Introducción a la RMN 2D

Metodologías para la determinación estructural

de fármacos y el estudio de fenómenos de
reconocimiento molecular

Programa de doctorado en Química Médica

Hasta ahora hemos visto muchos pulsos pero una sola dimensión
aunque vimos como una secuencia de pulsos múltiple nos da distintos
espectros en función de los periodos tD que usemos entre pulsos

RMN bidimensional. Conceptos básicos Correlación Un experimento 2D básico seria repetir una secuencia de
pulsos 1D con una variación sistemática del periodo de tiempo
Homonuclear. COSY, TOCSY variable t1, y luego representarlo (stacked plot). Durante el tiempo de
evolución no se observa nada luego pueden evolucionar coherencias no
observables (Multi cuanto) que durante el tiempo de mezcla se conviertan en
Javier Pérez Castells observables.
USP-CEU 1 USP-CEU 2

Introducción a la RMN 2D Introducción a la RMN 2D

El segundo pulso π / 2 actúa solo sobre la
Se va a recoger una matriz de datos en la que las filas son cada uno de componente de la magnetización que este
los espectros individuales a cada incremento de t1 y las columnas son en el eje y del plano <xy>.
el comportamiento a cada uno de esos incrementos de una frecuencia • La componente en el eje x no es afectada,
pero su amplitud
determinada. va a depender de la frecuencia del pico.

Esto es el esqueleto de lo que va a ser la secuencia de pulsos COSY.

Lo analizamos para un singlete fuera de resonancia (ωo), y para t1’s diferentes.

Empezando tras el primer pulso π / 2:

USP-CEU 3 USP-CEU 4
 Introducción a la RMN 2D
Tenemos datos en frecuencia en un eje (f2,
que viene del tiempo t2), y datos en función
del tiempo en el otro (t1).
• Como la variación de intensidad en t1 es
también periódica, podemos hacer una
seudo-FID mirando a los puntos para cada
frecuencia de los picos en f2.
• Una cosa que no estamos considerando
durante todos estos pulsos, esperas, pulsos,
etc., es que la señal también va a estar
afectada por relajación T1 y T2.
Ahora tenemos FIDs en t1, y podemos hacer una segunda transformada de Fourier en el dominio de t1
(la primera fue el dominio de t2), y obtenemos un espectro bi-dimensional:
• Tenemos ‘picos de cruce’ donde las dos lineas se interceptan en el mapa 2D, en este caso en la diagonal.
USP-CEU
COSY
COSY significa COrrelation SpectroscopY, en este caso, espectroscopia de correlacion homonuclear.
• En la introducción anterior consideramos un espin aislado sin acoplamientos. Obviamente, esto no es
muy útil.
• El COSY es útil para averiguar que espin esta acoplado con otros espines. Los picos fuera de la
diagonal indican esto, o sea, que los dos picos en la diagonal estan acoplados.
• Con esta idea básica vamos a tratar de ver el efecto de la secuencia de pulsos COSY 90y - t1- 90y - t2
en un par de espines acoplados.
USP-CEU
Introducción a la RMN 2D
Matriz de datos raw
Funcion de ventana a t2 FIDs
Trasformada de Fourier respecto a t2
Se forman los interferogramas
Funcion de ventana a los interferogramas
Llenado de ceros
FT de la dimensión t1
Espectro 2D
Faseado f2 luego f1
Procesado ulterior sym, etc
5 USP-CEU 6
COSY
•Si miramos al núcleo I y aplicamos los dos pulsos π / 2 (un seudo-pulso π), invertimos parte de
la población de S, y esto tiene un efecto en I (transferencia de polarización).
• Como la transferencia de polarización de I a S o de S a I es lo mismo, lo explicamos de I a S y
asumimos que nos da lo mismo de S a I. Perturbamos I y vemos lo que pasa con S.
• Después del primer π / 2, tenemos dos vectores de I en el eje x, uno moviéndose a ωI + J / 2 y
el otro a ωI - J / 2. El segundo pulso va a mezclar: parte de la magnetización de I se queda en I y
parte pasa a S lo cual al final de las FT dará dos señales una en la diagonal otra, el pico de cruce.
• El pico de cruce es una magnetización que ha precesionado a ωI durante t1 y a ωS durante t2,
por eso sale fuera de la diagonal. Puesto que a S le pasa lo mismo que a I salen picos simétricos
respecto a la diagonal. (el COSY es simétrico)
• La variación en la inversión de población de I
depende del coseno de su frecuencia. Considerando
que estamos en resonancia con una de las líneas y
que t1 = 1/ 4 J. Cada vector transfiere magnetización
durante el segundo pulso a las otras 3 transiciones del
7 sistema generando la estructura fina del espectro. USP-CEU 8
 COSY
Para el caso general llegaríamos a esta relación
para el cambio de la intensidad de la señal de S
(depues del pulso π / 2) en función de la
frecuencia del espin I y de JIS
Dos problemas:
Multipletes con diferente fase en los picos de
Correlación del sistema A2X3 del cruce y en fase en la diagonal.
etilbenceno en antifase Si se ajusta la fase de los de cruce los de la
diagonal se ven dispersivos.
Solución: ciclado de fases o presentación en
magnitud
Esta es la ‘huella’ tipica de un doblete en un
COSY Sensible a la fase (phase-sensitive
COSY). Los senos hacen que las señales sean
dispersivas en f1 y f2 y también en la
diagonal
USP-CEU
COSY
El COSY (o experimento de Jenner) fue uno de los primeros 2D (1971), y es una de las
secuencias de pulso 2D mas útiles para elucidación estructural. Tiene miles
de variaciones y mejoras (DQF-COSY, E-COSY, etc.).
Problemas adicionales:
Picos axiales (se eliminan con el ciclado TPPI, Time proportional phase incrementation)
Artefactos (se eliminan con la simetrización)
COSY largo
USP-CEU
Para evitar los antifases y sobretodo las señales dispersivas en la diagonal cuyas colas
pueden ocultar señales próximas se pueden procesar los COSYs en magnitude
calculation, lo cual implica una combinación matemática de partes real e imaginaria que
sale con peor resolucion peo que se mejora con una fuerte función de ventana (sinebell
cuadrática). Aun así, la función disminuye la intensidad de algunos picos por lo que se
llega a un compromiso y queda menos resuelto. Se usa solo para rutina.
M = (real2 + imaginaria2)1/2
9 USP-CEU 10
gCOSY
Puesto que muchas presentaciones sensibles a la fase
requieren un ciclado de fases pueden necesitar mucho
tiempo de adquisición. El tiempo de adquisición se limita
mucho con el gCOSY (COSY con gradientes), que
destruye la magnetización z no deseada y por tanto sus
correspondientes señales. Se pueden lograr así espectros
de alta calidad en tan solo 5 min.
La bobina de gradientes desfasa las coherencias a lo
largo del eje z con un pulso que no es cuadrado y luego
de un período en el que sucede otra cosa, generalmente
un pulso, las refasea con otro pulso igual.
Por ejemplo: en el COSY tras el 2º pulso en el cual se
hacen detectables magnetizaciones que estaban en el eje
z el segundo pulso de gradientes las desfasa y las hace
indetectables.
Sustituye así al tedioso ciclado de fases y permite
aumentar mucho la ganancia del receptor reduciendo el
num de scans
Los gradientes permiten:
•Seleccionar caminos de coherencia
•Suprimir señales de disolvente
•Eliminar magnetización no deseada procedente de ruido
11 USP-CEU 12
o de inhomogeneidad.
 DQF-COSY DQF-COSY
Se basa en añadir un tercer
pulso al final que convierte
en detectables las
coherencias de doble
cuanto que se generan tras
el segundo pulso. Los
gradientes o un ciclado de
fases adecuado hacen
indetectables las
coherencias de un cuanto
que había antes del 3er
pulso

Recordemos que los multipletes se ven en antifase en el COSY y en la diagonal

dispersivos. Esa dispersión se evita con el filtrado
Como solo se ven las coherencias de doble cuanto desaparecen los singletes que son
los que mas ruido aportan y más colas y eso puede incluir al disolvente

USP-CEU 13 USP-CEU 14

DQF-COSY 2
3
4
5
6
1
Zona aromáticas de un 2D COSY del
12,14-ditbutilbenzo[g]criseno
13

9
8
7

TOCSY
11 10

• Aunque alargando el tiempo de mezcla en el COSY(delayed y relayed COSY) o

simplemente disminuyendo el plano de corte se pueden ver acoplamientos a 4 y 5
enlaces se pierde la señal y es bueno disponer de un método de ver todas las
correlaciones escalares de un sistema de espines.
• Es el Total correlation spectroscopy (TOCSY) experiment. Es muy útil en análisis de
moleculas con sistemas de spin independientes.
• Se basa en una secuencia de bloqueo de spin (en el plano transversal) que se logra con
un tren de pulsos (MLEV-17 etc) que coloca al sistema en condiciones de mezcla
isotrópica (todos los spines experimentan el mismo campo efectivo).
• Entonces se cumple la condición de Hartmann-Hahn y la magnetización se trasfiere
entre núcleos acoplados.
• En definitiva, pueden aparecer señales de cruce entre todos los spines del sistema y
además salen en fase, con lo que es muy ventajoso respecto al COSY.
• La aparición y la intensidad de las señales depende del tiempo de mezcla que escojamos.

USP-CEU 15 USP-CEU 16
 TOCSY
Trabajo a campos bajos - Spin-locking TOCSY
• Una primera idea sobre el TOCSY es que es como hacer el mezclado a un campo mas ‘bajo.’
• La tecnica que usamos para lograr esto se llama spinlocking. La idea es sacar la magnetización •BSL es un campo magnético variable aplicado aprox a la resonancia de los espines de
fuera de los efectos de Bo ‘enganchandolo los espines’ a un campo magnetico distinto. O sea, los nuestra muestra. Es estático en el sistema rotatorio y por eso estos experimentos se
hacemos precesionar alrededor de un campo B que no esta alineado con el eje z. conocen como experimentos de sistema rotatorio.
• Para tener spin-lock de la magnetizacion lo primero es sacarla del eje z (lejos de Bo). Por tanto • Habría distintas formas de generar el BSL. Una es basicamente usar un campo de BC
primero hacemos un pulso π / 2. que actuaria todo el tiempo de mezcla, pero eso implica un ancho espectral muy bajo y
• Una vez que M está en el plano <xy>, hay que mantenerla alli haciéndola precesionar alrededor entonces solo los espines con ωo similar a ωSL van a estar bien ‘enganchados.’
de un nuevo campo magnético alineado con el eje x o y.
Podemos usar pulsos de RF cortos y obtener los mismos resultados. Los llamamos pulsos
• Esto lo hacemos con un campo de banda continua (BC) o con un campo generado por pulsos
compuestos, ya que son una colección de pulsos cortos (µs) esparcidos por todo el periodo de
compuestos (‘tren’ de pulsos) que tiene el mismo efecto que la irradiacion de BC: Cuando
mezcla (o todo el periodo del spin-lock) y tienen el mismo efecto que irradiación de BC.
logramos esta condición (llamada la condición de Hartmann-Hahn), las frecuencias de todas las
• El mas comun es llamado MLEV, o ciclo de desacoplamiento de Malcom LEVitt. Una
transiciones del sistema son proporcionales a BSL (al TOCSY se le llamaba HOHAHA
variación es llamada DIPSI (Decoupling In the Presence of Scalar Interactions).
(HOmonuclear HArtmann-HAhn experiment)
• Un PC es basicmente un monton de pulsos juntos que usamos repetidas veces. PC’s tipicos
son R = (π/2)x(π)y(π/2)x o R = (π/2)x(3π/2)y(π/2)x.
•Lo que hacen, basicamente, es mantener a la magnetización en el plano <xy>. Si ponemos
muchos en sucesión podemos mantener el spin-lock por el tiempo que queramos.
Normalmente las fases de los distintos PC’s del spin-lock se alternan (R):

USP-CEU 17 USP-CEU 18

TOCSY TOCSY
• Durante tm tenemos mezclado de todos los espines que pertenezcan al mismo sistema en la
• En un sistema bajo spin lock el efecto del desplazamiento químico desaparece, es como si molecula, osea que surgen cross-peaks de un espin a todos los demas. En t2 (f2) tambien
todos los espines tuvieran el mismo offset. detectamos δ y J, osea que el 2D es simetrico.
• Sin embargo los acoplamientos siguen funcionando, es decir se trasfiere magnetización
entre los espines del mismo sistema.

•En suma logramos que la magnetización no decaiga y damos tiempo a trasferir coherencia.
Un espin se correlaciona con todos los demás del sistema:
CT-COSY TOCSY

3 6 6
4 4
•La mayor transferencia entre dos espines con un acoplamiento de J Hz es óptima cuando el 5 5
periodo del spin-lock, tm, es 1 / 2J.
• El TOCSY-1D necesita un pulso π / 2 selectivo para afectar solo al espin que queremos
‘enganchar’ 2 2
Los dos pulsos antes y despues del mezclado son llamados pulsos de recorte (trimming 1 3
pulses), y son necesarion para que el spin-lock funcione cuando usamos PC’s con pulsos 1
duros como el MLEV o el DISPI…
USP-CEU 19 USP-CEU 20
 TOCSY TOCSY
TIEMPO DE MEZCLA,
POTENCIA
Picos TOCSY
HN-Hβ βs

Picos COSY
HN-Hα α

USP-CEU 21 USP-CEU 22

TOCSY INADEQUATE
2D 13C-13C INADEQUATE (Incredible Natural
Abundance DoublE QUAntum Transfer Experiment)
sería una especie de COSY de 13C utilísimo en teoría.
Pero la probabilidad de que dos 13C queden juntos es
solo del 0.01%. Por eso es poco utilizado a no ser que
Gramicidina-S se disponga de muestras enriquecidas a un 10% en 13C y
por ello la abundancia natural de los pares contiguos de
13C sea similar a la de un espectro normal de 13C y se
pueden usar concentraciones normales porque si no,
hacen falta entre 100 y 500 mg de muestra. Un 2D
INADEQUATE no tiene el mismo aspecto que un
COSY porque el eje f2 es el espectro de carbono normal
y el eje f1 es la frecuencia del doble cuanto es decir la
suma de las frecuencias que correlacionan. No hay
diagonal y cuando las señales que correlacionan están
próximas se pierde sensibilidad debido a que los
acoplamientos no son de primer orden. Aparecen a
ambos lados de una seudo-diagonal de pendiente 2.

USP-CEU 23 USP-CEU 24
INADEQUATE INADEQUATE

CH3

OH

H3C CH3

INADEQUATE
Simetrizado

CH3

Mentol

OH
USP-CEU 25 USP-CEU 26
H3C CH3