Práctica N°4.

Bioensayo en semillas

I. INTRODUCCIÓN

El efecto tóxico o la respuesta tóxica es cualquier cambio en el funcionamiento normal

del organismo que ha sido producido por la exposición a una sustancia tóxica, para
este efecto se consideran solamente los cambios irreversibles o que permanecen un
periodo prolongado después de la exposición. Para el efecto de toxicología ambiental
las exposiciones se clasifican en exposiciones crónicas, subcrónicas y agudas. Las
exposiciones crónicas duran entre el 10 % y el 100% de la vida del organismo, las
exposiciones crónicas son menores al 10% del periodo vital y las exposiciones agudas
suceden en un solo evento y abarcan periodos cortos como de 24 a 120 horas (1). El
objetivo de realizar pruebas de toxicidad aguda es identificar el potencial toxicológico
de compuestos químicos ya sean comerciales o presentes en el ambiente. Este tipo de
pruebas son más factibles de hacer debido a que el tiempo de exposición es corto.

El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa) es una prueba

estática de toxicidad aguda (120 horas de exposición) en el que se pueden evaluar
los efectos fitotóxicos de compuestos puros o de mezclas complejas en el proceso de
germinación de las semillas y en el desarrollo de las plántulas durante los primeros
días de crecimiento. Como puntos finales para la evaluación de los efectos fitotóxicos,
se determina la inhibición en la germinación y la inhibición en la elongación de la
radícula y del hipocotilo (Figura 1). Es importante destacar que durante el período de
germinación y los primeros días de desarrollo de la plántula ocurren numerosos
procesos fisiológicos en los que la presencia de una sustancia tóxica puede interferir
alterando la supervivencia y el desarrollo normal de la planta, siendo por lo tanto una
etapa de gran sensibilidad frente a factores externos adversos. Por otra parte, muchas
de las reacciones y procesos involucrados son generales para la gran mayoría de las
semillas, por lo que la respuesta de esta especie y los datos obtenidos a partir de la
aplicación de esta prueba son en gran medida representativos de los efectos en
semillas o plántulas en general. El éxito o aptitud de una plántula para establecerse en
un ambiente determinado es de gran importancia para garantizar la supervivencia de
la especie. La evaluación del desarrollo de la radícula y del hipocotilo, constituyen
indicadores representativos para determinar la capacidad de establecimiento y
desarrollo de la planta.

A diferencia de la prueba tradicional de germinación de semillas, la evaluación del

efecto en la elongación de la radícula y del hipocotilo de las plántulas permite ponderar
el efecto tóxico de compuestos solubles presentes en niveles de concentración tan
bajos que no son suficientes para inhibir la germinación, pero que sin embargo pueden
retardar o inhibir completamente los procesos de elongación de la radícula o del
hipocotilo, dependiendo ello del modo y sitio de acción del compuesto. De esta
manera, la inhibición en la elongación de la radícula e hipocotilo constituyen
indicadores subletales muy sensibles para la evaluación de efectos biológicos en
vegetales, aportando información complementaria a la proporcionada al estudiar el
efecto en la germinación. Este ensayo puede ser aplicado para la evaluación de la
toxicidad de compuestos puros solubles, de aguas superficiales (lagos, ríos), aguas
subterráneas, aguas para consumo humano, aguas residuales domésticas e
 industriales, además de lixiviados de suelos, sedimentos, lodos u otras matrices
sólidas (Bowers et al, 1997; Cheung et al, 1989; Dutka, 1989). A diferencia de otras
pruebas en las que se consideran algas o plantas acuáticas sumergidas como
organismo de diagnóstico, el bioensayo con semillas permite evaluar la fitotoxicidad de
muestras coloreadas o con elevada turbiedad de manera directa y sin necesidad de
filtración previa, reduciéndose así las interferencias debidas al pretratamiento y
simplificando el procedimiento de prueba.

Figura 1. Proceso de germinación y morfología de la semilla y la plántula de lechuga

Lactuca sativa L.

II. OBJETIVO

 Los alumnos evaluarán los métodos de germinación y los efectos fitotóxicos de

una solución que contiene un elemento contaminante, en el proceso de
germinación de las semillas y en el desarrollo de las plántulas (de lechuga -
Lactuca sativa L.) durante los primeros días de crecimiento.

III. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS

Materiales para ensayo de germinación de semillas:

 Muestra biológica: Semillas. (*Semillas de lechuga de la especies L. sativa L

variedad mantecosa)
 Taper y Frasco con tapa (Cajas Petri de 100 mm de diámetro)
 Regla u otro elemento de medición
 Pinzas
 Toallas de papel
 Bolsas plásticas
 Agua (sin cloro, detergentes u otros; el agua puede ser previamente calentada)
Materiales para ensayo de toxicidad aguda

 Matraces aforados de 50 mL
 Pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 mL
 Regla u otro elemento de medición
 Pinzas
 Toallas de papel
 Bolsas plásticas
 **Papel de filtro Whatman No. 3 (o equivalente), 90 mm de diámetro.
 *Las semillas de lechuga se adquieren en establecimientos locales, procurando
que sean semillas sin ningún tratamiento (sin fungicidas o plaguicidas), con buen
poder germinativo y baja variabilidad en la elongación de la radícula e hipocotilo.
**El papel de filtro que se seleccione como sustrato de germinación debe tener las
siguientes características: trama amplia y porosa que asegure una buena
capacidad de retención de líquido; resistencia de la fibra del papel para que las
radículas crezcan por su superficie sin atravesarlo, situación que dificultaría la
remoción de las plántulas sin dañarlas; ausencia de residuos tóxicos (por ejemplo,
blanqueadores; y que no promueva el desarrollo de hongos (no asociados a las
semillas).

IV. METODOLOGÍA
Ensayo de germinación de semillas:
1. Identificar el tiempo de germinación de la semilla a experimentar, que no sea mayor
de 1 semana (de preferencia que sea de la temporada).
2. Elaborar el germinador horizontal (taper) y vertical (frasco) de 10 - 20 semillas
aprox., siguiendo el ejemplo de los videos:
https://www.youtube.com/watch?v=RFHjwBE9zqs
https://www.youtube.com/watch?v=PDIQMriH9is
https://www.youtube.com/watch?v=QY5cu57-ibg&t=1s
3. Tomar foto de los germinadores elaborados.
4. Adicionar la cantidad de agua y colocarlos en la oscuridad teniendo en cuenta el
control de la temperatura (recomendable 22°C aprox), la cantidad de semillas
utilizadas.

 Colocar las cajas en bolsas de plástico negras, para evitar la pérdida de agua por
evaporación y para no inhibir la germinación, debido a que las semillas son
fotoblasticas negativas.
4. Revisar periódicamente cada día para evitar sequedad y/o producción de hongos u
otros.
5. Describir cada 2 días hasta el periodo de germinación de la semilla (registrado en la
literatura), los cambios de la semilla (anotando fecha y hora):
- Color y olor.
- Cuantas germinaron (cuantas tienen tallos, hojas, radículas).
- Cuantas se pudrieron.
- También es necesario anotar cualquier cambio.
- Registrar la medición de elongación de la radícula (retirar la semilla con cuidado de
no dañar la radícula)
6. Las fotos deben tomarse al inicio y final del experimento.