuelto se realiza de forma “amperométrica”, por la reducción

del oxígeno en la superficie del cátodo y la formación de cloruro de plata en el ánodo.
Una solución electrolítica une al ánodo estableciéndose un voltaje de polarización entre
ellos. Cuando un fluido que contiene oxígeno disuelto se pone en contacto con el
electrodo, el oxígeno difunde a través de una membrana semipermeable
estableciéndose la siguiente reacción:
Cátodo: O2 + 2H2O + 4e- 4OH-
Ánodo: 4Ag + 4Cl- 4AgCl + 4e-

El resultado es una corriente eléctrica que es proporcional a la actividad del oxígeno

disuelto o presión parcial de oxígeno disuelto.
En el comercio especializado existen distintos tipos de electrodos y de medidores

controladores de oxígeno disuelto que los usuarios podrán elegir.
El control del oxígeno disuelto en una biorreacción ocurre a través de la modificación

del flujo de gas (aire u oxígeno puro) o de la intensidad de agitación del caldo de cultivo.
Medición y control de espuma
Cuando en el caldo de cultivo existen compuestos orgánicos, como por ejemplo

proteínas y carbohidratos, generalmente se forma espuma. Esto se favorece a altos
flujos de aire y alta intensidad de agitación.
La formación de espuma es crítica en los biorreactores por muchas razones, las más
destacadas son las siguientes:
1. Disminución del volumen del líquido en el interior del biorreactor si la espuma

sale por el venteo o salida del gas agotado.
2. Contaminación microbiológica del bioproceso si la espuma alcanza a salir por el
venteo o salida del gas agotado.
3. Disminución de la actividad biológica del bioproducto si posee propiedades
tensoactivas y es sensible a fuerzas de torsión.
Por las razones anteriores, la medición y control de la espuma es imprescindible en los

Bioprocesos.

El control del volumen de la espuma se logra a través de un “rompedor mecánico” o

mediante la adición controlada de un “antiespumante”. El rompedor de espuma es un
impulsor, colocado generalmente por encima del caldo de cultivo, que gira a altas
velocidades que al girar y estar en contacto con la espuma actúa en forma semejante a
una centrífuga, impulsando a la fase pesada al fondo y dejando pasar la fase ligera (el
gas). El antiespumante rompe la espuma cambiando la tensión superficial del caldo de
cultivo.
La selección del sistema de control de espuma ocurrirá después de evaluar las

características técnicas y económicas de ambos sistemas. Un rompedor mecánico
requiere de energía adicional y de acciones costosas de mantenimiento preventivo y
correctivo, mientras que los antiespumantes, son compuestos químicos extraños al
sistema biológico de la biorreacción que potencialmente pueden llegar a contaminar el
producto final, a pesar de que existan antiespumantes aprobados por instituciones
internacionales.
A pesar de lo anterior, el sistema más comúnmente empleado para controlar la

formación de espuma es usando antiespumantes. El control de espuma se basa en la
conductividad eléctrica que presentan los medios de cultivo. Cuando la espuma
asciende y hace contacto con el sensor, que es una varilla metálica colocada en la parte
superior del biorreactor, cierra un circuito eléctrico que envía una señal a un controlador
que acciona la bomba de adición de antiespumante. Una vez que la espuma se ha
destruido, deja de hacer contacto con el sensor y la bomba deja de adicionar
antiespumante.

OBJETIVO
El alumno manejará los sistemas de medición y control de variables de operación de

biorreactores de tanques agitados, a través de las determinaciones en línea de la
temperatura, pH, oxígeno disuelto y espuma.
MATERIALES Y MÉTODOS
Equipo:
Biorreactor tipo tanque agitado
Instrumentación.
Sistema de medición y control de temperatura
Sistema de medición y control de pH
Sistema de medición y control de oxígeno disuelto
Sistema de medición y control de espuma
El sistema de medición y control de temperatura consta de:

1. Sensor RTD
2. Cables
3. Medidor
4. Controlador
5. Recipiente de agua de enfriamiento con una resistencia eléctrica de inmersión
6. Bomba de agua de enfriamiento
El sistema de medición y control de pH consta de:

1. Electrodo de pH con su camisa presurizable y conectores para el biorreactor
2. Cables
3. Medidor

4. Controlador
5. Bombas de adición de ácido o álcali
El sistema de medición y control de oxígeno disuelto consta de:

1. Electrodo polarográfico
2. Cables
3. Medidor
4. Controlador
El sistema de medición y control de espuma consta de:

1. Electrodo
2. Medidor
3. Controlador
4. Bomba de adición de antiespumante
Materiales
Tanque de nitrógeno puro con válvula de control de presión y de flujo.

Vasos de precipitados de 250 mL, 500 mL y de 2000 mL.
Probetas de 1000 mL.
Mangueras de silicón para bombas peristálticas
Reactivos
Solución de NaOH 0.5N

Solución de HCl 0.5N
Antiespumante Mazu al 10% v/v en agua
Solución proteica o un detergente

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Actividades previas
1. Medir las dimensiones de todas las partes del biorreactor.
2. Consultar los manuales de operación tanto del biorreactor como de los equipos
de medición y control que se utilizarán.
3. Identificar, en el biorreactor, los sistemas de medición y control de temperatura,
pH, oxígeno disuelto y espuma.
4. Llenar el biorreactor con agua de la llave o con una solución protéica o de
detergente (su profesor se lo indicará).
5. Calibrar los electrodos de temperatura, pH y oxígeno disuelto.
6. Establecer las condiciones de operación (Todo lo anterior auxiliado por sus
instructores).
Medición y control del pH
Establecer una velocidad de agitación del biorreactor siguiendo las indicaciones

establecidas en el manual de operación del equipo. Encender el equipo de medición y
control y verificar que el valor de pH que registra el mismo sea igual que el de la
muestra tomada del biorreactor y medida fuera de línea. De no ser así, ajustar el equipo
de acuerdo a las indicaciones del manual.
Ajustar el pH a un valor de 5 con una disolución de ácido clorhídrico 0.5 N. y establecer

en el equipo un valor de Set Point de 5 (Consultar el manual del equipo).
El equipo de medición y control debe tener acoplado el sistema de adición de álcali que
consta de una bomba peristáltica capaz de agregar al biorreactor una disolución de
NaOH 0.5 N, de acuerdo a la señal del controlador.

Agregar al biorreactor 10 mL de una disolución de ácido clorhídrico 0.5 N con objeto de

simular una biorreacción acidogénica (disminuye el valor del pH conforme pasa el
tiempo). Observe como el controlador enviará una señal a la bomba peristáltica para
adicionar el álcali. La bomba dejará de funcionar (de adicionar álcali) cuando el pH
alcance o sobrepase el valor del Set Point.
Repita el procedimiento hasta que quede comprendido el sistema de medición y control.
Medición y control de la temperatura
Agregue al biorreactor 10 litros de agua a temperatura ambiente (25°C) y establezca

una velocidad de agitación de 300 rpm, ayudados por su instructor. Verifique que las
válvulas del circuito de circulación del agua de enfriamiento a través de la chaqueta
estén abiertas y encienda el equipo de medición y control de la temperatura que consta
de los elementos ya descritos. Establezca en el controlador de temperatura un valor de
Set Point de 33°C (ayudados por su instructor). Encienda la bomba de circulación del
agua y espere hasta que la temperatura en el interior del biorreactor alcance la
temperatura del Set Point.
Medición del oxígeno disuelto
Agregue al biorreactor 10 litros de agua a temperatura ambiente (25°C) y establezca

una velocidad de agitación de 300 rpm, ayudados por su instructor. Establezca un flujo
de aire a un valor de 0.5 vvm (verifíquelo en el rotámetro). Encienda el equipo de
medición de oxígeno disuelto y espere unos 15 minutos hasta que la lectura
permanezca estable. Con este valor, establezca en el equipo el 100% del valor de
saturación.

Ayudados por sus instructores, conecte un tanque de nitrógeno puro al sistema de

introducción de aire del biorreactor y haga pasar un valor de flujo de nitrógeno tal que
no sobrepase los 0.75 vvm totales (verifíquelo en el rotámetro), con objeto de disminuir
la presión parcial de oxígeno en el aire. Esto provocará que la concentración de
oxígeno disuelto sea menor que cuando se burbujea aire solamente.
Observe como el oxígeno disuelto baja en el equipo de medición.
Ahora cierre completamente el flujo de nitrógeno y observe como el valor de oxígeno

disuelto volverá a su valor normal (100% del de saturación).
Medición y control de la espuma
Agregue al biorreactor 10 litros de agua con un 2% de detergente (o de ser posible una

disolución protéica) a temperatura ambiente (25°C) y establezca una velocidad de
agitación de 250 rpm, ayudados por su instructor y un flujo de aire de 0.15 vvm
(verifíquelo en el rotámetro).
A esta velocidad observe si se forma espuma. Incremente la velocidad de agitación en

intervalos de 50 rpm, hasta llegar a 400. Mantenga las diferentes velocidades durante
10 minutos y observe lo que ocurre con la formación de espuma (debe incrementarse
su velocidad de formación) y anote sus observaciones. Estando a 400 rpm, incremente
el flujo de aire hasta un valor de 0.75 vvm, observe y anote lo que pasa con la
formación de espuma.
Conecte el sistema de control de espuma. La bomba peristáltica de adición de

antiespumante debe estar conectada y la manguera debe estar inmersa en una
solución de antiespumante Mazu al 10% en agua.

Elija una velocidad de agitación y un flujo de aire que tengan la más alta formación de
espuma, con objeto de que el controlador envíe la señal de adición de antiespumante.
Anote y discuta sus observaciones.
RESULTADOS Y MANEJO DE DATOS
Elabore diagramas (en autocad) en los que se observen los sistemas de medición y
control de pH, temperatura, oxígeno disuelto y espuma en un biorreactor.
Elabore un reporte por equipo en los que establezca sus conclusiones respecto a las
necesidades de instrumentación y control en las biorreacciones.
BIBLIOGRAFÍA
1. Aiba, S., Humphrey, A.E., Millis N.F. 1973. Biochemical engineering, 2nd. Edition
Academic.
2. Harper, E.H. 2000. El ABC de la instrumentación en el control de procesos
industriales. Limusa. 1ª Edición. México.
3. Lydersen, B.K., D'Elia N. A., Kim, L. N. 1994. Bioprocess engineering: systems,
equipment and facilities. John Wiley and Sons, Inc., USA.
4. Wang, D.I.C., Cooney, C.L., Demain, A.L., Dunill, P., Humphrey, A.E., Lilly, M.D.
1978. Fermentation and enzyme technology. John Wiley and Sons.

PRÁCTICA 3
Práctica 3. Servicios Auxiliares
Servicios Auxiliares
INTRODUCCIÓN
Los servicios auxiliares necesarios en la operación de un biorreactor incluyen aire

comprimido, diversos gases comprimidos (nitrógeno, oxígeno, etc.), agua de
enfriamiento (agua helada y agua de torre), agua para servicios varios, vapor de planta
y energía eléctrica.
Aire:
El aire tiene varios usos en un biorreactor, entre ellos por orden de importancia
mencionaremos:
1. Proveer oxígeno al medio de cultivo.
2. Como fuerza motriz para la transferencia de momento y masa.
3. Como fuerza motriz para transferir líquidos de un recipiente a otro.

4. Para accionar instrumentación de control de tipo neumático.

5. Como medio de enfriamiento para los recipientes después de la esterilización.
La elección del tipo de aire a utilizar dependerá del uso que se haga de él. El aire debe
ser seco y libre de aceite. Además, cuando se requiera que el proceso o producto no se
afecte por la introducción de microorganismos ajenos, contenidos en la corriente de
aire, será necesario que éste sea estéril.
En la actualidad, para la esterilización del aire que se introducirá al biorreactor se

utilizan prefiltros y filtros absolutos. Los prefiltros son casi obligatorios para compresores
lubricados con aceite, para eliminar partículas de este lubricante, sin embargo,
actualmente los compresores libres de aceite van ganando terreno, por lo que en estos
casos los prefiltros sirven para aumentar la eficiencia y la vida media de servicio de los
filtros absolutos. Estos últimos deberán tener un 100% de retención de partículas de
hasta 0.01 µm en el aire de servicio. Los filtros constan de dos elementos principales: el
cartucho que contiene el elemento filtrante y la camisa en la que se coloca el cartucho.
En el comercio especializado, se encuentran varios tipos de filtros absolutos. Algunos
de los materiales utilizados para los cartuchos son: ésteres de celulosa, polisulfonas,
fluoruro de polivinilo y politetrafluoroetileno, mientras que el material más utilizado para
la camisa es el acero inoxidable (304, 316 o 316L) con mecanismos de sellado rápido y
hermético. El diámetro de los cartuchos es de 2½” a 2¾”, con longitudes variables que
van desde 10” (0.25 m) hasta 40” (1m). Se recomienda que los filtros a emplear en los
biorreactores sean del tipo de membrana hidrofóbica. La naturaleza hidrofóbica (que
repele el agua) de estas membranas pueden alcanzar 100% de remoción de bacterias y
bacteriófagos en condiciones de operación húmedas o secas. La esterilización de los
filtros se realiza con vapor saturado que circula en el sentido de la introducción del aire
al biorreactor.
Los sistemas de compresión de aire constan de los siguientes componentes:

compresor, filtro de admisión de aire, sistema de enfriamiento (si lo tiene), depósito de

almacenamiento y sistema de control de presión. En varios puntos del sistema de

distribución se deben colocar trampas o purgas para eliminar condensados.
Los compresores de aire para plantas biotecnológicas son generalmente de dos tipos:
rotatorios y reciprocantes de accionamiento positivo. También existen los compresores
de tipo centrífugo para grandes volúmenes de aire a bajas presiones. El aire es tomado
directamente de la atmósfera. Independientemente del tipo, preferentemente deberán
ser especificados como libres de aceite.
La tubería de distribución puede ser especificada en diferentes materiales dependiendo

del servicio: desde acero al carbón para aire de equipos y motores hasta acero
inoxidable 304 ó 316 acabado sanitario para el aire proveniente del filtro absoluto hacia
el punto de suministro al biorreactor o para líneas de distribución instaladas en un
cuarto limpio.
Además del aire comprimido algunos gases comprimidos también tienen aplicaciones
en biorreactores. Los más comunes son nitrógeno y oxígeno puros: el nitrógeno para la
formación de atmósferas inertes, mientras que el oxígeno se usa para enriquecer el aire
y alcanzar una mayor velocidad de transferencia de oxígeno en el biorreactor. Estos
gases son generalmente suministrados en cilindros a una presión mayor que la
atmosférica de tal manera que se pueden transportar al lugar de uso. La tubería de
distribución y suministro debe cumplir con las mismas características que la del aire.
Vapor:
El vapor de planta es utilizado como el medio principal de calentamiento en miles de

industrias, y para la generación de energía eléctrica como uso secundario. Además, el
vapor limpio o puro se utiliza en el procesamiento de alimentos y medicinas, en la
esterilización de productos y equipos, etc. Su uso generalizado se debe a las
siguientes razones:

1. La generación de vapor es una de las formas más económicas de generación de

energía.
2. El vapor puede controlarse de manera relativamente sencilla debido a que circula
de una zona de alta presión a una de menor presión sin necesidad de otro
equipo.
3. El vapor es fácil de producir ya que se obtiene del agua que además puede ser
reutilizable.
Un generador de vapor o caldera es aquel equipo que transforma el agua en vapor

aprovechando el calor generado por la combustión de un material combustible, teniendo
como característica principal que es un recipiente cerrado sujeto a una presión mayor a
la atmosférica.
Existen dos tipos de generadores de vapor:
1. Generadores de Tubos de Agua.- En éstos el agua circula al interior de una serie

de tubos (serpentín), mientras que el calor se transfiere de la cámara de
combustión hacia el interior de los tubos, así el agua contenida dentro de los
tubos comienza a elevar su temperatura hasta evaporarse. Este es el tipo más
común y con el que cuenta la UPIBI.
2. Generadores de Tubos de Humo.- En forma totalmente opuesta, en este tipo de
generadores los gases de combustión circulan por los tubos, mientras que el
agua se encuentra almacenada en la cámara exterior. Así el calor se transfiere
del interior de los tubos hacia el agua almacenada alrededor de éstos.
La capacidad de un generador de vapor se mide bajo un estándar internacional llamado

Caballo Caldera el cual es equivalente a generar 15.65 kg/h de vapor con una
temperatura de 100 ºC a presión atmosférica y que es alimentado con agua a 100 ºC.
Otra definición nos dice que con estos 15.65 kg/h de vapor es posible obtener 8,430
kcal/h de calor aprovechable en un proceso. Así un generador de vapor que tenga una
capacidad de 100 caballos caldera será capaz de generar 1565 kg/h de vapor.

Las calderas generalmente vienen como paquetes en tamaños estandarizados que

incluyen:
1. El tanque de condensados que se instala generalmente 2 m arriba de la bomba de
alimentación de agua al generador.
2. La bomba de agua que envía el agua a presión hacia el serpentín del generador.
3. El generador de vapor de tubos de agua por donde circulan en sentido contrario el
agua y los gases de combustión, de tal manera que a medida que el agua avanza en
su recorrido encuentra temperaturas más altas, por lo que incrementa su temperatura
hasta convertirse en vapor. Los componentes básicos del generador son:
o Serpentín
o Quemador-ventilador
o Cámara de combustión
4. El separador de vapor en donde por medios mecánicos se provoca el
desprendimiento de pequeñas partículas de agua (humedad) que arrastra el vapor.
5. La trampa de vapor que desaloja los condensados removidos del vapor y los envía
de regreso al tanque de condensados para repetir nuevamente el ciclo.
6. Sistema de control y de seguridad, entre los que destacan: válvulas de alivio y de
seguridad, manómetros, control principal de temperatura con termopar, interruptores
del termostato, interruptor de presión de vapor e interruptor del nivel de aceite.
El agua que entra a una caldera requiere de un acondicionamiento previo (ver tabla 1)
para proteger los equipos contra la incrustación, la corrosión y otras complicaciones.
Por eso es necesario acoplar a ésta un sistema de acondicionamiento previo del agua
que generalmente incluye un suavizador y un tanque de salmuera.
El suavizador consiste en una columna empacada con una resina catiónica depositada
sobre un lecho de grava que le sirve de soporte y a la vez de filtro. En la resina se lleva
a cabo el intercambio de los iones calcio y magnesio que son los responsables de la
dureza del agua por iones sodio que contiene la resina. El tanque de salmuera tiene

como función regenerar la resina a fin de que recupere su capacidad de intercambio

iónico.
Tabla 1. Características del agua de alimentación a una

caldera.
Dureza cero
Oxígeno disuelto, CO2 cero
Sulfitos 50 – 100 ppm
pH 10.5 a 11.5
Sólidos en suspensión cero
Sólidos disueltos < 6000 ppm
El sistema de distribución de vapor se realiza por medio de tuberías, generalmente de

acero al carbón cédula 40, cuidando que las velocidades y caídas de presión estén
comprendidas en los intervalos recomendados para el dimensionamiento de las
mismas. El vapor puro requerirá de tuberías de acero inoxidable con acabado sanitario.
En adición al sistema de distribución de vapor deberán preverse los sistemas de manejo

de condensados, ya que éstos pueden reutilizarse con un importante ahorro en el
acondicionamiento del agua de alimentación a la caldera y en la energía requerida para
el calentamiento de la misma hasta el punto de ebullición.
Agua de enfriamiento:
El agua como servicio auxiliar se utiliza como fluido de enfriamiento para el control de la
temperatura del caldo de fermentación en los biorreactores. Esta agua, a diferencia del
agua de proceso, nunca entra en contacto con las materias primas o productos de la

biorreacción, ni con las superficies en contacto con éstos; sino que circula a través de
las chaquetas o serpentines según el diseño del biorreactor.
En la práctica el agua es un servicio escaso y es necesario recircularla, enfriarla y

reutilizarla. Dependiendo de la temperatura requerida para el agua de enfriamiento ésta
puede ser:
o Agua de torre.- Con una temperatura de entre 10 °C y 25 °C dependiendo del
diseño de la torre y de las condiciones ambientales del lugar. Los equipos más
utilizados en la industria biotecnológica por su tamaño compacto son las torres
de enfriamiento por evaporación. Otros sistemas para mayores capacidades son
las torres atmosféricas y los estanques de enfriamiento, los cuales requieren
grandes espacios para su instalación. El agua de torre es susceptible de
degradación debido al crecimiento de organismos o bien al aumento en la
concentración de sales que favorecen la incrustación. Por lo tanto las torres de
enfriamiento requieren un mantenimiento constante que implica: tratamiento con
algunos químicos para impedir la incrustación de sales, cloración para impedir la
formación de microorganismos y purgas frecuentes para impedir la acumulación
de sólidos.
o Agua helada.- Con una temperatura de entre 5°C y 10 °C: Los componentes
principales de un sistema de agua helada son los mismos que los de un ciclo de
refrigeración: el compresor, el condensador, la válvula de expansión, el
evaporador, la bomba de recirculación, y el tanque de expansión. El evaporador
es simplemente un intercambiador de calor donde el refrigerante se vaporiza a
expensas de la energía que toma del agua, que como resultado de este proceso
se enfría. Esta agua helada se dirige a los puntos donde se necesita y de ahí se
retorna al evaporador por medio de la bomba de recirculación. Por otro lado el
gas refrigerante se comprime, se enfría en el condensador y se dirige
nuevamente al evaporador pasando por una válvula de expansión donde se
vaporiza parcialmente disminuyendo aún más su temperatura.

Para dimensionar un sistema de enfriamiento será necesario conocer la demanda de

agua (flujo) y el intervalo de temperaturas entre el agua que sale hacia el proceso y la
que regresa al sistema. Las tuberías de transporte y suministro del agua de
enfriamiento son por lo general de acero al carbón y cobre en un diámetro adecuado
para los flujos que se manejen.
Agua para servicios varios:
Este tipo de agua se utiliza para las operaciones de lavado y limpieza del biorreactor y
del área de proceso. Esta agua puede ser potable, debe estar libre de sedimentos, pero
no requiere ningún tratamiento adicional.
Energía eléctrica:
La instalación eléctrica tiene como propósito proporcionar la energía para accionar

bombas, compresores, motores eléctricos y otros equipos mecánicos, instrumentos,
tableros de control y alumbrado. El sistema se debe adecuar para entregar en el punto
que se requiera la energía necesaria sin causar sobrecalentamiento o cambios de
voltaje innecesarios.
Esto se logra a través de líneas de alambrado que unen el generador con el punto
donde se necesita la energía conectando todos los componentes y que se dividen en
secciones según el servicio y el área dando lugar a los circuitos.
El sistema eléctrico básico está constituido por la fuente, el equipo de transformación,

los dispositivos de protección, las líneas de distribución y los puntos de uso.
Voltajes de distribución.- La energía comprada o generada se suministra a voltajes

muy altos y para usarse en la planta debe ser reducida al voltaje de utilización, para

esto se requiere el uso de subestaciones reductoras o transformadores. El voltaje de

operación recomendado por los fabricantes de motores y demás equipo eléctrico
aparece en la placa o en las instrucciones de operación de dicho equipo. La
especificación típica para motores eléctricos y demás equipos accionados
eléctricamente es de 120 V, 240 V y en algunos casos hasta 480 V, los instrumentos
generalmente necesitan voltajes de 12-24 V.
Corriente.- La corriente puede ser de dos tipos: la corriente alterna (AC) que es
periódica con pequeñas oscilaciones, desde un valor máximo en un sentido hasta el
mismo valor pero en sentido contrario, de tal manera que su intensidad media es nula; y
la corriente continua o directa (DC ó CC) que proporciona un valor constante todo el
tiempo, como la producida por dínamos, pilas y acumuladores.
Dispositivos de Protección.- Los circuitos y equipos deben ser protegidos por

dispositivos que abran los circuitos para que la corriente no fluya en condiciones de
sobrecarga o falla. Esto se hace por medio de interruptores. Mediante los
transformadores se obtienen voltajes reducidos que alimentan los diferentes circuitos,
cada uno de los cuales debe tener su interruptor de desconexión.
Equipo eléctrico para áreas peligrosas.- Cuando las materias primas o productos de
la biorreacción son potencialmente peligrosos, es decir que emiten a la atmósfera
grandes cantidades de partículas muy pequeñas que pueden penetrar hacia los
circuitos eléctricos e iniciar una chispa (p.ej. polvos, solventes, etc), tanto el equipo
eléctrico como los transformadores, mecanismos de distribución y motores deben ser
especificados a prueba de explosión.

Conductores.- Del punto de suministro al punto de utilización (equipo, compresores,

bombas, etc.) la corriente eléctrica se distribuye por medio de conductores que pueden
ser alambres, cordones o cables, los cuales pueden ser vistos como las arterias y venas
por donde viaja la corriente.
o Hilo o alambre: Es un conductor constituido por un único alambre macizo,
generalmente de cobre.
o Cordón: Es un conductor constituido por varios hilos unidos eléctricamente
enrrollados helicoidalmente alrededor de uno o varios hilos centrales.
o Cable: Es un conductor formado por uno o varios hilos o cordones aislados
eléctricamente entre sí. Según el número hilos o cordones que lleva un cable se
denomina unipolar, bipolar, tripolar, etc.
Los cables son canalizados en las instalaciones dentro de tuberías metálicas o canales
para protegerlos de agentes externos como la humedad, la corrosión los golpes, etc.,
que se sujetan al techo o paredes por medio de soportes. En algunos lugares se
entierran dichas tuberías bajo el piso, aunque esto lo hace de difícil acceso y
mantenimiento.
OBJETIVOS
El alumno identificará los servicios auxiliares necesarios para la operación de un

biorreactor, describirá sus componentes y explicará su funcionamiento.
PROCEDIMIENTO
Para la sesión de introducción de esta práctica el alumno buscará, en todas las fuentes
posibles, información sobre los tipos de sistemas de compresión de aire, generación de

vapor y agua de enfriamiento que se emplean en la industria biotecnológica. También

investigará los elementos básicos de una instalación eléctrica industrial.
Para la sesión experimental:

1. Se mostrará a los alumnos el cuarto de calderas, se les pedirá que identifiquen
todos sus componentes y que elaboren el diagrama de flujo de este sistema.
2. Se mostrará a los alumnos los diversos compresores con que cuenta la planta
piloto y los laboratorios, se les pedirá que identifiquen y describan sus
componentes y los clasifiquen de acuerdo con los tipos encontrados en la
literatura.
3. El profesor y el técnico a cargo describirán los procedimientos de arranque y paro
de la caldera y los compresores, así como una breve descripción de su
funcionamiento.
4. Los alumnos identificarán las líneas de agua, vapor, aire y electricidad de la planta
piloto, observando su ruta y registrando sus características: (materiales,
aislamiento, diámetros, color, etc.), se hará lo mismo en el laboratorio de
biorreactores indicando la clasificación de colores en caso que la haya. Los
alumnos realizarán un esquema tipo lay-out de la planta piloto indicando las rutas
de estos servicios hasta los biorreactores que se utilizarán en prácticas
posteriores.
5. Se mostrará a los alumnos el biorreactor New Brunswick Scientific para que
identifiquen en éste las líneas de suministro de agua, aire, vapor y condensados,
así como sus accesorios (filtros, trampas de vapor, reguladores de presión,
válvulas, etc.). Se hará especial énfasis en los filtros para aire y vapor, y en el
sistema de esterilización para las líneas de agua y aire. Los alumnos observarán
el cambio de materiales en las tuberías de entrada al biorreactor.
En cada actividad los alumnos deberán anotar sus observaciones en la bitácora,
acompañándolas de esquemas, dibujos, etc.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El alumno realizará un informe de las actividades desarrolladas que deberá contener los
siguientes puntos:
Introducción, objetivo, tipo y descripción de caldera, tipo y descripción de compresores,
diagrama de flujo de servicios, diagrama de ruta de servicios, observaciones sobre cada
una de las actividades realizadas, conclusiones generales sobre el desarrollo de la
práctica y bibliografía.
BIBLIOGRAFÍA
1. Clayton, A. 2000. Curso de operación y mantenimiento preventivo a generadores de

vapor.
2. Lydersen, B.K., D'Elia N. A., Kim, L. N. 1994. Bioprocess engineering: systems,
equipment and facilities. John Wiley and Sons, Inc., USA.
3. Perry, R.H., Green, D.W. 2004. Manual del Ingeniero Químico. McGraw-Hill.
4. Rase, H.F., Barrow, M.H. 1981. Ingeniería de proyectos para plantas de proceso.
CECSA.

PRÁCTICA 4
Práctica 4. Tiempo de mezclado en biorreactores
Tiempo de mezclado en
biorreactores
INTRODUCCIÓN
Tanque agitado
La agitación y aireación en un biorreactor se realiza para alcanzar los siguientes

propósitos:
1. Suministrar el oxígeno necesario a los microorganismos para que se realicen
apropiadamente sus actividades metabólicas.
2. Mantener en suspensión a los microorganismos.
En los biorreactores de tanque agitado, la agitación del caldo de cultivo se lleva a cabo
mediante las dos formas siguientes:
1. Por el movimiento de dispositivos mecánicos tales como impulsores de tipo
turbina o de propelas.

2. Por el movimiento ascendente de burbujas de aire.
Por lo tanto, la intensidad de agitación depende de la velocidad de movimiento de los

impulsores y de la velocidad de aireación.
La agitación puede describirse mediante el tiempo de mezclado, el cual se define como

el tiempo que transcurre después de la adición de un trazador para alcanzar un
determinado grado de homogeneidad, generalmente del 95%, del líquido contenido en
el biorreactor.
Un mezclado insuficiente puede causar regiones en las que haya altas concentraciones
de inhibidores de crecimiento, deficiencia de oxígeno o de algún otro nutriente,
gradientes importantes de temperatura y pH, que se pueden reflejar en lo obtención de
bajas productividades y bajos rendimientos. Por ello, es importante estudiar el efecto de
las variables de operación sobre el grado de mezclado que se pueda alcanzar en el
biorreactor.
Columna
En los biorreactores de columna la agitación del caldo de cultivo se lleva a cabo

mediante el movimiento ascendente de las burbujas de aire. El número y tamaño de las
burbujas de aire dependen de la velocidad de aireación, de las propiedades físicas del
caldo de cultivo, del tipo de dispersor, de la altura de la columna y de la presencia de
dispersores colocados a lo largo de la columna. Un aumento en la velocidad de
aireación, aumentará la fracción de gas retenido y las velocidades locales del líquido.
Junto con esto, se hacen más pronunciados los perfiles parabólicos de la fracción de
gas retenido a través de la sección transversal de la columna con su máximo en el
centro.

El elemento estructural a través del cual tiene lugar la dispersión del gas se llama
dispositivo de dispersión primaria. El gas dispersado inicialmente puede ser
redispersado. Esto se lleva a cabo por dispositivos de dispersión secundaria. En las
columnas de burbujas de una etapa y en las columnas de burbujas multietapa, el aire se
introduce a través de dispositivo de dispersión primaria, tal como un tubo perforado, un
plato perforado o un plato sinterizado, en donde es dispersado finamente. También, las
burbujas de aire que aumentan de tamaño debido a la coalescencia pueden ser
redispersadas al pasar a través de dispositivos de dispersión secundaria, tales como
mallas o bandejas perforadas colocados a lo largo de la columna. En los biorreactores
de columna de burbujas multietapa, la dispersión de aire se lleva a cabo
predominantemente en los dispositivos de dispersión primaria
Airlift
Los biorreactores airlift tienen forma de columna o torre, en su interior tienen al menos
dos zonas, una de flujo ascendente y otra de flujo descendente. El movimiento del
líquido se debe a que en dichas zonas la densidad de la dispersión gas-líquido es
diferente porque hay mayor cantidad de aire en la zona de flujo ascendente que en la
de flujo descendente. La diferencia de las fracciones de gas retenido, es una medida de
la diferencia de densidades entre las dispersiones gas-líquido en dichas zonas, la cual
es la fuerza motriz para la circulación del líquido en el biorreactor.
Debido al movimiento del líquido, las burbujas de gas en la zona de flujo ascendente
subirán más rápido, disminuyendo la fracción de gas retenido y la diferencia de presión
hidrostática. En contraste con las condiciones de una columna de burbujas, los
biorreactores airlift se caracterizan por tener fracciones de gas retenido menores y por
una distribución más uniforme de la fase gaseosa a través de la sección transversal de
la zona de flujo ascendente, con un máximo de la fracción de gas retenido local cerca
de la pared de la zona de flujo ascendente. También, en contraste con las columnas de
burbujas, los airlift muestran velocidades de líquido mucho más altas. La velocidad del

líquido afecta decisivamente todos los parámetros que caracterizan el desempeño del
biorreactor, tales como la fracción de gas retenido, el tiempo de mezclado y el
desempeño en cuanto a transferencia de masa y calor. En general, la velocidad del
líquido en los biorreactores airlift se determina por la velocidad de aireación, la
geometría del biorreactor y las propiedades físicas de la fase líquida.
El mezclado del líquido es predominantemente producido por la circulación del líquido y

en menor grado por la dispersión axial debida al ascenso de las burbujas de aire. El
mezclado ocurre predominantemente en las zonas de deflexión superior e inferior,
debido a las diferencias de velocidad ahí existentes. Para una geometría definida, la
rapidez del mezclado puede expresarse en términos del tiempo de circulación, el cual
se define como el tiempo requerido para que el líquido circule una vez dentro del
biorreactor. Por ello, el conocimiento del tiempo de circulación y de los factores que lo
afectan es necesario para el diseño, modelado y operación de un biorreactor airlift.
OBJETIVOS
Tanque agitado
El alumno determinará el tiempo de mezclado en un biorreactor de tanque agitado bajo
diferentes condiciones de aireación y agitación.
Columna
El alumno determinará el tiempo de mezclado en un biorreactor de columna de burbujas
bajo diferentes condiciones de aireación, utilizando dos diferentes tipos de dispersores.
Airlift
El alumno determinará el tiempo de circulación, el tiempo de mezclado y las fracciones
de gas retenido global, en la zona de flujo ascendente y en la zona de flujo descendente
en un biorreactor airlift bajo diferentes condiciones de aireación.

Biorreactores
1. Biorreactor de tanque agitado.
2. Biorreactor de columna de burbujas
3. Biorreactor airlift
Instrumentacion
1. Cronómetros.
2. Rotámetros.
3. Manómetros.
4. Termómetros.
5. Medidor de pH con adquisición de datos en línea.
6. Computadora y software para la adquisición de datos en línea.
Reactivos
1. Solución de NaOH 6N.
2. Solución de HCl 6N.
3. Solución de azul de bromocresol.
4. Soluciones reguladoras de pH, de 4 y 9.
Determinación del tiempo de mezclado en los biorreactores:
Tanque agitado y columna

El método que se utilizará es del de adición de trazadores tales como ácidos y bases.
Airlift
a) Determinación del tiempo de circulación y del tiempo de mezcla

El método que se utilizará es el de adición de trazadores tales como ácidos y

bases.
b) Determinación de la fracción de gas retenido local
Utilizando el método manométrico.
c) Determinación de la fracción de gas retenido global
Midiendo el volumen del líquido aireado y el volumen del líquido sin airear.
Actividades previas
1. Medir las dimensiones de todas las partes del biorreactor.
2. Llenar el biorreactor con agua de la llave.
3. Agregar al biorreactor 0.2 ml de la solución de indicador.
4. Una vez conectado el sistema de medición de pH a la computadora, calibrar el
electrodo y colocarlo en el biorreactor.
Condiciones de operación
Tanque agitado
o Las velocidades de agitación serán: 300, 500 y 700 rpm.
o Para cada velocidad de agitación, se probarán las siguientes velocidades de
aireación: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 vvm.
Columna
o Velocidades de aireación: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 vvm
o Tipos de dispersores: tubo perforado y plato poroso.

Airlift
o Velocidades de aireación: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 vvm
o Tipos de tubos de arrastre: 2 diámetros diferentes.
Medición del tiempo de mezclado

Método de adición de pulsos.
1. La adición de pulsos se realizará a través de la boquilla inferior de los
biorreactores.
2. Al momento de adicionar un pulso de ácido o base, registrar el tiempo que
transcurre hasta lo obtención de la homogenización del color del líquido en el
biorreactor. Simultáneamente a la adición del pulso, ejecutar el programa de
adquisición de datos de pH de manera que registre el valor de pH cada 0.16 seg.
3. Ajustar el pH a un valor entre 8.5 y 9.0.
4. Adicionar 1 mL de la solución de HCl 6N, el indicador virará a azul.
5. Adicionar 1 mL de la solución de NaOH 6N, el indicador virará a amarillo.
6. Medir el nivel del líquido aireado.
7. Cambiar las condiciones de operación y una vez alcanzado el estado estacio-
nario, de nuevo agregar pulsos y medir el nivel del líquido aireado.
Medición de la fracción de gas retenido local para el biorreactor airlift
1. Medir la diferencia de alturas del agua contenida en los manómetros de presión

diferencial de cada zona del biorreactor.
2. Medir la distancia entre las tomas de presión estática de la zona de flujo
ascendente y las de la zona de flujo descendente.
Medición de la fracción de gas retenido global

1. Medir el nivel del líquido sin airear en el biorreactor.
2. Medir el nivel del líquido aireado para cada condición de operación.

RESULTADOS Y MANEJO DE DATOS
Tanque agitado
1. Elaborar gráficas de pH en función del tiempo.
2. Calcular el tiempo de mezclado.
3. Construir gráficas del tiempo de mezcla en función de la velocidad de aireación
(expresada como vvm y vs).
4. Calcular la potencia de agitación sin aireación y con aireación.
5. Calcular la potencia de aireación.
6. Obtener las correlaciones matemáticas de las relaciones del tiempo de mezclado
con las variables de operación empleadas.
Columna
2. Calcular el tiempo de mezclado.
3. Construir gráficas del tiempo de mezcla en función de la velocidad de aireación
(expresada como vvm y vs).
con la velocidad de aireación (expresada como vvm y vs).
Airlift
2. Calcular el tiempo de circulación y el tiempo de mezclado.
3. Construir gráficas del tiempo de circulación en función de la velocidad de
aireación (expresada como vvm y vs) y del
4. Elaborar gráficas de tiempo de mezclado en función de la velocidad de aireación
(expresada como vvm y vs) para cada tipo de tubo de arrastre.
5. Calcular las fracciones de gas retenido en la zona de flujo ascendente y en la
zona de flujo descendente.
6. Calcular la fracción de gas retenido global.


8. Construir gráficas del tiempo de circulación en función de las fracciones de gas
retenido y del tiempo de mezclado en función de las fracciones de gas retenido.
con la velocidad de aireación (expresada como vvm y vs).
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

La discusión deberá incluir al menos lo siguiente:
1. Comparación de los tiempos de mezclado obtenidos en cada condición de
operación.
2. Comparación de las potencias de aireación y de agitación.
3. Comentarios sobre el aspecto de la dispersión gas-líquido.
Airlift
La discusión deberá incluir al menos lo siguiente:
1. Comparación de los tiempos de circulación y de mezclado obtenidos en cada
velocidad de aireación.
2. Comparación de las fracciones de gas retenido.
3. Comentarios sobre el aspecto de la dispersión gas-líquido.
4. Investigación sobre la relación de diámetros entre el tubo de arrastre y el del
biorreactor que ofrece la mínima resistencia al flujo.

BIBLIOGRAFÍA
Tanque agitado
1. Aiba, S., Humphrey A.E., Millis, N.F. 1973. Biochemical engineering, 2nd. Edition
Academic.
2. Hicks, R.W., Gates, L.E. 1976. How to select turbine agitators for dispersing gas into
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4. Wang, D.I. C., Cooney, C L., Demain, A.L., Dunill, P., Humphrey, A.E., Lilly, M.D.
Columna
1. Miyahara, T., Matsuba, Y., Takahashi, T. 1983. The size of bubbles generated from
perforated plates. Int. Chem. Engng. 23. 3: 517-523.
2. Schüegerl, K. 1982. New bioreactors for aerobic processes. Int. Chem. Engng. 22. 4:
591-610.
3. Schüegerl, K., Lucke, J., Oels, U. 1980. Bubble column biorreactors. Adv. In
Biochem. Engng. 45. 7: 1-84.
Airlift
1. Blenke, H. 1985. Biochemical loop reactors. Biotechnology 2, Ed. by Rehm, H. J., y
G. Reed.
2. Joep, J.M. 1988. Gas hold up measurements in bioreactors. Trends in
Biotechnology. 6: 19-22.
3. Weiland, P., Onken, V. 1981. Differences in the behaviour of bubble columns and
airlift loop reactors. Ger. Chem. Eng. 4: 174-181.

PRÁCTICA 5
Práctica 5. Transferencia de oxígeno en biorreactores agitados y neumáticos
Transferencia de oxígeno en
biorreactores agitados y neumáticos
INTRODUCCIÓN
Tanque agitado
Las conversiones microbianas aeróbicas son reacciones de oxidación que requieren

oxígeno molecular disuelto. Una gran diferencia del oxígeno con respecto a otros
nutrientes, es su extremadamente baja solubilidad en agua. Consecuentemente, la
transferencia de oxígeno puede llegar a ser uno de los principales factores limitantes de
la productividad celular y/o de metabolitos, debido a la influencia de la concentración del
oxígeno disuelto sobre las actividades metabólicas de las células.
La velocidad de transferencia de oxígeno de un biorreactor de tanque agitado depende

de las condiciones de aireación y agitación y de las propiedades físicas del caldo de
cultivo. La ecuación que describe la velocidad de transferencia de oxígeno (VTO) es:

VTO = k L a (C * − C ) (1)
donde:
kLa : coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, h-1.
C* - C : fuerza impulsora de la transferencia de oxígeno, mMoles/L.
El kLa es un parámetro que sirve para conocer la rapidez con la que se transfiere
oxígeno del aire al líquido contenido en un biorreactor. Existen diferentes métodos para
determinar la velocidad de transferencia de oxígeno. En esta práctica se combinan dos
de ellos, el de balance de oxígeno o medida directa con el del sulfito. Por lo tanto, se
empleará un sistema físico aire-agua y no uno biológico. Un balance de oxígeno del aire
considerando la entrada y la salida del biorreactor es:
7.32 x 10 5 ⎡⎛ Qi Pi y i ⎞ ⎛ Qo Po y o ⎞⎤
VTO = ⎢⎜⎜ ⎟⎟ − ⎜⎜ ⎟⎟⎥ (2)
VL ⎣ ⎝ Ti ⎠ ⎝ T0 ⎠⎦
donde:
VL : volumen de líquido en el biorreactor, litros.
Q : flujo volumétrico de aire, litros/min.
P : presión total absoluta, atm.
T : temperatura del aire, 0K.
y : fracción mol de oxígeno.
7.32 x 105 : factor de conversión.
i = a la entrada del biorreactor.
o = a la salida del biorreactor.
En esta práctica para que haya una transferencia neta de oxígeno debe haber consumo
del mismo, por lo que como “consumidor” de oxígeno se emplea sulfito de sodio. En
este caso la reacción de oxidación es tan rápida que la concentración de oxígeno
disuelto en el líquido es cero. La reacción que se efectúa es:

Cu2+
2 Na2SO3 + O2 2Na2SO4
Otro parámetro importante que determina la velocidad de transferencia de oxígeno de

un biorreactor es la fracción de gas retenido o "gas holdup", definido como la fracción
de la unidad de volumen de la mezcla gas-líquido que es ocupada por la fase gaseosa.
Cuando el tamaño promedio de las burbujas es constante, una mayor fracción de gas
retenido, implica una mayor área interfacial gas-líquido y en consecuencia una mayor
transferencia de oxígeno.
Columna
La velocidad de transferencia de oxígeno es determinada de manera importante por el

área superficial de las burbujas de aire, de aquí que el aire se disperse en forma de
burbujas pequeñas para proveer una gran área de contacto entre las fases líquida y
gaseosa. Sin embargo, en algunos caldos de fermentación, las burbujas pequeñas
tienden a unirse formando burbujas más grandes. Así que aún con una dispersión
primaria muy fina y dependiendo de las propiedades físicas del caldo de cultivo y de la
intensidad de la turbulencia dentro del biorreactor, las burbujas pueden crecer hasta
aproximadamente 6 mm de diámetro después de dejar la zona de dispersión.
Este fenómeno conocido como coalescencia de las burbujas, es causado por el hecho
de que una película líquida entre dos burbujas de aire adyacentes se hace cada vez
más delgada hasta que eventualmente se rompe.
En una dispersión gas-líquido cuyo comportamiento es 100% coalescente, el líquido es

un líquido puro. Al ir aumentando la concentración de electrolitos disueltos en dicho
líquido, se va inhibiendo la coalescencia de las burbujas. También la presencia de
proteínas, alcoholes y substancias surfactantes, afecta el grado de coalescencia de las
burbujas.

La coalescencia de las burbujas afecta entonces el diámetro de las burbujas. Éste junto
con la fracción de gas retenido determinan el área superficial de contacto entre las
fases líquida y gaseosa, de acuerdo a la siguiente ecuación:
6ε
a= (3)
d b ((1 − ε ))
donde:
a: área interfacial gas-líquido.
ε : fracción de gas retenido.
d b : diámetro de las burbujas.
Airlift
Si el oxígeno molecular no fuera continuamente transferido del aire al caldo de cultivo

de microorganismos, el oxígeno disuelto sería consumido en pocos segundos bajo
condiciones normales de fermentación, debido a la baja solubilidad del oxígeno en los
caldos de cultivo. El suministro del oxígeno al caldo de cultivo de microorganismos, es
por lo tanto, un aspecto muy importante en el diseño de biorreactores para procesos
aeróbicos. En el transporte de oxígeno de la fase gaseosa al caldo de cultivo de
microorganismos, la resistencia de la película líquida en la interfase gas-líquido es, en la
mayoría de los casos, el paso limitante de la velocidad de suministro de oxígeno.
El kLa es un parámetro que sirve para conocer la rapidez con la que se transfiere
oxígeno del aire al líquido contenido en un biorreactor. Este coeficiente depende del
grado de coalescencia de las burbujas. Por ejemplo, el kLa empleando una solución
acuosa con una fuerza iónica de I=0.4, es más grande, por un factor de seis, que el
obtenido con agua. Esto es debido a un aumento del área interfacial.

Un efecto importante de la circulación del líquido es que disminuye la frecuencia de la

coalescencia al aumentar la velocidad del líquido. Esto es resultado de que las
distancias entre las burbujas de gas son más grandes debido a que las fracciones de
gas retenido son menores y a que la distribución de gas es más uniforme. Además,
porque disminuye el movimiento transversal de las burbujas de gas.
En general, en los biorreactores de columna de burbujas se obtienen fracciones de gas

retenido más grandes, mientras que el los biorreactores airlift, la fracción de gas
retenido disminuye al aumentar la velocidad de circulación del líquido. La velocidad del
líquido representa por lo tanto, un parámetro muy importante para adaptar la fracción de
gas retenido y el tiempo de residencia promedio de las burbujas a los requerimientos de
proceso.
En los biorreactores airlift de gran altura, la velocidad de transferencia de masa cambia

a lo largo de la ruta de flujo de una manera complicada, debido a que el área interfacial
y la diferencia de concentración de oxígeno cambian de un punto a otro debido a la
expansión o compresión, al consumo de oxígeno y a cambios en la presión hidrostática
y en la velocidad local del líquido.
OBJETIVO
El alumno determinará la velocidad de transferencia de oxígeno, el coeficiente

volumétrico de transferencia de oxígeno y la fracción de gas retenido global en
diferentes tipos de biorreactores

Biorreactor
1. Biorreactor de tanque agitado.
2. Biorreactor de columna de burbujeo.
3. Biorreactor airlift
Instrumentos
1. Rotámetros.
2. Analizador de oxígeno en fase gaseosa.
3. Manómetros.
4. Termómetros.
5. Medidor de pH.
Reactivos
1. Na2SO3
2. Almidón en solución al 1%.
3. HCL 3N
4. NaOH 3N
5. Soluciones reguladoras de pH, de 4 y 9.
Métodos
o Determinación de la velocidad de transferencia de oxígeno: mediante el método
combinado del balance de oxígeno con el del sulfito.
o Determinación del kLa usando la siguiente ecuación:
kLa = VTO / C*
o C* se calcula con la ecuación de la ley de Henry.
o Determinación de la fracción de gas retenido global: método de expansión de
gas.

Actividades previas
1. Preparar en el biorreactor una solución de Na2SO3 0.6N.
2. Adicionar Cu2SO4 a la solución de sulfito, para tener una concentración final de
0.25 g/L.
3. Ajustar el pH a 7.6 y mantenerlo constante durante la experimentación.
Condiciones de operación
Tanque agitado
o Las velocidades de agitación serán: 300, 500 y 700 rpm.
o Para cada velocidad de agitación, se probarán las siguientes velocidades de
aireación: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 vvm.
Columna
o Velocidad de aireación: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 vvm.
Airlift
o Velocidad de aireación: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 vvm.
o Tipos de tubos de arrastre: de 2 diámetros diferentes.
Medición de la concentración de oxígeno gaseoso.

1. Una vez establecidas las condiciones de operación, medir la concentración del
oxígeno del aire que sale del biorreactor, utilizando el analizador de oxígeno
previamente calibrado.

Medición de la fracción de gas retenido global.

1. Medir el nivel del líquido sin airear y el nivel del líquido aireado para cada
condición de operación.
Airlift
1. Medir la diferencia de alturas del agua contenida en los manómetros de presión
diferencial de cada zona del biorreactor,
2. Medir la distancia entre las tomas de presión estática de la zona de flujo
ascendente y entre las de la zona de flujo descendente.
RESULTADOS
1. Calcular la VTO, el kLa y la fracción de gas retenido global, para cada condición
de operación.
2. Calcular C*.
3. Obtener la correlación del kLa con la velocidad de aireación, ésta expresada en
vvm y en m/s.
4. Obtener la correlación del kLa con la fracción de gas retenido.
La discusión deberá contener al menos la siguiente información:

1. Comparación de las diferentes condiciones de operación y fracciones de gas
retenido con respecto a los valores del kLa.
2. Comparación de los valores de kLa que obtuvo para cada uno de los biorreactores
empleados y explique el porqué de las diferencias.

3. Cuál es el aspecto de la dispersión gas-líquido para cada condición de operación.

4. Explicación de los valores de kLa de los líquidos que promueven la coalescencia y
de los líquidos que la inhiben.
BIBLIOGRAFÍA

1. Aiba, S., Humphrey, A. E., Millis, N. F. 1973. Biochemical engineering. Academic
Press.
2. Van´t Riet, K. 1991. Basic bioreactor design. Mercel Dekker, Inc. USA.
3. Wang, D .I .C., Cooney, C. L, Demain, A. D., Dunill, P., Humphrey, A. E., Lilly, M. D.
Airlift
1. Chisti, M. Y. 1989. Airlift bioreactors. Elsevier Applied Science. England.
2. Merchuk, J. C. 1990. Why use airlift reactors. TiBTech. 8. 66-71.
3. Vant Riet, K. 1991. Basic bioreactor design. Mercel Dekker, Inc. USA.
4. Weiland, P., Onken, U. 1981.Differences in the behaviour of bubble columns and
airlift loop reactors. Ger. Chem. Eng. 4: 174-181.

PRÁCTICA 6
Práctica 6. Mantenimiento de asepsia en biorreactores
Mantenimiento de asepsia en
biorreactores
INTRODUCCIÓN
En esta práctica la asepsia se considera como el conjunto de procedimientos

destinados a eliminar o retirar microorganismos de un biorreactor y de todas las
tuberías conectadas a él, con el propósito de asegurar que únicamente estén presentes
el o los biocatalizadores, microorganismos o enzimas, responsables de efectuar la
bioconversión de materias primas a un producto especificado. En consecuencia, la
asepsia del biorreactor y de las tuberías asociadas a él, garantizan que los procesos de
bioconversión se lleven a cabo sin contaminaciones por microorganismos extraños.
Los microorganismos contaminantes pueden competir con el microorganismo cultivado

por el substrato o pueden desplazarlo al tener una velocidad de crecimiento mayor,
incluso pueden producir substancias que dañen al microorganismo cultivado o inactiven
a las enzimas. Por lo tanto, la presencia de microorganismos contaminantes ocasionan

que los rendimientos y productividades de producción establecidos no se puedan

alcanzar, ocasionando pérdidas económicas.
Para poder lograr la asepsia del biorreactor y de las tuberías asociadas a él, se deben
proponer desde la etapa de diseño, una geometría interna y arreglos de tuberías, que
eviten la acumulación de substancias al llevar a cabo el vaciado de ellos. Las
substancias acumuladas pueden propiciar una contaminación. También, la asepsia se
facilita mediante una limpieza efectiva del biorreactor y tuberías, lo que se alcanza al
especificar materiales de construcción con un acabado que evite el atrapamiento de
partículas sólidas con microorganismos. Las partículas sólidas eventualmente limitan la
transferencia de calor, evitando el calentamiento de los microorganismos a la
temperatura de esterilización y por lo tanto, dejándolos viables para generar una
contaminación.
Una vez lavado el biorreactor y las tuberías, el biorreactor se llena con medio de cultivo
para proceder a la esterilización. Después de la esterilización, el biorreactor debe
operar asépticamente. Para lograrlo, es necesario el buen funcionamiento del sello
mecánico para mantener una presión positiva que evite la entrada de microorganismos.
También, se requiere el más alto aseguramiento posible de la integridad y eficiencia de
remoción del filtro para la esterilización del aire.
Existen diferentes métodos para probar la integridad de filtros. Uno de ellos es la prueba
de la intrusión del agua. Es una prueba práctica y validada, que se puede considerar
para probar la integridad in situ de los filtros hidrofóbicos para la esterilización del aire.
Otra prueba es la de mantenimiento de la presión.

OBJETIVO
El alumno aplicará las pruebas de intrusión de agua y de mantenimiento de la presión

para probar la integridad de filtros de aire, con los que se garantice la operación
aséptica en biorreactores.
Biorreactor.
1. Biorreactor agitado de 30 L, equipado con prefiltros y filtros hidrofóbicos para la
esterilización de aire.
Instrumentación.
1. Cronómetro.
2. Rotámetro.
3. Manómetro.
4. Termómetro.
Reactivos
1. Agua desionizada
2. Isopropanol
Prueba de intrusión de agua
El principio de esta prueba es que si el lado corriente arriba de un filtro hidrofóbico seco
se llena de agua y se presuriza, la naturaleza hidrofóbica de la membrana porosa
prevendrá el flujo del líquido a través del filtro hasta que se alcanza la presión de la
intrusión. A presiones por debajo de la presión de intrusión ocurre un flujo pequeño pero

medible del agua a través de la membrana. La presencia de poros más grandes en el

filtro será detectada por un flujo creciente debido al agua que atraviesa estos poros. La
figura 1 muestra el principio de esta prueba.
Presión Aire
Membrana
Aire hidrofóbica
Agua
Agua
Filtro: Poro B
Membrana Poro A
hidrofóbica
Carcasa
Unidad de filtración
Figura 1. Principio de la prueba de intrusión de agua. Si el tamaño de los poros es como

el tamaño del poro B, el flujo de agua será menor que el flujo correspondiente a poros
del tamaño del poro A.
La tabla 1 muestra el resultado de una prueba de intrusión de agua para un filtro de

membrana de la marca Pall. Los parámetros de la prueba son específicos para cada
filtro y deben ser proporcionados por el fabricante.

Tabla 1. Parámetros de la prueba de intrusión de agua para un filtro de cartucho

EMFLON PFR de Pall.
Número de catalogo AB1PFR7PVH4
Presión de prueba 2500 mbar
Flujo máximo permisible 0.33 mL/min
Usando agua desionizada a una temperatura de 20° ± 2°C.
Prueba de mantenimiento de la presión
La prueba de mantenimiento de la presión es una forma modificada de una prueba de

flujo difusivo, que es la prueba de flujo hacia delante corriente arriba del filtro. Ésta
puede llevarse a cabo después de la esterilización del filtro, antes de la filtración y
después de la filtración estéril, puesto que las conexiones estériles corriente abajo no se
desconectan. Una ventaja de la prueba de mantenimiento de la presión es que también
confirma la integridad de la unidad de filtración, incluyendo los sellos de la carcasa.
Prueba de intrusión de agua
1. Instalar el filtro seco.

2. Llenar con agua desionizada el lado corriente arriba del filtro.
3. Aplicar una presión predeterminada, utilizando aire. Esto causa una disminución
del nivel de agua dentro de la carcasa del filtro, debido a la compresión de los
pliegues del filtro y al paso de aire atrapado a través de la membrana. Es
importante que los cambios de volumen corriente arriba del filtro debido a estos

efectos se haya estabilizado, para que se puedan medir los flujos de agua muy
pequeños que pasan a través de la membrana.
4. Dejar pasar 10 minutos para que ocurra la estabilización tanto del flujo como de
la temperatura.
5. Después de la estabilización, medir el flujo de agua. Esto se puede hacer,
determinando el flujo de aire corriente arriba que es requerido para mantener la
presión constante.
6. Al terminar la prueba, drenar el agua del filtro y de las tubería.
7. Secar el filtro y la tubería.
8. Comparar los resultados de la prueba con los límites especificados.
9. Si los resultados están dentro de los límites especificados, entonces el filtro está
listo para usarse.
Prueba de mantenimiento de la presión
1. Mojar la membrana del filtro con una mezcla de isopropanol agua 60:40 (v/v).
2. Instalar el filtro en la carcasa.
3. Presurizar la unidad de filtración a una determinada presión.
4. Aislar la unidad de filtración de la fuente de presión y de la tubería corriente bajo.
5. La difusión del gas a través de la membrana mojada se mide cuantitativamente
como un descenso de la presión después de un periodo de tiempo especificado.
6. Medir el volumen corriente abajo de la carcasa.
7. Mantener constante la temperatura en el volumen corriente abajo de la carcasa.
8. Verificar que no haya fugas en el sistema de tuberías corriente abajo.
9. Comparar los resultados con los valores publicados de la disminución de la
presión, los cuales se basan en carcasas estándares con válvulas corriente
arriba localizadas tan cerca como sea posible de la carcasa del filtro.
10. Si los resultados están dentro de los límites especificados, entonces el filtro está
listo para usarse.

RESULTADOS
1. Elabore el isométrico de tuberías que muestre la instalación del filtro.

2. Dibuje un diagrama de bloques de los procedimientos experimentales realizados
en esta práctica.
3. Construya una grafica del flujo de agua en función del tiempo.
4. Realice una grafica de la presión en función del tiempo.
La discusión versará al menos sobre lo siguiente:

1. Las especificaciones de los líquidos que se requieren para mojar la membrana de
filtros hidrofóbicos en las pruebas de integridad de flujo difusivo.
2. La razón de que las pruebas de integridad de filtros deban ser correlacionados
con la prueba de la carga bacteriana líquida, la cual es un indicador del
desempeño de los filtros.
3. Tres pruebas que se han utilizado comúnmente en filtros para la esterilización de
gas, así como sus ventajas y desventajas.
BIBLIOGRAFÍA
1. Lydersen B.K., D´elia N.A., Nelson, K.M.L. 1994. Bioprocess engineering: systems,
equipment and facilities. John Wiley and Sons, Inc. New York.
2. Johnston P.R. 2004. Fluid sterilization by filtration. Interpharm, CRC Press LLC.
3. Jornitz. M.W. 2006. Sterile filtration. Springer-Verlag, Berlin.

PRÁCTICA 7
Práctica 7. Esterilización del sistema de biorreacción
Esterilización del sistema de

biorreacción
INTRODUCCIÓN
Una esterilización adecuada del medio de cultivo es importante para garantizar el éxito
de muchas fermentaciones industriales. Para lograr este propósito, se emplea cualquier
método capaz de destruir o separar a los microorganismos contaminantes indeseables.
La técnica más común es la destrucción de los microorganismos contaminantes. El
término destrucción, en este caso, significa la pérdida de viabilidad del microorganismo.
La destrucción de microorganismos se puede llevar a cabo por varios métodos:

1. Calor, ya sea seco o húmedo
2. Agentes químicos
3. Radiaciones
4. Vibraciones sónicas

El método más comúnmente utilizado para medios líquidos es el de calor húmedo ya

que es simple, confiable y económico.
Cinética de muerte térmica de microorganismos
Generalmente se clasifica la velocidad de muerte de los microorganismos en: velocidad

de muerte logarítmica y velocidad de muerte no logarítmica.
Velocidad de muerte logarítmica
La velocidad de muerte logarítmica se puede expresar matemáticamente mediante la

ecuación:
dN
- = kN (1)
dt
Separando variables e integrando.
N
ln = − kt (2)
No
N
= exp(− kt ) (3)
No
La ecuación (3) describe apropiadamente la cinética de muerte térmica de células

vegetativas.

Velocidad de muerte no logarítmica
Este tipo de comportamiento de muerte térmica se encuentra a menudo en esporas

bacterianas. Se proponen varias explicaciones para esta conducta: germinación de
esporas, técnicas experimentales deficientes, impactos múltiples para la inactivación y
eventos secuenciales en la inducción de muerte.
El modelo de eventos secuenciales propone que la muerte ocurre de la siguiente

manera:
N R ⎯⎯
kR
→ N S ⎯⎯
kS
→ ND (4)
Se propone que una espora resistente NR sufre inactivación o muerte a un estado final
ND a través de un intermediario sensible NS.
Se establecen las ecuaciones diferenciales:
dN R
= − kR N R (5)
dt
dN S
= kR N R − kS N S (6)
dt
La solución a estas ecuaciones diferenciales simultáneas es:
N ⎡ kR ⎤⎡ k ⎤
=⎢ exp(k S t )⎥ ⎢ S exp(− k R t )⎥ (7)
N0 ⎣ kR − kS ⎦⎣ k R ⎦

Efecto de la temperatura sobre la cinética de muerte
Considerando la muerte térmica de los microorganismos de manera similar a las

reacciones químicas, la relación entre las constantes cinéticas y la temperatura
presenta un comportamiento análogo. La teoría más frecuentemente empleada es la
teoría de Arrhenius.
Esta relación se expresa matemáticamente como:
⎛ −E ⎞
k = A exp⎜ ⎟ (8)
⎝ RT ⎠
Esterilización por lote
En el proceso de esterilización por lote, el medio se coloca en el fermentador y el

contenido se calienta a la temperatura de esterilización asignada. Para establecer la
relación entre tiempo y temperatura se puede utilizar la ecuación (1). Sin embargo, k
durante la esterilización por lote no es constante ya que la temperatura durante el
calentamiento y enfriamiento varían. Incorporando el efecto de la temperatura
establecido por la ecuación de Arrhenius la ecuación queda:
⎛ −E ⎞
t
No
∇ TOTAL = ln = A∫ exp⎜ ⎟ dt (9)
N 0
⎝ RT ⎠
El símbolo ∇ representa el grado de destrucción en todo el proceso.
El ciclo de esterilización está formado por tres períodos:

1. Elevación de temperatura o calentamiento.

2. Mantenimiento de temperatura
3. Descenso de temperatura o enfriamiento.
El perfil temperatura - tiempo durante la fase de calentamiento es función de varios
factores, por ejemplo: la forma en que se lleva a cabo el calentamiento, ya sea
inyección directa de vapor, calentamiento indirecto a la chaqueta, mediante serpentines
o eléctricamente. La tabla 1 muestra las relaciones tiempo – temperatura de acuerdo a
la forma de transferencia de calor.

TIPO DE RELACION
TRANSFERENCIA DE TEMPERATURA- ayb
CALOR TIEMPO
Adición de vapor al ⎛ at ⎞
a=
hs
T = To⎜ 1 + ⎟
medio ⎝ 1 + bt ⎠ MToC
(Hiperbólica ) s
b=
M
Calentamiento con T =To(1 + at ) q

a=
dispositivo eléctrico MToC
( lineal )
Calentamiento con vapor (

T = TH 1 + be− at ) a=
Ua ′
(intercambiador de calor) MC
( exponencial )
To − TH
b=
TH
Enfriamiento (
T = T∞ 1 + be− at ) a=
WC′ ⎛
− Ua ′
⎜ 1 − e MC ′ ⎟
⎞
(Intercambiador de calor) MC ⎝ ⎠
To − T∞
b=
T∞
Tabla 1. Relaciones tiempo – temperatura de acuerdo a la forma de transferencia de

calor

OBJETIVO
El alumno diseñará el ciclo de esterilización para un medio de cultivo en un biorreactor.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Material y equipo
1. Fermentador de 12 litros.
2. Cronómetro
3. Cajas de Petri estériles.
4. Pipetas estériles.
5. Frascos de dilución con agua estéril.
6. Agar nutritivo
7. Mechero.
8. Esporas de Bacillus subtilis.
Trabajo experimental
1. Una vez montado el vaso conteniendo 12 litros de agua inocular con esporas de
Bacillus subtilis.
2. Establecer la temperatura de esterilización.
3. Anotar los datos de tiempo y temperatura durante todo el ciclo de esterilización,
en intervalos de un minuto.
4. Tomar cuatro muestras a diferentes tiempos: al principio del ciclo de esterilización
(No), al final del período de calentamiento (N1), al final del período de
mantenimiento (N2), y al final del período de enfriamiento (N3).
5. De cada una de las muestras tomadas, se hace una dilución y se siembran por
duplicado en cajas de Petri utilizando la técnica de vaciado en placas. Se
incuban a 30 ºC, hacer cuenta de colonias cada 24 h, durante tres días.

MUESTRA DILUCIÓN
NO 10-1 10-5
N1 10-1 10-5
N2 10-1 10-3
N3 10-1 10-2
INFORME
1. Presentar en un cuadro los valores de temperatura y tiempo para el ciclo de

esterilización. Graficar los perfiles para las etapas de calentamiento,
mantenimiento y enfriamiento.
2. Determinar los valores de (a) y (b) de las ecuaciones de temperatura en función

del tiempo para las etapas de calentamiento y enfriamiento.
3. Calcular el coeficiente global de transferencia de calor (UiD) para las etapas de

calentamiento y enfriamiento.
4. Con los valores de No, N1, N2 y N3 determinará el grado de destrucción para el

calentamiento, mantenimiento, enfriamiento y el ∇ciclo de esterilización .
5. En el período de mantenimiento determinará el valor de la energía de activación

conociendo el valor de la constante de Arrhenius: A = 7.49 X 1038 min-1 .
6. Elaborar un cuadro de valores de (k) en función del tiempo y trazará la gráfica

correspondiente. Obtendrá el grado de destrucción para calentamiento,

mantenimiento, enfriamiento y total por integración gráfica en la curva anterior y

por algún método numérico.
7. En el caso de que la esterilización haya sido deficiente, recalcular el tiempo de

mantenimiento, suponiendo los criterios de diseño de calentamiento y
enfriamiento constantes y una población final de microorganismos viables de 10-3
( probabilidad de que en mil lotes de esterilización, uno resulte contaminado).
8. Realizar el escalamiento de las etapas de calentamiento, mantenimiento y

enfriamiento para un volumen de 10,000 litros de medio de cultivo. Graficar los
perfiles de temperatura vs. Tiempo para ambas escalas. El escalamiento se
efectuará con base al criterio de (P/V).
9. Discutir los perfiles obtenidos en ambas escalas con base en las siguientes
variables: volumen de trabajo, área de transferencia de calor, coeficiente global
de transferencia de calor, flujo de vapor y flujo de agua de enfriamiento.
10.Calcular los tiempos del ciclo de esterilización para ambas escalas cuando se
usa una temperatura de mantenimiento de 121 ºC, No = 106 UFC/mL y N = 10-3
. Discutir estos resultados.
11. Exponer sus conclusiones.

NOMENCLATURA
a’ - Área de transferencia de calor: calcularla experimentalmente

A - Constante de Arrhenius, min-1.
C - Calor específico del medio de cultivo, kcal/ kg C
C’ - Calor específico del elemento enfriador, kcal / kg C
E - Energía de activación, cal / g mol, kcal / kg mol
h - Entalpía relativa al medio. kcal / kg (entalpía del vapor a la temperatura del medio
de cultivo).
k - Constante específica de velocidad de muerte, min. -1
kR - Constante específica de inactivación de esporas resistentes.
ks - Constante específica de intermediarios sensibles.
M - Masa inicial del medio, kg.
N - Concentración de microorganismos en el tiempo t
No - Concentración de microorganismos to
N1 - Concentración de microorganismos t1
ND -Concentración de esporas inactivas.
NR -Concentración de esporas resistentes.
NS - Concentración de esporas sensibles
q - Velocidad de transferencia de calor, kcal / s
R - Constante Universal de los gases, 1.98 cal / g Mol ºK
s - Gasto masa de vapor, kg / s, kg / h, kg / min.
t - Tiempo, min, h.
T - Temperatura absoluta ºK
T0 - Temperatura inicial del medio ºK
TH - Temperatura de la fuente de calentamiento ºK
T∞ - Temperatura de la fuente de enfriamiento, 293 ºK
U - Coeficiente global de transferencia de calor, kcal / m2 h ºC
W - Gasto masa del elemento enfriador: calcularla experimentalmente

BIBLIOGRAFÍA
1. Abbot, F.J., Clamen, A., 1973. Biotechnol. Bioeng. 15:117-127.

2. Bailey, J.E., Ollis, D.F. 1977. Biochemical engineering fundamentals. McGraw-Hill,
Inc.
3. Deindoerfer, F.H. y Humphrey, A.E., 1959. Appl. Microbiol. 7: 256-264.
4. Richards, J.W., 1961. Progress in Ind. Microbiol. 5: 143-173.
5. Wang, I.C.D., y col. 1979. Fermentation and Enzyme Technology. John Wiley, N. Y.

PRÁCTICA 8
Práctica 8. Producción de biomasa en cultivo por lote
Producción de biomasa en
Cultivo por lote
INTRODUCCIÓN
Los sistemas fermentativos se clasifican en tres grupos: cerrados, abiertos y sistemas

semicerrados. Al primer grupo pertenece el cultivo por lote empleado tradicionalmente
desde el siglo antepasado en el cual una vez iniciada la fermentación ya no existe
entrada ni salida de materiales.
Hasta la fecha la gran mayoría de las fermentaciones a nivel industrial se llevan a cabo
en cultivo por lote. Este consiste en agregar al fermentador un medio de cultivo que
contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento del microorganismo y/o para la
producción de un metabolito. El medio después de ser esterilizado y enfriado a la
temperatura de fermentación, se inoculará con el microorganismo para permitir su
desarrollo y producción del metabolito, hasta un tiempo en el cual ocurre el agotamiento
de uno o más nutrientes del medio de cultivo. Terminada la fermentación, se cosecha la
totalidad del volumen de mosto o medio agotado para recuperar el producto.

Ya vacío el fermentador se limpia y lava perfectamente para permitir la siguiente

fermentación. La determinación de los parámetros cinéticos de un cultivo por lote tiene
la finalidad de conocer, predecir y controlar la fermentación misma. El cultivo por lote
tiene la particularidad de que todos los parámetros cinéticos varían con el tiempo de
fermentación. Los valores obtenidos de estos parámetros son lo suficientemente
confiables si las determinaciones se realizan adecuadamente durante el proceso de
fermentación.
OBJETIVO
El alumno determinará los parámetros cinéticos de la levadura Candida utilis creciendo

en condiciones óptimas en un cultivo por lote.
Equipo
1. Autoclave (15 L de capacidad).
2. Incubadora rotatoria de temperatura controlada.
3. Fermentador con ambiente controlado (de 2 litros).
4. Electrodo de pH esterilizable.
5. Medidor controlador de pH.
6. Bombas peristáltica (0 a 2 L/h).
7. Placas de calentamiento y agitación.
8. Espectrofotómetro (rango: visible y UV).
9. Centrífuga clínica (0 a 5000 rpm).
10. Balanza analítica (0 a 200 g de capacidad.).
11. Estufa.
12.Equipo de filtración con vacío.

Microorganismo
Candida utilis
La cepa empleada se conserva en tubos con medio inclinado de PDA (papa-dextrosa-

agar) a una temperatura de 40C.
Medios de Cultivo
Cuadro 1. Medios de cultivo
COMPONENTE MEDIO PARA EL MEDIO PARA EL
INOCULO CULTIVO POR LOTE
(g/L) (g/L)
Glucosa 15.0 15.0
(NH4)2SO4 2.73 1.365
NaH2PO4 1.2637 1.2637
Extracto de levadura 0.990 0.990
* FeSO4 7H2O
* CuSO4 5H2O
* ZnSO4 H2O
* Na2MoO4 2H2O
* MnSO4 H2O
Emplear agua de la llave
(*) Todas las sales ya están disueltas en una solución concentrada, el volumen (en mL)
a emplear se calcula mediante la siguiente relación:
Vsales (mL) = 0.05 x conc. de glucosa (g/L) x volumen medio (L)
Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inóculo).

Métodos analíticos
Determinación de la concentración celular (x)
Procedimiento: A las membranas puestas previamente a peso constante y colocadas

sobre el dispositivo de filtración se les adiciona 5mL de suspensión celular y se filtra al
vacío. Se separa el filtrado, y el paquete celular se lava con 5mL de agua destilada y se
filtra nuevamente (este segundo filtrado no debe mezclarse con el primero). El paquete
celular lavado se coloca en una estufa a 600C durante 24 horas. La concentración
celular se estima por diferencia de pesos. (todas las pesadas deben hacerse en balanza
analítica).
Determinación de azúcares reductores por DNS
Reactivos:
1g de ácido 3,5- dinitrosalicílico se disuelve en 20ml de NaOH 2N, se agregan después

50ml de agua, y luego 30 g de tartrato de sodio y potasio. Todo se lleva a un volumen
de 100ml.
Procedimiento:
A 1mL del filtrado se le adiciona 1mL del reactivo DNS, se coloca en baño maría a
ebullición durante 5min. Posteriormente se deja enfriar y se adicionan 5mL de agua
destilada. Se leen los tubos a 540nm. Se emplean 2 controles de concentraciones de
0.4 y 0.8 g/L de glucosa, y con el blanco de reactivos se ajusta a cero el
espectofotómetro.
Curva tipo de glucosa.

Elaborar una curva tipo de glucosa con volúmenes de 0.1 a 1mL de solución patrón de
1.0 g/Lde glucosa.

Preparación del inóculo

Se preparan 180 mL de medio de cultivo para desarrollo del inóculo, los cuales se
reparten en dos matraces (de 500ml) con 90 mL de medio cada uno. Se esterilizan a 15
lb/in2 durante 15 min. Se enfría. Se inoculan con 5mL del mismo medio sobre la cepa en
tubo inclinado, en condiciones asépticas. Se dejan incubando en una agitadora (110
golpes/minuto) a una temperatura de 350C durante 18 horas.
Cultivo por lote
A) Se preparan 1620 mL de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el pH a

4.0. El medio se carga en el fermentador, previamente preparado, y se esteriliza en el
autoclave a 15 lb/in2, 15 min. También se esterilizan, conjuntamente, los recipientes que
contienen el antiespumante y el álcali.
B) El fermentador con el medio de cultivo se coloca en el sistema de agitación, venteo,

agua de enfriamiento, etc. y después se inocula con los dos matraces del inóculo, en
condiciones asépticas: El cultivo por lote operará bajo las siguientes condiciones:
velocidad de agitación : 500 rpm
aireación : 1 vvm
temperatura : 35 ºC
pH (con NH4OH 2N) : 3.8
antiespumante (PPG-10%): “de acuerdo a la formación de espuma”
C) Se tomarán muestras cada hora para la determinación de la concentración celular

por peso seco y turbidimetría, y azúcares residuales por el método del DNS. Las
determinaciones se harán por duplicado. El cultivo por lote durará aprox. 10 horas
durante las cuales el pH será controlado con NH4OH 2N.

D) Procesamiento de muestras.
Las muestras se tratarán bajo el esquema de la figura 1.
(10mL) MUESTRA
Determinación de conc. (5mL) (5mL) Filtración al vacío

celular por turbidez
Filtrado Paquete celular
Adicionar 5 mL de
agua destilada y filtrar
de nuevo
Determinación de la
Determinación de conc. celular por peso
glucosa residual seco
Figura 1. Procesamiento de las muestras.

INFORME
1. Presentar los resultados en el cuadro 2.

2. Presentar las curvas tipo de concentración celular y de glucosa.
3. Elaborar los siguientes gráficos:
a) Concentración celular (x) vs. Tiempo (identificar las fases del crecimiento).
b) Concentración residual de glucosa (s) vs. Tiempo
c) Logaritmo natural de la concentración celular vs. Tiempo (solo para la fase
exponencial)
4. Determinar los siguientes conceptos:
a) Velocidad específica de crecimiento (μ) a cada tiempo de cultivo.
b) Velocidad específica de consumo de sustrato (qs) a cada tiempo de cultivo.
c) Velocidad específica de crecimiento máxima (μmax).
d) Rendimiento celular con base al consumo de sustrato (Yxs) a cada tiempo de
cultivo.
e) Rendimiento celular global con base al consumo de sustrato (Yxs(global)).
f) Constante de afinidad por le sustrato (Ks).
g) Productividad celular global (Rx global).
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
El alumno discutirá los resultados obtenidos en la práctica.
RESUMEN
El alumno elaborará un resumen de la práctica.

BIBLIOGRAFÍA
1. Dunn, I.J., Mor, J.R. 1975. Variable-volumen continuous cultivation. Biotechnol.

Bioeng. 17: 1805-1822.
2. Pirt, S.J. 1975. Principles of microbial and cell cultivation. Black Well Scientific
Publications, London.
3. Whitaker, A. 1980. Fed-batch culture. Process Biochem. 15:10-15.
4. Yamané, T., Hirano, S. 1977. Semibatch culture of microorganism with constant feed
of substrate: A mathematical simulation. J. Ferment Technol. 55:156-165.

Cuadro 2. Resultados del cultivo por lote.
Concentración celular (por Concentración celular Glucosa residual

TIEMPO DE turbidimetría) (por peso seco)
HORA CULTIVO No. Dilución. Lectura g/L No. pms pmcs g/L tubo Lectura Dilución g/L
de de
(h) tubo tubo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
pms : peso membrana seca
pmcs: peso membrana más células Reunir todas las muestras y aplicar la
secas técnica de
Curva tipo de biomasa DNS, empleando 2 controles de 0.4 y
0.8 g/L de glucosa
pendiente (m) =
ordenada (b) = 0.4 g/L _________
0.8 g/L _________

Cultivo por lote
Actividades
1. Membranas a peso constante (20 membranas).
2. Curva tipo de glucosa.
3. Curva tipo de concentración celular
4. Preparación del medio de cultivo para el inóculo /esterilización /enfriamiento /

inoculación de los matraces con la cepa en tubo inclinado/ incubación durante 18
horas.
5. Preparación del medio de cultivo para el cultivo por lote / preparación del
fermentador / esterilización del fermentador con medio de cultivo y esterilización
del álcali y el antiespumante / enfriamiento / inoculación con los matraces a el
fermentador / arranque de la fermentación.
6. Toma de muestra cada hora del cultivo por lote/procesamiento de las muestras.
7. Descarga y lavado del fermentador.
84
PRÁCTICA 9
Práctica 9. Producción de biomasa en cultivo por lote alimentado
Cultivo por lote alimentado
INTRODUCCIÓN
Generalmente los sistemas fermentativos se clasifican en tres grupos: Sistemas

cerrados, Sistemas abiertos y Sistemas semicerrados. Al primer grupo pertenece el
cultivo por lote empleado tradicionalmente desde el siglo XIX, en el cual una vez
iniciada la fermentación ya no hay entrada ni salida de nutrientes.
Los cultivos continuos (simple etapa; con recirculación; y múltiple etapa; principalmente)
pertenecen al segundo grupo, en donde existe entrada (nutrientes) y salida de
materiales (nutrientes no consumidos, biomasa y metabolitos).
En los sistemas semicerrados sólo ocurre entrada de nutrientes, pero no salida de

materiales, por lo que también se les conoce como sistemas de volumen variable.
También a este tipo de sistemas se les denomina genéricamente como cultivos
Fedbatch (término introducido por Yoshida en 1973) porque operativamente inician con
85
un cultivo por lote, y al finalizar éste, se inicia la alimentación de nutrientes al

biorreactor. A su vez, por la forma de suministro de los nutrientes, pueden clasificarse
en cultivos con alimentación a flujo variable ó flujo constante. A este último pertenece el
cultivo objeto de esta práctica: cultivo por lote alimentado a flujo cte. (ó Fedbatch
Lineal).
Hasta antes de la década de los setentas, el cultivo Fedbatch Lineal venía

empleándose empíricamente, pero diseñado, en principio, para ser más productivo que
el cultivo por lote. Fue en 1975 cuando Pirt(2) reportó un tratamiento matemático de este
sistema, el cual consiste en el conjunto de ecuaciones diferenciales del sistema que
describen a las velocidades volumétricas de acumulación de materiales en el
biorreactor, es decir, la aplicación de la ecuación general de balance para biomasa,
sustrato y producto (Acumulación = Entrada - Salida + Generación).
Como toda resolución de sistemas de ecuaciones, la resolución del sistema de

ecuaciones diferenciales que describen este cultivo, nos dará las funciones (x, s, p) =
f(t), es decir, podremos conocer, a cualquier tiempo del cultivo, los valores de la
concentración de biomasa, sustrato residual y del metabolito de interés. Dado que todas
las variables son dependientes del tiempo, no existe solución analítica al sistema de
ecuaciones diferenciales, por lo que debe resolverse utilizando algún método numérico
(el más usual es el de Runge-Kutta de cuarto orden).
Sin embargo, pueden encontrarse dos soluciones particulares a este sistema bajo las
siguientes condiciones:
1. El suministro del sustrato limitante es mayor que lo demandado por el

microorganismo.
2. El suministro del sustrato limitante es menor que lo demandado por el

microorganismo.
86
En el primer caso puede existir acumulación y desacumulación de la concentración del

sustrato residual, durante el tiempo necesario para alcanzar el volumen final del
biorreactor, y dependiendo de los valores del flujo de alimentación y de la concentración
del sustrato limitante, pueden calcularse las concentraciones celular y de producto a
cualquier tiempo. Debido a este exceso en el suministro del sustrato limitante el
microorganismo crecerá a su máxima velocidad de crecimiento.
Para el segundo caso, como la demanda es mayor que el suministro, todo (o casi todo)
el sustrato limitante suministrado es completamente consumido por el microorganismo,
por lo que la concentración del sustrato residual durante el cultivo es muy baja. Bajo
esta condición el microorganismo ajusta su maquinaria metabólica al bajo suministro del
sustrato, ocasionando limitación en su crecimiento que se ve reflejado en una baja
velocidad de crecimiento.
También, el cálculo de la concentración celular y de producto podrán determinarse

resolviendo el sistema de ecuaciones bajo las condiciones de este segundo caso, y
cuyos resultados dependerán de los valores del flujo de alimentación y concentración
del sustrato limitante.
OBJETIVO
El alumno conocerá y realizará un cultivo por lote con alimentación constante

empleando Candida utilis, y comprobará que este sistema fermentativo es de mayor
productividad y rendimiento que el cultivo por lote.
87
Equipo
1. Autoclave (15 L de capacidad).
2. Incubadora rotatoria de temperatura controlada.
3. Fermentador con ambiente controlado (de 2 ó 6 litros).
5. Medidor controlador de pH.
6. Electrodo de oxígeno disuelto.
7. Medidor de oxígeno disuelto.
8. 2 Bombas peristáltica (0 a 2 L/h).
9. 2 Placas de calentamiento y agitación.
10. Espectrofotómetro (intervalo: visible y UV).
11.Centrífuga clínica (0 a 5000 rpm).
12. Balanza analítica (0 a 200 g de capacidad).
13. Estufa con vacío.
Microorganismo utilizado: Candida utilis.
La cepa empleada se conserva en tubos con medio inclinado de PDA (papa-dextrosa-

88
Medios de Cultivo

COMPONENTE MEDIO PARA EL MEDIO PARA EL MEDIO PARA LA
INOCULO CULTIVO POR LOTE ALIMENTACION
(g/L) (g/L) (g/L)
Glucosa 15.0 15.0 40.0
(NH4)2SO4 2.73 1.365 3.64
NaH2PO4 1.2637 1.2637 3.37
Extracto de levadura 0.990 0.990 2.64
* FeSO4 7H2O
* CuSO4 5H2O
* ZnSO4 H2O
* Na2MoO4 2H2O
* MnSO4 H2O
(*) Todas las sales ya están disueltas en una solución concentrada, el volumen (en mL)
a emplear se calcula mediante la siguiente relación:
Vsales (mL) = 0.05 x conc. de glucosa (g/L) x volumen medio (L)
Métodos Analíticos
Determinación de la concentración celular (x)
Procedimiento: A las membranas puestas previamente a peso constante y colocadas

sobre el dispositivo de filtración se les adiciona 5mL de suspensión celular y se filtra al
vacío. Se separa el filtrado, y el paquete celular se lava con 5mL de agua destilada y se
filtra nuevamente (este segundo filtrado no debe mezclarse con el primero). El paquete
celular lavado se coloca en una estufa a 600C durante 24 horas. La concentración
89
celular se estima por diferencia de pesos. (todas las pesadas deben hacerse en balanza
analítica).
Determinación de azúcares reductores
Reactivos:
1g de ácido 3,5- dinitrosalicílico se disuelve en 20mL de NaOH 2N, se agregan después

50mL de agua, y luego 30 g de tartrato de sodio y potasio. Todo se lleva a un volumen
de 100mL.
Procedimiento:
A 1mL del filtrado se le adiciona1mL del reactivo DNS, se coloca en baño maría a
ebullición durante 5min. Posteriormente se deja enfriar y se adicionan 5mL de agua
destilada. Se leen los tubos a 540nm. Se emplean 2 controles de concentraciones de
0.4 y 0.8 g/L de glucosa, y con el blanco de reactivos se ajusta a cero el
espectrofotómetro.
Curva tipo de glucosa.

Elaborar una curva tipo de glucosa con volúmenes de 0.1 a 1mL de solución patrón de
1.0 g/L de glucosa.
90
reparten en dos matraces (de 500mL) con 90 mL de medio cada uno. Se esterilizan a
15 lb/in2 durante 15 min. Se enfría. Se inoculan con 5ml del mismo medio sobre la cepa
en tubo inclinado, en condiciones asépticas. Se dejan incubando en una agitadora (110
golpes/minuto) a una temperatura de 350C durante 18 horas.
Cultivo por lote
A) Se preparan 810 mL de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el pH a

4.0. El medio se carga en el fermentador, previamente preparado, y se esteriliza en el
autoclave a 15 lb/in2, 15 min. También se esterilizan, conjuntamente, los recipientes que
contienen el antiespumante y el álcali.
B) El fermentador con el medio de cultivo se coloca en el sistema de agitación, venteo,

agua de enfriamiento, etc. y después se inocula con un matraz del inóculo, en
condiciones asépticas: El cultivo por lote operará bajo las siguientes condiciones:
velocidad de agitación : 500 rpm

aireación : 1 vvm
temperatura : 35 ºC
pH (con NH4OH 2N) : 3.8
antiespumante (PPG-10%): “de acuerdo a la formación de espuma”
91
Se tomarán muestras sólo al inicio y al final del cultivo por lote el cual durará 12 horas.
A las muestras se les determinará concentración celular por peso seco (y turbiedad) y
glucosa residual por el método del DNS.
Cultivo por lote alimentado constantemente (Feed-batch Lineal)
A) Se preparan 900 mL de medio de cultivo para el cultivo Fed Batch Lineal y se ajusta
el pH a 4.0. El medio se prepara en un matraz de 2 litros, y se esteriliza junto con la
manguera de adición y el "medidor" de flujo (pipeta), a 15 lb/in2 durante 15 min.
B) Se calibra la bomba peristáltica, previamente al paso anterior, a un flujo de 180 mL/h,

que será el flujo de adición para el cultivo alimentado.
C) Una hora antes de finalizar el cultivo por lote se conecta la manguera del matraz que
contiene el medio estéril a la bomba peristáltica y a la entrada del fermentador en
condiciones asépticas. Al finalizar el cultivo por lote se inicia la alimentación del medio
de cultivo. Esta adición terminará cuando se agoten los 900 mL de medio de cultivo.
Este cultivo operará bajos las mismas condiciones de operación del cultivo por lote:
velocidad de agitación, aireación, T, pH, etc.
Se tomarán muestras cada hora, las cuales serán procesadas de acuerdo a la siguiente
figura.
92
(10mL) MUESTRA
Determinación de conc. (5mL) (5mL) Filtración al vacío

celular por turbidez
Filtrado Paquete celular
Adicionar 5 mL de
agua destilada y filtrar
de nuevo
Determinación de la
Determinación de conc. celular por peso
glucosa residual seco
Fig. 1. Procesamiento de las muestras.
93
INFORME
1. Determinar μmax, Yx/s (global) y Rx (global) de Candida utilis en el cultivo por

lote.
2. Para el cultivo alimentado elaborar las siguientes gráficas (teóricas y

experimentales):
a) Concentración celular (x) vs. tiempo

b) Volumen de medio de cultivo alimentado (V) vs. tiempo
c) Biomasa total (X) vs. tiempo ; donde X = xV
d) Glucosa residual (s) vs. tiempo
e) Velocidad específica de crecimiento (μ) vs. tiempo
3. Estimar los valores de la productividad celular global (Rx global) y el rendimiento

celular global con base al consumo de sustrato (Yx/s global) en el cultivo por lote
alimentado constantemente.
El alumno discutirá los resultados obtenidos en la práctica.
RESUMEN
El alumno elaborará un resumen de la práctica.
94
BIBLIOGRAFÍA
1. Dunn, I. J., Mor, J.R. 1975. Variable-volumen continuous cultivation. Biotechnol.

Bioeng. 17: 1805-1822.
2. Pirt, S.J. 1975. Principles of microbial and cell cultivation. Black Well Scientific
Publications, London.
3. Whitaker, A. 1980. Fed-batch culture. Process Biochem. 15:10-15.
4. Yamané, T., Hirano, S. 1977. Semibatch culture of microorganism with constant feed
of substrate: A mathematical simulation. J. Ferment Technol. 55:156-165.
95
Cuadro 2. Resultados del cultivo por lote alimentado constantemente.
Concentración celular Concentración celular Glucosa residual Metabolito de

TIEMPO (por turbidez) (por peso seco) interés
DE
HORA CULTIVO No. dilu- lec g/L No. pms pmcs g/L tubo lec- dilu- g/L
de ción. tu- de tura ción
(h) tubo ra tubo
Cultivo por lote alimentado constantemente

Flujo = 180 mL / hora
Condiciones de
Fermentación:
Agitación: 500 rpm
Aireación: 1 vvm
Temperatura: 35 ºC
pH : 3.8
Vop = __________
pms : peso membrana seca Reunir todas las

pmcs: peso membrana más muestras y aplicar la
células secas técnica de
Curva tipo de biomasa DNS, empleando 2
controles de 0.4 y 0.8 g/l
pendiente (m) = de glucosa
ordenada (b) = 0.4 g/L _________
0.8 g/L _________
96
Fed Batch Lineal
Actividades:

inoculación de los matraces con la cepa en tubo inclinado.
fermentador / esterilización del fermentador con medio de cultivo / enfriamiento /
inoculación con los matraces a el fermentador / desarrollo del cultivo por lote /
muestreo: inicio y al final.
4. Preparación del medio de cultivo para la alimentación / esterilización en matraz
junto con las tuberías y medidor (pipeta) de flujo / enfriamiento / alimentación
constante (a un flujo previamente determinado) del medio al fermentador.
5. Toma de muestras (cada hora) del cultivo alimentado / determinación de
absorbancia / determinación de peso seco / determinación de glucosa residual.
6. Calibración, previa, de la bomba peristáltica para el flujo determinado
(preparación de las mangueras, conexiones, pinzas, pipeta graduada, etc.)
97
PRÁCTICA 10
Práctica 10. Producción de biomasa en cultivo continuo
Cultivo continuo
INTRODUCCIÓN
El cultivo continuo simple etapa pertenece al grupo denominado Sistemas

Fermentativos Abiertos. En este sistema hay una entrada y salida de materiales:
suministro continuo de nutrientes, y salida continua de biomasa, sustrato residual y
producto. Operativamente el flujo de entrada es igual al flujo de salida por lo que el
volumen de operación del biorreactor permanece constante durante todo el cultivo.
Fue en la década de los sesentas cuando se iniciaron los primeros estudios

experimentales y teóricos acerca del cultivo continuo. En estos estudios se propuso la
Teoría del Quimiostato, la cual a grandes rasgos, establece que al trabajar un volumen
constante en cultivo continuo, y después de un determinado tiempo (el necesario para
realizar dos o tres recambios del volumen de trabajo), éste alcanza un estado de
equilibrio dinámico donde las concentraciones de biomasa, sustrato residual y producto
98
permanecerán constantes en el tiempo. Esta teoría también predice que cuando se

cambien los flujos de alimentación y remoción de caldo (los cuales a su vez deben ser
iguales entre sí para mantener la condición de volumen constante) el sistema se
alterará y finalmente alcanzará un nuevo equilibrio dinámico donde las concentraciones
de biomasa, sustrato residual y producto ya no variarán en el tiempo pero sus valores
serán más o menos los mismos independientemente de los flujos. Sin embargo,
también predice que cuando los flujos de trabajo son más elevados que el valor de la
velocidad específica máxima de crecimiento, el sistema se quedará sin células,
condición conocida como lavado del fermentador, debido a que se ha rebasado la
capacidad del microorganismo para metabolizar los nutrientes que le son suministrados
a altas velocidades.
En un quimiostato (biorreactor de laboratorio operando en continuo) una vez que se ha

alcanzado el estado de equilibrio, se crean ambientes constantes que permiten
mantener indefinidamente un determinado estado fisiológico del microorganismo. Y en
este estado la velocidad específica de crecimiento es constante y por ende lo son
también el resto de las velocidades específicas de consumo de sustrato, de producción
del metabolito, de consumo de oxígeno, y de generación de calor.
Así, uno de los principales usos del quimiostato es el de la caracterización cinética de la

producción de metabolitos empleando un determinado microorganismo, en un
determinado medio de cultivo y en determinadas condiciones de cultivo.
Con todo lo anterior, en un cultivo continuo puede controlarse y mantenerse aquella

velocidad específica de crecimiento donde el microorganismo produzca la mayor
cantidad de aquel metabolito que se desea obtener, siendo ésta la principal
característica por la que fueron diseñados los sistemas de fermentación continuos.
99
OBJETIVO
El alumno determinará los parámetros cinéticos de Candida utilis creciendo en

condiciones óptimas en un cultivo continuo.
Equipo
1. Autoclave (15 litros de capacidad).

2. Baño metabólico de Temperatura controlada.
3. Fermentador con panel de control (2 ó 6 litros).
5. Electrodo de oxígeno disuelto.
6. 3 Bombas peristálticas (0 a 2 L/h).
7. 2 Placas de calentamiento y agitación.
8. Espectrofotómetro (intervalo: 200 a 700 nm).
9. Centrífuga clínica (0 a 5000 rpm).
10.Balanza analítica (0 a 200 g de capac.).
11. Estufa con vacío.
Microorganismo utilizado: Candida utilis.
La cepa empleada se conserva en tubos en medio inclinado de PDA (papa-dextrosa-

100
Preparación de medios de cultivo

MEDIO PARA MEDIO PARA MEDIO PARA
COMPONENTE EL INOCULO EL CULTIVO EL CULTIVO
POR LOTE (g/L) CONTINUO
(g/L) (g/L)
Glucosa 15.0 15.0 20.0
(NH4)2SO4 2.73 2.73 1.82
NaH2PO4 1.2637 1.2637 1.685
Extracto de levadura 0.990 0.990 1.32
* FeSO4 7H2O
* CuSO4 5H2O
* ZnSO4 H2O
* Na2MoO4 2H2O
* MnSO4 H2O
(*) Todas las sales están disueltas en una solución concentrada, el volumen (en mL) a
emplear se calcula mediante la siguiente relación:
Vsales (mL) = 0.05 [ conc. de glucosa (g/L) ] [ volumen medio (L) ]
Métodos Analíticos
Determinación de la concentración celular

Procedimiento: el mismo de la práctica 8.
Determinación de azúcares reductores (DNS)

Reactivos: los mismos de la práctica 8.
Procedimiento: el mismo de la práctica 8.
Curva tipo de glucosa: la misma de la práctica 8.
101

reparten en dos matraces (de 500ml) con 100 mL de medio cada uno. Se esterilizan a
15 lb/in2 durante 15 min. Se enfría. Se inoculan con 5mL del mismo medio sobre la cepa
en tubo de medio inclinado en condiciones asépticas. Se dejan incubando en una
agitadora (110 golpes/minuto) a 350C durante 18 horas.
Cultivo por lote

A) Se preparan 900mL de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el pH a
4.0. El medio preparado se pasa al fermentador (previamente preparado este último) y
se esteriliza en el autoclave a 15 lb/in2, 15 min. También se esterilizan los recipientes
que contienen el álcali y el antiespumante.
B) El fermentador cargado con el medio estéril, se coloca en el sistema de agitación,

venteo, agua de enfriamiento, etc. y después se inocula con un matraz del inóculo, en
condiciones asépticas: El cultivo por lote operará bajo las condiciones descritas en el
cuadro 2.
Cuadro 2. Condiciones de cultivo

PARAMETROS CONDICIONES
Velocidad de agitación 500 rpm
Aireación 1 vvm
Temperatura 35 ºC
pH (con NH4OH 2N) 3.8
Antiespumante Polipropilenglicol al 10%
102
Se tomarán muestras al inicio y al final del cultivo por lote y éste durará 12 horas. A las
muestras se les debe determinar concentración celular por peso seco (por filtración) y
sustrato residual por el método del DNS.
Cultivo continuo
A) Se preparan 3.0 litros de medio de cultivo para el cultivo continuo y se ajusta el pH a

3.8. El medio se prepara en un recipiente que lo contenga totalmente, y se esteriliza
junto con mangueras y conexiones a 15 lb/in2 durante 15 min. Esta misma cantidad de
medio de cultivo se prepara y esteriliza para cada velocidad de dilución.
B) Previamente al paso anterior se calibra la bomba peristáltica, que adicionará el

medio de cultivo, a un flujo de 0.1 L/h para la 1ª velocidad de dilución.
Para las restantes velocidades de dilución (D) la bomba se calibrará a los siguientes
flujos:
D (h-1) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

F (L/h) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
C) Media hora antes de finalizar el cultivo por lote se conecta la manguera del recipiente
que contiene el medio estéril a la bomba y al puerto de suministro del fermentador, en
condiciones asépticas.
Al terminar el cultivo por lote se inicia el suministro continuo del medio de cultivo al
fermentador. El fluido de salida se recibe en otro recipiente el cual es marcado con la
hora a la cual se inició el suministro de medio (el fluido de salida sale a través del tubo
capilar colocado previamente en el fermentador).
103
El cultivo continuo operará en todas las velocidades de dilución bajo las mismas
condiciones de agitación (500 rpm), aireación (1 vvm), temperatura (35 ºC), pH (3.8) y
control de la espuma.
D) Se recomienda que cinco minutos antes de terminar la adición de todo el medio de

cultivo para la 1ª velocidad de dilución, se tome muestra para la determinación de
concentración celular y glucosa residual.
Esto mismo se repite para cada una de las velocidades de dilución restantes. También
se deben tomar 2 mL del medio alimentado para determinar la concentración de
glucosa.
E) Al finalizar la adición de todo el medio del cultivo para la 1ª velocidad de dilución, se

inicia inmediatamente la adición del siguiente medio de cultivo (preparado y esterilizado
previamente) para la segunda velocidad de dilución y al segundo flujo de adición. Esto
mismo se repite para las velocidades de dilución restantes.
F) En cada velocidad de dilución tomar una pequeña muestra para observarla al

microscopio y detectar cualquier contaminación. Si esto ocurre, detener la fermentación
y repetir la velocidad de dilución que se estaba trabajando.
104
INFORME
1. Determinar Yx/s (global) y Rx (global) de Candida utilis en el cultivo por lote.
2. Para el cultivo continuo elaborar lo siguiente:

a) Tabular los valores de concentración celular (x), glucosa residual (s),
rendimiento celular en base al consumo de sustrato (Yx/s), velocidad específica
de consumo de sustrato (qs ) y la productividad celular (Rx ) en función de la
velocidad de dilución (D).
b) Gráfica de la concentración celular (x) v.s. velocidad de dilución (D).
c) Gráfica de la concentración de glucosa residual (s) v.s. velocidad de dilución
(D).
d) Gráfica de la productividad celular (Rx ) v.s. velocidad de dilución (D).
e) Gráfica de la velocidad específica de consumo de sustrato (qs ) v.s. velocidad
de dilución (D).
e.1) Obtención de los valores de (m) y (Yg).
f) Gráfica de la velocidad específica de consumo de oxígeno (qo2 ) v.s. velocidad
de dilución (D).
f.1) Determinación de (mos) y (Yog).
si ΔHglucosa = 3.74 kcal/g ; ΔHcelulas = 5.61 kcal/g
g) Gráfica de la velocidad específica de genración de calor (qk) v.s. velocidad de
dilución (D).
g.1) Determinación de (mk) y (Ykg).
El alumno discutirá los resultados obtenidos en la presente práctica.
RESUMEN
El alumno elaborará un resumen de la presente práctica.
105
BIBLIOGRAFÍA
1. Wang, D.I.C., Cooney, C.L., Demain, A.L., Dunill, P., Humphrey, A.E., Lilly, M.D.
2. Tempert, D.W. 1970. The continuous cultivation of micro-organisms. I. Theory of the
Chemostat. Methods in Microbiology. Vol. 2. Academic. Press.
3. Herbert, A., Elsworth, F., Telling, H. 1956. The continuous culture of bacteria; a
theoretical and experimental study. Journal of Microbiology 14, 601-622.
106
CONCENTRACION CONCENTRACION GLUCOSA

TIEMPO CELULAR CELULAR RESIDUAL METABOLITO DE
DE (por turbidez) (por peso seco) INTERES
HORA CULTIVO No. dilu- lec g/L No. pms pmcs g/L No. dilu- lectu g/L
de ción tu de de ción ra
(h) tubo ra Mta tubo
Cultivo continuo de una etapa
HORA Vr D F SF [x] [s]

to tf (L) (h-1) (L/h) g/L Condiciones de
0.1 Fermentación:
0.2 Agitación: 500 rpm
0.3 Aireación: 1 vvm
0.4 Temperatura: 35 ºC
0.5 pH : 3.8
M : membrana Reunir todas las muestras
pms : peso membrana seca y aplicar la
pmcs: peso membrana mas
células secas.
técnica de DNS,
empleando 2 testigos de
0.4 y 0.8 g/L de glucosa
0.4 g/L _________
0.8 g/L _________
107
Cultivo continuo
Actividades:

inoculación de los matraces con la cepa en tubo inclinado.
fermentador / esterilización del fermentador con medio de cultivo /
enfriamiento / inoculación con los matraces a el fermentador / desarrollo del
cultivo por lote / muestreo: inicio y al final.
4. Preparación del medio de cultivo para cada VELOCIDAD DE DILUCIÓN /
esterilización en matraz junto con las tuberías y medidor (pipeta) de flujo /
enfriamiento / alimentación (a un flujo previamente determinado) del medio al
fermentador.
5. Toma de muestras, 10 minutos antes de terminar la correspondiente
VELOCIDAD DE DILUCIÓN/ determinación de absorbancia / determinación de
peso seco / determinación de glucosa residual.
6. Calibración, previa, de la bomba peristáltica para el flujo determinado para
cada VELOCIDAD DE DILUCIÓN (preparación de las mangueras,
conexiones, pinzas, pipeta graduada, etc.).
108

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

M. EN C. DYNORA VÁZQUEZ GURROLA

La Biotecnología, concebida como la aplicación del conocimiento para la obtención de

Este manual de prácticas del Laboratorio de Biorreactores se centra en el desarrollo de

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 2

operación de biorreactores. En la práctica 3 se revisarán los servicios auxiliares que son

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 3

Práctica 1. Presentación de biorreactores diversos ......................................................... 5

Práctica 2. Instrumentación para el seguimiento y control de la biorreacción ............... 10

Práctica 3. Servicios auxiliares ...................................................................................... 26

Práctica 4. Tiempo de mezclado en biorreactores......................................................... 38

Práctica 5. Transferencia de oxígeno en biorreactores agitados y neumáticos ............. 48

Práctica 6. Mantenimiento de asepsia en biorreactores ................................................ 57

Práctica 7. Esterilización del sistema de biorreacción ................................................... 64

Práctica 8. Producción de biomasa en cultivo por lote .................................................. 75

Práctica 9. Producción de biomasa en cultivo por lote alimentado ................................ 85

Práctica 10. Producción de biomasa en cultivo continuo ............................................... 98

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 4

Práctica 1. Presentación de biorreactores diversos

El biorreactor puede considerarse como el corazón de todo proceso biotecnológico, ya

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 5

funcionamiento es de vital importancia en la rentabilidad del bioproceso, sobre todo en

Los biorreactores pueden clasificarse de la siguiente forma:

A continuación se describe cada tipo de biorreactor.

Este tipo de biorreactor es muy empleado, en todas las escalas de producción, en

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 6

altas velocidades de transferencia de masa y de calor. Consisten de un cuerpo cilíndrico

A pesar de su versatilidad, sus costos de construcción, operación y mantenimiento son

Este tipo de biorreactores carece de sistema de transmisión mecánica para mezclar el

Al carecer de partes “móviles” tanto la construcción, operación y mantenimiento de este

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 7

La denominación de esto tipo de reactores se debe al patrón de circulación definido del

Para la sesión de introducción de esta práctica el alumno deberá haber consultado en

Se mostrarán a los alumnos los diversos tipos de biorreactores de nivel laboratorio y

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 8

También se propone visitar la planta de tratamiento “Aguas de San Juan Ixhuatepec, S.

El alumno realizará un informe detallado de los biorreactores presentados en el que

Tipo de biorreactor. Capacidad. Características geométricas (incluyendo esquema del

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 9

Práctica 2. Instrumentación para el seguimiento y control de la biorreacción

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 10

Los actuadores eléctricos son usados pera manejar aparatos electrónicos o

Debido a la naturaleza de la biorreacción, se requiere que la gran mayoría de los

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 11

medir ciertas propiedades químicas como pH, concentración de oxígeno disuelto y

Para conocer el estado de una variable de operación o de un parámetro específico con

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 12

pH = - log10 [H+] (1)

Un electrodo de pH consiste de dos celdas: un elemento sensor del pH y un elemento

El método se fundamenta en la existencia de una diferencia de potencial entre las dos

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 13

Figura 1. Esquema de un electrodo de pH

Debido a que el electrodo de vidrio y los electrodos de referencia comerciales tienen un

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 14

En la figura 2 se puede observar la disposición de un sistema de medición y control del

Figura 2. Diagrama de bloques de un sistema de control

Medición y control de temperatura

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 15

La resistencia es medida con un dispositivo y convertida por un transductor a valores de

La acción puede consistir en hacer pasar agua de enfriamiento o vapor, a través de un

R0 = resistencia a 0°C [=] Ω

Vázquez Gurrola, Orozco Álvarez, Ordaz Contreras, García Salas 16

Medición y control del oxígeno disuelto