Por el contrario, los cofactores reclutados N-terminalmente ajustan los valores de β-catenina

Salida transcripcional para garantizar la autorrenovación adecuada y el comportamiento

proliferativo de los IESC.
El deterioro de las interacciones N-terminales desencadena una hiperproliferación transitoria
de IESC, incluso
resultando en el agotamiento de la reserva de células madre autorrenovables. Diferenciación
errónea del IESC,
acompañada de una respuesta de proteínas desarrollada al estrés y una infiltración inmune,
resulta en una
cesar que se asemeja a una aberrante "villización" de las criptas intestinales. Nuestros datos
sugieren que específicos de IESC
Las células madre epiteliales testinales (IESC) alimentan el perpetuo
reposición de la monocapa epitelial que recubre el intestino. Se dividen en promedio una vez
al día para dar lugar a progenitores de ciclo rápido (amplificadores de tránsito, TA), que se
someten a varias rondas de división celular antes de diferenciarse en células del linaje
absorbente (enterocitos) y secretor (Paneth, cáliz, mechón y células enteroendocrinas) 1. La
señalización de Wnt / β-catenina es necesaria para el mantenimiento del grupo IESC2. Sin
embargo, hasta la fecha, las redes reguladoras de genes que rigen el comportamiento de los
IESC siguen siendo esquivas. El nivel de actividad de la vía Wnt por sí solo no puede
explicar la tasa de proliferación específica del tipo celular y la capacidad de autorrenovación
de las células IESC, TA y Paneth3,4. Por lo tanto, la regulación diferencial de la expresión
génica diana de Wnt puede determinar la identidad del grupo autorrenovable de IESC.
Una señal extracelular común puede traducirse en distintas respuestas celulares y decisiones
de destino a través de la expresión de efectores autónomos de células específicas. En el
contexto de la señalización de Wnt, los cofactores transcripcionales que interactúan con la β-
catenina se han implicado repetidamente en la modulación específica de tejido y tipo celular
de las respuestas de Wnt5. Los interaccionadores de β-catenina C-terminal, como la proteína
de unión a CREB (CBP) y p300, así como los miembros del complejo Mediador y del factor
1 asociado a la ARN polimerasa II (PAF1), son coactivadores promiscuos que interactúan,
además de con β-catenina, con varios otros factores de transcripción6,7. Por el contrario, el
linfoma de células B 9 (BCL9) y el paralog BCL9-like (BCL9L) se unen específicamente a
una fracción N-terminal de β-catenina y actúan como efectores transcripcionales específicos
de tejido8-12. Aunque prescindibles para la homeostasis intestinal normal, los BCL9 / 9L son
necesarios para la regeneración intestinal en caso de agresiones13-16, lo que sugiere que
podrían ser necesarios para la reconstitución del conjunto de células madre. Además, se ha
proporcionado evidencia convincente de que BCL9 / 9L juega un papel crucial en el
mantenimiento de la madre del tumor en varios modelos murinos de cáncer colorrectal13-16.
Aún no se ha probado si la regulación diferencial de las salidas de señalización Wnt está
relacionada con la determinación del destino y la capacidad de autorrenovación específicas
del IESC. En este estudio, diseccionamos las contribuciones individuales de las ramas
transcripcionales C- y N-terminales de la β-catenina al mantenimiento de la homeostasis
intestinal. Utilizando alelos mutantes knock-in de β-catenina que perjudican específicamente
el reclutamiento de cofactores de β-catenina N- o C-terminales8, mostramos cómo la
regulación diferencial de la señalización de Wnt / β-catenina gobierna la identidad y el
destino de IESC. Mientras que los cofactores C-terminales actúan como un interruptor de
todo o nada para la expresión del gen diana Wnt, los cofactores N terminales son
responsables de la modulación transcripcional selectiva asegurando la proliferación adecuada
y la autorrenovación de las IESC.
Resultados
La atenuación de las salidas transcripcionales de β-catenina N- frente a C-terminal en el
epitelio intestinal tiene distintos impactos fenotípicos. Previamente generamos alelos
transgénicos de β-catenina (Ctnnb1) que albergan mutaciones que previenen interacciones
con cofactores transcripcionales N- o C-terminales (NTF y CTF, respectivamente) 8. La
mutación D164A anula la interacción con los NTF, mientras que el truncamiento ΔC anula la
interacción con los CTF (Fig. 1a). Para superar la letalidad embrionaria de estos alelos,
utilizamos ratones heterocigotos compuestos que llevan un alelo de β-catenina mutante y uno
condicional (Fig. 1a complementaria). De manera similar, para los ratones Ctnnb1KO / wt
constitutivamente hemicigóticos, los animales Ctnnb1D164A / flox y Ctnnb1ΔC / flox no
muestran anomalías manifiestas, lo que indica una haplosuficiencia de β-catenina para el
mantenimiento de la homeostasis intestinal. La combinación con el controlador villin-
CreERT217 permite la deleción inducible del alelo de β-catenina condicional (Ctnnb1flox)
específicamente en el epitelio intestinal, dejando así
las salidas transcripcionales de Wnt están únicamente bajo el control de la β-catenina mutante
(D164A o ΔC).
Mientras que los ratones villin-CreERT2; Ctnnb1wt / flox (control) son viables e
indistinguibles de los animales homocigotos de tipo salvaje (wt), la única presencia de β-
catenina mutante es letal. Villin-CreERT2; Los animales Ctnnb1ΔC / flox (ΔC) exhiben
criptas atróficas y alcanzan un punto final humanitario 4 días después de la inducción de
CreERT2 (4d después de la inducción (pi)) (Fig. 1b complementaria). Esto está de acuerdo
con nuestros resultados anteriores en animales villin-CreERT2; Ctnnb1dm / flox, que
expresan β-catenina doble mutante (dm) que alberga mutaciones N y C-terminales18. Los
animales Villin-CreERT2; Ctnnb1D164A / flox (D164A) solo alcanzan el punto final
humanitario a los 7d pi y sufren de colitis grave (Fig. 1c complementaria). Por tanto, ni la β-
catenina C- ni N-terminalmente mutada es haplosuficiente en el epitelio intestinal, ya que
estos mutantes no pueden sustituir al alelo wt. Sin embargo, los distintos impactos fenotípicos
de estas mutaciones sugieren diferentes roles de las ramas C- y N-terminales de la
transcripción mediada por β-catenina, que nos propusimos investigar.
La producción de Wnt / β-catenina requiere una modulación selectiva de la expresión génica
por transcripcional
cofactores.
Confirmamos la recombinación completa del alelo de β-catenina floxado en el epitelio
intestinal mutante 2d pi (Fig. 1d suplementaria). En consecuencia, y de acuerdo con el rápido
recambio de las células epiteliales intestinales, observamos el agotamiento de la proteína wt
β-catenina de las criptas 2d pi (Fig. 1e complementaria). Por tanto, 2d pi, las criptas de
animales ΔC, D164A y dm solo albergan β-catenina mutante, que está presente a niveles
citosólicos y nucleares comparables a los de β-catenina wt (Figura complementaria 1f). Es
importante destacar que la integridad de la cripta y las vellosidades permaneció inalterada. De
hecho, como se informó anteriormente para los animales con β-catenina-dm8,18, el tipo de
fenotipo observado está completamente conectado a los resultados transcripcionales y no es
atribuible a la pérdida de adhesividad epitelial, como en el caso de la pérdida completa de β-
catenina. De hecho, la β-catenina mutante co-localiza con la molécula de adhesión de células
epiteliales (Epcam) en la membrana celular (Fig. 1g complementaria).
Realizamos la secuenciación de ARN de preparaciones a granel de epitelio del intestino
delgado aislado 2d pi de animales control, ΔC, D164A, dm y KO. El análisis de componentes
principales indicó diferencias sorprendentes en la alteración de las interacciones N-terminal
versus C-terminal en el transcriptoma epitelial (Fig. 1b). Los genes expresados
diferencialmente (DEG, logFC> | 2 |, p <0.05) de los animales ΔC se superponen
ampliamente con los de los animales dm y los animales knock-out (KO), lo que indica que la
β-catenina mutada en el extremo C no es capaz de mantener Niveles de señalización Wnt
necesarios para la renovación adecuada del epitelio intestinal (Fig. 1c y Fig. Complementaria
2a). De hecho, la atenuación de las salidas transcripcionales de β-catenina C-terminal en el
epitelio intestinal provoca una pérdida de IESC y el desgaste de la proliferación en el
compartimento amplificador transitorio, como lo demuestra la expresión del gen IESC y del
marcador proliferativo (figura 1d), enriquecimiento del conjunto de genes análisis (GSEA,
Fig. 2b complementaria) 19, así como tinciones de proteínas e hibridación in situ del ARN
(Fig. 1e-g). La regulación a la baja de genes diana Wnt auténticos en animales ΔC, dm y KO
2d pi se confirmó mediante qRT-PCR (Fig. 2c complementaria).
Al contrario de lo que se observó en ratones ΔC, los cambios transcriptómicos inducidos en
animales con β-catenina-D164A (es decir, mutante N-terminal) solo se superpusieron
mínimamente con los inducidos por la pérdida de β-catenina (Fig. 1c y Fig. 2a
complementaria) ). Es de destacar que la exclusividad de los DEG en los mutantes D164A
puede atribuirse parcialmente a un enriquecimiento específico de D164A de genes
expresados por infiltración de células inmunes (Fig. 2d complementaria). A diferencia de lo
que observamos en las criptas ΔC, la expresión de los objetivos Wnt, genes IESC y
marcadores de proliferación aumentó significativamente en las criptas D164A 2d pi (Fig. 1e,
f, y Fig. 2c complementaria). Además, las criptas mutantes D164A mostraron un aumento del
área Lgr5 +, como lo muestra la hibridación in situ fluorescente de una sola molécula
(smFISH), lo que indica una expansión del compartimento IESC.
(Fig. 1g y Fig. 2e complementaria). Además, tanto la presencia de células Ki67 + en la parte
inferior de las criptas D164A (flechas blancas en la figura 1e, y evidenciadas en la figura
complementaria 2f) como la expresión de Myc regulada al alza en la base de la cripta (figura
1h) indican un aumento de la proliferación de IESC. Estos resultados indican que la
prevención de las interacciones de la β-catenina con los CTF reprime por completo las salidas
de Wnt, incluida la proliferación y los genes asociados con IESC, lo que compromete el
mantenimiento de las células madre. De lo contrario,
h control D164A
I
pag
D
2
,
A
norte
R
metro
C
y
METRO
La atenuación de las salidas transcripcionales N-terminal de β-catenina aumenta la
proliferación de IESC y da como resultado una expansión del compartimento de células
madre.
Es de destacar que, a pesar de que el CreERT2 impulsado por villinas está activo a lo largo
del epitelio gastrointestinal, no encontramos cambios morfológicos ni proliferativos en el
epitelio colónico de animales mutantes de β-catenina en 2 o 4 días pi (Fig. Complementaria
3a, b). Esto probablemente se deba a la dinámica de renovación más lenta del colon.

COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | (2021) 12: 1368 |

https://doi.org/10.1038/s41467-021-21591-9 | www.nature.com/naturecommunications 3
ARTÍCULO COMUNICACIONES DE NATURALEZA | https://doi.org/10.1038/s41467-
021-21591-9
Fig. 1 La atenuación de las salidas transcripcionales de β-catenina N- frente a C-terminal
tiene efectos contrastantes sobre la homeostasis intestinal. a Esquema de proteínas β-catenina
wt y mutantes con interacciones deterioradas con cofactores transcripcionales N- o C-
terminales. b Análisis de componentes principales (PCA) del transcriptoma de muestras
RNASeq del epitelio del intestino delgado de control y mutante promediado. Punto de
tiempo: 2d pi. PC1 y PC2 explican el 94,8 y el 3% de la varianza, respectivamente. KO:
villin-CreERT2; Ctnnb1flox / flox, n = 2; dm: villin-CreERT2; Ctnnb1dm / flox, n = 3;
control: villin-CreERT2; Ctnnb1wt / flox, n = 3; D164A: villin-CreERT2; Ctnnb1D164A /
flox, n = 3; ΔC: villin-CreERT2; Ctnnb1ΔC / flox, n = 2. c Parcela alterada de genes
cruzados expresados diferencialmente (DEG) (logFC> | 2 |, p <0.01, calculado por
prueba exacta de edgeR) en ΔC, dm, KO y D164A, con respecto al control. d Mapa de calor
de FPKM normalizado de genes marcadores Wnt e IESC a través de mutantes agrupados
jerárquicamente. Las filas se escalan. e Hibridación in situ de ARNm de Axin2 (Wnt-target),
inmunofluorescencia de control de Olfm4 (marcador IESC) y Ki67 (células en proliferación),
criptas duodenales D164A y ΔC. Hematoxilina, DAPI (núcleos) o E-cadherina (membrana
celular) como contratinción. Las flechas blancas indican células Ki67 + en la base de la
cripta. Punto de tiempo: 2d pi. Barra de escala, 20 μM. f Cuantificación de células Axin2 + (n
= 2) y células Ki67 + (n = 3) por cripta. * p = 0,019, calculado mediante la prueba T de
Student de dos colas no emparejada. El diagrama de barras indica el número medio de células
positivas. g, h smFISH de ARNm de Lgr5 y Myc. Los recuadros muestran un mayor aumento
de la base de la cripta. Las flechas indican moléculas de ARNm individuales visibles como
puntos. La línea discontinua roja indica el compartimento de células madre Lgr5 +. Punto de
tiempo: 2d pi. Barra de escala, 20 μM. Imágenes representativas de tres réplicas biológicas.
epitelio 20. Además, los niveles elevados de E-cadherina en el colon actúan como sumidero
de β-catenina, retrasando los efectos de las mutaciones introducidas21. Por tanto, centramos
nuestra investigación en el epitelio del intestino delgado.
Las criptas intestinales que carecen de la salida a través de cofactores reclutados N-terminales
exhiben pérdida de células madre e hiperplasia secretora 4d pi. No habíamos observado
ningún fenotipo manifiesto de células caliciformes o células de Paneth en animales ΔC o
D164A 2d pi (Fig. Complementaria 3c, d). Inesperadamente, la morfología de la cripta 4d pi
en D164A se vio profundamente alterada por la aparición de grandes células granulares que
carecían de expresión de genes diana Wnt (Axin2), así como marcadores pro-vida (Ki67) e
IESC (Olfm4) (Fig. 2a) . Estas células expresan el marcador de linaje secretor Sox9 (Fig. 2a),
y son doblemente positivas para lisozima (Lyz) y mucinas (teñidas con azul alcián, AB) (Fig.
2b). Además, observamos células Lyz + mal localizadas en las vellosidades de animales
D164A (Fig. 2b). Estas células recuerdan a las células intermedias, que comparten tanto los
rasgos de Paneth (lisozima) como los de células caliciformes (mucinas), son el resultado de la
diferenciación errónea de las células madre y se han observado tras la perturbación
experimental de la señalización de Notch, Wnt o EGF en el epitelio intestinal22-26. Sin
embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a su aparición en el tejido se desconocen
en gran medida. Curiosamente, se observó un cambio hacia la diferenciación del linaje
secretor tras la deleción de los cofactores N-terminales BCL9 / 9L en tumores APCmin16, lo
que sugiere que los NTF podrían reprimir la especificación del linaje secretor.
Tomados en conjunto, los resultados presentados hasta ahora indican que, de forma similar a
la deleción completa de β-catenina, el bloqueo de su reclutamiento de CTF provocó
rápidamente una pérdida letal de células madre (Fig. 2C). Por otro lado, la interacción
deficiente con BCL9 / 9L desencadena una hiperproliferación transitoria de IESC, seguida de
su diferenciación aberrante. La dinámica celular profundamente distinta que conduce al
colapso de la cripta por deterioro de las salidas de β-catenina N- frente a C-terminal, sugiere
por tanto funciones independientes de estas ramas transcripcionales en el mantenimiento de la
homeostasis del IESC.
Los IESC hiperproliferativos que expresan solo Ctnnb1D164A tienen una mayor capacidad
para formar organoides. Un trabajo reciente indicó que no se pudieron establecer organoides
intestinales a partir de criptas deficientes en BCL9 / 9L aisladas 4d pi15. Sin embargo,
planteamos la hipótesis de que la expansión del compartimento IESC proliferativo en las
criptas D164A observadas 2d pi se traduciría en un aumento de la tasa de formación de
organoides. Para probar esto, diseñamos un ensayo de formación de organoides (Fig. 3a):
aislamos criptas intestinales de villin-CreERT2; Ctnnb1wt / flox (control) y villin-CreERT2;
Ctnnb1D164A / flox (D164A) animales 0, 2 y 4d después de la inducción de CreERT2,
sembraron cantidades iguales en Matrigel y cuantificaron el número de orga noides formados
7 días después. Sorprendentemente, las criptas D164A aisladas 2d pi mostraron un aumento
de 1,6 veces en la tasa de formación de organoides en comparación
a criptas no inducidas (Ctnnb1D164A / flox), y un aumento de 10 veces en comparación con
el control respectivo (Fig. 3b). Morfológicamente, los organoides derivados de las criptas
hiperproliferativas mostraron un aumento de la proliferación y gemación celular (Fig. 3c). De
acuerdo con la naturaleza transitoria de la hiperproliferación observada in vivo, las líneas
organoides obtenidas de las criptas D164A 2d pi no se pueden mantener en cultivo y mueren
tras el primer paso (paneles posteriores a la división, Fig. 3c). Las criptas aisladas de
animales D164A 4d pi no lograron establecer organoides in vitro, de acuerdo con la pérdida
de células madre y los marcadores de proliferación observados en el tejido (Fig. 3b). En
resumen, estos resultados in vitro recapitulan y subrayan funcionalmente nuestras
observaciones in vivo.
Nos preguntamos por qué las criptas de control aisladas 2d y 4d pi mostraron una reducción
drástica en la tasa de formación de organoides en comparación con las criptas no combinadas
(Fig. 3b). Encontramos que, en contraste con la situación in vivo, la β-catenina no es
haplosuficiente in vitro: las criptas aisladas de ratones constitutivamente hemicigóticos
(Ctnnb1KO / wt), que no muestran un fenotipo manifiesto, no logran establecer organoides
intestinales (Fig. 3a complementaria) . Además, las criptas aisladas de animales Ctnnb1ΔC /
flox y Ctnnb1dm / flox tampoco crecen in vitro (Fig.4a complementaria), lo que indica que se
necesitan dos copias de los alelos de β-catenina transcripcionalmente activos para mantener la
expresión del gen diana de Wnt requerida por los organoides intestinales . Establecimos
cultivos de organoides a partir de villin-CreERT2 no inyectado; Ctnnb1wt / flox (control) y
villin-CreERT2; animales Ctnnb1D164A / flox (D164A) y recombinación inducida in vitro.
En contraste con los organoides que carecen del controlador villin-CreERT2, tanto los
organoides de control como los D164A murieron dentro de los 7 días posteriores a la adición
de 4OHT, y perdieron rápidamente la expresión de los marcadores indicativos de
señalización Wnt, tallo o proliferación (Fig. 4b-d complementaria). Este comportamiento no
pudo rescatarse mediante la adición de medio acondicionado con Wnt3a al cultivo antes de la
adición de 4OHT (Fig. 4e complementaria). Los requisitos de señalización diferencial de Wnt
/ β-catenina de las criptas intestinales in vitro podrían deberse al hecho de que los organoides
carecen de un nicho de soporte mesenquimatoso y que se parecen mucho a un estado
regenerativo, en lugar de homeostático, de las criptas intestinales.
La proliferación impulsada por Myc-E2F conduce al agotamiento del conjunto de células
madre en animales mutantes N-terminales (D164A). Para diseccionar las redes reguladoras de
genes que subyacen a la hiperproliferación transitoria de las IESC desencadenadas por
interacciones deterioradas de β-catenina-NTF, realizamos una secuenciación de ARN
unicelular basada en gotas (scRNAseq) de criptas del intestino delgado aisladas de animales
de control y D164A a 0, 2 y 4d pi. Centramos nuestro análisis en los cambios en la expresión
génica que se producen a lo largo del tiempo en las células madre y los progenitores
tempranos (células SCEP), que anotamos manualmente en función de la expresión del gen
marcador (Fig. Complementaria 5a, b). El análisis de expresión génica diferencial confirmó
nuestros resultados anteriores, lo que indica que los IESC y los marcadores de proliferación
(por ejemplo, Olfm4 y Mki67) están regulados positivamente en las células D164A SCEP 2d
pi

INGLÉS
FRANCÉS
Texto original
clear
volume_up
2236 / 5000
Resultados de traducción
Axin2 Hem Ki67 E-cadherin Olfm4 DAPI Lyz Ecadh DAPI Sox9 DAPI
a
control
I
pag

D164A
D
4
B
Lyz mucinas hematoxilina

I
pag

D
4
C
control
KO / ∆C
2d pi 4d pi
pérdida letal de
intestinal
criptas
D164A
IESC
ejército de reserva
células hiperproliferativas células de Paneth
celdas intermedias

pérdida de IESC y arresto proliferativo

D164A
IESC
hiperproliferación
pérdida letal de
intestinal
criptas
secretor
hiperplasia

Fig. 2 Las criptas intestinales que carecen de salida a través del N-terminal reclutaron
cofactores para exhibir pérdida de células madre e hiperplasia secretora 4d pi. a Axin2 (diana
Wnt) hibridación in situ, Olfm4 (marcador IESC), Ki67 (células en proliferación), lisozima
(Lyz, células Paneth) y Sox9 (precursores de células Paneth) inmunofluorescencia de control
(villin-CreERT2; Ctnnb1wt / flox) y D164A (villin-CreERT2; Ctnnb1D164A / flox) criptas
duodenales. Hematoxilina (núcleos), DAPI (núcleos) o E-cadherina (forma celular) para
contratinción. Punto de tiempo: 4d pi. Barra de escala, 20 μM. Imágenes representativas de
tres réplicas biológicas. b Células de Paneth y células caliciformes visualizadas por Lyz-HRP
y azul alcián (mucinas), respectivamente. Hematoxilina como contratinción. Las flechas
marrones indican células Lyz +, que también se encuentran mal ubicadas en las vellosidades
de los animales D164A. Las flechas azules indican células que expresan mucina. Los
recuadros muestran un mayor aumento de las criptas. Punto de tiempo: 4d pi. Barra de escala,
20 μM. Imágenes representativas de tres réplicas biológicas. c Modelo de trabajo que resume
los impactos de la contribución faltante de cofactores de β-catenina N- vs. C-terminales.

en comparación con los controles, mientras que su expresión se pierde 4d pi (Fig.

suplementaria 5c, d). Para desenredar los efectos transcriptómicos causados por interacciones
N-terminales deterioradas de los que surgen debido a la pérdida aguda del alelo de β-catenina
condicional, diseñamos un procedimiento de normalización utilizando los datos de series de
tiempo de control (Métodos). Los datos normalizados resultantes representan
cambios transcriptómicos que ocurren en las células SCEP, a lo largo del tiempo, al alterar
las interacciones β-catenina-NTF.
Confirmando los datos presentados anteriormente, las células D164A SCEP exhibieron una
regulación positiva transitoria de IESC y marcadores de proliferación 2d pi (Olfm4, Mki67,
Ccnd1), seguido de una mayor expresión de marcadores de diferenciación 4d pi (Ada, Apoa4,
Apoa1,
Fig. 3 Las IESC hiperproliferativas que expresan solo Ctnnb1D164A tienen una mayor
capacidad para formar organoides. a Diseño experimental de ensayo de formación de
organoides. b Tasa de formación de organoides (en%) de las criptas de control (villin-
CreERT2; Ctnnb1wt / flox) y mutantes (villin-CreERT2; Ctnnb1D164A / flox) aisladas 0, 2 y
4d pi. **** p <0,0001, ** p = 0,0088, * p = 0,0207, calculado mediante la prueba T de
Student de dos colas no apareados (n = 3). El gráfico de barras indica la tasa media. c
Imágenes de campo claro de organoides de control y mutantes formadas a partir de criptas
aisladas 2d pi cultivadas en Matrigel durante 10 días. Los recuadros muestran un aumento
mayor. Imágenes representativas de tres réplicas biológicas. Barras de escala, 20 μM. d
Imágenes confocales de criptas aisladas 2d pi y cultivadas en Matrigel durante 7 días.
Muestra de tinción EdU
células en proliferación. E-cadherina (forma celular) y DAPI (núcleos) como contratinción.
Barra de escala, 20 μM. Imágenes representativas de tres réplicas biológicas.

Alpi, Ace1, Muc3, Lyz1) (Fig. Complementaria 5g). Esto se destaca por los mapas de
difusión27 como un cambio a lo largo del continuo de diferenciación de células madre: las
células SCEP aisladas 2d pi tienen una distribución significativamente más "parecida a la
madre", mientras que las células SCEP de las criptas D164A 4d pi están más desplazadas
hacia la diferenciación (Fig. 4a, B). También identificamos células secretoras intermedias en
D164A dentro de células SCEP 4d pi por su coexpresión de características de células de
Paneth y caliciformes (Fig. 5e complementaria).
La regulación al alza de los marcadores de células madre 2d pi estuvo acompañada de un
aumento significativo en los niveles medios de expresión de genes relacionados con el ciclo
celular28 (Fig. 4c). Es de destacar que este comportamiento de las células D164A SCEP no
se observó en otros tipos de células con

6 COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | (2021) 12: 1368 |

https://doi.org/10.1038/s41467-021-21591-9 | www.nature.com/naturecommunications
COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | https://doi.org/10.1038/s41467-021-21591-
9 ARTÍCULO
Fig. 4 La proliferación impulsada por Myc-E2F va seguida de señalización de estrés y
pérdida de células madre en criptas mutantes N-terminales (D164A). a Mapa de difusión de
células madre y células progenitoras tempranas (SCEP) aisladas de D164A (villin-CreERT2;
Ctnnb1D164A / flox, n = 3) criptas 0, 2 y 4d pi y normalizadas por el control respectivo
(villin-CreERT2; Ctnnb1wt / flox, n = 3). Células (puntos) coloreadas por punto de tiempo
después de la inducción de Cre (días pi). El componente de difusión 1 (DC1) representa el
pseudotiempo de diferenciación. A la derecha, células coloreadas por su expresión promedio
de células madre (arriba) y genes marcadores de diferenciación (abajo). b Distribución de la
puntuación DC1 en células SCEP D164A normalizadas a lo largo del tiempo (*** p <2,2e-
16, prueba de Wilcoxon bilateral). c Distribución de la puntuación del ciclo celular
(expresión media de genes cíclicos) en SCEP D164A normalizados a lo largo del tiempo (***
p <2,2e-16, prueba de Wilcoxon bilateral). d Perfil de expresión de células madre y genes
marcadores de proliferación en células SCEP normalizadas ordenadas a lo largo de
pseudotime supervisado (psupertime). Celdas (puntos) coloreadas por punto de tiempo. e
Análisis de expresión de conjuntos de genes (GSEA) en genes variables en el tiempo en
SCEP a través de puntos de tiempo. Puntuación de enriquecimiento normalizada (eje y) a lo
largo del tiempo (eje x) de conjuntos de genes MSigDB. El tamaño de los puntos indica el
tamaño del conjunto de genes enriquecido. El color del punto indica el valor p de
enriquecimiento, calculado por la prueba hipergeométrica. Conjuntos de genes seleccionados
etiquetados (identificadores en el texto). f Distribución de las respuestas pronosticadas del
modelo de regresión logística que muestra un desplazamiento de las células SCEP
normalizadas 2d pi del tallo epitelial intestinal
señalización activa de Wnt, como en las células de Paneth o en los enterocitos (Fig. 5f
complementaria). El análisis de pseudotiempo supervisado29 confirmó que las células madre
y los marcadores de proliferación exhiben un perfil de expresión similar a lo largo del tiempo,
aumentando 2d pi y, posteriormente, disminuyendo 4d pi (Fig. 4d). Habíamos observado un
aumento de la expresión de Myc en las criptas D164A 2d pi (Fig. 1h), por lo que
preguntamos si la proliferación impulsada por Myc inducía un aumento de la velocidad del
ciclo celular de las células SCEP. De hecho, en 2d pi, los objetivos Wnt dependientes de Myc
se enriquecieron significativamente en DEG entre 0d y 2d pi (objetivos APC dependientes de
Myc obtenidos de la referencia 30. Código MSigDB M1757, puntuación de enriquecimiento
normalizado (NES) = 1,68, p <0,05 ) (Figura 4e). Además, la firma del factor E2 (E2F), un
importante regulador del ciclo celular y un objetivo de Myc, se enriqueció significativamente
(M5901, NES = 1.56, p <0.05) junto con genes involucrados en el ciclo celular (M14460,
NES = 1.65, p <0.05) y punto de control G2M (M5901, NES = 1.72, p <0.05) (Fig. 4d). Estas
firmas de proliferación se redujeron significativamente 4d pi (NES <-1, p <0,05), lo que
refleja una detención proliferativa abrupta (Fig. 4c, d).
Nos preguntamos si el estallido de proliferación inducido por Myc-E2F observado indujo una
conversión en bloque de IESC D164A en TA, que se sabe que exhiben una mayor expresión
de dianas Wnt proliferativas31. Como nuestros modelos de ratón no albergan ningún
informador de IESC (por ejemplo, Lgr5-EGFP) que permita la identificación de células
madre, probamos esta hipótesis computacionalmente. Entrenamos un modelo de regresión
logística en TA e IESC obtenido de un conjunto de datos de una sola célula disponible
públicamente de epitelio del intestino delgado murino32, y probamos células SCEP de 0d y
2d pi contra este modelo. La comparación de la distribución de las respuestas del modelo
predichas de los dos puntos de tiempo muestra un cambio significativo de las células 2d pi
hacia los rasgos TA (Fig. 4F). En conjunto, nuestros resultados indican que la alteración de
las interacciones β-catenina-NTF activa transitoriamente un programa de proliferación
impulsado por Myc-E2F en IESC, lo que da como resultado el agotamiento del grupo IESC
autorrenovable.
Las señales de estrés intrínseco celular y ambiental inducen una mala diferenciación.

GSEA de genes variables en el tiempo en células SCEP sugiere un aumento en la

señalización de estrés en las criptas tras el deterioro de las interacciones β-catenina-NTF.

De hecho, los mediadores clave de la respuesta de la proteína desplegada (UPR) —Xbp1,

Creb3 y Creb3l3 — se encuentran entre los factores de transcripción más fuertemente

regulados al alza en las células D164A SCEP a lo largo del tiempo (Fig. 5h

complementaria). Confirmamos la expresión ectópica de Creb3l3 en las criptas D164A 4d

pi usando smFISH (Fig. 5a). Creb3l3 es un gen fuertemente zonado; su expresión

aumenta a lo largo del eje cripta-vellosidad, con expresión máxima en la punta de las

vellosidades33. Además, la expresión de los marcadores de UPR Hspa5 y Ddit3 en las

criptas 2d pi se incrementó significativamente en D164A en comparación con los

controles, según se midió independientemente mediante qRT-PCR (Fig. 5b).

Finalmente, de acuerdo con la activación de la UPR, los genes involucrados en el inicio

de la traducción y la función ribosómica están significativamente regulados a la baja en

las criptas D164A (M27686, NES = −2.52, p <0.05 y M189, NES = −3.26, p <0.001,

respectivamente) ( Figura 4e).

Además de los genes implicados en el estrés intrínseco de las células, también encontramos
genes de estrés inducidos por citocinas fuertemente regulados al alza en las células D164A
SCEP a lo largo del tiempo. De hecho, las firmas de la señalización del factor de necrosis
tumoral α (TNFα) y del interferón γ (IFNγ) se enriquecieron significativamente (M5913,
NES = 2,32, p <0,001 y M5890, NES = 2,08, p <0,001, respectivamente). Además, los genes
inducidos por citocinas Irf7, Fos, Jun y Junb figuraban entre los factores de transcripción más
regulados al alza según nuestro análisis de pseudotiempo supervisado (Fig. 5h
complementaria). Curiosamente, encontramos una regulación positiva dependiente del tiempo
de los genes implicados en la presentación de antígenos endógenos (M16750, NES = 3.01, p
<
0,001), específicamente genes que codifican componentes de los complejos MHC de clase II
(Figs. 4e y 5c).
Por tanto, nuestros datos de scRNAseq sugieren que la diafonía entre los compartimentos

epitelial e inmunitario de la cripta aumenta tras el deterioro de las interacciones de β-

catenina-NTF. Perfilamos el infiltrado inmune intestinal mediante citometría de flujo y

encontramos que el número de células CD45 + se duplicó con el tiempo en los animales

D164A, pero no en los controles (Fig. 5e). De hecho, el análisis de inmunofluorescencia

indica una infiltración sustancial de células CD45 + en la zona pericríptica, así como

dentro de las criptas, de animales mutantes N-terminales (Fig. 5d). Específicamente, el

perfil de leucocitos reveló un aumento significativo de linfocitos T CD4 +, monocitos

MHCII + y MHCII−, así como neutrófilos, en animales D164A. Es de destacar que los

mutantes ΔC muestran un recuento de células CD45 + inalterado y una composición de

la población inmunitaria en 2d pi (Fig. 5e y Fig. 6a complementaria). Recientemente se

ha demostrado que TNFα, IFNγ e interleucina 17 (IL-17) derivados de células T inhiben

la renovación de IESC34, y que el exceso de señalización de interferón-γ induce una

diferenciación errónea hacia el destino secretor35. Tras la reestimulación con PMA e

ionomicina, observamos un aumento sustancial, aunque no significativo, en la secreción

de TNFα, IFNγ e IL-17 de células T CD4 + y CD8 + aisladas de animales D164A 4d pi

(Fig. 6b complementaria).
Preguntamos si la afluencia de células inmunes fue causada por una ruptura de la barrera
epitelial intestinal, en lugar de señales derivadas de criptas. Para ensayar la permeabilidad
intestinal, administramos dextrano conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC-
dextrano) por sonda oral a ΔC, D164A y ratones de control 2d y 4d pi. De acuerdo con
nuestras observaciones anteriores que indicaban integridad epitelial intacta, no encontramos
ninguna diferencia significativa (p> 0,01) en la concentración de FITC-dextrano en el plasma
de animales mutantes (Fig. 5g).
En conjunto, estos resultados sugieren que, tras su hiperproliferación inducida por
interacciones deterioradas de β-catenina-NTF, las IESC están sujetas a una combinación de
tensiones intrínsecas celulares (UPR) y ambientales (citocinas), que inhiben su
autorrenovación34-36. En particular, la presentación de antígenos está intrínsecamente ligada
a la UPR, ya que Xbp1 también es un regulador de los genes del MHC de clase II37,38. La
pérdida de células madre y la diferenciación aberrante de la cripta, acompañada de un
aumento de la infiltración inmunitaria, inevitablemente dan como resultado el fracaso de la
homeostasis epitelial.
El panorama de la cromatina de las criptas D164A refleja la transición a la detención
proliferativa y la diferenciación errónea. Nuestros análisis revelaron cambios
transcriptómicos y morfológicos rápidos y profundos en las criptas tras el deterioro de las
interacciones β-catenina-NTF (mutante D164A). Razonamos que perfilar el panorama de la
cromatina de las criptas D164A proporcionaría información sobre los mecanismos
reguladores de genes responsables de una reprogramación tan drástica de las células
epiteliales. Con este fin, realizamos un ensayo de cromatina accesible por transposasa
utilizando secuenciación (ATACSeq) de control y criptas D164A aisladas 2d pi. El análisis
de pico diferencial reveló que 1469 picos ATAC son diferencialmente accesibles (logFC> | 1
| & p <0,01) en las criptas D164A, en comparación con las criptas de control (Fig. 6a, b).
Sometimos estos picos a análisis de motivos con HOMER39 y encontramos un
enriquecimiento significativo (valor q corregido por Benjamini <0,001) de motivos asociados
con factores de transcripción implicados en la diferenciación intestinal, como los factores
nucleares de hepatocitos (HNF4a, 1,1b), ETS- factores de transcripción relacionados (EHF,
ELF3,5), Homeobox de tipo caudal (Cdx2,4), factores de unión a GATA y factores similares
a Krüppel (Fig. 7a complementaria). Estos hallazgos se correlacionan con una mayor
expresión de marcadores de linaje secretor y absortivo en las criptas D164A observadas en 4d
pi. Además, los picos anotados en los genes diana Wnt

8 COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | (2021) 12: 1368 |

https://doi.org/10.1038/s41467-021-21591-9 | www.nature.com/naturecommunications
COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | https://doi.org/10.1038/s41467-021-21591-
9 ARTÍCULO

B
un control D164A
3
)
norte
H
D
o
I
PAG
A
s
2
GRAMO
s

I
o
mi
t

.
r
pag
metro
** Hspa5

D
px
mi
ro
norte
1

4
,
UN

.
le
R
C
F2g
o
l(
0
control D164A

R
metro

3l
3
B
mi
r
C
norte
o
es
s
mi
r
px
mi

.
le
) ** Ddit3
6
H
D
PAG
A
4
GRAMO

o
t

.
metro
r
o
2
norte

C
F
2
gramo

C
Cd74
0d pi 2d pi 4d pi
D
control
o
l
(
R
2d pi
control D164A 0 4d pi

H2-Aa
H2-Ab1
H2-D1
H2-K1
mi
2 107
mi
tu
s
s
I
Células CD45 +
2d pi
4d pi *** ns
Yo p
AD
h
da
C
mi
54
D164A
t
gramo

/
s
ll
mi
C
1 107 0
control D164A DeltaC
DC

F
mi
tu
s
s
4 106
Células T CD4 +
*
2106 linfocitos T CD8 +
2106 células B 2 d pi 4 d pi

eso

gramo

/
s
ll
mi
C
2 106
0
control D164A
1 106
0
control D164A
1 106
0
control D164A

mi
tu
s
s
eso

gramo

/
s
ll
mi
C
2106 1106 0
MHCII + monocitos **
5,0 105 MHCII- monocitos ****
2,5 105
0.0
2105 neutrófilos 1105
0
**

gramo
norte
control D164A 0.03
control D164A
2d pi
4d pi
control D164A

a
r
tx
mi
D-
C
TI
F
)L
metro
/gramo
metro
(
0,02 0,01 0,00
ns ns ns ns
control DeltaC D164A control D164A

(Tcf7l1 / 2, Axin2, Fzd7, Sp5), inhibidores de Wnt (Tle3, Trabd2b, Wif1, Dab2ip, Amer3) y
genes del ciclo celular (E2f1, Cenpf, Cebpe) figuran entre los picos perdidos (Fig. 6b). Estos
resultados indican que el paisaje de cromatina 2d pi es un preludio de la detención
proliferativa y la hiperplasia secretora observada en mutantes N-terminales (D164A) 4d pi.
De hecho, encontramos que una fracción significativa de conjuntos de genes
sobrerrepresentados en D164A frente a las criptas de control de acuerdo con nuestro análisis
de picos ATAC (2d pi) también fueron
sobrerrepresentados en el transcriptoma de las criptas mutantes D164A (4d pi) (Fig. 7b
complementaria).
La señalización de JNK media la remodelación importante de la cromatina en las criptas
D164A. De acuerdo con nuestros resultados de scRNAseq, el análisis de los datos de
ATACSeq reveló un fuerte enriquecimiento de motivos unidos por factores de transcripción
aguas abajo de la c-Jun N-terminal

COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | (2021) 12: 1368 |

https://doi.org/10.1038/s41467-021-21591-9 | www.nature.com/naturecommunications 9
ARTÍCULO COMUNICACIONES DE NATURALEZA | https://doi.org/10.1038/s41467-
021-21591-9
Fig. 5 Estrés de UPR e infiltración inmune en criptas D164A 4d pi. un smFISH muestra la
localización restringida a vellosidades del ARNm de Creb3l3 en animales de control (villin
CreERT2; Ctnnb1wt / flox) y su expresión ectópica en criptas D164A (villin-CreERT2;
Ctnnb1D164A / flox). Las líneas de puntos rojas y verdes indican el área de la cripta y de las
vellosidades, respectivamente. Los recuadros rojos y verdes muestran un mayor aumento del
área de la cripta y de las vellosidades, respectivamente. Las flechas indican moléculas de
ARNm individuales visibles como puntos. Punto de tiempo: 4d pi. Barra de escala, 20 μM.
Imágenes representativas de tres réplicas biológicas. b qRT-PCR indica un aumento de la
expresión de los marcadores UPR Hspa5 (** p = 0,0028) y Ddit3 (** p = 0,0077) en las
criptas D164A (n = 3) con respecto al control (n = 4). Niveles de expresión normalizados a
GAPDH. Punto de tiempo: 4d pi. Prueba T de Student de dos colas no emparejada. c
Aumento de la expresión de genes que codifican componentes de complejos MHC de clase II
en células D164A SCEP normalizadas a lo largo del tiempo. d Inmunofluorescencia de CD45
en control y secciones de intestino delgado D164A 2 y 4d pi. El recuadro muestra la
infiltración de células inmunitarias (en un círculo) dentro de la cripta (línea discontinua).
Barra de escala, 20 μM. Imágenes representativas de tres réplicas biológicas. e Recuentos
totales de leucocitos por mg de tejido en los animales control, D164A y ΔC (villin-CreERT2;
Ctnnb1ΔC / flox) 2d pi (n = 3) y 4d pi (n = 3). *** p = 0,0004, calculado mediante ANOVA
de una vía con la prueba posterior de Tukey. El gráfico de barras indica los recuentos medios.
f Recuentos por mg de tejido de monocitos CD4 + (* p = 0,0394) y linfocitos T, linfocitos B,
MHCII + (** p = 0,0066) y MHCII- CD8 +
(**** p <0,0001) y neutrófilos (** p = 0,001) 2d pi (n = 3) y 4d pi (n = 3). ANOVA
unidireccional con posprueba de Tukey. El gráfico de barras indica los recuentos medios. g
Permeabilidad intestinal del control, animales D164A y ΔC 2d y 4d pi, cuantificada mediante
la concentración de FITC-dextrano (mg / ml) en plasma. La línea horizontal indica la
concentración media. ns = p> 0.01, calculado por ANOVA de una vía con la prueba posterior
de Tukey (n = 3, excepto para el control 4d pi donde n = 2).

señalización de quinasas (JNK), a saber, los factores de transcripción AP-1 Fra1 / 2, Fos,
Fosl2, JunB, Atf3 y BATF (Fig. 6c). En conjunto, estos motivos se enriquecieron en 220 de
los 600 picos ganados en D164A (37%), incluidos los picos mapeados a Fos, así como
Mapk8 (JNK) y Mapk13 (SAPK4) estrechamente relacionado, lo que indica una activación
robusta de JNK mediada por JNK expresión génica (Fig. 6d y Fig. 7a complementaria).
Validamos la activación de la vía JNK por inmunofluorescencia, que revela una fuerte
acumulación nuclear de JNK fosforilada (pJNK) en D164A, pero no en las criptas de control
4d pi (Fig. 6e). De manera similar a Creb3l3, la expresión de los factores de transcripción Fos
y JunB normalmente se restringe a los enterocitos en la punta de las vellosidades33,40. Sin
embargo, en animales D164A, las transcripciones 4d pi, Fos y JunB se expresan
ectópicamente en criptas (Fig. 6f), lo que corrobora los resultados de ATAC-Seq y
scRNASeq. Además, la glicoproteína de mucina transmembrana Muc13, que se demostró de
forma independiente que es inducida por la actividad de JNK41, también figura entre los
picos ganados en las criptas mutantes D164A (Fig.6b), en línea con el aumento de positividad
de azul alcián de células intermedias hiperplásicas y mal diferenciadas. 4d pi. En conjunto,
estos resultados indican que, tras la falta de interacciones de β-catenina-NTF, se activa la
señalización de JNK. Si bien la diferenciación errónea de los IESC tras la perturbación de la
señalización de nicho se ha descrito anteriormente, la vía JNK no se ha visto hasta ahora
implicada en la pérdida de los IESC.
Bcl9 / 9L son esenciales tras la reducción aguda de los niveles de β-catenina. Nos
preguntamos por qué la sola presencia de β-catenina-D164A conduce al agotamiento de las
células madre, mientras que la pérdida de BCL9 / 9L solo regula a la baja transitoriamente los
marcadores IESC13-16. Posiblemente, esta discrepancia se deba al hecho de que, en nuestro
modelo, el deterioro de las interacciones de β-catenina NTF se produce de forma
concomitante con una reducción aguda de los niveles de β-catenina (recombinación del alelo
wt floxed). De hecho, aunque son prescindibles para la homeostasis epitelial intestinal, se
requieren BCL9 / 9L cuando se desafía la homeostasis, por ejemplo, tras la desregulación de
la señalización de Wnt por inhibición de LGK97415, tratamiento de DSS13 o irradiación15.
Apoyando esta noción, la deleción simultánea de BCL9 / 9 L y una copia de β-catenina en
villin-CreERT2; Ctnnb1wt / flox; Bcl9flox / flox; Bcl9lflox / flox animales, conduce al punto
final humanitario 6d pi (Fig. 7a). Morfológicamente, observamos atrofia de las criptas,
engrosamiento mesenquimatoso y acortamiento de las vellosidades, así como criptas que
recuerdan la hiperplasia secretora observada en los animales D164A (fig. 7b). En presencia
de dos copias de β-catenina, la pérdida de BCL9 y BCL9L deja inalterada la morfología
intestinal (Fig. 7b).
En conjunto, nuestros datos indican que los cofactores transcripcionales modulan
selectivamente la expresión del gen Wnt-diana mediada por β-catenina. Proponemos un
modelo en el que los coactivadores C-terminales gobiernan los niveles de señalización de
Wnt basales. El deterioro de su actividad conduce a la pérdida de células madre y al arresto
proliferativo. Por el contrario, los cofactores N-terminales mantienen el estado de las células
madre. Bloqueando su contribución
resulta en hiperproliferación y diferenciación aberrante de IESCs (Fig. 7c).
Discusión
Anteriormente hemos demostrado que las salidas transcripcionales C- y N-terminales de la
señalización de Wnt / β-catenina tienen funciones distintas e independientes durante el
desarrollo embrionario8. En este estudio, nuestro objetivo fue descubrir sus contribuciones
específicas al mantenimiento de la homeostasis del IESC en adultos. Demostramos que la
dinámica celular del colapso de la cripta tras el deterioro de las interacciones de β-catenina
BCL9 / 9L es profundamente distinta de la rápida atrofia de la cripta observada tras la
deleción de β-catenina o el deterioro de las interacciones con cofactores reclutados en el
extremo C-terminal. Nuestros datos sugieren que los coactivadores reclutados C-
terminalmente actúan como un interruptor binario de transcripción y, por lo tanto, son
esenciales para la transcripción basal mediada por β-catenina de genes diana de Wnt. Por el
contrario, los cofactores N-terminales ajustan la producción transcripcional de la β-catenina a
los niveles requeridos para la proliferación y autorrenovación adecuadas de las IESC. Los
resultados presentados en este documento proporcionan evidencia de que la regulación
diferencial de las salidas transcripcionales de β-catenina preserva la ventana estrecha de la
actividad de la vía Wnt requerida para gobernar la identidad y el destino de las IESC. Esta
modulación transcripcional selectiva puede ser clave para preservar los niveles "justos" de
señalización de Wnt, que han sido implicados en la homeostasis del IESC tanto fisiológica
como en el contexto tumoral42.
Recientemente se ha proporcionado evidencia convincente de que el nicho intestinal IESC se
regenera fácilmente tras perturbaciones, ya que las células diferenciadas pueden revertir a
células madre43-46. La plasticidad epitelial puede así enmascarar los efectos de los estudios
de pérdida de función de proteínas, como BCL9 / 9L, cuya contribución a la homeostasis
intestinal solo se hace evidente cuando se desafía el nicho de células madre epiteliales. Si
bien se ha prestado cada vez más atención al papel de estas proteínas en el mantenimiento de
la raíz del cáncer colorrectal, se ha pasado por alto la función de las interacciones β-catenina-
NTF en la homeostasis intestinal saludable. Nuestros datos sugieren que los cofactores N-
terminales restringen selectivamente las salidas de Wnt / β-catenina que promueven la
proliferación impulsada por Myc-E2F, lo que garantiza el mantenimiento de un grupo de
IESC que se renueva automáticamente. De hecho, en las criptas mutantes N terminales, la
proliferación excesiva de IESC condujo rápidamente al agotamiento del conjunto de células
madre. Concomitantemente con la activación robusta de la vía JNK, las criptas sufren una
profunda desdiferenciación y "villización". De hecho, mostramos la expresión de criptas
ectópicas de programas genéticos característicos de los enterocitos en la punta de las
vellosidades33,40, donde las células diferenciadas terminalmente son eliminadas por
apoptosis. El aumento de la inflamación y la colitis eventualmente resulta en una pérdida letal
de la función intestinal. Curiosamente, recientemente se ha descrito que un subconjunto pro-
liferativo de IESC funciona como células presentadoras de antígenos no convencionales,
organizando interacciones con células inmunes en el intestino a través de la expresión de
complejos MHC de clase II34. Por otro lado, las señales derivadas de células T
son capaces de inhibir la autorrenovación e inducir la diferenciación de IESCs34-36. Es
tentador especular que la diferenciación terminal de las células madre inducida por citocinas,
posiblemente a través de la vía de la JNK, es un mecanismo incorporado para prevenir su
proliferación anormal. Sin embargo, más estudios deberían analizar el papel de las señales
derivadas de células inmunes para el mantenimiento de la homeostasis intestinal tanto en
condiciones fisiológicas como perturbadas.
Métodos
Ratones. El alelo Ctnnb1-flox47 se combinó con el Ctnnb1-delC, Ctnnb1-dm o Ctnnb1-
D164A8, y se crió en la cepa de ratón VillinCre-ERT2 (The Jackson Laboratory) para
generar villin-CreERT2; Ctnnb1wt / flox-CreERT v2 ; Ctnnb1flox / flox (KO), villin-
CreERT2; Ctnnb1dm / flox (dm), villin-CreERT2; Ctnnb1D164A / flox (D164A) y villin-
CreERT2; Ctnnb1ΔC / flox (ΔC). En estos ratones, el alelo de β-catenina condicional se
puede eliminar específicamente en el epitelio intestinal mediante recombinación mediada por
VillinCre-ERT2 inducible por tamoxifeno, dejando

COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | (2021) 12: 1368 |

https://doi.org/10.1038/s41467-021-21591-9 | www.nature.com/naturecommunications 11
ARTÍCULO COMUNICACIONES DE NATURALEZA | https://doi.org/10.1038/s41467-
021-21591-9
Fig. 6 La señalización de JNK media en la remodelación de la
cromatina principal y desencadena la expresión de los genes de la
punta de las vellosidades en las criptas D164A. un diagrama de Venn
de picos de ATACseq medidos en criptas aisladas de animales de
control (villin-CreERT2; Ctnnb1wt / flox, n = 3) y D164A (villin-
CreERT2; Ctnnb1D164A / flox, n = 3). Punto de tiempo: 2d pi. El
análisis diferencial de picos indica que se obtienen 600 picos
(logFC> 1 & p <0,01) y que se pierden 869 (logFC <-1 & p <0,01,
calculado mediante la prueba exacta de edgeR) en las criptas D164A.
b Gráfico de volcán de picos de ATACseq en criptas de control y
mutantes. Los picos ganados (logFC> 1 & p <0.01) se evidencian en el
recuadro rojo. Picos perdidos (logFC <−1 & p <0.01) evidenciados en
caja gris. Los picos seleccionados están etiquetados. Valores p
calculados con la prueba exacta de edgeR. c Tabla de los 10 motivos
de unión del factor de transcripción (TF) más significativamente
enriquecidos en picos diferenciales obtenidos del análisis de
motivos HOMER (prueba hipergeométrica). d Pistas de control
combinadas de ATACSeq y recuentos de D164A. Las flechas negras
muestran picos ganados con motivo de unión AP-1 anotado en
Mapk8 / JNK y Mapk13 / SAP1. e Inmunotinción de fosfo-JNK en
cortes duodenales de control y D164A. E-cadherina (forma celular)
como contratinción. Punto de tiempo: 4d pi. Barra de escala, 20 μM.
Imágenes representativas de 3 réplicas biológicas. f smFISH de
ARNm de Fos y JunB en cortes duodenales de control y D164A. DAPI
(núcleos) como contratinción. Los recuadros muestran un aumento
mayor. Las flechas indican moléculas de ARNm individuales
visibles como puntos. Punto de tiempo: 4d pi. Barra de escala, 20
μM. Imágenes representativas de tres réplicas biológicas.

Fig. 7 Las salidas transcripcionales de la β-catenina de regulación selectiva gobiernan la

identidad de las células madre del epitelio intestinal. un diagrama de supervivencia de villin-
CreERT2; Ctnnb1wt / flox (control, n = 3), villin-CreERT2; Ctnnb1D164A / flox (D164A, n
= 5), villin-CreERT2; Bcl9flox / flox; Bcl9lflox / flox; Ctnnb1wt / CreERT-3) y ; Bcl9flox /
flox; Bcl9lflox / flox; Ctnnb1wt / wt animales (n = 3). **** p <0,0001 calculado mediante la
prueba de rango logarítmico bilateral (Mantel-Cox). b Secciones de histología de villin
CreERT2; Bcl9flox / flox; Bcl9lflox / flox; Ctnnb1wt / flox y villin-CreERT2; Bcl9flox /
flox; Bcl9lflox / flox; Ctnnb1wt / wt animales. La deleción concomitante de Bcl9, Bcl9L y
una copia de β-catenina induce atrofia de las criptas y acortamiento de las vellosidades. Punto
de tiempo: 6d pi. Barra de escala, 20 μM. Imágenes representativas de tres réplicas
biológicas. c Esquemas del modelo propuesto. Los coactivadores C-terminales gobiernan la
señalización de Wnt basal y la prevención de su actividad conduce a la pérdida de células
madre y la detención proliferativa. Por el contrario, los cofactores N-terminales actúan como
especificadores de células madre
Transcripción mediada por Wnt / β-catenina bajo el control exclusivo de β-catenina mutante
(wt en animales de control). El alelo Ctnnb1-D164A se detectó con los cebadores 5′-
TCCCTGAGACGCTAGATG-3 ′ y 5′-GAGTCCCAGCAGTACAAC-3 ′, produciendo un
amplicón del tamaño de 475 pb para el tipo salvaje y 628 pb para los alelos mutantes8.
El alelo Ctnnb1-ΔC se determinó utilizando los cebadores 5′-GTGCACACGTCATGCTTTA
C-3 ′ y 5′-TGGCTTGTCCTCAGACATTCG-3 ′, que generan un amplicón de tamaño 349 pb
para el tipo salvaje y 415 pb para alelos mutantes8. La presencia del alelo villin-CreERT2 se
detectó con los cebadores 5′-CAAGCCTGGCTCGACG GCC-3 ′ y 5′-
CGCGAACATCTTCAGGTTCT-3 ′, que generan un pro de 220 pb.
conducto 17. Para inducir la recombinación mediada por Cre-ERT2, se inyectó tamoxifeno
(Sigma, 80 mg / kg) por vía intraperitoneal durante dos días consecutivos. Se confirmó la
recombinación del alelo de β-catenina condicional para cada ratón incluido en este estudio
mediante PCR con los cebadores 5′-AAGGTAGAGTGATGAAAGTTGTT-3 ′ (RM41), 5′-
CACCATGTCCTCTGTCTATTC-3 ′ (RM42) y 5′-TACACTATTGACTT-CACAG 3
'(RM43), generando productos de 221 pb para el alelo de tipo salvaje, 324 pb para el alelo
floxed y 500 pb para el alelo floxdel47 (Fig. Complementaria 1d). Para eliminar Bcl9 y
Bcl9L, se combinaron 13 alelos condicionales previamente publicados con el alelo villin-Cre-
ERT2 (villin-CreERT2; Bcl9flox / flox; Bcl9lflox / flox) y con el alelo Ctnnb1-flox (villin-
CreERT2; Bcl9flox / flox; / flox; Ctnnb1flox / wt). Todo gen
Las secuencias de cebadores de tipificación se pueden encontrar en la Tabla complementaria
1. Los ratones se sacrificaron 48 h después de la primera inyección de tamoxifeno.
Alternativamente, los ratones se inyectaron en 4 días consecutivos y se sacrificaron 96 h
después de la primera inyección, o se inyectaron en 5 días consecutivos y se sacrificaron 6 o
7 días después de la primera inyección. Los experimentos con ratones se realizaron de
acuerdo con las directrices suizas y fueron aprobados por la Oficina Veterinaria del Kanton
de Zúrich, Suiza. Todos los animales se mantuvieron sobre un fondo C57BL / 6. Los ratones
tenían entre 8 y 12 semanas de edad en el momento de los tratamientos y los aislamientos
celulares. En todos los experimentos se utilizaron ratones de ambos sexos y como controles
se utilizaron compañeros de camada.
Inmunohistoquímica. El duodeno disecado se lavó abundantemente en PBS helado, luego se
cortó en trozos de 1 cm y se fijó en PFA al 4% en PBS durante la noche a 4ºC. Después de
repetidos lavados en PBS, los tejidos se deshidrataron en un procesador de tejidos giratorio,
se incrustaron en parafina y se cortaron en secciones de 8 µm. Las secciones de tejido
desparafinizadas se sometieron a recuperación de antígeno en citrato de sodio 2,4 mM y
ácido cítrico 1,6 mM, pH 6, durante 25 min en un vaporizador. Las secciones se lavaron con
PBST (Tween-20 al 0,1% en PBS) y se bloquearon durante 30 min a TA en tampón de
bloqueo (BSA al 5%, suero de cabra normal inactivado por calor al 5% en PBST). Después
de la incubación durante la noche a 4 ° C con anticuerpo primario (1: 100, en tampón de
bloqueo, Tabla complementaria 1), las secciones se lavaron en PBST y se incubaron con
anticuerpo secundario (1: 400, en tampón de bloqueo) durante 1 hora a temperatura ambiente.
Los núcleos se tiñeron con DAPI (Sigma, 1: 1000) en solución de bloqueo durante 5 min a
TA. Se tomaron imágenes de las secciones en un microscopio confocal Leica LSM 710 y se
procesaron igualmente utilizando el software ImageJ (FIJI), o se escanearon en el sistema
automatizado de imágenes de patología cuantitativa Vectra 3.0 (Perkin Elmer). El porcentaje
de células de la cripta Ki67 + se cuantificó automáticamente con el software inForm Cell
Analysis (Perkin Elmer). El área de la cripta se definió manualmente. Cuantificamos al
menos 30 criptas de 2 a 3 ratones diferentes por condición. Los gráficos de barras se
generaron en GraphPad Prism. Se utilizó la función de prueba T de Student no emparejada en
GraphPad Prism para analizar la importancia de las comparaciones de dos grupos.
Doble histología para células intermedias. Las secciones de tejido desparafinizadas se
incubaron con peróxido de hidrógeno durante 5 min para bloquear la peroxidasa endógena,
luego se incubaron durante 30 min en tampón de bloqueo (5% BSA, 5% de suero de cabra
normal inactivado por calor en PBST) durante 30 min. Después de la incubación durante la
noche con anticuerpo anti-Lyz primario (Dako), las secciones se lavaron repetidamente en
PBST y se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado durante 1 ha TA y luego se
visualizaron con VEC TASTAIN ABC HRP Kit (Vector Laboratories) como lo indica el
fabricante. A continuación, las secciones se incubaron en una solución acuosa al 3% de ácido
acético durante 3 min y luego las mucinas se tiñeron con azul alcián (1 g en 100 ml de ácido
acético al 3%) durante 15 min. A continuación, se realizó la tinción con hematoxilina
(solución acuosa al 50%) de acuerdo con el procedimiento estándar. Se obtuvieron imágenes
de las secciones en el sistema Leica THUNDER 3D Live Cell Imaging.
Hibridación in situ de ARN. El duodeno se lavó abundantemente en PBS helado, luego se
cortó en trozos de 1 cm y se fijó con agitación suave en formalina al 10% durante 20 ha
temperatura ambiente. La hibridación in situ del ARNm de Axin2 se realizó con el kit ACD
RNAscope (ACDBio), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron
imágenes de las secciones en un sistema automatizado de obtención de imágenes de patología
cuantitativa Vectra 3.0 y la cuantificación se realizó con el software inForm Cell Analysis
(Perkin Elmer). El porcentaje de células de la cripta de ARN Axin2 + se cuantificó
automáticamente como para la tinción Ki67.
Hibridación in situ de una sola molécula. Se sacrificaron los ratones y se extrajo el duodeno y
se lavó abundantemente en PBS helado. A continuación, el tejido duodenal se cortó en trozos
de 1 cm y se fijó en PFA al 4% (Santa Cruz Biotechnology, sc-281692) en PBS durante 3 hy
posteriormente se agitó en sacarosa al 30%, PFA al 4% en PBS durante la noche a 4ºC. Los
tejidos fijados se incluyeron en el compuesto TIssue-Tek OCT (Sakura, 4583). Ocho
Se seccionaron secciones de micrómetros de espesor sobre cubreobjetos revestidos con poli
L-lisina. Las bibliotecas de sondas se diseñaron utilizando el software Stellaris FISH Probe
Designer
(Biosearch Technologies) (ver Datos suplementarios 1) y acoplados a Cy5 (Myc, Fos,
Creb3l3) o TMR (Lgr5, JunB) como se describe48. Las secciones intestinales se hibridaron
con conjuntos de sondas smFISH de acuerdo con un protocolo previamente publicado49. Se
utilizó DAPI (Sigma-Aldrich) como contratinción nuclear. Las imágenes smFISH se
realizaron en un sistema Leica THUNDER 3D Live Cell Imaging, utilizando los siguientes
ajustes de compensación computacional THUNDER con el software LAS-X: Escala de
funciones (nm): 350, Intensidad (%): 98, Ajustes de desconvolución: Automático y
Optimización : Alto. El área de Lgr5 + por cripta se cuantificó manualmente usando FIJI.
Cuantificamos al menos 8 criptas de 2 a 3 ratones diferentes por condición. Los gráficos de
barras se generaron en GraphPad Prism. La función de prueba T de Student no emparejada en
Graph Pad Prism se utilizó para analizar la importancia de las comparaciones de dos grupos.
Aislamiento y cultura de la cripta. Las criptas duodenales se aislaron y cultivaron como se
describe50 con modificaciones menores. Se disecó el duodeno, se lavó minuciosamente, se
abrió longitudinalmente y luego se cortó en franjas de 1 a 2 mm. Después de lavados
repetidos en PBS helado, los fragmentos duodenales se incubaron durante 20 min en reactivo
de disociación celular suave (Stemcell Technologies). Las criptas se liberaron gradualmente
del tejido durante cuatro rondas de lavado en BSA al 0,2% y se filtraron a través de un filtro
de 70 micrones, generando 4 fracciones. Solo las fracciones 3 y 4 que contenían criptas
intestinales se utilizaron para experimentos posteriores (organoides o suspensión unicelular).
Las criptas se sembraron en domos Matrigel (Corning) de 50 μL y se cultivaron en Intesticult
(Stemcell Technologies). Tras el paso, el medio de cultivo se complementó con un inhibidor
de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) 1 μM (Y27632, Millipore). Se indujo la
recombinación con 4-hidroxitamoxifeno 100 nM (4OHT, Sigma) añadido al medio de cultivo
tras la división. El medio acondicionado con Wnt3a se obtuvo como se describe51.
Para el ensayo de formación de organoides, los ratones se sacrificaron 0, 2 o 4 días después
de la inyección. Las criptas se sembraron en cantidades iguales (500 criptas) en domos
Matrigel de 50 μL. Los organoides se cuantificaron manualmente 7 días después de la
siembra de criptas y se recolectaron micrografías usando el AmScope 5.2. software. Para la
tinción con EdU, se sembraron criptas en portaobjetos con cámara de 8 pocillos con fondo de
vidrio (Thermo Fisher Scientific, Lab TekTM, 154532) en gotas de 20 μl. La incorporación
de EdU (pulso de 30 min) y la visualización se realizaron de acuerdo con las instrucciones del
fabricante con el kit Edu Click 647 (baseclick) antes de la incubación durante la noche con el
anticuerpo anti-Ecadherin (BS Transduction Lab) para la tinción de la forma celular. Las
imágenes se realizaron en un microscopio confocal de disco giratorio Visitron CSU-W1 con
un objetivo CFI PlanFluor × 20.
Western blot. Las criptas del intestino delgado se aislaron como se describió anteriormente.
Para asegurar una lisis eficaz, las células de las criptas se disociaron en células individuales
mediante incubación de 5 min en TripLE. Después de la neutralización con FBS, las células
se lavaron con PBS, se resuspendieron en 200 μL de tampón hipotónico (Hepes 10 mM pH
7,9, MgCl2 1,5 mM, KCl 10 mM, DTT 0,5 mM, cóctel inhibidor de proteasa ULTRA
completo (Sigma)) y se incubaron 10 min en hielo. Se añadió NP-40 al 10% (50 μL) antes de
agitar con vórtex y 1 min de centrifugación a 7000 x g. El sobrenadante (extracto citosólico)
se eliminó, se sonicó durante 5 min y se almacenó a -80 ° C. El sedimento nuclear se
resuspendió en 200 μL de tampón hipertónico (Hepes 20 mM pH 7,9, MgCl2 1,5 mM, NaCl
0,42 M, DTT 0,5 mM, EDTA 0,2 mM, glicerol al 25%, cóctel inhibidor de proteasa complete
ULTRA (Sigma)) y se rotó a 4ºC. ° C durante 20 min. Después de 5 min de centrifugación a
velocidad máxima, se eliminó el sobrenadante (extracto citosólico), se sonicó durante 5 min y
se almacenó a -80 ° C. La concentración de proteína se determinó con el ensayo BCA. Los
lisados de proteínas se hirvieron con el agente desnaturalizante de muestras NuPAGE (4x) y
el agente reductor (10x) (Invitrogen), se separaron en geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris y se
transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Anticuerpos secundarios conjugados con HRP
unidos a anti-β-catenina monoclonal (Novus NBP1-32239), anti-β-actina monoclonal de
ratón (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778) y A / C antilamina monoclonal de ratón
(eBioscience , 14-9847-82) se visualizaron con sustrato WesternBright Quantum HRP
(advansta). Las manchas sin recortar se encuentran en el archivo de datos de origen.
PCR cuantitativa en tiempo real. El ARN de la cripta se aisló mediante extracción con fenol-
cloroformo y se sometió a transcripción inversa con el kit de síntesis de ADNc (Takara Bio
Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó un nanogramo de ARN total.
La expresión de genes de interés se cuantificó mediante qRT-PCR utilizando el kit SYBR
Green de Applied Biosystems monitoreado por el sistema QuantStudio3 (Applied
Biosystems). Las muestras se midieron por triplicado técnico y los valores umbral de ciclo
promedio se normalizaron a GAPDH utilizando el método ΔΔCT52.
Ensayo de permeabilidad intestinal FITC-dextrano. Se administraron por vía oral a ratones
control (n = 5), ΔC (n = 3) y D164A (n = 6) 0,6 mg por g de peso corporal de dextrano
conjugado con isotiocianato de fluoresceína 4kD (FITC-dextrano) (Sigma) por sonda oral 2d
o 4d pi. Se retiraron alimentos y agua. Los ratones se sacrificaron 4 h después de la
administración de FITC-dextrano, se extrajo aproximadamente 1 ml de sangre post mortem y
se recogió en tubos BD Microtainer SST. La sangre se centrifugó a 5000 xg durante 10 min.
El plasma se diluyó con el mismo volumen de PBS y se analizó la concentración de FITC a
una longitud de onda de excitación de 490 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm
en un instrumento TECAN Infinite 200Pro.
Aislamiento de leucocitos para citometría de flujo. Se sacrificaron ratones control (n = 5), ΔC
(n = 3) y D164A (n = 5) 2d o 4d pi. El duodeno se abrió longitudinalmente, se lavó y se cortó
en pedazos. Se quitaron los parches de Peyer. Las piezas fueron ponderadas
y se incubó en HBSS con FCS al 10%, penicilina / estreptomicina 100 U / ml y EDTA 5 mM
a 37ºC en una incubadora con agitación. A continuación, los tejidos se digirieron a 37 ° C
durante 50 min con Hepes 15 mM, una mezcla igual de 250 U / ml de colagenasa tipo IV y
tipo VIII (Sigma-Aldrich) y 0,05 mg / ml de DNasa I en medio RPMI-1640 suplementado
con FBS al 10% y penicilina / estreptomicina 100 U / ml. Después, las células se colocaron
en capas sobre un gradiente de Percoll al 40/80%, se centrifugaron y la interfaz se lavó en
PBS. Los recuentos de leucocitos totales se determinaron mediante la adición de perlas de
recuento absoluto countBright (Life Technologies) a cada muestra antes de la citometría de
flujo para la normalización al peso del tejido. Para la tinción de la superficie, las células se
tiñeron en PBS con BSA al 0,5% con el tinte de viabilidad fijable eFluor 780 (1: 1000,
eBioscience) y una combinación de los siguientes anticuerpos (1: 200): anti-ratón B220
(RA3-6B2), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD4 (RM4-5), CD45 (30-F11), F4 / 80
(BM8), Ly6G (1A8), Ly6C (HK1.4), CD103 (2E7), CD8 (53-6.7), F4 / 80 (MB8), MHC-II
(M5 / 114.15.2), TCR-β (H57-597), todos de BioLegend. Se incluyó el bloque Fc (anti-CD16
/ CD32, Affymetrix) para minimizar la unión inespecífica del anticuerpo. Para la tinción de
células T con citocinas intracelulares, las células se incubaron durante 3,15 h en IMDM
completo que contenía PMA 0,1 μM e ionomicina 1 μM con soluciones de brefeldina A
(eBioscience) y GolgiStop (BD Biosciences) 1: 1000 a 37 ° C en una incubadora
humidificada con 5% de CO2. Después de la tinción de la superficie, las células se fijaron y
se permeabilizaron con el kit de solución de permeabilización / fijación Cytofix / Cytoperm
(BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, las células
se tiñeron durante 50 min con anticuerpos contra IL-17A (TC11-18H10.1), IFN-γ (XMG1.2)
y TNF α (MP6-XT22), todos de Biolegend. Las muestras se adquirieron en un LSRII
Fortessa (BD Biosciences) y se analizaron utilizando el software FlowJo v10.6.2 (Becton
Dickinson & Company).
Secuenciación de ARN. Control (n = 3), KO (n = 2), dm (n = 3), ΔC (n = 2) y D164A (n = 3)
se sacrificaron ratones 2d pi y el aislamiento de ARN del epitelio duodenal se realizó como
descrito 53. Brevemente, el duodeno disecado se lavó completamente en PBS helado, luego
se abrió longitudinalmente y se incubó durante 20 min en hielo en tampón de disociación 1
(EDTA 30 mM, DTT 1,5 mM en PBS), seguido de 10 min de incubación en tampón de
disociación 2 (30 mM). EDTA mM en PBS) a 37 ° C con agitación suave. El epitelio se
liberó mediante agitación con vórtex, se sedimentó mediante centrifugación a 4 ° C durante 5
min a 1000 × gy se resuspendió en 500 μl de reactivo TRI (Sigma). El ARN se extrajo
mediante precipitación con fenol-cloroformo. El tratamiento con ADNasa se llevó a cabo con
un kit de eliminación de ADN sin ADN (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. La preparación de la biblioteca se realizó con el kit Illumina TruSeq RNA. La
secuenciación de ARN se realizó en Illumina NextSeq500 por el Functional Genomics Center
Zurich (FGCZ).
Análisis de secuenciación computacional de ARN. La calidad de las
lecturas se verificó con FastQC54. La alineación de lecturas con el
genoma de referencia “Mus_musculus.GRCm38.95” y el recuento de
lecturas se realizó en el marco de trabajo Support Users for SHell
Script Integration (SUSHI )55, con la aplicación RSEMApp. Las
comparaciones por pares se realizaron con la aplicación SUSHI
EdgeRApp (basada en edgeR56). El análisis de componentes
principales y el filtrado de genes expresados diferencialmente
(DEGS, logFC> | 2 |, p <0.01) se realizaron en R (versión 3.6.1). El
paquete pheatmap57 se utilizó para generar el mapa de calor de
FPKM normalizado. Realizamos GSEA19 en genes expresados
significativamente diferencialmente (logFC> | 2 |, p <0.01)
utilizando el paquete Bioconductor fgsea con parámetros
predeterminados58. Los genes se clasificaron según el valor p y
teniendo en cuenta la direccionalidad del cambio de pliegue con la
fórmula ranking = −log10 (P) / sign (log2ratio) (obtenido de la
publicación de blog http: // genomespot.blogspot.co.at/2016
/04/how-to-generate-rank-file-from-gene.html). La colección de
conjuntos de genes Hallmarks de la base de datos de firmas
moleculares59 se importó en R con el paquete msigdbr. El análisis
de enriquecimiento de tipo celular de DEG en todas las condiciones
se realizó en la herramienta basada en web EnrichR60,61
Secuenciación de ARNm unicelular basada en gotas. Los ratones de control (n = 3) y D164A
(n = 3) han sacrificado 0, 2 o 4 días después de la inyección, las criptas se aislaron como se
describe50. Las fracciones de cripta 3 y 4 se combinaron y se disociaron en células
individuales incubándolas con 5 ml de Enzima Triple Express precalentada (ThermoFischer)
en un baño de agua a 37ºC durante 5 min con agitación frecuente. Se inactivó TripLE con
FBS al 50% en Advanced DMEM / F12 (ThermoFischer). Se sedimentaron células
individuales a 180 xg durante 3 min y se resuspendieron en 2 ml de Intesticult frío (Stemcell
Technologies Inc).
Los grumos se disolvieron pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 ml antes
de filtrar dos veces a través de un filtro de 40 μm. La viabilidad y el número de células se
cuantificaron automáticamente con un Countess (Thermo Scientific). El flujo de trabajo de
DropSeq se realizó como se describe62 en un instrumento Nadia (Dolomite Bio). La
secuenciación se realizó en Illumina NovaSeq6000 con un kit de reactivos SP.
Análisis computacional de datos scRNaseq
Reducción de dimensionalidad y agrupamiento. La calidad de las lecturas se verificó con
FastQC. El procesamiento de datos sin procesar de archivos fastq se realizó con el pipeline de
zUMIs63 utilizando el genoma de referencia “Mus_musculus.GRCm38.95”. El análisis de
scRNaseq se realizó con Seurat 3 en R 3.6.164. Las células se filtraron en función del
contenido de genes mitocondriales, los recuentos de identificadores moleculares únicos
(UMI) se normalizaron logarítmicamente de acuerdo con
a la configuración predeterminada de Seurat. El escalado se realizó en los genes variables
(FindVar iableFeatures, parámetros: x.low.cutoff = 0.0125, x.high.cutoff = 3, y.cutoff = 0.5)
regresando el número de UMI y el contenido de genes mitocondriales. Las muestras se
fusionaron y el análisis conjunto se realizó con el paquete conos65. Las células se agruparon
con el método de la comunidad de Leiden (resolución = 1,3). El gráfico conjunto (en el
espacio PCA) se incrustó en el espacio UMAP y se convirtió en un objeto Seurat. Los grupos
de células madre y progenitores tempranos se subconjuntos y los recuentos de UMI
normalizados logarítmicamente se exportaron y se utilizaron para el algoritmo de
normalización y el análisis posterior.
Algoritmo de normalización. El análisis de los datos del curso de tiempo de control reveló
que la pérdida aguda de un alelo de β-catenina solo provocó una regulación a la baja leve y
transitoria de los objetivos de Wnt, la proliferación y los marcadores de tallo, que luego
volvieron a los niveles de expresión normales en 4d pi. Por lo tanto, ideamos una
normalización de los datos del curso temporal de mutantes para desenredar estos efectos de
los inducidos por interacciones N-terminales deterioradas, que fueron el foco de nuestra
investigación. Para cada punto de tiempo (0, 2 y 4d pi), dividimos la expresión de celda única
D164A (de la ranura de datos) de cada
gen por la expresión media del gen correspondiente en el control con la fórmula: En [exp
(D164A) / (mean (exp (control)]. Las tres matrices dispersas D164A normalizadas resultantes
(una por punto de tiempo) se utilizaron para crear objetos Seurat , que se fusionaron,
escalaron y visualizaron en el espacio UMAP usando dimensiones 1:10.
Mapas de difusión y análisis pseudotime. Para mapas de difusión y análisis de pseudotiempo
supervisado, el objeto Seurat normalizado se convirtió en un Experimento de celda única. Los
mapas de difusión se generaron con el paquete Bioconductor destiny66 utilizando parámetros
predeterminados. Las puntuaciones en el componente de difusión 1 se compararon mediante
la prueba de Wilcoxon (alternativa: dos caras) en base R. El análisis de pseudotime
supervisado se realizó con el paquete Bioconductor psupertime29 en todos los genes o solo
en factores de transcripción de ratón, estableciendo la escala en FALSE.
Puntuación y clasificación del ciclo celular. La puntuación del ciclo celular se realizó con el
algoritmo CellCycleScoring de Seurat, utilizando genes relacionados con el ciclo celular de
28. Se utilizó la prueba de Wilcoxon (alternativa: dos caras) para comparar las puntuaciones
de G2M. Para asignar una medida de similitud a los perfiles transcriptómicos de IESC o TA,
entrenamos una regresión logística (modificación de la regresión multinomial de
MatchSCore267) utilizando marcadores IESC y TA extraídos de un conjunto de datos
unicelulares disponibles públicamente32. Al recopilar las probabilidades estimadas de
pertenencia a clases de TA para cada punto de tiempo por separado, comparamos estas
distribuciones de probabilidad y probamos la significancia de la diferencia utilizando la
prueba de Kolmogorov-Smirnov (alternativa: bilateral).
Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. Usamos la
función Seurat FindMarkers (parámetros predeterminados min.pct
0.25 y logfc.threshold 0.25) para calcular genes expresados
diferencialmente entre puntos de tiempo en nuestra célula madre
D164A normalizada y conjunto de datos de progenitores tempranos.
Luego clasificamos los genes con la fórmula ranking = −log10
(p_val_adj) / sign (avg_logFC) y realizamos GSEA19,59 en R usando el
paquete Bio conductor fgsea con parámetros predeterminados58.
Las siguientes colecciones de conjuntos de genes se importaron en
R con el paquete msigdbr: Hallmarks59, Perturbaciones químicas y
genéticas (diversas contribuciones), KEGG68,69 y proceso biológico
de ontología genética70. Los gráficos se generaron con el paquete
R ggplot271.
ATAC-Seq. Se sacrificaron ratones de control (n = 3) y D164A (n = 3) 2d pi y se procesaron
de forma independiente para la preparación de la biblioteca ATACSeq, siguiendo el
protocolo de72. Brevemente, se realizó una suspensión unicelular de criptas duodenales como
para scRNAseq, lo que asegura una contaminación prácticamente ausente de células no
epiteliales. Se lisaron 50.000 células en 50 µl de tampón de lisis frío (Tris-HCl 10 mM, pH
7,4, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, IGEPAL CA-630 al 0,1%). Después de la centrifugación a
500 × g durante 10 min a 4 ° C, las células se resuspendieron en 50 ml de mezcla de
transposición Illumina 1X (25 ul de tampón de ADN Tagment, 2,5 ul de enzima de ADN
Tagment, 22,5 μl de H2O sin nucleasa) y se incubaron durante 30 min a 37 ° C en una
coctelera. Inmediatamente después de la reacción en posición trans, el ADN se purificó
utilizando el kit de purificación QIAgen MinElute PCR Purification Kit de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. La biblioteca se amplificó con cebadores de secuenciación de
Nextera en la mezcla maestra de PCR NEBNext Hot Start High-Fidelity 2X durante 5 ciclos.
El número apropiado de ciclos de PCR adicionales se determinó mediante qPCR. Las
bibliotecas amplificadas se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR QIAgen
MinElute. El ADN se eluyó en 20 ml de tampón EB y se cuantificó y visualizó para el control
de calidad con un 2200 TapeStation System (Agilent). Las bibliotecas se secuenciaron en un
Illumina HiSeq2500 con una configuración de lectura de 70 pb de extremo emparejado.
Análisis computacional ATAC-Seq. La calidad de las lecturas se verificó con FastQC.
Adaptadores recortados con cutadapt, alineación en GRCh38.95 usando Bowtie2 con
parámetros de mapeo predeterminados73, así como filtrado duplicado con Picard y llamada
de picos con MACS2 (p <0.01) se realizaron en la tubería ENCODE74 con el apoyo de la
aplicación SUSHI AtacENCODEApp, para cada replicar biológicos por separado. Los
archivos de picos se fusionaron en BEDtools v2.29.275 y se convirtieron en una anotación
segura, a la que se asignaron lecturas sin procesar con la función FeatureCounts en el paquete
rsubread76. La matriz de recuento resultante se filtró en busca de picos con baja cobertura
(recuento de lectura mínimo de 10 para cada muestra). Los recuentos restantes se
normalizaron luego por el tamaño total de la biblioteca y los factores de normalización
derivados de TMM

14 COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | (2021) 12: 1368 |

https://doi.org/10.1038/s41467-021-21591-9 | www.nature.com/naturecommunications
COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | https://doi.org/10.1038/s41467-021-21591-
9 ARTÍCULO

calculado con edgeR56. Los picos diferenciales entre los grupos de

muestras se identificaron utilizando la función de prueba exacta
en edgeR. Solo los picos con un cambio logarítmico> 1 y un valor de
p <0,01 se consideraron accesibles diferencialmente para un
análisis adicional. Se utilizó HOMER39 para la anotación de picos y
el análisis de enriquecimiento de motivos. Los motivos con valor q
corregido por Benjamini <0,001 se consideraron enriquecidos
significativamente. Los archivos de control bigWig (n = 3) y D164A
(n = 3) se combinaron en una sola pista para su visualización en
Integrative Genomics Viewer (IGV) 77. Los genes asociados con un
pico de acceso diferencial se clasificaron con la clasificación de
fórmula = −log10 (valor P) / signo (log2FC) y se utilizaron para
GSEA con la R utilizando el paquete de bioconductores fgsea con
parámetros predeterminados58. La importancia de la superposición
entre conjuntos de genes sobrerrepresentados en scRNAseq y en
ATACSeq se cuantificó con una prueba hipergeométrica. Los
gráficos se generaron con el paquete R ggplot271.
Análisis estadístico. El análisis estadístico y la visualización se realizaron utilizando R
(Versión 3.6.0, R Foundation for Statistical Computing Viena, Austria), R Studio y Prism
8.2.0. Las pruebas de significación estadística se realizaron como se describe en la leyenda de
cada figura. A menos que se indique lo contrario, todas las pruebas fueron significativas con
un valor de p <0,05. Los valores de p> 0,05 se definieron como no significativos y no se
presentan en los gráficos. Los valores de p proporcionados se ajustaron para múltiples
hipótesis de prueba de acuerdo con el método estadístico particular mencionado en la leyenda
de la figura y en la parte correspondiente que describe el análisis computacional.
Resumen de informes. Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en
el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.