Buscar Iniciar sesión

Explore Información Diario

naturaleza informes científicos artículos artículo

Descargar PDF

Artículo Acceso abierto Publicado: 05 febrero 2019

Una variante del gen MICA se asocia con la progresión de la fibrosis hepática en la hepatitis
C crónica a través de mecanismos dependientes de TGF-β1
Rasha El Sharkawy ,Ali Bayoumi ,[…] Consorcio Internacional de Genética de Enfermedades Hepáticas (ILDGC)

Informes científicos  9 , Número de artículo:  1439 ( 2019 )

1180 Accesos 34 Altmétrico Métrica

Abstracto

La hepatocarcinogénesis está estrechamente relacionada con la fibrosis hepática. Recientemente, se identificaron dos
variantes de GWAS, MICA rs2596542 y DEPDC5 rs1012068, asociadas con el desarrollo de carcinoma hepatocelular
(CHC) inducido por VHC en pacientes japoneses. Se desconoce el papel de estas variantes en la inflamación hepática y
la fibrosis que están estrechamente asociadas con el desarrollo de HCC, ni los mecanismos biológicos subyacentes a su
impacto en el hígado. Aquí, demostramos en 1689 pacientes con hepatitis C crónica (CHC) (1,501 con CHC y 188 con
CHC relacionado con el VHC), que el MICAEl alelo (T), a pesar de no estar asociado con la susceptibilidad al CHC, se
asocia con un aumento del estadio de fibrosis (OR: 1,47, IC del 95%: 1,05-2,06, p = 0,02) y la tasa de progresión de la
fibrosis (índice de riesgo: 1,41, IC del 95%: 1,04-1,90, p = 0,02). La variante DEPDC5 no se asoció con ninguno de estos
fenotipos. La expresión de MICA se reguló negativamente en las etapas avanzadas de fibrosis. Además, el transporte
del alelo (T) se asoció con una menor expresión de MICA en hígado y suero. La expresión del factor de crecimiento
transformante-β1 (TGF-β1) suprime la expresión de MICA en las células estrelladas hepáticas. Nuestros hallazgos
sugieren un mecanismo novedoso que vincula la susceptibilidad a la fibrosis avanzada y, posteriormente,
indirectamente a HCC, al nivel de expresión de MICA a través de mecanismos dependientes de TGF-β1.

Download PDF

Introducción

La infección crónica por el virus de la hepatitis C (VHC) es una de las principales causas de cirrosis, carcinoma
hepatocelular (CHC) y trasplante de hígado, y se estima que 339.000 personas mueren anualmente por complicaciones
1
. La fibrosis o cirrosis hepática avanzada representa el principal factor de riesgo para desarrollar complicaciones y
mortalidad relacionadas con el hígado, pero actualmente no existen terapias antifibróticas aprobadas 2 .

La tasa de progresión de la fibrosis hepática varía mucho según la etiología de la enfermedad y también entre
individuos; este último es al menos parcialmente atribuible a factores genéticos. En la infección crónica por el VHC, la
genética del huésped juega un papel fundamental en la configuración de la respuesta inmunitaria, las interacciones
virus-huésped y, en última instancia, la predilección y el progreso de la fibrosis hepática 3 , 4 . Es probable que este
riesgo sea poligénico y dependa de múltiples factores genéticos y epigenéticos, ya que las variaciones en los loci
individuales suelen tener un tamaño de efecto modesto y solo explican una pequeña fracción del fenotipo 5 . Esto ha
llevado en el pasado reciente a un cambio hacia el descubrimiento de nuevas variantes con efectos limitados que, en
última instancia, podrían orientar el desarrollo de puntuaciones poligénicas con alto valor predictivo.

Dos estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) han investigado el riesgo de CHC relacionado con el VHC en
pacientes japoneses. El primero identificó un locus en la región flanqueante 5 'de la cadena A ( MICA ) relacionada con
MHC de clase I en 6p21.33 (rs2596542) para estar fuertemente asociado con HCC y la progresión de CHC a HCC 6 .
MICA es un ligando para el miembro D del grupo asesino natural 2 (NKG2D), una glucoproteína de membrana similar a
lectina de tipo C altamente conservada y uno de los principales receptores de activación en las células NK 7 . El
segundo GWAS identificó un locus de susceptibilidad cerca de DEPDC5 (rs1012068) 8 . La función de DEPDC5 no se
comprende bien, pero se ha relacionado con formas hereditarias de epilepsia 9 , cáncer de vejiga 10y glioblastomas
malignos 11 .

Sin embargo, lo que complica la interpretación de estos hallazgos es que el desarrollo de CHC en la infección crónica
por VHC está estrechamente relacionado con la fibrosis hepática y el 90% de los casos surgen en hígados cirróticos 12 .
Por lo tanto, las variantes de riesgo que predisponen a la fibrosis podrían estar asociadas con la formación de HCC sin
una causalidad directa y desenredar las dos es problemático. Al respecto, se sabe poco sobre el efecto potencial de
variantes en MICA y DEPDC5sobre la fibrosis hepática ya que ambos GWAS se realizaron en pacientes en los que no se
disponía de biopsia hepática. Es importante destacar que los datos funcionales sobre el papel de estas variantes con
respecto a las vías de fibrosis o al desarrollo de CHC son limitados. La literatura disponible también está restringida a
poblaciones japonesas con infección crónica por VHC y CHC, mientras que un único informe en caucásicos 13 sugiere
que DEPDC5, pero no MICA, está asociado con la progresión de la fibrosis.

Aquí buscamos diseccionar el papel de MICA rs2596542 y DEPDC5 rs1012068 en la fibrosis hepática y el HCC
relacionado con el VHC. Para ello, se evaluaron estas variantes en 1.501 pacientes con HCC de ascendencia caucásica en
los que se disponía de biopsia hepática y se compararon con 188 pacientes con HCC relacionado con HCC. Realizamos
estudios funcionales para explorar los mecanismos que podrían subyacer a la asociación genética con la fibrosis.

Resultados

Caracteristicas del paciente

Las características clínicas, demográficas y bioquímicas de los pacientes de la cohorte con infección crónica por VHC (n
= 1501) se presentan en la Tabla complementaria  1 . La distribución de genotipos de MICA rs2596542 y DEPDC5
rs1012068 estaba en equilibrio de Hardy-Weinberg y se presenta en la Tabla complementaria  2 . La frecuencia de
alelos menores (MAF) para las dos variantes fue similar a la observada en una población europea sana del proyecto del
genoma 1000 ( http://browser.1000genomes.org ), que tiene alguna diferencia con la población japonesa.

Asociación de MICA rs2596542 y DEPDC5 rs1012068 con características víricas y clínicas

Para explorar si las variables clínicas basales difieren entre los pacientes con VHC crónico según el genotipo MICA
rs2596542 o DEPDC5 rs1012068, examinamos la asociación de los genotipos con las variables clínicas basales; los
resultados se presentan en las Tablas complementarias  3 y 4 , respectivamente. No hubo evidencia de asociación entre
el genotipo rs2596542 o rs1012068 con ninguna variable clínica (es decir, edad, IMC, niveles iniciales de ALT, AST, GGT,
ALP, plaquetas, leucocitos, cuantificación del ARN del VHC, frecuencia de género o distribución del genotipo del VHC).

MICA rs2596542, pero no DEPDC5 rs1012068 se asocia con la gravedad de la fibrosis

A continuación, evaluamos la asociación entre MICA rs2596542 y DEPDC5 rs1012068 y daño hepático (inflamación
hepática y fibrosis). La distribución de rs2596542 y rs1012068 genotipos de acuerdo con características histológicas se
representa en la Fig.  1 .
 Figura 1

Asociación de MICA rs2596542 y DEPDC5 rs1012068 con inflamación, estadio de fibrosis. Asociación de MICA
rs2596542 con estadio de fibrosis ( a ) e inflamación ( b ) y DEPDC5 rs1012068 con estadio de fibrosis ( c ) e
inflamación ( d ) en la cohorte de CHC (n = 1501). Los valores p son univariados y se proporcionan para el modelo
aditivo de herencia. El alelo MICA rs2596542 (T) es el alelo de riesgo, el mismo alelo de riesgo en el GWAS de
Kumar et al . 6 . El alelo DEPDC5 rs1012068 (G) es el alelo de riesgo, el mismo alelo de riesgo en el GWAS de Mikiet
al . 8 .

Primero, examinamos la asociación de las dos variantes genéticas con la fibrosis. En análisis multivariados que
adoptaron un modelo aditivo ajustado por edad, sexo, IMC, genotipo del VHC e ingesta de alcohol, MICA rs2596542 se
asoció significativamente con el estadio de fibrosis (estimación ajustada, 0.072, SE, 0.051; p = 0.01) (Tabla
complementaria  5 ). En un análisis posterior, cuando la cohorte se segregó en aquellos con fibrosis leve (F0-1) versus
fibrosis avanzada (F2-4), el transporte de cada copia del alelo MICA rs2596542 (T) se asoció consistentemente con un
aumento significativo del riesgo de fibrosis avanzada, independientemente de la edad, el sexo, el IMC, el genotipo del
VHC y la ingesta de alcohol (OR: 1,47, IC del 95%: 1,05-2,06, p = 0,02) (Tabla complementaria  6). De forma similar,
rs2596542 se asoció con fibrosis grave (F3-F4) (OR: 1,43, IC del 95%: 1,03–1,99, p = 0,03). Por el contrario, no
observamos asociación entre DEPDC5 rs1012068 y estadio de fibrosis (Tabla complementaria  5 ); la distribución de los
genotipos de rs1012068 tampoco fue significativamente diferente según la presencia o ausencia de fibrosis significativa
o severa (Tabla complementaria  6 ).

A continuación, examinamos la asociación de las dos variantes genéticas con la inflamación hepática definida por
histopatología hepática puntuada según METAVIR. Ni MICA rs2596542 ni DEPDC5 rs1012068 demostraron asociación
alguna con el grado de inflamación (Tabla complementaria  5 ). Tampoco se observó asociación cuando la cohorte se
dicotomizó en inflamación ausente / leve (A0-A1) versus inflamación moderada / grave (A2-A3) (Tabla complementaria 
6 ). De manera consistente, no se observaron diferencias en las enzimas hepáticas séricas (ALT o AST; como índices de
daño hepático) según rs2596542 o rs1012068 (Tablas complementarias  3 y 4 , respectivamente).

Asociación entre MICA rs2596542 y progresión de la fibrosis

Para validar estas observaciones, realizamos un análisis en los 815 pacientes de toda la cohorte con infección crónica
por VHC y una duración conocida de la infección. Esto permitió evaluar la relación con la progresión de la fibrosis sin
los sesgos inherentes de los análisis transversales. Las características basales de la cohorte fueron similares entre los
sujetos incluidos y no incluidos en el subanálisis de progresión de la fibrosis (Tabla complementaria  7 ). Dado que la
tasa de progresión de la fibrosis (FPR) puede no ser constante en el tiempo 14, utilizamos el análisis de riesgos
proporcionales de Cox. En este análisis, rs2596542 se asoció con un mayor riesgo de progresión a fibrosis significativa
(≥F2) en un modelo multivariado que incluía edad, sexo, IMC y genotipo del VHC (cociente de riesgos: 1,41, IC del 95%:
1,04–1,90, p = 0,02 por cada alelo T). Por el contrario, DEPDC5 rs1012068 no se asoció con FPR (índice de riesgo: 1,06,
IC del 95%: 0,76–1,48, p = 0,7) (Tabla complementaria  8 ). En resumen, estos datos sugieren que MICA rs2596542 pero
no DEPDC5 rs1012068 está asociado con la gravedad de la fibrosis y la progresión de la fibrosis.

La infección crónica por VHC aumenta la expresión de MICA hepática

En los estudios posteriores que se informan a continuación, buscamos definir la base funcional para la asociación de
variantes en MICA a la fibrosis hepática. La expresión de MICA es baja en tejidos sanos pero puede ser inducida por
estresores celulares como la infección viral 15 ; Se desconoce el efecto de la infección por VHC sobre la expresión de
MICA hepática. Por lo tanto, comparamos la expresión de MICA en el hígado de pacientes con VHC y de controles no
infectados. La RT-PCR demostró un aumento de la expresión de ARNm de MICA en pacientes con infección crónica por
VHC (Fig.  2a ). Luego evaluamos la expresión de MICA en JFH1 / Huh7 in vitromodelo de replicación del VHC. De
manera consistente, las células Huh7 infectadas con la cepa JFH1 del VHC demostraron una regulación al alza de 3
veces el ARNm de MICA en comparación con las células de control no infectadas (Fig.  2b ), p <0,05).

Figura 2
 Expresión de MICA hepática y sérica. Expresión de ARNm de MICA hepática relativa en 94 pacientes con infección
crónica por el virus de la hepatitis C y 28 controles ( a ); expresión relativa de ARNm de MICA en células Huh7
infectadas con el virus de la hepatitis C de la cepa JFH1 en comparación con células de control infectadas simuladas
( b ); correlación entre el genotipo MICA rs2596542 y el ARNm de MICA hepático ( c ) y los niveles de MICA soluble
(n = 214) ( d). El eje x muestra los genotipos en rs2596542 y el eje y muestra el nivel de expresión de MICA en
relación con GAPDH por PCR cuantitativa en tiempo real o la concentración de MICA soluble en pg / ml por ELISA,
respectivamente. El nivel de ARNm de MICA hepático se correlaciona positivamente con los niveles de MICA
soluble en suero en una subcohorte de CHC con ARN y suero disponibles (n = 58) ( e ); ARNm de MICA hepático
según fibrosis hepática ( f). El eje x muestra la fibrosis hepática dicotomizada como ausente / leve (estadio METAVIR
F0-F1) o moderada / grave (estadio METAVIR F2-F4), y el eje y muestra la expresión de MICA hepática. El número de
muestras independientes analizadas en cada grupo se muestra debajo de la figura y el valor P se calculó usando la
prueba t de Student de dos colas o la prueba ANOVA con la prueba de Tukey para la corrección de comparaciones
múltiples.

El efecto biológico de MICA en el hígado infectado por el VHC probablemente refleja una interacción compleja entre
los diferentes tipos de células dentro de un hígado inflamado que finalmente conduce a la fibrosis. Por lo tanto,
examinamos la expresión de MICA en cuatro tipos primarios de células hepáticas humanas, a saber, hepatocitos, células
de Kupffer, células endoteliales sinusoidales hepáticas y células estrelladas mediante PCR en tiempo real. La expresión
más alta de MICA estaba en las células estrelladas seguidas de las células de Kupffer, mientras que las células
sinusoidales y los hepatocitos tenían una expresión baja (Fig. 1 complementaria  ).

Los niveles de MICA membranosa y soluble se asocian con el genotipo MICA y la gravedad de la fibrosis

No se sabe si el alelo de riesgo MICA está asociado con la expresión alterada unida a la membrana (mMICA) en el
tejido hepático de pacientes con infección crónica por VHC, ya que todos los datos actuales disponibles se basan en la
forma soluble (sMICA) presente en el suero 6 , 16 . Como se muestra en la Fig.  2c , observamos una asociación
significativa entre el genotipo rs2596542 y la expresión de ARNm de MICA; el alelo (T) asociado con ARNm de MICA
hepático inferior en los 94 pacientes con tejido hepático disponible (P = 0,01, p = 0,02 después del ajuste por edad y
sexo).

Luego medimos MICA soluble (sMICA) por ELISA en muestras de suero de una subcohorte de 214 pacientes con
infección crónica por VHC; sus características se resumen en la Tabla complementaria  9 y se corresponden con la
cohorte general. De manera similar a mMICA, en comparación con los pacientes que albergan el genotipo MICA
rs2596542 CC, los niveles de sMICA se redujeron significativamente en aquellos con el alelo T de riesgo (Fig.  2d ).
Determinamos la correlación de mMICA con sMICA en 58 pacientes en los que se disponía de datos emparejados de
hígado y suero. En este análisis, los niveles de sMICA asociados con la expresión de mMICA (p = 0,0001) (Fig.  2e ).

En total, la expresión de MICA está regulada positivamente en la infección por VHC de una manera dependiente del
genotipo rs2596542 con individuos portadores de rs2596542 (T) que expresan niveles más bajos de mMICA y sMICA.
Esto sugiere que las diferencias en los niveles de expresión de mMICA según el genotipo no son una consecuencia de
las diferentes tasas de desprendimiento de MICA.

Expresión de MICA y fibrosis hepática

La contribución general de la vía MICA / NKG2D a la fibrosis no está clara. Curiosamente y de acuerdo con los datos
genéticos, la expresión de MICA hepática fue significativamente menor en sujetos con fibrosis hepática significativa
(F2-F4) en comparación con aquellos con fibrosis hepática leve o nula (F0 / 1) (n = 94) (Fig.  2f ). La expresión de MICA
no se correlacionó con la inflamación hepática, las enzimas hepáticas, los niveles de ARN del VHC y el genotipo, la
edad o el sexo. De manera similar, los niveles de sMICA disminuyeron en pacientes con fibrosis significativa en
comparación con los que no la tenían, aunque esto no fue significativo (Fig. 2 complementaria  ).

La expresión de MICA está regulada por TGF-β1 en células estrelladas hepáticas

A continuación, pensamos en explorar cómo la expresión diferencial de MICA hepática podría estar relacionada con la
progresión de la fibrosis. Las células estrelladas hepáticas (HSC) son responsables del depósito de matriz extracelular
que histológicamente se evidencia como fibrosis 17 y como hemos demostrado, también tienen la mayor expresión de
MICA. La destrucción de las células madre hematopoyéticas activadas por las células NK para mejorar la fibrosis
hepática es en parte por una manera dependiente de MICA / NKG2D 18 . Por lo tanto, investigamos la regulación de la
expresión de MICA en HSC en un contexto fibrótico.

Se ha informado que la expresión superficial de MICA está regulada negativamente por TGF-β1 19 , un factor de
crecimiento establecido que media la lesión hepática y la fibrosis 12 . Por lo tanto, caracterizamos la regulación mediada
por TGF-β1 de la expresión de MICA en las HSC. Primero evaluamos la expresión de ARNm de TGF-β1 después de la
infección por VHC in vitro usando qRT-PCR. Esto reveló un aumento significativo en TGF-β1 en células JFH-1 / Huh7
infectadas con VHC en comparación con células no infectadas (Fig.  3a ). Consistentemente, se observó aumento de la
transcripción de TGF-β1 en el hígado a partir de muestras de hígado infectados por VHC crónica en comparación con
los controles sanos (Fig.  3b). Dentro del grupo de infección crónica por el VHC, la expresión de ARNm de TGF-β1 se
incrementó significativamente con el avance de la etapa de fibrosis (  Fig.3b ) y esto se observó consistentemente en la
subcohorte con suero disponible descrito anteriormente (n = 214) Figura  3c ).

figura 3
 La transformación del factor de crecimiento beta influye en la expresión de MICA. Expresión relativa de ARNm de
TGF-β1 en células Huh7 infectadas con la cepa JFH1 del virus de la hepatitis C en comparación con células de
control infectadas de forma simulada ( a ); expresión relativa de ARNm de TGF-β1 hepático en 94 pacientes con
infección crónica por el virus de la hepatitis C y 28 controles según el estadio de fibrosis ( b ); concentración sérica
de TGF-β1 en niveles de pg / ml según fibrosis hepática (n = 214) ( c ); Expresión de ARNm de MICA y niveles de
proteína en la modulación de la superficie de la célula estrellada hepática por TGF-β1. Se evaluó la expresión de
ARNm de MICA en el control, TGF-β1 (2 ng / ml) con o sin LY2109761 (un inhibidor de TGFβR-I / II) (100 nM, se
agregó 90 minutos antes que TGF-β1) o LY2109761 (100 nM) células tratadas durante 24 horas mediante PCR en
tiempo real (d ), o 48 horas para citometría de flujo ( e ); el nivel de MICA soluble se evaluó en el sobrenadante de
control o células LX2 tratadas con TGF-β1 (2 ng / ml) durante 24 y 48 horas mediante ELISA ( f ). Los resultados se
expresan como media ± sem (n = 3) y el valor de P se calculó utilizando la prueba t de Student de dos colas o la
prueba ANOVA con la prueba de Tukey para la corrección de comparaciones múltiples. * P <0,05, ** P <0,001, *** P
<0,0001.

Dados estos resultados, examinamos el efecto de TGF-β1 sobre la expresión de MICA en una línea celular derivada de
HSC humana (LX2). Observamos una marcada represión de los transcritos de ARNm de MICA en células LX2
estimuladas con TGF-β1 (Fig.  3d ), así como una expresión de superficie reducida de MICA, mediante citometría de
flujo (Fig.  3e ). Para confirmar que este efecto estaba mediado a través del TGFβR, usamos un inhibidor farmacológico
específico de TGFβR-I / II (usando LY2109761) y esto, como se esperaba, revirtió el efecto inhibidor del TGFβ1 exógeno
sobre la expresión de MICA (Fig.  3d y e). Para caracterizar el papel del TGF-β1 derivado de HSC endógeno en la
regulación de la expresión de MICA, utilizamos células LX2 tratadas con LY2109761 y demostramos una inducción
significativa de transcritos de ARNm de MICA y niveles de expresión de superficie (Fig.  3d y e ).

Por último, informes anteriores han observado un efecto positivo del tratamiento con TGF-β1 sobre la expresión de
algunas proteasas, incluida la MMP-9. Dado que la expresión de la superficie de MICA se puede modular a un nivel
postraduccional mediante la escisión proteolítica 20 , preguntamos si el desprendimiento de sMICA se mejoraba en las
células estimuladas con TGF-β1, contribuyendo así a la atenuación de la expresión de superficie en estas células. Con
este fin, medimos sMICA en el sobrenadante del cultivo celular y demostramos que el nivel de sMICA liberado por las
células estimuladas con TGF-β1 no era diferente en comparación con las células de control, lo que sugiere que la
escisión de MICA no está mediada por proteasas dependientes de TGF-β1 (Fig.  3f ).

El polimorfismo MICA no está asociado con HCC

 Como MICA se descubrió originalmente como un locus de riesgo para el HCC en pacientes japoneses, investigamos el
papel de MICA en la hepatocarcinogénesis. Se comparó MICA distribución de los genotipos en pacientes con HCV-HCC
crónica (n = 188) a la no-HCC de toda la cohorte infección crónica por el VHC se ha descrito anteriormente (n = 1501;
el cuadro complementario  10 ). No observamos diferencias en la distribución de MICA rs2596542 entre sujetos con
CHC y sin HCC. Debido a que el HCC ocurre principalmente en el contexto de la cirrosis, realizamos un análisis similar
restringiendo la comparación a aquellos con HCC versus aquellos con infección crónica por VHC y cirrosis (n = 210).
Nuevamente, no hay diferencia en MICASe observó una distribución de rs2596542 entre sujetos con HCC y aquellos
con cirrosis (p = 0,77). Los resultados no se modificaron después del ajuste por edad y sexo. Estos hallazgos implican
que es poco probable que el polimorfismo MICA rs2596542 esté directamente asociado con la aparición de CHC.

Discusión

Aquí, informamos que una variante genética en MICA originalmente identificada por GWAS como una variante de
riesgo de susceptibilidad al CHC asociado al VHC en pacientes japoneses 6 se asocia con la gravedad y progresión de la
fibrosis, pero no con el CHC. Funcionalmente, nuestros datos sugieren que la asociación con HCC está plausiblemente
mediada por efectos indirectos a través de la modulación del riesgo de fibrosis. Después de los datos de los efectos
sobre la progresión de la fibrosis, mostramos MICA reducciones genotipo-dependiente en la expresión génica MICA
hepática y los niveles de proteína MICA solubles. Al vincular estos hallazgos con la fibrosis, el TGF-β1 aumentó con el
avance de la fibrosis y hubo una reducción correspondiente en la expresión de MICA. In vitro, El tratamiento con TGF-
β1 dio como resultado la represión de proteínas transcripcionales y de superficie de MICA en células HSC. Estos efectos
que proponemos conducen a una mayor probabilidad de fibrosis en aquellos con el genotipo de riesgo. Por lo tanto,
nuestros hallazgos sugieren una explicación molecular para la asociación de rs2596542 con fibrosis hepática (Fig.  4 ).

Figura 4
 Modelo propuesto para el efecto de MICA rs2596542 en la modulación del riesgo de fibrosis hepática. Los
pacientes que portan el genotipo de riesgo MICA tienen una expresión de MICA hepática y sérica baja. TGF-β1
suprime aún más la expresión de MICA en las células estrelladas hepáticas, lo que conduce a un aumento de la
fibrosis hepática.

De acuerdo con los hallazgos actuales en el contexto de la infección crónica por VHC, un informe reciente sugiere que
los polimorfismos MICA (MICA * 012: 01/02, MICA * 017 y MICA * 027) están asociados con la fibrosis hepática en la
esquistosomiasis 21 . Es de destacar que en el informe GWAS original de MICA en HCC relacionado con el VHC, Kumar
et al ., No utilizaron la cirrosis relacionada con el VHC sin HCC como su cohorte de control, enmascarando cualquier
posible confusión por fibrosis 6 . Esto y el hecho de no encontrar una asociación con MICA en un estudio japonés
similar publicado 2 meses después 8, así como los datos funcionales que proporcionamos, sugieren que la asociación
informada con HCC en realidad se relaciona con el riesgo de fibrosis hepática.

MICA es una proteína inducible por estrés presente en niveles muy bajos en tejidos sanos, pero puede ser inducida por
estrés celular como la infección viral 15 . De manera consistente, demostramos aumentos en la expresión de MICA
durante las primeras etapas de la infección por VHC, mientras que disminuye con el aumento de la fibrosis de una
manera dependiente del genotipo rs2596542. Además, el alelo de riesgo (T) se correlacionó con una menor mMICA en
el hígado. De acuerdo con otros grupos 6 , 16 , demostramos niveles de expresión disminuidos de sMICA en el suero de
pacientes con el alelo (T) rs2596542.

Los mecanismos que vinculan los genotipos MICA con el riesgo de fibrosis no se han dilucidado previamente. MICA es
un ligando para la activación del receptor de células NK NKG2D y esta interacción da forma a la capacidad antifibrótica
de las células NK a través de la eliminación de las HSC activadas 18 , 22 Verificamos que la infección por VHC se asocia
con un aumento en la expresión de TGF-β1 en el hígado 23 y el último induce una marcada represión de la expresión de
MICA en HSC. Esto sugiere que el genotipo MICA podría estar asociado con alteraciones en TGF-β1 (a través de
mecanismos aún no definidos) y puede ser la base de la fibrosis acelerada que observamos.

No observamos ninguna asociación entre DEPDC5 rs1012068, la otra variante identificada por GWAS como una
variante de riesgo para HCC 8 , con fibrosis o HCC. Un gran estudio japonés de 2.266 pacientes con VHC que se había
erradicado el VHC y con seguimiento a largo plazo de hasta 20 años, también fue incapaz de encontrar ninguna
asociación entre DEPDC5 SNP rs1012068 y en el riesgo acumulado de HCC 24 . Algunos estudios han reportado una
asociación de DEPDC5 con fibrosis pero con efectos opuestos del alelo de riesgo 13 , 25 , 26 . Un estudio reciente más
pequeño realizado en europeos sugirió una asociación entre DEPDC5 rs1012068 pero no MICArs2596542 y riesgo de
cirrosis en la infección crónica por VHC 13 . Las razones de la discrepancia entre nuestro estudio y este trabajo no están
claras, pero pueden estar relacionadas con las diferencias en las características basales y que los análisis de asociación
para la fibrosis se realizaron de manera diferente, ya que esos autores compararon F0-F1 versus F4. Curiosamente, en
ese estudio, MICA rs2596542 mostró una tendencia de significación con cirrosis (p = 0,07) en la cohorte de
descubrimiento (n = 477) pero no se investigó en la cohorte de validación. Es necesario definir la función de DEPDC5
en el hígado.

Nuestro estudio tiene algunas limitaciones, incluido el hecho de que el tamaño de la muestra de las subcohortes de
PCR y ELISA fue relativamente modesto. Además, si MICA rs2596542 es el polimorfismo funcional o si existen otras
variantes en el desequilibrio de ligamiento y los mecanismos funcionales detallados de los efectos aún no se
comprenden completamente.

En conclusión, hemos demostrado que MICA rs2596542 está asociado con la progresión de la fibrosis hepática,
probablemente mediada y amplificada en parte a través de mecanismos dependientes de TGFβ-1.
Métodos

Cohorte de pacientes

El estudio incluyó a 1689 pacientes consecutivos (1,501 con HCC y 188 con HCC relacionado con el VHC) de la base de
datos del Consorcio Internacional de Genética de Enfermedades Hepáticas (ILDGC). Se han informado detalles de la
cohorte y los criterios de inclusión 27 , 28 , 29 . En resumen, se incluyeron todos los sujetos a los que se les realizó una
biopsia de hígado con puntuación para el estadio de fibrosis y la actividad de la enfermedad antes del tratamiento
antivírico y el ADN genómico. Para aquellos con CHC, se incluyeron aquellos con positividad en suero de ARN del VHC
de ascendencia caucásica autoinformada. Los pacientes fueron excluidos si tenían evidencia de coinfección con otros
virus de la hepatitis, otras enfermedades hepáticas mediante pruebas estándar o descompensación hepática actual o
previa. El diagnóstico de CHC se basó en las Guías de práctica clínica de la EASL-EORTC 30.

El protocolo del estudio se ajustó a las directrices éticas de la Declaración de Helsinki de 1975. La aprobación de ética
se obtuvo de los Comités de Ética de Investigación en Humanos del Distrito de Salud Local de Western Sydney y la
Universidad de Sydney. Todos los demás sitios contaron con la aprobación ética de sus respectivos comités de ética y el
estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de los centros involucrados. Se obtuvo el consentimiento
informado por escrito para las pruebas genéticas de todos los participantes.

Evaluación clínica y de laboratorio

Se recogieron los siguientes datos en el momento de la biopsia hepática de todos los pacientes: sexo, edad, etnia,
centro de reclutamiento, ingesta de alcohol (g / día), índice de masa corporal (IMC) y pruebas de laboratorio de rutina.
El IMC se calculó como el peso dividido por el cuadrado de la altura (kg / m 2 ).

Métodos para estimar la duración de la infección.

La progresión de la fibrosis se examinó en 815 pacientes con infección crónica por VHC con una duración estimada
confiable de la infección, como se informó anteriormente 31 , 32 . En resumen, para los sujetos con antecedentes de
consumo de drogas inyectables, el tiempo de infección se calculó utilizando el "primer año de inyección" informado.
Para los pacientes con antecedentes de transfusión de sangre, se asumió que el inicio de la infección era el año de la
transfusión. Para los pacientes con antecedentes de exposición ocupacional, se asumió que el inicio de la infección era
el primer año de exposición al pinchazo de aguja. La duración de la infección se calculó restando la edad estimada en
el momento de la infección de la edad en el momento de la biopsia.

Genotipado

El genotipado para MICA rs2596542 y DEPDC5 rs1012068 se contrató al Centro de Investigación del Genoma de
Australia (AGRF; QLD, Australia). Se genotipificaron 1051 muestras usando el sistema Sequenom MassARRAY y la
química iPLEX Gold, mientras que 638 muestras se genotiparon usando el método de discriminación alélica de
genotipado TaqMan SNP (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Todos los genotipos fueron cegados a las
variables clínicas.

Histopatología hepática

La histopatología hepática se puntuó según METAVIR 33 . La fibrosis se clasificó de F0 (sin fibrosis) a F4 (cirrosis). La
necroinflamación (A) se calificó como A0 (ausente), A1 (leve), A2 (moderada) o A3 (grave). La concordancia
interobservador entre patólogos se estudió previamente y fue buena (κ = 77,5) para la estadificación METAVIR
utilizando la estadística κ 34 .
Otros metodos

Los métodos de cultivo celular, PCR en tiempo real, ELISA y citometría de flujo se describen en Materiales y métodos de
la información complementaria.

análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete de software estadístico SPSS para Windows, versión 21
(SPSS, Chicago, IL). Todas las pruebas fueron de dos colas y los valores de p <0,05 se consideraron significativos. Los
detalles de los análisis estadísticos se describen en los Materiales y métodos de la información de respaldo.

Disponibilidad de datos

Todos los datos se proporcionan dentro del texto principal y el archivo complementario.

Referencias

1.
1. OMS. Hepatitis C. Hoja informativa. Actualizado en abril de 2017,
http://www.who.int/mediacentre/factssheets/fs164/en/ (consultado el 30 de julio de 2017).

2.
2. Iredale, JP Modelos de fibrosis hepática: exploración de la naturaleza dinámica de la inflamación y reparación
en un órgano sólido. J Clin Invest 117 , 539–48 (2007).

3.
3. Romero-Gomez, M., Eslam, M., Ruiz, A. & Maraver, M. Genes y hepatitis C: susceptibilidad, progresión de la
fibrosis y respuesta al tratamiento. Liver Int 31 , 443–60 (2011).

4.
4. Eslam, M. y George, J. Estudios de asociación de todo el genoma y hepatitis C: cosechando los beneficios de la
revolución genómica. Semin Liver Dis 35 , 402-20 (2015).

5.
5. Gibson, G. Variantes raras y comunes: veinte argumentos. Nat Rev Genet 13 , 135–45 (2011).

6.
6. Kumar, V. y col . El estudio de asociación de todo el genoma identifica un locus de susceptibilidad para el
carcinoma hepatocelular inducido por el VHC. Nat Genet 43 , 455–8 (2011).

7.
7. Raulet, D. H. Roles of the NKG2D immunoreceptor and its ligands. Nat Rev Immunol 3, 781–90 (2003).

8.
8. Miki, D. et al. Variation in the DEPDC5 locus is associated with progression to hepatocellular carcinoma in
chronic hepatitis C virus carriers. Nat Genet 43, 797–800 (2011).

9.
9. Ishida, S. et al. Mutations of DEPDC5 cause autosomal dominant focal epilepsies. Nat Genet 45, 552–5 (2013).

10.
10. Harada, Y. et al. Cell-permeable peptide DEPDC1-ZNF224 interferes with transcriptional repression and
oncogenicity in bladder cancer cells. Cancer Res 70, 5829–39 (2010).

11.
11. Seng, T. J. et al. Complex chromosome 22 rearrangements in astrocytic tumors identified using microsatellite
and chromosome 22 tile path array analysis. Genes Chromosomes & Cancer 43, 181–193 (2005).

12.
12. Zhang, D. Y. & Friedman, S. L. Fibrosis-dependent mechanisms of hepatocarcinogenesis. Hepatology 56, 769–
75 (2012).
13. 13. Burza, M. A. et al. DEPDC5 variants increase fibrosis progression in Europeans with chronic hepatitis C virus
infection. Hepatology 63, 418–27 (2016).

14.
14. Poynard, T. et al. Rates and risk factors of liver fibrosis progression in patients with chronic hepatitis c. J
Hepatol 34, 730–9 (2001).

15.
15. Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W. & Jung, H. Regulation of ligands for the NKG2D activating
receptor. Annu Rev Immunol 31, 413–41 (2013).

16.
16. Huang, C. F. et al. Genetics Variants and Serum Levels of MHC Class I Chain-related A in Predicting
Hepatocellular Carcinoma Development in Chronic Hepatitis C Patients Post Antiviral Treatment. E Bio Medicine 15,
81–89 (2017).

17.
17. Tsuchida, T. & Friedman, S. L. Mechanisms of hepatic stellate cell activation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 14,
397–411 (2017).

18.
18. Krizhanovsky, V. et al. Senescence of activated stellate cells limits liver fibrosis. Cell 134, 657–67 (2008).

19.
19. Friese, M. A. et al. RNA interference targeting transforming growth factor-beta enhances NKG2D-mediated
antiglioma immune response, inhibits glioma cell migration and invasiveness, and abrogates tumorigenicity in
vivo. Cancer Res 64, 7596–603 (2004).

20.
20. Groh, V., Wu, J., Yee, C. & Spies, T. Tumour-derived soluble MIC ligands impair expression of NKG2D and T-cell
activation. Nature 419, 734–8 (2002).

21.
21. Gong, Z. et al. Association of MICA gene polymorphisms with liver fibrosis in schistosomiasis patients in the
Dongting Lake region. Brazilian Journal of Medical and Biological Research 45, 222–229 (2012).

22.
22. Radaeva, S. et al. Natural killer cells ameliorate liver fibrosis by killing activated stellate cells in NKG2D-
dependent and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-dependent manners. Gastroenterology
130, 435–52 (2006).

23.
23. Taniguchi, H. et al. Hepatitis C virus core protein upregulates transforming growth factor-beta 1 transcription. J
Med Virol 72, 52–9 (2004).

24.
24. Nagaoki, Y. et al. Hepatocellular carcinoma development of hepatitis C virus patients with eradication to
interferon therapy: a large scale, long-term study of 2266 patients. Hepatology 60, 1162a–1163a (2014).

25.
25. Motomura, T. et al. Neither MICA Nor DEPDC5 Genetic Polymorphisms Correlate with Hepatocellular
Carcinoma Recurrence following Hepatectomy. HPB Surg 2012, 185496 (2012).

26.
26. Al-Anazi, M. R. et al. Variations in DEPDC5 gene and its association with chronic hepatitis C virus infection in
Saudi Arabia. BMC Infect Dis 14, 632 (2014).

27.
27. Eslam, M. et al. IFN-lambda 3, not IFN-lambda 4, likely mediates IFNL3-IFNL4 haplotype-dependent hepatic
inflammation and fibrosis. Nature Genetics 49, 795–+ (2017).

28.
28. Thabet, K. et al. MBOAT7 rs641738 increases risk of liver inflammation and transition to fibrosis in chronic
hepatitis C. Nat Commun 7, 12757 (2016).

29.
 Eslam,
29. M. et al. Diverse impacts of the rs58542926 E167K variant in TM6SF2 on viral and metabolic liver disease
phenotypes. Hepatology 64, 34–46 (2016).

30.
30. European Association For The Study Of The, L., European Organisation For, R. & Treatment Of, C. EASL-EORTC
clinical practice guidelines: management of hepatocellular carcinoma. J Hepatol 56, 908–43 (2012).

31.
31. Eslam, M. et al. Interferon-lambda rs12979860 genotype and liver fibrosis in viral and non-viral chronic liver
disease. Nat Commun 6, 6422 (2015).

32.
32. Eslam, M. et al. FibroGENE: A gene-based model for staging liver fibrosis. J Hepatol 64, 390–398 (2016).

33.
33. Bedossa, P. & Poynard, T. An algorithm for the grading of activity in chronic hepatitis C. The METAVIR
Cooperative Study Group. Hepatology 24, 289–93 (1996).

34.
34. Eslam, M. et al. IFNL3 polymorphisms predict response to therapy in chronic hepatitis C genotype 2/3
infection. J Hepatol 61, 235–41 (2014).

Acknowledgements

We would like to thank all the patients for their participation in this study. M.E., C.L., M.D. and J.G. are supported by the
Robert W. Storr Bequest to the Sydney Medical Foundation, University of Sydney; a National Health and Medical
Research Council of Australia (NHMRC) Program Grant (APP1053206, APP1149976) and Project grants (APP1107178
and APP1108422). G.D. is supported by an NHMRC Fellowship (1028432). U.S. and J.N. are supported by DFG SFB-TR57
and the Hector-Foundation (M63). R.E. and K.T. are supported by a scholarship from the Egyptian government. A.B. is
supported by an Australian Government Research Training Program (RTP) scholarship.

Author information

1. Rasha El Sharkawy and Ali Bayoumi contributed equally.

Affiliations

1. Storr Liver Centre, The Westmead Institute for Medical Research and Westmead Hospital, University of Sydney, and
Westmead Hospital NSW, Sydney, Australia

Rasha El Sharkawy, Ali Bayoumi, Mayada Metwally, Olivier latchoumanin, Khaled Thabet, Mustafa A. M. Najim, Mark W.

Douglas, Christopher Liddle, Liang Qiao, Jacob George, Mohammed Eslam, Rose White & Reynold Leung

2. Division of Hepatology, Ospedale Casa Sollievo della Sofferenza, IRCCS, San Giovanni Rotondo, Italy

Alessandra Mangia & Rosanna Santoro

3. Section of Hepatology, Clinic for Gastroenterology and Rheumatology, University Clinic Leipzig, Leipzig, Germany

Thomas Berg, Janett Fischer & Barbara Malik

4. Unit for The Clinical Management of Digestive Diseases and CIBERehd, Hospital Universitario Virgen del Rocío,
University of Seville, Sevilla, Spain

Manuel Romero-Gomez, Rocío Gallego-Durán & Angela Rojas

 5. Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medical Science, University of Turin, Turin, Italy

Maria Lorena Abate, Elisabetta Bugianesi & Chiara Rosso

6. NIHR Biomedical Research Unit in Gastroenterology and the Liver, University of Nottingham, Nottingham, United
Kingdom

William L. Irving

7. Institute of Translational and Stratified Medicine, Plymouth University, Plymouth, United Kingdom

David Sheridan & Lavinia Mezzabotta

8. Kirby Institute, The University of New South Wales, Sydney, NSW, Australia

Gregory J. Dore, Gail Matthews, Jason Grebely & Julie R. Jonsson

9. Department of Internal Medicine I, University of Bonn, Bonn, Germany

Ulrich Spengler & Jacob Nattermann

10. Università degli Studi di Milano Centro A.M. e A. Migliavacca, First Division of Gastroenterology, Fondazione IRCCS
Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Department of Pathophysiology and Transplantation Milan Italy, Milan,
Italy

Pietro Lampertico & Roberta D’Ambrosio

11. Department of Gastroenterology and Hepatology, Nepean Hospital, Sydney, NSW, Australia

Martin Weltman

12. Department of Gastroenterology and Hepatology, Fremantle Hospital, Fremantle, WA, Australia

Lindsay Mollison & Vincenzo Fragomeli

13. Department of Gastroenterology & Hepatology, Royal Perth Hospital, Wellington, WA, Australia

Wendy Cheng

14. Gastrointestinal and Liver Unit, Prince of Wales Hospital and University of New South Wales, Sydney, NSW,
Australia

Stephen Riordan

15. Department of Anatomical Pathology, Institute of Clinical Pathology and Medical Research (ICPMR), Westmead
Hospital, Sydney, Australia

Duncan McLeod

16. The University of Queensland, School of Medicine, Princess Alexandra Hospital, Woolloongabba, QLD, Australia

Elizabeth Powell
 17. Biochemistry Department, Faculty of Pharmacy, Minia University, Minia, Egypt

Khaled Thabet

18. Department of Medical Laboratories Technology, Faculty of Applied Medical Sciences, Taibah University, Medina,
Saudi Arabia

Mustafa A. M. Najim

19. Centre for Infectious Diseases and Microbiology, Marie Bashir Institute for Infectious Diseases and Biosecurity,
University of Sydney at Westmead Hospital, Westmead, NSW, Australia

Mark W. Douglas

20. Institute of Translational Medicine, Newcastle University, Tyne, UK

Margaret Bassendine

Consortia

International Liver Disease Genetics Consortium (ILDGC)

Rose White
, Angela Rojas
, Margaret Bassendine
, Chiara Rosso
, Lavinia Mezzabotta
, Reynold Leung
, Barbara Malik
, Gail Matthews
, Jason Grebely
, Vincenzo Fragomeli
 & Julie R. Jonsson

Contributions

R.E., A.B., M.M., M.E. and J.G. conceived the research; patient enrolment, clinical phenotype data collation and sample
acquisition/DNA preparation was performed by R.E., A.B., M.M., M.E., J.G., M.R.-G., A.M., W.L.I., T.B., G.J.D., D.S., M.L.A.,
E.B., M.W., L.M., W.C., S.R., R.S., J.F., U.S., J.N., P.L., R.D., R.G.-D., M.W.D., E.B., C.L., O.L. and L.Q. genotyping was
performed by K.T., M.M. histological analysis of tissues was conducted by D.M.; statistical analysis and interpretation of
results was performed by R.E., A.B., M.M., M.E. and J.G.; RT–PCR: R.E.; ELISA: A.B.; Tissue culture: R.E., JFH-1 data:
M.A.M.N., the manuscript was written and revised by R.E., A.B., M.M., M.E. and J.G. All authors critically reviewed the
manuscript and approved the final submitted manuscript.

Corresponding author

Correspondence to Jacob George.

Ethics declarations
Competing Interests

The authors declare no competing interests.

Additional information

Publisher’s note: Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and
institutional affiliations.

A comprehensive list of consortium members appears at the end of the paper

Electronic supplementary material

Supplementary file

Rights and permissions

Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use,
sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to
the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons license, and indicate if changes were
made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons license,
unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons
license and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to
obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this license, visit
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reprints and Permissions

About this article

Cite this article

Sharkawy, R.E., Bayoumi, A., Metwally, M. et al. A variant in the MICA gene is associated with liver fibrosis progression in
chronic hepatitis C through TGF-β1 dependent mechanisms. Sci Rep 9, 1439 (2019). https://doi.org/10.1038/s41598-
018-35736-2

Received 25 May 2018 Accepted 09 November 2018 Published 05 February 2019

DOI https://doi.org/10.1038/s41598-018-35736-2

Share this article

Anyone you share the following link with will be able to read this content:

Get shareable link

Provided by the Springer Nature SharedIt content-sharing initiative
Subjects Hepatitis C • Liver fibrosis

Postdoctoral Fellow-Cancer Virology

University of Pittsburgh (Pitt)

View more positions at

Informes científicos ISSN 2045-2322 (en línea)

© 2020 Springer Nature Limited