INTRODUCCION

Las caseínas son un conjunto heterogéneo de proteínas por lo que es difícil

fijar una definición. Sin embargo, todas las proteínas englobadas en lo que se
denomina caseína tienen una característica común: precipitan cuando se
acidifica la leche a pH 4,6. Por ello, a la caseína también se le suele denominar
proteína insoluble de la leche. Por otra parte, y aunque las proteínas que se
denominan caseínas son específicas de cada especie, se clasifican en los
siguientes grandes grupos de acuerdo con su movilidad electroforética: αs1-
caseína, αs2-caseína, β-caseína y κ-caseína (véase la Figura 1). Esta última es
de especial interés en la industria quesera, ya que su hidrólisis enzimáticas por
la renina genera una nueva proteína, denominada para-κ-caseína. Cuando está
última reacciona con el calcio genera paracaseína de calcio. Durante el
proceso de maduración del queso, y a partir de la para-κ-caseína, se forman
unos macropéptidos denominados γ-caseínas, responsables de las
características reológicas y organolépticas de los quesos. La producción de
acido láctico a partir de la bacterias transforman la lactosa y se desnaturaliza la
caseína cuando el ph llega al "punto isoeléctrico" 4.6 El punto isoeléctrico es el
pH al que una sustancia anfótera tiene carga neta cero. El concepto es
particularmente interesante en los aminoácidos y también en las proteínas. A
este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula.
Las moléculas complejas, tales como las proteínas, se combinan con los iones
hidrógeno y con otros iones presentes en la disolución, dando lugar a la carga
neta de la molécula. A la concentración de iones hidrógeno, o al pH, para el
cual la concentración del ion híbrido de una proteína es máxima y el
movimiento neto de las moléculas de soluto en un campo eléctrico es
prácticamente nulo, se lé denomina punto isoeléctrico. Sustancias
isoeletronicas: Son átomos o iones que poseen el mismo número de electrones
e igual configuración electrónica.

http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practi
ca3FQB.pdf

OBJETIVOS

 El estudiante identificará el pH isoeléctrico de la caseína

 El objetivo fundamental de esta práctica es la determinación del punto
isoeléctrico de la caseína una vez extraída esta mediante procedimiento
químico de la leche entera liquida.
 Realizar la extracción de la caseína de la leche y verificar su naturaleza
proteica.
 MARCO TEORICO

A diferencia de muchas otras proteínas, incluso de la leche, las caseínas no

precipitan por acción del calor. Por el contrario, precipita por la acción de una
enzima proteasa presente en el estómago de los mamíferos llamada renina y
forma un precipitado denominado paracaseína. Si la precipitación se realiza por
la acción de ácidos, se le llama caseína ácida. En la elaboración de los quesos
tienen lugar ambos tipos de precipitaciones.

Cuando se emplea la enzima tripsina, la caseína se hidroliza a una molécula

fosfatada llamado peptona.

Las características de las caseínas de la leche de vaca se resumen en la tabla

2. La secuencia aminoacídica (ver Figura 2) de la caseína contiene un número
inusual de residuos del aminoácido prolina: entre 10 en la αs2-caseína y 35 en
la β-caseína. Como resultado, las caseínas son relativamente hidrofóbicas
(poco soluble en agua) y carecen de estructura secundaria o terciaria bien
definidas. En la leche se encuentra como suspensión de partículas que
asemeja a las micelas de surfactantes (pequeñas esferas hidrofílicas en el
exterior e hidrofóbicas en el interior). Estas micelas de caseína se estabilizan
por iones de calcio e interacciones hidrofóbicas.

Otro dato interesante, utilizado para separar las caseínas del resto de las
proteínas lácteas mediante su precipitación, es que su punto isoeléctrico (pI)
promedio es de 4,6. A este pH, las caseínas se encuentra en su punto de
menor solubilidad debido a la reducción de las repulsiones intermoleculares,
por lo que precipitan (vulgarmente se dice que coagulan). Ahora bien, el pI es
diferente para cada una de las fracciones caseínicas, ya que varía entre el
4,44-4.97 para la αs1-caseína y el 5,3-5,8 en la variante genética B de la κ-
caseína. Además de usarse directamente en la elaboración de productos
alimentarios (derivados lácteos y cárnicos, panes y productos de repostería,
etc.), la caseína se utiliza en la elaboración de productos no alimentarios:
pegamentos y pinturas, cubiertas protectoras, plásticos (véase la tabla 3). Otros
usos tecnológicos son la clarificación de vinos o como ingrediente en
preparados de biología molecular y microbiología (medios enriquecidos para el
cultivo microbiano).

En la alimentación especial, la caseína sirve para la elaboración de preparados

médicos y concentrados proteicos destinados a la alimentación de los
deportistas, especialmente después de su entrenamiento. Así, se ha observado
que la digestión de las caseínas es más lenta que la de las lactoproteínas
solubles (también denominadas seroproteínas) y, por ello, más apropiada para
reparar el anabolismo de los aminoácidos durante el período que sigue a una
comida. http://es.wikipedia.org/wiki/Case%C3%ADna

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

MATERIALES Y REACTIVOS

- Diez beaker de 25 ml - Termómetro

- Dos beaker de 50 ml
- Un beaker de 250 ml
- Probeta de 50 ml
- Matraz aforado de 50 ml
- pipeta graduada de 5,0 ml
- pipeta graduada de 1,0 ml
- pipeta graduada de 10,0 ml
- Embudo de vidrio mediano
- Papel de filtro
- Reactivos por grupo:
- Agua destilada
- Acetato sódico 0,1 N
- Ácido acético 0,01 N
- Ácido acético 0,1 N
- Ácido acético 1,0 N
- NaOH 1N
- Éter etílico
- Etanol al 70%

MATERIALES Y REACTIVOS DE USO GENERAL:

- Soluciones buffer pH 4,0 y 7,0 para calibrar el potenciómetro

- Potenciómetro (pH-metro)
- Leche entera corriente (1 litro).

Metodología

A. Aislamiento de la caseína:

- Caliente en un beaker de 150 ml de agua destilada a 38ºC, añada 50ml

de Leche y luego gota a gota y con agitación, adicione ácido acético 1M hasta
que observe que se forma un precipitado (la leche se corta).
- Deje sedimentar y filtre sobre papel de filtro usando un embudo de
cristal.
- Lave el precipitado con 20 ml de etanol en el mismo filtro.
- Seque el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro.
- Coloque el precipitado en un beaker pequeño previamente pesado,
vuelva a pesar el beaker con el precipitado y luego adicione 5ml/g de éter
etílico.
- Filtre nuevamente.
- Deseche el líquido quedando un precipitado blanco de fácil manipulación
que es la caseína.

B. Preparación de la solución de caseína:

- Coloque aproximadamente 500 mg de caseína en un beaker de 50ml.

- Agregue 40 ml de agua destilada y 10 ml de NaOH 1N; agite hasta lograr una
solución total de la caseína.
- Una vez disuelta la caseína, se vierte en un matraz aforado de 50 ml, adicione
5 ml de Ácido acético 1N y diluya con agua destilada hasta 100 ml y mezcle
bien.
- La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar.

C. Determinación de pi de la caseína:

En diez beaker de 25 ml limpios y secos adicione exactamente los volúmenes

de los reactivos según la siguiente tabla.

TABLA DE DISOLUCIONES

TUBO Acetato 0.1N Acético 0.1N Acético 0.01 N pH

resultante (aprox.)
1 0.5 9.5 - 3.2
2 1 9 - 3.6
3 1.5 8.5 - 3.8
4 2 8 - 4
5 3 7 - 4.2
6 4 6 - 4.5
7 6 4 - 4.7
8 8 2 - 5.1
9 6 - 4 5.5
10 8 - 2 6.1

Medir experimentalmente el ph de todos los vasos, que debe cubrir un rango

Aproximado semejante al teórico (3 a 6,5). Anotar los valores reales en la tabla,
que deben ser semejantes a los expresados y en todo caso creciente.
- añadir 1 ml de disolución de caseína a cada tubo.
- agitar suavemente cada uno y esperar aproximadamente 3 minutos.
- medir la absorbencia de cada muestra a 640 nm con las cubetas de
colorimetría de 1cm de paso óptico, teniendo la precaución de agitar bien el
contenido de cada tubo para obtener una solución / suspensión homogénea
antes de verter una parte en la cubeta.
- anotar resultados, representar la absorbencia frente al pH, y determinar el pi
Aproximado de la caseína.
 RESULTADO

TABLA DE DISOLUCIONES

TUBO Acetato 0.1N Acético 0.1N Acético 0.01 N pH resultante (aprox.)

nm

1 0.5 9.5 - 3.2 3.30 0.209

2 1 9 - 3.6 3.58 0.55

3 1.5 8.5 - 3.8 3.64 0.244

4 2 8 - 4 3.89 0.185

5 3 7 - 4.2 4.06 0.255

6 4 6 - 4.5 4.28 0.274

7 6 4 - 4.7 4.63 0.303

8 8 2 - 5.1 4.87 0.232

9 6 - 4 5.5 5.62 0.338

10 8 - 2 6.1 6.08 0.150

 GRAFICAS

PH ABSORCION (NM)

3,3 0,209

3,58 0,53

3,64 0,244

3,87 0,185

4,06 0,255

4,28 0,274

4,63 0,303

4,87 0,232

5,62 0,338
6,08 0,15

RELACION DE PH vsABSORCION

0,6

0,5

0,4
ABSORCION

0,3

0,2

0,1

0
0 2 4 6 8
PH (nm)
Grafica 1: Relación De PH Vs Absorción
 ABSORCION PH
( NM ) (X) (Y)

0,209 3,3
0,53 3,58
0,244 3,64
0,185 3,87
0,255 4,06
0,274 4,28
0,303 4,63

0,232 4,87

0,338 5,62

0,15 6,08

RELACION DE ABSORCION vs PH

7
6
5
4
PH(nm)

3
2
1
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
ABSORCION

Grafica 2: Relación De Absorción Vs PH

 ANALISIS DE RESULTADO

El pH isoeléctrico (baja solubilidad, carga neta igual a 0) debe recordarse

cuando se investiga sobre la separación y purificación de fracciones proteicas.
Existen varios métodos para la determinación experimental del pH isoeléctrico
(pHI) de una proteína. En esta determinación el pH donde se presenta la
mínima solubilidad puede ser usado para estimar el pH isoeléctrico de la
caseína.
La caseína está presente en la leche en forma de partículas coloidales o
micelas y son fácilmente separadas por precipitación isoeléctrica. El cuajado y
la acidificación son una práctica de la tecnología de lácteos para la preparación
de productos de leche agria y algunos quesos suaves. La acidificación natural
se lleva a cabos por inoculación de la leche con iniciadores por ejemplo,
cultivos de bacterias ácidos lácticos.
En la extracción de la leche se puede considerar unos diferentes tipos de
proteínas, como la caseína, lacto albumina, lacto globulinas. Todas globulares.
La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se
separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las
fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a
una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los
grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina
y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica
(caseinato cálcico). La caseína representa cerca del 77% al 82% de las
proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de la leche líquida.

http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practi
ca3FQB.pdf

CONCLUSION

 La caseína es una proteína exclusiva de la leche que aporta

aminoácidos esenciales. Son las proteínas de la leche justamente lo que
le da a este alimento su valor nutricional.
 No existe leche sin las suficientes proteínas: para que un producto sea
realmente leche debe contener un mínimo de 30 gramaos por litro de las
proteínas que le son propias. De esos 30 gramos de proteínas, al menos
70 por ciento deben ser caseína.

 Así la verdadera leche tiene un mínimo de 30 gramos por litro de sus

proteínas, pero la fórmula láctea puede tener sólo 22 gramos por litro de
proteína de la leche, de los cuales 15.4 gramos por litro debe
corresponder a la caseína.
  La manipulación de los componentes de la leche juega un papel
importante a nivel industrial, tal como la caseína que es muy utilizado a
nivel industrial para fabricar cosas como pegamento. Pero también es de
vital importancia en la dieta humana ya que nos proporciona gran
cantidad de nutrientes y vitaminas.

BIBLIOGRAFIA

 http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Pract
ica3FQB.pdf
 http://es.wikipedia.org/wiki/Case%C3%ADna

 http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Pract
ica3FQB.pdf
 http://www.fortunecity.com/littleitaly/siena/600/fisiclec.htm

CUESTIONARIO
1. Composición de la leche y los distintos tipos de leche

R/.. Composición de leche: La leche animal se componen principalmente de

agua (80-90%) en la que se encuentran disueltas o en suspensión las
proteínas, la lactosa (azúcar de la leche), los minerales y las vitaminas
hidrosolubles (diagrama 2.1). La grasa de la leche está en emulsión y se
encuentra distribuida en el líquido a manera de glóbulos que pueden unirse
unos a otros formando una capa de crema cuando la leche fresca se deja en
reposo.

Tipos de leche: de cabra, yegua, oveja, doncella (pez), burra, materna,

2. Consultar la composición de las proteínas presentes en la leche

R/.. El sistema proteínico de la leche

Las caseínas (fosfoproteínas) representan el 80% de las proteínas de la
leche de vaca; el resto está constituido por Beta-lactoglobulina (alrededor del
10% de las proteínas totales), Alfa-lactoalbúmina (en torno al 2% de las
proteínas totales) y pequeñas cantidades de diversas proteínas (enzimas,
inmunoglobulinas, etc.)
Cuando se coagulan las caseínas, quedan en solución las otras proteínas;
conjuntamente con la lactosa y sales minerales para constituir el llamado
lactosuero.
La fracción caseínicas.
Comprende varios tipos de moléculas de las cuales el 50%
aproximadamente es de alfa-caseínas, 30% de beta-caseína, 15% de k-
caseína y 5% de gama-caseína. Estos compuestos pueden separarse por
ultra centrifugación, la fracción caseínicas total se precipita por descenso del
pH de la leche hasta 4,7 aproximadamente.
A pH 7 y aisladamente, la alfa-caseína está bajo la forma de pequeños
polímeros, la beta-caseína al estado de monómero y la k-caseína al estado
de polímeros mayores.
A pH 7 y 37°C, el agregado de iones Ca++ no afecta a la k-caseína, en
cambio la beta-caseína precipita y la alfa-caseína coagula. Los complejos de
alfa y k se asocian con la caseína para formar micelas.
Durante el cuajado de la leche, el cuajo ataca a la caseína k, escindiendo el
enlace peptídico fenilalanina-metionina. La paracaseína k así formada ya no
estabiliza más el complejo con la caseína alfa, y en presencia de calcio, los
conjuntos micelares coagulan, formando un gel, la cuajada, que expulsa al
líquido llamado lactosuero, por sinéresis.
La velocidad de coagulación y sinéresis aumentan cuanto mayor sean los
contenidos de caseínas, calcio y acidez de la leche. 
Beta-lactoglobulina
No se encuentra en la leche humana. Es la proteína más abundante en el
lacto suero de la leche de vaca.
La composición en aminoácidos es bien conocida y se sabe que hay por lo
menos 4 variantes genéticas, que se distinguen por la sustitución de ciertos
aminoácidos en la cadena proteica.
Incide en los tratamientos tecnológicos de la leche, en efecto, su
desnaturalización por calentamiento reduce el riesgo de coagulación de la
leche durante la esterilización.
Alfa-lactoalbúmina
Es una de las proteínas del sistema lactosa-sintetiza, presente en las células
de las glándulas mamarias.
En conjunto provocan la unión de la glucosa con la galactosa, asegurando la
síntesis de la lactosa.
Es insoluble a pH entre 4 y 5,5, a un lado y a otro lado de esta zona, la
molécula sufre modificaciones de conformación, rápida o lenta, reversibles o
no, que conducen a diversas formas polimerizadas.

3. PH inicial de la leche
R/…El pH inicial de la está en un alrededor de 6.5

4. Cuál es la función del etanol en la leche

R/… El etanol al igual que otros alcoholes puede actuar en las membranas
biológicas fundamentalmente de 3 formas 1) alterando la fluidez de las
membranas, lo que indirectamente afectaría el funcionamiento de las proteínas
como enzimas y canales; 2) produciendo una deshidratación a nivel de las
membranas; 3) interactuando directamente con las proteínas de la membrana.
Los efectos del etanol en las membranas biológicas podrían explicar en parte,
los efectos generalizados del etanol.

5. Que procedimiento existe para extraer el agua de snl precipitada (filtro y

embudo)

R/… Por evaporación del agua utilizando calor, secando los productos
mecánicamente, como en la producción de leche en polvo, utilizando
secadoras a rodillo o atomizadores. Secando los productos al sol o al aire libre,
como en el caso de la elaboración de quesos o la extracción de la caseína de
la leche (proteína de la leche).

6. Que métodos hay para filtrar caseína.

 El microfiltrado. Aquí se pueden separar componentes pesados de la
leche. La grasa, por ejemplo, puede ser removida usando un tamaño de poro
que restringe solamente la crema de la leche, dejando pasar a la leche
descremada. Puede utilizarse también un tamaño de poro aún menor para
permitir la separación de la caseína del suero de la leche. Luego llegamos al
ultrafiltrado, en el cual se retienen todos los componentes grandes de la leche,
proteínas y grasas, pero permitiendo pasar lacrosa, agua y minerales. Es aquí
donde, con el agregado de agua, o diafiltración, se puede lavar aún más
lactosa de la leche. Las siguientes membranas utilizadas en el procesamiento
lácteo son de Nanofiltrado. Estas membranas retienen todos los componentes
exceptuando sales y agua. Por último, también se utilizan membranas de
ósmosis inversa. Esta membrana permite solamente el pasaje de agua,
actuando entonces puramente como concéntrate.
 El filtrado por membranas cross-flow ha abierto las puertas para una
gran variedad de innovadores productos lácteos. No hace falta mirar atrás
demasiado lejos hacia los días en los que separadores mecánicos eran la única
vía de cosechar un componente de la leche. Hoy, no solo puede separarse la
crema; prácticamente todo componente mayor de la leche puede separarse por
membranas de filtro. La tecnología de filtrado por membrana ha obtenido
rápidamente prominencia en el procesamiento de ingredientes lácteos. El
Microfiltrado, Ultrafiltrado, Nanofiltrado y la Ósmosis inversa hacen posible la
producción de productos con propiedades y funcionalidades únicas.

7. Por que el sobrenadante (suero dulce) es de color amarillo.

Las proteínas que aparecen en el sobrenadante de la leche después de la
precipitación a pH 4.6 se llaman proteínas del suero colectivamente. Estos
proteínas globulares son más solubles en agua que las caseínas y son objeto
de desnaturalización por el calor. Las proteínas del suero nativas tienen buen
poder gelificante. La desnaturalización aumenta su capacidad de retención de
agua.

Las principales fracciones son ß-lactoglobulinas, alfa-lactoalbúmina, albúmina

sérica bovina e inmunoglobulinas (Ig). ß -Lactoglobulinas: (pm - 18,000) Este
grupo, incluyendo ocho variantes genéticas, comprende aproximadamente la
mitad de las proteínas del suero totales. Tiene dos enlaces bisulfuro y un grupo
tiol libre. El punto isoeléctrico (pH 3.5 a 5.2), los dímeros se asocian más allá
de octameros pero por pH debajo de 3.4, ellos se disocian a monómeros. Alfa-
Lactalbumins: (pm-14,00). Estas proteínas contienen ocho grupos cisteína,
todos involucraron enlaces disulfuro, y cuatro residuos de triptófano. La
desnaturalización térmica y pH <4.0 resultan en la perdida de calcio.

http://www.fortunecity.com/littleitaly/siena/600/fisiclec.htm

8. Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína.

El punto Isoeléctrico (o pH isoeléctrico) de la caseína es 4.6. A este pH, la

caseína se encuentra en su punto de menos solubilidad, debido a que hay
menos repulsiones intermoleculares, por lo que precipita. El precipitado es de
color blanco parecido a queso cottage el cual como la mayoría de quesos está
compuesto por este.

9. Por que las proteínas tienen solubilidad mínima en el pl.

El pH del medio afecta la solubilidad de las proteínas, puesto que cuando es

igual al pi de las proteínas esta pierde su carga eléctrica neta y con ello su
solubilidad, llegándose a precipitar en algunos casos.
El pi de una proteína puede determinarse, registrándose experimentalmente
valores de absorbancia de solución a distinto ph s.
El pi depende de la fuerza iónica y del tipo de ion…. fi= ½ ∑ci. zi 2 → carga
iónica.
AISLAMIENTO DE LA CASEÍNA Y DETERMINACIÓN DEL PUNTO
ISOELECTRICO

WILLIAM CONTRERAS GARAVITO

DANIEL AMELL JIMÉNEZ
ADER NUÑEZ ORTEGA
DR. RUBEN JARAMILLO

UNIVERSIDAD DE SUCRE
EDUCACION Y CIENCIA
BIOLOGIA
BIOQUIMICA
OCTUBRE-27-2008