DAÑO ENDOTELIAL EN ISQUEMIA PROLONGADA

En condiciones normales las células endoteliales se encuentran continuamente

reconociendo y respondiendo en forma activa frente a los cambios que ocurren en
el ambiente extracelular local, como sucede en presencia de bacteremia, trauma,
isquemia- reperfusión, etc. En otras palabras, la activación de la célula endotelial
se produce como respuesta adaptativa normal y la forma de presentación y
duración de ésta dependerá del tipo de estímulo, sitio donde se desarrolla y
momento en que ocurre su activación dentro del sistema circulatorio.

Las células endoteliales forman una monocapa que recubre el interior de la pared
vascular en contacto directo con las células de la sangre. El endotelio es
considerado un órgano que en los últimos años ha adquirido una gran relevancia
para comprender e incluso tratar patologías cardiovasculares como la
hipertensión, arteriosclerosis, hipercolesterolemia, menopausia, diabetes etc.
Probablemente en 1980 cuando Furchgott y Zawdzki1 descubrieron la existencia
de un factor difusible desde el endotelio que tenía capacidad vasorrelajadora y,
posteriormente, el Dr. Salvador Moncada2 identificó este factor como el óxido
nítrico (NO) dedujeron la importancia que iba a alcanzar el estudio del NO en la
fisiopatología cardiovascular. El NO se forma en el endotelio mediante la
conversión metabólica de L-arginina en Lcitrulina, reacción que está catalizada por
la enzima NO sintasa endotelial (NOSe)2 . El NO liberado por el NOSe es el
responsable de la vasorrelajación endotelio dependiente a través de la guanilato
ciclasa soluble, enzima localizada en las células del músculo liso vascular y que
genera GMP cíclico. El NO no sólo tiene importancia en la regulación del tono
vascular, ya que reduce también el grado de activación de plaquetas y leucocitos
impidiendo su agregación y adhesión a la pared del vaso.

la falta de relajación a través del sistema NO/GMPc se ha definido como

disfunción endotelial. La disfunción endotelial se ha detectado en prácticamente
todas las patologías de origen cardiovascular. La disfunción del endotelio existe no
solo cuando las manifestaciones clínicas de la patología cardiovascular son
evidentes, sino también ocurre incluso antes de que se pueda detectar daño
vascular por cualquier técnica de imagen.

El óxido nítrico (·NO). El ·NO se forma a partir de L-arginina por la acción de las
NOS, incluyendo una isoforma inducible que se expresa principalmente bajo
condiciones patológicas (iNOS o NOS2), y dos constitutivas, la eNOS (NOS3) y
nNOS (NOS1) que se expresan en el endotelio y en el sistema nervioso,
respectivamente17. El ·NO cumple múltiples funciones fisiológicas y patológicas
como mediador intra e intercelular en procesos de inmunomodulación,
neurotransmisión y regulación del tono vascular
  La isquemia: es decir el déficit de flujo sanguíneo tisular, resulta en un daño
celular reversible en la medida que se restablezca la reperfusión a tiempo.
Aunque la restauración del flujo sanguíneo a un órgano isquémico es
esencial para prevenir el daño celular irreversible, la reperfusión (la
restauración del flujo sanguíneo luego de un período de isquemia) per se
puede aumentar la injuria tisular en exceso a aquélla producida solamente
por la isquemia. Esto se denomina njuria por isquemia reperfusión es decir
el daño celular luego de la reperfusión de tejidos isquémicos, previamente
viables, colocando a los órganos en un riesgo mayor de necrosis celular y
por ende limitando la recuperación de la función.

El reconocimiento de que la disfunción micro vascular es un factor temprano y

determinante en la patogénesis de la injuria por I/R ha orientado los esfuerzos
para caracterizar completamente las alteraciones vasculares asociadas con I/R y
para definir los mecanismos que provocan esta patología

Respuestas microvasculares locales a la Isquemia/Reperfusión

La isquemia prolongada provoca cambios metabólicos y estructurales:

 Disminuye la fosforilación oxidativa, consumiendo el ATP existente y

fallando en la resíntesis del mismo y de fosfocreatina (fosfatos de alta
energía)
 Altera la función de las bombas iónicas de membrana, dependientes de
ATP, distorsionando la distribución iónica, favoreciendo la entrada de Ca++,
Na+ y Agua dentro de la célula
 Altera el potencial de membrana
 Incrementa el volumen intracelular
 Disminuye la fluidez de la membrana
 Empeora la organización citoesquelética de las células endoteliales

Existen numerosas situaciones en las que pueden ocurrir isquemia de un órgano,

con falta o disminución del flujo sanguíneo y del aporte de O2 y nutrientes al
órgano. El daño por IR es un fenómeno de acentuación del daño celular en un
órgano isquémico después del reestablecimiento del flujo de O2. El conocimiento
de los mecanismos del daño en IR es de gran interés, ya que participan en la
fisiopatología de varias situaciones clínicas como el infarto miocárdico, accidente
cerebrovascular, traumatismos mayores, algunas cirugías y shock de diverso
origen2. En el hígado, el daño por IR está asociado al trasplante, cirugía hepática
resectiva o de reconstrucción vascular y trauma
En condiciones de isquemia prolongada ocurren cambios funcionales que
incluyen: i) la disminución de la fosforilación oxidativa y de las bombas de
membrana dependientes de ATP, con la consiguiente entrada de calcio, sodio y
agua a la célula; ii) el catabolismo del ATP que lleva a la acumulación de
hipoxantina con generación de especies reactivas del O2 (EROS) con la reentrada
del O2; iii) la promoción de la expresión de productos génicos proinflamatorios
(moléculas de adhesión de leucocitos, citoquinas) y agentes bioactivos
(endotelina, tromboxano A2) a nivel endotelial; y iv) la represión de los productos
de algunos genes protectores [óxido nítrico sintasa (NOS) constitutiva,
trombomodulina] y agentes bioactivos [prostaciclina, óxido nítrico (·NO)]. Así, la
isquemia induce un estado proinflamatorio que aumenta la vulnerabilidad del tejido
durante la reperfusión.

Uno de los primeros factores implicados en la patogenia de la lesión por IR fue el

nivel de Ca+2, ya que él se acumula en los tejidos postisquémicos y el uso de
bloqueadores de los canales de Ca+2 disminuye la lesión7. El mecanismo a través
del cual se relaciona el aumento del Ca+2 intracelular con el daño, involucra tanto
la activación de enzimas hidrolíticas dependientes de Ca+2 (fosfolipasas,
proteasas, nucleasas), como el desacoplamiento de la fosforilación oxidativa
mitocondrial con la consecuente disminución del nivel de ATP.

Durante el periodo isquémico (hipóxico) las células endoteliales sufren

alteraciones en el potencial de membrana y en la distribución de iones, se
incrementa el volumen intracelular, la membrana pierde fluidez, y se desorganiza
el citoesqueleto (Fig. 2). Al mismo tiempo se agotan las reservas energéticas,
disminuye la producción de algunos agentes bioactivos como la prostaciclina o el
óxido nítrico (NO), y se incrementa la de otros como la endotelina o el tromboxano
A223 Algunos genes se inducen, en especial los mediadores de la inflamación
como las moléculas de adhesión celular endotelial (ECAM) e intercelular (ICAM-l)
y citokinas, mientras que otros se inhiben, como la NO sintetasa o la
trornbornodulina". En la fase postisquémica, es decir, con la reperfusión, muchos
de estos cambios se exacerban, aunque los cambios morfológicos tardan en
aparecer". Éstos sólo se hacen evidentes tras una isquemia prolongada, y
consisten en edema celular, separación de las células endoteliales de sus
membranas basales, y adhesión de leucocitos activados, especialmente
neutrófilos, a la superficie de las células endoteliales". A una escala bioquímica la
reperfusión induce un incremento en la producción de metabolitos oxigenados
reactivos (radicales libres y derivados) y una disminución en la de NO, con
pésimas implicaciones para el tejido. La principal consecuencia funcional de la
reperfusión en las arteriolas es un fracaso en la relajación mediada por NO de la
musculatura lisa29 Parece que esta incapacidad se debe a una inactivación del
NO por el radical superóxido (véase más adelante), que se produce en grandes
cantidades por los leucocitos activados y adheridos; esta incapacidad puede ser
superada experimentalmente mediante el uso de antioxidantes. En cuanto a los
capilares, las principales alteraciones durante la reperfusión consisten en un
incremento de la filtración de líquido hacia el intersticio debida a una mayor
conductividad hidráulica, y una reducción en el número de capilares perfundidos
como consecuencia de una disminución de la luz capilar provocada por una
combinación de edema de las células capilares, de la presión de los leucocitos
adheridos con o sin plaquetas, y del acúmulo de líquido intersticial, Sin embargo,
la mayor parte de las disfunciones de origen inflamatorio tienen lugar en las
vénulas. Su respuesta a la reperfusión se caracteriza principalmente por
adhesiones de leucocitos al endotelio y su migración transendotelial, agregación
de plaquetas-leucocitos, activación de mastocitos y macrófagos, extravasación de
albúmina, y sobre todo, superproducción de moléculas oxidantes. La gran
proliferación de

eucocitos tiene como origen la síntesis de moléculas de adhesión en las células

endoteliales, especialmente la selectina P y la molécula de adhesión intercelular o
ICAM-l31• La superproducción de oxidantes tiene su razón en un origen doble: las
células endoteliales y los leucocitos". Las primeras generan radicales tras los
primeros minutos de la reperfusión, mientras que los leucocitos adherentes lo
hacen posteriormente. Esta producción tiene su origen principal en la enzima
xantina oxidasa, que durante la hipoxia ha cambiado su función de xantina
deshidrogenasa NAD-reductora (es decir, que cede electrones al NAD+) a xantina
oxidasa o; reductora (es decir, que cede electrones al oxígeno molecular). Durante
la isquemia, el consumo y agotamiento de los niveles de ATP provoca la
acumulación de catabolitos de las purinas, como la hipoxantina y xantina. Con la
reperfusión e influjo de O2, la xantina oxidasa meta balizará rápidamente esos
catabolitos a la vez que reduce el O2, provocando así la hiperproducción de
radical superóxido y su derivado, el peróxido de hidrógeno. El descenso en ATP
también provocará el incremento en la concentración intracelular libre de calcio y
hierro (por movilización de ferritina tras los cambios en el potencial de membrana),
que participará activamente en la formación de nuevos radicales libres y en la
activación Cada dependiente de proteasas que van a convertir la xantina
deshidrogenasa en xantina oxidase".

Daño por reperfusion

Un complejo HIF contiene una subunidad reguladora alfa y una subunidad

constitutiva beta, que pertenecen a la familia de los factores de transcripción
bHLH/PAS (proteínas que contienen además del dominio bHLH (por “basic
helixloop helix”), un dominio PAS (por “Per Arnt Sim”). La subunidad beta es
constitutiva y está asimismo implicada en la respuesta a los xenobióticos que se
acompaña de una heterodimerización con el receptor intracelular AhR (Aryl
hydrocarbon Receptor). La subunidad alfa es regulada por el oxígeno. Tres genes
distintos, que codifican la subunidad HIF-alfa, han sido identificados en los
mamíferos: HIF1α, HIF-2α (también llamado EPAS1) y HIF-3α cuyos transcritos
ha sido llamado IPAS, por inhibitory PAS protein (proteína inhibidora a dominio
PAS). Nuestro conocimiento de HIF-3α , del cual existen varias variantes de
episaje que, en algunos, pueden tener una actividad inhibidora sobre la respuesta
de HIF, es limitada. Como regla general, los cultivos celulares expresan ambos
genes HIF-1α e HIF-2α. Es de hacer notar que la regulación se opera
esencialmente por medio de la estabilización de las proteínas HIFα, de suerte que
es posible determinar el grado de activación de HIF a partir de la cantidad de HIF-
1α y de HIF-2α detectada por immunoblotting o por análisis inmunoquímico. En la
rata, se ha constatado que existe en los tejidos in situ, a escala celular, una
expresión predominante del gen HIF-1α o del gen HIF-2α. Estudios de inactivación
génica (“Knockout”) han establecido, en la rata, que la redundancia funcional entre
estas subunidades es limitada; la inactivación de una o de otra posee efectos
severos sobre el desarrollo embrionario. A nivel de la célula, HIF-1 y HIF-2
modifican de manera diferente la expresión de los genes aún cuando este proceso
no esté todavía completamente dilucidado.

La EPO es una hormona glicoproteica circulante, indispensable para la producción

de los eritrocitos. Durante la vida postnatal, es producida esencialmente por los
fibroblastos intersticiales renales. Si el aporte de oxígeno al riñón disminuye, la
tasa de ARNm de la EPO aumenta llevando así a la elevación de las
concentraciones circulantes de EPO. Se trata de una respuesta de fuerte amplitud
(hasta 1000 veces) que implica una intensificación de la transcripción de los
genes. El hígado es, asimismo, productor de EPO, pero los pacientes con
insuficiencia renal en estadío avanzado son generalmente anémicos y tienen una
respuesta disminuída a EPO. No existe un modelo de cultivo celular de
fibroblastos renales que produzcan EPO; se constata una secreción de EPO
regulada por el oxígeno en ciertas líneas celulares de hepatoma. Este control se
opera principalmente por intermedio de un activador sensible a la hipoxia situado
justo hacia delante del gen, notablemente conservado de una especie a la otra. El
estudio de este elemento de activación ha llevado al aislamiento del complejo HIF.
Paralelamente a este descubrimiento, diversas experiencias de transferencia
genética han logrado mostrar que este activador era capaz de responder al
oxígeno en todos los tipos de células de mamíferos estudiados sugiriendo así que
este sistema de transactivación regula a otros genes. El sistema EPO plantea un
cierto número de preguntas muy interesantes a las cuales aún no se ha dado
respuesta. Se ignora, por ejemplo, la razón por la cual la expresión de la EPO se
halla afectada en la insuficiencia renal. Es de hacer notar que la respuesta de la
EPO se halla con frecuencia relativamente preservada en los pacientes con
enfermedad poliquística autosómica dominante. Es poco probable que este
fenómeno esté directamente ligado a la anomalía genética puesto que,
generalmente, los pacientes dializados que desarrollan una enfermedad quística
adquirida no requieren tampoco una suplementación de EPO. El rol de elementos
específicos del sistema HIF en la regulación normal de la EPO es otra pregunta
que permanece sin respuesta. Los estudios llevados a cabo en la rata han
revelado que una disminución del aporte de oxígeno al riñón induce en los
fibroblastos exclusivamente a la proteína HIF-2α y no a la proteína HIF-1α. Esta
constatación sugiere fuertemente que la respuesta de EPO está mediada por la
activación de HIF-2α. Así, los ratones Knockout para el gen HIF-2α presentan un
déficit hematopoyético que se restablece por el injerto a ratones irradiados con
dosis letales de células de médula ósea en las cuales había sido transferido el gen
HIF-2α. Además, en ratones heterozigotos para un alelo HIF-2α defectuoso, la
respuesta eritropoyética a la hipoxia está alterada. El hecho es que la EPO se ha
mostrado particularmente sensible a la inactivación funcional o “Knockdown” del
gen HIF-2α en la regulación de la EPO. Ha sido, asimismo, reportado que ratones
heterozigotos para un déficit en HIF-1α manifiestan una respuesta eritropoyética a
la hipoxia disminuída lo que parece indicar que HIF-1α se haya implicado en la
respuesta normal de la EPO in vivo.

Durante la isquemia, la ausencia de oxígeno y de sustratos oxidables (glucosa,

ácidos grasos, etc.) provoca la disminución de la fosforilación oxidativa y, por
ende, de la producción de ATP. En condiciones normales, las células miocárdicas
oxidan preferentemente ácidos grasos. Cuando el corazón se somete a isquemia,
no se observan cambios en la utilización de los sustratos respecto a un miocardio
normal37. Sin embargo, cuando el miocardio es reperfundido y ocurre un
aturdimiento, rápidamente se producen ajustes en la utilización de los sustratos, y
se observa un uso preferencial de ácidos grasos de cadena larga para el
metabolismo energético38. Así, si se reperfunde el corazón con una mezcla de los
sustratos oxidables antes mencionados, los ácidos grasos son los que aportan la
mayor parte de la energía (el 57-63%). La isquemia es capaz de producir
translocación de los receptores de glucosa GLUT-4 y GLUT-139. El aporte de
glucosa puede favorecer la formación de piruvato y, en consecuencia, la
producción de ATP40, y en el miocardio no isquémico puede cambiar el
metabolismo basado en los ácidos grasos a uno basado en la glucosa. En
animales de experimentación se ha demostrado que cuando se estimula la
oxidación de la glucosa por parte del miocardio aturdido, la recuperación contráctil
es más rápida y completa41.

 La acumulación de superóxido que ocurre en ausencia de NO luego de la I/R, permite un

aumento de la síntesis de peróxido de hidrógeno (H2O2). Los dos metabolitos reactivos de
O2 (O2 - y H2O2 ) pueden rápidamente iniciar y exacerbar el estado inflamatorio en las
vénulas:

 Incentivando la producción de factor de agregación plaquetaria, a través de la

activación de la fosfolipasa.
 Promoviendo la activación y depósito de complemento en la superficie de la célula
endotelial.
 Movilizando los depósitos preservados de P-Selectina a la superficie de la célula
endotelial, donde media el rodado de los leucocitos.

Los metabolitos reactivos de O2 también ayudan a sostener la adhesión leucocito-endotelial

que ocurre muchas horas después de la reperfusión activando genes que codifican esa
adhesión molecular como E-Selectina (permite rodado leucocitario) y ICAM-1 ( permite
firme adhesión y emigración leucocitaria). La síntesis de moléculas de adhesión,
dependiente de la transcripción, de las células endoteliales, asegura que la respuesta
inflamatoria iniciada por I/R pueda ocurrir por muchas horas luego de la iniciación de la
reperfusión y del disbalance NO-superóxido.