GUÍA No. 5.

CUANTIFICACIÓN DE POLIFENOLES POR HPLC

Magaly Cristina Arévalo Guancha Farmacognosia y Fitoquímica

Edwar Emanuel Barón Chinchilla Semestre V
Ian Felipe González Rodríguez Universidad el Bosque
Grupo 1

- PROCEDIMIENTO
(Kuppusamy, Dong, Eun, Ilavenil, Srigopalram, Valan y
Choon, 2018).

Figura 2. Procedimiento de Determinación del contenido

fenólico (Kuppusamy, Dong, Eun, Ilavenil, Srigopalram, Valan
y Choon, 2018).

Figura 1. Procedimiento de Preparación de la muestra botánico

 - PREGUNTAS DE APRENDIZAJE

1. ¿Por qué son ampliamente estudiados los compuestos polifenólicos derivados de plantas?

Principalmente, los compuestos polifenólicos son compuestos sintetizados por las plantas que presentan una serie
de funciones para brindarles estabilidad y supervivencia, entre ellas se encuentran: estabilidad química, amargor,
sabor, color y control biológico contra hongos, bacterias y virus fitopatógenos, además de la maduración, variedad
y capacidad, sin embargo, se ha demostrado que los compuestos polifenólicos son de gran relevancia para la salud
humana, presentando una serie de propiedades y actividades biológicas de gran peso para la medicina como la
actividad antitumoral, antiviral, antibiótica, antiinflamatoria, entre otras; además, son de gran importancia para la
eliminación de radicales libres, quelatar metales en el cuerpo, haciéndolos de gran valor para la medicina y
farmacia (Kuppusamy, Dong, Eun, Ilavenil, Srigopalram, Valan y Choon, 2018).

2. ¿Cómo se clasifican los polifenoles?

Existen una gran variedad de clases y subclases de esta familia de compuestos que se caracterizan por la presencia
de anillos fenólicos, sin embargo, se puede decir que los polifenoles se pueden clasificar de la siguiente forma:
ácidos fenólicos, estilbenos, lignanos, alcoholes fenólicos y flavonoides (Quiñones, Miguel y Aleixandre, 2012).

Figura 3. Núcleos estructurales de los principales compuestos polifenólicos (Quiñones, Miguel y Aleixandre, 2012).

3. ¿Cuál es el fundamento de la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC)?

La cromatografía HPLC, es una técnica analítica de separación ampliamente usada, pues presenta una serie de
ventajas como tener alta sensibilidad, fácil adaptación a determinantes, idoneidad para su separación y su
aplicación a sustancias que son de gran interés para las industrias y la medicina. Su mecanismo se basa en la en
la distribución de los componentes entre dos fases: la fase estacionaria que está contenida en la columna y la fase
móvil, la cual eluye a través de la columna. La función de esta fase móvil no sólo es la de arrastrar al analito, sino
que también debe interaccionar con el analito (Abad, Berrueta, Garmón, Gallo y Vicente,2009).

4. ¿Qué conceptos previos se debe conocer para la lectura de espectros de masas?

Para realizar una correcta lectura de un espectro es importante saber:

- Ion Molecular (pico molecular) M+: es el ion obtenido por la pérdida de un electrón por la molécula. Es
el pico que representa la masa sin ese electrón.
- El pico base: el pico más intenso del espectro, al que por convenio se le asigna una intensidad del 100 %.
- Radical catión: son especies cargadas con un número impar de electrones.
 - Picos de fragmentación: picos correspondientes a fragmentos más ligeros, formados por descomposición
del ión molecular. A menudo se corresponden con los carbocationes más estables.
(Abad, Berrueta, Garmón, Gallo y Vicente,2009).

5. ¿Cuál es el fundamento de la cromatografía HPLC-DAD?

La cromatografía HPLC-DAD es una técnica rápida y precisa para la cuantificación de componentes, mientras
que HPLC es una técnica de separación, su sistema combinado con DAD/UV permite la detección de absorbancia
de sustancias en una mezcla, es decir, DAD es el mecanismo encargado de detectar la absorción en las regiones
UV-Vis (Kuppusamy, Dong, Eun, Ilavenil, Srigopalram, Valan y Choon, 2018).

- RESULTADOS

La cuantificación de los diferentes polifenoles de Lolium multiflorum a diferentes concentraciones (1, 0.5, 0.25,
0.125 mg/mL) se realizó mediante el método de HPLC-DAD inyectando 10 µL de muestra utilizando un
automuestreador G1315A y luego separadas en una columna Agilent Zorbax SB-C18, el método se validó
construyendo una curva estándar para cada estándar interno trazando la concentración del estándar (mg/ml) frente
al área de pico a una longitud de onda específica de 240 nm, determinando una ecuación de regresión lineal para
cada compuesto (Kuppusamy, Dong, Eun, Ilavenil, Srigopalram, Valan y Choon, 2018).

Tabla N°1. Identification data (retention time, recovery, LOD, and LOQ) of phenolic acids and flavonoids in the extract of Lolium
multiflorum (Kuppusamy, Dong, Eun, Ilavenil, Srigopalram, Valan y Choon, 2018).
Curva estándar
Recuperación LOD LOQ
Pico N° Compuesto λ (nm) RT (min) (Ecuación de R2
(%) (µ/mL) (µ/mL)
regresión)
Acido y = 276.61x-
1 260 15.4 0.99 95.178 1.71 5.19
cafeico 24.87
Acido p- y = 190.98x-
3 260 23.3 0.99 93.984 1.02 3.10
cumarico 14.957
y = 332.94x-
9 Luteolina 260 44.1 0.99 94.418 1.15 3.48
24.652
y = 244.51x-
11 Vitexina 260 30.4 0.99 94.454 0.38 1.16
19.13

Con base a la tabla reportada en el artículo referenciado (Tabla N° 1) se procede a calcular mediante el
software Excel 2019 respecto a cada ecuación de regresión y teniendo en cuenta las concentraciones usadas (1,
0.5, 0.25, 0.125 mg/mL).

Acido cafeico Luteolina

300 400
y = 79,525x - 94,023
250
Area bajo la curva

R² = 0,92
Area bajo la curva

300 y = 95,72x - 107,89

200 R² = 0,92
150 200
100 100
50
0
0
0,125 0,25 0,5 1
-50 0,125 0,25 0,5 1 -100
Concentración (mg/mL) Concentración (mg/mL)
 Acido p-cumarico Vitexina
200 250
y = 54,907x - 62,702
y = 70,297x - 80,258
Area bajo la curva

200

Area bajo la curva

150 R² = 0,92
R² = 0,92
150
100
100
50
50
0 0
0,125 0,25 0,5 1 0,125 0,25 0,5 1
-50 -50
Concentración (mg/mL) Concentración (mg/mL)
Gráficas N°1-4. Concentración de 4 de los compuestos obtenidos de Lolium multiflorum vs Área bajo la curva de cada uno de ellos.

Siguiendo el método y las ecuaciones de regresión descritas en el artículo se procede a graficar, y en la parte
“practica” se determinó que las ecuaciones de la recta y los R2 obtenidos no son similares a los reportados,
teniendo un error de 7,1% en cada caso (Ecuación 1) en estos últimos, esto se debe posiblemente al uso de datos
y cifras significativas, ya que respecto al artículo el cual posiblemente este usando el ANOVA para basar los
datos en estadísticas, puede que algunos datos no se encuentren reportados en su totalidad en el documento
revisado, pero aun así las ecuaciones presentan una posible linealidad (Kuppusamy, Dong, Eun, Ilavenil,
Srigopalram, Valan y Choon, 2018)..

|𝐸𝑥𝑝−𝑅𝑒𝑝𝑜𝑟𝑡𝑎𝑑𝑜| |0.92−0.99|
%𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = ∗ 100 %𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = ∗ 100 = 7.1%
𝑅𝑒𝑝𝑜𝑟𝑡𝑎𝑑𝑜 0.99

Tabla N°2. contenido fenólico total y flavonoides totales en el extracto de Lolium multiflorum (Kuppusamy, Dong, Eun, Ilavenil,
Srigopalram, Valan y Choon, 2018).
Ensayos fitoquímicos Extracto crudo de etanol-agua de Lolium
multiflorum
Contenido total de fenoles (TPC) GAE/5g 19.54 ± 0.36
Contenido total de flavonoides (TFC) QUE/5g 34.16 ± 0.54
Donde GAE son mg de equivalentes de ácido gálico y QUE mg de equivalentes de quercetina.

También se reportan los cromatogramas HPLC de los patrones internos para todos los compuestos,
Cromatogramas N°1 Y 2.

Cromatograma N°1. ácidos fenólicos estándar (de izquierda a derecha, ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido p-cumarico, ácido
clorogénico, ácido dihidroxibenzoico, galato profiláctico, catequina) (Kuppusamy, Dong, Eun, Ilavenil, Srigopalram, Valan y Choon,
2018).
 Cromatograma N°2. flavonoides estándar (de izquierda a derecha, hidróxido de rutina, luteolina, kaemferol, vitexina, narcisista,
miricetina) (Kuppusamy, Dong, Eun, Ilavenil, Srigopalram, Valan y Choon, 2018).

Estos cromatogramas se comparan con el Cromatograma N°3.

Cromatograma N°3. separación simultánea de ácidos fenólicos y flavonoides en el extracto de Lolium multiflorum (Kuppusamy,
Dong, Eun, Ilavenil, Srigopalram, Valan y Choon, 2018).

- CONCLUSIONES

El uso de HPLC-DAD para la cuantificación de polifenoles demuestra ser un método muy específico y eficiente
para la determinación de los diferentes compuestos de una mezcla, proporcionando una precisión, exactitud y
linealidad referente a los resultados ya que estos demuestran ser muy eficiente, respecto al artículo revisado
permitiendo separar, y cuantificar los polifenoles de Lolium multiflorum.

- REFERENCIAS

Abad, B., Berrueta, L., Garmón S., Gallo, B. & Vicente, F. (2009). A general analytical strategy for the characterization of
phenolic compounds in fruits by high-performance liquid chromatography with diode array detection coupled to
electrospray ionization and triple quadrupole mass spectrometry. Journal of Chromatography A, vol. 1216(28), pp.
5398-5415.
Kuppusamy, P., Dong, K., Eun, C., Ilavenil, S., Srigopalram, S., Valan, M. & Choon, K. (2018). Quantification of major
phenolic and flavonoid markers in forage crop Lolium multiflorum using HPLC-DAD. Brazilian Journal of
Pharmacognosy, vol. 28, pp. 282-288.

Quiñones, M., Miguel, M. & Aleixandre, A. (2012). Los polifenoles, compuestos de origen natural con efectos saludables
sobre el sistema cardiovascular. Revista de Nutrición Hospitalaria, vol. 27(1), pp. 76-89.