Las células dendríticas cargadas con células

muertas de cáncer de mama inducen la

diferenciación de linfocitos T citotóxicos
específicos del tumor
 Eve-Marie Neidhardt-Berard ,
 Frederic Berard ,
 Jacques Banchereau y
 A Karolina PaluckaAutor de correo electronico

Investigación de cáncer de mama20046 : R322

https://doi.org/10.1186/bcr794
© Neidhardt-Berard y otros; licenciatario BioMed Central Ltd 2004

 Recibido el 29 de julio de 2003.

 Aceptado: 25 de marzo de 2004.
 Publicado el 30 de abril de 2004

Resumen
Fondo
Los primeros ensayos clínicos, principalmente en el contexto de un melanoma, han
demostrado que las células dendríticas (DC) que expresan antígenos tumorales inducen
algunas respuestas inmunitarias y algunas respuestas clínicas. Una dificultad importante
es la extensión a otros tumores, como el carcinoma de mama, para los cuales hay pocos
antígenos asociados a tumores definidos disponibles. Hemos demostrado, utilizando tanto
el carcinoma de próstata como el melanoma como sistemas modelo, que las CD cargadas
con líneas de células tumorales alogénicas muertas pueden inducir a las células T CD8 + a
diferenciarse en linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos para antígenos tumorales
compartidos.

Métodos
El presente estudio se diseñó para determinar si las CD capturarían células muertas de
cáncer de mama y presentarían sus antígenos a las células T CD4 + y CD8 + autólogas .

Resultados
 Mostramos que las células cancerosas de mama muertas son capturadas por CD
inmaduras que, después de la maduración inducida, pueden presentar eficazmente los
péptidos MHC de clase I y clase II a los linfocitos T CD8 + y CD4 + . Los CTL obtenidos
son capaces de matar las células objetivo sin la necesidad de un tratamiento previo con
interferón gamma. Los CTL se pueden obtener cultivando las CD cargadas con células de
cáncer de mama muertas con linfocitos de sangre periférica no separados, lo que indica
que las CD pueden superar cualquier efecto inhibitorio potencial de las células de cáncer
de mama.

Conclusión
La carga de CD con células de cáncer de mama muertas puede considerarse un nuevo
enfoque para la inmunoterapia del cáncer de mama y para la identificación de antígenos
de cáncer de mama compartidos.

Palabras clave

 cáncer de mama
 muerte celular
 células dendríticas
 inmunoterapia
 inmunidad tumoral

Introducción
El concepto de inmunoterapia del cáncer ha sido activado en la última década por la
identificación molecular de antígenos de cáncer humano [ 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 ]. Estos
enfoques terapéuticos se facilitaron aún más mediante la identificación de métodos de
cultivo in vitro , lo que permitió la generación de grandes cantidades de células
dendríticas (CD) [ 7 , 8 , 9 ] en las que los antígenos cancerosos pueden presentarse a las
células T [ 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15]. Numerosos estudios en animales han demostrado
que la inmunización con DC cargados con antígeno tumoral induce respuestas
antitumorales protectoras [ 16 , 17 , 18 , 19 ]. Sin embargo, las estrategias de carga de
antígeno óptimas para ensayos en humanos aún están por determinarse.

El enfoque de grado clínico más utilizado se basa en cargar moléculas de MHC de clase I
vacías con péptidos exógenos. Sin embargo, este enfoque está limitado por la restricción
de péptidos a un tipo dado de antígeno leucocitario humano (HLA), por inducción de
respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) y por limitación de las respuestas inducidas a
antígenos asociados a tumores definidos.
 Hemos demostrado que las CD cargadas con líneas de células tumorales alogénicas
muertas pueden inducir a las células T CD8 + a diferenciarse en efectores específicos de
antígeno tumorales compartidos, utilizando tanto el carcinoma de próstata como el
melanoma como sistemas modelo [ 20 , 21 ]. Un enfoque de este tipo ofrece nuevas
posibilidades para el suministro de antígenos asociados a tumores a las CD porque el uso
de células tumorales como fuente de antígenos debería proporcionar epítopos tanto de
MHC de clase I como de clase II, lo que conduce a una respuesta inmune diversa que
involucra a muchos clones de CTL y CD4 + Células T El uso de células tumorales en tal
enfoque también debería proporcionar un amplio espectro de antígenos asociados a
tumores presentados, dando como resultado un repertorio más amplio de respuestas de
células T provocadas.

El objetivo fue aplicar este conocimiento al carcinoma de mama, un tumor que se sabe
que es relativamente no inmunogénico. Esta no inmunogenicidad reputada se puede
originar a partir de los efectos inhibitorios del cáncer de mama en el crecimiento de CD y
la diferenciación de CD, que dependen de la secreción de citoquinas como la IL-6, el
factor estimulante de colonias de monocitos y el factor de crecimiento endotelial vascular
[ 22 , 23 , 24 , 25].]. Por lo tanto, aunque nuestro trabajo anterior en melanoma y
carcinoma de próstata demostró la validez de cargar CD con células tumorales muertas
para obtener inmunidad específica de células T, este enfoque debía probarse en un
contexto de cáncer de mama. De hecho, cada tipo de tumor representa su propia
entidad; por ejemplo, diferentes orígenes de tejidos hacen que las extrapolaciones de un
tumor a otro sean difíciles, lo que requiere un análisis por separado.

Aquí mostramos que los CD pueden capturar células muertas de cáncer de mama y
posteriormente pueden activar células T CD4 + así como células T CD8 + . Esto representa
un nuevo enfoque para el desarrollo de protocolos de vacunación basados en DC en el
cáncer de mama y para la identificación de antígenos de cáncer de mama compartidos.

materiales y métodos
Medios y reactivos.
El medio de cultivo completo era RPMI 1640, 1% L-glutamina, 1% penicilina /
estreptomicina, 50 µM de 2-mercaptoetanol, 1% de piruvato de sodio, 1% de
aminoácidos esenciales y FCS al 10% inactivado por calor (Life Technologies, Grand
Island, NY, EE. UU.). Para los cultivos de células T, FCS se reemplazó por un 10% de
suero humano AB (Gemini Bio-products, Woodland, CA, EE. UU.). Factor estimulante
de colonias de granulocitos y monocitos (Leukine, Immunex, Seattle, WA, EE. UU.),
Ligando soluble CD40 (Immunex) e IL-7 (Immunex o R&D System, Minneapolis, MN,
EE. UU.) Se utilizaron en las concentraciones respectivas de 100 ng / ml, 200 ng / ml y
10 UI / ml. Se usó IL-4 (Schering-Plough, Kenilworth, NJ, EE. UU. [Amablemente
proporcionado por S. Narula] o R&D System) a 5 ng / ml, e IL-2 (Genzyme Co.,
Cambridge, MA, EE. UU.) Se utilizó utilizado a 10 UI / ml. La cicloheximida y el
colorante de ADN 7-aminoactinomicina D se obtuvieron de Sigma (St Louis, MO, EE.
UU.). Anti-Fas mAb, El clon CH11 (Beckman-Coulter, Miami, FL, EE. UU.) se utilizó a
1 μg / ml. Se utilizó interferón gamma (IFN-γ) a 100 ng / ml (Actimune, InterMune
Pharmaceuticals, MD, EE. UU.).

Líneas celulares
Las líneas celulares de cáncer de mama MCF-7 y HCC1806 fueron establecidas por el
Dr. A. Gazdar y el Dr. J. Minna en el Centro Médico UTSW, Dallas y están disponibles
en la ATCC (Rockville, MD, EE. UU.). Las líneas celulares de carcinoma de próstata
K562 y LnCAP eran de ATCC. Todas las líneas celulares se mantuvieron en medio de
cultivo. Las células HCC1806 se destruyeron mediante tratamiento con mAb anti-Fas
(CH11, 1 μg / ml durante 7 horas) seguido de sensibilización con cicloheximida (50 μg /
ml). Las células MCF-7 se destruyeron mediante irradiación gamma (150 Gy, y luego se
cultivaron durante 48 horas en medio sin suero) seguido de sensibilización por factor de
necrosis tumoral alfa (TNF-α) (24 horas a 100 ng / ml).

CDs derivados de monocitos

Las CD derivadas de monocitos se generaron a partir de células mononucleares de sangre
periférica separadas por Ficoll de voluntarios sanos HLA-A201 + (IRB 097-053). Los
monocitos se enriquecieron por adherencia y se cultivaron con factor estimulante de
colonias de granulocitos y monocitos e IL-4 (> 90% CD1a + DC en el día 5). La
maduración de DC se indujo mediante un cultivo de 48 horas con un ligando CD40
soluble, con medios condicionados con monocitos o con la combinación de IL-1, IL-6 y
TNF-α.

Purificación de células T
Las células T CD4 + y CD8 + purificadas (autólogas a las CD) se obtuvieron por
agotamiento de células mononucleares de sangre periférica con mAb CD4 (13B8.2),
mAb CD8 (B9.11), mAb CD14 (RM 052), mAb CD16 (3G8) ), CD19 mAb (J4,119),
CD56 mAb (NKH-1), mAb anti-HLA-DR (B8.12.2) y mAb antiglicoforina A (D2.10)
(todos de Immunotech, Marseille, Francia), y con cabra anti-ratón IgG Dynabeads
(Dynal, Lake Success, NY, EE. UU.).

Analisis confocal
Las células se dejaron adherir en portaobjetos recubiertos con polilisina (Baxter,
Deerfield, IL, EE. UU.) Durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se eliminó el
sobrenadante. Después de la fijación con paraformaldehído al 4% en PBS, las células se
lavaron con PBS y se montaron. La microscopía confocal se realizó con un Leica TCS-
NT SP (Leica, Deerfield, IL, EE. UU.) Equipado con láseres de argón, criptón y helio /
 neón, y usando un espectrofotómetro para separar el canal de detección de FITC (510–
550 nm) y 7-aminoactinomicina D (600–660 nm).

Proliferación de células T
La proliferación de células T se midió por incorporación de timidina después de 5 días de
cultivo de DC cargadas con tumor y células T autólogas.

Producción de citoquinas.
La producción de citoquinas en los días 6 sobrenadantes se determinó mediante ELISA
utilizando kits de Pharmingen (San Diego, CA, EE. UU.; IL-4, IL-10 e IFN-γ) de acuerdo
con las sugerencias del fabricante.

Generación de CTLs
Las CD cargadas con tumor se cultivaron con linfocitos T CD8 + purificados autólogos o
linfocitos autólogos de sangre periférica (PBL) a 10 5 DC y 10 6células T. Los cocultivos
se reestimularon semanalmente (un total de tres estimulaciones) y se suplementaron con
IL-7 (10 UI / ml en las semanas 1 y 2), e IL-2 (10 UI / ml en las semanas 2 y 3). La
actividad de CTL se midió en un ensayo estándar de liberación de 51 Cr de 4 horas , donde
el 51Los objetivos marcados con Cr (NEN Life Science Products Perkin Elmer, Boston,
MA, EE. UU.) Se expusieron a células T cultivadas y la lisis se midió después de 4 horas
de cocultivo. El porcentaje de células muertas se calculó utilizando la fórmula: porcentaje
de liberación = 100 × (conteos por minuto [cpm] experimento - cpm liberación
espontánea) / (cpm liberación máxima - cpm liberación espontánea).

Resultados
DC capturan células de cáncer de mama muertas
MCF-7 y HCC1806 son líneas celulares de cáncer de mama HLA-A201 + . Las células
MCF-7 tienen características de células epiteliales mamarias diferenciadas, expresan
receptor de estrógeno y son susceptibles al TNF. Las células HCC1806 están menos
diferenciadas y no expresan el receptor de estrógeno. Las células HCC1806 son sensibles
a la apoptosis inducida por Fas después de la sensibilización con cicloheximida
(Fig. 1a ). Las células MCF-7 son resistentes a Fas, pero podrían destruirse mediante una
combinación de irradiación gamma (150 grises) y falta de suero. Debido a que tanto
HCC1806 como MCF-7 crecen como células adherentes y se desprenden al morir, la
fracción no adherente se puede usar como una fuente conveniente de células muertas para
la carga de CD.
Figura 1
Las células dendríticas inmaduras (DC) capturan las células muertas de cáncer de
mama. (a) Las células HCC1806 se tratan con cicloheximida tratada (50 mg / ml) en una
etapa de sensibilización. Después de 2 horas a 37 ° C, se agrega anticuerpo anti-Fas
(CH11; Immunotech) a una concentración de 1 mg / ml y las células se incuban durante
el período de tiempo indicado. (b) Células muertas de cáncer de mama marcadas con 7-
aminoactinomicina D (7AAD) se incuban durante 1 hora a 37 ° C con CD derivadas de
monocitos inmaduros marcadas con CD1a en una proporción de 1: 1. La captura se
determina mediante citometría de flujo (el CD1a / 7AAD de doble positivo representa las
CD que han capturado células muertas de cáncer de mama) y se confirma mediante
microscopía confocal (c) . Yoduro de propidio.
Las DC inmaduras derivadas de monocitos fueron capaces de capturar células muertas de
cáncer de mama después de 1 hora de incubación en una proporción de 1: 1 a 37 ° C
(Fig. 1b, 1c ). El análisis de citometría de flujo y la microscopía confocal, utilizando
células de cáncer de mama muertas marcadas con 7-aminoactinomicina D y CD
inmaduras marcadas con CD1a, muestran una fagocitosis significativa. Las DC cargadas
que se volvieron a cultivar durante 48 horas con citoquinas sobrevivieron, así como las
células descargadas, y fueron tan eficientes en la inducción de la proliferación de células
T ingenuas alogénicas (datos no mostrados). Esto demuestra que la captura de células
muertas de cáncer de mama no afecta en gran medida la función de DC.

Los DC cargados con células de cáncer de mama destruidas inducen la

proliferación de IFN-γ autólogo, produciendo células T CD4 +
A continuación, determinamos si las CD que capturaron células de tumores de mama
alogénicas muertas pueden presentar antígenos derivados de células para inducir la
proliferación de células T CD4 + . Las DC inmaduras se cargaron así con células de
cáncer de mama muertas, se indujeron a madurar en un cultivo de 48 horas con un
ligando de CD40 o un cóctel de citoquinas, y se usaron como estimuladores en cocultivo
con células T CD4 autólogas.

La proliferación de células T CD4 se encontró solo en cocultivos con CD cargadas con

tumor (Fig. 2a ), pero no en cultivos con CD descargadas o solo con células cancerosas
eliminadas (datos no mostrados). Las células T CD4 +autólogas en
proliferación secretaron altos niveles de IFN-γ (Fig. 2b ) y no pudieron detectarse IL-4 ni
IL-10 (datos no mostrados).

Figura 2
Las células dendríticas (CD) cargadas con células de cáncer de mama (BrCa) muertas
inducen la proliferación de células T CD4   con una fuerte polarización de células T tipo
+

1 ayudante. Las DC descargadas y las DC cargadas con HCC1806 se cultivan con

células T CD4   purificadas . (a) La proliferación de células T se determina mediante la
+

incorporación de timidina en el día 5. No se detecta proliferación cuando las

células T CD4   se cultivan con BrCa destruido solo sin DC (no se muestran los
+

datos). (b) Los sobrenadantes de los cultivos de células DC T se analizan mediante

ELISA para determinar los niveles de interferón gamma (IFN-γ). Los resultados son
representativos de dos experimentos.
Los DC cargados con células de cáncer de mama destruidas inducen la
diferenciación de las células T CD8 en CTL
A continuación, determinamos si las CD cargadas con células muertas de cáncer de
mama provocan CTL capaces de destruir las células tumorales utilizadas para la
inmunización. Se utilizaron CD de HLA-A201 + cargadas con tumor y maduradas para
estimular, a intervalos semanales, células T CD8 + autólogas purificadas durante un
período de cultivo de 3 semanas.

Como se muestra en la Fig. 3a , las DC cargadas indujeron la diferenciación de los CTL

capaces de destruir las células HCC1806 a una lisis específica del 37 ± 2%. El
tratamiento de los objetivos con IFN-γ aumenta su sensibilidad a los CTL con 60 ± 9% de
lisis específica (media ± error estándar, n = 3). La lisis observada no se debe a células
asesinas naturales porque las células K562 no están lisadas. Como se esperaba, las células
T cultivadas con CD descargadas no pueden destruir las células HCC1806. HLA-A201 +
Los
 CTL generados con DC cargados con HCC1806 no pudieron destruir la línea celular de
carcinoma de próstata HLA-A201 + LnCap, lo que sugiere una falta de antígenos
tumorales compartidos entre estas dos líneas celulares. Sin embargo, los CTL HLA-
A201 + cebados con HCC1806 tampoco pudieron matar al HLA-A201 + Células de cáncer
de mama MCF-7.
 figura 3
Las células dendríticas (CD) cargadas con células de cáncer de mama destruidas inducen
la diferenciación autóloga de células T CD8 en linfocitos citotóxicos (CTL). Las
células T CD8   purificadas se cultivan durante 3 semanas con DC descargadas (UL-DC)
+

o con DC cargadas con HCC1806 (L-DC) matado. Las células T se analizan en un ensayo

de liberación de cromo de 4 horas, utilizando células HCC1806 como dianas y células
K562 como controles para la actividad asesina natural (media ± error estándar, n =
3) (a) , así como tumor HLA-A201   no relacionado líneas celulares, células de cáncer de
+

próstata (Ln-CAP) y otra célula de cáncer de mama (MCF-7) (b). No se provocan CTL

cuando las células T se cultivan con células de cáncer de mama eliminadas sin los CD
(datos no mostrados). En otra serie de experimentos, los linfocitos de sangre periférica
(células T CD4   y CD8   ) se cultivan durante 3 semanas con UL-DC, o con DC cargadas
+ +

con MCF-7 (c) o con L-DC (d) . Los resultados son representativos de dos experimentos.

Debido a que se ha demostrado que las células del cáncer de mama inhiben las funciones
de la CD así como la diferenciación de las células T CD4, analizamos la diferenciación
de CTL a partir de PBL no separado. Las PBL se cultivaron con CD maduras cargadas
con células de cáncer de mama muertas durante 3 semanas (tres estimulaciones) sin
agregar citoquinas suplementarias (IL-7 o IL-2). Como se muestra en la Fig. 3 , los PBL
cultivados compuestos por 80% de células T CD4 + pueden destruir las células de cáncer
de mama utilizadas para la inmunización, ya sea células MCF-7 (Fig. 3c ) o células
HCC1806 (Fig. 3d ). Como ya se describió, se encontró que las dianas tratadas con IFN-γ
eran más sensibles a las CTL. Los CD cargados con células muertas de cáncer de mama
pueden inducir CTL capaces de matar el tumor utilizado para la inmunización.

Discusión
Dada la limitada disponibilidad de antígenos asociados a tumores de mama definidos, el
presente estudio se diseñó para identificar las condiciones que permiten la carga de CD
con líneas celulares de cáncer de mama alogénicas muertas. Esto implicó una estrategia
doble que permitiría el desarrollo de nuevas vacunas contra el cáncer de mama en dos
niveles. La primera fue la preparación de vacunas que pueden usarse en pacientes que
padecen cáncer de mama, lo que aprovecharía la respuesta a los antígenos de cáncer de
mama compartidos "desconocidos". Luego se identificaron tales antígenos desconocidos
mediante la clonación de células T provocadas.

En el presente estudio, identificamos condiciones de grado clínico que producen células

muertas de cáncer de mama, que pueden ser capturadas por DC. Las células de cáncer de
mama capturadas se procesaron mediante CD para generar complejos de péptidos de
clase I y clase II reconocidos por células T CD8 + y células T CD4 + ,
respectivamente. Por lo que sabemos, este es el primer estudio que demuestra la
generación de CTL específicas para el cáncer de mama, utilizando CD cargados con
líneas celulares de cáncer de mama alogénicas muertas. La pregunta principal que surge
 es la naturaleza de los antígenos presentados por las CD cargadas contra las cuales se han
cebado las células T (es decir, ¿son antígenos específicos del cáncer de mama o antígenos
específicos del aloantígeno?).

Nuestros estudios previos con carcinoma de próstata y melanoma indicaron que una
posible generación de células T alo-específicas no impidió el desarrollo de CTL
específicas para antígenos tumorales compartidos, como se identificó por la capacidad de
las CTL cebadas para matar las células T2 pulsadas con péptidos. De hecho, se generaron
CTL específicos de PSA cuando se usaron CD cargados con células de carcinoma de
próstata [ 21 ], mientras que los CTL específicos de MART / Tyrosinase / GP-100 /
MAGE-3 podrían provocar el cultivo de células T CD8 + con DC cargadas con células de
melanoma muertas [ 20 ].

A diferencia de estos hallazgos anteriores en el melanoma y el carcinoma de próstata,

aquí no pudimos establecer la especificidad de los CTL provocados contra antígenos
tumorales conocidos como TERT, péptidos derivados de la quinasa de adhesión focal o c-
erb-2. Esto sugeriría que, en el caso del cáncer de mama, la presentación del aloantígeno
por las DC cargadas eclipsa la presentación de antígenos tumorales, y explicaría la falta
de destrucción cruzada entre las dos líneas celulares de cáncer de mama utilizadas para
los experimentos. Una explicación alternativa es que estos antígenos no son antígenos
inmunodominantes presentados por DC cargados. De hecho, debido a sus características
biológicas únicas, las dos líneas celulares de cáncer de mama que hemos utilizado
podrían proporcionar epítopos de antígenos asociados a tumores inmunodominantes muy
diferentes.

Por lo tanto, se necesitan más estudios para determinar el valor terapéutico potencial de
las CD cargadas con células de cáncer de mama alogénicas muertas. La demostración
aquí de que las CD cargadas con células de cáncer de mama alogénicas muertas pueden
inducir la diferenciación de CTL proporciona un nuevo enfoque para la identificación de
antígenos de cáncer de mama compartidos a través de la clonación de células T.

Conclusión
La carga de CD con células de cáncer de mama muertas puede considerarse un nuevo
enfoque para la inmunoterapia del cáncer de mama y para la identificación de antígenos
de cáncer de mama compartidos.