TESIS DOCTORAL

Título

Estudio del aire como vía de diseminación de

microorganismos enológicos

Autor/es

María del Patrocinio Garijo Jiménez

Director/es

María Pilar Santamaría Aquilué y Ana Rosa Gutiérrez Viguera

Facultad

Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

Titulación

Departamento

Agricultura y Alimentación

Curso Académico
 Estudio del aire como vía de diseminación de microorganismos enológicos,
tesis doctoral
de María del Patrocinio Garijo Jiménez, dirigida por María Pilar Santamaría Aquilué y Ana
Rosa Gutiérrez Viguera (publicada por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una
Licencia
Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.
Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los
titulares del copyright.

© El autor
© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2014
publicaciones.unirioja.es
E-mail: publicaciones@unirioja.es
ESTUDIO DEL AIRE COMO VÍA DE

DISEMINACIÓN DE

MICROORGANISMOS ENOLÓGICOS

Mª Patrocinio Garijo Jiménez

Directoras: Ana Rosa Gutiérrez
35 Pilar Santamaría
 UNIVERSIDAD DE LA RIOJA
DEPARTAMENTO DE AGRICULTURA Y ALIMENTACIÓN

Las abajo firmantes, Dra. Pilar Santamaría Aquilué, Investigadora del Instituto de
Ciencias de la Vid y del Vino (ICVV) y la Dra. Ana Rosa Gutiérrez Viguera Profesora
Titular del Departamento de Agricultura y alimentación de la Universidad de La Rioja,

HACEN CONSTAR

Que el presente trabajo titulado: “Estudio del aire como vía de diseminación de
microorganismos enológicos”, que presenta Dña. MARIA DEL PATROCINIO
GARIJO JIMÉNEZ para optar al grado de Doctor por la Universidad de La Rioja, ha
sido realizado bajo nuestra dirección en el Centro de Investigación y Desarrollo
Tecnológico de La Rioja, y que todos los resultados obtenidos son fruto de
experimentos llevados a cabo por la doctoranda.

Para que conste y tenga los efectos oportunos, firmamos el presente certificado

Logroño, 25 de Julio de 2013

Dra. Pilar Santamaría Aquilué Dra. Ana Rosa Gutiérrez Viguera

 Agradecimientos
En primer lugar a la Consejería de Agricultura, Ganadería y Medio
Ambiente del Gobierno de la Rioja, donde desarrollo mi trabajo.

A la inestimable colaboración de la Bodega Santos Díaz de Tudelilla, la

Cooperativa Vinícola Riojana de Alcanadre y el Centro de Investigaciones
Agrarias (CIDA). Precisamente es a todo el equipo humano de este Centro al que
debo mi agradecimiento más sincero, desde el campo y administración hasta el Jefe
de Servicio.

Muy especialmente a la sección de Viticultura y Enología, con Rosa al

frente, con la que no solo comparto despacho sino también buenos y malos
momentos, profesionales y personales, de la que no dejo de aprender a todos los
niveles, gracias por todo.

A los compañeros de siempre, Juana, Antonio, Laura… A las que están

temporalmente: Araceli, Isabel… Su apoyo es siempre incondicional.

Para mis directoras me faltan elogios y palabras. Sin Ana Rosa este trabajo
no hubiera sido posible, es su empuje y optimismo lo que hace que todo resulte
más fácil. ¡Qué placer poder trabajar contigo! Espero que aún nos queden muchos
años.

A Pili no sé como agradecerle su infinita paciencia, su meticulosidad en

todo lo que hace, sus enseñanzas continuas…lo haces todo perfecto. No terminaré
de admirarte nunca. Es un lujo contar con vuestra amistad.
 Tampoco quiero olvidarme de las nuevas compañeras de “Micro”, Isabel,
Lucía, Leti…

A Tere por darme la idea de la maquetación y a Eva por currárselo como

nadie, con ella he aprendido muchísimo.¡Qué buena es la savia joven! Os espera un
futuro prometedor, estoy segura. ¡Gracias, chicas!

A Susana y Carmen,” mis profes de la Uni”, con las que he aprendido y

disfrutado. ¡Qué suerte tienen vuestros alumnos! A Carmen Tenorio, que me
instruyó en nuevas técnicas y me apoyó en todo momento.

Por último, al motor de mi vida, mi familia. A mis padres, porque se lo

debo todo y sé que hubieran disfrutado de este momento. A Irene, Jorge y Maixi
por todas las horas que os he robado y por animarme a seguir. Siempre estáis ahí,
sois lo más importante.
A Maixi

A Irene y Jorge

A la memoria de mis padres…

 Índice
PRESENTACIÓN

ABREVIATURAS ......................................................................................... I

CAPÍTULO 1

INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 3
1.1.-La elaboración del vino........................................................................ 3
1.2.-Microorganismos asociados a la uva y a la vinificación .................... 7
1.2.1.-Levaduras....................................................................................... 8
1.2.2.-Bacterias lácticas............................................................................ 16
1.2.3.-Mohos ............................................................................................ 21
1.3.-Origen y diseminación de los microorganismos enológicos .............. 23
1.3.1.-Microorganismos en las uvas y diseminación en viñedo ............... 24
1.3.2.-Microorganismos de vinificación y su diseminación
en la bodega ................................................................................... 28

CAPÍTULO 2

OBJETIVOS .................................................................................................. 35

CAPÍTULO 3

MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................... 39

3.1.-Ensayos y tomas de muestras ............................................................. 39

3.1.1.-Muestreos en el aire ....................................................................... 40

i
 3.1.1.1.-Primer Ensayo ..................................................................... 43
3.1.1.2.-Segundo Ensayo .................................................................. 44
3.1.1.3.-Tercer Ensayo ..................................................................... 46
3.1.2.-Muestreos de instalaciones ............................................................ 47
3.1.3.-Muestreos de racimos .................................................................... 48
3.1.4.-Muestreos durante las Fermentaciones Alcohólica
y Maloláctica ................................................................................ 48
3.1.4.1.-Primer Ensayo ..................................................................... 48
3.1.4.2.-Segundo Ensayo .................................................................. 49
3.2.-Procesamiento de las muestras ........................................................... 50
3.2.1.-Muestras de aire ............................................................................. 50
3.2.2.-Muestras de instalaciones .............................................................. 51
3.2.3.-Muestras de racimos ...................................................................... 51
3.2.4.-Muestras de depósitos en fermentación ......................................... 52
3.3.-Aislamiento y conservación de colonias de los microorganismos ..... 53
3.3.1.-Levaduras ...................................................................................... 54
3.3.2.-Bacterias lácticas ........................................................................... 54
3.3.3.-Mohos ............................................................................................ 54
3.4.-Identificación de las colonias aisladas ................................................ 54
3.4.1.-Identificación de levaduras ............................................................ 54
3.4.1.1.-Identificación de las especies de levaduras
mediante PCR_RFLP ...................................................................... 55
3.4.1.2.-Identificación de especies mediante
secuenciación del ADN ................................................................... 61
3.4.1.3.-Caracterización clonal de Saccharomyces cerevisiae
mediante análisis de restricción del ADNmt .................................... 63
3.4.2.-Identificación de Bacterias Lácticas ............................................... 66
3.4.2.1.-Identificación fenotípica de bacterias lácticas ..................... 66

ii
 3.4.2.2.-Identificación de las bacterias lácticas mediante PCR ......... 69
3.4.2.3.-Identificación de bacterias lácticas mediante
secuenciación del ADN ................................................................... 71
3.4.2.4.-Tipificación de los clones de Oenococcus oeni mediante
electroforesis de campos pulsados (PFGE) ....................................... 72
3.4.3.-Identificación de mohos ................................................................. 78
3.6.-Medios de cultivo y disoluciones ......................................................... 80
3.6.1.-Disoluciones base .......................................................................... 80
3.6.2.-Disoluciones empleadas en el análisis del ADNmt ........................ 81
3.6.3.-Disoluciones empleadas en el análisis de campos pulsados ........... 81
3.6.4.-Medios para el aislamiento, conservación y crecimiento de levaduras 82
3.6.5.-Medios para de recuento y aislamiento de bacterias lácticas .......... 84
3.6.6.-Medios para aislamiento y recuento de mohos ............................... 84

CAPÍTULO 4

RESULTADOS .............................................................................................. 87

4.1.-Estudio de la presencia de mohos, levaduras y bacterias

en el aire de una bodega durante la vinificación. ...................................... 89

Estudio del aire como vía de diseminación de levaduras de la especie

S. cerevisiae responsables de la fermentación alcohólica.

The occurrence of fungi, yeasts and bacteria in the air of a Spanish

winery during vintage. ................................................................................ 93

4.2.-Estudio de las levaduras presentes en las instalaciones de una bodega

comercial. Comparación de los clones de Saccaromyces cerevisiae aislados en
instalaciones, depósitos en fermentación y en el aire.

4.2.1.- Resumen ......................................................................................... 101

iii
 4.2.2.- Levaduras presentes en las instalaciones.......................................... 102

4.2.3.- Comparación de clones de S. cerevisiae en aire, depósitos e

instalaciones ................................................................................................ 106

4.3.- Estudio del aire como vía de diseminación de las bacterias lácticas
responsables de la fermentación maloláctica. .............................................. 113
.........................................................................................................................

Presence of lactic bacteria in the air of a winery during the vinification

period. ............................................................................................................. 117

4.4.- Estudio de la presencia y evolución de los microorganismos de interés

enológico en las uvas y en el aire del viñedo. ................................................ 125

Presence of enological microorganisms in the grapes and the air of a

vineyard during the ripening period. ........................................................... 129

CAPÍTULO 5

DISCUSIÓN ...................................................................................................... 139

CAPÍTULO 6

CONCLUSIONES ............................................................................................ 157

BIBLIOGRAFIA .............................................................................................. 163

iv
 Presentación
Esta memoria de Tesis Doctoral se presenta en forma de compendio de
publicaciones científicas siguiendo la normativa de la Universidad de La Rioja
aprobada por Consejo de Gobierno el 22 de julio de 2005.

El objetivo de esta tesis fue estudiar el efecto del aire como vía de
diseminación de microorganismos enológicos, primero en la bodega y
posteriormente en el viñedo, centrándose tanto en los agentes de las fermentaciones
alcohólica y maloláctica, levaduras y bacterias lácticas, como en los mohos. De
este modo, se presentan tres artículos científicos. En el primero se estudió la
presencia de mohos, levaduras y bacterias lácticas en el aire de una bodega durante
la vinificación, y se compararon los clones de Saccharomyces cerevisiae aislados
en el aire con los del mosto/vino de los depósitos en fermentación. Este artículo se
completó con los resultados obtenidos acerca del estudio de las levaduras aisladas
en diferentes zonas de las instalaciones de la misma bodega.

En el segundo artículo se estudió el aire como vía de diseminación de las

bacterias lácticas responsables de la fermentación maloláctica, comparando
asimismo los clones de Oenococcus oeni presentes en el aire y en los vinos.

Por último, en el tercer artículo se presentan los resultados del estudio

realizado sobre la presencia y evolución de los microorganismos de interés
enológico en las uvas y en el aire del viñedo durante el periodo de maduración en
dos campañas consecutivas.
 Para facilitar la lectura de esta memoria, en el capítulo Introducción se
recogen las características de los microorganismos de interés enológico: levaduras,
bacterias lácticas y mohos, así como los estudios más relevantes sobre su origen y
diseminación. En el 2º capítulo se definen los Objetivos.

En el apartado Materiales y métodos se describe tanto el plan de trabajo

como la metodología aplicada para llevar a cabo los objetivos planteados en esta
Tesis, cuyos resultados han dado lugar a las publicaciones científicas que se
adjuntan en la sección de Resultados. En ésta se incluye asimismo un resumen de
cada una de ellas.

Finalmente, en el último capítulo se plantea una Discusión de los datos más

relevantes, y por último se presentan las Conclusiones más destacadas que pueden
extraerse de esta Tesis.

Este trabajo ha sido posible gracias a la financiación del Gobierno de La

Rioja y la U.R. mediante los siguientes Proyectos:

 PR-08-06. Influencia de diferentes factores sobre la diversidad

genética en levaduras de vinificación. Mantenimiento de un banco
de levaduras autóctonas.

 PR-10-07. Variabilidad de las levaduras vínicas en bodega a lo

largo del tiempo. Estudio de distintas vías de inoculación de
mostos con levaduras en la bodega. Mantenimiento de un banco de
levaduras autóctonas.

 Proyecto FOMENTA 2007/04. Análisis de la calidad

microbiológica del aire de las bodegas. Estudio del aire como vía
de diseminación de microorganismos útiles y de alteración.
 PR-08-08. Estudio comparativo de los microorganismos de
vinificación (levaduras y bacterias lácticas) presentes en distintos
ambientes de una bodega.

 PR-06-09. Estudio del origen de los microorganismos (levaduras y

bacterias lácticas) presentes en las uvas de vinificación durante el
periodo de maduración.
 Abreviaturas
ADN Ácido desoxirribonucleico
ADNmt ADN mitocondrial
ADNr ADN ribosomal
Apdo. Apartado
ARNr Ácido ribonucleico ribosómico
ATP Adenosin Trifosfato
BL Bacterias lácticas
ºC Grados Celsius
C.A. Comunidad Autónoma
CIDA Centro de Investigación y Desarrollo Agrario
CGA Cloranphenicol Glucosa Agar
cm Centímetro
dNTP Desoxi-nucleótidos tri-fosfato
D.O.Ca. Denominación de Origen Calificada
EDTA Ácido etilendiaminotetracético
FA Fermentación alcohólica
FF Final de fermentación
Fig. Figura
FML Fermentación maloláctica
FT Fermentación tumultuosa
g Gramo
h Hora
ha Hectárea
IF Inicio de fermentación
IGS Intergenic spacer
ITS Internal Transcribed Spacer
Kb kilobases

I
Abreviaturas
l Litro
LSU Large subunit
M Molar
m Metro
min Minuto
mg Miligramo
ml Mililitro
mm Milímetro
mM Milimolar
MRS Man, Rogosa and Sharpe
N Normal
NMP Numero más probable
OTA Ocratoxina A
pb Pares de bases
rpm Revoluciones por minuto
PCR Polymerase Chain Reaction
PCR-RFLP PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism
p/v Peso/volumen
PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis
s Segundo
SDS Sodio dodecil sulfato
sp especie
spp especies
SSU Small subunit
Tª Temperatura

TBE Tris borato EDTA

II
 Abreviaturas
TCA Tricloroanisol

TCF Triclorofenol
TE Tris EDTA
TSB Tryptone Soy Broth
UFC Unidades formadoras de colonias
U.R: Universidad de La Rioja
UV Ultravioleta
YPD Yeast Peptone Dextrose
µg Microgramo
µl Microlitro
µm Micra

Microorganismos
A. pullulans Aureobasidium pullulans
A. niger Aspergillus niger
K. apiculata Kloeckera apiculata
L. Lactobacillus
Ln. Leuconostoc
N.S. No-Saccharomyces
O. Oenococcus
P. Pediococcus
P. verrucosum Penicillium verrucosum
P. viridicatum Penicillium viridicatum
S. Saccharomyces
S. b. Saccharomyces bayanus

III
Capítulo 1
Introducción
 Introducción

1.1.- La elaboración del vino

Una de las definiciones más completas que se pueden encontrar del vino es
la que ofrece la ley 24/2003, de 10 de julio, de la Viña y el Vino, según la cual “el
vino es el alimento natural obtenido exclusivamente por fermentación alcohólica,
total o parcial, de uva fresca, estrujada o no, de mosto de uva”.

Definir la calidad del vino resulta complejo por los numerosos

condicionantes (objetivos y subjetivos) que intervienen. A pesar de ello, de forma
general, se puede afirmar que la calidad está condicionada por tres factores
fundamentales: la materia prima (variedad de uva, procedencia, grado de
maduración, estado sanitario, etc.), la tecnología de la vinificación aplicada y la
población microbiana que interviene en el proceso (tanto la que acompaña a la uva
como la que se encuentra en el ambiente de la bodega). Es lo que Paronetto (1992)
denomina respectivamente fase química, fase física y fase biológica. En este
sentido, la vitivinicultura tradicional ha ejercido, a nivel mundial, un exhaustivo
control sobre las dos primeras fases en cuanto a utilización de variedades, selección
clonal de las mismas, control de plagas, determinación de índices de madurez,
tecnologías modernas de vinificación, etc. Sin embargo, el conocimiento de los
aspectos microbiológicos implicados en la elaboración del vino ha tenido un gran
retraso con relación a los otros dos, quizás porque la Microbiología es una ciencia
relativamente nueva si la comparamos con la Agricultura y la Tecnología. Dentro
ya de la “era científica”, los avances en el conocimiento y aplicación práctica de la
Microbiología Enológica son relativamente recientes, y van cobrando importancia
como consecuencia de los grandes avances en los campos de la Biología Molecular
y la Biotecnología (Ramón, 1997).

3
Introducción

La vinificación se puede definir como el conjunto de operaciones y

prácticas que se llevan a cabo con el fin de transformar la uva en vino, respetando
al máximo las cualidades intrínsecas que posee dicha uva, para así obtener el mejor
resultado posible (Suárez e Iñigo, 2004). Este proceso es el resultado de numerosas
reacciones bioquímicas, que implican la interacción de muchas especies
microbiológicas, representadas por levaduras, bacterias y hongos filamentosos
(Fleet, 2007; Fulgesand y Edwards, 2007).

La elaboración del vino incluye dos transformaciones principales:

1) La fermentación alcohólica (FA): proceso bioquímico por el cual los

azúcares del mosto se transforman básicamente en etanol y CO 2, mediante una
sucesión de reacciones en cadena que tienen lugar en el citoplasma de las levaduras
y que puede expresarse mediante la siguiente ecuación global simplificada:

C6H12O6 + 2 ADP + 2 HPO4= 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O + 56 Kcal

Paralelamente y de forma asociada a la degradación de los azúcares, las

levaduras utilizan otros compuestos presentes en el mosto, que son necesarios para
su desarrollo y multiplicación, dando lugar a gran cantidad de metabolitos
secundarios:

- Alcoholes superiores, procedentes del metabolismo nitrogenado

de las levaduras, que participan en el equilibrio aromático del
vino.

- Ésteres formados a partir de los alcoholes superiores, la mayoría

de los cuales contribuyen de forma muy positiva al aroma de los
vinos.

4
 Introducción

- Sustancias azufradas que pueden influir en el equilibrio

organoléptico del vino y que se forman a partir de los compuestos
derivados del azufre y presentes en el mosto.

2) La fermentación maloláctica (FML): consiste fundamentalmente en la

desacidificación biológica del vino que resulta de la transformación del ácido L(-)
málico (dicarboxílico) en ácido L(+) láctico (monocarboxílico) y CO 2, por acción
de las bacterias lácticas. Bioquímicamente es el resultado de la actividad de la
enzima maloláctica característica de las bacterias lácticas, que precisa de los
cofactores NAD+ y Mn2+, según la siguiente reacción:

COOH
COOH
Enzima
HO – C – H
maloláctica
HO – C – H + CO2
NAD+ Mn++
H–C–H
CH3
COOH

Ácido L(–)-málico Ácido L(+)-láctico

Esta transformación tiene un doble efecto: por un lado, desacidifica el vino,

es decir eleva el pH, tanto más cuanto más alto es el contenido inicial de ácido
málico y por otra parte lo suaviza, al hacer desaparecer el sabor ácido y duro del
ácido málico y sustituirlo por el sabor más suave del ácido láctico. Por lo tanto, la
FML modifica las características organolépticas del vino a la vez que contribuye a
su estabilidad microbiológica, por lo que se considera indispensable para el
afinamiento y estabilidad del vino, constituyendo el primer paso hacia la fase de
envejecimiento.

5
Introducción

Al igual que las levaduras en la FA, las bacterias lácticas son capaces de
metabolizar un número importante de sustancias que contiene el vino produciendo
numerosos metabolitos secundarios:

- Los azúcares residuales de la FA suministran la energía suficiente

a las bacterias lácticas para su crecimiento y permiten la formación
de biomasa que llevará a cabo la FML. Sin embargo la
fermentación de estos azúcares conduce a la formación de acetato
lo que produce un aumento en la acidez volátil.

- El ácido cítrico es también un sustrato importante para las bacterias

lácticas, a partir del cual no solo se genera ácido acético, sino
también otros productos como diacetilo que contribuye al buqué
del vino y a su complejidad.

- Los aminoácidos del vino son utilizados por las bacterias lácticas
para la síntesis de proteínas, pero este metabolismo nitrogenado
puede también producir aminas biógenas y carbamato de etilo, que
pueden resultar perjudiciales para la salud humana.

Tanto la FA como la FML contribuyen esencialmente a la calidad final del

producto (Swiegers et al., 2005) y se llevan a cabo por una sucesión de
microorganismos, fundamentalmente levaduras y bacterias lácticas. En numerosos
estudios se han examinado las levaduras y bacterias que participan en la
fermentación espontánea de los mostos (Lafon-Lafourcade et al., 1983; Fleet et al.,
1984; Fleet, 1993; Querol et al., 1994; López, 2004; Santamaría, 2009). En general,
las levaduras predominan durante la FA, dada su mejor adaptación al bajo pH y a la
alta concentración de azúcares del mosto. Normalmente, cuando los azúcares
reductores son transformados en etanol, el nivel de levaduras disminuye y el
desarrollo de bacterias comienza a ser importante. En la mayoría de las bodegas,

6
 Introducción

una vez finalizada la fermentación alcohólica, la FML suele suceder

espontáneamente; sin embargo, este desarrollo espontáneo es impredecible. El
proceso no siempre se lleva a cabo, o no se hace en el momento adecuado ni en
óptimas condiciones, ya que son muchos los factores que influyen en el
crecimiento y desarrollo de las bacterias lácticas del vino (Carreté et al., 2002).

Los hongos filamentosos son otros de los microorganismos que acompañan

a la vendimia y también se encuentran en la bodega, asociados a la elaboración y
conservación del vino. Tienen una importancia creciente por ser, en general,
causantes de alteraciones en la calidad e incluso, por poder plantear serios riesgos
en la salud de los consumidores.

1.2.- Microorganismos asociados a la uva y a la vinificación

La ecología microbiana de las uvas es muy compleja, incluyendo

levaduras, bacterias y hongos filamentosos que tienen, como se ha visto
anteriormente, diversas características y efectos fisiológicos en la elaboración del
vino (Barata et al., 2012a). Algunas especies se encuentran solamente en las uvas
como son los hongos parásitos o ciertas bacterias ambientales, mientras que otras
tienen la capacidad de sobrevivir y crecer en el vino, constituyendo el ecosistema
microbiano del mismo. Este ecosistema comprende levaduras, bacterias lácticas y
bacterias acéticas. La proporción de estos microorganismos en la uva depende de la
etapa de maduración en que se encuentre el fruto y de la disponibilidad de
nutrientes. Por otro lado, la microbiota de las bayas se ve afectada,
fundamentalmente, por el estado sanitario de las mismas, de tal modo que en uvas
dañadas se encuentran mayor número de microorganismos y mayor diversidad de
especies.

7
Introducción

1.2.1.- Levaduras

Las levaduras se definen como microorganismos eucariotas del reino

Fungi, cuyo crecimiento vegetativo se produce, en su mayoría, a partir de la
gemación o fisión binaria, y cuyas esporas sexuales no se forman en el interior de
cuerpos fructíferos (Kurtzman y Feel, 1998). La mayor parte de las levaduras se
consideran unicelulares, con un solo núcleo y una estructura de pared celular
variable, lo que ha permitido su clasificación en Ascomicetos y Basidiomicetos.
Muchas levaduras presentan reproducción sexual, formando ascas o basidios,
estructuras donde tiene lugar la meiosis y que definen el estado perfecto
(teleomórfico) de la levadura. Algunas especies se caracterizan por formar
pseudohifas o incluso hifas verdaderas. Las células vegetativas pueden presentar
morfologías muy variadas, determinándose en algunas especies la formación de
esporas asexuales. Pueden tener ciclos de vida muy complejos, además de ser muy
variables en cuanto a sus capacidades fisiológicas.

La clasificación de las levaduras está en constante revisión debido a los

avances en las técnicas de Biología Molecular. Entre el centenar de géneros
registrados que representan más de setecientas especies, solamente 15 tienen
importancia enológica. La Tabla 1 muestra la clasificación propuesta actualmente,
donde se citan las especies más extendidas en Enología (Lonvaud-Funnel et al.,
2010).

8
 LEVADURAS
ASCOMICETOS BASIDIOMICETOS

DEUTEROMICETOS HEMIASCOMICETOS

Dothidaceae Candidaceae Dipodascaceae Lipomycetaceae Metschnikowiaceae Schizosaccharomycetaceae Saccharomycetaceae Sporiodiobolaceae Tremellaceae

Aureobasidium Brettanomyces Yarrowia Lipomyces Metschnikowia Schizosaccharomyces Debaryomices Rhodosporidium Bulleromyces

pullulans anomala lipolytica spencermartinsiae pulcherrima pombe hansenii babjevae albus
Brettanomyces Zygoascus Metschnikowia Hanseniospora Rhodosporidium Cryptococcus
bruxellensis hellenicus fructicola guillermondii kratochilovae albidus
Candida Metschnikowia Hanseniospora Rhodotorula Cryptococcus
boidinii audauensis opuntiae glutinis aureus
Candida Hanseniospora Rhodotorula Cryptococcus
cantarellli uvarum graminis cellulolyticus
Candida Hanseniospora Rhodotorula Cryptococcus
cidri batistae mucilaginosa flavescens
Candida Issatchenkia Sporidiobolus Cryptococcus
fructus orientalis pararoseus laurentii
Candida Issatchenkia Sporidiobolus
intermedia terricola salmonicolor
Candida Kluyveromices Sporobolomyces
membranafaciens lactis foliicola
Candida Kloeckera Sporobolomyces
stellata apiculata roseus
Lodderomyces
elongisporus
Pichia anomala
Pichia fermentans
Saccharomyces
bayanus
Saccharomyces
cerevisiae
Torulaspora
Tabla 1.- Clasificación actual de levaduras. (Tomado de Lonvaud-Funnel et al., 2010). delbrueckii
Introducción

En el viñedo, suelo, hojas y madera predominan fundamentalmente

levaduras oxidativas del grupo de los Basidiomicetos, cuya importancia es
irrelevante desde el punto de vista enológico debido a su incapacidad para
fermentar azúcares o sobrevivir en los vinos (Sabate et al., 2002). Además, aparece
frecuentemente un Ascomiceto o “levadura negra”, Aureobasidium pullulans que
parece reducir la biodiversidad de los Basidiomicetos (Čadež et al., 2010) y en
opinión de algunos autores, también el crecimiento de Botrytis cinerea en la
superficie de las uvas, disminuyendo por tanto la putrefacción (Schena et al.,
2003). Puede decirse que es la principal levadura del viñedo, a pesar de su nulo
poder fermentativo y su nula participación en las vinificaciones. Esta levadura se
considera como un hongo negro parecido a las levaduras y es el saprofito más
abundante en la filosfera (Zalar et al., 2008).

El aumento de la proporción de Ascomicetos oxidativos o débilmente

fermentativos puede ocurrir durante la maduración, pero el mecanismo por el que
se produce esta sucesión no está claro. Puede deberse a una interacción de especies
(Fleet, 2003), aunque el factor principal es la disponibilidad de nutrientes porque al
aproximarse la maduración las bayas se comportan de manera diferente a las hojas
de la vid, probablemente porque el hollejo se ablanda permitiendo la liberación de
nutrientes y la colonización por levaduras del grupo de los Ascomicetos (Barata et
al., 2012b).

Las levaduras están consideradas como el grupo más importante de

microorganismos, y han sido utilizadas durante siglos por su interés comercial en la
producción de pan, vino, cerveza, sidra y otras bebidas alcohólicas (Martorell,
2006).

Louis Pasteur demostró, de forma irrefutable, el papel imprescindible de

las levaduras en la fermentación alcohólica. La elaboración del vino se debe a la

10
 Introducción

acción secuencial de varias especies de levaduras pertenecientes a distintos

géneros. Como se ha mencionado anteriormente, se conocen cerca de un centenar
de géneros pero las levaduras enológicas están representadas por algo más de una
quincena y se pueden agrupar en dos categorías: Saccharomyces y No-
Saccharomyces. En el primer grupo se incluyen levaduras pertenecientes al género
Saccharomyces y son los principales agentes de la fermentación (Beltrán et al.,
2002). Sin embargo, la carga microbiana de la uva que entra en la bodega está
formada casi exclusivamente por levaduras No-Saccharomyces, que se caracterizan
por su capacidad limitada de fermentación.

Las poblaciones de levaduras que se pueden encontrar en las bayas de un

racimo son del orden de 103 a 105 células/grano de uva, dependiendo de la
vendimia, grado de madurez y estado sanitario del racimo, sobre todo cuando
existen importantes roturas del hollejo, así como también de las condiciones
climáticas del cultivo del viñedo y de los tratamientos fitosanitarios aplicados al
mismo (Sabate et al., 2002; Renouf et al., 2005, 2006b y 2007; Ocón et al., 2010a;
Hidalgo, 2011). En cuanto a las especies de levaduras agrupadas como No-
Saccharomyces se pueden encontrar levaduras apiculadas de los géneros Kloeckera
(especialmente K. apiculata, o su forma esporógena Hanseniospora uvarum) que
pueden llegar a constituír entre un 50% y un 99% de las levaduras aisladas de la
uva. Además, se encuentran en menor proporción diversas especies pertenecientes
a géneros como Candida, Hansenula, Cryptococcus, Kluyveromyces, Pichia,
Rhodotorula y Bretanomyces/Dekkera, entre otros (Pretorius et al., 1999; Raspor et
al., 2006; Fleet, 2008).

Las levaduras del grupo Saccharomyces aparecen en una proporción

relativamente baja en la vendimia respecto a las No-Saccharomyces. Partiendo de
esta premisa y teniendo en cuenta que las Saccharomyces son los verdaderos
agentes de la fermentación, resulta difícil explicar que con la carga microbiana que

11
Introducción

lleva la uva, el proceso fermentativo pudiera llevarse a cabo. Por tanto, se pone de
manifiesto que es interesante conocer los microorganismos presentes en otros
medios, como son las instalaciones y el ambiente de la bodega.

En la bodega, las levaduras se encuentran fijadas sobre suelos, paredes,

depósitos, conducciones y maquinaria de procesado (Rosini et al., 1982; Pretorius,
2000; Ocón et al., 2010b). A medida que la vendimia va tomando contacto con los
diferentes materiales de la bodega, las levaduras pasan al mosto y comienzan a
multiplicarse y a fermentar. La flora que constituye la microbiota de la bodega, al
contrario de lo que ocurre en la uva, está formada tanto por Saccharomyces
cerevisiae, como por No-Saccharomyces. Hasta hace poco tiempo se creía que las
levaduras presentes en los materiales de vinificación pertenecían principalmente a
la especie Saccharomyces cerevisiae, es decir levaduras capaces de completar una
fermentación (Beltrán et al., 2002). Sin embargo, en trabajos más recientes se ha
puesto de manifiesto que las No-Saccharomyces pueden ser mayoritarias también
en las instalaciones (Santamaría et al., 2005; Ocón et al., 2010b).

Numerosos estudios se han dedicado al aislamiento e identificación de las

levaduras presentes en la superficie de las bayas e instalaciones de la bodega
(Sabate et al., 2002; Combina et al., 2005; Raspor et al., 2006; Barata et al., 2008),
y también son muchos los análisis cuantitativos y cualitativos de las especies
presentes durante la FA (Fleet y Heard, 1993; Guillamón et al., 1998; Esteve-
Zarzoso et al., 1999; Renouf et al., 2007) que han confirmado que en la
elaboración tradicional (sin el empleo de cultivos iniciadores) el mosto de uva es
transformado en vino por la acción secuencial de varias especies de levaduras que
se suceden en el transcurso de dicha fermentación.

En general, se puede afirmar que estas fermentaciones espontáneas

comienzan con el crecimiento de levaduras pertenecientes a los géneros Candida,

12
 Introducción

Debaryomyces, Hanseniospora, Metschnikowia, Pichia, Torulaspora y

Zygosaccharomyces, que se consideran levaduras de bajo poder fermentativo. El
crecimiento de estas especies de levaduras se limita a los dos o tres primeros días
de la fermentación, transcurridos los cuales mueren por el efecto tóxico del etanol
que se va generando. Paralelamente, levaduras más alcohógenas de la especie S.
cerevisiae van poblando el medio, coexistiendo inicialmente con las levaduras de la
uva y/o las instalaciones. A medida que avanza la FA se van convirtiendo en
dominantes y conducen el proceso hasta el final, siendo las responsables últimas de
dicha fermentación. Dentro de este género, encontramos una gran diversidad clonal
con un gran número de cepas o individuos con propiedades tecnológicas muy
variables (Ribèreau-Gayon et al., 2006; Santamaría, 2009). La mayor o menor
diversidad clonal está condicionada por factores como la localización geográfica,
las características de la campaña y la tecnología de la vinificación empleada.

Las levaduras No-Saccharomyces son muy sensibles al etanol y menos

competitivas en medios con alta concentración de azúcares (Torija et al., 2001).
Además de por la concentración de etanol, la presencia y el crecimiento de las
levaduras No-Saccharomyces durante la fermentación alcohólica también está
influenciada por la diversidad de levaduras en el mosto, la interacción entre las
diferentes especies y cepas, la composición en nutrientes del mosto y las
condiciones del proceso, principalmente la adición de sulfuroso y la temperatura de
fermentación (Fleet y Heard, 1993; Nissen et al., 2003; Pérez-Nevado et al., 2006;
Ocón et al., 2010a).

En las primeras fases de la fermentación las levaduras No-Saccharomyces

pueden alcanzar poblaciones de 106-107 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml
(Fleet, 2003), nivel comparable al que alcanza la especie S. cerevisiae en plena
fermentación. A pesar de permanecer en el medio sólo durante los primeros días de
la fermentación, las No-Saccharomyces producen gran cantidad de metabolitos que

13
Introducción

pueden favorecer o perjudicar la calidad final del producto (Mas et al., 2004). Por
ello, aunque durante mucho tiempo fueron consideradas sin interés, e incluso
indeseables, desde hace varios años son objeto de numerosos estudios. Estas
levaduras No-Saccharomyces producen y excretan diferentes enzimas (proteasas,
lipasas, estearasas, carbohidrolasas, etc.) que pueden interaccionar con los sustratos
presentes en el medio mejorando algunas etapas del proceso de elaboración del
vino como son la maceración, filtración y clarificación, el aumento de rendimiento
y la extracción de color o las características del vino, especialmente el aroma. En
este contexto, y teniendo en cuenta que las enzimas procedentes de la uva son
relativamente escasas y con una actividad muy limitada y que la levadura vínica
por excelencia, S. cerevisiae, no es en general una productora destacable de
enzimas extracelulares, es importante estudiar la posibilidad de sacar el mayor
rendimiento a las enzimas producidas por las levaduras que intervienen en la
elaboración, ya que permitiría por un lado reducir el aporte enzimático exógeno, y
por otro mejorar el proceso y los atributos sensoriales del vino. (Strauss et al.,
2001; Maturano et al., 2012). En este sentido, muchos autores opinan que las
levaduras No-Saccharomyces pueden dar lugar a vinos caracterizados por aromas
más complejos y de mayor calidad (Soden et al., 2000; Bely et al., 2008; Viana et
al., 2008; Ciani et al., 2010; Zott et al., 2011). Así, Moreira et al. (2008) plantearon
que el crecimiento de levaduras apiculadas durante los primeros días de
fermentación no influía negativamente sobre la producción de alcoholes superiores
y compuestos azufrados, y aumentaba la producción de ésteres. Debido a ésto,
durante los últimos años son muchos los estudios llevados a cabo con coinóculos
de levaduras No-Saccharomyces (Hanseniaspora uvarum, Torulaspora
delbrueckii, Kluyveromyces thermotolerans, Pichia kluyveri), junto con
Saccharomyces cerevisiae, bajo diferentes condiciones de vinificación (Anfang et
al., 2009; Andorrá et al., 2010; Izquierdo et al., 2011; Azzolini et al., 2012). Los
efectos positivos de estas fermentaciones multiestarter han favorecido la selección

14
 Introducción

de nuevos cultivos No-Saccharomyces capaces de conducir la fermentación

alcohólica junto con Saccharomyces cerevisiae (Comitini et al., 2011; Rantsiou et
al., 2012; Sadoudi et al., 2012).

Por otro lado, el proceso de vinificación incluye múltiples etapas en las

cuales puede producirse un crecimiento microbiano no deseado, alterando tanto la
calidad organoléptica como el estado sanitario del vino. Entre estos
microorganismos alterantes se incluyen algunas levaduras No-Saccharomyces
pertenecientes a los géneros Brettanomyces/Dekkera, Candida,
Hanseniospora/Kloeckera, Metschnikowia, Pichia, Saccaromycodes,
Schizosaccaromyces y Zygosaccharomyces (du Toit y Pretorius, 2000). Entre las
alteraciones organolépticas destacan la refermentación, la formación excesiva de
determinados ésteres, el incremento de la acidez volátil, la formación de fenoles
volátiles y compuestos derivados de la tetrahidropiridina, la formación de films o
películas microbianas, una excesiva desacidificación y la formación de olores
azufrados o de reducción. En este sentido, los puntos críticos potenciales de
contaminación microbiológica incluyen en primer lugar las uvas como materia
prima, seguido de las instalaciones y equipos de la bodega y por último el proceso
de fermentación y el envejecimiento. (Loureiro y Malfeito-Ferreira, 2003;
Fugelsang y Edwards, 2007; Suárez et al., 2007; Trioli, 2009).

En general, parece necesario realizar estudios más profundos del

ecosistema del viñedo y de la bodega para establecer el origen de las levaduras que
llevan a cabo la fermentación y de las que causan defectos en el vino.

15
Introducción

1.2.2.- Bacterias lácticas

Las bacterias son microorganismos procariotas, que se diferencian de las

levaduras por su pequeño tamaño y la ausencia de membrana nuclear que forme un
verdadero núcleo. El término bacterias lácticas engloba a una gran diversidad de
microorganismos que difieren tanto morfológica como fisiológicamente. El
concepto de “bacterias lácticas” como grupo microbiano surgió a principios del
siglo XX para designar a un grupo heterogéneo de bacterias que en la actualidad
responden a la definición general de “bacterias en forma de cocos o bacilos Gram-
positivas, catalasa negativas, inmóviles, no esporuladas, anaerobias pero
aerotolerantes y que producen ácido láctico como metabolito mayoritario de la
fermentación de los azúcares”.

Las bacterias lácticas que se pueden encontrar en las uvas y el vino

pertenecen a cuatro géneros: Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc y
Oenococcus. Garvie (1967) propuso una nueva nomenclatura para las bacterias de
la especie Leuconostoc oenos que se diferenciaban del resto de Leuconostoc por su
mayor tolerancia al etanol y a la acidez, diferenciación que fue confirmada por
Dicks et al. (1995) por técnicas de biología molecular. Se estableció así un nuevo
género (Oenococcus) que contenía una única especie (O. oeni). Recientemente,
Endo y Okada (2006) propusieron una nueva especie del género Oenococcus (O.
kitaharae) para bacterias lácticas aisladas de residuos de la destilación de shochu.

Para su clasificación, además de su morfología, cocos (forma esférica) y

bacilos (forma alargada), se considera el carácter homofermentativo o
heterofermentativo, en función de su comportamiento frente al catabolismo de los
azúcares. Las bacterias homofermentativas producen más del 85% de ácido láctico
a partir de glucosa y/o fructosa. Las heterofermentativas producen además de ácido
láctico, anhídrido carbónico, etanol y ácido acético, en cantidades variables según

16
 Introducción

las cepas (Hidalgo, 2011). Las principales especies de bacterias lácticas que se
encuentran en los mostos y en los vinos aparecen reflejadas en la tabla 2.

Tabla 2. Clasificación de las bacterias lácticas (tomado de Hidalgo, 2011)

Morfología Naturaleza Especies Ácido láctico
celular fermentativo
Heterofermentativos Lactobacillus casei L
facultativos Lactobacillus plantarum DL
Lactobacillus brevis DL
Bacilos
Heterofermentativo Lactobacillus hilgardii DL
Lactovacillus fructivorans DL
Lactobacillus buchneri DL
Pediococcus damnosus DL
Homofermentativo Pediococcus pentosaceus DL
Cocos Pediococcus parvulus DL
Oenococcus oeni D
Heterofermentativo
Leuconostoc mesenteroides D

Los cocos del género Pediococcus son homofermentativos, mientras que

Leuconostoc y Oenococcus son heterofermentativos. Los Lactobacillus pueden
presentar los dos comportamientos y se dividen en tres grupos: los
homofermentativos estrictos, no identificados nunca en el vino, que no fermentan
las pentosas y forman dos moléculas de ácido láctico a partir de una de glucosa; los
heterofermentativos facultativos, que además de transformar una molécula de
glucosa en dos de ácido láctico, fermentan las pentosas a ácido láctico y ácido
acético por la vía heterofermentativa de las pentosas fosfato y los
heterofermentativos, que fermentan la glucosa por la vía de las pentosas fosfato
formando ácidos láctico y acético, etanol y CO2 y las pentosas dando ácido láctico
y ácido acético (Ribèreau-Gayón, 2006).

El papel de las bacterias lácticas en el campo de la enología es

controvertido: por un lado ejercen un papel beneficioso cuando se quiere que
realicen la fermentación maloláctica, pero también pueden producir alteraciones
que provocan la pérdida de calidad del vino.

17
Introducción

Las primeras observaciones de la FML se remontan al siglo XIX, cuando

se describió una segunda fermentación en los vinos jóvenes que coincidía con el
incremento de temperaturas al final de la primavera. En los estudios sobre las
alteraciones del vino, que llevó a cabo Louis Pasteur, se aislaron las primeras
bacterias lácticas, considerándose como perjudiciales puesto que se asociaban a la
alteración conocida como “tourné” o “vuelta” de los vinos, que era más frecuente
en regiones cálidas.

En la actualidad, la FML se considera un importante factor de calidad en

los vinos tintos y en ciertos vinos blancos. Además es un factor de normalización
de la calidad entre campañas, que contribuye a la estabilidad microbiológica del
producto final y ofrece la oportunidad de modificar las propiedades sensoriales del
vino. En el caso de los vinos tintos de Rioja se considera indispensable para el
afinamiento y estabilidad y constituye el primer paso hacia su fase de
envejecimiento.

Se han aislado bacterias lácticas en hojas de vid, uvas, equipos de bodega,

barricas, etc. (Bae et al., 2006). Esto quiere decir que están presentes durante todas
las etapas de vinificación y que, como las levaduras, acompañan a la vendimia y
permanecen en el material de bodega después de la FML (Fugelsang y Edwards,
2007). Las bacterias lácticas se encuentran inicialmente en la uva en número
inferior al de levaduras y bacterias acéticas, alcanzando recuentos inferiores a 100
células por grano de uva (Peynaud, 1989).

En las horas posteriores al estrujado de la vendimia, su población aumenta

hasta 103-105 UFC/ml (López, 2004), formando parte de un complejo sistema de
especies de levaduras y bacterias que proceden tanto de la uva como de las
instalaciones y del material de la bodega. Las especies que se han identificado en
esta fase han sido: L. plantarum, L. casei, L. hilgardii, L. brevis, P. damnosus, P.

18
 Introducción

pentosaceus, P. parvulus, Ln. mesenteroides y O. oeni (Lonvaud-Funnel, 1999;

López, 2004; Izquierdo et al., 2009). Su número y proporción dependen de las
condiciones de maduración, del estado de la vendimia y de las innumerables
interacciones entre las decenas de especies de microorganismos que colonizan el
medio (Landete, 2005; Krieger, 2006; Renouf et al., 2006a).

En las condiciones habituales de vinificación (con sulfitado de la vendimia

y en un medio cuya composición química cambia constantemente y donde todos
los microorganismos luchan por desarrollarse), las bacterias lácticas consiguen
multiplicarse de forma muy transitoria, para dejar paso a las levaduras. Cuando se
inicia la FA y la población de levaduras se encuentra en fase de crecimiento
exponencial, el número de bacterias lácticas desciende hasta 102 UFC/ml,
dependiendo del pH y del grado alcohólico del vino. También disminuye la
diversidad de especies, produciéndose una selección en favor de las cepas más
resistentes al etanol (du Plessis et al., 2004; Reguant et al., 2005). Cuando cesa por
completo la actividad de las levaduras, a veces incluso antes, la población de
bacterias lácticas prosigue su adaptación al medio y se produce su multiplicación.
O. oeni es la especie mayoritariamente identificada cuando finaliza la FA (López,
2004; Lonvaud-Funnel, 2006; Renouf et al., 2007; López, 2009).

En contadas ocasiones, como por ejemplo en vinos con pH elevado, se

puede producir una ligera proliferación de otras especies, en muchos casos
indeseables. Aunque no se conocen los mecanismos de esta selección, el hecho es
que O. oeni se adapta mejor que el resto de las especies a los cambios en el medio,
soportando también mejor las posibles carencias nutritivas y el aumento de la
toxicidad que resulta del metabolismo de las levaduras (Bartowsky, 2005;
González et al., 2012). Dependiendo de los factores limitantes con los que se
enfrente, la fase de latencia puede ser más o menos larga. Cuando se alcanzan en el
medio poblaciones de 105-107 UFC/ml, comienza a producirse la degradación del

19
Introducción

ácido málico, siendo O. oeni la principal especie responsable de la misma (López et

al., 2007). Durante la FML el metabolismo de O.oeni modifica la composición
química del vino y esto se traduce en cambios en el aspecto, el aroma y el paladar
del mismo (Swiegers et al., 2005). O. oeni es capaz de interactuar con gran parte de
los compuestos químicos presentes en el vino, incluyendo los carbohidratos, los
polioles, las proteínas, los aminoácidos, los compuestos fenólicos, los ácidos
orgánicos y los glicósidos (Bartowsky, 2005). Muchas de las modificaciones en la
composición del vino dependen de la cepa de bacteria. La diversidad clonal de
Oenococcus oeni en la FML es variable según los distintos trabajos consultados.
Así Reguant y Bordons (2003), Palacios et al. (2004) y Pramateftaki et al. (2006),
encontraron escasa diversidad de cepas, mientras que otros como Bartowsky et al.
(2003) y Tenorio et al. (2007), encontraron una amplia diversidad entre las cepas
que llevaron a cabo las fermentaciones malolácticas espontáneas.

En algunos casos se ha observado que L. plantarum y Pediococcus spp.

también participan en la degradación del ácido málico y pueden ser responsables de
fermentaciones espontáneas. Recientemente, L. plantarum se ha vuelto a considerar
como una opción para la FML (du Toit et al., 2011). Las bacterias lácticas también
pueden alterar el vino cuando su actividad va más allá de la FML, particularmente
en vinos de pH elevado, produciendo mal sabor o aminas biógenas (López et al.,
2008; Arena et al., 2011; Pan et al., 2011). La capacidad de Oenococus oeni para
producir histamina y tiramina depende de la cepa bacteriana y de la composición
del vino, que a su vez es dependiente de las cepas de levaduras que han llevado a
cabo la FA y de la duración del tiempo de contacto bacteria-levadura después de
finalizada la FML (Rosi et al., 2009).

Después de la desaparición del ácido málico, permanece en el vino una

población bacteriana más o menos importante, dependiendo en buena medida de
las condiciones del vino y del tratamiento aplicado al mismo. El aporte de SO 2

20
 Introducción

provoca una pérdida de viabilidad de estas bacterias. También es importante el pH

del vino, de tal modo que a pH bajo las bacterias mueren progresivamente,
mientras que a pH superior a 3.5, la población puede seguir aumentando y aparecer
de nuevo poblaciones mixtas de bacterias compuestas por diversas especies de
Pediococcus y Lactobacillus, además de O. oeni (Izquierdo et al., 2009; Pozo-
Bayón et al., 2009).

1.2.3.- Mohos

Son organismos eucariotas, multicelulares y filamentosos, constituidos por

micelios verdaderos. Además carecen de clorofila y están formados por una serie
de células alineadas llamadas hifas. El micelio es el conjunto de hifas ramificadas y
resulta visible sobre el alimento, bien en superficie o en el interior, mediante un
aspecto y color característicos.

En la uva se pueden desarrollar varios tipos de mohos que entran en la

bodega durante la vendimia. Además, los mohos son microorganismos ubicuos en
la bodega y están presentes tanto en las superficies como en el aire (Donnelly,
1977). Los géneros que se encuentran habitualmente en la uva son Aspergillus,
Botrytis, Penicillium (Abrunhosa et al., 2001; Esteban et al., 2004) y, en menor
cantidad y acompañando muchas veces a los anteriores, Alternaria, Cladosporium,
Moniliella y Phythophthora (Rosa et al., 2002). Los mismos géneros mayoritarios
se encuentran también en el ambiente de las bodegas (Ocón et al., 2011 y 2013c).

Uno de los mohos más conocidos es el hongo saprofítico Botritis cinerea,

que se desarrolla en la uva causando la podredumbre gris, y cuya presencia en
bodega se asocia a la entrada de vendimia contaminada. Las uvas atacadas por
Botrytis presentan una mayor facilidad para el desarrollo de otros mohos como
Penicillium y Aspergillus, que son dos de los géneros que más preocupan en el

21
Introducción

sector de la elaboración del vino, puesto que son los responsables de la presencia
de Ocratoxina A (OTA) (Bellí et al., 2004; Soriano del Castillo, 2007) y de la
contaminación de los corchos de las botellas (Suárez et al., 2004).

La OTA es una toxina fúngica que se encuentra en uvas y productos

derivados de la uva. Representa un riesgo para la salud humana debido a sus
efectos nefrotóxicos, teratogénicos, inmunosupresores, y carcinógenos (Picco y
Rodolfi, 2004; Patiño et al., 2007).

El crecimiento de los hongos ocratoxigénicos se inhibe por el etanol y las

condiciones anaerobias resultantes de la degradación de los azúcares, pero ésto no
tiene efecto alguno sobre las micotoxinas presentes. La OTA formada en un paso
anterior a la FA no se degrada ni durante el proceso de vinificación, ni durante el
almacenamiento posterior del vino.

Un diagnóstico rápido y precoz de los hongos responsables de la

producción de OTA en vinos y zumos, antes de que la toxina haya alcanzado
niveles detectables o de riesgo, permite implantar medidas de control adecuadas
para impedir la presencia de la toxina en el producto final. En trabajos previos (Pitt,
1987) se han identificado distintas especies responsables de la aparición de OTA,
como las del género Penicillium (P. verrucosum y P. viridicatum), además de otros
géneros productores como Aspergillus spp. (Bellí et al., 2004), Botrytis cinerea,
Alternaria spp., Cladosporium spp. (Leong, 2007; Melki Ben Fredj et al., 2007).
Tras los estudios realizados durante los últimos años en España, se ha llegado a la
conclusión de que los Aspergillus negros son los causantes de la producción de
OTA en el ámbito español, destacando la especie Aspergillus carbonarius.
Aspergillus niger presenta menor capacidad para producir esta toxina (Bellí et al.,
2004), aunque los últimos estudios revelan que es capaz de producir fumonisina B 2,

22
 Introducción

considerada también una micotoxina con potenciales efectos cancerígenos

(Logrieco et al., 2011).

Por otro lado, el género Penicillium es un moho capaz de alimentarse de

diversos sustratos, lo que le permite desarrollarse en diferentes ambientes. En el
vino también se encuentra en la etapa final de la elaboración. En la actualidad, uno
de los problemas que más preocupa al sector enológico mundial durante la
conservación de los vinos en botella, es la aparición de compuestos como el 2, 4, 6
tricloroanisol (TCA) a partir de 2, 4, 6 triclorofenol (TCF) y otros compuestos
clorados, cuya presencia se ha relacionado con ciertas especies de hongos
filamentosos (Suárez et al., 2004), principalmente del género Penicillium. Éstos
encuentran en el corcho un sustrato a partir del cual producen una reacción
bioquímica que degrada los clorofenoles, a través de una metilación, a
cloroanisoles (compuestos volátiles muy odoríferos, responsables del temido
defecto del vino conocido como gusto a corcho o “goût de bouchon”). Aunque las
uvas son el principal vehículo de transmisión de los mohos, hay que tener en cuenta
que las esporas de los hongos son ubicuas en la naturaleza. Éstas se separan
completamente del micelio y son lanzadas para ser transportadas por el aire (Carlile
et al., 2001).

1.3.- Origen y diseminación de los microorganismos

enológicos

El origen de los microorganismos asociados a la vinificación y la vía por la

cual llegan hasta el mosto es una cuestión debatida desde hace tiempo. En la
actualidad se admite que tienen dos posibles orígenes: la uva y el material de la
bodega (Fleet y Heard, 1993; Mortimer y Polsinelli, 1999). Además de las uvas y
los equipos de bodega, existe una tercera vía por la que levaduras y bacterias

23
Introducción

pueden llegar al mosto: la adición exógena o inoculación con levaduras secas

activas o bacterias liofilizadas. Esta práctica es común en las nuevas regiones
productoras de vinos y crece con fuerza en las más tradicionales. La introducción
de estas levaduras y bacterias en algún depósito permite su posterior diseminación
por el ecosistema de las bodegas (Constantí et al., 1997; Beltrán et al., 2002),
utilizando las mismas rutas que las cepas indígenas.

1.3.1.-Microorganismos en las uvas y diseminación en el viñedo

Las uvas tradicionalmente se han considerado como la primera fuente de

microorganismos que participan en la vinificación. Sin embargo, estos
microorganismos necesitan un vector que les permita llegar hasta ellas. Algunos
investigadores creen que llegan hasta los racimos debido al efecto del viento
(Aranda et al., 2005) y principalmente por insectos como abejas, avispas y
Drosophila (Parle y di Mena, 1966; Mortimer y Polsinelli, 1999; Zacchi y
Vaughan-Martini, 2002; Groenewald et al., 2006; Stefanini et al., 2012).
Recientemente se ha comprobado la diseminación de levaduras de interés
enológico por medio de pájaros migratorios (Francesca et al., 2012).

El ecosistema microbiano de las uvas puede verse afectado por múltiples

factores como el suelo, la variedad de uva, las técnicas de cultivo empleadas en el
viñedo o los tratamientos fitosanitarios (Renouf et al., 2005 y 2006b; Martins et al.,
2012). La población de levaduras No-Saccharomyces encontrada sobre las uvas es
muy variable. La distribución de especies varia entre zonas geográficas y entre
vendimias debido a la temperatura, las lluvias, humedad, sanidad de las uvas,
prácticas culturales del viñedo, etc., aunque casi siempre se encuentran los mismos
géneros (Jolly et al., 2003). En lo que se refiere al efecto de las condiciones
climáticas en las poblaciones de levaduras en las uvas, los resultados de la
bibliografía son confusos. Así, Combina et al. (2005) y Čadež et al. (2010)

24
 Introducción

obtuvieron recuentos más altos de levaduras totales en las bayas en años lluviosos,
resultado contrario al obtenido por Comitini y Ciani (2006). En concordancia con
estos últimos autores, Rementería et al. (2003) detectaron una población de
levaduras más elevada en años cálidos y secos. Sin embargo, los estudios
realizados por Jolly et al. (2003) en Sudáfrica durante tres vendimias y en cuatro
regiones diferentes no pudieron establecer una relación entre las condiciones
climáticas de estas zonas y las especies de No-Saccharomyces encontradas.
Asimismo, Valero et al. (2005) tampoco encontraron ninguna correlación entre las
cepas de S. cerevisiae y las condiciones climáticas de los viñedos del Noroeste de
Portugal donde se realizó el estudio.

En cuanto a la influencia de la localización del viñedo y la variedad de uva

existe una tendencia a relacionar la tipicidad del vino con la microbiota específica
de la uva de la región que lo produce. Sin embargo, autores como Sabate et al.
(2002) o Rementería et al. (2003) no hallaron correlaciones entre estos aspectos y
el número y diversidad de levaduras en las bayas.

Por otra parte, numerosos trabajos han puesto de manifiesto que la

principal levadura fermentadora, Saccharomyces cerevisiae, está prácticamente
ausente de las uvas y del suelo del viñedo (Vaughan-Martini y Martini, 1995). Por
ello, el origen de esta levadura está en continuo debate y en la actualidad existen
dos teorías: una indica que son las uvas dañadas (por mohos, insectos, pájaros o
demasiada agua), las que sirven como medio de vida a muchos microorganismos,
incluida S. cerevisiae y otra que dice que la principal fuente de esta levadura es el
ecosistema de la bodega, aunque no niega una minoritaria presencia en las uvas
(Fleet y Heard, 1993).

Diferentes estudios realizados sobre uvas indicaban que S. cerevisiae sólo

está presente en porcentajes inferiores al 0,1% del total de levaduras presentes y

25
Introducción

que no se encuentra distribuida ni en todas las cepas ni en todos los granos de uva
(Török et al., 1996; Van der Westhuizen et al., 2000; Mercado et al., 2007). Por el
contrario, Schuller et al. (2005) obtuvieron resultados que claramente indicaban
que S. cerevisiae estaba presente en las uvas de un viñedo de la región de Vinho
Verde en un número suficientemente elevado como para conducir una
fermentación espontánea. Valero et al. (2005 y 2007) demostraron que la
diseminación de cepas comerciales de S. cerevisiae en el viñedo se ve favorecida
por el agua de escorrentía y se da en distancias cortas, llevándose a cabo por
diversos vectores como insectos, viento y otros. También demostraron que algunas
cepas de esta especie podían permanecer en el ecosistema del viñedo de un año a
otro.

El modelo Hansen, que trata de explicar la circulación de levaduras en la

naturaleza (Martini, 1993), indica que las células de levadura son residentes
habituales en la superficie de los frutos y que desde ahí pasan al suelo debido a la
lluvia o a los frutos caídos. El suelo es su hábitat de invierno hasta que al principio
del verano las células alcanzan nuevamente a los frutos por medio de los vientos y
las corrientes de aire. Griffin et al. (2003) demostraron que las partículas de polvo
pueden servir como medio de dispersión de levaduras y hongos, mientras que
Benda (1982) indicaba que el transporte de las levaduras a los frutos se debe a los
insectos y no al viento.

Aceptando que el moho saprofítico Botrytis cinerea se conserva durante el

invierno en los sarmientos (esclerocios) y ocasionalmente en las grietas de la
madera y yemas (micelio), parece concebible que las levaduras que causan
alteraciones en el vino que son también de naturaleza saprofítica, se comporten de
un modo semejante, pero este punto no ha sido confirmado. Sin embargo, sí parece
claro que las levaduras deben tener vectores ambientales que les permitan llegar a

26
 Introducción

la superficie de las bayas y desarrollarse cuando las condiciones les sean más
favorables, lo que ocurre generalmente entre el periodo de envero a vendimia.

Adams (1964) identificó levaduras de los géneros Kloeckera, Torulopsis y

Cryptococcus en muestras de aire recogidas alrededor de viñedos y de otras zonas
hortícolas. Davenport (1974) observó posteriormente que la mayoría de las
levaduras del aire del viñedo pertenecían mayoritariamente a los géneros
Sporobolomyces y Cryptococcus, encontrándose en forma de “propágulos”
(adheridos a semillas o insectos voladores), mientras que el aire en sí mismo
contenía muy pocas levaduras. Por su parte, Fleet et al. (2002) indicaron que en el
aire se encuentran pequeñas poblaciones de levaduras, siendo las más importantes
las pertenecientes al género Sporobolomyces. Más recientemente, los resultados
publicados en el Annual Report 2009/2010 del Fraunhofer Institute for Molecular
Biology and Applied Ecology (www.ime.fraunhofer.de) indican que las levaduras
encontradas en el aire de un viñedo de Pinot Noir eran Zygosaccharomyces
florentinus, Metschnikowia pulcherrima y Pichia burtonii, mientras que en otro
viñedo de Chardonay las especies detectadas eran Metschnikowia pulcherrima,
Pichia burtonii y Candida zelanoydes. En las uvas las únicas especies encontradas
fueron Metschnikowia pulcherrima y Pichia burtonii.

Mortimer y Polsinelli (1999) afirmaban que S. cerevisiae no se transporta

por el viento en el viñedo porque no es una levadura contaminante del aire. Por el
contrario, Adams (1964) había demostrado su presencia en el aire del viñedo y
Santamaría (2009) atribuyó la aparición de la misma cepa de S. cerevisiae en los
vinos de cuatro bodegas próximas, a los fuertes vientos que hubo durante la época
de vendimias en la zona. También Valero et al. (2005) optaron por este método de
dispersión para explicar la aparición de determinadas cepas de esta especie en
viñedos alejados de la bodega donde habían sido inoculadas.

27
Introducción

Fugelsang et al. (2007) indicaron que las bacterias lácticas también están
presentes en el viñedo, pero que debido a sus necesidades nutricionales, su
densidad de población y la diversidad de especies es limitada (las uvas sanas
contienen menos de 103 UFC/g). Bae et al. (2006) también encontraron muy bajas
poblaciones de estos microorganismos en el viñedo y sólo las detectaron en uvas
dañadas. El agente típico de la FML, Oenococcus oeni, se ha aislado raramente de
uvas, probablemente porque al tratarse de una bacteria anaerobia (o semianaerobia)
y nutritivamente escrupulosa, es incapaz de competir con levaduras y bacterias
acéticas en las condiciones aeróbicas de las bayas. No se han encontrado
referencias respecto a la presencia de bacterias lácticas en el aire del viñedo. Sin
embargo, Yanagida et al. (2008) las encontraron en muestras de suelo de viñedo, lo
que indica que pueden llegar al aire adheridas a partículas de polvo o insectos,
como ya se ha visto que ocurre con las levaduras (Parle y Di Mena, 1966).

La mayoría de las células vegetativas de bacterias mueren rápidamente, en

cuestión de segundos, en el aire seco, pero las esporas fúngicas y bacterianas
pueden sobrevivir. La tasa de sedimentación de microorganismos es importante
pues determina la tasa de recontaminación de productos o equipos durante el
tiempo de exposición.

1.3.2.- Microorganismos en la vinificación y su diseminación en la

bodega

Las uvas que entran en la bodega tienen una población importante de

microorganismos adheridos a la pruina, compuesta por levaduras, bacterias y
mohos. Pero en el equipamiento de la bodega (tolva, estrujadora, despalilladora,
depósitos, etc.) también existen microorganismos y así, las levaduras, las bacterias
y los mohos que se encuentran en contacto con estas superficies pasan al mosto y,

28
 Introducción

si las condiciones ambientales lo permiten, comienzan a multiplicarse y a

fermentar.

Desde hace años, los bodegueros han venido observando que las primeras
fermentaciones espontáneas, tanto alcohólicas como malolácticas, que tienen lugar
en la bodega cada campaña, suelen ser más largas que las que suceden a
continuación (Peynaud, 1989). La razón podría deberse a que a medida que
transcurren los días de vendimia, el material de bodega se enriquece en levaduras, y
por lo tanto también los mostos o vendimias procesadas, produciéndose un
aumento de microorganismos en los primeros depósitos, su posterior diseminación
por la bodega y la llegada en gran cantidad a otros depósitos, por lo que las
fermentaciones posteriores se inician más rápidamente y transcurren a mayor
velocidad. Granchi et al. (2007), han sugerido que las cepas de S. cerevisiae que
dominan la fermentación del primer depósito de cada vendimia invaden el
ambiente de la bodega y producen una inoculación natural en las fermentaciones
siguientes. Este fenómeno también se observa en bodegas de nueva instalación,
donde el inicio de la fermentación de los primeros mostos es difícil.

Es conocido que la diseminación de los microorganismos en la bodega

tiene lugar por la maquinaria e instrumental de la misma, por los trabajadores, por
los insectos y… probablemente también por el aire.

La supervivencia de los microorganismos y su desarrollo está directamente

relacionado con las condiciones ambientales (temperatura, humedad, disponibilidad
de nutrientes...). El aire por si mismo no permite el desarrollo de los
microorganismos y sólo actúa como un medio de transporte o soporte de los
mismos hasta que estos caen y se depositan en las superficies de alrededor (Curiel
et al., 2000). Según estos autores, los microorganismos pueden viajar por el aire de
tres formas: adheridos a partículas de polvo, adheridos a gotas de líquido o como

29
Introducción

partículas individuales. Los microorganismos en el aire sufren condiciones de

estrés por calor, humedad, luz y falta de nutrientes. Fleet et al. (2002) indicaron
que en condiciones ambientales adversas predominan en el medio los
Basidiomicetos sobre los Ascomicetos y también los microorganismos capaces de
esporular, porque la esporulación favorece la resistencia de las levaduras a las
condiciones adversas. La mayoría de las levaduras encontradas en el aire de varias
bodegas por Ocón et al. (2013a, b) disponían de estas características. Además, la
producción de gomas y mucílagos sirve a algunos microorganismos como factor de
protección frente al estrés producido por la temperatura, la desecación y la
irradiación.

La primera referencia encontrada respecto a la calidad microbiana del aire

en una bodega es la de Beech (1993), en un estudio sobre sidra en el que encontró
relación entre la exposición del líquido al aire y la contaminación con levaduras
Brettanomyces. Posteriormente Connel et al. (2002) encontraron estas levaduras en
muestras de aire procedentes de distintas zonas de una bodega comercial
(vinificación, prensado, barricas y embotelladora), indicando que esta levadura
alterante podía diseminarse por la bodega a través de corrientes de aire. Estos
autores detectaron poblaciones de esta levadura entre 12 y 400 UFC/m3 de aire en
la zona de embotellado y prensado respectivamente. Anteriormente, Donelly
(1977) llevó a cabo un estudio para determinar la cantidad y tipos de
microorganismos presentes en el aire de la zona de embotellado de una bodega,
llegando a la conclusión de que las principales fuentes que proporcionaban
microorganismos al aire, y por ello las principales causas de contaminación durante
el embotellado, eran la llenadora, el vino derramado, el desagüe y el aire exterior.
Al limpiar estas superficies o eliminar la entrada de aire, la concentración de
microorganismos en el aire disminuía paralelamente. Según estos datos, los
microorganismos presentes en el aire parecen ser representativos de los que se
encuentran en el vino o en las superficies de las instalaciones próximas. Este autor

30
 Introducción

identificó en el aire tanto levaduras como bacterias lácticas y acéticas

pertenecientes a los géneros Acetobacter, Lactobacillus, Bacillus, Saccharomyces,
Rhodotorula y Serratia.

En los últimos años se han realizado estudios comparando la calidad

ambiental en bodegas y se han evaluado los mohos que se encuentran en el aire,
por ejemplo en Francia (Simeray et al., 2000) y en el norte de Italia y Suiza (Picco
y Rodolfi, 2004). Más recientemente, Mandl et al. (2008) analizaron el contenido
en mohos en el aire de distintas bodegas austríacas y nuestro equipo lo ha hecho en
bodegas de la D.O.Ca. Rioja (Ocón et al., 2011, 2013c). Los mismos autores (Ocón
et al., 2013a, b) han estudiado las levaduras presentes en el aire de diferentes zonas
de varias bodegas y han encontrado que el nivel de levaduras en el aire era bajo y
que la mayoría de las levaduras eran No-Saccharomyces. S. cerevisiae sólo se
detectó en la nave de vinificación en la época de vendimia. El aire de la zona de
embotellado fue el que mayor población de levaduras tenía, tanto desde un punto
de vista cuantitativo como cualitativo, lo que la convierte en la zona de mayor
riesgo de contaminación del vino a través de este medio.

En la literatura consultada no se ha encontrado información sobre la

presencia de bacterias lácticas en el aire de las bodegas y muy poco sobre la
presencia de otros microorganismos en este medio. Sin embargo, en otras industrias
alimentarias se ha encontrado relación entre las bacterias lácticas presentes en el
aire de la zona de procesado y las responsables de la contaminación del producto
terminado (Korkeala y Björkroth, 1997; Vihavainen et al., 2007).

El análisis del aire es frecuente en algunas industrias alimentarias

(Salustiano et al., 2003), principalmente en las zonas de envasado aséptico de los
alimentos, donde la presencia de microorganismos en el ambiente supone una vía
de contaminación y alteración de los mismos. La necesidad de controlar la calidad

31
Introducción

microbiológica del aire, para asegurar que los productos alimenticios permanezcan
seguros y sanos en todas las etapas de su proceso, está bien establecida en fábricas
de alimentos. Concentraciones de microorganismos de 100 a 10.000 UFC/m 3 en el
aire son bastante normales (Curiel et al., 2000).

A pesar de ello, no existen trabajos realizados en bodegas donde se haya

determinado la presencia en el aire de microorganismos directamente responsables
de la fermentación, así como su relación con los procesos enológicos que tienen
lugar en los depósitos a lo largo del proceso de elaboración.

32
Capítulo 2
Objetivos
 Objetivos

El principal objetivo de este trabajo fue estudiar el AIRE como elemento

diseminador de los microorganismos de interés enológico, principalmente
levaduras y bacterias lácticas responsables de las fermentaciones alcohólica y
maloláctica, en la bodega y en la viña. En este objetivo general se pueden
considerar los siguientes objetivos parciales:

 Analizar la presencia de levaduras en las instalaciones de la

bodega antes de la entrada de uva.

 Estudiar la presencia y evolución de varios tipos de

microorganismos enológicos (levaduras, bacterias y mohos) en el
ambiente de una bodega durante el período de vinificación.

 Estudiar y comparar los diferentes clones de S. cerevisiae aislados

en el ambiente de la bodega y en las instalaciones con los que
llevan a cabo las fermentaciones.

 Estudiar y comparar los diferentes clones de bacterias lácticas de

la especie O. oeni detectados en el aire de la bodega con los
presentes en los depósitos en fermentación.

 Estudiar y comparar las levaduras y bacterias lácticas presentes

en el aire del viñedo con las presentes en las uvas durante el
período de maduración.

35
Capítulo 3
Material y Métodos
 Material y Métodos

3.1.- Ensayos y tomas de muestra

Se realizaron un total de tres ensayos, dos en bodega y un tercero en viñedo.

Primer ensayo. Se llevó a cabo en la Bodega Santos Montiel de Tudelilla (La

Rioja) durante los meses de septiembre a diciembre de 2006. En esta bodega sólo se
elaboran vinos tintos y todas las fermentaciones, tanto alcohólica como maloláctica,
transcurren de forma espontánea, sin inoculación con microorganismos
seleccionados.

En este primer trabajo se llevaron a cabo muestreos del aire de la bodega, de

distintas zonas de las instalaciones y del vino de varios depósitos en los que se estaba
desarrollando la FA. En las muestras de aire se cuantificó la población de levaduras,
de bacterias lácticas y de mohos. En los muestreos de las instalaciones y de los
depósitos en fermentación sólo se cuantificaron las levaduras.

Todos los muestreos correspondientes a levaduras (aire, instalaciones y

depósitos) se tipificaron y se compararon los clones de S. cerevisiae aislados.

Segundo ensayo. Se realizó en la Bodega Cooperativa Vinícola Riojana de

Alcanadre (La Rioja), durante los meses de septiembre de 2007 a julio de 2008. Al
igual que en la bodega anterior, las fermentaciones transcurren de manera espontánea,
no existiendo inoculación exógena de ningún tipo de microorganismos. En este caso
se tomaron muestras del aire de la bodega y del vino de varios depósitos mientras se
estaba desarrollando la FA y la FML, de manera que los muestreos se iniciaron 15
días antes de la entrada de uva en la bodega y concluyeron un mes después de haber
finalizado la última FML.

39
Material y Métodos

En todas las muestras se estudiaron y tipificaron las bacterias lácticas (BL) presentes
y se compararon los clones de O. oeni presentes en ambos medios.

Tercer ensayo. El lugar del ensayo fue una parcela de Tempranillo en la

finca del CIDA, Agoncillo (La Rioja). Se muestreó el aire del viñedo y se tomaron
diferentes racimos de la parcela durante el periodo de maduración y vendimia en las
campañas de 2008 y 2009. Se eligió una calle y en una de las filas se marcaron dos
cepas en las que se tomaron muestras de aire y racimos. La orientación de esta parcela
es este-oeste y el marco de plantación 2,6 x 1,3 m (2960 cepas/ha). Asimismo, se
tomaron datos sobre las condiciones ambientales, temperatura, radiación, viento,
precipitaciones… en cada muestreo.

En este caso, se identificaron las levaduras y las BL a nivel de género y

especie con el objetivo de analizar y comparar su presencia y evolución en las uvas y
en el aire del viñedo.

3.1.1.- Muestreos en el aire

Se analizó la presencia en el aire de tres tipos de microorganismos

enológicos: levaduras, bacterias lácticas y mohos.

Todos los muestreos se llevaron a cabo con el muestreador de aire airIDEAL

3P, de la casa comercial Biomèrieux (Fig. 1), que permite la toma de diferentes
volúmenes de aire de forma directa en placas Petri, para detectar la presencia de
microorganismos viables. El aire es aspirado a una velocidad de impacto inferior a 20
m/s por una turbina que atraviesa una rejilla estéril, la cual captura partículas de
tamaño de 3 µm. El volumen de aire aspirado impacta sobre una placa Petri de 100
mm de diámetro que contiene un medio de cultivo selectivo, específico para cada
microorganismo objeto de estudio. Se utilizaron placas con medio Cloranfenicol-

40
 Material y Métodos

Glucosa-Agar (CGA) para levaduras, placas con Agar-Czapek para mohos y placas
con MRS-Agar modificado para bacterias lácticas.

Figura 1.- Muestreador de aire airIDEA 3P utilizado en los ensayos.

Figuras 2. y 3.- Posición del muestreador en la tolva de recepción y en la nave de

elaboración.

41
Material y Métodos

Dependiendo del lugar en el que se realizó el muestreo, el equipo se colocó

de distintas formas: para la toma de muestras en la zona de recepción de la uva
(Ensayo 1), el equipo se suspendió en el centro de la tolva a una distancia
aproximada de 2 m (Fig. 2). Para muestrear la zona de elaboración en las bodegas
(Ensayos 1 y 2), el aerobiocolector se situó en el centro de la nave, sobre una
plataforma situada a 1 m de altura del suelo (posiciones A y B, Fig. 3).

En el último ensayo, el muestreador se colocó en una plataforma a 0,5 m del

suelo en la calle del viñedo próximo a las dos cepas en las que se tomaron muestras
de uva (Fig. 4, posiciones A y B).

Figura 4.- Posiciones del muestreador en la calle del viñedo.

42
 Material y Métodos

Los volúmenes de aire analizados variaron entre 20 y 1500 l dependiendo del

tipo de microorganismo objeto de estudio, del lugar y/o etapa de vinificación. En cada
muestreo y para cada microorganismo, en general, se tomaron por duplicado dos
volúmenes distintos de aire.

3.1.1.1.- Primer Ensayo

Los muestreos del aire en la bodega de Tudelilla comenzaron el 27 de

septiembre, cinco días antes de la entrada de la primera uva vendimiada, que tuvo
lugar el 2 de octubre y finalizaron el 19 de diciembre, un mes después de que
acabaran las fermentaciones malolácticas en todos los depósitos. Se eligieron dos
zonas de la bodega para muestrear el ambiente: la zona de recepción (T1) y la zona de
elaboración (T2). En este caso se tomaron en cada muestreo dos volúmenes diferentes
de aire por duplicado para cada microorganismo objeto de estudio: mohos, levaduras
y bacterias.

Se recogieron un total de cinco muestras en la zona de recepción (27 de

septiembre, 2, 9 y 16 de octubre y 8 de noviembre). En la zona de elaboración, el
número de muestreos fue de 13 (27 de septiembre; 2, 5, 9, 11, 16, 20, 24 y 31 de
octubre; 8, 14 y 28 de noviembre y 19 de diciembre). La mayor parte de los
muestreos tuvo lugar en octubre, mes en el que coincidieron la entrada de uva en la
bodega y el desarrollo de la FA. Durante el mes de noviembre se llevaron a cabo las
FML y la última toma de muestras se efectuó en diciembre, cuando ya no existía
actividad fermentativa en la bodega (Tabla 3).

43
Material y Métodos

Tabla 3.- Muestreos realizados en el aire en la zona de recepción (T1) y en la nave de

elaboración (T2) y condiciones de vinificación en la bodega de Tudelilla. Campaña 2006.

Nº muestreo Fecha Zona Condiciones de vinificación en bodega

T1
0 27/09 Bodega limpia, antes de entrada de uva
T2
T1
1 02/10
T2 Entrada de uva con depósitos en FA
2 05/10 T2
T1
3 09/10
T2
4 11/10 T2
T1 Entrada de uva, depósitos en FA y algunos con
5 16/10 FA acabada
T2
6 20/10 T2
7 24/10 T2
8 31/10 T2
T1
9 08/11
T2 Fin de FA e inicio y desarrollo de la FML
10 14/11 T2
11 28/11 T2
12 19/12 T2 Vinos terminados

3.1.1.2.- Segundo Ensayo

En la Cooperativa Vinícola de Alcanadre se realizaron 20 muestreos en el aire

de la nave de elaboración (Tabla 4). En este caso, se tomaron muestras por duplicado
solo con medios selectivos para bacterias lácticas.

44
 Material y Métodos

Tabla 4.- Muestreos realizados en el aire en la nave de elaboración y condiciones de

vinificación en la Cooperativa de Alcanadre.

Nº muestreo Fecha Condiciones de vinificación en bodega

0 18/09/07 Bodega limpia, antes de la entrada de uva en bodega

1 02/10/07 Entrada de uva en bodega

2 05/10/07 Entrada de uva en bodega e inicio de FA

3 11/10/07 Entrada de uva en bodega con depósitos en FA

4 17/10/07 Fermentación alcohólica

5 31/10/07 Fermentación alcohólica

6 14/11/07 FA acabada / No FML

7 22/11/07 FA acabada / No FML

8 26/11/07 FA acabada/ No FML

9 05/12/07 FML lenta en depósitos aislados

10 27/12/07 FML lenta en depósitos aislados

11 24/01/08 FML lenta en depósitos aislados

12 28/02/08 Sin actividad fermentativa

13 03/04/08 Sin actividad fermentativa

14 09/05/08 Sin actividad fermentativa

15 26/05/08 FML lenta en 4 depósitos de la bodega

16 30/05/08 FML lenta en 2 depósitos

17 05/06/08 FML lenta en 2 depósitos

Vaciado de depósito con FML acabada y FML lenta en 4
18 13/06/08
depósitos
19 05/07/08 Fin FML

El primer muestreo (18 de septiembre) se realizó en la bodega limpia antes de

la entrada de uva y los cinco siguientes (2, 5, 11, 17 y 31 de octubre) coincidieron con
la recepción de uva en la Cooperativa y con el desarrollo de las fermentaciones

45
Material y Métodos

alcohólicas. Los seis siguientes (14, 22 y 26 de noviembre, 5 y 27 de diciembre y 24

de enero) se llevaron a cabo cuando no había ni FA ni FML, o bien esta última se
desarrollaba de forma lenta e intermitente en depósitos aislados. Durante los meses de
febrero, marzo y abril no se detectó actividad fermentativa en la bodega (muestreos
12, 13 y 14). A partir del 26 de mayo, cuando comenzó a aumentar la temperatura, se
reinició la actividad maloláctica. Se realizaron 4 muestreos a partir de ese momento
(26 y 30 de mayo, 5 y 13 de junio). Por último, se muestreó el aire de la bodega el día
3 de julio, cuando había cesado toda la actividad fermentativa (Tabla 4).

3.1.1.3.- Tercer Ensayo

Las muestras se recogieron en dos puntos próximos a dos cepas del viñedo
(Apdo. 3.1.1), durante dos años consecutivos. Se realizaron cinco muestreos cada
año, coincidiendo con las cuatro semanas previas a la vendimia, y un último en el
momento de la misma. Se tomaron por duplicado muestras de aire junto a las cepas
marcadas con medios de cultivo selectivos, específicos para levaduras y bacterias
lácticas. Los trabajos se iniciaron a primera hora de la mañana, tomándose datos de
temperatura, radiación, viento y lluvia a lo largo de todo el proceso.

Los muestreos de aire en 2008 se realizaron los días 11, 19 y 25 de

septiembre y 2 y 10 de octubre. El segundo año (2009) las condiciones climatológicas
favorecieron la maduración de las uvas en la zona y el proceso se adelantó
aproximadamente 15 días. Así, las fechas de muestreo fueron 27 de agosto, 3, 10, 17
y 24 de septiembre. La última muestra analizada cada año correspondió al momento
de la vendimia (Tablas 5 y 6).

46
 Material y Métodos

Tabla 5.- Muestreos realizados en el aire del viñedo y condiciones climatológicas. Campaña
2008.
Semanas antes Condiciones meteorológicas medias
Fecha
de vendimia Tª Radiación Viento Lluvia
4 11/09 27ºC Soleado Ligero** No
3 19/09 23ºC Nublado No No
2 25/09 17ºC Nublado Ligero No
1 03/10 12ºC Nublado Si Ligera
0* 10/10 15ºC Soleado No No
* Momento de la vendimia. ** Ligero: débil y esporádico.

Tabla 6.- Muestreos realizados en el aire del viñedo y condiciones climatológicas. Campaña
2009.
Semanas antes Condiciones meteorológicas medias
Fecha
de vendimia Tª Radiación Viento Lluvia
4 27/08 33ºC Soleado Ligero ** No
3 03/09 31ºC Soleado Ligero No
2 10/09 27ºC Soleado Ligero No
1 17/09 20ºC Soleado No No
0* 24/09 22ºC Soleado No No
*Momento de la vendimia. **Ligero: débil y esporádico.

3.1.2.- Muestreos de instalaciones

Los muestreos de distintas zonas de las instalaciones de la bodega de

Tudelilla en la vendimia de 2006 se llevaron a cabo el día 27 de septiembre, cinco
días antes de la entrada de uva. En este momento, la bodega estaba limpia y preparada
para el inicio de la campaña.

La toma de muestras se realizó con un hisopo humedecido en medio TSB

(Tryptone Soy Broth) sobre una superficie de 9 cm2 en cada uno de los 10 puntos
elegidos como representativos de las instalaciones de la bodega (tolva de recepción,
despalilladora, estrujadora, bomba de pastas, pared del depósito, boca de salida del

47
Material y Métodos

depósito, prensa, bomba de trasiego, suelo y pared de la bodega). Los hisopos se

colocaron en tubos con 2 ml de TSB y se trasladaron al laboratorio para proceder
posteriormente a la siembra, recuento e identificación de las levaduras presentes.

3.1.3.- Muestreos de racimos

En el tercer ensayo, el estudio del aire en el viñedo se completó tomando

muestras de racimos para analizar los microorganismos presentes en la superficie de
las bayas. Cada vez que se realizó el muestreo del aire (Apdo. 3.1.1.3), se cortó un
racimo de cada una de las dos cepas con tijeras esterilizadas y se trasladó en una bolsa
estéril al laboratorio.

3.1.4.- Muestreos durante las Fermentaciones Alcohólica y Maloláctica

3.1.4.1.- Primer Ensayo

Se tomaron muestras en distintos momentos de la FA en tres de los ocho

depósitos de la bodega de Tudelilla. La elección de los depósitos se efectuó en
función del momento de entrada de la uva. Así, el primer depósito muestreado
(depósito A) se encubó con la primera uva que entró en la bodega (2 de octubre); el
segundo (depósito B) se encubó el 9 de octubre (hacia la mitad de la campaña),
mientras que en el tercero (depósito C) la uva procedía de la última vendimia, que se
llevó a cabo el 16 de octubre. Todas las fermentaciones se realizaron en depósitos de
acero inoxidable de 25000 litros de capacidad y a una temperatura controlada de
28ºC.

Cada depósito se muestreó en tres momentos diferentes: 24 h después del

encubado (IF), fermentación alcohólica tumultuosa (FT) y fin de fermentación
alcohólica (FF). La muestra se tomó después de remontar el depósito, en un recipiente

48
 Material y Métodos

estéril de 100 ml y se transportó al laboratorio en condiciones de refrigeración para su

procesamiento posterior.

Los días que se tomaron muestras de los depósitos en fermentación

coincidieron con muestreos en el aire de la zona de elaboración: muestreos 2, 3, 4, 5,
6 y 7 (Tabla 3).

3.1.4.2.- Segundo Ensayo

En la vendimia de 2007, una vez finalizadas las FA, se produjeron

temperaturas excesivamente bajas que primero retrasaron el inicio de las FML y que
posteriormente hicieron que se desarrollaran de manera lenta e intermitente durante el
invierno. Al aumentar la temperatura en el mes de mayo, se reactivó y generalizó la
actividad fermentativa, dándose por concluida en el mes de junio. Estas
circunstancias, unidas a la dinámica y tamaño de la nave en la que se realizaron los
muestreos (44 depósitos de 44000 litros cada uno) no hicieron posible muestrear y
seguir la evolución de la fermentación de un mismo depósito. Las muestras se fueron
tomando en diferentes depósitos y momentos, coincidiendo con tomas de muestras
del aire de la bodega en la zona más próxima a éstos: muestreos del 1 al 18 (Tabla 4).
Únicamente los muestreos 15 y 18 se correspondieron con el mismo depósito.

Las muestras tomadas se transportaron al laboratorio en las mismas

condiciones que en el Ensayo 1, donde se procesaron posteriormente para la
cuantificación e identificación de BL.

49
Material y Métodos

3.2.-Procesamiento de las muestras

3.2.1.- Muestras de aire

Las placas obtenidas de los muestreos de aire se trasladaron al laboratorio y

se incubaron en estufa, a la temperatura y tiempo indicados para el crecimiento de
cada microorganismo: 25ºC durante 48 h para levaduras, 20ºC durante 7 días para
mohos y 30ºC durante 10 días en anaerobiosis para BL. Se agregaron cristales de
difenilo (aproximadamente 100 mg por placa) (Panreac Química, S.A., Barcelona,
España) a las placas de levaduras y de bacterias, para impedir el desarrollo de mohos.

Después del período de incubación respectivo, se procedió al recuento de

microorganismos. De los dos volúmenes de muestras de aire tomadas en un momento
dado, se eligió para el recuento aquella placa que contenía menos de 100 UFC, según
las instrucciones dadas por el fabricante del muestreador. El resultado de estos
recuentos se expresó como promedio del número obtenido en las dos repeticiones
analizadas. Posteriormente, este valor se convirtió en el número más probable de
microorganismos recogidos por la placa (NMP). Para realizar la conversión del
número de UFC en el número más probable, se utilizó una tabla estadística de
conversión, incluida en el manual de instrucciones del equipo, que se basa en la Ley
de Feller:

NMP = N (1/N +1/N−1+1/N−2+ ........ +1/N−UFC+1)

Donde:

NMP = la cantidad total más probable de microorganismos que hayan

atravesado los orificios de la placa.

50
 Material y Métodos

N = cantidad de orificios de la rejilla

UFC = unidades formadoras de colonias, valor leído en el laboratorio.

Con el fin de determinar el número más probable de microorganismos

recogidos por metro cúbico de aire (NMP/m 3), el número más probable de
microorganismos recogidos por placa se multiplicó por 1000 y se dividió por el
volumen de aire del muestreo en litros.

3.2.2.- Muestras de instalaciones

Los tubos con medio TSB que contenían los hisopos procedentes de la toma
de muestras de las instalaciones se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente.
Posteriormente, se sembraron en superficie 100 µl de este medio en placas Petri con
CGA y se incubaron a 25ºC durante 48 h. Al cabo de este tiempo se realizó el
recuento de las colonias de levaduras presentes en cada uno de los 10 puntos elegidos
donde hubo crecimiento, expresándose el resultado como UFC/cm 2.

3.2.3.- Muestras de racimos

Los racimos se pesaron y se introdujeron en vasos de precipitado con 400 ml

de solución salina estéril al 0.9% (volumen adecuado para cubrir el racimo).
Finalmente, los vasos se colocaron en un agitador orbital a 150 rpm durante una hora.
Transcurrido ese tiempo, el racimo se secó sobre papel de filtro y se desgranó para
pesar el raspón.

A partir de la solución salina en la que se habían introducido los racimos, se

sembraron por duplicado 100 µl de la misma en placas con el medio adecuado para
cada tipo de microorganismo: CGA para levaduras y MRS modificado, con
pimaricina para BL. Las primeras se incubaron a 25ºC durante 48 h y las segundas a

51
Material y Métodos

30ºC durante 10 días en anaerobiosis, procediéndose al recuento de colonias de

levaduras y BL al finalizar el periodo de incubación. Los resultados se expresaron
como UFC/g.

3.2.4.- Muestras de depósitos en fermentación

Las muestras de mosto/vino recogidas en botes estériles durante las

fermentaciones alcohólicas espontáneas para el aislamiento de levaduras se
procesaron siguiendo el método de diluciones decimales seriadas y siembra en placa
Petri con medio CGA. Las placas se incubaron a 25ºC durante 48 h, al cabo de las
cuales se contaron las colonias crecidas en las placas que contenían entre 30 y 300
colonias procedentes de los tres depósitos estudiados en los tres momentos (IF, FT y
FF), expresándose el resultado como UFC/ml.

Las muestras recogidas de mosto/vino para el aislamiento de BL se

procesaron del mismo modo que las levaduras pero se sembraron en placas Petri con
medio MRS-modificado al que se añadió pimaricina (50 mg/l) para impedir el
crecimiento de levaduras. Las placas se incubaron en anaerobiosis (GasPak. Oxoid
Ltd., Basingstoke, England) a 30ºC durante 10 días, para evitar el posible crecimiento
de bacterias acéticas y favorecer el crecimiento de las BL. Como en el caso anterior y
tras su periodo de incubación, en aquellas placas cuyo crecimiento estuvo
comprendido entre 30 y 300 colonias se efectuó el recuento de bacterias totales
viables, expresándose el resultado como UFC/ml.

52
 Material y Métodos

3.3.- Aislamiento y conservación de colonias de

microorganismos

3.3.1.- Levaduras

De todas las placas de CGA procedentes del análisis de aire se aislaron al

azar, siempre que fue posible, un mínimo de 10-20 colonias de cada muestreo. En las
placas procedentes del estudio de instalaciones de la bodega (Tudelilla) se procedió
de igual forma, aislándose 10 colonias de cada placa en los puntos donde hubo
crecimiento. Del mismo modo, en las que procedían del análisis de racimos, se
aislaron aleatoriamente un máximo de 20 colonias de cada placa y muestreo.
Finalmente, en las placas procedentes de la fermentación de la bodega de Tudelilla se
seleccionaron diez colonias al azar (10 del comienzo de la fermentación, 10 de la
fermentación tumultuosa y 10 del final de la fermentación), resultando un total de 30
colonias por cada depósito.

Cada colonia fue reaislada por agotamiento de estría en placa Petri con medio
YPD (Yeast Peptone Dextrose) para asegurar la presencia de un solo microorganismo
(cultivo puro). Una colonia de cada placa se creció en YPD durante 24-48 h a 28ºC
para obtener cultivo suficiente para su posterior conservación.

Todas las colonias de levaduras aisladas, independientemente de su origen, se

sembraron en tubos de Agar-Malta y se guardaron en cámara a 4ºC hasta el momento
de su análisis. Asimismo, todos los cultivos se conservaron a -20ºC tras resuspender
el cultivo fresco en tubos eppendorf con glicerol al 20%.

53
Material y Métodos

3.3.2.- Bacterias lácticas

De las placas de MRS modificado con pimaricina procedentes del aire y

fermentaciones (Ensayo 2) y de aire y racimos (Ensayo 3) se aislaron, siempre que
fue posible, 20 colonias al azar de cada placa, que se crecieron en MRS modificado
durante 48 h, a 30ºC en anaerobiosis, para proceder posteriormente a su conservación
en viales con leche estéril al 20% (Skim-milk, Difco) a -20ºC.

3.3.3.- Mohos

Una vez realizado el recuento de las colonias crecidas en Agar Czapek se

aislaron 10 colonias al azar de cada placa, que fueron conservadas en el mismo medio
e identificadas en pasos ulteriores.

3.4.- Identificación de las colonias aisladas

3.4.1.- Identificación de levaduras

Todas las colonias de levaduras aisladas en aire, depósitos de fermentación e

instalaciones de la bodega procedentes del primer ensayo, se sembraron
posteriormente sobre placas Petri que contenían medio de Agar-lisina (Scharlau
Microbiology, Barcelona, España). El crecimiento en estas placas permitió distinguir
entre levaduras de los géneros Saccharomyces y No-Saccharomyces, puesto que
solamente éstas últimas son capaces de crecer en dicho medio (Bely et al., 2008,
Lopandic et al., 2008). Las colonias con crecimiento positivo en este medio fueron
multiplicadas y conservadas sobre medio LM.

54
 Material y Métodos

3.4.1.1.- Identificación de las especies de levaduras mediante PCR-RFLP

Las colonias de levaduras que dieron un resultado positivo en el test de Agar-

Lisina (Ensayo 1) y todas las aisladas en el Ensayo 3 se identificaron a nivel de
género y especie empleando la técnica PCR-RFLP de la región ITS del ADN
ribosomal. Esta técnica es una de las más comúnmente utilizadas para la
identificación de especies de levaduras en Enología, pues es un método rápido, eficaz
y reproducible (Guillamón et al., 1998; Pulvirenti y Giudici, 2003; Fernández-Espinar
et al., 2005). La zona amplificada del ADN codifica la región conocida como ITS
(Internal Transcribed Spacer) ó 5.8S-ITS del ARNr, según el método propuesto por
Esteve-Zarzoso et al., 1999. Los primers utilizados para amplificar esta región fueron
los descritos por White et al. (1990).

El ADNr es una formación en tándem de numerosas copias en el genoma

haploide de todos los hongos. Comprende, entre otras, las regiones codificantes del
gen de la subunidad pequeña (SSU) ARNr (18S), el gen 5.8S y el gen de la subunidad
grande (LSU) ARNr (26S), y otras regiones interesantes para la identificación de
especies fúngicas como son los espaciadores internos (ITS) y los externos (ETS),
regiones que se transcriben pero que no son procesadas. A su vez, las unidades
codificantes están separadas por los espaciadores intergénicos (IGS o NTS). Las
regiones ITS e IGS son las que presentan mayor variabilidad en la secuencia,
mientras que las regiones que codifican (18S, 5.8S y 26S) están mucho más
conservadas. (Soriano del Castillo, 2007).

La región que incluye el gen 5.8S y los dos ITS se conoce como región ITS y
se caracteriza por poseer una zona altamente conservada (5.8S) y otra zona variable
(los ITS) (Fig. 5).

55
Material y Métodos

Los cebadores empleados para la reacción de PCR en la región ITS son los
mismos para más de 500 especies de levaduras, por lo que las diferencias se
establecen por el diferente tamaño del amplificado (Pulvirenti et al., 2003).

NTS NTS
ETS ITS1 ITS2
ETS

18S SSU 26S

26S LSU
LSU
1700 pb 5.8S 3300 pb

Figura 5.- Esquema de la organización de los genes ribosomales.

A) Extracción de ADN genómico amplificable por PCR

La extracción de ADN se realizó a partir de un cultivo fresco empleando el

método propuesto por López (2004). La cantidad de ADN necesaria para llevar a
cabo una reacción de PCR es mínima, por lo que para dicha técnica se utilizó un
protocolo de extracción rápido, sin inhibidores del enzima Taq polimerasa. A partir
de un cultivo puro en placa de 48 h se recogió un asa de siembra y se resuspendió en
250 µl de tampón de lisis (Tris 50 mM, pH 8; β-mercaptoetanol 10 mM, Apdo. 3.6.)
en un tubo eppendorf. Se agitó con vortex y se dejó reposar durante 10 min a
temperatura ambiente. Se sometió a 100ºC durante 10 min en un baño de agua
hirviendo. Se agitó en caliente con vortex y se centrifugó a 13000 rpm durante 3 min.
El sobrenadante, que contiene el ADN genómico se recogió en un eppendorf estéril y
se utilizaron 10 µl para cada reacción de amplificación por PCR.

56
 Material y Métodos

B) Reacción en cadena de la polimerasa

La mezcla de reacción de PCR se preparó en un volumen final de 50 µl,

utilizando los componentes que se indican en la Tabla 7 (Esteve-Zarzoso et al., 1999).

Tabla 7.-. Componentes de la reacción de PCR, volumen y concentración.

Volumen Concentración final en la
Co mponent es muestra reacción

Tampón de reacción NH4+ (Bioline) 5 µl 1x

MgCl2 50 mM (Bioline) 3 µl 3 mM

4 dNTP mix 50 mM (Bioline) 1 µl 12.5 mM

Cebador directo 25 pmol/µl (TIB Molbiol) 1 µl 0.5 pmol/ µl

Cebador reverso 25 pmol/µl (TIB Molbiol) 1 µl 0.5 pmol/ µl

BiotaqTM DNA polimerasa (Bioline) 0.3 µl 1.5 U

H2O destilada estéril 28.7 µl -

ADN 10 µl -

La reacción de amplificación se realizó en un termociclador GeneAmp®

PCRSystem 2700 (Applied Biosystems). En todos los casos se incluyó una muestra
control negativo (con cebadores y sin ADN) para asegurar el buen funcionamiento de
la técnica. Las secuencias de los cebadores, las condiciones de amplificación y los
tamaños de los fragmentos de ADN amplificados se describen en la Tabla 8.

57
Material y Métodos

Tabla 8.- Cebadores y condiciones de amplificación de la PCR de levaduras (Esteve-Zarzoso

et al., 1999).

Fragmento amplificado
Cebadores (secuencia 5´ → 3´) Condiciones de amplificación
(pb)

95ºC 5 min 1 ciclo

ITS1

TCCGTAGGTGAACCTGCGG 94ºC 1 min

Variable según género 55.5ºC 2 min 35 ciclos
ITS4 de levadura
72ºC 2 min
TCCTCCGCTTATTGATATGC

72ºC 10 min 1 ciclo

C) Restricción de los productos de PCR

El producto de PCR obtenido de cada muestra en el apartado anterior fue

sometido directamente a restricción con tres enzimas diferentes: Hinf I, HaeIII y CfoI,
según se indica en la Tabla 9.

Tabla 9.- Componentes del análisis de restricción.

Cantidad por reacción
Componentes
Volumen final 10 µl

Enzima de restricción HinfI, HaeIII o Cfo 0.5 µl

SuRE/Cut buffer H, M ó L 1 µl

Agua destilada estéril 3.5 µl

Producto de PCR 5 µl

Este volumen se incubó en baño termostático de agua a 37ºC durante 90 min

para que se produjera la reacción enzimática.

58
 Material y Métodos

D) Electroforesis en gel de agarosa

Para la visualización de los productos de amplificación de PCR y de los

fragmentos de restricción de cada uno de ellos, se utilizó la técnica de electroforesis
horizontal en gel de agarosa.

En el caso de los productos de PCR se utilizó un gel al 1.5% (p/v) de agarosa

en tampón TBE 0.5x, y en el de los fragmentos de restricción un gel al 3% de agarosa
en tampón TBE 0.5x. Las dimensiones de los geles fueron de 15x15 cm2 y la
electroforesis se llevó a cabo en la unidad BIO-RAD SUB-CELL GT a 150 V durante
1 h 45 min para el producto de PCR y 2 h 45 min para los fragmentos de la digestión.

Finalizadas las electroforesis los geles se tiñeron en una solución de bromuro

de etidio de 0.5 µg/ml y fueron visualizados, analizados y fotografiados en el equipo
Image Store 5000 (UVP) (BIO-RAD) con el programa Quantity One.

El marcador de peso molecular utilizado en estos geles fue Hyperladder IV de

Bioline de 100-1000 pb, con el que se estimaron, por comparación, las bandas
obtenidas

E) Identificación de especies de levaduras

El peso molecular del fragmento de ADNr amplificado se estimó por

comparación con el marcador de peso molecular HyperLadder IV de Bioline de 100-
1000 pb y se comparó con los obtenidos en nuestro laboratorio y con los perfiles
descritos en bibliografía (Guillamón et al., 1998; Granchi et al., 1999) (Fig. 6).

59
Material y Métodos

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 18 19 20

1000 pb

100 pb

Figura 6.- Ejemplo de electroforesis en gel de agarosa de los amplificados de PCR de varias
especies. Carriles 1 y 20 marcador de 100 pb (Hyperlader IV).Carriles 2, 3, 4, 7 y 8 producto
de PCR de 585 pb. Carriles 5, 6, 9 y 10 producto de PCR de 800 pb. Carriles 11, 12, 14 y 15
producto de PCR de 400 pb. Carril 18 producto de PCR de 650 pb. Carril 19 control
negativo.

Los productos de amplificación de distinto tamaño corresponden a especies

diferentes. Sin embargo cuando los amplificados son del mismo tamaño no siempre
corresponden a la misma especie, por lo que es necesario recurrir a los perfiles de
restricción de estos amplificados con diferentes enzimas. Igualmente, los pesos
moleculares de los fragmentos obtenidos con cada enzima se determinaron por
comparación con el marcador de peso molecular de 100 pb y se confrontaron con los
aportados en bibliografía y con los identificados a través del portal www.yeast-id.org.
En la Fig. 7 se muestran tres perfiles de restricción correspondientes a las especies A.
pullulans, K. apiculata y S. cerevisiae.

60
 Material y Métodos

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

1000 pb

100 pb

Figura 7-. Electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos de restricción de varias

especies. Carriles 1 y 20 corresponden al marcador de 100 pb. Los carriles 2, 3 y 4
corresponden a los cortes con los enzimas HinfI, HaeIII y CfoI que representan a la
especie A. pullulans. Los carriles 5, 6 y 7; 8, 9 y 10; 11, 12 y 13 y 17, 18 y 19 son cortes
realizados con los mismos enzimas y corresponden a la especie K. apiculata. Los carriles
14, 15 y 16 son los obtenidos con los tres enzimas y representan el perfil de S. cerevisiae.

3.4.1.2.- Identificación de especies mediante secuenciación del ADN

Las colonias cuyos perfiles no fue posible identificar por el método anterior,
se identificaron mediante secuenciación. Para ello, se amplificó mediante PCR el
dominio D1/D2 con los cebadores y condiciones descritos por Kurtzman et al. (1998)
y que se detallan en la Tabla 10.

61
Material y Métodos

Tabla 10.- Cebadores y condiciones de la PCR universal de levaduras (Kurtzman et al., 1998).

Fragmento Condiciones de
Cebadores (secuencia 5´ → 3´)
amplificado (pb) amplificación

94ºC 3 min 1 ciclo

NL1

CGATTAGATACCCTGGTAGTCC
580 94ºC 1 min
NL4 52ºC 45 s 36 ciclos
72ºC 2 min
TCGTTGCGGGACTTAACCCAAC

72ºC 4 min 1 ciclo

Esta técnica se basa en el análisis de una pequeña parte de la subunidad 26S

del ADNr, el dominio D1/D2, un fragmento constituido por 600 pb (Fig. 8). La región
D1/D2 puede considerarse como la “huella digital” para un gran número de especies
de Ascomicetos. La mayoría pueden ser identificados en base a las diferencias
existentes en este dominio (Kurtzman et al., 1998).

D1/D2 D1/D2

26S 5S 18S 5.8S 26S

Figura 8.- Esquema del dominio D1/D2.

Los productos de PCR se purificaron y se secuenciaron por Macrogen Inc.

facilities (Seoul, South Korea), para determinar el género y especie de levadura. Las
secuencias resultantes se enfrentaron a la base de datos del NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.org) para determinar la especie de levadura a la
que pertenecía cada colonia aislada.

62
 Material y Métodos

3.4.1.3.- Caracterización clonal de Saccharomyces cerevisiae mediante

análisis de restricción del ADNmt

Las cepas del género Saccharomyces, es decir las que produjeron un resultado
negativo en el test de Agar-Lisina, se identificaron a nivel de especie y clon mediante
técnicas de biología molecular. Se utilizó el análisis de restricción del ADN
mitocondrial (ADNmt) que permite la identificación de clones de Saccharomyces
cerevisiae, mediante determinación de su perfil genético.

El ADNmt de Saccharomyces cerevisiae es una pequeña molécula de 60-80

kb que posee un marcado polimorfismo, el cual se pone de manifiesto al analizar los
perfiles de restricción. El análisis de la variabilidad que revela esta molécula es uno
de los más aplicados en la caracterización de cepas vínicas de S. cerevisiae (revisión
bibliográfica en Fernández-Espinar et al., 2005).

Se utilizó la técnica rápida desarrollada por Querol (1992) basada en el hecho

de que el ADNmt de las levaduras es una molécula con un 75% de adenina (A) y
timina (T), que también posee unas 200 regiones ricas en citosina (C) y guanina (G).
Por tanto, al realizar una digestión del ADN total de la levadura con enzimas de
restricción del tipo G1C1A1T1, éstos no reconocen ni las secuencias ricas en GC ni en
AT. Dado el bajo número de puntos de corte del ADNmt y el elevado número de
puntos de restricción del ADN nuclear, el ADNmt se rompe en pocos fragmentos de
gran tamaño, que se visualizan claramente como bandas bien definidas superpuestas a
la sombra de degradación, formada por los pequeños y numerosos fragmentos del
ADN nuclear.

A) Preparación de la muestra

Cada colonia aislada se creció en 5 ml de medio YPD a 28ºC durante toda la

noche y en agitación para partir de un cultivo joven.

63
Material y Métodos

B) Extracción del ADN

El cultivo se recogió por centrifugaciones sucesivas en tubos eppendorf, se

lavó con agua estéril y se resuspendió en 0.5 ml de la solución de sorbitol (Solución
1). Se añadieron 40 µl de una solución de Zymoliasa, para romper las paredes
celulares, dejándolo incubar a 37ºC durante 60 min. Los protoplastos obtenidos se
recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron en una solución de Tris-HCl 1
M/EDTA 0.5 M (Solución 2), se añadieron 50 µl de SDS 10% y se dejaron en reposo
durante 30 min a 65ºC.

Posteriormente, se añadieron 200 µl de acetato potásico 5 M y se colocaron

los tubos en un baño de hielo durante 30 min para precipitar las proteínas, que se
recogieron mediante centrifugación. El sobrenadante se vertió en un tubo eppendorf y
se volvió a repetir la operación dejándolo en reposo en baño de hielo otros 15 min. La
precipitación del ADN se realizó añadiendo 700 µl de isopropanol al sobrenadante y
dejándolo en reposo a temperatura ambiente durante 10 min. El sedimento de ADN se
lavó con 500 µl de etanol al 70%, se centrifugó y se secó a vacío. Finalmente, el
ADN se resuspendió en 30 µl de tampón TE (Reactivos en Apdo. 3.6).

C) Análisis de restricción del ADNmt

10 µl del ADN obtenido en el apartado anterior se digirieron con el enzima de

restricción AluI. Se empleó este enzima porque en el laboratorio se ha comprobado
que, en nuestro caso, es la que mayor poder de discriminación proporciona
(Gutiérrez, 1994). Cuando fue necesario confirmar la identificación también se
emplearon otros enzimas como RsaI o Hinf I. La digestión se realizó en baño
termostático a 37ºC durante 14-16 h.

64
 Material y Métodos

D) Separación de los fragmentos de ADNmt

Los fragmentos de restricción se separaron mediante electroforesis horizontal

(Biorad ADN sub cell) en geles de agarosa al 1%, en tampón TBE (Tris-borato 45
mM, EDTA 0.5 M, pH 8). Para analizar los fragmentos, los geles se sumergieron en
una solución de bromuro de etidio (5 µg/ml), donde se mantuvieron durante 15 min. y
se visualizaron, analizaron y fotografiaron en el equipo Image Store 5000 (UVP)
(BIO-RAD) con el programa Quantity One.

El marcador de peso molecular utilizado en todos los geles fue el ADN del
fago λ, digerido λcon Hind λIII.

E) Comparación de clones de Saccharomyces cerevisiae

El análisis del ADNmt de las colonias de Saccharomyces cerevisiae permitió

obtener el patrón de restricción de cada una de ellas. Asumiendo que cada patrón es
representativo de una cepa (Guillamón, 1996), puede establecerse que patrones
iguales proporcionados por diferentes colonias, corresponderán a levaduras iguales
pertenecientes al mismo clon. La digestión del ADNmt de S. cerevisiae, obtenido con
el enzima AluI, dio lugar a un patrón de restricción formado por 5 ó 6 bandas. Todas
ellas tenían un tamaño comprendido entre unas 4200 y 20000 pb. El fragmento de
mayor peso molecular es característico de la especie, mientras que en el resto es
donde se encontró la variabilidad intraespecífica, que permitió la identificación
clonal. La variabilidad mostrada por los patrones de restricción en los fragmentos
inferiores a 2500 pb, anteriores a los barridos proporcionados por la digestión del
ADN nuclear, también se utilizó en la identificación y comparación clonal, siempre y
cuando lo permitió su resolución.

De este modo, se pudieron comparar los patrones de restricción obtenidos de

las cepas aisladas en el aire, las aisladas en las instalaciones y las cepas que llevaron a

65
Material y Métodos

cabo la fermentación en los depósitos estudiados del Ensayo 1. Algunos de estos

clones se muestran en la Fig. 9.

λ λ Clones S. cerevisiae λ

Figura 9.- Diferentes clones de S. cerevisiae aislados en instalaciones, depósitos en

fermentación y aire (Ensayo 1).

3.4.2.- Identificación de bacterias lácticas

3.4.2.1.- Identificación fenotípica de bacterias lácticas

Todas las colonias de bacterias aisladas en los distintos muestreos, tanto en el

aire como en los depósitos en fermentación y en los racimos, se caracterizaron,
inicialmente por métodos de biología clásica:

 Tinción Gram.

Es una de las tinciones diferenciales de más utilización en el laboratorio de

microbiología. Las bacterias, en función de determinadas características de su pared
celular, tienen una diferente capacidad de ser teñidas y decoloradas por diferentes

66
 Material y Métodos

compuestos. Se partió del frotis del microorganismo preparado y fijado.

Posteriormente se realizó la tinción con los siguientes pasos:

1. Se cubrió el frotis con cristal violeta y se mantuvo durante 1 min.

2. Se lavó con agua corriente.

3. Se cubrió con lugol y se mantuvo durante 30 s.

4. Se lavó con agua.

5. Se realizó la decoloración con una mezcla de alcohol-acetona (1/1) durante

unos segundos, hasta que no se liberó más colorante (etapa crítica).

6. Se lavó con agua.

7. Se cubrió con safranina (colorante de contraste) durante 1 min.

8. Se lavó con agua.

9. Se dejó secar al aire y se observó al microscopio con el objetivo 100x con

aceite de inmersión.

Las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta, no se decoloran con

alcohol-acetona y aparecen de color violeta oscuro. Las bacterias Gram negativas
pierden el cristal violeta y por el contraste con la safranina aparecen de color rosa.

Las bacterias lácticas pertenecen al grupo de las Gram positivas y, por lo

tanto, aparecen teñidas de violeta oscuro, mientras que las bacterias acéticas se tiñen
de color rosa.

67
Material y Métodos

 Estudio morfológico

Simultáneamente a esta tinción, se realizó un estudio morfológico mediante

observación microscópica siguiendo las recomendaciones indicadas en el Manual
Bergey (Holt et al., 1994).

Este primer estudio permitió la identificación de las bacterias lácticas a nivel

de género. Las bacterias lácticas del vino pertenecen a cuatro géneros: Lactobacillus,
Pediococcus, Leuconostoc y Oenococcus, representados cada uno de ellos por una o
varias especies, siendo Oenococcus oeni la más interesante desde el punto de vista
enológico. Al microscopio aparece con forma de coco, un poco ovoide, y formando
largas cadenas. Pediococcus es perfectamente redondeada, de mayor tamaño y se
agrupa en tetradas (Fig. 10). Los Lactobacillus tienen forma alargada, como pequeños
“baston.

Oenococcus

Pediococcus

Figura 10.- Oenococcus y Pediococcus vistos al microscopio.

68
 Material y Métodos

3.4.2.2.- Identificación de las bacterias lácticas mediante PCR

Todas las colonias de bacterias aisladas en medio MRS-modificado con

pimaricina se identificaron mediante PCR.

Para la caracterización de las colonias bacterianas como pertenecientes al

grupo de las bacterias lácticas (Gram+), además del estudio fenotípico, se utilizó el
método descrito por (Van de Klundert et al., 1993). Este método se basa en el estudio
del ARNr 16S, que es un polirribonucleótido codificado por el gen rrs o ADN
ribosómico ADNr 16S (ADN 16S). Estos ADNr constituyen una buena herramienta
para el estudio y secuenciación de especies bacterianas, ya que su secuencia se ha
mantenido muy conservada durante la evolución, debido al papel estructural y fijo
que desempeñan en el ribosoma. La secuencia del gen ADNr 16S presenta de forma
aproximada 1500 pb, y se compone de 9 zonas variables V1-V9 y zonas conservadas
(Fig. 11).

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 pb

V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9

Figura 11.- Esquema del gen ADNr 16S.

Los cebadores universales elegidos son complementarios a las zonas

conservadas del inicio del gen, en la zona de 540 pb y al final del gen. La extracción
del ADN y la reacción de PCR son las mismas que las realizadas en el Apdo. 3.4.1.1
A y B. Las condiciones de esta PCR y los cebadores empleados son los detallados en
la Tabla 11.

69
Material y Métodos

Tabla 11.- Cebadores y condiciones de amplificación de la PCR universal de bacterias lácticas

(Van de Klundert et al., 1993).
Fragmento
Cebadores (secuencia 5´ → 3´) amplificado Condiciones de amplificación
(pb)
94ºC 3 min 1 ciclo
rrs1

CGATTAGATACCCTGGTAGTCC 94ºC 30 s
320
60ºC 45 s 32 ciclos
rrs2
72ºC 2 min
TCGTTGCGGGACTTAACCCAAC

72ºC 4 min 1 ciclo

Esta primera PCR permitió confirmar las bacterias aisladas como

pertenecientes al grupo de las bacterias lácticas (Fig. 12).

320 pb

320 pb

Figura 12.- Electroforesis en gel de agarosa de los amplificados de PCR universal de BL.

70
 Material y Métodos

Dado que, desde el punto de vista enológico, el género más interesante es

Oenococcus oeni, se realizó su estudio por PCR especie-específica mediante el
método descrito por Zapparoli et al. (1998), con los cebadores y condiciones de
PCR que se detallan en la Tabla 12.

Tabla 12.- Cebadores de PCR empleados para la identificación de la especie Oenococcus oeni
y condiciones de amplificación (Zapparoli et al., 1998).
Fragmento
Cebadores (secuencia 5´ → 3´) amplificado Condiciones de amplificación
(pb)
94ºC 2 min 1 ciclo
Lo-1

TAATGTGGTTCTTGAGGAGAAAAT 94ºC 25 s
1023
64ºC 2 min 30 ciclos
Lo-2
72ºC 2 min
ATCATCGTCAAACAAGAGGCCTT

72ºC 8 min 1 ciclo

En todos los casos se incluyó una muestra control positivo y una muestra
control negativo (con cebadores y sin ADN) para asegurar el buen funcionamiento de
la técnica.

Todos los productos de PCR fueron visualizados por electroforesis en geles

de agarosa tal y como se describe en el Apdo. 3.4.1.1 D, con la salvedad de que el gel
se preparó al 1% y la electroforesis se llevó a cabo a 100 V durante 1 h y 30 min.

3.4.2.3.- Identificación de especies de bacterias lácticas mediante

secuenciación del ADN

Las colonias de bacterias lácticas cuya identificación no pudo confirmarse por

esta última técnica fueron purificadas y secuenciadas por Macrogen Inc., Seúl, Corea.

71
Material y Métodos

Para ello, se utilizaron los fragmentos de ADN amplificados mediante la PCR

universal de bacterias lácticas (Van de Klundert et al., 1993). Las secuencias
resultantes se enfrentaron a la base de datos del NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.org) para determinar la especie de bacteria láctica
a la que pertenecía cada colonia aislada.

3.4.2.4.- Tipificación de los clones de Oenococcus oeni mediante

electroforesis de campos pulsados (PFGE)

Las bacterias lácticas identificadas como Oenococcus oeni se tipificaron a

nivel clonal mediante electroforesis de campos pulsados (PFGE Pulsed Field Gel
Electrophoresis) utilizando el enzima de restricción SfiI, según el método descrito por
Birren y Lai (1993), con algunas modificaciones en la preparación de los bloques de
agarosa (López et al., 2007).

La electroforesis de campos pulsados es una electroforesis utilizada para

separar moléculas voluminosas de ADN, considerándose voluminosas aquellas que se
encuentran en el rango de 200 a 2200 Kb. Las moléculas de ADN que se van a
separar tienen dos conformaciones: relajada y elongada. Estas moléculas tienen la
forma relajada en ausencia de un campo eléctrico y la elongada cuando se orientan en
presencia del campo eléctrico.

Las moléculas de ADN en un campo eléctrico se elongan, se alinean con el

campo y migran hacia el ánodo, en un proceso que se denomina "reptación". Al
desaparecer el campo eléctrico, la velocidad con que una molécula de ADN vuelve a
su conformación relajada es directamente proporcional a su longitud. En un campo
eléctrico que cambie de dirección alternativamente, las moléculas de ADN sufren
estos procesos de relajación, elongación y orientación sucesivamente. Cuanto mayor
es la molécula de ADN, más tarda en pasar de una conformación a otra y en

72
 Material y Métodos

orientarse, de modo que en un campo eléctrico pulsado se retardan más las moléculas
grandes y avanzan más rápido las moléculas pequeñas. En el proceso de "reptación"
las moléculas grandes avanzan más despacio que las moléculas más pequeñas y se
separan en el campo eléctrico "pulsado", es decir, que es activo y desaparece
alternativamente en pulsos, y que además puede cambiar su orientación (N-S-E-O y
con distintos ángulos). En nuestro caso se utilizó el sistema CHEF (Clamped
Homogeneous Electric Field Electrophoresis) que consta de 24 electrodos en
disposición hexagonal. Entre ellos forman ángulos de 60º (resultante de 120º). Se
establece un gradiente de voltaje y las trayectorias de las moléculas de ADN son
rectas (Fig. 13).

Figura 13.- Equipo de campos pulsados

73
Material y Métodos

Los pasos previos para la extracción del ADN genómico completo de estas
bacterias son:

A) Preparación de la muestra

Los cultivos puros se sembraron en placas de MRS modificado sin pimaricina

a 30ºC y en anaerobiosis durante 48 h para obtener biomasa.

B) Lisis de la pared bacteriana

Una vez obtenido crecimiento, de cada cultivo se realizó una suspensión en 3

ml de solución salina estéril hasta alcanzar una turbidez equivalente al nº 1 en la
escala de McFarland (BioMérieux ® SA Marcy l´Etoile, France). Las muestras se
centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min y se desechó el sobrenadante. Las células
del pellet se resuspendieron en 100 µl de solución de lisozima (100 mg/ml), se
homogeneizaron en vórtex y se incubaron a 37ºC durante 1 h.

C) Preparación de los insertos

Tras el periodo de incubación con lisozima, las muestras se centrifugaron a

3000 rpm durante 10 min y se eliminó el sobrenadante. Se añadieron 100 µl de buffer
de almacenamiento (10 mM Tris-HCl, pH 8; 10 mM EDTA, pH 8) y se mantuvieron
en un baño termostático a 50ºC. A esa misma temperatura, en el baño de agua, se
añadieron a cada muestra 100 µl de agarosa de alta pureza (Bio-Rad) disuelta al 1%
en buffer de almacenamiento. La mezcla se resuspendió suavemente con micropipeta
y se rellenaron dos pocillos por cada muestra, dejando solidificar los insertos a Tª
ambiente. Los insertos así preparados se conservaron a 4ºC en tubos Falcon estériles
con 8 ml aproximadamente de buffer de almacenamiento.

74
 Material y Métodos

D) Ruptura de la membrana celular

La solución de ruptura de la membrana celular se preparó con 1 g/l de

Proteinasa K disuelta en EDTA 0.5 M, pH 9.5 y Sarcoxyl al 20%. Una vez eliminado
el buffer que contenía los insertos, se añadieron 3 ml de la solución de ruptura a cada
tubo Falcon y se incubó a 56ºC durante toda la noche.

E) Lavado de los insertos

Para su utilización inmediata, se decantó la solución de ruptura de la

membrana celular y se realizaron los siguientes lavados:

 Con 8 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 8 y EDTA 50 mM, pH 8 a 56ºC

durante 15 min con agitación.

 Con 8 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 8 y EDTA 50 mM, pH 8, a Tª

ambiente durante 20 min con agitación (dos veces).

 Con 8 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 8 a Tª ambiente durante 20 min y con

agitación (2 veces).

Los insertos pueden guardarse, tras los lavados en Tris-HCl 10 mM a pH 8,

en cámara a 4ºC durante varios días.

F) Digestión enzimática con SfiI

Después de los lavados el inserto, cortado en una pieza del tamaño del pocillo
(1-2 mm), se colocó en un tubo eppendorf al que se adicionaron 100 µl del tampón
del enzima, manteniéndose durante 20 min a Tª ambiente.

Después de eliminar este tampón, se añadieron 5U del enzima SfiI en 100 µl

de su buffer, incubándose a 50ºC durante toda la noche.

75
Material y Métodos

Tras la incubación se inactivó el enzima con 800 µl de tampón TBE 0.5x,

manteniéndolos a 52ºC durante 8 min.

G) Preparación del gel de agarosa

Se preparó un gel con agarosa de alta pureza (Bio-Rad) al 1% (p/v) en TBE

0.5x, dejándose solidificar a Tª ambiente y se introdujeron los insertos tras la
digestión enzimática, sellándose con agarosa atemperada a 50ºC. Como marcador de
peso molecular se utilizó CHEF DNA Size standard (Bio-Rad).

H) Electroforesis de campos pulsados

La cubeta de electroforesis de campo pulsante CHEF-DR III (Bio-Rad) se

llenó con 2 l de tampón TBE 0.5x y cuando alcanzó 14ºC se sumergió el gel. Se
emplearon pulsos de 5 a 45 s, a 5.5 V/cm durante 23 h. La velocidad de la bomba se
fijó a 70 (0.75 l/min).

I) Tinción del gel

El gel se tiñó en una solución de bromuro de etidio 0.5 µg/ml durante 15 min
y se visualizó, analizó y fotografió en el equipo Image Store 5000 (UVP) (BIO-RAD)
con el programa Quantity One. En ocasiones los resultados mejoraron si el gel se
mantiene en agua destilada con agitación suave durante 3 h aproximadamente (Fig.
14).

76
 Material y Métodos

Figura 14.- Ejemplo de electroforesis en gel de agarosa de diferentes clones de O. oeni.

J) Análisis de los patrones de PFGE

Para la conversión, normalización y comparación de los perfiles

electroforéticos obtenidos por PFGE, se empleó el análisis visual y el programa FP
QuestTM (Bio-Rad). Esta herramienta informática permitió analizar los perfiles
numérica y estadísticamente, empleando para ello el método estadístico UPGMA
(Unweighted Pair Group Method using Average linkage) y el coeficiente de
correlación de Pearson.

77
Material y Métodos

3.4.3.- Identificación de mohos

Los mohos son hongos filamentosos que se clasifican según su morfología

asexual, su micelio vegetativo y sus esporas. La identificación taxonómica de los
mohos aislados de las placas se realizó de acuerdo a la observación macroscópica y
microscópica, en concordancia con una guía publicada para cada género (Samson et
al., 2006). (Fig. 15, 16, 17 y 18)

Figura 15.- Placas con distintos géneros de mohos.

Figura 16.- Botrytis en placa y al microscopio.

78
 Material y Métodos

Figura 17.- Penicillium en placa y al microscopio.

Figura 18.- Aspergillus en placa y al microscopio

79
Material y Métodos

3.6.- Medios de cultivo y disoluciones

3.6.1.- Disoluciones base

Tris HCl 1 M, pH 8

Tris base (Sigma) ................................................................... 121.1 g

HCl 37% (Panreac) ....................................................................... 42 ml
Agua destilada, csp ……………...………... .................................. 1000 ml

Ajustar a pH 8 con HCl y enrasar. Esterilizar a 121ºC durante 20 min.

EDTA 0.5 M, pH 8 y pH 9.5

EDTA (Sigma) ............................................................................... 186.1 g

Agua destilada, csp ....................................................................... 1000 ml

Ajustar a pH 8 y a pH 9.5 con NaOH y enrasar. Esterilizar a 121ºC durante

20 min.

Tampón TBE 5x

Tris base (Sigma) ........................................................................... 54.0 g

Acido bórico (Sigma) ..................................................................... 27.5 g
EDTA 0.5 M, pH = 8 ..................................................................... 20 ml
Agua destilada, csp ........................................................................ 1000 ml

Tampón de lisis para extracción de ADN

β-mercaptoetanol (2-mercaptoetanol) (Sigma) ............................... 700 µl

Tris HCl 1 M, pH 8 ...................................................................... 50 µl
Agua destilada estéril, csp ............................................................. 100 ml

La extracción de ADN se realiza con una dilución 1:10 de este tampón.

80
 Material y Métodos

3.6.2.- Disoluciones empleadas en el análisis del ADN mitocondrial

Extracción del ADN:

Solución 1: Sorbitol 0.9 M + EDTA 0.5 M (pH 8.0), pH 7.5

Solución de Zymoliasa: 1.5 mg de Zymoliasa en 1.3 ml de Solución 1
Solución 2: Tris HCl 50 mM + EDTA 20 mM, pH 7.4
Solución de SDS: 10% p/v, pH 7.2 con HCl concentrado
Acetato potásico 5 M: 49 g de acetato en 100 ml de agua, pH 4.8 con acético
glacial
Tampón TE: Tris HCl 10 mM + EDTA 1 mM

Todos los reactivos fueron de Sigma-Aldrich, excepto la Zymoliasa

(Seikagaku Corporation).

Gel de electroforesis y Tinción

Agarosa D1 (Pronadisa) 1%, 1.5% o 3% en tampón TBE (0.5x)
Tampón TBE (0.5x) (Apdo. 3.6.1)
Solución de bromuro de etidio (Bio-Rad): 0.5 mg/ml

3.6.3.-Disoluciones empleadas en el análisis de campos pulsados

Aparte de las disoluciones base descritas en el Apdo. 3.6.1 se utilizaron:

Solución con Proteinasa K

Proteinasa K from Tritirachium album (Sigma) ........................... 100 mg
N-Laurylsarcosine sodium salt (Sigma) al 20% ............................ 5 ml
EDTA 0.5 M, pH 9.5, csp ............................................................. 100 ml

Agarosa de alta pureza

Agarosa (Bio-Rad) ........................................................................ 1 g
Tampón TBE (0.5x), csp ............................................................... 100 ml

81
Material y Métodos

3.6.4.- Medios para aislamiento, conservación y crecimiento de levaduras

Cloranfenicol Glucosa Agar. Medio utilizado para el aislamiento de levaduras.

Extracto de levadura ...................................................................... 10 g

D (+) Glucosa ................................................................................ 20 g
Cloranfenicol.................................................................................. 0.5 g
Agar ............................................................................................... 17 g
Agua destilada ................................................................................1000 ml

Se utilizó un medio deshidratado preparado (Cultimed) (42.5 g/l, pH 6.6 +/-

0.2) y se esterilizó a 118ºC durante 15 min.

Agar de Malta. Medio utilizado para la conservación de las levaduras aisladas.

Extracto de malta (Cultimed) ......................................................... 35 g

Agar (Cultimed) ............................................................................. 30 g
Agua destilada ................................................................................1000 ml

Una vez preparado se distribuyó en tubos para colocar en “slam” y se

esterilizaron a 120ºC durante 20 min.

Trtyptone Soy Broth (TSB). Medio empleado para la toma de muestras de

instalaciones.

TSB (Cultimed) .............................................................................. 30 g

Agua destilada ................................................................................1000 ml

Agar lisina. Medio para diferenciar Saccharomyces y No-Saccharomyces

Agar lisina (Scharlau) .................................................................... 66 g

Lactato potásico al 50% (Fluka) ..................................................... 10 ml
Ácido láctico (Scharlau) ................................................................. 1 ml

82
 Material y Métodos

Agua destilada ............................................................................... 1000 ml

Se disuelve el agar lisina en 1 l de agua que contenga 10 ml de lactato

potásico, y se lleva a ebullición hasta disolución completa. Se deja enfriar a 50ºC y se
añade 1 ml de ácido láctico.

Yeast peptona dextrosa (YPD). Se empleó para el crecimiento masivo de cada

colonia aislada, tanto en forma sólida, como líquida (sin agar).

Extracto de levadura (Cultimed) .................................................... 10 g

Peptona (Cultimed) ...................................................................... 20 g
Glucosa (Scharlau) ........................................................................ 20 g
Agar (Cultimed) ........................................................................... 20 g
Agua destilada .............................................................................. 1000 ml

Se esterilizó a 120ºC durante 15 min.

Medio de crecimiento LM. Se utilizó para el crecimiento de cada colonia de No-

Saccharomyces aislada.

Extracto de levadura (Cultimed) .................................................... 3g

Peptona (Cultimed) ...................................................................... 5g
Glucosa (Scharlau) ........................................................................ 10 g
Extracto de malta (Cultimed) ........................................................ 3g
Agar (Cultimed) ........................................................................... 20 g
Agua destilada .............................................................................. 1000 ml

Esterilizar a 121ºC durante 20 minutos y distribuir en placas Petri.

83
Material y Métodos

3.6.5.- Medios de recuento y aislamiento para bacterias lácticas

MRS modificado (Man, Rogosa and Sharpe)

MRS broth (Scharlau) .................................................................... 52 g

D-fructosa (Panreac) ...................................................................... 6g
DL-málico (Panreac) ...................................................................... 5g
L-cisteína HCl (Sigma) .................................................................. 0.5 g
Pimaricina VGP, S.L ....................................................................... 50 mg
Agar bacteriológico. (Cultimed) ..................................................... 30 g
Suero de tomate.............................................................................. 100 ml
Agua destilada ................................................................................ 900 ml

Se autoclava a 121ºC durante 20 min.

Se añade pimaricina para impedir el crecimiento de levaduras. Se prepara

disuelta en agua estéril (75 mg en 6 ml de agua) y se añaden 4 ml al medio
atemperado, y se distribuye en placas.

Para el crecimiento de las bacterias lácticas aisladas se empleó el mismo

medio pero sin pimaricina.

3.6.6.- Medio para aislamiento y recuento de mohos

Agar-Czapek. Medio empleado para el aislamiento y recuento de mohos.

Czapek Dox (modificado) Agar (medio deshidratado) .................. 45.4 g

Agua destilada ……………………………………………. ........... 1000 ml
Se calienta y agita hasta ebullición y se esteriliza a 121ºC durante 15 min.

84
Capítulo 4
Resultados
 4.1
ESTUDIO DE LA PRESENCIA DE MOHOS, LEVADURAS
Y BACTERIAS EN EL AIRE DE UNA BODEGA
DURANTE LA VINIFICACIÓN.

ESTUDIO DEL AIRE COMO VÍA DE DISEMINACIÓN

DE LEVADURAS DE LA ESPECIE Saccharomyces
cerevisiae RESPONSABLES DE LA FERMENTACIÓN
ALCOHÓLICA.

The occurrence of fungi, yeasts and bacteria in the air of a

Spanish winery during vintage.

Artículo publicado en:

International Journal of Food Microbiology

2008, 125, 141-145

 4.1 Resultados

Resumen

Desde hace años, los bodegueros han venido observando que las primeras
fermentaciones espontáneas que tienen lugar en la bodega cada campaña suelen ser
más largas que las que suceden a continuación. La razón podría deberse al
incremento de microorganismos que se produce en el primer depósito y su
posterior diseminación por la bodega. En este sentido, algunos autores han sugerido
que las cepas de Saccharomyces cerevisiae que dominan la fermentación del
primer depósito de cada vendimia invaden el ambiente de la bodega y producen
una inoculación natural en las fermentaciones siguientes. La diseminación de los
microorganismos en el interior de la bodega tiene lugar por la maquinaria e
instrumental de la misma, los operarios, los insectos y… probablemente el aire.

Los objetivos de este trabajo fueron dos:

1. Estudiar la presencia y evolución de los microorganismos de

interés enológico (levaduras, bacterias y mohos) en el aire de una
bodega durante el período de vinificación.

2. Comparar los clones de Saccharomyces cerevisiae presentes en el

aire de la bodega con los que llevaron a cabo las fermentaciones en
la misma.

El desarrollo de estos objetivos se llevó a cabo como parte del Primer

ensayo especificado en el Apdo. 3.1, en la bodega Santos Montiel de Tudelilla (La
Rioja) durante los meses de septiembre a diciembre de 2006. En esta bodega sólo
se elaboran vinos tintos y todas las fermentaciones, tanto alcohólica como
maloláctica, se llevan a cabo de forma espontánea, sin inoculación con
microorganismos seleccionados.

89
4.1 Resultados

En este estudio, se ralizaron muestreos de aire en la zona de elaboración,

con un muestreador ambiental airIDEAL 3P con placas Petri que contenían un
medio de cultivo selectivo específico para cada tipo de microorganismo objeto de
estudio (Cloranfenicol Glucosa Agar para detectar la presencia de levaduras, Agar
MRS modificado para bacterias lácticas y Agar Czapek para mohos).

Simultáneamente a los muestreos realizados en el aire, se tomaron muestras

para el aislamiento de las levaduras presentes en el mosto/vino de tres de los ocho
depósitos de la bodega. El muestreo de estos tres depósitos se realizó en distintos
momentos de la fermentación alcohólica (24 h después del encubado, fermentación
tumultuosa y final de fermentación). Para diferenciar las levaduras Saccharomyces
y No-Saccharomyces se utilizó el medio selectivo Agar lisina, y la tipificación de
clones de la especie Saccharomyces cerevisiae se llevó a cabo mediante el análisis
de restricción del ADN mt.

Los resultados obtenidos mostraron que la presencia en el aire de los tres

tipos de microorganismos asociados a la uva y a la vinificación aumentó en la
atmósfera de la bodega durante la época de vendimia. Los microorganismos
cuantitativamente más abundantes fueron los mohos, que en los momentos con
mayor entrada de uva en la bodega llegaron a superar niveles de 10000 NMP/m3.
Las levaduras y las bacterias se detectaron en menor cantidad (valores máximos en
torno a 1000 NMP/m3 y 400 NMP/m3 respectivamente), quedando su presencia
limitada a los períodos de tiempo en que las fermentaciones alcohólica y
maloláctica tuvieron lugar. Los datos indicaron que la fuente de mohos en el aire de
la bodega durante la vendimia procedió básicamente de las uvas. La presencia de
levaduras y bacterias lácticas en el ambiente durante el mismo periodo se debió a
su proyección al aire desde los depósitos en fermentación. El nivel más elevado de
levaduras que de bacterias en el aire puede explicarse por la mayor cantidad de CO2

90
 4.1 Resultados

desprendido en la FA y por las manipulaciones del contenido de los depósitos

durante la misma (trasiegos, bazuqueos, remontados, etc.).

Los mohos presentes en el aire pertenecieron a los géneros Aspergillus,

Penicillium y Botrytis. Este último sólo se detectó durante los días de entrada de
uva en la bodega. Fuera de este periodo, los únicos mohos detectados en el
ambiente fueron Aspergillus y Penicillium, siendo mayoriatario Penicillium.

Las levaduras aisladas en el aire pertenecieron tanto a la especie

Saccharomyces cerevisiae como al grupo No-Saccharomyces. Las primeras sólo se
detectaron cuando se inició la actividad fermentativa, alcanzando niveles del 100%
cuando los depósitos estaban fermentando activamente. Antes del desarrollo
masivo de las fermentaciones alcohólicas y una vez concluidas éstas, las únicas
levaduras presentes en el aire fueron No-Saccharomyces.

Cuando se compararon las cepas de Saccharomyces cerevisiae aisladas al

mismo tiempo en el ambiente y en los depósitos en fermentación se encontraron
varios clones comunes, lo que significa que la carga microbiológica del aire fue
indicativa de la que estaba actuando en los depósitos, confirmándose que hubo un
intercambio de microorganismos entre ambos medios. Esto sugiere que el aire por
sí mismo puede ser otra vía de diseminación de microorganismos dentro de la
bodega y de inoculación de los depósitos.

La originalidad de este trabajo radica en el hecho de que fue la primera vez

que se aplicó el análisis del aire a la monitorización de procesos microbianos en el
sector enológico.

91
 International Journal of Food Microbiology 125 (2008) 141–145

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International Journal of Food Microbiology

j o u r n a l h o m e p a g e : w w w. e l s e v i e r. c o m / l o c a t e / i j f o o d m i c r o

The occurrence of fungi, yeasts and bacteria in the air of a Spanish winery
during vintage
Patrocinio Garijo a, Pilar Santamaría a, Rosa López a, Susana Sanz b, Carmen Olarte b, Ana Rosa Gutiérrez b,⁎
a
Servicio de Investigación y Desarrollo Tecnológico de La Rioja (CIDA). Ctra. de Mendavia-Logroño, NA 134, km. 88, 26071 Logroño, La Rioja, Spain
b
Departamento de Agricultura y Alimentación (CCT), Universidad de La Rioja. C/Madre de Dios, 51 26006 Logroño, La Rioja, Spain

A R T I C L E I N F O A B S T R A C T

Article history: This research studies the presence of microorganisms of enological interest (yeasts, bacteria and molds) and
Received 23 October 2007 their evolution in the air of a wine cellar. The samples were taken throughout the winemaking campaign
Received in revised form 20 February 2008 (September–December) in a winery of the D.O.Ca. Rioja, Spain. They were collected using an airIDEAL
Accepted 24 March 2008
atmosphere sampler from Biomerieux. For the isolation, specific selective media were used for each group of
microorganisms. The results obtained indicate that the presence in the winery air of the various different
Keywords:
Yeasts
microorganisms studied is directly related to the winemaking processes that are taking place in the winery.
Lactic bacteria Thus, the number of molds present decreases once grapes have ceased to be brought into the winery. The
Molds maximum number of yeasts in the air is found when all the vats in the cellar are fermenting, while the lactic
Air bacteria are not detected until the first malolactic fermentation begins. The species of yeasts and molds
Winery identified are also related to the winemaking processes. The coincidence of strains of Saccharomyces
cerevisiae among those present in the vats during alcoholic fermentation and those isolated from the air,
confirms the role of the latter as a transmitter of microorganisms.
© 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction
Winemaking is a process in which a series of complex micro-
biological transformations take place, involving interactions between
yeasts, bacteria and filamentous fungi. The conversion of must into
wine occurs through alcoholic fermentation (AF), a process performed
by yeasts. This initial transformation is followed by what is known as
malolactic fermentation (MLF), caused by lactic bacteria. Both
microbiological processes make an essential contribution to the final
quality of the product. The origin of these microorganisms and the
way in which they get into the must is a question which has been
debated for some time (see for example the studies carried out by
Peynaud and Domercq on microorganisms in the winery environment
by Peynaud and Domercq, 1956, 1961) but nowadays it is accepted that
the yeasts and bacteria which take part in the fermentation processes
have two possible sources: the grapes and the material in the winery
environment (Fleet and Heard, 1993; Mortimer and Polsinelli, 1999).
The grapes which come into the winery have an important population
of microbes adhered to the bloom, made up of yeasts, bacteria and
molds. But the winery equipment (stemmer, crusher, pipework, vats,
etc.) also contribute microorganisms and thus, as the must comes into
contact with the different winery equipment, the yeasts, bacteria and
molds which have been in contact with these surfaces pass into the
⁎ Corresponding author. Tel.: +34 941299727; fax: +34 941299721.
E-mail address: ana-rosa.gutierrez@unirioja.es (A.R. Gutiérrez).
must and, if the environmental conditions allow, begin to multiply and
ferment.
Molds are ubiquitous, with various genera commonly found on
grapes (Aspergillus, Botrytis and Penicillium), and to a lesser extent
Phythophthora, Moniliella, Alternaria and Cladosporium (Rosa et al.,
2002). Molds are also ubiquitous inside wineries and are present on
surfaces and in the air (Donnelly, 1977). The yeasts associated with
vinification can be grouped into two categories: Saccharomyces and
non-Saccharomyces. The first of these groups includes yeasts belong-
ing to the Saccharomyces genus and these are the main agents
responsible for fermentation (Beltrán et al., 2002). The yeasts get onto
the grapes through the effects of wind dispersal and via insects
(Carrascosa et al., 2005). The microbial load of the grapes entering the
winery is almost exclusively composed of non-Saccharomyces yeasts,
so the inoculation of musts with Saccharomyces mainly occurs through
the winery equipment (Pretorius, 2000). Lactic bacteria have been
isolated from vine leaves, grapes, winery equipment, barrels, etc (Bae
et al., 2006). This means that they are present during all stages of
vinification and, like the yeasts, enter with the grapes and remain in
the winery equipment after MLF (Fugelsang and Edwards, 2007).
For many years, winemakers have found that the first spontaneous
fermentations (alcoholic and malolactic) carried out on each harvest
at the wineries take longer than subsequent ones (Peynaud, 1989). The
reason would be due to the increase in microorganisms which occurs
in the first vat, and in their dispersal around the cellar and arrival in
large quantities in other vats in which the subsequent fermentations
take place, and which would start up more quickly. Recently, Granchi,

0168-1605/$ – see front matter © 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2008.03.014
142 P. Garijo et al. / International Journal of Food Microbiology 125 (2008) 141–145
Augruso, Ganucci, and Vicenzini (2007), have suggested that Sac-
charomyces cerevisiae which dominate the fermentation of the first vat
of each harvest invade the winery environment and produce a natural
inoculation in the subsequent fermentations. The dispersal of the
microorganisms in the winery occurs through the machinery, tools,
insects and probably the air.
The aim of the present work is to study the presence and evolution
of various types of winemaking microorganisms (yeasts, bacteria and
molds) in the air of a winery during the period of vinification for the
2006 campaign. In the recent literature consulted, only Connell et al.
(2002), have used the analysis of air in a winery for a study of the
presence of microorganisms and they found Brettanomyces yeasts in
air samples taken from different parts of a commercial wine cellar.
Previously, Donnelly (1977) used this approach in a winery bottling
room. However, the analysis of the air is common in other food
industries (Salustiano et al., 2003), primarily in the aseptic packaging
of food, where the presence of microorganisms in the air is a source of
contamination and spoilage of foodstuffs. The need to control the
microbiological quality of the air to ensure that food products remain
safe and wholesome throughout their shelf life is well established in
food factories, because air carries many microorganisms. Concentra-
tions of 100–10,000 microorganisms per cubic meter are quite normal
(Curiel et al., 2000).
2. Materials and methods
2.1. Sample collection
The research was carried out during the months of September–
December 2006 in a winery situated in the village of Tudelilla (La
Rioja, Spain). Only red wines are made in this winery and all the
fermentation processes, both alcoholic and malolactic are always
spontaneous. Sampling of the winery air began on 27 September,
5 days before the first grapes were brought into the cellar (which
happened on 2 October), and ended on 19 December, 1 month after
the last malolactic fermentation was complete. In total, 13 air samples
were taken in the winery (27 September; 2, 5, 9, 11, 16, 20, 24, 31
October; 8, 14, 28 November and 19 December). As can be seen, most
of the samples were taken during the month of October coinciding
with grape reception into the winery and alcoholic and malolactic
fermentation.
Air samples were taken using the airIDEAL 3P air sampler from
BioMérieux, an impaction aerobiocollector used to detect the
presence of viable microorganisms in the environment to be tested
by precise sampling of a given volume of air. Air is taken up with a
turbine through a grid surface. The acceleration of airflow results in
the impaction of airborne microorganisms on the agar. Passage of the
air through the grid filters out particles, thereby facilitating the
enumeration of CFU (colony forming units) after incubation of the
medium.
An analysis was performed for the presence in the air of three types
of winemaking microorganisms: yeasts, lactic bacteria and molds. All
the samples were taken from the same point in the winery, located in
the middle of the winemaking area. The sampler was placed on a
platform 1 m above the ground. The study of each of the microorgan-
isms was made using petri dishes with specific selective media for
each one: Cloramphenicol Glucose Agar for yeasts (Biokar Diagnostics,
France), Agar Czapek (Scharlau Microbiology, Barcelona, Spain) for
molds and modified MRS-Agar (Scharlau Microbiology, Barcelona,
Spain) for lactic bacteria. The volume of air analyzed varied between
20 and 100 l depending on the microorganism under study and of the
stage in the vinification process. In each sampling, two different
volumes of air were analyzed in duplicate for each microorganism.
Simultaneously with the analysis of yeasts in the air, the
indigenous yeasts which produced three of the eight spontaneous
alcoholic fermentations carried out in the winery during the whole of
the campaign were analyzed. The aim of the sampling was to compare
the microorganisms present at the same time in both media. The wine
was fermented in 25,000-l stainless steel vats at a controlled
temperature of 28 °C. The fermentation processes analyzed were:
the first fermentation of the campaign, vatted on 2 October, another
midway through the period, vatted on 9 October and the final
fermentation of the year, vatted on 16 October. The three spontaneous
fermentations were sampled at three different stages: 24 h after
vatting, vigorous or tumultuous fermentation and end of fermenta-
tion. The collection of colonies was considered to be representative of
the total yeast population (Santamaría et al., 2007), and it was in line
with previous studies (Santamaría et al., 2005). All samples were
collected in sterile bottles and taken to the laboratory for processing.
2.2. Microbial analyses
The plates obtained from the air sampling were transferred to the
laboratory and incubated in the appropriate conditions for the growth
of each microorganism (incubator at 25 °C for 48 h for yeasts, cool
store at 20 °C for 7 days for molds, and anaerobiosis at 30 °C for
10 days in the case of lactic bacteria). Some diphenyl crystals
(approximately 100 mg per plate)(Panreac Química SA, Barcelona,
Spain), were added to the yeast and bacteria plates in order to impede
the development of mold. After the incubation period, the number of
each type of microorganism was counted. From the two volumes of air
samples at any given moment, the one chosen for the count was that
in which the plates contained less than 100 CFU (according to
manufacturer's instructions). The result of this count was expressed as
the average of the number obtained in the two repeat samples
analyzed (CFU). Subsequently, this value was converted into the most
probable number of microorganisms collected per plate (MPN). The
MPN value is calculated from the CFU count, using Feller's law:
MPN = N · (1/N + 1/N − 1 + 1/N − 2 + …….. + 1/N − CFU + 1). A reading and
statistical correction table is used to convert the number of CFU to
MPN (included in the equipment's instruction manual). This statistical
correction corresponds to the random passing of microorganisms
through the orifices of the grid. In order to determine the most
probable number of microorganisms collected per cubic meter of air
(MPN/m3), the most probable number of microorganisms collected
per plate (MPN collected) was multiplied by 1000 and divided by the
volume of air sampled in liters. In every plate with yeasts, ten colonies
were randomly selected and stored in tubes with malt agar for later
analysis.
Samples collected in sterile bottles during spontaneous alcoholic
fermentations for isolation of yeasts, were processed as follows: serial
dilutions were carried out and the samples were seeded onto plates
containing a chloramphenicol glucose agar medium. The plates were
incubated at 25 °C for 48 h. Plates containing between 30 and 300
yeast colonies were examined; ten colonies from each sample were
randomly selected (10 from the start of fermentation, 10 from vigorous
fermentation and 10 from the end of fermentation), making a total of
30 colonies for each tank. The colonies chosen were stored in tubes
with malt agar for later analysis.
All the colonies of yeasts isolated both in the air and in
fermentations were later seeded onto Petri plates containing Lysine
Agar Medium (Scharlau Microbiology, Barcelona, Spain). The growth
in these dishes allowed us to distinguish between Saccharomyces and
non-Saccharomyces yeasts, since only the latter are capable of growing
in such a medium.
Individual isolates of the Saccharomyces genus, isolated both in the
air and in spontaneous fermentations, were identified by mithochon-
drial DNA (mtDNA) restriction analysis. The Restriction Fragment
Length Polymorphism (RFLP) of mithochondrial DNA was used for
distinguishing between strains of S. cerevisiae (Pulvirenti and Giudici,
2003). Yeast cells were grown overnight in a culture of 5 mL YEPD (1%
yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) (Cultimed, Panreac Química
 P. Garijo et al. / International Journal of Food Microbiology 125 (2008) 141–145
S.A., Barcelona, Spain). DNA extraction and mtDNA restriction patterns
were determined by the methodology described by Querol et al.
(1992). The DNA of all the colonies was digested with the restriction
endonuclease AluI, in accordance with the supplier's instructions
(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany). The restriction frag-
ments were separated by electrophoresis (BioRad, Hercules, CA:DNA
Sub Cell, Segrate, Italy) in 1% agarose gels (Agarose MP, Roche
Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germany) in a 0.5 × TBE buffer (45 mM
Tris–borate, 1 mM EDTA, pH 8) (Sigma, St. Louis, USA.) and visualized
on a UV transilluminator after ethidium bromide (5 μg/mL) staining
for 10 min. Those strains which proved identical in this digestion were
compared again using the RsaI enzyme for the digestion.
On the mold plates, 10 colonies were randomly selected and grown
on plates with Agar Czapek until their later identification. Molds are
filamentous fungi that are classified based on the morphology of
asexual or vegetative mycelial elements and their spore structures
(Samson et al., 1995). Taxonomic identification of all isolates was
achieved through macroscopic and microscopic observation in
accordance with guidelines published for each genus.
3. Results and discussion
3.1. Evolution of microbial populations
In general terms, the presence in the air of the three types of
microorganisms associated with grapes and vinification, increases in
the winery atmosphere during harvest time (Fig. 1). The quantitatively
most abundant microorganisms in the winery air were molds,
ubiquitous microorganisms which form part of any ecosystem. The
yeasts and bacteria were found in a much smaller quantity, with their
presence limited to the period of time during which the fermentation
processes induced by these microorganisms (alcoholic and malolactic
fermentation) were actually taking place. This data suggests that the
yeasts and bacteria which were developing in the vats from the
components of the must or of the wine passed into the air, that is, that
there was an exchange between the liquid medium in fermentation
(must/wine) and the gaseous one (air).
The results obtained indicated that the presence in the air of the
various microorganisms studied was directly related to the wine-
making processes that were taking place in the winery. As can be seen
in Fig. 1, the number of molds existing in the winery before the start of
the campaign (sample of 27 September) increased to levels of above
10,000 MPN/m3 throughout the period of reception of grapes (2
October to 16 October) drastically diminishing from then on, when the
majority of the vats were already in fermentation. The presence of
yeasts in the air was only detected after alcoholic fermentation began
in the first vat. Beforehand, in the samples taken in the empty winery
Fig. 1. Evolution of the populations of yeasts, lactic bacteria and molds in the air of the
winemaking area of a winery during the 2006 harvest campaign. Molds (○), Yeasts (Δ)
and Lactic Bacteria (□).
143
(27 September) and on the first day of reception of grapes (2 October),
no yeasts were found in the air in the winemaking area. The maximum
number of yeasts was found when most of the vats in the winery were
fermenting (20 October), only to gradually decrease afterwards until
they totally disappeared. For their part, the lactic bacteria were absent
from the winery air until after the start of the first malolactic
fermentation (16 October), and rapidly disappeared from the air once
this fermentation was complete in the last tank (14 November). These
data are in accord with Curiel et al. (2000), who indicated that the
concentration of microorganisms in food factories differs according to
season and location. In agricultural areas during harvesting, the
concentration of spores of bacteria and molds on the outside can be
extremely high, close to a billion per cubic meter. In enclosed spaces,
the concentration usually varies less, between several hundred and a
thousand per cubic meter.
So as it seems clear that the source of the molds in the winery air
during the harvesting period is basically the grapes, the presence of
yeasts and lactic bacteria in the air during the same period seems to be
due to their projection from the tanks in which they are developing in
large numbers. Although both microorganisms (yeasts and lactic
bacteria) reach similar levels of population in the tanks during
fermentation (106–108 CFU/ml) (Carrascosa et al., 2005), the number
of yeasts detected in the air during the AF phase is much greater than
the number of bacteria found during MLF (Fig. 1). This fact could be
explained by the greater amount of CO2 given off in alcoholic
fermentation, and by the processes carried out on the content of the
vats during this (racking off, pumping over, pressing). These two
factors (CO2 released and processes in the vats) would suppose a
greater degree of release of yeasts into the atmosphere than in the
case of lactic bacteria.
The survival of the microorganisms and their subsequent growth is
closely related to environmental conditions such as temperature,
humidity, presence of nutrients, etc. The air itself does not permit
microbes to develop and only acts as a support medium or carrier until
the microorganisms fall and are deposited on the surrounding
surfaces. The period of time during which the microorganisms remain
in the air is focused, then, in the period covering projection and
transport, and afterwards they are rapidly deposited. These results
coincide with the ones given in a generic form for food industries by
Curiel et al. (2000). They report that microorganisms can travel
through the air in three ways: adhering to a dust particle, adhering to a
droplet or as a single particle. Most vegetative bacteria die rapidly (in
seconds) in dry air, but bacterial or fungal spores can survive. The
sedimentation rate of microorganisms, is also important as it
determines the rate of microbial recontamination of products or
equipment during the time of exposure.
3.2. Molds
The molds which colonized this winery's air in the greatest
quantity belonged to three genera: Aspergillus, Penicillium and Botry-
tis (Fig. 2). The presence of Botrytis, since it is a typical mold “of the
country” (Leong, 2007), was mainly concentrated during the days
when the grapes were being brought in (2 October to 16 October),
representing 20–40% of the total, the rest being made up of Aspergillus
and Penicillium. Before and after this period, when grapes were not
coming into the winery, Aspergillus and Penicillium, typical “ware-
house molds”, were the only ones detected in the winery ecosystem.
The last samplings, performed when there was no longer any
microbial activity in the winery and when it was only being used as
a wine store, showed that the most abundant mold in the atmosphere
belonged to the Penicillium genus (80%). These three genera are those
commonly found on grapes in previous studies (Rosa et al., 2002).
As can be seen in Fig. 1, from the time when reception of grapes
into the winery ended, the population of molds decreases in the
atmosphere until levels of around 2500–3000 MPN/m3 are reached, a
144 P. Garijo et al. / International Journal of Food Microbiology 125 (2008) 141–145

and 8 November, reaching a level of 100% of the yeasts isolated over

Fig. 2. Percentage distribution of the main genera of molds present in the air of the the
winemaking area of a winery during the 2006 harvest campaign: Penicillum (□), As-
pergillus ( ) and Botrytis (■).
value which gradually fell to levels of less than 1000 MPN/m3. These
data confirm that the raw material was the vehicle for the
introduction of these microorganisms into the winery, and that
these then remained in the air, given that air is their normal form of
dispersal. The concern about molds in enology, is that these
microorganisms are capable of growth on the outer and inner surfaces
of wooden barrels and on cork in bottled wines, producing sensorially
powerful metabolites that can play a significant role in wine quality. A
major concern with the growth of certain molds on grapes is the
production of mycotoxins. Molds known to produce “moldy” sensory
attributes in wine and also mycotoxins in grapes belong to the As-
pergillus and Penicillium genera (Abrunhosa et al., 2001; Esteban et al.,
2004), principally the genera found in this study. Nevertheless, the
level of molds in the air diminishes after the harvest until low levels
are reached, and moreover, among the Aspergillus and Penicillium
genera, not all the species nor all the strains of each species are
responsible for the previously mentioned problems. In this study, the
molds have only been identified at genus level, so no assessment can
be made of the risk that exists due to the nature of the molds which
entered with the grapes.
the period 9 October to 20 October, the peak period of fermentative
activity in the winery. Prior to 5 October and after 8 November, all the
yeasts were identified as being non-Saccharomyces. These results are
also evidence of the release of yeasts from the fermentation tanks into
the air outside, since during the period when fermentation was at its
highest level of intensity, the population in the vats is almost
exclusively composed of yeasts of the S. cerevisiae species, and in
this period these were also the main yeasts detected in the air.
It is a widely proven fact that most of the yeasts found on the grape
belong to the non-Saccharomyces group (Fleet and Heard, 1993).
Hence, the entire total of the yeasts identified in the winery air in the
first days of the campaign belong to this group, since they would come
in with the grapes. After 24 October, when all the alcoholic
fermentation processes had finished in all the vats, these yeasts
reappear in the air of the winery, reaching 100% in the last samples.
The oxidative metabolism of these yeasts would explain their
remaining in the winery atmosphere, as well as their massive
presence in the tools and equipment of the wineries outside
harvesting time as has been reported in other studies (Santamaría et
al., 2005).
Unlike the results for the proportion of non-Saccharomyces yeasts
found in the air, all of the colonies isolated in the must 24 h after being
put into the vats belonged to non-Saccharomyces yeasts. Yeasts from
the non-Saccharomyces group mainly act in the tanks during the first
stages of maceration (Combina et al., 2005), while the intensity of the
fermentation process and the ethanol concentration are still low and
less carbon dioxide is released. This would mean that the yeasts are
Table 1
Strains of Saccharomyces cerevisiae expressed in percentage over total isolated. In bold,
strains simultaneously present in the air and in three of the winery's fermentation vats
(vigorous and final stages)
AF vigorous
Tank 1 Tank 2 Tank 3
5-October 11-October 20-October

Yeast strain Air Tank Yeast strain Air Tank Yeast strain Air Tank
3.3. Yeasts
Ia 50 – Ib 30 – Ic 20 –
IIa 50 – IIb 10 – IIc 10 –
The yeasts isolated from the air belonged to both the Saccharo- IIIa – 10 IIIb 10 10 IIIc 20 10
myces genus and the non-Saccharomyces group (Fig. 3). The presence IVa – 10 IVb 10 – IVc 10 –
in the air of Saccharomyces yeasts was detected between 5 October Va – 10 Vb 10 10 Vc 10 10
VIa – 10 VIb 10 – VIc 10 –
VIIa – 10 VIIb 10 20 VIIc 10 20
VIIIa – 10 VIIIb 10 – VIIIc 10 –
IXa – 20 IXb – 30 IXc – 10
Xa – 20 Xb – 10 Xc – 10
XIb – 10 XIc – 10
XIIb – 10 XIIc – 10
XIIIc – 10

AF final

Tank 1 Tank 2 Tank 3

9-October 15-October 24-October

Yeast strain Air Tank Yeast strain Air Tank Yeast strain Air Tank

XIa 10 – XIIIb 60 – XIVc 10 30

XIIa 10 – XIVb 20 10 XVc 10 –
XIIIa 20 – XVb 20 – XVIc 10 –
XIVa 30 – XVIb – 10 XVIIc 10 10
XVa 20 – XVIIb – 20 XVIIIc 20 –
XVIa 10 10 XVIIIb – 30 XIXc 10 –
XVIIa – 20 XIXb – 10 XXc 10 –
XVIIIa – 10 XXb – 10 XXIc 10 –
XIXa – 10 XXIb – 10 XXIIc – 10
XXa – 10 XXIIIc – 20
Fig. 3. Percentage distribution of the types of yeasts (Saccharomyces, ■, and Non-Sac- XXIa – 10 XXIVc – 10
charomyces, □) present in the air of the winemaking area of a winery during the 2006 XXIIa – 10 XXVc – 20
harvest campaign.
 P. Garijo et al. / International Journal of Food Microbiology 125 (2008) 141–145
projected outside the vats to a lesser extent, and this would explain
why they were not detected in the air during the period of greatest
fermentative activity in the winery (9 October to 20 October), despite
being present at the beginning of fermentation in all the vats. The ratio
of Saccharomyces/non-Saccharomyces yeasts in each vat contributes to
the chemical composition and the sensory characteristics of the wine
obtained, clearly affecting its quality (Jolly et al., 2003).
Comparing the strains of S. cerevisiae isolated on the same date in
the air and inside the fermentation vats (Table 1), various common
clones were found in both media, which confirmed that there is an
exchange of microorganisms between the fermentation tanks and the
air. In tank 1 during the vigorous fermentation phase, no common
clones were observed between the media. This could be due to the fact
that on the date of sampling (5 October), the presence of Saccharo-
myces yeasts in the air was still low (Fig. 3), as this was the first vat in
the winery to begin fermentation. Thus, only two different S. cerevisiae
clones were found in the air, and neither of these coincided with the 8
different clones of this species detected in the fermentation vat. But
after this time had passed, when the alcoholic fermentation had
become more widespread in the whole winery, and was coming to an
end in the first vat, common clones were already detected between
the air and the vats. Thus, at the end of alcoholic fermentation in the
first vat (9 October), clone XVIa appeared in both media. Clones IIIb, Vb
and VIIb appeared in both media during vigorous fermentation in tank
2, and XIVb did so towards the end of this phase. Finally, in tank 3,
clones IIIc, Vc and VIIc in vigorous fermentation and IVc and XVIIc at
the end, were also present in both the air and the tanks. The
conclusion which can be drawn from these data is that there was an
exchange of microorganisms/strains between the liquid medium in
fermentation and the gaseous one (the air), which could indicate that
the air in itself could be an as yet unstudied means for the dispersal of
microorganisms within the winery and for the inoculation of tanks, in
addition to the ones already known (insects, tools). Donnelly (1977),
adapted a filtration air-sampling method to determine the extent and
kinds of airborne microorganisms in a large bottling winery. Different
sources contributed the majority of the airborne organisms which in
turn are the most likely to cause wine contamination at bottling.
Something similar could happen in the vinification area in the cellar.
However, in the recent bibliography consulted, no similar data
taken in wineries were found which would allow us to compare the
results of this study, so this could be the start of a new line of research
for the winemaking industry.
4. Conclusions
The results of this study suggest that the microbial load of the air at
any given time seems to be indicative of the microorganisms which
are acting in the winery. Hence, this technique to analyze the
microbiological quality of the air, once perfected, could serve to
control processes and even microbiological deviation during the
production and storage of wines. The originality of this research lies in
the fact that it is the first time that this air analysis technology has
been applied to monitoring microbial processes in the winemaking
sector. While it is true that the study has mainly focused on the
dispersal of winemaking yeasts, in subsequent studies other micro-
organisms of interest to winemakers will also be tackled in depth,
both those which have beneficial effects and those which can cause
defects. This study is therefore the start of an interesting line of
research in winery environmental microbiology.
Acknowledgments
This research received funding from the Government of La Rioja,
and was carried out with the collaboration of the Santos Montiel
145
winery (Tudelilla, La Rioja, Spain) who allowed us the use of their
installations, equipment and wines for the study. We also thank Ian
Thomas for correcting the English of the manuscript.
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 4.2
ESTUDIO DE LAS LEVADURAS PRESENTES EN LAS
INSTALACIONES DE UNA BODEGA COMERCIAL.
COMPARACIÓN DE LOS CLONES DE Saccharomyces
cerevisiae AISLADOS DE INSTALACIONES, DEPÓSITOS
EN FERMENTACIÓN Y EN EL AIRE

Este Apdo. forma parte del trabajo realizado para la

obtención del Diploma de Estudios Avanzados (DEA), que llevó
por título: “Vías de diseminación de microorganismos
enológicos en una bodega durante una vendimia”. Dentro del
Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias y Alimentarias (U.
R., junio 2010).

Trabajo presentado en el XVII Congreso Nacional de

Microbiología de los Alimentos, celebrado en Valladolid en
septiembre de 2010.
 4.2 Resultados

4.2.1.- Resumen

Este estudio constituyó uno de los capítulos del trabajo presentado para la
obtención del Diploma de Estudios Avanzados (DEA), defendido en 2010 en la
U.R., bajo la dirección de la Dras. Ana Rosa Gutiérrez y Pilar Santamaría.

Hasta el momento, se ha admitido que la microbiota asociada a la

vinificación tenía mayoritariamente dos posibles orígenes: la uva y el material de la
bodega. En este sentido, se puede considerar que los microorganismos que
acompañan a la vendimia están presentes durante todas las etapas de vinificación y
que finalmente permanecen en las instalaciones de la bodega. Así, se ha
demostrado que, dentro de este ecosistema microbiano, las levaduras se encuentran
fijadas sobre suelos, paredes, depósitos, conducciones y maquinaria de procesado
(tolva, estrujadora, despalilladora, etc.) y que en los meses que siguen a la
vinificación, las levaduras responsables de la fermentación permanecen en la
bodega y colonizan las superficies de la misma. No obstante, según se ha indicado
en el anterior capítulo, el aire también puede ser una vía de diseminación de
microorganismos en la bodega. Este medio no permite el desarrollo microbiano y
sólo actúa como soporte o transporte, hasta que los microorganismos caen y se
depositan en las superficies circundantes, siendo importante la tasa de
sedimentación porque determina la recontaminación de productos o equipos.

Por otra parte, hasta hace unos años se creía que las levaduras presentes en
los materiales de vinificación pertenecían principalmente a la especie S. cerevisiae,
es decir levaduras capaces de completar una fermentación. Sin embargo, en
trabajos más recientes se ha puesto de manifiesto que las No-Saccharomyces
pueden ser mayoritarias también en las instalaciones.

101
4.2 Resultados

Los objetivos de este trabajo fueron:

1. Estudiar la distribución de levaduras Saccharomyces/No-

Saccharomyces en las instalaciones de una bodega antes de la
vendimia.

2. Comparar los clones de S. cerevisiae procedentes de las

instalaciones con los presentes en el aire de las zonas de recepción
y elaboración y con los que llevaron a cabo las fermentaciones.

Para abordar estos objetivos, los muestreos en las instalaciones se

realizaron una vez efectuada la limpieza en la bodega con el fin de prepararla para
la campaña, cinco días antes de la entrada de la primera uva vendimiada. La toma
de muestras se realizó en 10 puntos (tolva de recepción, despalilladora, estrujadora,
bomba de pastas, pared del depósito, boca de salida del depósito, prensa, bomba de
trasiego, suelo y pared de la bodega), como se especifica en el Apdo. 3.1.2 de esta
memoria. Además de los muestreos realizados en las instalaciones se tomaron
muestras de los mostos en fermentación y del aire de la bodega en la zona de
recepción y de elaboración durante todo el periodo de la vinificación (Apdos.
3.1.1.1 y 3.1.4.1).

4.2.2.- Levaduras presentes en las instalaciones

El total de colonias aisladas fue de 46 (Tabla 13), de las cuales 29

pertenecieron al grupo No-Saccharomyces (63%) y 17 al género Saccharomyces
(37%). Sólo se aislaron colonias en seis puntos de los 10 muestreados, no
obteniéndose ningún crecimiento en las tolvas de recepción y la bomba de pastas,
ni en la pared interior del depósito, ni en la prensa de platos.

102
 4.2 Resultados

Tabla 13.- Zonas muestreadas en la bodega y número de colonias aisladas.

Nº colonias
Punto de muestreo No-Saccharomyces Saccharomyces
aisladas
Tolva recepción 0 0 0
Despalilladora 10 0 10
Estrujadora 4 4 0
Tolva bomba de pastas 0 0 0
Pared interior depósito 0 0 0
Boca salida depósito 10 10 0
Prensa de platos 0 0 0
Bomba trasiego 2 0 2
Pared 10 7 3
Suelo 10 8 2
TOTAL 46 29 17

Las levaduras No-Saccharomyces no se tipificaron, por lo que no pudo

determinarse el posible papel que éstas desempeñaron en la calidad final de los
vinos elaborados. Sí se pudo constatar que la población de No-Saccharomyces en
las distintas superficies de la bodega fue mayor que la de Saccharomyces, lo que en
principio parece contradecir lo apuntado por otros autores, que mostraron a la
especie S. cerevisiae como la principal colonizadora de las superficies de la bodega
(Pretorius, 2000; Beltrán et al., 2002). Así, Rosini (1984) demostró que, en los
meses que siguen a la vinificación, era esta especie la que permanecía en la bodega,
colonizando el equipamiento y las superficies de la misma. Vaughan-Martini y
Martini (1995) encontraron que las poblaciones de levaduras de la bodega eran
absolutamente distintas de las que vienen con la uva, siendo mayor el número de
Saccharomyces en la primera.

Sin embargo, los datos de este trabajo coincidieron con los aportados en
estudios previos por Ciani et al. (2004) y Santamaría et al. (2005, 2008), donde

103
4.2 Resultados

pudo verse como la presencia de levaduras No-Saccharomyces en las superficies de

las bodegas fue importante, incluso cuantitativamente mayor que la de las
levaduras de la especie S. cerevisiae. En trabajos más recientes también se observó
que la población de No-Saccharomyces fue superior a la de S. cerevisiae, y que son
levaduras que sobreviven a los métodos de limpieza empleados, identificándose
especies capaces de participar tanto en la FA como en la alteración los vinos (Ocón
et al., 2010b).

Las colonias No-Saccharomyces representaron el 100% de los aislados de

la estrujadora y de la boca de salida del depósito. Asimismo, fueron mayoritarias en
la pared y en el suelo (70% y 80%, respectivamente). No se identificaron en el
resto de los puntos muestreados.

Las colonias de Saccharomyces aisladas en distintas zonas de la bodega se

tipificaron a nivel clonal mediante el análisis del ADNmt, lo que permitió la
identificación de 7 clones distintos (Fig. 19). El clon I fue mayoritario (40%) y sólo
uno de ellos (clon VI) se aisló en más de una de las zonas muestreadas, la pared y
el suelo de la bodega (Fig. 20).

VII

VI

V
IV
No-Saccharomyces Saccharomyces
III
63% 37%
II

Figura 19.- Distribución y porcentaje de las levaduras aisladas en instalaciones y clones de

S. cerevisiae identificados.

104
 4.2 Resultados

La distribución de levaduras No-Saccharomyces y de clones de S.

cerevisiae en cada uno de los diez puntos muestreados en la bodega se muestra en
la Fig. 20, en la que se puede observar que en la despalilladora y en la bomba de
trasiego todas las colonias aisladas pertenecieron a la especie S. cerevisiae,
apareciendo tres clones diferentes en la primera (I, II y III) y un único clon en la
segunda (IV). En la estrujadora y en la boca de salida del depósito, todos los
aislados correspondieron al grupo No-Saccharomyces, mientras que en la pared y
en el suelo éstos se encontraron como mayoritarios, además de una pequeña
proporción de S. cerevisiae, incluyendo un clon común en ambos puntos (clon VI).

V V II
III
VI
VI
II

IV

I
tolva

tolva bomba pastas

pared

suelo
bomba trasiego
salida depósito
pared interior depósito

prensa
estrujadora
despalilladora

Figura 20.- Distribución (%) de colonias No-Saccharomyces ( N.S.) y de clones de S.

cerevisiae (I…VII) en los puntos muestreados en las instalaciones de la bodega

105
 4.2 Resultados

4.2.3.- Comparación de clones S. cerevisiae en aire, depósitos e instalaciones

Al comparar las cepas de S. cerevisiae aisladas en el aire de la zona de

recepción y elaboración de la bodega, con las aisladas en los depósitos en
fermentación, y así como con las identificadas previamente en las instalaciones, se
encontraron clones comunes (Tabla 14), lo que vino a confirmar el intercambio de
microorganismos entre estos medios.

Tabla 14.- Comparación de clones S. cerevisiae identificados en el aire, en las instalaciones

y en tres depósitos en fermentación de la bodega.
CLONES IDENTIFICADOS*
AIRE DEPÓSITOS
INSTALACIONES
RECEPCIÓN ELABORACIÓN A B C
II IT1 IT2 IA IB IC
III II T1 IIT2 IIA IIB IIC
IIII IIIT1 IIIT2 IIIA IIIB IIIC
IVI IVT1 IVT2 IVA IVB IVC
VI VT1 VT2 VA VB VC
VII VIT1 VIT2 VIA VIB VIC
VIII VIIT1 VIIT2 VIIA VIIB VIIC
VII T1 VIII T2 VIIIA VIIIB VIIIC
IXT1 IXT2 IXA IXB IXC
XT2 XA XB XC
XIT2 XIA XIB XIC
XIIT2 XIIA XIIB XIIC
XIIIT2 XIIIA XIIIB XIIIC
XIVT2 XIVA XIVB
XVT2 XVA
XVIT2 XVIA
XVIIT2 XVIIA
*Colores iguales indican que se trata XVIIIT2
del mismo clon de S: cerevisiae XIXT2
XXT2
XXIT2
XXIIT2
XXIIIT2
XXIVT2
XXVT2
XXVIT2

106
 4.2 Resultados

Así, teniendo en cuenta la distribución clonal de S. cerevisiae en las

instalaciones de la bodega, aire de la zona de elaboración y recepción y en los
mostos en fermentación de los tres depósitos estudiados (Tabla 14 y Fig. 21) se
pudo observar que:

 De los tres clones aislados en la despalilladora antes de iniciarse la

recepción de uva (II, III y IIII), el clon III se aisló en el ambiente de
la zona de elaboración de la bodega (clon VIIIT2) y en los tres
depósitos estudiados en momentos posteriores (clones IIIA, IXB y
IIC). Asimismo los clones II y IIII estuvieron presentes en el
ambiente de la bodega (XIT2 y IVT2) en los dos primeros depósitos
controlados: clones X A y IA en el depósito A y clones IVB y IIIB en
el depósito B.

 El clon VII, aislado en la pared y en el suelo de la bodega, también

se identificó en el aire de las zonas de elaboración (clon IT2) y de
recepción (clon IT1) y en dos de los tres depósitos: clon IX A en el
depósito A y clon XIIIC en el depósito C.

 El clon VI procedente de la pared de la bodega sólo se detectó al

inicio de la fermentación del depósito B (clon IIB).

 Los otros dos clones que se aislaron en la bomba de trasiego (IV I)

y en el suelo (VIII) no se detectaron ni en aire ni en los depósitos
en fermentación.

 En el depósito A, en las fechas en que fue muestreado, sólo se aisló

un clon simultáneamente en el depósito y en el aire, clon IX A y IT2
respectivamente, coincidiendo con el final de la fermentación del
mismo.

107
4.2 Resultados

Instalaciones

III
Aire: zona de elaboración
II
V XIV XXI XXIV XXV XXVI
III
X XIX XXII XXIII VIII
IV VII XIII XXIII
XV XVIII
XII
I II
XI
XI XX
V VIII
XVII IX
VII
VI IX IX VIII
VI VI XVII
VI
VIII
tolva

tolva bomba pastas

pared

suelo
bomba trasiego
salida depósito
pared interior depósito

prensa
estrujadora
despalilladora

IV VIII IV
XVI
I VI I

8 nov.
5 oct.

9 oct.

11 oct.

16 oct.

20 oct.

24 oct.

31 oct.
Fechas de muestreos

Superficies muestreadas

Depósito A
II S.p. XVI

I XV
Depósito B
VIII
XIV
VII XII XIV

VII
XIII
VI XI XIII Depósito C
XII
XI
V XI I X IX
I XII
IV XVII X VII
II IX
VI VI XI
X V VIII *
V XIII
III IX
IX IV III X

III VIII
2-oct.

5-oct.

9-oct.

VIII VIII

III III IV
II
9-oct.

11-oct.

16-oct.

II

Fechas muestreo depósitos

16-oct.

20-oct.

24-oct.

Figura 21.- Distribución (%) y comparación de clones de S. cerevisiae en las superficies de

la bodega, aire y depósitos estudiados. Colores iguales indican que se trata del mismo clon.
* S. bayanus.

108
 4.2 Resultados

Sin embargo, cinco clones de este depósito fueron detectados

posteriormente en el aire (clones IA, IIIA, VIA, XA y XVIIA). Este
resultado pudo deberse a que al tratarse del primer depósito
encubado en la bodega la presencia de levaduras S. cerevisiae en el
ambiente era todavía baja. No ocurrió así con los clones de las
instalaciones puesto que cuatro de ellos estuvieron presentes en
dicho depósito, lo que supondría que por contacto pasaron al
mosto/vino

 En el depósito B, encubado a mitad de campaña, ocho de los 14

clones aislados en vinificación también se identificaron en el aire,
bien en el mismo momento de elaboración o en momentos
posteriores. Las tres cepas de S. cerevisiae presentes en la
despalilladora también se aislaron en este depósito, además el clon
IIB coincidió con el aislado en la pared (clon V I).

 En el último depósito (C) encubado en la bodega esa campaña se

observó que seis de los trece clones identificados (IIC, IIIC, IVC,
VIIIC, XC y XIIIC) coincidieron con otros detectados en el ambiente
días antes (VIIIT2, XVIIT2, XXT2, XIIIT2, VIT2 y IT2), lo que vino a
confirmar que el aire fue el agente diseminador de estos
microorganismos. Otros dos clones de este depósito (IIC y XIIIC)
coincidieron con cepas aisladas en las instalaciones (despalilladora
clon III, pared y suelo clon VII).

 De los 26 clones aislados e identificados en el aire de la zona de

C
elaboración a lo largo de todo el proceso, dos de ellos (IT1 y IVT1)
se encontraron también en el ambiente de la tolva de recepción y
cuatro en las instalaciones de la bodega (II, III, IIII y VII).

109
4.2 Resultados

Asimismo diez de ellos también se detectaron entre los aislados en

los mostos en fermentación.

A la vista de estos resultados, puede concluirse que se produjo un

intercambio de cepas de S. cerevisiae entre las superficies de la bodega, el medio
líquido (mosto/vino) y el gaseoso.

110
 4.3
ESTUDIO DEL AIRE COMO VÍA DE DISEMINACIÓN
DE LAS BACTERIAS LÁCTICAS RESPONSABLES DE
LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA.

Presence of lactic bacteria in the air of a winery during the

vinification period.

Artículo publicado en:

International Journal of Food Microbiology

2009, 136, 142-146

 4.3 Resultados

Resumen

Las bacterias lácticas están presentes durante todas las etapas de

vinificación y, al igual que las levaduras, entran con la uva y permanecen en el
equipamiento de las bodegas tras la fermentación maloláctica. En las primeras
etapas de la elaboración se encuentran en bajo número y pertenecen principalmente
a los géneros Lactobacillus y Pediococcus. Sin embargo, a medida que avanza la
vinificación se seleccionan las cepas resistentes al alcohol, que pertenecen
principalmente a la especie Oenococcus oeni. Esta bacteria tiene una elevada
tolerancia a las condiciones del vino y por ello es el microorganismo mayoritario
durante la FML. Cuando se inicia la FML en los primeros depósitos se produce un
aumento del número de bacterias y éstas se diseminan por la bodega a través del
utillaje, insectos, y... probablemente el aire, contaminando de esta forma todo el
ecosistema.

En el trabajo presentado en el Apdo. 4.1 ya se había comprobado que

cuando en los depósitos de la bodega se estaba desarrollando la FML se
producía una proyección de BL al aire de la zona de vinificación,
incrementándose la presencia de dichos microorganismos en ese medio.
Para completar dicho estudio, el objetivo planteado en este ensayo fue:

Comparar la población de BL presentes en dos hábitats de

una bodega: en el aire de la zona de vinificación y en los
depósitos en fermentación, con el fin de evaluar el posible
intercambio de estos microorganismos entre ambos
medios.

113
4.3 Resultados

En la literatura no se ha encontrado información acerca de la

presencia de BL en el aire de las bodegas, y muy poca sobre la presencia de
otros microorganismos enológicos en este medio. Se trataba por tanto de estudiar la
posibilidad de que el aire actúe como vía de diseminación de BL en la bodega a lo
largo del periodo de vinificación.

El trabajo se llevó a cabo durante los meses de septiembre de 2007 a julio

de 2008 en la Bodega Cooperativa Vinícola Riojana de Alcanadre (La Rioja,
España) (Segundo ensayo especificado en el Apdo. 3.1.1.2). En esta bodega, al
igual que en la del Ensayo anterior, las fermentaciones, tanto alcohólica como
maloláctica transcurren de forma espontánea, sin inoculación de microorganismos
seleccionados. Los muestreos del aire se iniciaron quince días antes de la entrada
de uva en la bodega y concluyeron un mes después de haber finalizado la última
FML. Las condiciones particularmente frías de la vendimia de 2007 retrasaron el
inicio de las FML en la Cooperativa, y una vez iniciadas no se generalizaron en
todos los depósitos, sino que lo hicieron de forma lenta y sucesiva en depósitos
aislados, por lo que las fermentaciones se prolongaron hasta el mes de junio. En
total se realizaron 19 muestreos, los 6 primeros durante el período de entrada de
uva en la bodega y fermentación alcohólica, y los restantes durante los meses de
desarrollo de la FML espontánea.

El equipo empleado fue el muestreador ambiental airIDEAL 3P con placas

Petri que contenían MRS-modificado, medio selectivo específico para BL. En cada
toma de muestra de aire también se tomaron muestras en el depósito de vinificación
más próximo a la zona de muestreo del aire, con el fin de analizar y comparar las
bacterias presentes al mismo tiempo en ambos medios. Las colonias aisladas del
medio MRS, procedentes tanto del aire como del vino, se sometieron a la tinción de
Gram y a un estudio morfológico mediante observación microscópica.
Posteriormente, se analizaron primero mediante PCR específica de BL para

114
 4.3 Resultados

determinar su pertenencia a dicho grupo y finalmente se determinaron las

pertenecientes a la especie O. oeni por PCR especie-específica. Las que no
pudieron ser identificadas por estos métodos fueron purificadas y secuenciadas por
Macrogen Inc. Facilities (Seoul, South Korea). Las bacterias pertenecientes a la
especie Oenococcus oeni fueron comparadas entre sí a nivel clonal mediante
electroforesis en campo pulsante (PFGE).

Durante el período estudiado, se detectó un número bajo de bacterias en el

aire debido probablemente a que la FML no tuvo lugar simultáneamente en todos
los depósitos de la bodega. En el trabajo presentado en el Apdo. 4.1 sí se detectó
un incremento significativo de la población bacteriana en el aire (500 NMP/m 3)
debido probablemente a la realización simultánea de la FML en todos los depósitos
y a las menores dimensiones del local de vinificación. En el presente estudio sólo
se aislaron bacterias en el aire en dos fases del proceso de vinificación: con la
entrada de uva en la bodega y cuando se detectó actividad maloláctica en alguno de
los depósitos. En el primer caso esta presencia pudo estar relacionada con la carga
bacteriana que acompañó a la uva y en el segundo con el desarrollo de BL durante
la FML en los depósitos, que por efecto del gas carbónico desprendido fueran
expulsadas al ambiente exterior. Durante el desarrollo de las FML los valores de
bacterias detectadas en el aire solo alcanzaron 9 NMP/m3. Curiosamente en este
estudio el número más alto de bacterias en el aire (328 NMP/m 3) se detectó cuando
la degradación del ácido málico ya había terminado en todos los depósitos,
coincidiendo con el trasiego de un vino que había terminado la transformación
unos días antes. Estas observaciones sugirieron que la causa de este incremento de
bacterias en el aire se debió a la manipulación del vino cargado de estos
microorganismos.

Todas las bacterias aisladas en el aire antes del comienzo de las

fermentaciones malolácticas pertenecieron al grupo de BL (Pediococcus

115
4.3 Resultados

pentosaceus y Leuconostoc mesenteroides), pero no a la especie Oenococcus oeni.

Sin embargo, a partir del inicio de la FML en la bodega, las bacterias aisladas tanto
en el aire como en los depósitos pertenecieron a dicha especie. Al analizar la
presencia de cepas de Oenococcus oeni comunes en el aire y en el vino en cada
muestreo, se detectaron coincidencias en todos los momentos, con la excepción del
depósito en el que tuvo lugar la primera FML. Sin embargo, el clon mayoritario
detectado en el vino en ese momento estuvo presente en el aire en los siguientes
muestreos. De igual modo, otros clones de O. oeni coincidieron en aire y vino en
tomas sucesivas. El porcentaje de clones comunes fue mayor o menor en función
de las distintas condiciones de cada momento, puesto que la FML no se desarrolló
de forma simultánea en todos los depósitos de la bodega, debido a las
peculiaridades de esa vendimia.

Los datos obtenidos mostraron la presencia simultánea de cepas iguales de

Oenococcus oeni en el aire de la bodega y en los depósitos de vinificación. Este
resultado indicaría el intercambio de bacterias entre ambos medios y sugeriría al
aire como elemento diseminador de estos microorganismos en la bodega, ligado
tanto a la FML como a los momentos de manipulación/trasvase del líquido.

116
 International Journal of Food Microbiology 136 (2009) 142–146

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International Journal of Food Microbiology

j o u r n a l h o m e p a g e : w w w. e l s ev i e r. c o m / l o c a t e / i j f o o d m i c r o

Short communication

Presence of lactic bacteria in the air of a winery during the vinification period
P. Garijo a, R. López a, P. Santamaría a, E. Ocón b, C. Olarte b, S. Sanz b, A.R. Gutiérrez b,⁎
a
ICVV, Instituto de Ciencias de la Vid y el Vino (CSIC, Gobierno de La Rioja), C/Madre de Dios 51, 26006 Logroño, Spain
b
Universidad de La Rioja, C/Madre de Dios 51, 26006 Logroño, Spain

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: In this paper we have studied the presence and evolution in the winery air of the lactic bacteria responsible
Received 15 July 2009 for malolactic fermentation. Sampling took place during the winemaking process (between September 2007
Accepted 14 August 2009 and July 2008) in a winery from the Rioja appellation in Spain. The results obtained indicated that the
presence of these microorganisms in the atmosphere was detected when grapes were entering the winery,
Keywords:
while malolactic fermentation was taking place, and when liquid containing bacteria was manipulated. The
Winery
Air
species and clones of the lactic bacteria identified were also related to those present in the vinification tanks
Lactic acid bacteria at any given stage of the process.
Malolactic fermentation © 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction
The conversion of must into wine occurs through alcoholic fer-
mentation (AF), a process performed by yeasts. This initial transfor-
mation is followed by what is known as malolactic fermentation
(MLF), caused by lactic bacteria. Both microbiological processes make
an essential contribution to the final quality of the product (Swiegers
et al., 2005). The origin of the yeasts and bacteria which take part in
the fermentation processes has two possible sources: the grapes and
the material in the winery environment (Fleet and Heard, 1993;
Mortimer and Polsinelli, 1999).
Lactic bacteria are present during all stages of vinification and, like
the yeasts, enter with the grapes and remain in the winery equipment
after MLF (Fugelsang and Edwards, 2007). Lactic acid bacteria have
been isolated from vine leaves, grapes, winery equipment, barrels, etc.
(Bae et al., 2006; Lonvaud-Funel, 1999). In the early stages of
winemaking (must and alcoholic fermentation) the lactic bacteria
are found in small numbers and mainly belong to the Lactobacillus and
Pediococcus genera. However, as alcoholic fermentation progresses,
only those strains which are able to resist alcohol are able to survive,
belonging to the Oenococcus oeni species, and these are the main
agents in MLF (Du Plessis et al., 2004; Reguant et al., 2005).
For many years, winemakers have found that the first spontaneous
(alcoholic and malolactic) fermentations which occur during each
harvest at the wineries take longer than subsequent ones (Peynaud,
1989). The reason would be due to the increase in microorganisms
which occurs in the first vat, and in their dispersal around the cellar
and arrival in large quantities in other vats in which the subsequent
⁎ Corresponding author. Tel.: +34 941299727; fax: +34 941299721.
E-mail address: ana-rosa.gutierrez@unirioja.es (A.R. Gutiérrez).
fermentations take place, and which would start up more quickly. This
dispersal could occur via the machinery, tools, insects and probably
the air. The yeasts and bacteria could be projected out of the vats via
the CO2 gas which is given off during alcoholic and malolactic
fermentation, spreading through the winery by this means (Garijo
et al., 2008). Recently, Granchi et al. (2007) have suggested that
Saccharomyces cerevisiae, which dominate the fermentation of the
first vat of each harvest, invade the winery environment and produce
a natural inoculation in the subsequent fermentations. Something
similar could happen with the lactic acid bacteria responsible for MLF.
In published literature, no information has been found on the
presence of lactic bacteria in the atmosphere of wineries, and very
little on the presence of other oenological microorganisms in this
medium. Only Beech (1993), in cider, found a relationship between
exposure of the liquid to air and contamination with Brettanomyces
yeasts, and Connell et al. (2002) found Brettanomyces yeasts in air
samples from different areas of a commercial wine cellar. Previously,
Donnelly (1977) used this approach in a winery bottling room.
Recently, Mandl et al. (2008) analyzed mold content in the air of
various Austrian wineries and Garijo et al. (2008) showed that the
presence in the air of various microorganisms (yeasts, molds and
bacteria) is linked to the oenological processes that are taking place in
the vats during the harvest period. In this work, it was stated that the
presence of lactic bacteria was not detected in the air of the
winemaking area until malolactic fermentation began in the vats. In
other food industries a relationship has been found between the lactic
bacteria present in the processing plant air and those responsible for
the contamination of the finished product (Korkeala and Björkroth,
1997; Vihavainen et al., 2007).
The aims of this work were to study the presence and evolution of
the lactic bacteria responsible for malolactic fermentation in the air of
a winery and compare these with those which are found in the nearby

0168-1605/$ – see front matter © 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2009.08.018
 P. Garijo et al. / International Journal of Food Microbiology 136 (2009) 142–146 143

vinification vats with the aim of evaluating the possible exchange of
these microorganisms between the two media.
2. Materials and methods
2.1. Sample collection
The research was carried out during the months of September
2007–July 2008 in a winery situated in the village of Alcanadre (La
Rioja, Spain). Sampling of the winery air began on September 18,
fifteen days before the first grapes were brought into the cellar, and
ended two weeks after the last malolactic fermentation was complete.
In total, 20 air samples were taken in the winery (Table 1).
Air samples were taken using the air IDEAL 3P air sampler from
BioMérieux, an impaction aerobiocollector used to detect the
presence of viable microorganisms in the environment to be tested
by precise sampling of a given volume of air. The samples were taken
from the point in the winery located in the middle of the winemaking
area or near to a vat in which MLF was in progress. The sampler was
placed on a platform 1 m above the ground. The study was made using
petri dishes with modified MRS-Agar (Scharlau Chemie S.A., Barce-
lona, Spain), a specific selective media for lactic bacteria, to which
50 mg/l of pimaricin was added to inhibit the growth of yeasts. The
volume of air analyzed in duplicate was 1500 l.
As well as the bacteria from the air, those present in the fer-
mentation vat nearest to the zone from which the air sample was taken
were also analyzed. All the wines analyzed, with the exception of
samples 15 and 18, came from different vats. The samples of liquid
were collected in sterile jars and taken to the laboratory for processing.
2.2. Microbial analyses
The plates were incubated under anaerobiosis at 30 °C for 10 days.
Some diphenyl crystals (approximately 100 mg per plate) (Panreac
Química SA, Barcelona, Spain), were added to the plates in order to
impede the development of molds. Colonies were counted and cell
populations (CFU) were calculated from duplicate analyses. Subse-
quently, this value was converted into the most probable number of
microorganisms collected per plate (MPN), using a statistical
correction table included in the equipment's instruction manual.
Finally, the most probable number of microorganisms collected was
expressed as MPN/m3. From each plate, a maximum of twenty
colonies were randomly selected and stored in frozen tubes with
skimmed milk for later analysis.
Must and wine samples were serially diluted and 0.1 ml was
inoculated onto plates of modified MRS-Agar medium with pimaricin
that was incubated in anaerobiosis (GasPak. Oxoid Ltd., Basingstoke,
England) at 30 °C for ten days and viable counts were obtained as the
number of CFU/ml. Plates containing bacteria colonies were examined
and twenty colonies were randomly selected and stored in frozen
tubes with skimmed milk for later analysis.
All bacteria isolated both in the air (62 colonies) and in liquid (120
colonies) were analyzed via PCR to detect those belonging to the
group of lactic bacteria (Van de Klundert and Vliegenthart, 1993). The
sequences of the primers used were Rrs1 (GGATTAGATACCCTGG-
TAGTCC) and Rrs2 (TCGTTGCGGGACTTAACCCAAC). These PCR pro-
ducts were purified and sequenced by Macrogen Inc. facilities (Seoul,
South Korea) in order to determine the species of lactic bacteria each
isolate belonged to (retrieved from GenBank: www.ncbi.nlm.nih.gov/
blast/blast.cgi).
Subsequently, the O. oeni species was confirmed by the species-
specific PCR method described by Zapparoli et al. (1998) based on the
amplification of a fragment of the gene of the specific malolactic
enzyme of that species. The sequences of the primers used in the
identification were Lo-1 (TAATGTGGTTCTTGAGGAGAAAAT) and Lo-2
(ATCATCGTCAAACAAGAGGCCTT). The amplification reaction was
conducted in an Applied Biosystems (GeneAmp PCR System 2700)
thermocycler. For visualizing the amplified fragments the horizontal
agarose gel electrophoresis technique was used, prepared with
agarose (Bio-Rad) at a concentration of 1% in a TBE 0.5× tampon,
staining of gel by immersion in ethidium bromide (2 μg/ml), and
visualization in an ultraviolet transilluminator with an image
capturing system (GEL DOC, Bio-Rad, Madrid, Spain). The molecular
weight marker used was the Hyper Ladder IV (Bio-Rad).
Finally, the classification of types of O. oeni clones was conducted
via Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) using the restriction
enzyme SfiI and the CHEF-DR II (Bio-Rad) system, according to the
method described by Birren and Lai (1993) with some modifications
for agarose blocks preparation (López et al., 2007). Electrophoresis
was performed at 14 °C at a constant voltage of 4.5 V/cm with a switch
time ramped from 5 to 45 s over 24 h period. Gels were stained with
ethidium bromide (0.5 µg/ml) and photographed under UV light. The
FPQuest™ 4.5 software (Bio-Rad) was used for conversion, normal-
ization, and further processing of images. Comparison of the PFGE

Table 1
Conditions of vinification and evolution of MPN/m3 of lactic bacteria in the air of the vinification area and of the CUF/ml in the wine in a vinification tank during the period
September 2007–July 2008.

Sample Date Conditions of vinification in the winery MPN/m3 in air CUF/ml in must/wine

0 18-September Cellar empty. Before grapes entered 0 –

1 2-October Entry of grapes into the winery 4 125
2 5-October Entry of grapes into the winery. AF 0 –
3 11-October Entry of grapes into the winery. AF 4 400
4 17-October Alcoholic fermentation 0 –
5 31-October Alcoholic fermentation 0 –
6 14-November No AF/No MLF 0 –
7 22-November No AF/No MLF 0 –
8 26-November No AF/No MLF 0 –
9 5-December Slow MLF in isolated vat 4 27 × 105
10 27-December Slow MLF in isolated vat 0 –
11 24-January Slow MLF in isolated vat 3 36 × 105
12 28-February No MLF 0 –
13 3-April No MLF 0 –
14 9-May No MLF 0 –
15 26-May Slow MLF in 4 vats in the winery 9 63 × 104
16 30-May Slow MLF in 2 vats 0 –
17 5-June Slow MLF in 2 vats 0 –
18 13-June Emptying of vat with completed MLF and slow MLF in 2 vats 328 98 × 104
19 5-July No MLF 0 –

AF: alcoholic fermentation. MLF: malolactic fermentation.

144 P. Garijo et al. / International Journal of Food Microbiology 136 (2009) 142–146
patterns obtained was performed with Pearson's product-moment
correlation coefficient and the Unweighted Pair Group Method using
Arithmetical averages (UPGMA) (Fig. 1).
3. Results and discussion
3.1. Lactic bacteria in the winery air
During the period studied, a low number of bacteria were detected
in the air (Table 1), probably due to the fact that malolactic
fermentation had not occurred simultaneously in all the winery's
vats. In most wineries, once alcoholic fermentation is complete, MLF
usually starts up spontaneously. However, this spontaneous activity is
unpredictable, since there are many factors which affect the growth
and development of lactic bacteria in the wine (Carreté et al., 2002)
and, consequently, malolactic transformation.
As can be seen in Table 1, bacteria have only been isolated from
the air in two stages of the vinification process: when the grapes
came into the winery and when malolactic activity was detected
in any isolated vat. In the first case, this presence could be linked to
the bacterial load which accompanies the grapes, and in the second,
to the development of lactic bacteria during malolactic fermenta-
tion in one of the vats, which are given off outside the tanks due
to the carbonic gas produced. However, the values in this latter
case are very low if we compare the ones obtained by Garijo et al.
(2008), which reached levels close to 500 MPN/m3 when all of
the tanks in the cellar were undergoing malolactic fermentation. In
this study, the maximum value reached during MLF was 9 MPN/m3.
The numerical discrepancies found would be accounted for by
the fact that in the previously mentioned study, all the tanks were
undergoing MLF simultaneously. In our case, the highest value for
bacteria in the air (328 MPN/m3) was detected when MLF had
finished in nearly all the vats, coinciding with emptying and cleaning
one of them that had finished a few days earlier (sample no. 18). This
suggests that the fact that a large quantity of lactic bacteria passed
into the air was due to the handling of the liquid charged with these
microorganisms.
These data would seem to indicate that the potential dissemina-
tion and/or contamination of lactic bacteria in the winery through the
medium of the air, could occur when the product containing the
bacteria is moved (grapes or wine). The handling may be mechanical
(movement of grapes or wine), or caused by the carbonic gas which is
given off during MLF. The handling of wine loaded with microorgan-
isms as the source of these found in the air was already noted by
Fig. 1. UPGMA dendrogram based on the SfiI PFGE patterns of the 8 Oenococcus oeni strains isolated from air in this study.
Garijo et al. (2008) who found that the levels of microorganisms in the
air during AF were much higher than those of MLF, due to pumping
over and the greater quantity of carbon dioxide freed in the first
transformation.
Specific PCR analysis for lactic bacteria from the bacteria isolated
from the air indicated that they all belonged to this group. The lactic
bacteria isolated in the winery air in the first moments of the harvest
period (samples 1 and 3) were identified as belonging to the Leuco-
nostoc mesenteroides and Pediococcus pentosaceus species. These
species of bacteria are normally associated with grapes and the
vinification process but they are not normally the ones responsible for
triggering malolactic fermentation (Landete, 2005; Krieger, 2006;
Renouf et al., 2006). In addition, all the lactic bacteria isolated from
sample 9 onwards belonged to the O. oeni species. These results
would be because the bacteria were isolated in the air at times when
some tank in the winery was undergoing malolactic fermentation, a
transformation mainly conducted by bacteria of this species (Prama-
teftaki et al., 2006).
3.2. Lactic bacteria isolated in musts and wines
The lactic bacteria present in the vinification vats during the first
samples were also there in low quantities (Table 1). Such low
populations in the wines could be due to the low ambient temperature
in the winery during the period studied, and would explain the slowness
of the malolactic fermentation in all the vats (Henick-Kling, 1993).
Of the colonies isolated in each of the previously mentioned
moments, most of those from samples 1 and 3 did not belong to the O.
oeni species (93% and 100% respectively), which would coincide with
the lactic population commonly detected in the must or at the start of
alcoholic fermentation. However, once malolactic fermentation began
in the wine, all the isolates of lactic bacteria in the wine belonged to
that species. O. oeni has a high tolerance to the conditions of wine
(Lonvaud-Funel, 1995) and hence it is the majority microorganism
during malolactic fermentation (Renouf et al., 2006). Various authors
have reported this situation in different winemaking regions
(Pramateftaki et al., 2006; Tenorio et al., 2007; Ruiz et al., 2008).
3.3. Strains of O. oeni in the air and in the wines
The data for lactic bacteria obtained from the air and from the
vinification vats would be totally linked: O. oeni, the agent of malolactic
fermentation, appear simultaneously in both media and in identical
proportions (100%), once malolactic fermentation began in the vats. On
 P. Garijo et al. / International Journal of Food Microbiology 136 (2009) 142–146 145

the other hand, when there is no malolactic fermentation in the wine, O.
oeni is not detected in either the wine or the air.
When analyzing the clones of O. oeni isolated from the air during
the season (Table 2), it was observed that 2 of the 8 clones identified
in this medium (I and II), were present in 3 of the 4 samples in which
bacteria of this species were detected in the air. The diversity of clones
of the O. oeni species in the air was variable: initially one single clone
was found (sample 9), then 2 (sample 11) and finally 7 and 3 different
clones (samples 15 and 18 respectively). At the moment at which
the greatest diversity was detected (sample 15), four tanks were
undergoing MLF that could have led to a greater number of bacteria
coming from each of the 4 tanks being projected into the atmosphere,
producing a more complex population. The diversity of clones of the
O. oeni species found in the air seems high at first sight (Table 2).
However, there are no data for lactic bacteria in the air of wineries
with which to compare these results. However, there are studies
conducted in other food industries in which there are references to
the high diversity of species and clones of lactic bacteria present in the
air of the plants (Vihavainen et al., 2007).
When studying the clones of the O. oeni species isolated from the
wines during the harvest period, it was noticed that the two principal
clones detected in the air also appeared in this medium in important
proportions, particularly clone II, which was detected at three of the
four points studied. As in the case of the air, the diversity of clones was
also variable during the harvest period (2, 4, 3 and 4 different clones).
The clonal diversity of O. oeni in malolactic fermentation is variable in
the different studies consulted. Thus, Reguant and Bordons (2003),
Palacios et al. (2004) and Pramateftaki et al. (2006), all found little
diversity of strains, while Bartowsky et al. (2003) and Tenorio et al.
(2007) found a wide diversity between the strains responsible for
spontaneous malolactic fermentation.
When analyzing the presence of clones common to the air and the
wine in each sample, we found that the percentage of clones in
common was greater or lesser depending on the different conditions
prevailing at a given moment. However, coincidences were detected
at each point of sampling except number 9, which may be due to MLF
having just started in the cellar, since the vat analyzed at this point
was the first to begin this transformation during the harvest time
studied. However, the majority clone detected in the wine at that
moment (II) is found in the air in subsequent samples. In contrast, in
sample number 11, the only two clones detected in the air (I and II)
are the majority ones in the wine (30% and 50% respectively). In
sample 15 the two strains in the wine and in the air coincide (clones
IV and V), which between them represent 25% and 40% respectively of
the total clones in each medium. In sample 18 clones II and IV were
detected simultaneously in the air and in the wine, representing
between them 90% and 55% respectively of the total population. Garijo
et al. (2008), studying S. cerevisiae clones in the air and in nearby vats
also found a coincidence between them in both media which led them
to conclude that in alcoholic fermentation there was an exchange of
yeasts between the liquid medium in fermentation and the gaseous
one (the air), which could indicate that the air in itself could be an as
yet unstudied means for the dispersal of microorganisms within the
winery and for the inoculation of tanks. As can be seen in this study,
this hypothesis would also be valid for the lactic bacteria responsible
for malolactic fermentation. The strains present in the liquid would
pass into the air and in this way would spread around the cellar, so
that they could fall into other wines and thereby contaminate them.
Their subsequent development in these vats would depend on the
greater or lesser adaptation to the conditions of the new wine. This
continuous exchange between the two media would explain the
presence of common strains of O. oeni in both media and their
different proportion during the period under study.
4. Conclusions
The results of this study confirm the role of the air in spreading
vinification microorganisms through the wine cellar. In a previous work
we studied the dispersal of winemaking yeast by this route and this
study has concluded that this hypothesis is also valid as an explanation
of the spread of lactic bacteria in the cellar. The data obtained indicate
the simultaneous presence of the same species and strains of lactic
bacteria in the winery air and in the vinification vats. This result would
indicate the exchange of bacteria between the two media and would
suggest that the air is a factor in the spread of these microorganisms in
the wine cellar, associated with malolactic fermentation and, principal-
ly, with the moments when the liquid is moved/racked. This hypothesis
suggests the possibility that during such manipulation, other micro-
organisms can be spread through the air which has an effect on the
vinification process and the conservation of the wines. Nevertheless, the
low number of bacteria isolated in the air at certain points during this
study, plus the fact that it is the first known study on this topic to date,
makes it necessary to deepen knowledge of the microbiology of winery
air and the role that this medium has in the dissemination, inoculation
and contamination of must and wine.
Acknowledgements
This study has been undertaken with a grant from the Government
of La Rioja (R-10-07 and FOMENTA 2007/04 Projects), and was made
possible with the collaboration of the Bodega Cooperativa Vinícola
Riojana de Alcanadre (La Rioja, Spain).

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Table 2
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 4.4
ESTUDIO DE LA PRESENCIA Y EVOLUCIÓN DE LOS
MICROORGANISMOS DE INTERÉS ENOLÓGICO EN
LAS UVAS Y EN EL AIRE DEL VIÑEDO

Presence of enological microorganisms in the grapes and the

air of a vineyard during the ripening period.

Artículo publicado en:

European Food Research and Technology

2011, 233, 359-365

 4.4 Resultados

Resumen

Las uvas se han considerado como la primera fuente de microorganismos

indígenas del vino, pero estos microorganismos necesitan un vector para llegar
hasta ellas. En los últimos años se han mostrado opiniones tanto a favor como en
contra del aire como agente diseminador de los microorganismos en el viñedo.
Por ello, se planteó el siguiente objetivo:

Comparar las levaduras y bacterias de interés enológico

presentes simultáneamente en las uvas y en el aire de un
viñedo durante las semanas previas a la vendimia, para poder
determinar el papel que el aire/viento pudiera tener en la
diseminación de estos microorganismos en el viñedo.

La investigación se llevó a cabo durante el período de maduración de las

uvas en los años 2008 y 2009, en un viñedo situado en Agoncillo (La Rioja). Se
efectuaron cinco muestreos en uvas y aire en las semanas previas a la vendimia,
coincidiendo el último con la fecha de recolección. La muestra de uvas consistió
en un racimo recogido en una cepa próxima a la zona de toma de muestras de aire,
que se transportó en condiciones estériles hasta el laboratorio. Una vez allí, se
colocó en una solución isotónica estéril en un agitador orbital a 150 rpm durante 1
h. De la solución se tomaron 100 µl y se sembraron en placas Petri con medios
adecuados para el aislamiento de levaduras (CGA) y BL (MRS- Agar con
pimaricina). Las muestras de aire se tomaron con el equipo airIDEAL 3P junto a
la cepa donde se recogieron los racimos, con placas con medios de cultivo
selectivos específicos para cada microorganismo objeto del estudio.

De cada placa de CGA procedente de aire y uvas se aislaron un máximo

de 20 colonias de levaduras, que posteriormente fueron identificadas mediante

125
4.4 Resultados

PCR-RFLP de la región 5,8S-ITS del ADN ribosomal. Cuando no fue posible

identificar los perfiles obtenidos con los descritos en la bibliografía, los productos
de PCR fueron purificados y secuenciados por Macrogen Inc. Facilities (Seoul,
South Korea).

Todas las bacterias aisladas de placas con MRS-modificado fueron

analizadas por PCR para determinar su pertenencia o no al grupo de BL y, en este
caso, secuenciadas por Macrogen para determinar la especie a la que pertenecían
cada una de ellas.

Cada día de muestreo se tomaron datos sobre las condiciones ambientales

de temperatura, radiación, viento, lluvia, etc.

De los dos tipos de microorganismos de interés enológico estudiados, sólo

las levaduras estuvieron presentes en las dos campañas en prácticamente todos los
muestreos efectuados, tanto en los racimos como en el aire, observándose además
que durante el periodo de maduración la población de levaduras en el viñedo fue
aumentando en uvas y en aire. No obstante, el número de levaduras detectadas en
el aire fue mucho menor que en los racimos y similar en los dos años. La causa de
las diferencias entre los dos habitats pudo deberse a que en las dos campañas
estudiadas no se produjeron ni vientos fuertes ni lluvias intensas durante los
muestreos, que pudieran provocar movimientos bruscos de los racimos y con ello
el paso de los microorganismos de los racimos al aire. Hubo una gran diferencia
entre las poblaciones de levaduras encontradas en los racimos en 2008 y 2009,
diferencias que pudieron deberse a las condiciones climáticas de cada año. Así, el
primer año las temperaturas fueron suaves y no hubo días soleados, mientras que
el segundo año la campaña se adelantó 15 días y las temperaturas fueron más
elevadas, con días de fuerte irradiación.

126
 4.4 Resultados

La población de levaduras, en ambos habitats, estuvo dominada por la

especie Aureobasidium pullulans a lo largo de todo el período estudiado. Esta
levadura estuvo presente en todas las muestras en un elevado porcentaje, lo que
la convirtió en la principal levadura del viñedo, a pesar de ser tecnológicamente
irrelevante en los procesos de vinificación. Junto a ella, otras levaduras que
aparecieron tanto en el aire como en las uvas fueron Candida spp. y en menor
medida Hanseniaspora uvarum. Algunas levaduras sólo se detectaron en racimos
(Saccharomyces cerevisiae y Acremonium strictum) y otras sólo en aire
(Rhodosporidium babjevae, Sporothrix spp., Kabatiella microsticta y Pichia
kluyveri).

Al comparar los microorganismos recolectados en el aire con los aislados

en los racimos de uva, se observó que las levaduras No-Saccharomyces
mayoritarias en el aire del viñedo son muy similares a las encontradas en los
racimos de uva durante el período de maduración, lo que podría sugerir un
intercambio de microorganismos entre ambos medios.

La presencia de BL no tuvo continuidad. En 2008 no se detectaron ni en

aire, ni en uvas. En 2009 se aislaron en racimos y en el aire en dos de los cinco
momentos estudiados. A pesar de detectarse un número muy bajo de bacterias,
todas ellas pertenecieron al grupo de BL de interés enológico. Las colonias
aisladas en el aire pertenecieron a la especie Pediococcus pentosaceus y en los
racimos a las especies Pediococcus pentosaceus y Oenococcus oeni.

A pesar de que en las uvas se aislaron los principales agentes de las

fermentaciones alcohólica y maloláctica, Saccharomyces cerevisiae y Oenococcus
oeni, éstos no se encontraron en el aire del viñedo.

La ausencia y/o el bajo número de bacterias y el limitado número de

levaduras aisladas del aire en el presente trabajo no permitieron extraer

127
4.4 Resultados

conclusiones definitivas sobre el aire como agente diseminador de

microorganismos en el viñedo. Por ello, se hace necesario profundizar en el
conocimiento de la microbiología del aire del viñedo y en el papel de este medio
en la dispersión, inoculación y contaminación de las uvas por levaduras y
bacterias.

128
Eur Food Res Technol (2011) 233:359–365
DOI 10.1007/s00217-011-1528-3
ORIGINAL PAPER
Presence of enological microorganisms in the grapes and the air
of a vineyard during the ripening period
P. Garijo • R. López • P. Santamarı́a •
E. Ocón • C. Olarte • S. Sanz • A. R. Gutiérrez
Received: 5 April 2011 / Revised: 6 June 2011 / Accepted: 11 June 2011 / Published online: 28 June 2011
Ó Springer-Verlag 2011
Abstract This study looks at the presence and evolution
of yeast and lactic bacteria in the air of a vineyard during
the 4 weeks up to harvesting. The work was conducted in
two successive harvests (2008 and 2009) in a vineyard of
Tempranillo grapes cultivated under the DOCa Rioja
(Spain). The microorganisms collected from the air were
compared with those isolated at the same time from the
grape clusters, in order to analyze the air as a means of
dispersal of the microorganisms present on the grapes
inside the vineyard. A very low number of bacteria were
detected on the clusters and in the air, but they all belonged
to the group of lactic bacteria of enological interest. In the
case of yeasts, the results obtained indicate that their
presence in the air is much lower than that detected on the
clusters, but that there continues to be a growing evolution
in both media throughout the ripening period. In addition,
the main species detected are similar in both cases, so that
it can be suggested that the yeasts detected in the air are
representative of the ones found on the grapes. However,
although we isolated the main agents of alcoholic and
malolactic fermentation, Saccharomyces cerevisiae and
Oenococcus oeni, from the grapes, these were not found in
the air.
Keywords Yeasts
Lactic bacteria
Air
Vineyard

Grapes
P. Garijo
R. López
P. Santamarı́a
E. Ocón
C. Olarte

S. Sanz
A. R. Gutiérrez (&)
ICVV, Instituto de Ciencias de la Vid y el Vino (CSIC, Gobierno
de la Rioja, Universidad de La Rioja), C/Madre de Dios 51,
26006 Logroño, Spain
e-mail: ana-rosa.gutierrez@unirioja.es
Introduction
Grapes have long been considered the primary source of
indigenous wine microorganisms. But these microorgan-
isms need a vector to reach the grapes. Some researchers
believe that they are brought to the berries due to the effect
of dispersal by the wind [1] and principally by insects such
as bees, wasps and Drosophila [2, 3]. Hansen’s model of
yeast circulation in nature [4] indicated that yeast cells are
normal residents from the surface of fruits; from there, they
may reach the soil that is their winter milieu, either washed
off by rain or along with the fallen fruits. At the beginning
of the summer, cells are transported back to the fruits by
the shuttling activity of winds and air currents. However,
Benda [5] indicated that yeasts are transferred to grapes by
insects and that wind is not responsible for the transfer of
yeast cells to grape berries.
The population of non-Saccharomyces yeasts that
appear on the grapes is very variable. The spread of species
varies from one geographical zone to another, and from
one vintage to another, due to the influence of the tem-
perature, rainfall, moisture, insects, health of the grape,
growing practices, etc., although the same genera are
almost always observed [6]. But several studies have
shown that the main fermentative yeast, Saccharomyces
cerevisiae, is practically absent from grapes and vineyard
soil [7]. Hence, the source of this yeast is open to debate
and two theories exist: one claims that damaged grapes
(whether by molds, insects, too much water or birds) serve
as a deposit for microorganisms, including S. cerevisiae,
while the second theory says the main source is the winery
environment, although it does not rule out a minority
presence on the grapes [8]. Mortimer and Polsinelli [2]
affirmed that S. cerevisiae is not moved around by the wind
in the vineyard because it is not an airborne contaminant.
123
360
However, previously, Adams [9] had demonstrated the
presence of this species in vineyard air. Santamarı́a [10]
attributed the appearance of the same S. cerevisiae strain in
the grapes in four nearby wineries, to the strong winds
experienced during the harvest period in the zone, and
Valero et al. [11] also opted for this dispersal method to
explain the appearance of these yeasts in vineyards far
away from the wineries where they had been sown.
Consequently, the aim of this study was to compare the
yeasts and enological bacteria found simultaneously on the
grapes and in the vineyard air during the weeks leading up
to the harvest, and to analyze the role of the air/wind in the
dispersal of enological microorganisms in the vineyard.
The role that this medium plays in the dissemination of
yeasts and bacteria responsible for alcoholic and malolactic
fermentation in the winery has been shown in previous
studies [12, 13].
Materials and methods
Sample collection
The research was carried out during the grape ripening
period of the 2008 and 2009 vintages in a vineyard situated
in the village of Agoncillo (La Rioja, Spain). The samples
were taken from two points (two stocks) in the middle of
the vineyard. Samples were taken during the 4 weeks prior
to harvesting (five samples in all). Air and grape samples
were taken in duplicate from each of the two points. In
addition, data concerning the environmental conditions at
each sampling (temperature, sun, wind, rain) were
recorded.
From each of the vines, a cluster was cut using ethanol-
sterilized shears and placed in a sterile plastic bag for
transfer to the laboratory. At the laboratory, it was
weighed, placed in a sterile flask containing 400 mL of an
isotonic solution and shaken in an orbital shaker at
150 rpm for 1 h in order to wash it and to release the
microorganisms. From the saline solution, these were sown
on petri dishes in duplicate quantities of 100 ll with a
suitable medium for isolating yeasts (Chloramphenicol
Glucose Agar: 5% yeast extract, 20% glucose, 0.5%
chloramphenicol, 17% agar) and lactic bacteria (Modified
selective MRS agar with pimaricin: 52% MRS broth, 6%
fructose, 5% D,L malic acid, 10% tomato juice, 0.5%
L-cystein CHL, 30% agar, 0.5% pimaricin).
Air samples were collected between 10:00. and 13:00.
using the airIDEAL 3P air sampler from BioMérieux, an
impaction aerobiocollector used to detect the presence of
viable microorganisms in the environment to be tested by
precise sampling of a given volume of air. Air is taken up
with a turbine through a grid surface (rate of flow
123
Eur Food Res Technol (2011) 233:359–365
100 L min-1). The acceleration of airflow results in the
impaction of airborne microorganisms on the agar. Passage
of the air through the grid filters out particles, thereby
facilitating the enumeration of CFU (colony-forming units)
after incubation of the medium. The sampler was placed on
a platform 0.5 m above the ground in the middle of the
space between rows in the vineyard, near the corresponding
vine stock. The study was made using petri dishes with
Chloramphenicol Glucose Agar and Modified MRS agar
with pimaricin, the appropriate media for isolating yeasts
and lactic acid bacteria, respectively. The volume of air
analyzed in duplicate in both cases was 1,500 L.
Samples in 2008 were taken on 11th, 19th, 25th Sep-
tember and 3rd, 10th October. In the second year (2009),
the weather conditions were very favorable for maturation
of the grapes from the zone and the whole process was
carried out about 15 days earlier. Consequently, the sam-
pling dates were 27th August, 3rd, 10th, 17th and 24th
September. The final sample analyzed each year corre-
sponded to the moment of harvesting.
Microbial analyses
The yeast plates were incubated at 25 °C for 72 h, and the
bacteria plates were incubated under anaerobiosis (GasPak.
Oxoid Ltd., Basingstoke, England) at 30 °C for 10 days.
Some diphenyl crystals (approximately 100 mg per plate)
(Panreac Quı́mica SA, Barcelona, Spain) were added to the
plates in order to impede the development of molds. Col-
onies were counted and cell populations (CFU) were cal-
culated from duplicate analyses. Subsequently, in plates
coming from air samples, this value was converted into the
most probable number of microorganisms collected per
plate (MPN), using a statistical correction table included in
the equipment instruction manual. Finally, the most prob-
able number of microorganisms collected was expressed as
MPN/m3. From each plate, a maximum of twenty colonies
were randomly selected and stored for later analysis: yeasts
in LM medium (10% D-glucose, 5% mycopeptone, 3%
yeast extract, 3% malt extract, 20% bacteriological agar)
and bacteria in frozen tubes with skimmed milk.
Molecular characterization of the microorganisms
The identification of yeasts analysis was carried out using
PCR–RFLP of the ITS region of the ribosomal DNA. The
extraction of DNA was conducted from the fresh yeast
culture using the method proposed by López [14]. PCR
amplification was applied to the 5.8S-ITS region of the
rDNA following the method proposed by Esteve Zarzoso
et al. [15]. The primers used to amplify the region were
those described by White et al. [16]. The amplification
reaction took place in the GeneAmpÒ PCRSystem 2700
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thermocycler (Applied Biosystems). The fragments of A 250

amplified DNA were separated using electrophoresis in

1.5% agar gel on a TBE buffer, subsequently stained with 200

cfu x 103/1000g
ethidium bromide and photographed under ultraviolet light
150
in the Image Store 5000 (UVP) apparatus (BIO-RAD). For
the analysis of restriction of the product of PCR, 5-lL
100
aliquots were subjected to digestion by the HinfI, HaeIII
and CfoI enzymes. The RFLP products were analyzed by 50
electrophoresis in agar gel at 3% (p/v). The 100-bp PCR
Molecular Ruler molecular weight marker was used as a 0
standard for both the PCR products and the RFLP frag- 4 3 2 1 0

ments. The identification of the isolated yeasts was per- Weeks before harvest

formed through a comparison of the restriction profile of B 4,5

each yeast with those obtained in our laboratory [17] and 4
with the profiles described in bibliography [18, 19]. There 3,5
were colonies whose profiles did not coincide with those 3

included in the previous references. The PCR products of
the D1/D2 domain of large subunit (26S) ribosomal DNA
[20] coming from these non-identified colonies were
purified and sequenced by Macrogen Inc. facilities (Seoul,
South Korea) in order to determine which species of yeast
each isolate belonged to (retrieved from GenBank:
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi). The yeasts identi-
fied by this method were Rhodosporidium babjevae, Spo-
rothrix spp, Acremonium strictum and Kabatiella
microsticta.
All bacteria isolated were analyzed via PCR to detect
those belonging to the group of lactic bacteria [21]. The
sequences of the primers used were Rrs1 (GGATTAGA-
TACCCTGGTAGTCC) and Rrs2 (TCGTTGCGGGACT-
TAACCCAAC). These PCR products were purified and
sequenced by Macrogen Inc. facilities (Seoul, South Korea)
in order to determine the species of lactic bacteria each
isolate belonged to (retrieved from GenBank: www.ncbi.
nlm.nih.gov/blast/blast.cgi).
Results and discussion
Evolution of microbial populations in grapes
and in air during ripening period
Of the two types of microorganisms of enological interest,
only the yeasts were present in both campaigns during
almost the whole period studied, both on the grapes and in
the air. The presence of yeasts increases in the vineyard
during the ripening period both on the grapes and in the
atmosphere (Fig. 1). This increase in the number of yeasts
on grapes is due to the greater size and the elasticity of the
berries and so the microorganisms have more large surface
available to adhere to and more access to nutrients. How-
ever, the quantities of yeasts found in the air are much
lower than those on the clusters: In the grapes it varies
MPN/m3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
4 3 2 1 0
Weeks before harvest
Fig. 1 Evolution of yeast number on grape clusters (a), and in
vineyard air (b) during the weeks before harvest in two successive
vintages: 2008 (filled circle), 2009 (filled square)
between 102 and 105 cfu/1,000 g, while in the air the levels
are 0–4 MPN/m3. These quantitative differences were
maintained during both years of the study. Fleet et al. [22]
indicated that only small populations of yeasts (\100 cfu/mL)
are found in air. But in the present study, the level detected
is much lower than this value, even though the levels
detected on the grapes are normal [23].
The causes of these differences between the air and the
grapes may have been due to the different nature of the two
substrates and to the nonexistence of strong agitation of the
clusters [absence of human activity in the vineyard and the
atmospheric conditions in which there were no strong
winds or heavy rainfall during sampling (Table 1)]. Curiel
et al. [24] indicated that the air only acts as a support
medium or carrier until the microorganisms fall and are
deposited on the surrounding surfaces. These authors also
reported that microorganisms can travel through the air in
three ways: adhering to a dust particle, adhering to a
droplet or as a single particle. Davenport [25] observed that
most of the yeasts from the vineyard atmosphere were from
airborne propagules, e.g., seed heads and flying insects,
whereas the air itself contained very few yeasts. In the
previous studies conducted in two wineries, Garijo et al.
[12, 13] also detected a lower quantity of enological

123
362
Table 1 Climatic conditions during the sampling period in two vintages
Weeks before harvest 2008
T (°C) Sunny/Cloudy Wind
4 27 Sunny Light*
3 23 Cloudy No
2 17 Cloudy Light
1 12 Cloudy Yes
0 15 Sunny No
* Light: weak and sporadic during the sampling
microorganisms in the air in comparison with the liquid in
which they were fermenting and indicated that the presence
and detection of enological microorganisms in large
quantities in the winery air were conditioned by the han-
dling of wine loaded with microorganisms.
There is a big difference between the yeast population
found on the clusters in 2008 and 2009 (Fig. 1a). These
differences may be due to the different climate conditions
prevailing in each year (Table 1), which play a crucial role
on microbial population [26]. Climatic variations and
viticultural practices are factors that are liable to influence
the berry microenvironment and consequently the micro-
bial ecosystem on the surface. The temperature and cloud
conditions during the sampling were clearly different in the
2 years. However, the yeasts detected in the air in the
2 years are similar (0–4 MPN/m3) (Fig. 1b).
The presence of lactic acid bacteria had no continuity. In
2008 no bacteria were isolated from either the air or the
grapes. In 2009 there was only bacterial growth on the
clusters in 2 out of five samplings, 2nd and 4th, with
the equivalent of a concentration of 17 and 32 cfu/g,
respectively. In the air, a bacteria was only isolated in the
4th sample and another in the 5th, representing a bacterial
load in both cases of 5 MPN/10 m3. Fugelsang et al. [27]
indicated that lactic acid bacteria are present in vineyards;
however, given their nutritional requirements, species
diversity and population density are limited (undamaged
fruits contain \103 cfu/g). In previous studies, Bae et al.
[28] also found very low populations of lactic acid bacteria
from the grapes and only a few samples of damaged grapes
gave isolation of lactic acid bacteria when analyzed by
direct plate culture. No references to lactic acid bacteria
present in the air of the vineyard have been found, although
Yanagida et al. [29] isolated these microorganisms from
samples of soil, so that they may become airborne attached
to dust particles or insects, as has already been shown to
occur in the case of yeasts [3]. Griffin et al. [30] demon-
strated that dust particles can serve as a vessel for the
dispersion of bacteria and fungi. However, and despite the
low number of isolations, in the present work, populations
123
Eur Food Res Technol (2011) 233:359–365
2009
Rain T (°C) Sunny/Cloudy Wind Rain
No 33 Sunny Light No
No 31 Sunny Light No
No 27 Sunny Light No
Light 20 Sunny No No
No 22 Sunny No No
of lactic acid bacteria in grapes are in accordance with the
level of these microorganisms detected in the air.
Identification of the microorganisms present
in the grapes and in the air
The molecular analysis of the 4 colonies of bacteria iso-
lated showed that these were all lactic bacteria. The sub-
sequent sequencing of them determined that the two
colonies isolated in the air and one of those isolated on the
clusters belonged to the species Pediococcus pentosaceus.
The other colony isolated on the grape clusters was
Oenococcus oeni. The former bacteria is normally associ-
ated with grapes and the vinification process, but it is not
normally the one responsible for triggering malolactic
fermentation [31]. However, O. oeni is the species pri-
marily responsible for conducting it [32].
The total number of yeasts isolated and identified in
2008 was 176 (46 from the air and 130 from the clusters),
and 126 (14 from the air and 112 from the clusters) in
2009. In this latter year, the number of yeast colonies
isolated in the air was lower than in 2008 (14 as against
46). Of the 14 colonies, 3 came from the third sampling, 4
from the fourth and 7 from the last. The weather conditions
of this second year (Table 1) and the smaller yeast popu-
lations on the clusters (Fig. 1a) could account for the lower
total number of colonies isolated from the air. In the first
two samples taken in 2009, no yeasts were detected in the
air, which coincided with temperatures of over 30 °C in the
vineyard. Previously, Magyar et al. [33] demonstrated that
meteorological circumstances affected to the biodiversity
of air spora in an Italian vineyard.
The population of yeasts present, both on the clusters
and in the air, is dominated by the species Aureobasidium
pullulans throughout the period studied (Figs. 2, 3). It is
present in practically all the samples in high percentages.
This makes it the main yeast in the vineyard despite
playing absolutely no part in fermentation or vinification
processes. This yeast is considered as black yeast-like
fungus and is the most widespread sporophyte in the
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A A
100% 100%
90% 90%
80%
80%
70%
60% 70%
50% 60%
40% 50%
30%
40%
20%
30%
10%
0% 20%
4 3 2 1 0
10%
Weeks before harvest
0%
4 3 2 1 0
B Weeks before harvest
100%
90%
B
80% 100%
70% 90%
60% 80%
50% 70%
40%
60%
30%
50%
20%
40%
10%
30%
0%
4 3 2 1 0 20%
Weeks before harvest 10%
Aureobasidium pullulans Candida spp Hanseniaspora uvarum
0%
Pichia kluyveri Kabatiella microsticta Sporotrix spp. 4 3 2 1 0
Rodosporidium babjevae
Weeks before harvest
Aureobasidium pullulans Candida spp Hanseniaspora uvarum
Fig. 2 Percentage of yeast species isolated on grape clusters (a), and Saccharomyces cerevisiae Acremonium strictum
in vineyard air (b) during the weeks before 2008 harvest
Fig. 3 Percentage of yeast species isolated on grape clusters (a), and
in vineyard air (b) during the weeks before 2009 harvest
phyllosphere. Sabaté et al. [34] found this yeast in vineyard
soil and in vine plant substrates (bark, leaves and grapes).
Together with A. pullulans, other yeast species that species in grapes mainly at the first stage of grape devel-
appear continuously both in the air and on the grapes are opment. Prakitchaiwattana et al. [37] found it especially in
Candida spp., and to a lesser degree, Hanseniaspora uva- Chardonnay grapes. Kabatiella microsticta is a species
rum. These two yeasts among others are commonly found closely associated with A. pullulans (it used to be called
on the surface of grapes [35, 36]. Candida spp. was Aureobasidium microstictum) [38]. Sporothrix spp is a
detected on the clusters and in the air in both years, but in thermally dimorphic fungus that can be found worldwide.
2009 on the clusters it was found in only small quantities The species is present in soil and in plant material. Con-
and only on ripe grapes. H. uvarum was not detected in the sequently, its presence in the vineyard air is not surprising.
air in 2008 and appeared on the grapes in the last sample, Something similar could happen with the endophytic fun-
similarly when the grapes were already ripe. gus Acremonium. This end fungus was isolated from
Some yeasts were only detected in samples isolated grapevine material (leaves) in previous works [39]. In the
from clusters in 2009 (S. cerevisiae and Acremonium air in 2008, the Pichia yeast appears in the third sample;
strictum) and others only in the air in 2008 (Rhodospori- however, it is not detected in the clusters examined at that
dium babjevae, Sporothrix spp, Kabatiella microsticta and same point in time. It could have been carried in the air
Pichia kluyveri). These differences were perhaps also from another neighboring cluster. In the same way, on the
caused by the atmospheric conditions in each year which 2009 clusters, Candida spp appeared at the end although it
encouraged the evolution of certain particular species. The is not present in the air.
detection in only one of the media (air or grape clusters) Fleet et al. [22] indicated that small populations of
may have been due to the fact that they were there in such yeasts are found in air, with Sporobolomyces spp. being the
low quantities. R. babjevae appeared in the air at the end of most significant. Species of Kloeckera, Torulopsis and
ripening in 2008. However, Renouf et al. [36] detected this Cryptococcus have also been isolated from air samples

123
364
collected around vineyards and other horticultural regions
[9]. Davenport [25] observed that most yeasts from the
vineyard air belonged to Sporobolomyces and Cryptococ-
cus spp. The results found in the Annual Report 2009/2010
from the Fraunhofer Institute for Molecular Biology and
Applied Ecology (http://www.ime.fraunhofer.de) show that
the yeasts found in the air from a Pinot Noir vineyard were
Zygosaccharomyces florentinus, Metschnikowia pulcherr-
ima and Pichia burtonii. In a Chardonnay vineyard, the
yeasts found were M. pulcherrima, P. burtonii and Can-
dida ylanoide. In the corresponding grapes, the only spe-
cies found were M. pulcherrima and P. burtonii. These data
indicated a certain correspondence between the yeasts
found in the two media at the time of the harvest, similar
results to the ones found in the current study where there
was a large coincidence between the yeasts identified in the
air and grape clusters at the moment of the harvest, espe-
cially in 2009.
Different authors have published contradictory infor-
mation about the presence of S. cerevisiae in the vineyard.
In this work, yeasts of this species were found in the
samples on clusters taken three and 2 weeks before the
harvest in 2009 in different proportions (3 and 33%,
respectively). Different studies on grapes demonstrated that
it only occurs in percentages below 0.1% of naturally
occurring yeast biota, and, moreover, that they are not
systematically widespread on either all plants or all grapes
[40–42]. Shuller et al. [43] obtained results that clearly
indicated that S. cerevisiae occurs in vineyard ecosystems
belonging to the Vinho Verde Region in sufficiently high
numbers to conduct a spontaneous fermentation. Valero
et al. [11] demonstrated that the dissemination of com-
mercial yeast S. cerevisiae in the vineyard is mainly
favored by water runoff and from macerated grape skin
dumping sites and then different vectors, insects, wind and
others. But in the present study, this yeast was not detected
in the air at any time, which does not allow us to state that
it could be disseminated in this way. Perhaps, the dis-
semination of this species in the vineyard occurs princi-
pally postharvest as showed the previous articles cited.
Conclusions
The two main microorganisms responsible for vinification
(S. cerevisiae and O. oeni) were detected at some isolated
moment during maturation, but neither of them was detec-
ted in the air. The majority of the non-Saccharomyces
yeasts detected in the vineyard air (A. pullulans and Can-
dida spp.) are the same as those found on the clusters during
the ripening period, which could suggest that an exchange
of microorganisms takes place between the media. How-
ever, the absence or low number of bacteria and the limited
123
Eur Food Res Technol (2011) 233:359–365
number of yeasts isolated in the air during this study make it
necessary to deepen knowledge of the microbiology of
vineyard air and the role that this medium has in the dis-
semination, inoculation and contamination of grapes.
Acknowledgments This study has been undertaken with a grant
from the Government of La Rioja (R-08-08, R-06-09 and FOMENTA
2007/04 Projects).
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123
Capítulo 5
Discusión
 Discusión

El origen y la diseminación de los microorganismos asociados a la

vinificación, tanto en el viñedo como en la bodega, es una cuestión sometida a
debate desde hace tiempo, pero todavía sin concluir satisfactoriamente. Las uvas,
los mostos y los vinos contienen, de forma natural, una población muy variada de
microorganismos que probablemente han llegado ahí por rutas diversas.

Tradicionalmente se han considerado las uvas como la primera fuente de

microorganismos que participan en la vinificación; pero es obvio que estos
microorganismos necesitan un vector que les permita llegar hasta ellas. La mayoría
de los investigadores creen que llegan hasta los racimos por medio de los insectos
(Parle y di Mena, 1966; Mortimer y Polsinelli, 1999; Zacchi y Vaughan Martini,
2002; Stefanini et al., 2012) y algunos también creen que pueden ser transportados
por efecto del viento (Carrascosa et al., 2005). En trabajos previos se ha descrito la
presencia de levaduras de interés enológico en el aire del viñedo (Adams, 1964;
Fleet et al., 2002; Valero et al., 2005; Santamaría, 2009; Annual Report 2009/2010
del Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology), pero no se
han encontrado referencias respecto a la presencia de bacterias lácticas en dicho
medio.

El equipamiento de la bodega, y concretamente la maquinaria de recepción

y procesado de la vendimia (tolva, estrujadora, despalilladora, depósitos, etc.) se
consideran el segundo punto de aporte de microorganismos a la vinificación. Estos
se encuentran adheridos a la superficie de estos equipos y por contacto pasan al
mosto y al vino (Rosini, 1984; Santamaría et al., 2005; Ocón et al., 2010b). Estos
microorganismos proceden de las uvas procesadas en años anteriores y también de
las fermentaciones previas.

139
Discusión

A partir de los microorganismos de las uvas y los procedentes de las

instalaciones se pueden llevar a cabo las fermentaciones alcohólica y maloláctica
en los mostos. Sin embargo, desde siempre se ha observado que las primeras
fermentaciones espontáneas, tanto alcohólicas como malolácticas, que tienen lugar
en las bodegas cada campaña, suelen ser más largas que las que suceden a
continuación. La razón se debería al enorme aumento de microorganismos que se
produce en los primeros depósitos y a su posterior diseminación por la bodega, lo
que daría lugar a una inoculación natural que haría que las fermentaciones
siguientes arrancasen más rápidamente y transcurran a más velocidad.

Esta diseminación de los microorganismos generados en los depósitos de

fermentación por toda la bodega tiene lugar por diferentes vías demostradas con
anterioridad: por contacto con la maquinaria y el instrumental utilizado durante las
elaboraciones, por medio de los trabajadores y por los insectos (Zacchi y Vaughan-
Martini, 2002; Ocón et al., 2010b; Stefanini et al., 2012). También es posible,
aunque hasta el momento no existía constancia de este hecho, que el aire pueda ser
una vía de transporte y diseminación de microorganismos en el interior de las
bodegas.

En las industrias se estudian los microorganismos del ambiente por su

interés sanitario o por la alteración que pueden causar en los productos que en ellas
se fabrican. De este modo, en las industrias alimentarias el análisis del aire es
frecuente, sobre todo en la zona de envasado aséptico de los alimentos (Salustiano
et al., 2003). Sin embargo, no existen trabajos realizados en bodegas donde se haya
determinado la presencia en el aire de microorganismos directamente responsables
de la fermentación, así como su relación con los procesos enológicos que tienen
lugar en los depósitos a lo largo del proceso de elaboración.

140
 Discusión

Teniendo en cuenta todo lo anterior, el objetivo de este trabajo fue analizar

el aire como vía de contaminación y diseminación de los microorganismos
implicados en las fermentaciones alcohólica y maloláctica, tanto en el viñedo como
en la bodega.

Inicialmente se estudió la presencia y evolución de los microorganismos de

interés enológico (levaduras, bacterias y mohos) en el aire de una bodega durante
todo el período de vinificación (septiembre-diciembre). Los resultados obtenidos
indicaron que la presencia en el aire de los distintos microorganismos estudiados
estaba directamente relacionada con los procesos enológicos que tenían lugar en la
bodega. En el transcurso de este periodo los microorganismos cuantitativamente
más abundantes fueron los mohos, microorganismos ubicuos que forman parte de
cualquier ecosistema. El número de mohos presentes en la bodega alcanzó un nivel
máximo al inicio de la campaña con valores superiores a 10000 NMP/m3, que se
mantuvieron durante todo el periodo de recepción de uva (octubre), disminuyendo
drásticamente a partir de este momento hasta alcanzar niveles inferiores a 1000
NPM/m3. Estos datos confirmaron que la materia prima fue el vehículo para la
introducción de estos microorganismos en la bodega, y que posteriormente
quedaron en gran cantidad en el aire, puesto que para ellos el aire es la forma
común de diseminación.

Las levaduras y bacterias lácticas se encontraron en cantidades muy

inferiores, y su presencia quedó limitada, fundamentalmente, al periodo de tiempo
en el que tuvieron lugar las fermentaciones conducidas por ellas (fermentación
alcohólica y maloláctica).

La presencia de levaduras en el aire comenzó a ser significativa después de

encubar el primer depósito. El número máximo de levaduras se halló cuando la

141
Discusión

mayor parte de los depósitos de la bodega estaban fermentando, disminuyendo

posteriormente de forma paulatina hasta casi su total desaparición.

Por su parte, las BL estuvieron ausentes en el aire de la bodega hasta

después de iniciarse la primera FML, y desaparecieron rápidamente una vez
concluida esta fermentación en el último depósito.

Con estos resultados, parece evidente que el origen de la elevada cantidad

de mohos en el aire de la bodega durante la época de vendimias fue debido
fundamentalmente a la uva. También parece obvio que la presencia de levaduras y
BL en el aire se debió a la actividad fermentativa en la bodega y a su proyección
desde los depósitos, en los que se estaban desarrollando en gran cantidad. A pesar
de que ambos microorganismos (levaduras y BL) alcanzan poblaciones similares
en los depósitos durante las fermentaciones, el número de levaduras detectado en el
aire durante el período de la FA fue mucho mayor que el número de bacterias
durante la FML. Este hecho podría explicarse por la gran cantidad de CO 2 que se
desprende durante la FA, y por la manipulación del liquido de los depósitos
durante la misma (bazuqueos, remontados, trasiegos, prensados, etc.). Estos dos
factores (CO2 desprendido y manipulaciones del depósito) supondrían una
liberación de levaduras al ambiente mayor que en el caso de las BL. De estos
resultados también se deduce que la permanencia de los microorganismos en el
aire se localiza en el período de tiempo que comprenden las respectivas
fermentaciones (alcohólica y maloláctica), después se depositarían rápidamente, y
dejan de detectarse en el aire.

Los mohos presentes en el aire pertenecieron a los géneros Aspergillus,

Penicillium y Botrytis. La presencia de Botrytis, típico moho “de campo” (Leong,
2007), se concentró principalmente durante los días de entrada de la uva,
suponiendo el 20-40% del total. Antes y después de este período, cuando no

142
 Discusión

entraba uva en la bodega, Aspergillus y Penicillium, típicos “mohos de almacén”,

fueron los únicos detectados en el ecosistema de la bodega. Los últimos muestreos,
realizados cuando ya no había actividad microbiana en la bodega y sólo había vinos
almacenados, mostraron que el moho más abundante en el ambiente pertenecía al
género Penicillium (80%). Estos tres géneros son los habitualmente descritos en
relación con viñedos y bodegas (Rosa et al., 2002). La preocupación que existe en
el sector enológico en relación con los mohos que se desarrollan en las bodegas, se
debe a que estos microorganismos pueden desarrollarse en las superficies tanto
externas como internas de las barricas, así como en los corchos de las botellas,
produciendo metabolitos (TCA) (Suárez et al., 2004) e incluso micotoxinas (OTA)
que pueden alterar la calidad del vino almacenado, provocando en un caso el
defecto conocido como “gusto a tapón” y en el otro constituyendo un riesgo para la
salud humana (Bellí, 2004; Picco y Rodolfi, 2004; Patiño et al., 2007). Los
principales géneros implicados en este problema son Aspergillus y Penicillium, que
a su vez son los géneros encontrados en este estudio. No obstante, el nivel de
mohos en el aire disminuye después de la vendimia hasta alcanzar niveles muy
bajos y además, dentro de los géneros Aspergillus y Penicillium, no todas las
especies ni todas las cepas de cada especie son causantes de los problemas
anteriores. En este trabajo, los mohos sólo se identificaron hasta nivel de género, y
por lo tanto no se pudo evaluar el riesgo existente por la naturaleza de los mohos
que entraron con la uva y los que finalmente permanecieron en la bodega.

Las levaduras aisladas del aire pertenecían tanto a la especie S. cerevisiae

como al grupo No-Saccharomyces. Las primeras sólo se detectaron cuando los
depósitos estaban fermentando activamente. Antes de un desarrollo masivo de las
fermentaciones alcohólicas y una vez concluidas éstas, las únicas levaduras
aisladas en el aire fueron No-Saccharomyces. Estos datos también evidencian la
liberación de levaduras desde los depósitos en fermentación hacia el aire exterior,
puesto que durante el período de máxima actividad fermentativa, la población de

143
Discusión

los depósitos está casi exclusivamente compuesta por levaduras de la especie S.

cerevisiae, y en este período éstas también fueron las principales levaduras
detectadas en el aire. Por otra parte, los aislamientos realizados en los depósitos en
fermentación, indicaron que en los primeros depósitos, las levaduras aisladas a las
24 h de encubado, pertenecían mayoritariamente al grupo No-Saccharomyces. Las
levaduras del grupo No-Saccharomyces actúan en los depósitos en las primeras
fases de encubado, cuando la actividad fermentativa es baja y se desprende menos
carbónico, por lo que las levaduras se proyectarían en menor medida, y por ello
apenas se detectarían en el aire durante ese período, a pesar de estar presentes en el
inicio de las fermentaciones de todos los depósitos. Es un hecho ampliamente
constatado que la mayor parte de las levaduras que se encuentra en la uva
pertenecen al grupo No-Saccharomyces. Por ello, prácticamente la totalidad de las
levaduras identificadas en el aire de la bodega en los primeros días de campaña
pertenecieron a este grupo, ya que entrarían con la uva. Cuando las fermentaciones
alcohólicas de todos los depósitos han finalizado, estas levaduras vuelven a
aparecer en el aire de las bodegas hasta alcanzar el 100% en los últimos muestreos.
El metabolismo oxidativo de estas levaduras justificaría su permanencia en el
ambiente de la bodega, al igual que su presencia en el utillaje e instalaciones de la
misma fuera de la época de vendimias tal y como se ha indicado en otros trabajos
(Santamaría et al., 2005; Ocón et al., 2010b).

Al comparar las cepas de S. cerevisiae aisladas en el aire con las aisladas

en los depósitos de fermentación al mismo tiempo, se encontraron varios clones
comunes en ambos medios, lo que también vino a confirmar ese intercambio de
microorganismos entre los depósitos en fermentación y el aire. En el primer
depósito, durante la fase tumultuosa de la fermentación, no se identificaron clones
comunes entre ambos medios. Esto podría deberse a que en la fecha de realización
del muestreo, la presencia en el aire de levaduras Saccharomyces era todavía baja,
puesto que se solo había un depósito en fermentación de la bodega. En este

144
 Discusión

momento, sólo se detectaron dos clones distintos de S. cerevisiae en el aire y

ninguno de ellos coincidió con los seis clones distintos detectados en esa fase en
dicho depósito en fermentación. Transcurrido ese momento, cuando la FA se
generalizó en la bodega ya se detectaron clones comunes entre el aire y los
depósitos. También se aislaron clones que estaban presentes en todos los depósitos,
previo paso por el aire. La conclusión que se deriva de estos datos es que existió un
intercambio de microorganismos/cepas entre el medio líquido en fermentación y
gaseoso (aire), lo que podría indicar que el aire por si mismo puede ser una nueva
forma de diseminación de microorganismos dentro de la bodega y de inoculación
de depósitos, además de los ya conocidos (insectos, utillaje).

En su día no se encontraron en la bibliografía datos similares tomados en

bodegas con los que comparar los resultados de este estudio, por lo que éste fue el
inicio de una nueva línea de trabajo en el ámbito enológico. Su originalidad radicó
en que fue la primera vez que se aplicó el análisis del aire a la monitorización de
procesos microbianos en el sector enológico. Los resultados derivados sugieren que
la carga microbiana del aire en cada momento parece ser indicativa de los
microorganismos que están actuando en la bodega. Por ello se pensó que quizás el
análisis microbiológico del aire de las bodegas podría servir para el control de
procesos e incluso de desviaciones microbiológicas durante la elaboración y la
conservación de los vinos.

El trabajo anterior se completó estudiando la presencia y distribución de las

levaduras Saccharomyces/No-Saccharomyces en las instalaciones de la misma
bodega, y se compararon los clones de S. cerevisiae detectados con los presentes
tanto en el aire como con los que llevaron a cabo las fermentaciones en dicha
bodega. Así, se pudo constatar que la población de levaduras No-Saccharomyces
en las distintas superficies de la bodega analizadas (tolva de recepción,
despalilladora, estrujadora, bomba de pastas, depósito de fermentación, boca de

145
Discusión

salida del depósito, prensa, bomba de trasiego, suelo y pared de la bodega), fue
mayor que la de Saccharomyces, lo que contrdijo lo apuntado por otros autores
(Rosini, 1984; Pretorius, 2000; Beltrán et al., 2002), que mostraron a la especie S.
cerevisiae como la principal colonizadora de las superficies de la bodega, aunque
estuvo de acuerdo con lo observado por otros investigadores (Ciani et al., 2004;
Santamaría et al., 2005, 2008; Ocón et al., 2010b). El análisis de las superficies se
llevó a cabo antes de que se iniciara la entrada de uva esa campaña, y en ese
momento las levaduras aisladas en el aire también fueron todas No-Saccharomyces.
Al comparar las cepas de S. cerevisiae identificadas en las instalaciones con las
aisladas en el aire de la zona de recepción y elaboración de la bodega y en los
depósitos en fermentación, se encontraron varios clones comunes, lo que vino a
confirmar el intercambio de microorganismos entre estos medios. De los 26 clones
de S. cerevisiae identificados en el aire de la zona de elaboración, dos se
encontraron también en el aire de la zona de recepción y cuatro en las instalaciones
de la bodega. Asimismo, diez de ellos también se detectaron en los aislados
obtenidos de los mostos en fermentación. A la vista de estos resultados, puede
concluirse que se produjo un intercambio de cepas de S. cerevisiae entre el medio
líquido (mosto/vino), el gaseoso (aire) y las superficies de la bodega.

En este trabajo no se identificaron las colonias de BL aisladas en el aire y

en los depósitos en fermentación, por lo que no se pudo determinar la presencia de
clones iguales de BL en ambos medios. Este estudio se llevó a cabo en la siguiente
campaña en otra bodega.

Este segundo ensayo se prolongó durante 10 meses, entre septiembre y

julio del año siguiente. Los muestreos del aire se iniciaron antes de la entrada de
uva en la bodega y concluyeron un mes después de haber finalizado la última FML.
También se aislaron e identificaron las BL presentes en el mosto/vino de depósitos
próximos a la zona donde se muestreó el aire. Las fermentaciones malolácticas se

146
 Discusión

desarrollaron de forma lenta e intermitente durante el mes de diciembre y los seis

primeros meses del año siguiente.

En el período estudiado se detectó un número muy bajo de bacterias en el

aire, debido probablemente a que la FML no tuvo lugar de forma simultánea en
todos los depósitos de la bodega. La degradación del ácido málico se produjo de
forma sucesiva en cada depósito, solamente en el mes de mayo tuvo lugar en cuatro
depósitos simultáneamente.

A lo largo del proceso de vinificación se aislaron bacterias en el aire en dos

fases: durante la entrada de uva en la bodega y cuando había actividad maloláctica
en alguno de los depósitos. En el primer caso, esta presencia podría estar
relacionada con la carga bacteriana que acompañó a la uva y en el segundo con el
desarrollo de BL durante la FML, que por efecto del anhídrido carbónico
desprendido fueran expulsadas al exterior de los depósitos. No obstante, los valores
en este último caso fueron muy bajos si se comparan con los obtenidos en el primer
trabajo de esta tesis, donde se llegaron a alcanzar niveles próximos a 500 NPM/m 3
cuando en la totalidad de los depósitos de la bodega se estaba degradando el ácido
málico. En el presente estudio, el valor máximo alcanzado fue de 9 NMP/m 3. Estas
diferencias se podrían explicar porque en la campaña anterior todos los depósitos
realizaron la FML simultáneamente en la misma nave de pequeñas dimensiones,
mientras que en este caso ésta se llevó a cabo de forma aislada en los diferentes
depósitos. Sólo cuando en cuatro de ellos se estaba desarrollando la FML, la
presencia de BL alcanzó 9 NMP/m3, anteriormente los recuentos oscilaron entre 0
y 4 NMP/m3. El valor más elevado de bacterias en el aire (328 NMP/m3) se detectó
cuando la FML había finalizado en casi todos los depósitos de la bodega,
coincidiendo con el vaciado y limpieza de uno de ellos que la había terminado unos
días antes Este hecho sugirió que el paso al aire en gran cantidad de las BL se debió
a la manipulación del líquido cargado de estos microorganismos.

147
Discusión

Estos datos parecen indicar que la potencial diseminación de BL en bodega

con el aire como mediador, también podría tener lugar cuando se mueve el
producto que contiene bacterias (uva o vino). Por lo tanto, la dispersión podría
deberse a una manipulación mecánica (movimiento de uva o vino), o provocada
por el anhídrido carbónico que se desprende durante la FML. La cantidad de
bacterias que pasan al aire estaría directamente relacionada con la intensidad del
movimiento (mucho mayor en el trasvase que el provocado por el carbónico que se
desprende en la fermentación maloláctica), y también con la cantidad de bacterias
contenidas en el producto manipulado (mayor en vino con FML recién terminada
que en uva). En aquellos momentos del proceso productivo en los que la uva o el
vino se manipulan, los microorganismos contenidos en ellos podrían pasar y
permanecer por un tiempo en el aire, para posteriormente depositarse inoculando o
contaminando de esta forma las superficies o líquido sobre el que caigan.

Todas las bacterias aisladas en el aire antes del inicio de las fermentaciones
malolácticas pertenecieron al grupo de las BL (Pediococcus pentosaceus y
Leuconostoc mesenteroides), pero no a la especie Oenococcus oeni. Sin embargo, a
partir del inicio de la FML en los depósitos, todas las bacterias aisladas en el aire
pertenecieron a la especie O. oeni. Lo descrito en el aire fue reflejo de lo que estaba
ocurriendo simultáneamente en los depósitos. Así, todas las bacterias aisladas en
los depósitos con mosto-vino y en el aire durante la FA (antes de que se iniciara la
FML en ningún depósito) fueron BL, pero no pertenecieron a la especie O. oeni.
Sin embargo, una vez iniciada la FML, todos los aislados de BL de los vinos y del
aire pertenecieron a dicha especie. Por lo tanto, los datos de BL obtenidos en el aire
y en los depósitos de vinificación estarían totalmente relacionados, así las cepas de
O. oeni, verdaderos agentes de la fermentación maloláctica (Pramateftaki et al.,
2006; Renouf et al., 2006; Ruiz et al., 2008), aparecieron simultáneamente en
ambos medios y en proporciones idénticas (100%) cuando se desarrollaron las
fermentaciones malolácticas en los depósitos. Por el contrario, cuando no hubo

148
 Discusión

actividad maloláctica, Oenococcus oeni no se detectó en el vino y tampoco en el

aire, lo que parece contradecir lo apuntado por otros autores (Lonvaud-Funel, 2006;
Renouf et al., 2007; López, 2009) que afirman que esta especie es la mayoritaria
cuando finaliza la FA.

Al analizar las cepas de O. oeni aisladas del aire se identificaron ocho

clones diferentes a lo largo de la campaña. Se observó que dos de los ocho clones
identificados en este medio estuvieron presentes en tres de los cuatro muestreos en
los que se detectaron bacterias de esta especie en el aire. La diversidad clonal de la
especie O. oeni en el aire fue variable a lo largo de la campaña: inicialmente se
identificó un solo clon, posteriormente dos y finalmente siete y tres clones
distintos. En el momento en el que se detectó mayor diversidad, cuatro depósitos
estaban realizando la FML lo que pudo provocar que un mayor número de bacterias
distintas procedentes de cada uno de los cuatro depósitos fueran proyectadas al
ambiente generando una población más compleja. Al estudiar los clones de O. oeni
aislados de los vinos se observó que los dos clones detectados mayoritariamente en
el aire también aparecían en los depósitos en proporciones importantes. Al
comparar los clones del aire y del vino en cada muestreo, se detectaron clones
comunes en todos los momentos, con la excepción del primer depósito en iniciar la
FML esa campaña. En los momentos siguientes, el porcentaje de clones comunes
fue mayor o menor (25-100%) en función de las distintas condiciones en las que se
desarrolló la FML en esa vendimia.

En esta bodega, que nunca ha usado cepas comerciales de BL, parece que
hay varios clones autóctonos de O. oeni que aparecen de forma más o menos
continua en los vinos durante la FML y en el aire. La importancia de estas cepas en
cada momento y el número y proporción de otras cepas que les acompañan,
estarían determinados por las diferentes características de los vinos que se elaboran
en cada depósito, que hacen que se adapten mejor unas que otras (Landete, 2005;

149
Discusión

Krieger, 2006; Renouf et al., 2006a). Las cepas presentes en el líquido pasarían al
aire y de esta forma se podrían diseminar por la bodega pudiendo caer sobre otros
vinos y así inocularlos. Su desarrollo posterior en ellos estaría condicionado por su
mayor o menor adaptación a las condiciones del nuevo vino. Este intercambio
continuo entre ambos medios explicaría la presencia de cepas comunes de O. oeni
en ambos medios y su diferente proporción a lo largo del período estudiado.

Los resultados de este segundo trabajo parecen confirmar el papel del aire
como elemento diseminador de los microorganismos que participan en la
vinificación en las bodegas. En el trabajo anterior se constató la dispersión de
levaduras durante la FA por esta vía, y ahora se concluye que esta hipótesis
también es válida para explicar la dispersión en la bodega de las BL. Los datos
obtenidos indicaron la presencia simultánea de las mismas especies y cepas de BL
en el aire de la bodega y en los depósitos de vinificación. Este resultado indicaría
intercambio de bacterias entre ambos medios y sugeriría al aire como elemento
diseminador de estos microorganismos en la bodega, ligado a la FML y a los
momentos de manipulación/trasiego del líquido. Esta hipótesis sugiere la
posibilidad de que durante las manipulaciones también se puedan diseminar a
través del aire otros microorganismos “alterantes” relacionados con la vinificación
y conservación de los vinos. No obstante, el bajo número de bacterias aisladas en el
aire en algunos momentos de este trabajo, y el hecho de que sea el primer estudio
conocido sobre el tema hasta este momento, hace necesario ampliar conocimientos
sobre la microbiología del aire de las bodegas y el papel de este medio como vía de
propagación, inoculación o contaminación de mostos y vinos.

Una vez “confirmada” la diseminación de levaduras y bacterias a través del

aire en el interior de la bodega durante las fermentaciones alcohólica y maloláctica,
se estudió si esta misma vía podía ayudar a explicar la carga microbiana de interés
enológico (levaduras y bacterias que llevan a cabo las fermentaciones) que

150
 Discusión

presentaban las uvas durante el período de maduración, y sobre cuyo origen no

existe unanimidad de criterio. Estudios llevados a cabo con anterioridad en nuestro
laboratorio nos habían llevado a pensar en el papel que ejercía el viento como
elemento diseminador de cepas de S. cerevisiae entre viñedos de bodegas próximas
(Santamaría, 2009). Además, algún trabajo recogido en la bibliografía indicaba esta
vía de diseminación para explicar la presencia de levaduras que habían sido
inoculadas en una bodega en viñedos alejados de la misma (Valero et al., 2005).
Por ello, el objetivo de esta tercera parte de la tesis fue comparar las levaduras y
bacterias presentes simultáneamente en las uvas y en el aire de un viñedo durante
las semanas anteriores a la vendimia, para analizar el posible papel del aire/viento
en la dispersión de microorganismos enológicos en el viñedo. El estudio se llevó a
cabo durante dos campañas consecutivas.

De los dos tipos de microorganismos de interés enológico, sólo se aislaron

levaduras en las dos campañas durante casi todo el período estudiado, tanto en uvas
como en aire. Por el contrario, la presencia de bacterias no tuvo continuidad: el
primer año no se aislaron bacterias ni del aire ni de las uvas, mientras que en el
segundo sólo hubo crecimiento bacteriano en uvas y aire en dos de los cinco
muestreos efectuados. En aire se aisló una bacteria en el 4º muestreo y otra en el 5º,
lo que supuso una carga bacteriana en ambos casos de 5 NMP/10 m 3. En uvas se
aislaron únicamente dos bacterias, una en el 2º y otra en el 4º muestreo, lo que
equivalía a una concentración de 17 UFC/g y 32 UFC/g respectivamente. Las dos
colonias aisladas del aire y una de las aisladas en uvas pertenecieron a la especie
Pediococcus pentosaceus. La otra colonia aislada de racimos fue O. oeni.

La presencia de levaduras fue incrementándose en el viñedo conforme

avanzaba la maduración, tanto en las uvas como en el aire, lo que indicó una
evolución similar en ambos medios. No obstante, las cantidades de levaduras
detectadas en el aire (0-4 NMP/m3) fueron mucho menores que en las uvas (10 3-106

151
Discusión

UFC/100 g). Estas diferencias cuantitativas, que se mantuvieron los dos años del
estudio, pudieron deberse a las condiciones climatológicas en las que se realizaron
los muestreos ya que no hubo vientos fuertes ni lluvias intensas durante los
muestreos que pudieran provocar movimientos vigorosos del material vegetal y el
paso de los microorganismos al aire. En los dos trabajos expuestos anteriormente
en esta memoria, también se detectó menor cantidad de microorganismos en el aire
respecto al líquido en el que estaban fermentando, y se indicó que la presencia y
detección de microorganismos en cantidades elevadas en el aire de la bodega
estuvo muy ligada a la manipulación del vino que los contenía. Los bajos niveles
de levaduras en el aire del viñedo pueden compararse con los detectados en el
trabajo anterior para las bacterias lácticas en el aire de la bodega (4 NMP/m 3) en
momentos de escasa actividad maloláctica. En dicho trabajo sólo se alcanzaron
poblaciones elevadas de bacterias en el aire al manipular el líquido al final de la
fermentación, lo que indica que hace falta no sólo mover con intensidad el material,
sino también que éste contenga una carga elevada de microorganismos para
evidenciarlos en gran cantidad en el aire. En el presente estudio, la menor
concentración de levaduras en los racimos respecto a depósitos en fermentación,
unido al hecho de que en las bodegas haya mayor acumulación de
microorganismos en el ambiente que en el campo, donde la renovación del aire es
constante, explicaría las menores cantidades medias de microorganismos
detectados en el aire del viñedo respecto al aire de las bodegas.

La población de levaduras presentes, tanto en los racimos como en el aire,

estuvo dominada por la especie Aureobasidium pullulans durante todo el período
estudiado. Esta especie estuvo presente prácticamente en todos los muestreos en
porcentajes elevados, lo que la convierte en la principal levadura del viñedo, a
pesar de su nulo poder fermentativo y su nula participación en las vinificaciones
(Sabate et al., 2002; Raspor et al., 2006). Junto con A. pullulans, otras especies de
levadura que aparecieron de forma continuada tanto en aire como en uvas fueron

152
 Discusión

Candida spp. y en menor medida Hanseniaspora uvarum. Estas dos levaduras son
habituales en la superficie de las uvas y en el inicio de la FA (Pretorius et al.,
1999). Hubo otras especies que se detectaron de forma esporádica sólo en una de
las campañas, sólo en los racimos ó sólo en el aire. Estas diferencias quizás
estuvieron provocadas por las condiciones ambientales de ambos años que
favorecieron el desarrollo de algunas especies en particular. La detección en uno
solo de los medios (aire o racimos) pudo deberse a la baja cantidad en que se
encontraban. En la única cita bibliográfica encontrada (Annual Report 2009/2010
www.ime.fraunhofer.de) que hace referencia a un trabajo similar a éste, se
obtuvieron datos que indicaron correspondencia entre las levaduras halladas en
ambos medios en el momento de la vendimia, resultados similares a los
encontrados en el presente trabajo donde la mayor coincidencia en las levaduras
identificadas entre racimos y aire fue en el momento de la vendimia, especialmente
en el segundo año de estudio.

Las levaduras No-Saccharomyces detectadas mayoritariamente en el aire

del viñedo fueron las mismas que las dominantes en los racimos durante el período
de maduración, por lo que se podría sugerir intercambio de microorganismos entre
ambos medios. También hay que señalar que los dos microorganismos principales
de la vinificación (Saccharomyces cerevisiae y Oenococcus oeni) se detectaron en
los racimos en algún momento aislado del período de maduración, pero ninguno de
ellos se aisló del aire. Los datos anteriores parecen indicar que, a diferencia de lo
que ocurre en el interior de la bodega durante las fermentaciones, en el viñedo el
aire no parece ser una vía importante de diseminación de los microorganismos
implicados en la vinificación. A pesar de esos indicios, la ausencia o el bajo
número de bacterias y el limitado número de levaduras aisladas en el aire durante
este estudio, hace necesario profundizar en el conocimiento de la microbiología del
aire del viñedo y en el papel que este medio juega en la diseminación, inoculación
y contaminación de las uvas.

153
Discusión

Por lo tanto, podemos concluir este estudio indicando que en la bodega la

carga microbiológica del aire puede ser representativa de los procesos que están
teniendo lugar en ella; que existe intercambio de microorganismos entre los tres
medios de la bodega: liquido (mosto/vino), sólido (instalaciones) y gaseoso (aire);
y que la manipulación del mosto/vino es una fuente importante de proyección de
microorganismos al ambiente. Sin embargo, en el viñedo las evidencias en esos
aspectos no son tan claras.

154
Capítulo 6

Conclusiones
 Conclusiones

Conclusión general
La carga microbiológica del aire de la bodega es indicativa de los procesos
que tienen lugar en ella y existió un intercambio de microorganismos entre el
medio líquido (mosto/vino), el sólido (instalaciones) y el gaseoso (aire). Asimismo,
las manipulaciones del líquido fueron una fuente importante de proyección de
microorganismos al ambiente. Sin embargo, en el viñedo estas conclusiones no
fueron tan claras.

Conclusiones parciales

1. A medida que avanzó el período de maduración de la uva se

produjo un aumento del número de levaduras tanto en el aire
del viñedo como en los racimos de uva.

2. En el viñedo, el aire no pareció ser una vía importante de

diseminación de los microorganismos implicados en la
vinificación.

3. La presencia en el aire de la bodega de los distintos tipos de

microorganismos asociados a la uva y a la vinificación está
directamente relacionada con los procesos enológicos que se
desarrollan en la misma.

4. Los microorganismos cuantitativamente más abundantes en

el ambiente de la bodega fueron los mohos, puesto que el aire
es su forma habitual de diseminación. Las especies de mohos
más frecuentes en el aire de la bodega fueron Penicillium y

157
Conclusiones

Aspergillus, mientras que la presencia de Botrytis se ciñe al

periodo de entrada de uva.

5. La fuente de mohos en el aire de la bodega durante la

vendimia se encuentró básicamente en las uvas, puesto que la
población de estos microorganismos aumentó hasta 20 veces
en ese periodo.

6. Las levaduras No-Saccharomyces fueron las mayoritarias en

el aire del viñedo y en la superficie de las bayas, así como en
las instalaciones y en el ambiente de la bodega antes de
iniciarse los procesos fermentativos y una vez concluidos
éstos.

7. Las levaduras de la especie S. cerevisiae se detectaron en el

aire principalmente durante el desarrollo de las
fermentaciones alcohólicas en la bodega. El origen de estas
levaduras fueron fundamentalmente los depósitos en
fermentación y las instalaciones puesto que se encontraron
clones comunes de esta especie en los tres medios.

8. Existió un intercambio de levaduras entre el medio líquido

(mosto/vino), el sólido (instalaciones) y el gaseoso (aire)
durante los procesos de vinificación.

9. La mayor proporción de BL en el aire de las bodegas se

produjo cuando se estaba desarrollando la FML. Las
dimensiones de la bodega y la realización de dicha
fermentación en varios depósitos simultáneamente determinó
la cantidad de BL detectadas en el aire.

158
 Conclusiones

10. Las especies de BL detectadas en el aire antes de iniciarse las

FML son P. pentosaceus y Ln mesenteroides, mientras que
durante el desarrollo de las mismas todas las bacterias
aisladas en aire y vino pertenecen a la especie Oenococcus
oeni, encontrándose clones comunes en ambos medios.

11. Los momentos del proceso productivo que implican

manipulación o aireación del vino provocan que los
microorganismos que contienen sean expulsados al exterior y
detectados en el aire en gran cantidad.

Consideración final

La técnica de análisis de la calidad microbiológica del aire que se ha

utilizado en estos trabajos podría contribuir al control de procesos y desviaciones
microbiológicas desde la maduración de la uva, pasando por la elaboración y
conservación de los vinos.

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