Persistencia de genes de resistencia a los antibióticos y cambios

en la comunidad bacteriana en el sistema de tratamiento de agua

potable: de la fuente de agua potable al agua del grifo
Hao-Chang Su a, b, You-Sheng Liu b, Chang-Gui Pan b, Jun Chen b, Liang-Ying He b,
Guang-Guo Ying b,c*
Resumen
Como contaminantes emergentes , los genes de resistencia a los antibióticos (ARG) se
han convertido en una preocupación pública. Este estudio tuvo como objetivo investigar la
ocurrencia y diversidad de ARG, y la variación en la composición de comunidades
bacterianas en fuentes de agua, plantas de tratamiento de agua potable y agua del grifo
en la región del Delta del Río Pearl, en el sur de China. Varios ARG estuvieron presentes
en los diferentes tipos de agua. Entre los 27 ARG objetivo, podrían ser indicadores
potenciales de ARG en muestras de agua. La abundancia total de los ARG detectados en
el agua del grifo fue mucho menor que en el agua de origen. Filtración y sedimentación de
arena en el tratamiento de agua potable ARG floR y sul1 predominaron en las fuentes de
agua de tres grandes ríos de la región. El análisis de correlación de Pearson sugirió
que sul1 , sul2 , floR y cmlAlas plantas podrían eliminar eficazmente los ARG; por el
contrario, la filtración de carbón activado granular aumentó la abundancia de ARG. Se
encontró que Pseudomonas puede estar involucrada en la proliferación y diseminación de
ARG en el sistema de tratamiento de agua potable estudiado. Las bacterias y los ARG
todavía estaban presentes en el agua del grifo después del tratamiento, aunque se
redujeron significativamente. Se necesita más investigación para optimizar el proceso de
tratamiento de agua para ARG eliminación.

Palabras clave Genes de resistencia a antibióticos, Bacterias, Agua potable

Tratamiento Agua del grifo
1 . Introducción
Los antibióticos se utilizan ampliamente como fármacos terapéuticos para los seres
humanos, el ganado y la acuicultura , y también son aditivos alimentarios en la
agricultura. En China, el uso total estimado de antibióticos en 2013 fue de
162.000  toneladas ( Zhang et al., 2015 ). El uso extensivo de antibióticos ha provocado
una contaminación ambiental generalizada por residuos de antibióticos, bacterias
resistentes a los antibióticos (ARB) y genes de resistencia a los antibióticos (ARG), que se
han convertido en una preocupación pública mundial ( Pruden et al.,
2006 ). Como contaminantes emergentes , los ARG se han detectado en una variedad de
compartimentos ambientales, como las aguas residuales de hospitales ( Durham et al.,
2010 , Vinue et al., 2010 );plantas de tratamiento de aguas residuales ( LaPara et al.,
2011 , Zhang y Zhang, 2011 ); pollo ( He et al., 2014 ), carne de res ( Hoyle et al., 2006 ),
cerdo ( He et al., 2016 , Xia et al., 2010 ), lechería ( Srinivasan et al., 2005 ) y granjas de
acuicultura ( Ishida et al., 2010 , Tamminen et al., 2011 ); y aguas superficiales y
sedimentos ( Pei et al., 2006 , Storteboom et al., 2010a , Storteboom et al., 2010b). Los
ARG pueden transferirse de fuentes humanas y animales a diferentes compartimentos
ambientales, incluidas las fuentes de agua potable y el agua del grifo, lo que en última
instancia amenaza la salud humana ( Becerra-Castro et al., 2015 , He et al., 2016 ). Por lo
tanto, es necesario comprender su abundancia en las fuentes de agua potable y su
eliminación en las plantas de tratamiento de agua potable (ETAP).
Estudios anteriores demostraron que los ARB y ARG prevalecen en las fuentes de agua
potable y los sistemas de distribución ( Bergeron et al., 2015 , Coleman et al.,
2013 , Fernando et al., 2016 , Guo et al., 2014 , Jiang et al., 2013 , Skariyachan et al.,
2015 ). Se informó que las cepas de coliformes fecales aisladas de una importante fuente
de agua potable en la India eran resistentes a un máximo de 37 antibióticos ( Skariyachan
et al., 2015 ). Además, se han detectado diversos ARG que proporcionan resistencia a
sulfonamida, tetraciclina , cefalosporina, cloranfenicol y penicilina en fuentes de agua
potable (Bergeron et al., 2015 , Fernando et al., 2016 , Lyimo et al., 2016 , Skariyachan et
al., 2015 ) y DWTP ( Bai et al., 2015 , Guo et al., 2014 , Jiang et al., 2013 ). La filtración
con carbón activado biológico (BAC) y la desinfección con cloraminas en las ETAP
podrían mejorar la resistencia de los ARB contra ampicilina, kanamicina, rifampicina,
cloranfenicol y estreptomicina ( Bai et al., 2015 ). Xu y col. informó que la filtración de BAC
aumentó el número de ARG detectados y la desinfección final con cloramina mejoró la
abundancia relativa de ARG en el agua tratada generada a partir de las ETAP ( Xu et al.,
2016). El ozono puede reaccionar con la materia orgánica y los metales en el agua, pero
afectó levemente a las bacterias y ARG ( Guo et al., 2014 , Xu et al., 2016 ). La filtración
de arena aumentó la abundancia relativa de ARG, pero disminuyó las concentraciones
absolutas de ARG ( Xu et al., 2016 ). Sin embargo, la comprensión de la eliminación de
ARG en las ETAP y los sistemas de distribución aún es limitada. Por lo tanto, es
necesario comprender la variación de los ARG desde la fuente hasta el agua del grifo.
La región del delta del río Pearl (PRD) es un área densamente poblada, y tres grandes
ríos, los ríos Este, Oeste y Norte, son las principales fuentes de agua potable, que
abastecen a una población de>  1,4 millones de personas en Guangzhou, China. El
objetivo de este estudio fue investigar la abundancia de ARG en la fuente y el agua del
grifo, el vínculo potencial entre la comunidad bacteriana y los ARG, y la eliminación de
ARG en las ETAP en la región del PRD. Los ARG seleccionados en esta investigación
incluyeron genes de resistencia a tetraciclina, sulfonamida, macrólido, cloranfenicol y
quinolona, que proporcionaron resistencia a los antibióticos más utilizados. Los resultados
de este estudio pueden proporcionar una mejor comprensión de la diversidad,
abundancia, diseminación y eliminación de ARG en el sistema de procesamiento y
distribución de agua potable.
2 . materiales y métodos
2.1 . Sitios de estudio y recolección de muestras
El delta del río Pearl, en el sur de China, fue seleccionado como el área de estudio, con
Guangzhou como la capital de la región. Los ríos Este, Norte y Oeste son grandes ríos en
la región y se utilizan como fuentes de agua potable (Fig. S1). Debido a la accesibilidad
limitada para el muestreo, solo se seleccionaron dos ETAP, la Planta A y la Planta B,
ubicadas en el centro de la ciudad de Guangzhou, para investigar la aparición y
eliminación de ARG en diferentes fases de tratamiento (Fig. S1 y Fig. 1 ). La información
detallada de la Planta A y la Planta B se muestra en la Tabla S1. La planta A es una
planta piloto que procesa 3000  m 3 / día de agua potable, procedente del río Pearl. La
planta A utiliza carbón activado granular (GAC) y carbón activado en polvo (PAC) en
paralelo para optimizar los parámetros del proceso (Tabla S1 yFigura 1 ). La Planta B es
una planta en pleno funcionamiento que trata hasta 1.000.000  m 3 / día de agua potable,
procedente del North River. La Planta B consta de un tanque de sedimentación, filtro de
arena, tanque de contacto de O 3 , GAC, tanque de agua limpia y efluente (Tabla S1 y Fig.
1 ). Debido a la diferencia en el tamaño de las plantas, las dos plantas no eran
comparables. Se recolectaron muestras de agua, incluidas las fuentes de agua potable
(ER, WR y NR) y su correspondiente agua del grifo (ER-T, WR-T y NR-T), de los tres ríos
(Este, Oeste y Norte). y de casas en Guangzhou durante diciembre de 2013 y marzo de
2014. Además, también se recolectaron muestras de agua de las Plantas A y B; los sitios
de muestreo se presentan en la Fig.1. Se recolectaron cinco y seis muestras de agua de
las Plantas A y B, respectivamente. Se recolectaron un total de 17 muestras de agua por
triplicado para este estudio.

Figura 1 . El proceso de tratamiento de agua y los sitios de muestreo en las Plantas

de tratamiento de agua potable A y B. A1-A5 fueron sitios de muestreo en la Planta A. B1-
B6 fueron sitios de muestreo en la Planta B.
2.2 . Extracción y purificación de ADN
Para las muestras de agua,  se filtraron 500 mL de cada muestra a través de un filtro de
membrana estéril (diámetro de poro de 0.45 μm) utilizando un aparato de filtración al
vacío ( Luo et al., 2010 , Ma et al., 2014 ), y los filtros de membrana se mantuvieron
asépticamente a -  80 ° C para la extracción total de ADN. El ADN se extrajo de los filtros
de membrana utilizando el PowerSoil DNA Isolation Kit (Mobio, EE. UU.), Siguiendo el
protocolo proporcionado por el fabricante. El ADN se purificó adicionalmente utilizando el
kit DNA Spin (Tiangen, China) para minimizar la inhibición de la PCR. En total, se
obtuvieron tres muestras de ADN para análisis molecular de cada muestra. La
concentración y la calidad de las muestras de ADN se determinaron mediante
un espectrofotómetro SmartSpec Plus (Bio-Rad, EE.UU.) y 1,5% de agarosa gel de
electroforesis .

2.3 . Cuantificación de ARG
Se utilizó PCR cuantitativa (qPCR) para cuantificar la abundancia de 27 ARG en muestras
de agua con un kit de qPCR en tiempo real SYBR Green (TaKaRa, Japón). Los
cebadores específicos de los genes de ARNr de 27 ARG y ARNr 16S se enumeran en la
Tabla S2. Los controles positivos contenían amplicones de PCR clonados y secuenciados
obtenidos de lodos de plantas de tratamiento de aguas residuales y estiércol de granjas
ganaderas, y en cada ejecución se incluyeron controles positivos y negativos (agua Milli-
Q). Se realizaron un total de 40  ciclos para mejorar las posibilidades de formación de
producto a partir de concentraciones iniciales bajas. Se utilizó una solución de reacción de
PCR de 20 μL: 10  μL de 2  ×  SYBR® Premix Ex Taq ™ (Tli RNaseH Plus), 0,08  μL de
cada  cebador 0,05 mM, 0,04  μL de 50 ×  colorante de referencia ROX, 2  μl de plantilla
de ADN (ADN  <  80  ng) y 7,8  μl de agua destilada (tratada con DNasa I). Los ensayos
de qPCR se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems ViiA7
(ABI, EE. UU.). El programa de temperatura para la cuantificación de ARG fue el
siguiente: desnaturalización inicial a 95  ° C durante 1  min, seguido de 40  ciclos de
15  sa 95  ° C, temperaturas de recocido de cada gen (Tabla S2) durante 30  s, 72  ° C
durante 30 s, y un paso final para una curva de fusión. La curva estándar de cada gen se
generó mediante una dilución de 10 veces de los plásmidos que llevan el gen diana, que
van desde 10 6 copias a 10 1 copias, con tres réplicas. El número de copias de cada gen
ARG y ARNr 16S se calculó a partir de la curva estándar correspondiente utilizando
el valor C T de cada gen en las ejecuciones de qPCR. El cuadrado del coeficiente
relacionado (r 2 ) de la curva estándar osciló entre 0,99 y 0,998, y la eficiencia de
amplificación osciló entre el 95% y el 110%.
2.4 . Secuenciación y procesamiento de datos de alto rendimiento
La secuenciación del amplicón del gen del ARNr 16S fue realizada por Shanghai
BIOZERON Biotechnology Co., Ltd. China para la taxonomía de especies microbianas en
fuentes de agua potable, agua del grifo y DWTP. Los cebadores específicos (515F:
GTGCCAGCMGCCGCGGTAA y 806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT) se aplicaron
para la amplificación de la región V4 del gen de rRNA 16S ( Caporaso et al., 2011 ). Los
productos de la PCR (320–350  pb) se reciclaron utilizando un kit de gel AxyPrepDNA. A
continuación, se construyó la biblioteca y se llevó a cabo la secuenciación del amplicón
del gen del ARNr 16S en la plataforma MiSeq PE250 (Illumina, EE. UU.) Utilizando la
estrategia MiSeq 2  ×  250 bp de extremos emparejados. Los datos generados se filtraron
para eliminar las lecturas que contienen tres o más nucleótidos ambiguos , aquellos con
un puntaje de calidad por debajo de 30, o aquellos con una longitud de secuencia
<  100  pb. Las secuencias de extremos emparejados se fusionaron usando FLASH
(Ajuste rápido de longitud de lecturas cortas, V1.2.11), con el umbral de error máximo
esperado establecido en 1.0. Las secuencias fusionadas se filtraron en función de la
calidad de la secuencia utilizando el programa de filtro FASTQ, con el umbral de error
máximo esperado establecido en 0,5 y la longitud de secuencia mínima establecida en
250  bp. Las unidades taxonómicas operativas (OTU) se agruparon utilizando USEARCH
(V7.1) en el umbral de divergencia del 3%, y las anomalías se eliminaron utilizando
UCHIME (V4.2.40). Después de filtrar por calidad, las secuencias se alinearon con las
secuencias de ARNr 16S en la base de datos de Greengenes (Versión
13.5 http://greengenes.secondgenome.com/) con datos de OTU para identificar especies
a nivel de filo, clase, orden, familia y género. Para explorar el vínculo potencial entre la
comunidad bacteriana y los ARG, los datos de OTU se evaluaron contra una base de
datos ARG ampliamente aceptada, la Base de datos de resistencia a antibióticos
(ARDB, http://ardb.cbcb.umd.edu /), para inferir sobre posibles portadores de ARG ( Fang
et al., 2014 ). Para evitar sesgos en el análisis de la diversidad alfa y beta, el número de
secuencias en cada muestra se normalizó a 15.468 secuencias / muestra antes del
cálculo para estandarizar el esfuerzo de secuenciación entre muestras. Las secuencias
obtenidas en el presente estudio se depositaron en la base de datos del NCBI con el
número de acceso SRP109695.
2.5 . Cálculo de eliminación de ARG
La remoción de ARG se calculó como remoción de troncos ( Da Silva et al.,
2006 ). Eliminación total de ARGs  =  log X afluente  -  log X efluente , donde X fue la
concentración de ARG, afluente fue el agua afluente de la planta de tratamiento de agua
potable , efluente fue el agua efluente final de la planta de tratamiento de agua
potable. Eliminación de ARG para el proceso de tratamiento i  =  log X influent- i  -  log
X efluente- i , donde X era la concentración de ARG, influent- i era el influente del proceso de
tratamiento de agua potable seleccionado i, y efluente- i fue el efluente del proceso de
tratamiento de agua potable seleccionado i .
2.6 . Estadísticas
Los análisis de correlación se realizaron con SPSS 17.0. ANOVA de una vía se utilizó
para probar la importancia de las diferencias de abundancia ARGs, los datos de UOT, alfa
valores de eliminación de diversidad y de registro de ARGs entre muestras
a p  <  0,05. Los promedios y las desviaciones estándar se calcularon utilizando Microsoft
Excel 2003. Los valores de abundancia relativa de diferentes taxones bacterianos se
transformaron utilizando la raíz cuadrada antes de aplicar pruebas multivariadas. Se
aplicaron transformaciones logarítmicas y Hellinger a los datos ARG y OTU,
respectivamente. La agrupación jerárquica se realizó sobre los datos de las OTU y las
comunidades bacterianas a nivel de filo, con Bray-Curtis como métrica de distancia,
utilizando R 3.1.
3 . Resultados
3.1 . ARG en fuentes de agua potable
La presencia y abundancia de los ARG objetivo en las muestras de agua estudiadas se
presentan en la Fig.2 . Se detectaron 21 ARG en fuentes de agua potable mediante PCR
cuantitativa en tiempo real y seis genes, sul3 , ermC , tetB / P , tetC , tetH y tetT , estaban
por debajo del límite de cuantificación (Tabla S2). La concentración más alta de ARG en
los ríos Este, Oeste y Norte fue la de floR , seguida de sul1 . La concentración más baja
de ARG en los ríos Este y Norte fue la del gen de resistencia a las quinolonas qepA ,
mientras que la concentración de qnrAfue el más bajo en el West River ( Fig. 2 ). Para
East River, Río West y North River, las concentraciones de cinco clases de ARGs diana
variaron de 10 7  copias / L a 10 9  copias / L (Fig. S2). Las concentraciones de genes de
resistencia al cloranfenicol fueron las más altas, seguidas de los genes de resistencia a
las sulfonamidas, y las concentraciones de genes de resistencia a las quinolonas fueron
las más bajas en las tres fuentes de agua potable. El gen de resistencia al
cloranfenicol floR tuvo la mayor abundancia relativa de ARG normalizado al gen de ARNr
16S (concentración de ARG objetivo / concentración de gen de ARNr 16S) para las tres
fuentes de agua potable, seguido de sul1(Figura S3). Entre las tres fuentes de agua
potable, las concentraciones totales de ARG objetivo fueron las más altas ( p  <  0.05) en
el East River, con una concentración de 3.51  ×  10 9  ±  5.27  ×  10 8  copias / L, seguidas
por los ríos North y West. (1,83  ×  10 9  ±  2,72  ×  10 8  copias / L y
1,84  ×  10 9  ±  2,77  ×  10 8  copias / L, respectivamente, p  >  0,05).
Figura 2 . Concentraciones de ARG en fuentes de agua potable y agua corriente
correspondiente. ER-T, agua del grifo procedente del East River; WR-T, agua del grifo
procedente del West River; NR-T, agua del grifo procedente del North River; Gen de ARNr
16S, 16S. El eje Y se muestra en escala logarítmica.
3.2 . ARG en agua del grifo
Se detectaron quince ARG en muestras de agua del grifo y doce genes
( sul3 , ermC , tetA , tetB / P , tetC , tetH , tetS , tetT , tetX , qnrA , qnrB y qnrD ) fueron
indetectables en las muestras de agua del grifo analizadas ( Fig. .2 ). Los ARG con las
concentraciones más altas fueron cmlA , oqxB y floR para las muestras de agua del grifo
NR-T, WR-T y ER-T, respectivamente. El gen de resistencia a la tetraciclina tetQtuvo la
concentración más baja en las muestras de agua del grifo WR-T y ER-T, respectivamente,
y tetO tuvo la concentración más baja en la muestra de agua del grifo NR-T. Entre las
cinco clases de ARG, los genes de resistencia al cloranfenicol tenían la concentración
más alta en las muestras de agua del grifo NR-T y ER-T, y los genes de resistencia a las
quinolonas tenían la concentración más alta en la muestra de agua del grifo WR-T (Fig.
S2). Los genes de resistencia a las sulfonamidas estaban por debajo del límite de
cuantificación para la muestra de agua del grifo ER-T. Las concentraciones de genes de
resistencia a macrólidos fueron las más bajas en las muestras de agua del grifo NR-T y
WR-T. De acuerdo con las abundancias relativas de ARG normalizados a genes de ARNr
16S, cmlA , oqxB y floRfueron los más abundantes en las muestras de agua del grifo NR-
T, WR-T y ER-T, respectivamente (Fig. S3). Entre estas tres muestras de agua del grifo,
NR-T tuvo la concentración total más alta de los ARG objetivo
(1,89  ×  10 8  ±  2,90  ×  10 7  copias / L; p  <  0,05), seguida de WR-T y ER-T
(1,74  ×  10 7  ±  2,39  ×  10 6  copias / L y 1,18  ×  10 7  ±  1,62  ×  10 6  copias / L,
respectivamente, p  >  0,05).
3.3 . ARG en dos plantas de tratamiento de agua potable
Se detectaron 21 y 20 ARG en los afluentes de las Plantas A y B, respectivamente ( Fig.
3 ). Sul1 fue el ARG más abundante en las Plantas A y B, mientras
que qepA y qnrA fueron los ARG menos abundantes en las Plantas A y B,
respectivamente. La planta A produjo dos aguas potables finales: el efluente de la
filtración de carbón activado en polvo (PAC) y el efluente de la filtración de carbón
activado granular (GAC). Las concentraciones totales de los ARG objetivo en los efluentes
finales fueron 1,48  ×  10 9  ±  2,00  ×  10 8  copias / L después de la filtración con carbón
activado en polvo, y 2,27  ×  10 9  ±  2,04 ×  10 8  copias / L después de la filtración de
carbón activado granular, y la eliminación de todos los procesos de tratamiento (en
comparación con el influente) fue de 0,23 log y 0,06 log (datos no mostrados) para
activado en polvo línea de filtración de carbono (A1, A2, A3 , y A4) y la línea de filtración
de carbón activado granular (A1, A2, A3 y A5), respectivamente ( Fig. 1 ). Los niveles de
eliminación de ARG en los procesos de tratamiento de la Planta A se proporcionan en
la Tabla 1 . Se observó que la filtración de arena tenía una  eliminación de > 3 log para los
genes de resistencia a
quinolonas qepA , qnrA , qnrB , qnrD y qnrS . Seis ARG , ermB , tetM, TetO , tetQ , tets ,
y tetW , se retiraron a un nivel de>  1-log por filtración de arena. La eliminación total de
ARG mediante filtración con arena fue de 0,35 log, seguida de filtración con carbón
activado en polvo (0,01 log). El filtro de carbón activado granular no eliminó ARG, y el
aumento para los ARG individuales osciló entre 0,06 log y 5,26 log. Se detectaron cinco
genes, qepA , qnrA , qnrB , qnrD y qnrS , que estaban por debajo del límite de
cuantificación después de la filtración con arena, después de la filtración con carbón
activado granular.
Figura 3 . Concentraciones de ARG en las Plantas A y B. PAC, carbón activado en
polvo; GAC, carbón activado granular; Gen de ARNr 16S, 16S. El eje Y se muestra en
escala logarítmica.
Cuadro 1 . Los valores de remoción de logaritmos de ARG en los procesos de tratamiento
de la Planta A y Planta B.
Para la Planta B, la concentración total de ARG objetivo fue
1,65  ×  10 9  ±  2,48  ×  10 8  copias / L en el afluente, y
7 6
1,07  ×  10    ±  1,63  ×  10    copias / L en el efluente final, y la eliminación por todos los
compartimentos de tratamiento fueron 2,19 log. El tanque de agua limpia eliminó la mayor
cantidad de ARG (1.3 log), seguido de sedimentación (0.69 log) y filtración de arena (0.48
log) ( Tabla 1 ). Se encontró que el tanque de agua limpia
elimina sul1 , sul2 , tetA , tetM , tetS , qepA ,qnrB , qnrD y qnrS por>  3-log. De manera
similar, el filtro de arena podría eliminar tetS , qnrD y qnrS en>  3-log, y la sedimentación
eliminó tetA y qnrA en>  3-log. Sin embargo, la eliminación de todos los ARG por filtración
de carbón activado granular y algunos ARG por el tanque de contacto de O 3 fueron
negativos, lo que indica que las concentraciones de algunos ARG aumentaron después
del procesamiento a través de estos dos procesos ( Cuadro 1 , p  < 0,05). En general, el
tanque de agua limpia, el tanque de sedimentación y el filtro de arena en la Planta B
jugaron un papel principal en la remoción de ARG del agua.
3.4 . Comunidad bacteriana en fuentes de agua potable, agua del grifo y planta de
tratamiento de agua potable
La diversidad alfa de bacterias en fuentes de agua potable, agua del grifo y muestras de
DWTP se presenta en la Tabla S3. El estimador Chao1 osciló entre 338 y 560. La
cobertura de Good estuvo entre 0,994 y 0,997, y el índice de Shannon para muestras de
agua osciló entre 3,37 y 4,76.
Actinobacteria , Proteobacteria y Bacteroidetes fueron los phyla más abundantes en las
comunidades bacterianas de muestras de fuentes de agua potable (Tabla S4 y Fig.
4 ). Actinobacteria fue el filo más abundante en West River (47.54%  ±  5.88%) y North
River (42.15%  ±  5.35%), seguido de Proteobacteria . Las proteobacterias fueron las
bacterias más abundantes en el East River, seguidas de Actinobacteria . Entre las cinco
clases de proteobacterias , las betaproteobacterias fueron las más abundantes en los ríos
este, oeste y norte, seguidas deAlphaproteobacteria (Tabla S5 y Fig. 4 ).
4 . Discusión
4.1 . Variación de ARG de la fuente al agua del grifo
En este estudio, varios ARG (10 4 -10 9  se detectaron copias / L) en las tres fuentes de
agua potable (el Este, Oeste, Norte y ríos), que son similares a los niveles medidos en el
río Huangpu y las fuentes de beber agua en Shanghai (10 4 –10 8  copias / L) ( Jiang et al.,
2013 ). Nueve ( sul2 , tetA , tetM , tetS , tetX , qepA , qnrA , qnrB y qnrD ), ocho
( sul1 , tetA , tetS , tetX ,qnrA , qnrB , qnrD y qnrS ) y
diez ARG ( sul1 , sul2 , tetA , tetS , tetX , qepA , qnrA , qnrB , qnrD y qnrS ) se eliminaron
del agua del grifo del agua potable de los ríos North, West y East fuentes,
respectivamente ( Fig. 2 ). Además, las concentraciones totales de ARG objetivo en el
agua del grifo disminuyeron significativamente, que fueron uno o dos órdenes de
magnitud más bajas que las de sus fuentes de agua correspondientes (ANOVA de una
vía, p  < 0,05). Esto sugiere que los procesos de tratamiento de
agua potable desempeñan un papel clave en la eliminación de ARG de las fuentes de
agua.
Sin embargo, la abundancia total de ARG en el agua del grifo correspondiente (por
ejemplo, en NR-T, 1,89  ×  10 8  ±  2,90  ×  10 7  copias / L) fue mayor que la del agua
totalmente procesada de la Planta B (1,08  ×  10 7  ±  1,63  ×  10 6  copias / L)
( p  <  0,05). La abundancia de la mayoría de los ARG,
incluidos sul1 , ermB , tetQ , tetW , cfr , cmlA , fexA , fexB , floR y qnrS, aumentó
significativamente del agua tratada en el sistema de distribución al agua del grifo. Esto
puede atribuirse a la posibilidad de que esos genes sean transportados por bacterias que
pueden sobrevivir a los procesos de tratamiento de agua, ya que se observó un aumento
significativo de la prevalencia (Fig. S3 y Fig. S6). Los resultados de este estudio son
consistentes con los de Xi et al., Quienes informaron que las cantidades
de cat , cmr , sul1 y sul2 en el agua del grifo eran más altas que las de la fuente y el agua
tratada (mezcla rápida, floculación , sedimentación, y desinfección con monocloramina)
( Xi et al., 2009). La mayor resistencia de los ARB a la amoxicilina, el cloranfenicol y la
rifampicina observada en el agua del grifo sugirió que los sistemas de distribución de
agua podrían servir como una incubadora para el crecimiento de la población de ARB y
como un reservorio para la propagación de la resistencia a los antibióticos frente a
patógenos oportunistas ( Xi et al., 2009 ).
Se informó que también se detectaron algunos ARB que albergan ARG y determinantes
de virulencia en la red de distribución de agua potable ( Faria et al., 2009 , Ram et al.,
2008 ). Faria y col. (2009) identificado coagulasa-negativos estafilococos (CNS) que eran
resistentes a beta-lactamas, tetraciclina , clindamicina y la eritromicina de un tratamiento
de agua potable planta y red de distribución en Portugal. Además, se detectaron genes de
resistencia a msrA , ermA , ermC y mecA en estas cepas del
SNC. Escherichia coli enterohemorrágica(EHEC) se han aislado de los sistemas de
distribución de agua potable en la India ( Ram et al., 2008 ). Entre los determinantes de
virulencia, los genes stx1 y stx2 estaban presentes en el 33,3% de los aislamientos,
mientras que otros poseían stx1 (11,1%) o stx2 (55,6%). Los determinantes de
virulencia eaeA , hlyA y chuA estaban presentes en el 100%, 23,3% y 16,7% de los
aislamientos, respectivamente ( Ram et al., 2008 ). Estos estudios indican que los ARG,
incluso los ARB que albergan determinantes de virulencia, existían en el agua. Se
necesita más investigación para explorar sus fuentes (sobrevivientes de las plantas de
tratamiento de agua potable, biopelículas desprendidas del sistema de
distribución, cambios transitorios de presión en el sistema, roturas principales y
contaminación de las tuberías de las instalaciones).
Algunos estudios anteriores han informado que ciertos ARG pueden usarse como
indicadores de la abundancia general de genes de resistencia en los sistemas
acuáticos. Por ejemplo, tetA puede indicar la abundancia de genes de resistencia a la
tetraciclina en la acuicultura ( Huang et al., 2017 ), y tetB puede indicar la abundancia de
ARG en aguas residuales y ríos receptores ( Makowska et al., 2016 ). Se realizó un
análisis de correlación de Pearson para evaluar las correlaciones entre los diversos tipos
de genes de resistencia, la suma de las cinco clases de ARG (∑  sul , ∑  erm , ∑  tet ,
∑  cml y ∑  qnr ) y la abundancia total de ARG (∑ ARG) en muestras de agua. Los
resultados demostraron que hubo correlaciones positivas y fuertes entre los ARG (que
confieren resistencia a antibióticos de la misma clase y de diferentes clases) en muestras
de agua (Tabla S6). Esto está de acuerdo con un estudio previo de Huang et
al. (2017) quienes encontraron que tetA se correlacionó significativamente con ∑  tet ,
∑  ARGs e intI1 ( p  <  0.01) ( Huang et al., 2017 ). Cuatro genes,
incluidos sul1 , sul2 , floR y cmlA , fueron los ARG más abundantes en las muestras de
agua ( Fig.1 , Fig.2). Estos cuatro ARG se correlacionaron de manera significativa y
positiva con la mayoría de los demás ARG, ∑  sul , ∑  erm , ∑  tet , ∑  cml , ∑  qnr y
∑  ARG ( R  =  0.504-0.993, p  < 0.05 o 0.01) (Tablas S5 y S6) . Además, estos cuatro
genes se han detectado con frecuencia en diversos entornos acuáticos ( He et al.,
2014 , Su et al., 2012 ). Por tanto, sul1 , sul2 , floR y cmlA  podrían utilizarse como
indicadores potenciales para evaluar la contaminación y el destino de los ARG en los
sistemas de agua potable.
Figura 4 . Composición de la comunidad microbiana a nivel de filo para la fuente de agua,
agua del grifo y planta de tratamiento de agua potable B. WR: fuente de agua en West
River; ER: fuente de agua en East River; WR-T: agua del grifo procedente de West
River; ER-T: agua del grifo procedente de East River. B1 – B6: muestras de agua de
diferentes etapas en la Planta B. B1, fuente de agua en North River; B2, muestra de agua
después del tratamiento de sedimentación; B3, muestra de agua después de la filtración
con arena; B4, muestra de agua después de la ozonizacióntratamiento; B5, muestra de
agua después del filtro de filtración activado granular; B6, muestra de agua después del
tratamiento del tanque de agua limpia. Los conglomerados 1, 2 y 3 representan tres
grupos según su similitud. Los taxones raros abarcaron todos los taxones con
abundancias inferiores al 1%. Los valores son el promedio de análisis por triplicado para
cada muestra.
Proteobacteria , Actinobacteria , Firmicutes y Cyanobacteria fueron los phyla más
abundantes en la comunidad bacteriana del agua del grifo (Tabla S4 y Fig. 4 ). Las
abundancias relativas de proteobacterias fueron las más altas en el agua del grifo de los
ríos Este, Oeste y Norte. Similar a la fuente de agua potable, Betaproteobacteria fue
la Proteobacteria más abundante en el agua del grifo del East River
(59,79%  ±  9,45%). Las bacterias más abundantes en el agua del grifo del West River
fueron Alphaproteobacteria y Gammaproteobacteria , y Alphaproteobacteria yLas
betaproteobacterias predominaron en el agua del grifo del río Norte (Tabla S5 y Fig. 4 ).
En la Planta B, la composición de la comunidad microbiana difirió entre los procesos de
tratamiento (Tabla S4 y Fig. 4 ). Actinobacteria fue la bacteria más abundante en la
muestra del influente (B1). Las proteobacterias fueron los filos bacterianos más
abundantes en las muestras B2, B3, B4, B5 y B6. Las secuencias afiliadas
a Betaproteobacteria fueron prevalentes (>  69% de las lecturas totales) en las muestras
B1, B2 y B3, pero las muestras B4 y B5 estuvieron dominadas por secuencias afiliadas
a Alphaproteobacteria (Tabla S5). En las muestras de agua finales, las secuencias
afiliadas a ambas clases fueron las más prevalentes.
También se investigaron los cambios en el género bacteriano portador de ARG en la
Planta B (Fig. S4). Streptomyces fue el género más abundante en el influente
(15,03%  ±  2,42%), seguido de Flavobacterium y Clavibacter . Después de la
sedimentación y la filtración de arena, Flavobacterium fue el género más
abundante. Methylobacterium , Mycobacterium y Mesorhizobium fueron los géneros más
abundantes después de la ozonización , con una abundancia relativa total de
58,4%. Después del paso de filtración de GAC, las secuencias afiliadas
al género Pseudomonas fueron abundantes, seguidas de Bdellovibrio y
Alkaliphilus . Después del tratamiento en el tanque de agua
limpia, Janthinobacterium , Mycobacterium , Pseudomonas , Bacillus , Azorhizobium y Bur
kholderia fueron los géneros más abundantes, con una abundancia relativa total de
61.08%.
3.5 . Análisis de correlación de Pearson para ARG en muestras de agua
Los resultados del análisis de correlación de Pearson entre cada ARG, ∑  sul , ∑  erm ,
∑  tet , ∑  cml , ∑  qnr y ∑  ARG en muestras de agua se presentan en las Tablas S5 y
S6. La mayoría de los genes de resistencia,
excluyendo cfr , fexA , fexB , oqxB , qnrA , qnrB , qnrD y qnrS , se correlacionaron
positivamente con ∑  sul , ∑  erm , ∑  tet , ∑  cml y ∑  ARG ( r  =  0,486-1,000, p <  0.01 o
0.05). Cuatro ARG , sul1 , sul2 , floR y cmlA , se correlacionaron significativamente de
manera positiva con la mayoría de los otros ARG, ∑  sul , ∑  erm , ∑  tet , ∑  cml , ∑  qnr y
∑  ARG ( R  =  0,504-0,993, p  <  0.05 o 0.01).
4 . Discusión
4.1 . Variación de ARG de la fuente al agua del grifo
En este estudio, varios ARG (10 4 -10 9  se detectaron copias / L) en las tres fuentes de
agua potable (el Este, Oeste, Norte y ríos), que son similares a los niveles medidos en el
río Huangpu y las fuentes de beber agua en Shanghai (10 4 –10 8  copias / L) ( Jiang et al.,
2013 ). Nueve ( sul2 , tetA , tetM , tetS , tetX , qepA , qnrA , qnrB y qnrD ), ocho
( sul1 , tetA , tetS , tetX ,qnrA , qnrB , qnrD y qnrS ) y
diez ARG ( sul1 , sul2 , tetA , tetS , tetX , qepA , qnrA , qnrB , qnrD y qnrS ) se eliminaron
del agua del grifo del agua potable de los ríos North, West y East fuentes,
respectivamente ( Fig. 2 ). Además, las concentraciones totales de ARG objetivo en el
agua del grifo disminuyeron significativamente, que fueron uno o dos órdenes de
magnitud más bajas que las de sus fuentes de agua correspondientes (ANOVA de una
vía, p  < 0,05). Esto sugiere que los procesos de tratamiento de
agua potable desempeñan un papel clave en la eliminación de ARG de las fuentes de
agua.
Sin embargo, la abundancia total de ARG en el agua del grifo correspondiente (por
ejemplo, en NR-T, 1,89  ×  10 8  ±  2,90  ×  10 7  copias / L) fue mayor que la del agua
totalmente procesada de la Planta B (1,08  ×  10 7  ±  1,63  ×  10 6  copias / L)
( p  <  0,05). La abundancia de la mayoría de los ARG,
incluidos sul1 , ermB , tetQ , tetW , cfr , cmlA , fexA , fexB , floR y qnrS, aumentó
significativamente del agua tratada en el sistema de distribución al agua del grifo. Esto
puede atribuirse a la posibilidad de que esos genes sean transportados por bacterias que
pueden sobrevivir a los procesos de tratamiento de agua, ya que se observó un aumento
significativo de la prevalencia (Fig. S3 y Fig. S6). Los resultados de este estudio son
consistentes con los de Xi et al., Quienes informaron que las cantidades
de cat , cmr , sul1 y sul2 en el agua del grifo eran más altas que las de la fuente y el agua
tratada (mezcla rápida, floculación , sedimentación, y desinfección con monocloramina)
( Xi et al., 2009). La mayor resistencia de los ARB a la amoxicilina, el cloranfenicol y la
rifampicina observada en el agua del grifo sugirió que los sistemas de distribución de
agua podrían servir como una incubadora para el crecimiento de la población de ARB y
como un reservorio para la propagación de la resistencia a los antibióticos frente a
patógenos oportunistas ( Xi et al., 2009 ).
Se informó que también se detectaron algunos ARB que albergan ARG y determinantes
de virulencia en la red de distribución de agua potable ( Faria et al., 2009 , Ram et al.,
2008 ). Faria y col. (2009) identificado coagulasa-negativos estafilococos (CNS) que eran
resistentes a beta-lactamas, tetraciclina , clindamicina y la eritromicina de un tratamiento
de agua potable planta y red de distribución en Portugal. Además, se detectaron genes de
resistencia a msrA , ermA , ermC y mecA en estas cepas del
SNC. Escherichia coli enterohemorrágica(EHEC) se han aislado de los sistemas de
distribución de agua potable en la India ( Ram et al., 2008 ). Entre los determinantes de
virulencia, los genes stx1 y stx2 estaban presentes en el 33,3% de los aislamientos,
mientras que otros poseían stx1 (11,1%) o stx2 (55,6%). Los determinantes de
virulencia eaeA , hlyA y chuA estaban presentes en el 100%, 23,3% y 16,7% de los
aislamientos, respectivamente ( Ram et al., 2008 ). Estos estudios indican que los ARG,
incluso los ARB que albergan determinantes de virulencia, existían en el agua. Se
necesita más investigación para explorar sus fuentes (sobrevivientes de las plantas de
tratamiento de agua potable, biopelículas desprendidas del sistema de
distribución, cambios transitorios de presión en el sistema, roturas principales y
contaminación de las tuberías de las instalaciones).
Algunos estudios anteriores han informado que ciertos ARG pueden usarse como
indicadores de la abundancia general de genes de resistencia en los sistemas
acuáticos. Por ejemplo, tetA puede indicar la abundancia de genes de resistencia a la
tetraciclina en la acuicultura ( Huang et al., 2017 ), y tetB puede indicar la abundancia de
ARG en aguas residuales y ríos receptores ( Makowska et al., 2016 ). Se realizó un
análisis de correlación de Pearson para evaluar las correlaciones entre los diversos tipos
de genes de resistencia, la suma de las cinco clases de ARG (∑  sul , ∑  erm , ∑  tet ,
∑  cml y ∑  qnr ) y la abundancia total de ARG (∑ ARG) en muestras de agua. Los
resultados demostraron que hubo correlaciones positivas y fuertes entre los ARG (que
confieren resistencia a antibióticos de la misma clase y de diferentes clases) en muestras
de agua (Tabla S6). Esto está de acuerdo con un estudio previo de Huang et
al. (2017) quienes encontraron que tetA se correlacionó significativamente con ∑  tet ,
∑  ARGs e intI1 ( p  <  0.01) ( Huang et al., 2017 ). Cuatro genes,
incluidos sul1 , sul2 , floR y cmlA , fueron los ARG más abundantes en las muestras de
agua ( Fig.1 , Fig.2). Estos cuatro ARG se correlacionaron de manera significativa y
positiva con la mayoría de los demás ARG, ∑  sul , ∑  erm , ∑  tet , ∑  cml , ∑  qnr y
∑  ARG ( R  =  0.504-0.993, p  < 0.05 o 0.01) (Tablas S5 y S6) . Además, estos cuatro
genes se han detectado con frecuencia en diversos entornos acuáticos ( He et al.,
2014 , Su et al., 2012 ). Por tanto, sul1 , sul2 , floR y cmlA  podrían utilizarse como
indicadores potenciales para evaluar la contaminación y el destino de los ARG en los
sistemas de agua potable.
4.2 . La eliminación de ARG y la variación de la comunidad bacteriana.
Ambas plantas A y B podrían eliminar los ARG mediante filtración de arena (0,35 log para
la planta A y 0,48 log para la planta B). Se observó disminución de la abundancia de
ARGs después de la filtración de arena ( Tabla 1 y Fig. 3 ), y de quinolona y tetraciclina
genes de resistencia ( qepA , qnrA , qnrB , qnrD , qnrS , tetM , tetO , tetQ , tets , y tetW )
se eliminaron en una nivel más alto. Esto es consistente con resultados previos para
plantas de tratamiento de agua en el delta del río Yangtze, China ( Guo et al., 2014 ), en
el que las abundancias de la mayoría de los ARG objetivo
(sul1 , sul2 , tetA , tetB , tetM , tetO , tetW , y TeTx ) se redujeron después de la filtración
de arena. Los resultados de este estudio y el de Guo et al. (2014) , indicó que la filtración
de arena es más efectiva para eliminar ARG que otros procesos de tratamiento. Esto
podría deberse al uso de arena de cuarzo en el filtro de arena, que es capaz de filtrar y
eliminar los sólidos en suspensión y los microorganismos del agua ( Matikka y Heinonen-
Tanski, 2016). El carbón activado (CA), la oxidación química combinada, la adsorción
física y química y la oxidación biológica se consideran métodos de tratamiento de agua
efectivos para eliminar los contaminantes orgánicos del agua ( Zhang et al., 2014 ). El
tratamiento con carbón activado en la Planta A eliminó una pequeña cantidad de ARG
después del tratamiento con PAC; sin embargo, la abundancia de ARG aumentó
significativamente después del tratamiento con GAC. Este hallazgo también se observó
en la Planta B ( Cuadro 1 ). Una mayor abundancia de ARG después del tratamiento con
GAC puede deberse a una mayor abundancia de bacterias, lo que muestra un aumento
en la abundancia de genes de ARNr 16S ( Fig.3) y una disminución de los valores de
prevalencia (abundancia de ARG por abundancia del gen de ARNr 16S) (Fig. S5 y Fig.
S6) después de la filtración con GAC. Estos resultados dispares entre GAC y PAC
podrían atribuirse a los diferentes tamaños de partículas de carbón activado, lo que
resulta en diferentes comunidades microbianas y biomasa en los dos materiales ( Meynet
et al., 2012 ). Por lo tanto, los filtros GAC deben reactivarse o reemplazarse para evitar
esto, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Se ha informado que el GAC mejoró la resistencia a los antibióticos bacterianos y la
capacidad antioxidante bacteriana en el proceso de tratamiento del agua potable ( Bai et
al., 2015 ). En este estudio, la abundancia de todos los ARG detectados aumentó
significativamente después del tratamiento con GAC en la Planta B ( Tabla 1 ). La
abundancia de cinco ARG , tetS , fexA , qepA , qnrA y qnrD , aumentó significativamente
en más de 3 log. Entre los géneros bacterianos, Pseudomonas se convirtió en el más
predominante después del tratamiento con GAC, con un aumento en su abundancia de
<  0,5% a más del 15% (Fig. S4). Pseudomonasspp. Las cepas eran bacterias resistentes
múltiples que portaban genes de resistencia a quinolonas qnrA ( Tran et al., 2011 )
y qnrB ( Michalska et al., 2014 , Tran et al., 2011 ). La concentración de los dos ARG más
abundantes, cmlA y sul1 , fue de hasta el 70,7% de la concentración total de ARG
después del tratamiento con GAC (datos no mostrados). Se informó
que Pseudomonas portaba integrones de clase 1 que albergan varios casetes de genes,
incluido cmlA ( Goli et al., 2017 , Kiddee et al., 2013 , Lin et al., 2012 , Yoo et al., 2012 )
ysul1 ( Adesoji et al., 2015 , Bruchmann et al., 2013 , Rojo-Bezares et al., 2016 , Tada et
al., 2016 , Xu et al., 2017 ). Estudios previos han demostrado que algunas cepas
de Pseudomonas que portan múltiples ARG son responsables de la persistencia y
diseminación de ARG ( Chowdhury et al., 2017 , Emami et al., 2015 , Leclercq et al.,
2016 , Shigemura et al., 2015 ). Por tanto, Pseudomonas puede ser uno de los géneros
más importantes que contribuyen a la proliferación y diseminación de ARGS en el sistema
estudiado.
La remoción total de ARGs por el tanque de agua limpia en la Planta B fue la más alta,
seguida por el tanque de sedimentación. Esto podría deberse a la función de
sedimentación adicional del tanque de agua limpia, que elimina los microorganismos en
suspensión. El tanque de sedimentación eliminó los ARG por sedimentación. La
ozonización se realiza para eliminar materia orgánica, bacterias y virus mediante la
formación de ozono molecular y radicales hidroxilo ( Vieno et al., 2007 ). Se observó que
eltratamiento conO 3 aumentó la concentración de ARG, lo cual es consistente con un
estudio anterior ( Guo et al., 2014 ). Puede deberse a la presión selectiva de O  3 para
ARB, ya que el locus regulatorio soxRSpodría aumentar la resistencia a los antibióticos en
respuesta a oxidantes, como el O 3 ( Jimenez-Arribas et al., 2001 ).
Este estudio, y los estudios anteriores, demostraron que las diferentes tecnologías de
tratamiento tenían diferentes efectos sobre la eficiencia de eliminación de los ARG. Pei y
col. (2007) encontraron que no era posible reducir los ARG en
una laguna lechera mediante un tratamiento biológico aeróbico o anaeróbico. La
desinfección UV no ha disminuido los ARG en los sistemas de tratamiento avanzados
( Chen y Zhang, 2013 ). Sin embargo, se ha informado de que ARGs, tales
como sul1 , sul2 , tetO , tetW , tetQ , y intI1 se eliminó eficazmente
mediante coagulación utilizando cloruro de polyferric y FeCl 3, con una reducción de 0,5
log a 3,1 log ( Li et al., 2017 ). La filtración de arena, el tanque de agua limpia y el tanque
de sedimentación en la Planta B eliminaron significativamente los ARG en este
estudio. Las bacterias portan varios ARG en los sistemas acuáticos ( Stokes y Gillings,
2011 ), y la alta eliminación de ARG puede atribuirse a la eliminación efectiva de
ARB. Nuestros resultados destacan que la sedimentación y la filtración de arena son los
tratamientos más eficientes en la remoción de ARG en el proceso de tratamiento de agua
potable.

5. Conclusiones
Este estudio presentó la aparición y diversidad de ARG que confieren resistencia a varios
antibióticos, así como la variación de la composición de la comunidad bacteriana en el
agua de la fuente, el agua del grifo y las plantas de tratamiento de agua potable en la
región del Delta del Río Pearl, en el sur de China. Entre los
27 ARG objetivo, floR y sul1 predominaron en las fuentes de agua de los tres grandes ríos
de la región. La abundancia total de todos los ARG detectados en el agua del grifo fue
mucho menor que la del agua de origen. El análisis de correlación de Pearson sugirió
que sul1, sul2 , floR y cmlA podrían ser indicadores potenciales de ARG en muestras de
agua. Procesos de filtración y sedimentación de arena enlas plantas de tratamiento de
agua potable eliminaron eficazmente los ARG; por el contrario, la filtración de carbón
activado granular aumentó la abundancia de ARG. Pseudomonas puede estar involucrada
en la proliferación y diseminación de ARG en el sistema de tratamiento de agua
potable. Se observaron cambios en la composición de la comunidad microbiana y los
ARG desde la fuente hasta el agua del grifo, pero las bacterias y los ARG todavía estaban
presentes en el agua del grifo después del tratamiento, aunque se redujeron
significativamente. La sedimentación y la filtración de arena podrían ser métodos efectivos
para eliminar los ARG en los sistemas acuáticos. Se necesita más investigación para
optimizar el proceso de tratamiento de agua para la eliminación de ARG.