TÉCNICA DE LA TINCIÓN DE GRAM

Lugar de realización: ​Bogota, Virtual Amrita Laboratories Universalizing Education

Fecha de realización: ​7 Mayo, 2020
Integrantes: ​Daniella Zambrano, Jeimy Vargas, Edward Baron, Ricardo Barbosa

Procedimiento:

Fig 1. Diagrama de flujo del procedimiento de una tinción de Gram previo a la observación
con microscopio.
(​Fuente propia basado en información de [1])
Resultados:
Tabla 1. Imágenes de las muestras observadas a 100x [1]

Muestra Imagen

Bacillus subtilis

Bacilos Gram Negativos

Bacilos Gram Positivos

Cocos Gram Positivos

 Cocos Gram Negativos

Estafilococos aureus

Análisis:
En la tabla 1 se presentan las imágenes de las muestras observadas bajo el microscopio de
la simulación. Se puede observar las formas características de los bacilos y los cocos tanto
gram positivos como negativos. También se evidencia la tinción característica de cada tipo
de bacteria, los gram positivos presentan la coloración morada del cristal violeta mientras
que los gram negativos presentan la coloración rosada de la safranina. Con respecto al
Bacillus subtilis ​la imagen del microscopio confirma que esta especie bacteriana es gram
positiva ya que los bacilos se encuentran teñidos de morado. Similarmente el ​Estafilococos
aureus también es una bacteria gram positiva ya que los cocos aparecen teñidos de morado
después de la tinción de gram.

La tinción característica de acuerdo al tipo de bacteria tiene que ver con la morfología de
esta en particular. Las gram positivas tienen una pared celular gruesa compuesta entre
60-90% de peptidoglicano mientras que las gram negativa tienen una pared celular delgada
compuesta entre 10-20% de peptidoglicano ubicada entre la membrana celular y una
membrana externa [2]. Esto quiere decir que el contenido lipídico en la pared celular es
mayor en las gram negativas que en las gram positivas [2].
Cuando la muestra es teñida con cristal violeta, este se disocia en los iones CV+ y CV- los
cuales penetran la capa de peptidoglicano; CV+ interacciona electrostáticamente con los
componentes negativos de la pared [2]. Se utiliza una solución de yodo como el lugol para
fijar este colorante a la pared celular [3]. El yodo actúa como mordiente, generado un
complejo con los iones CV+ retenidos en la pared de peptidoglicano para crear un complejo
más afín a los componentes de la pared celular [2]. Durante la etapa de decoloración, la
pared celular de las gram positivas se deshidrata y encoje, permitiendo que los poros de la
pared celular se cierren evitando que el complejo yodo-cristal violeta se pierda [2]. Por el
contrario, los lípidos de la pared celular de las gram negativas (como están en mayor
cantidad) se solubilizan, junto con la membrana externa, permitiendo la difusión del
complejo yodo-CV+ hacia el solvente usado, normalmente acetona o etanol [2]. Sin
embargo hay que aclarar que el paso de decoloración es crítico para la calidad de la
técnica; si la muestra se decolora por más tiempo del necesario, eventualmente hasta las
gram positivas perderán la coloración morada [1].

De acuerdo a lo anterior y manteniendo una técnica adecuada, las bacterias gram positivas
se observan moradas, mientras que las gram negativas necesitan un colorante adicional
para ser visualizadas [3]. Se agrega safranina para teñir a las gram negativas y por eso se
observan rosadas, aunque también se puede agregar fucsina básica [3].

Otro paso importante en la tinción de gram es la fijación por calor de la muestra. Este paso
se realiza para evitar que la muestra se pierda durante los lavados, pero la técnica en sí
ayuda a preservar la morfología del espécimen [3], el cual es el objetivo de la tinción de
gram: clasificar bacterias de acuerdo a una característica morfológica de su pared.

Conclusiones:
Basado en lo anteriormente discutido se puede decir que se pudo observar bajo el
microscopio de la simulación la técnica de la tinción de gram donde se evidenciaron algunas
etapas críticas para su buen desarrollo; la etapa de fijación por calor de la muestra y la
etapa de decoloración. Esta última en especial es importante ya que gracias a la morfología
de la pared celular de las bacterias permite el uso de un tinte secundario con el fin de lograr
la diferenciación entre gram positivas (moradas) y gram negativas (rosadas). Con base en
las muestras observadas durante la simulación, se evidencio que ​Bacillus subtilis ​y
Estafilococos aureus ambas se observaron de color morado y por ende se concluye que son
bacterias gram positivas.
Bibliografía:
[1] Amrita Lab. (2020). Gram Stain: Procedure. Amrita Laboratories Universalizing
Education. Obtenido de : https://vlab.amrita.edu/?pg=bindex&bsub=login_page
[2]Anderson, G.K. Beveridge, T. J., and H. C. Clark. (1983). Chemical Mechanism of the
gram stain and synthesis of a new electron-opaque marker for electron microscopy which
replaces the iodine mordant of the stain. J. Bacteriol. 156 (2):837-845.
[3] Prescott, Harley, Klein (2008). The study of microbial structure: microscopy and specimen
preparation. Microbiology 7th Ed. p 17-39. McGraw Hill

Anexo: Self Evaluation