Regulación alostérica de la actividad 6-fosfofructo-1-

quinasa del cuerpo graso y el músculo de vuelo de la

chinche chupa sangre Rhodnius prolixus
 

Gutemberg G. Alves I, II ; Monica M. Marinho-Carvalho I, II ; Georgia C.

Atella II ; Mario AC Silva-Neto II ; Mauro Sola-Penna I

I
 Laboratório de Enzimologia e Controle do Metabolismo (LabECoM), Departamento de
Fármacos, Faculdade de Farmácia Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-590
Rio de Janeiro, RJ, Brasil
II
 Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Biologia Molecular e Biotecnologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-590 Rio de Janeiro, RJ, Brasil

RESUMEN

Actividad de 6-fosfofructo-1-quinasa (fosfofructoquinasa; PFK) de Rhodnius prolixus,

un insecto hematófago que suele volar mal, se midió y comparó en dos tejidos
metabólicamente activos: el músculo de vuelo y el cuerpo graso. La actividad de esta
importante enzima reguladora glucolítica fue mucho más pronunciada en el músculo
(15,1 ± 1,4 U / mg) que en los extractos de grasa corporal (3,6 ± 0,4 U / mg), aunque
estos últimos presentaron mayores niveles de enzima por contenido proteico, según lo
medido por Western-Blot. Los extractos musculares son más responsables que la grasa
corporal del ATP y la fructosa 6-fosfato, ambos sustratos de la PFK. La regulación
alostérica ejercida por diferentes efectores como ADP, AMP y fructosa 2,6-fosfato
presentó un patrón singular para cada tejido. El pH óptimo (8,0-8,5) y la sensibilidad a
la variación del pH fueron muy similares, y el citrato no pudo inhibir la actividad de PFK
en ambos extractos.Nuestros resultados sugieren la existencia de una actividad PFK
particular para cada tejido, con patrones reguladores que son consistentes con sus
roles fisiológicos.

Palabras clave: fosfofructoquinasa, metabolismo, insecto.

RESUMO

A atividade da fosfofrutocinase (PFK) de Rodnius prolixus , um inseto hematófago, o

qual vôa somente pequenas distâncias, foi medida e comparada em dois tecidos
metabolicamente ativos - músculo de asa e corpo gorduroso. A atividade desta
importante enzima glicolítica regulatória foi muito mais pronunciada em músculo de
asa (15,1 ± 1,4 U / mg) do que em extrato de corpo gorduroso (3,6 ± 0,4 U / mg)
embora este último tenha apresentado níveis mais altos da enzima por quantidade de
proteína, como medido por western-blotting. Extratos de músculo foram mais
responsivos do que corpo gorduroso para ATP e frutose-6-fosfato, ambos substratos da
PFK. A regulação alostérica exercida por diferentes efetores tais como ADP, AMP,
frutose-2,6-bisfosfato apresentou um padrão singular para cada tecido. O pH ótimo
(8,0-8,5) ea sensibilidade a variações de pH, forram muito similar eo citrato foi incapaz
de inibir a atividade da PFK em ambos os extratos. Nossos resultados sugerem una
existencia de una actividad particular de PFK para cada tecido con padrões regulatórios
que son consistentes com susas funciones fisiológicas.

Palavras-chave: fosfotrutocinasa, metabolismo, inseto, glicólise, músculo, corpo

gorduroso.

INTRODUCCIÓN

El músculo de vuelo de los insectos se describe como un tejido altamente oxidativo en

comparación con el músculo esquelético que se encuentra en otros animales, y algunos
insectos presentan un aumento de 50 a 100 veces en su tasa glucolítica al inicio del
vuelo (Weis-Fough 1952, Krammer y Heinrich 1978, Wegener 1996). En insectos como
Rhodnius prolixus, que presenta hábitos relativamente sedentarios, aunque capaz de
vuelo sostenido por periodos superiores a 1 hora (Ward y Baker 1982, Ward et al.
1982), los carbohidratos pueden representar sustratos importantes para la oxidación
en el músculo de vuelo. La mayoría de los carbohidratos de este tejido provienen de la
glucogenólisis, así como de la hemolinfa, siendo originada directamente de la dieta o
liberada por el cuerpo graso (Candy y Kilby 1959, Candy et al. 1997). El cuerpo graso
parece acumular funciones tanto del hígado como del tejido adiposo (Keeley 1985).
Este tejido representa el principal almacenamiento de aminoácidos, glucosa, trehalosa
y lípidos en los insectos y puede ser responsable de cierto grado de homeostasis de
estos metabolitos en la hemolinfa (Becker et al. 2001).

6-fosfofructo-1-quinasa (PFK; fosfofructoquinasa; ATP: D-fructosa-6-fosfato-1-trans-

ferasa; EC2.7.1.11) cataliza la fosforilación de fructosa-6-fosfato a fructosa-1,6-
bisfosfato y es una enzima clave en la regulación de la glucólisis. En consecuencia, su
actividad podría reflejarse en el metabolismo de los carbohidratos tanto en el músculo
de vuelo como en el cuerpo graso. En diversos sistemas vivos, incluidos los insectos,
se sabe que esta enzima está modulada por ATP, ADP, AMP y fructosa 2,6-bisfosfato,
entre varios otros efectores (para una revisión, véase Uyeda 1979, Newsholme y Leech
1983, Schirmer y Evans 1990 ). Khoja (1991) ha demostrado que la fructosa 2,6-
bisfosfato es uno de los activadores más potentes de la actividad de la PFK en el vuelo
y los músculos de las piernas del insecto Poekilocerus bufonius., así como en otros de
sus tejidos, como el intestino grueso y medio. Sin embargo, varios informes indican
que algunos moduladores bien conocidos de la actividad de PFK de mamíferos, como
el   citrato, pueden tener poco o ningún efecto sobre la enzima del insecto (Walker
y Bailey 1969, Newsholme et al. 1977, Leite et al. 1988, Khoja et al. al. 1990).
Con el fin de proporcionar más información sobre el metabolismo de los carbohidratos
en insectos, en este estudio comparamos la actividad PFK de extractos obtenidos tanto
del músculo de vuelo como del cuerpo graso del insecto hematófago Rhodnius
prolixus , y su comportamiento regulador relacionado con los efectores más
importantes. con relevancia fisiológica en estos tejidos.

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES

ATP, ADP, AMP, Tris, fructosa 6-fosfato, fructosa-2,6-bisfosfato, NADH y las enzimas
acopladas aldolasa, triosa-fosfato isomerasa y una deshidrogenasa glicerofosfato
fueron obtenidos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, ESTADOS UNIDOS). La IgG
secundaria anti-ratón para el ensayo de transferencia Western se obtuvo de Santa
Cruz (CA, EE. UU.). Otros reactivos eran de la mayor pureza disponible.

OBTENCIÓN DE HOMOGENATOS DE GRASA CORPORAL Y MUSCULAR DE VUELO

En este estudio se utilizaron machos adultos de Rhodnius prolixus mantenidos en

nuestra colonia departamental a 28ºC, 70% de humedad y alimentados a intervalos de
28 días. Diez días después de la alimentación, el cuerpo graso y el músculo de vuelo
de 10 individuos fueron disecados, pesados y homogeneizados con un homogeneizador
de vidrio en una solución que contenía Tris-HCl 50 mM, KF 30 mM, EDTA 4 mM y 2-
mercaptoetanol 15 mM, pH 7,5. A continuación, se centrifugó la preparación a 6400
rpm y se midió el contenido de proteína del sobrenadante de acuerdo con Lowry et
al. (1951).

ENSAYO DE ACTIVIDAD 6-FOSFOFRUCTO-1-CINASA

Se midió la actividad de PFK de homogeneizados de cuerpos grasos y músculos de

vuelo como se describió anteriormente (Sola-Penna et al.2002, Meira et al.2005) en un
medio de reacción que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NADH 0,2 mM, 10 mM
MgCl 2 , ATP y fructosa 6-fosfato en las concentraciones indicadas en las figuras,
además de las enzimas acopladas aldolasa (0,25 U / ml), triosa fosfato isomerasa (1
U / ml) y una deshidrogenasa glicerofosfato (4 U / ml). La reacción se inició mediante
la adición de un volumen de homogeneizado que contenía 10 µg de proteína, y la
oxidación de NADH se controló durante 10 minutos en un espectrofotómetro a 340 nm,
y se identificó la fase lineal para cada experimento. Un coeficiente de extinción molar
de 6.220 × 10 6 M cm 2 se utilizó para el cálculo de la concentración de fructosa 1,6-
bisfosfato.

BLOTTING OCCIDENTAL

El anticuerpo policlonal generado contra la PFK de mamífero se obtuvo en nuestro

laboratorio (Meira et al. 2005) mediante la inyección subcutánea de ratas de 45 días
que pesaban aproximadamente 100 g con 250 µL de una solución que contenía 1 mg
de PFK de músculo esquelético de conejo purificada y adyuvante completo de Freund.
Se realizó una segunda inmunización 15 días después mediante la inyección de 70 µl
de adyuvante incompleto de Freund y 1 mg / ml de PFK. Se recogió IgG de 30 ml de
sangre extraída el día 45, después de centrifugación durante 30 minutos a 1500 rpm.
Para la transferencia Western, se separaron muestras de homogeneizados de masa
grasa y músculo de vuelo que contenían 150 µg de proteína con SDS-PAGE (10%) y se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, como se confirmó mediante tinción con
rojo Ponceau. La membrana se bloqueó, se lavó e incubó con 1:1000 anti-PFK IgG
purificado y 1: 800 anticuerpo secundario anti-ratón (Santa Cruz, CA, EE. UU.). La
membrana se desarrolló con revelador BCIP / NBT (Meira et al. 2005). Se utilizaron
PFK de músculo de conejo y un conjunto de estándares de masa molecular de Sigma
Chemicals Co. (St. Louis, MO, EE. UU.) Para determinar la masa molecular deR.
prolixus PFK, en una SDS-PAGE paralela.

ANÁLISIS CINÉTICO Y ESTADÍSTICO

Los parámetros cinéticos para las curvas del sustrato se calcularon mediante regresión
no lineal utilizando el software SigmaPlot (Systat, CA, EE. UU.). Los valores
presentados son la media ± errores estándar de los parámetros calculados ajustando
las ecuaciones siguientes a los datos experimentales para, al menos, 4 experimentos
independientes.

donde V es la tasa de enzima a una concentración de sustrato dada (S), K 0.5 es la

constante de afinidad aparente yn es el índice de cooperatividad.

donde V es la tasa de enzima a una concentración de sustrato dada (S), Ki es la

constante de inhibición aparente yn es el índice de cooperatividad.

Las diferencias estadísticas se calcularon mediante la prueba t de Student utilizando el

software SigmaStat (Systat, CA, EE. UU.). Se consideró un AP <0,05 como
estadísticamente diferente para todos los experimentos.

RESULTADOS

EFECTOS DEL PH

La actividad de PFK de R. prolixus depende de la concentración de H + en ambos

tejidos estudiados. La Figura 1A muestra la actividad de la enzima medida a diferentes
pH, a concentraciones fijas de ATP y fructosa-6-fosfato (2 y 5 mM,
respectivamente). La actividad en ambos extractos, después de normalizada por las
actividades máximas obtenidas ( Fig.1B ), presentó una respuesta muy similar al pH,
con una actividad máxima encontrada a valores de pH superiores a 8 (8,2 músculo,
8,4 grasa corporal), y una pronunciada disminución a Valores de pH inferiores a 7. A
pH 7,4, ambos tejidos presentaron mayor respuesta a la regulación alostérica que a un
pH óptimo, como se probó previamente, y luego se utilizó en los experimentos de
regulación alostérica presentados en este trabajo.

 
COMPORTAMIENTO CINÉTICO

Con el fin de comparar la actividad 6-fosfofructo-1-quinasa del músculo de vuelo de R.

prolixus y el cuerpo graso, medimos los parámetros cinéticos para los dos sustratos
enzimáticos, fructosa-6-fosfato y ATP. Los parámetros cinéticos se determinaron
midiendo la velocidad inicial de catálisis enzimática en función de la concentración de
sustrato. Todas las medidas de velocidad se realizaron siguiendo la formación del
producto en función del tiempo. La pendiente de formación del producto durante la
fase lineal inicial de la reacción se utilizó para determinar la velocidad inicial y se
expresa como U / mg. Se consideró una U como la formación de un producto µmol por
minuto. Figura 2 muestra las curvas de la velocidad inicial de PFK frente a la
concentración de fructosa-6-fosfato para ambos tejidos. La velocidad de la enzima
responde de manera alostérica a la fructosa-6-fosfato y los parámetros de la ecuación
1 se ajustaron mejor a los datos experimentales. El músculo de vuelo presenta una
mayor actividad específica de la enzima (p <0,05), en comparación con los
homogeneizados de cuerpos grasos (15,14 ± 0,63 U / mg y 5,3 ± 0,7 U / mg,
respectivamente; P <0,05, prueba t de Student). Además, observamos que la K para
la fructosa-6-fosfato es menor en el músculo de vuelo en comparación con el cuerpo
graso (0,81 ± 0,11 mM y 1,61 ± 0,25 mM, respectivamente; P <0,05, prueba t
de Student).

 
La Figura 3A muestra que la enzima responde en un patrón muy similar a
concentraciones más bajas (hasta 3 mM) de su otro sustrato, ATP. En ambos
extractos, la velocidad inicial de la enzima responde de forma alostérica al ATP. Los
parámetros mostrados en la Tabla I , obtenidos con el mejor ajuste de los datos
experimentales a la ecuación 1, revelaron que el homogeneizado de músculo, una vez
más con una mayor actividad específica de PFK, también tiene la menor K 0.5 para este
sustrato (0.68 ± 0.29 U / mg versus 0,95 ± 0,51 U / mg, para el homogeneizado de
cuerpos grasos; P <0,05, prueba t de Student). A concentraciones más altas ( Fig.
3B), El ATP se convierte en un potente inhibidor de la actividad de PFK en ambos
tejidos, aunque con efectos más pronunciados sobre los extractos de grasa
corporal. En este tejido, ATP 6 mM redujo la actividad de PFK al 25% de su velocidad
máxima, mientras que el homogeneizado muscular, sometido a las mismas
condiciones, presentó alrededor del 40% de la V.Sin embargo, el mejor ajuste de los
datos experimentales a la ecuación 2 reveló un inferior K i para ATP a concentraciones
más altas a la enzima muscular, como se muestra en la Tabla I . Aunque ambos
extractos presentaron cierto grado de cooperación hacia el ATP, no pudimos identificar
diferencias significativas entre ellos.

 
 

 
 

RESPUESTA A LA REGULACIÓN ALOSTERICA

En diferentes tejidos, la PFK está sometida a una regulación estricta, como resultado
de interacciones entre sustratos y varios inhibidores y activadores alostéricos. Se
describe que el citrato potencia los efectos inhibidores del ATP en varios tejidos
animales, proporcionando una explicación del ciclo corporal glucosa-ácido graso-
cetona. En R. prolixus , los homogeneizados de músculos y cuerpos grasos no
presentaron cambios en su actividad PFK ( Fig. 4 ) en función del aumento de las
concentraciones de citrato de sodio. Sin embargo, otros efectores alostéricos, como los
nucleótidos, pudieron afectar notablemente la actividad de PFK. Figura 5muestra que
el ADP puede aumentar la actividad enzimática en ambos extractos, pero a diferentes
potencias. A 5 mM de ADP, la actividad de PFK del cuerpo graso fue 6 veces mayor que
la observada en ausencia de efector, en comparación con una activación de 3 veces
encontrada en el músculo.

 
 

 
 

Las diferencias entre el cuerpo graso y el músculo de vuelo se hicieron evidentes

nuevamente cuando el regulador alostérico estudiado fue AMP ( Fig. 6 ). Este efector
fue capaz de activar PFK en ambos extractos, pero el patrón encontrado dependía de
las condiciones probadas. La Figura 6A muestra los efectos de diferentes
concentraciones de AMP sobre la actividad de PFK del homogeneizado de cuerpos
grasos donde se puede ver que el AMP era mucho más potente como activador a una
concentración inhibitoria de ATP (5 mM) que cuando el sustrato estaba presente en
una concentración estimulante saturante. (2 mM; P <0.05, t de Student-prueba). Sin
embargo, el mismo experimento realizado con los homogeneizados de los músculos de
vuelo mostró que el AMP podía activar la PFK, pero no se observaron diferencias
cuando el experimento se realizó a diferentes concentraciones de ATP ( Fig. 6B ; P>
0,05, prueba t de Student).

 
 

Esta dependencia de la concentración de ATP también se encontró en los efectos de

fructosa-2,6-bisfosfato, uno de los activadores más potentes de PFK ya descritos. A la
concentración de ATP estimulante saturante (2 mM), la fructosa-2,6-bisfosfato no pudo
activar la actividad del homogeneizado muscular ( Fig.7A , círculos), mientras que una
activación pequeña pero significativa (P <0.05, prueba t de Student) se observó en el
cuerpo graso ( Fig. 8A , círculos). Sin embargo, a la concentración inhibidora de ATP (5
mM), la fructosa-2,6-bisfosfato promueve una activación muy potente de la enzima en
ambos tejidos ( Fig. 7A y 8A).para el músculo de vuelo y el cuerpo graso,
respectivamente). Para una mejor visualización de la activación de fructosa-2,6-
bifosfato sobre la actividad de PFK de los tejidos de insectos, los datos presentados en
los paneles A de las figuras 7 y 8 se recalcularon la activación relativa ( Fig.
7B y 8B ). Como puede verse, esta activación es más pronunciada en el cuerpo graso
(10 veces) que en el músculo de vuelo (4 veces).

 
 

ANÁLISIS DE WESTERN-BLOTTING

Como se muestra en la Figura 9 , el sondeo de extractos de tejidos de insectos con

anticuerpos contra la PFK muscular de conejo provocó el reconocimiento de una banda
específica después de la electroforesis. Aunque ambos carriles presentaron tinción, fue
marcadamente mayor en los homogeneizados de cuerpos grasos, en todos los ensayos
de transferencia de Western realizados. En comparación, y la movilidad electroforética
con varias proteínas estándar y PFK de músculo de conejo, pudimos calcular para estas
bandas una masa molecular de 86 kDa por monómero (datos no mostrados).

DISCUSIÓN

Es razonable considerar la oxidación de carbohidratos como un proceso metabólico

importante en el músculo de vuelo de los insectos, especialmente aquellos que están
acostumbrados a la actividad de vuelo de corto alcance, y que entonces se requeriría
un estricto control glucolítico de la actividad de PFK en este tejido. Ya se ha
demostrado en uno de esos insectos, Rhodnius prolixus , una disminución significativa
en el almacenamiento de glucógeno muscular durante el vuelo (Ward et al. 1982).

Según nuestros datos, la actividad de PFK en el músculo de vuelo de R. prolixus es

muy sensible a la regulación alostérica. El ATP presenta efectos inhibidores a
concentraciones superiores a 3 mM, superiores a los descritos como inhibidores para
otros insectos (Walker y Bailey 1969, Holden y Storey 1993), pero con un Ki estimado
dentro del rango casi fisiológico descrito anteriormente (Wegener et al. 1991). ,
Wegener 1996). Es posible que, en el músculo, la actividad de PFK permanezca
mayoritariamente inhibida y dependiente de la activación promovida por otros
efectores. 31 estudios P espectroscopía de RMN in vivo con Locusta migratoriaindicó la
ausencia de mayores alteraciones del contenido de ATP en el músculo de vuelo durante
el vuelo (Wegener et al. 1991). Sin embargo, nuestros datos muestran que, al
menos in vitro , varios efectores como ADP, AMP y fructosa-2,6-bisfosfato son capaces
de activar la PFK del músculo de vuelo incluso en presencia de concentraciones
inhibidoras de ATP. Curiosamente, en nuestros experimentos, la fructosa-2,6-bisfosfato
mostró poco o ningún efecto a concentraciones más bajas de ATP, lo que sugiere que
el mecanismo de activación del compuesto contrarresta los efectos inhibidores del ATP.
Se encontró un patrón similar en los homogeneizados de cuerpos grasos, aunque con
algunas características singulares. Este tejido presentó mayor calcula K 0,5 a los
sustratos, y superior K i a la inhibición por ATP, en comparación con el músculo. Si bien
los niveles más altos de actividad relativa de PFK siempre se obtuvieron con
homogeneizados de músculo, el grado total de activación promovido por ADP, AMP y
fructosa-2,6-bisfosfato fue marcadamente mayor en el cuerpo graso. Esta sensibilidad
a los efectores alostéricos sugiere una vía glucolítica estrictamente regulada, que
puede ser compatible con las funciones fisiológicas del cuerpo graso. Algunos insectos
son extremadamente dependientes de los carbohidratos de la comida para mantener
los niveles de trehalosa en la hemolinfa (Thompson et al. 2001), mientras que los
insectos hematófagos comoR. prolixus (expuesto a dietas pobres en carbohidratos,
basadas en sangre) puede depender de la síntesis directa en el cuerpo graso. Este
proceso, conocido como trehalogénesis, requiere la regulación de varias enzimas,
incluida la glucógeno fosforilasa, fructosa-1,6-bisfosfatasa y PFK (Becker et al. 1996).
Nuestros datos sugieren que la fructosa-2,6-bifosfato es un fuerte candidato para la
regulación a corto plazo, ya que es capaz de aumentar varias veces la actividad de PFK
en extractos de grasa corporal, dependiendo de la concentración. Además, los niveles
de fructosa 2,6-bisfosfato en el cuerpo graso pueden alterarse en eventos fisiológicos
como el ayuno y la realimentación (Meyer-Fernandes et al. 2001). Este activador
puede representar un objetivo para la regulación inducida por varias hormonas,
incluidas la octopamina y las hormonas hipertrehalosemiantes.

El citrato, un modulador bien conocido de esta enzima en vertebrados (Newsholme et

al. 1977) fue incapaz de ejercer la inhibición de la actividad de PFK en ambos tejidos.
Esta insensibilidad al citrato se describió previamente en otros estudios con insectos
(Walker y Bailey 1969, Newsholme et al. 1977, Leite et al. 1988, Khoja et al. 1990),
aunque algunos informes describieron efectos leves (Khoja 1991, Holden y Storey
1993). Dentro del cuerpo graso, la falta de respuesta al citrato puede estar
correlacionada con la posibilidad de lograr mayores impuestos de síntesis de novo de
lípidos a partir de carbohidratos. En el músculo de vuelo, la ausencia del ciclo de
Randle es menos relevante si la actividad de vuelo sigue dependiendo de la oxidación
de los carbohidratos, aunque Ward et al. (1982) han mostrado evidencias de queR.
prolixus depende de la oxidación de los ácidos grasos durante el vuelo a largo
plazo. En ese caso, se necesitarían otros mecanismos para disminuir los niveles de
oxidación de carbohidratos en este tejido, como reducir los niveles de fructosa-2,6-
bifosfato, por ejemplo.

Se describe que PFK presenta mayores respuestas alostéricas a

mayores concentraciones de H + , en valores de pH mucho más bajos que el óptimo, y
conocido como pH regulador. Aunque no investigamos las alteraciones alostéricas
inducidas por el pH, nuestros datos han demostrado que, a concentraciones fijas de
ATP y fructosa-6-fosfato, ambos homogeneizados presentaron alteraciones muy
similares en la actividad de PFK. Esto sugiere que posibles alteraciones en K 0.5 y
K ipara estos sustratos esperados a diferentes valores de pH pueden tener tasas
similares en el cuerpo graso y el músculo de vuelo. Sin embargo, no está claro si la
sensibilidad al pH encontrada en el músculo volador presenta alguna relevancia
fisiológica, ya que el vuelo sobre insectos se describe como una actividad altamente
oxidativa (Ford y Candy 1972, Candy et al. 1997, Suarez 2000), con poca o sin
producción de lactato (el principal responsable de las alteraciones del pH en el
músculo). En Rhodnius y otros hemípteros, el sistema traqueolar transversal forma
grandes cavidades de aire entre las mitocondrias, lo que explica un suministro eficiente
de oxígeno (Wigglesworth y Lee 1982). Queda por saber si realmente se producen
alteraciones en el pH o la concentración de lactato en el músculo de vuelo de R.
prolixus .

En nuestro trabajo, no pudimos correlacionar la actividad PFK marcadamente más alta

que se encuentra en el músculo de vuelo con un mayor contenido de proteínas. Por el
contrario, la IgG policlonal anti-conejo de músculo PFK detectó niveles más bajos de
tinción de PFK en homogeneizados de músculo que los encontrados en la grasa
corporal en todos los experimentos de transferencia Western. Dado que tanto la
actividad de PFK como el contenido de PFK se ensayaron en el mismo tipo de
homogeneizado y se normalizaron con el contenido de proteína homogeneizada,
nuestros resultados sugieren fuertemente que se encuentra un tipo de enzima más
activa en el músculo de vuelo, presentando propiedades cinéticas y alostéricas
diferentes de las encontradas en Cuerpo gordo.

Hay tres isoformas diferentes de monómeros de PFK ya descritas: M (músculo), L

(hígado) y F (fibroblasto). En insectos, queda por determinar la presencia de diferentes
formas isoenzimáticas de PFK. En este trabajo, se generaron anticuerpos contra la PFK
del músculo esquelético de conejo, descrita como compuesta únicamente por la
isoforma M. Sin embargo, todas las isoformas presentan altos niveles de similitud, lo
que conduce a la producción de IgG policlonales incapaces de clasificarlas. En
consecuencia, es posible, pero no probable, que algún tipo de subunidad PFK
permanezca sin ser detectado en nuestro experimento. Sin embargo, queda claro que,
independientemente de esas posibilidades, tanto el cuerpo graso como el músculo de
vuelo tienen perfiles singulares de regulación glucolítica, lo que podría ser consistente
con su papel específico en varias condiciones fisiológicas, como el ayuno o el vuelo.

EXPRESIONES DE GRATITUD

Este trabajo es parte del trabajo de doctorado de GGA, y fue apoyado por becas de la
Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
(FAPERJ), Fundação Ary Frausino / Fundação Educacional Charles Darwin (FAF / FECD
Programa de Oncobiologia ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) y Programa de Núcleos de Excelência (PRONEX), y Programa de
Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (PADCT).

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Manuscrito recibido el 6 de noviembre de 2005; aceptado para su publicación el 7 de

noviembre de 2005; presentado por LUCIA MENDONÇA PREVIATO