República Bolivariana De Venezuela

Ministerio Del Poder Popular Para La Educación Superior

Universidad Nacional Experimental Francisco De Miranda

Área Ciencias De La Salud - Programa De Medicina

Unidad Curricular: Microbiología II

TECNICAS COMUNMENTE EMPLEADAS

PARA EL DIAGNOSTICO DE INFECCION
VIRAL

BACHILLERES:

Peniche Gleimar CI: 26.310.691

Reyes Yanny CI: 27.176.743

Ruiz Haddaluz CI: 26.352.008

Ulpino Jhonathan CI: 25.177.997

OCTUBRE-2020
 DESCRIPCION DE LA TOMA MANEJO Y PRESERVACION DE MUESTRAS
PARA ESTUDIOS VIROLOGICOS

El elemento fundamental para obtener un buen diagnóstico, depende de la calidad

de la muestra recibida en el laboratorio, y para obtener muestras de alta calidad, se debe
conocer el sitio o lesión donde se sospeche este el agente, de manera de pedir la secreción o
el tejido donde el virus o parte de él esté presente. Es importante también estimar el periodo
en que se encuentre la infección, para solicitar la muestra en el momento de mayor
replicación viral.
Son determinantes la cantidad y calidad de la muestra, así como las condiciones en
la que es mantenida y el tiempo en la que es transportada al laboratorio.
Ahora bien, los tipos de muestras e instrucciones para la correcta obtención y
transporte del diagnóstico virológico son los siguientes:

TIPO DE MUESTRA MATERIAL DE INSTRUCCIONES Y

RECOLECCIÓN PRECAUCIONES

Hisopado o Cepillado Torula o cepillo flexible Se recogen células

epiteliales (piel o mucosas)
Medio viral donde está ocurriendo la
Unidad refrigerante replicación activa del virus.

En caso de necesitar
aislamiento viral la muestra
debe enviarse en un medio
de transporte viral.

Sangre Tubo sin anticoagulante, Volúmenes requeridos

para pruebas de suero. dependerá de las técnicas,
las moleculares requieren de
Tubo con anticoagulante menor volumen.
para pruebas en sangre total
Se recomienda en general
entre 5 a 10 ml

Evitar hemolisis, no
congelar.

Fluidos o Secreciones Trocar para punción (LCR) En caso de muestras

o sonda fina (aspirado respiratorias, deben ser
nasofaríngeo o traqueal). puestas en medio de
transporte viral. LCR, orina
 Medio de transporte viral. o leche materna no
necesitan medio de
Unidad refrigerante. transporte.

No congelar

Deposiciones Frasco estéril, limpio. No congelar.

Unidad refrigerante.

Para el diagnostico virológico, debemos tener en cuenta que los virus son agentes
infecciosos pequeños que constan, esencialmente de un tipo de genoma (ADN o ARN) y
proteínas, algunos presentan además lípidos e hidratos de carbono unidos a las proteínas
virales.
Por ello existen técnicas de laboratorio específicas para la detección de la partícula
viral completa, los antígenos virales (proteínas) y el genoma viral. Además se puede
detectar y caracterizar la respuesta inmune antiviral especifica.

DESCRIPCION DEL FUNDAMENTO, INTERPRETACION DE LOS

RESULYADOS, VENTAJAS, LIMITACIONES Y UTILIDAD DE LA PRACTICA
DE CADA UNA DE LAS SIGUIENTES TECNICAS:

INMUNOANALISIS ENZIMATICO

(TECNICA ELISA)

Es una técnica analítica que depende de la reacción de Ag y Ac. Este método tiene
múltiples variaciones, lo que depende de la conjugación de una enzima con un anticuerpo.
La enzima se detecta por análisis de actividad enzimática con el sustrato. Tiene como
fundamento principal: detectar la presencia de antígenos o anticuerpos en la muestra de un
paciente y así poder determinar si el mismo padece o no de una infección.
Un en ensayo ELISA requiere, en términos generales, de tres componentes
esenciales: el antígeno a detectar o cuantificar, un anticuerpo específico para ese antígeno
conjugado a una enzima que genere una reacción cuantificable y un sistema que permita
estimar la cantidad de antígeno presente en la muestra a partir de la reacción enzimática que
se genere. El resto de detalles variará dependiendo del tipo de ELISA.
 LECTURA E INTERPRETACION DE RESULTADOS

La lectura de los resultados puede ser valoradas tanto visual como

colorimétricamente. A simple vista, pueden ser leídos ciertos ensayos rutinarios en los que
no haga falta una cuantificación y no se presenten abundantes casos dudosos ya que dicha
lectura visual tendrá el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar
equivocadamente los casos límite.
Para la cuantificación se mide la absorbancia en una longitud de onda determinada
en un espectrofotómetro: la absorbancia será directamente proporcional a la cantidad de
antígeno descubierto.
No Reactiva o Negativa: Significa que no se encontraron anticuerpos o antígenos
detectables en el momento de la prueba. Es necesario tener en cuenta el llamado "período
de ventana" y analizar la necesidad o conveniencia de repetir la prueba posteriormente.

Reactiva o Positiva: Significa que se encontraron anticuerpos o antígenos y es necesario

confirmar su especificidad, la prueba puede ser reactiva o falsamente reactiva.

VENTAJAS

-Luego de 25 años mantienen vigencia como procedimiento analítico de gran sensibilidad y

especificidad, sencilla, bajo costo, reproducible y adaptable a las características de
cualquier laboratorio.
-Poca cantidad de muestra.
-Menor tiempo.
-Más estables, mayor periodo de validez.
-Pureza estabilidad y cantidad del antígeno.
-Pueden detectar sustancias en el orden de los nanogramos y picogramos por mililitro.

LIMITACIONES
En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no
significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha
estado enferma y que ya se ha recuperado puede seguir produciendo anticuerpos. Esto
originaría un falso positivo. Asimismo, hay personas que producen una baja cantidad de
anticuerpos, por lo que estos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a
un falso negativo. Por último, pueden aparecer falsos negativos cuando se da
inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.
 ELISA DIRECTO

Este método tiene como fundamento detectar la presencia de antígenos en la

muestra del paciente. Sus pasos son:

-El antígeno se inmoviliza sobre una placa.

-Se añade un anticuerpo primario marcado con una enzima que se unirla al antígeno de
interés.
-Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionara una señal visible que
permitirá la detección y cuantificación del antígeno de interés.

VENTAJAS

-El protocolo es rápido y simple.

-No hay posibilidad de reactividad cruzada con el anticuerpo secundario.
-Menor probabilidad de error debido al uso de un menor número de reactivos y pasos en el
procedimiento.

DESVENTAJAS

-Pueden dar mayor ruido de fondo, ya que otras proteínas presentes en las muestras pueden
adherirse a la placa.
-No hay amplificación de la señal ya que no se emplea anticuerpos secundarios, lo que
reduce la sensibilidad del ensayo.
-El anticuerpo primario debe ir marcado, lo que resta flexibilidad al ensayo, y que puede
legar a alterar su inmunoreactividad.

ELISA INDIRECTO

Este método tiene como fundamento detectar la presencia de anticuerpos en la

muestra del paciente. Sus pasos a seguir son:

-El antígeno se inmoviliza sobre una placa.

-Se añade un anticuerpo primario sin marcar que se une al antígeno de interés
-Se añade un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo
primario
-Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que
permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de interés.
 VENTAJAS

-Alta sensibilidad, ya que el uso de anticuerpos secundarios posibilita la amplificación de la

señal-Alta flexibilidad por el hecho de que un mismo anticuerpo secundario puede
emplearse con diferentes anticuerpos primarios.

-El anticuerpo primario mantiene intacta su inmunoreactividad al no ir conjugado.

DESVENTAJAS

-Protocolo más complejo que el ELISA directo, que incluye pasos de incubación
adicionales con el anticuerpo secundario.
-El uso de anticuerpos secundarios puede dar lugar a una reactividad cruzada.

UTILIDAD PRÁCTICA

Elisa Directo: Se utiliza ampliamente en el diagnóstico de: hepatitis A y B, rotavirus, el

agente Norwalk, ADV, RSV (Virus sincitial respiratorio), parainfluenza, influenza A y B.

Elisa Indirecto: Es básicamente para determinar anticuerpos contra antígenos del dengue,
HSV (Virus del herpes simple), VIH, RSV (Virus sincitial respiratorio), CMV
(Citomegalovirus), Hepatitis A, B y C principalmente.
Y en general otras enfermedades como: Cáncer, hepatitis B, enfermedades
producidas por parásitos y bacterias. Y otras aplicaciones en hormonas, cuantificación de
inmunoglobulinas e inmunopatologia.
 AGLUTINACIÒN EN LÁTEX

FUNDAMENTO

Es una técnica para detectar antígenos o anticuerpos en fluidos corporales en una

variedad de ellos tales como saliva, el líquido cefalorraquídeo o la sangre utilizando
partículas de látex recubiertas con antígenos anticuerpos. La muestra se mezcla con
partículas recubiertas con antígenos o anticuerpos específicos. Cuando las partículas de
látex cubren un anticuerpo, los fragmentos de unión del anticuerpo quedan expuestos y
son capaces del unirse al antígeno que se encuentra en la muestra. Tiene una duración de
10-20 minutos.
Las partículas de látex son esferas de polietileno que se unen fácilmente al
fragmento cristalizable de moléculas de inmunoglobulina G (IgG) o inmunoglobulina M
(IgM), esta última es mucho más eficiente en aglutinar partículas naturales. Los fragmentos
de unión del anticuerpo quedan expuestos y son capaces de unirse al antígeno que se
encuentra en la muestra. Cuando los antígenos tienen varios epitopes (o estructuras
antigénicas repetitivas), los anticuerpos multivalentes acoplados a múltiples partículas de
látex que dan como resultado una aglutinación visible.

TIPOS DE REACTIVOS DE LÁTEX

Para detección de antígenos, son aquellas partículas de polietileno adosados a antígenos que
al someter con el suero éstas interactúan con anticuerpos propias de los antígenos
específicos.

PROCEDIMIENTO

-Suspender una gota de suero en lámina.

-Suspender una gota de reactivo al costado de la gota de muestra.

-Lentamente se homogeniza las dos gotas con suaves movimientos de rotación en el modo
que interactúen antígeno y anticuerpo.

Directa: Es un método simple el cual se toma una muestra y se mezcla con las gotas de
látex cubiertas con anticuerpos contra un antígeno en particular. Si el paciente tiene el
virus del cual se sospecha, el antígeno en la muestra reaccionara con los anticuerpos en las
partículas de látex, ocasionando la aglutinación.

Indirecta: Se toma la muestra del paciente y se mezcla con las gotas de látex cubiertas con
antígenos contra un anticuerpo en particular. Si el paciente tiene el virus del cual se
sospecha, el anticuerpo en la muestra reaccionara con los antígenos que recubran las
partículas de látex, generando aglutinación.

TIPOS DE MUESTRA

La prueba depende de qué tipo de muestra se necesite: Saliva, orina, líquido

cefalorraquídeo (punción lumbar).

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

La prueba de aglutinación de látex se puede visualizar a simple vista o puede

requerir de un microscopio. Un resultado positiva muestra aglutinación visible de las
partículas de látex. Un resultado negativo no mostrará la aglutinación. Un resultado no
concluyente una turbidez y deberá volver a realizarse el estudio. La información que
suministra corresponde a la exposición al agente o infección pasada.
Los resultados pueden interpretarse como inmune si es positivo o susceptible si es
negativo, la información suministrada corresponde a exposición del agente o infección
pasada, ya que las pruebas de látex no son muy específicas para la IgM.

VENTAJAS

Esta técnica se aplica ampliamente en el laboratorio de microbiología, ya que son

muy sencillas de realizar no requieren ningún equipamiento para su lectura, requiere solo
unos minutos, son rápidas y fáciles de implementar.

-Permite la detección de rotavirus en pruebas de rutinas.

-Toma pocos minutos

-No necesita equipo ni entrenamiento especial.

-Tiene buena sensibilidad (no tan como ELISA)

-Tiene buena especificidad (no tan buena como ELISA)

LIMITACIONES

-Presenta menor sensibilidad que las reacciones de interacción Primaria (ELISA,

Inmunofluorescencia indirecta)

.Generalmente es una prueba es una prueba de despistaje, pues solo determina la presencia
o no de anticuerpo pero no confirma el diagnostico ni evalúan el estado de infección.
 UTILIDAD PRÁCTICA

-Se utiliza para la demostración de rotavirus en materia fecal.

-Se emplea para detectar virus que estén adheridos a células

-Detección de anticuerpos que se desarrollen durante ciertas infecciones por hongos y

bacterias.

-Detección de hepatitis, herpes y rubeola.

INMUNOBLOT (WESTERN BLOT)

FUNDAMENTO

Se utiliza para la detección de anticuerpos específicos de antígenos. Se basa en la

separación electroforética de proteínas virales que son posteriormente inmovilizados en
papel de nitrocelulosa, el fin de determinar la presencia de anticuerpos específicos contra
cada una de esas proteínas. Se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad
enzimática, fluorescencia, entre otros métodos. De esta forma se puede estudiar la presencia
de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas. Y
tiene una duración de 1 día
La técnica consiste en tomar el suero del paciente (que está conformado por una
mezcla de proteínas) tratada con un detergente desnaturalizante y depositarla en una cámara
electroforética que contiene un gel de poliacrilamida (soporte solido), posteriormente
comienza la migración de las proteínas con respecto a su peso molecular, estructura y
carga neta por la aplicación de un campo magnético (las de bajo peso se mueven
rápidamente a diferencia de las más pesadas que casi no se desplazan). Al final de la
electroforesis es retirado del gel para ser transferido a una hoja de nitrocelulosa mediante
una corriente eléctrica.
Al tener ya la hoja de nitrocelulosa con las proteínas ya trasferidas se le añade una
sustancia que contiene anticuerpos específicos para la proteína de interés. A continuación
se depositan anticuerpos conjugados a enzimas (peroxidasa de rábano) que se unirán a la
reacción antígenos- anticuerpo que se llevó a cabo con anterioridad. Por último se le aporta
un sustrato que la enzima trasforma en un producto coloreado en el sitio antes mencionado.

PROCEDIMIENTO

-Separar proteínas virales a través de electroforesis en gel de poliacrilamida y transferirlo a

una membrana de nitrocelulosa.

-Cortar la membrana en tiras delgadas.

-Hacer reaccionar las tiras con suero del paciente (que se sospecha que tiene los antígenos)

-Se hace un lavado.

-Se agrega un anticuerpo anti- IgM marcado (conjugado/ligado) con una enzima
(peroxidasa de rábano). Esto produce un cambio de color que se nota al agregar el sustrato.

-Se hace un lavado.

-Se adiciona el sustrato de la enzima

Electroforesis: Es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas

en un campo eléctrico

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

De haber reacción entre antígeno y anticuerpo se observara como unas bandas

coloreadas que hacen evidente la unión de los anticuerpos que reaccionaron con las
proteínas que migro en ese sitio. Al comparar con un control se ubica y se determina el tipo
de proteína para la cual hay antígenos específicos, de esta forma se puede definir
exactamente contra cuales proteínas están dirigidos los anticuerpos del paciente y así
mismo determinar la fase de la infección en la que se encuentra.
La presencia de anticuerpos frente a las proteínas del virus demuestra una
exposición previa a dicho virus o una infección por él. El análisis por Inmunoblot de los
anticuerpos antivirus no es un diagnóstico de las enfermedades. Unos resultados negativos
en la prueba no excluye la posibilidad de la exposición o de la infección con el virus, así
como los resultados positivos no indican que el individuo en cuestión tenga la enfermedad,
aunque haya estado expuesto al virus con anterioridad.

VENTAJAS

-Se puede definir exactamente contra cuales proteínas están dirigidos los anticuerpos del
paciente y así mismo determinar la fase de infección en la que se encuentra.

-Eficaz y útil para detectar y caracterizar proteínas en pequeñas cantidades.

-Proporciona información cualitativa, cuantitativa y estructural de la proteína.

LIMITACIONES

-Proteínas no previstas tienen una ligera posibilidad de reaccionar con el anticuerpo

secundario, resultando en el etiquetado de una proteína incorrecta.

-Las proteínas más grandes y de mayor peso molecular no se trasferirá correctamente,

resultando en una banda de lectura incorrecta (o incluso, todas las bandas).

-Es un proceso muy delicado que requiere las cantidades correctas de cada componente en
orden para la identificación satisfactoria de la presencia de proteínas. Un desequilibrio en
cualquier etapa del procedimiento puede sesgar el proceso.

-Requiere un personal altamente capacitado.

-Requiere equipos de alta tecnología.

UTILIDAD PRÁCTICA

Es la mejor técnica para identificar y caracterizar bioquímicamente las

preparaciones antigénicas y sus variaciones. Se utiliza en la prueba del virus de
Inmunodeficiencia Humana (VIH). También se utiliza como prueba suplementaria y
confirmatoria de una prueba de despistaje como ELISA y aglutinación en látex en
infecciones por VIH o virus Linfotrofico Humano HTLV-1.
 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

La inmunofluorescencia indirecta o secundaria, es un método rápido y confiable que

de acuerdo a los sustratos utilizados (células HEp-2, neutrófilos o tejidos) permite
identificar los posibles antígenos reconocidos por los autoanticuerpos presentes en los
sueros de los pacientes con enfermedades autoinmunes.

TOMA, MANEJO Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS PARA EL ESTUDIOS

VIROLÓGICOS

El protocolo de inmunofluorescencia varía en dependencia de muchos factores y consiste

en:

-Preparación de las láminas y de las células

-Fijación de las muestras
-Permeabilización
-Bloqueo
-Inmunotinción o inmunomarcaje
-Montaje y observación
-La preparación de las muestras depende del tipo de estudio a realizar. En el caso de las
células de suspensión se aplica de la siguiente manera.

Las células en un medio de cultivo líquido, deben primero separarse de este

por centrifugación y luego deben ser lavadas con una solución tampón o
“buffer” isosmótico, que preserve su integridad.
Se utiliza un tampón fosfato-salino conocido como PBS, en el que se resuspenden
las células y esta mezcla vuelve a centrifugarse para obtener las células libres del medio de
cultivo, que puede tener sustancias interferentes.
Las láminas son cubiertas o “sensibilizadas” con una solución de poli-lisina, un
polímero sintético que hará las veces de “pegamento molecular” entre las células y el
soporte sólido, gracias a la interacción electrostática entre las cargas positivas de sus grupos
amino y las cargas negativas de las proteínas que recubren a las células.
Luego se procede a la fijación de la muestra: este proceso consiste en inmovilizar
las proteínas que se encuentran en el interior celular con la finalidad de mantener intacta su
ubicación espacial. Las moléculas que se emplean deben ser capaces de atravesar todos los
tipos de membranas celulares y de formar entramados con las proteínas covalentes.
Son muy utilizados el formaldehído y paraformaldehído, el glutaraldehído e incluso
el metanol, con el cual se incuban las muestras celulares por un tiempo determinado para
luego lavarlas con una solución tampón de carácter isosmótico.
Después de la fijación de las células se prosigue a unirlas a las láminas previamente
sensibilizadas con poli-lisina.
Posteriormente la permeabilización es indispensable si se quiere conocer la
localización de una proteína en el interior celular, y consistirá en incubar las muestras con
Tritón X-100, un detergente capaz de permeabilizar las membranas celulares.
El bloqueo es un paso fundamental en todas las técnicas inmunológicas. En esta
etapa del procedimiento, el bloqueo consiste en cubrir, en las láminas sensibilizadas, todos
los sitios con moléculas de poli-lisinas a los que no se adhirieron células y previene
cualquier unión inespecífica. Para el bloqueo se utilizan soluciones con albúmina de suero
bovina (BSA) en tampón PBS y se obtiene mejores resultados mientras más largo es el
tiempo de incubación con esta solución.
El procedimiento de inmunotinción o inmunomarcaje en el caso de una
inmunofluorescencia secundaria o indirecta deben realizarse dos incubaciones
consecutivas. Primero con los anticuerpos deseados y luego con los anticuerpos que son
capaces de detectar las regiones constantes de las inmunoglobulinas primarias. Son estos
anticuerpos secundarios los que están unidos covalentemente a los fluoróforos.
Para los marcajes simultáneos en la inmunofluorescencia indirecta es necesario
asegurarse de que cada anticuerpo primario sea producido en un paciente diferente, así
como también de que cada anticuerpo secundario esté acoplado a un fluoróforo distinto, la
incubación con los anticuerpos da mejores resultados mientras mayor sea el tiempo de esta.
Después de cada paso es necesario lavar el exceso de anticuerpos que no se unieron a las
muestras y en la inmunofluorescencia secundaria es necesario bloquear antes de añadir el
anticuerpo secundario.
Finalmente, en el montaje y observación durante el tiempo de incubación final con
los fluoróforos es necesario que las muestras permanezcan en la oscuridad. Para la
observación al microscopio es común emplear algunas sustancias para la preservación de la
fluorescencia de los fluoróforos acoplados a los anticuerpos.
 FUNDAMENTO

Se basa en la unión de anticuerpos antivirales presentes en el suero del paciente, a

los antígenos virales expresados en la superficie y citoplasma de células infectadas, que han
sido fijadas a un portaobjeto de vidrio. Tiene que ver concretamente con la visualización o
detección de esta reacción al excitar las moléculas fluorescentes a una longitud de onda
especifica. Como control de especificidad se usan células no infectadas.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

Los resultados de la prueba se basan en el desarrollo de la técnica en dos pasos. El

primero tiene que ver con el empleo de un anticuerpo no fluorescente y su unión al antígeno
de interés. Contra la región constante de este primer anticuerpo (que ahora servirá de
antígeno) se utiliza un segundo anticuerpo capaz de reconocerlo, que sí está asociado a una
molécula fluorescente.
La aparición de una señal fluorescente será el resultado del reconocimiento
específico entre el primer anticuerpo no fluorescente y el antígeno de interés; la presencia
de ese primer anticuerpo condiciona la del segundo, que sí está etiquetado y gracias al cual
podrá determinarse la presencia o ausencia del antígeno.
Los resultados de la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) de acuerdo a la
muestra en estudio se analizarán en parámetros evaluados, en un valor diagnóstico de
sensibilidad 98.75% (95,69-100%), especificidad 98,67% (95,40-100%), valor predictivo
positivo 98,75%(95,69-100%, valor predictivo negativo 98,67% (95,40-100%).

VENTAJAS

-Se pueden obtener resultados rápidos.

-No es necesario realizar cultivos.
-Se puede identificar microorganismos específicos en un grupo mixto.
-Determina la identidad de un organismo muerto.
-Es sensible.
-Un solo anticuerpo secundario puede usarse para localizar la unión histoespecífica de
varios anticuerpos primarios diferentes.

DESVENTAJAS

-Costos en reactivo y equipo.

-Debe ser realizado por personal muy especializado.
-Los resultados no son 100% específicos.
 LIMITACIONES

Un problema muy importante es el fotoblanqueo, es decir la perdida de actividad

fluorescente causada por la exposición a la luz. Esta pérdida de actividad puede ser
controlada reduciendo la intensidad o el tiempo de exposición a la luz. Incrementado la
concentración de Fluoróformo, o empleando fluoróforos más robustos que sean menos
propenso al fotoblanqueo
Para la marcación de estructuras subcelulares se encuentra limitada a su uso en
células fijadas (muertas) ya que los anticuerpos no son capaces de atravesar las membranas
íntegras de las células vivas. En el caso de células fijadas, dependiendo de la técnica de
fijado utilizada, puede ocurrir que las proteínas de interés queden unidas por enlaces
cruzados a otras proteínas, lo que puede causar tanto falsos positivos, como falsos
negativos debidos a unión inespecífica.

UTILIDAD PRÁCTICA.

La inmunofluorescencia secundaria es una técnica sumamente versátil, a la cual se

han dado multiplicidad de usos en el ámbito científico y clínico. Puede ser utilizada para
responder preguntas ecológicas, genéticas y fisiológicas respecto a muchos organismos.
Entre las aplicaciones clínicas se emplea para el diagnóstico directo de algunas
enfermedades dermatológicas, utilizando la inmunofluorescencia indirecta sobre tejido
epitelial de los pacientes estudiados.
Se ha dispuesto de las técnicas de inmunofluorescencia en organismos unicelulares
como las levaduras para visualizar los microtúbulos intranucleares y citoplasmáticos, actina
y proteínas asociadas, los filamentos de 10nm y otros constituyentes del citoplasma, de la
membrana y las paredes celulares.
 PCR- REACCION EN CADENA DE LA POLIMERAZA

FUNDAMENTO

Se basa en la amplificación secuencial de ADN, utiliza secuencias cortas de ADN

llamados cebadores para seleccionar la parte del genoma a amplificar, la temperatura de la
muestra se sube y se basa repetidamente para ayudar a la enzima de replicación del ADN
(ADN polimerasa, termoestable/ taq. polimerasa) a duplicar la secuencia del gen que está
siendo copiado. Con esta técnica se pueden producir un billón de copias de la secuencia en
estudio en solo unas pocas horas.
Cabe mencionar que en los casos en las que se deba detectar ARN viral, la
amplificación debe estar precedida por un paso de transcripción reversa, donde el ARN es
copiado a un ADN copia y esta será el templado que se utilizara en el posterior proceso de
amplificación por la polimerasa.
Existen varias modificaciones o tipos de la reacción de la polimerasa en cadena:

-PCR en Tiempo Real: Permite conocer y medir los productos de amplificación en

cada ciclo del proceso, más que el resultado final del mismo.

-PCR con Transcriptasa Inversa (RT-PCR): Utiliza ARN viral como molde
inicial y mediante una transcriptasa inversa, se sintetiza una cadena de ADN copia y a partir
de aquí se realiza la amplificación habitual.

VENTAJAS

-Permite generar millones de copias de la región de interés del ADN

-Detecta virus que no pueden ser aislados en cultivos celulares, o en aquellas infecciones en
las que la carga antigénica es muy baja para ser detectada por inmunoanalisis.

-Identifica virus con genoma ADN (por su estabilidad) a pesar de que las condiciones de la
muestra no sean las óptimas.

LIMITACIONES

-Posibilidad de contaminación y falsos positivos.

-Lleva tiempo, hay un límite en la cantidad de pruebas que pueda procesar el laboratorio en
un día.

-Disponibilidad de reactivos necesarios.

-Solo indica si alguien tiene el virus en el momento de la prueba, no si lo ha tenido.

UTILIDAD PRÁCTICA

Permita detectar las secuencias nucleotidicas de los agentes detectados, por lo tanto
permite clasificar los virus (genotipificacion), conocer su distribución y transmisión en las
poblaciones, y detectar mutaciones asociadas a resistencias de drogas antivirales o a
manifestaciones clínicas inusuales. Es uno de los pilares para el diagnóstico de estudio y
caracterización de brotes endémicos-epidémicos y pandémicos. Las autoridades de salud se
basan en estas técnicas para rastrear virus emergente.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

El diagnóstico molecular, permite conocer en un corto periodo de tiempo un gran

número de infecciones víricas difícil de cultivar.

Resultado Positivo De La Prueba PCR: Es indicativo de que el ácido nucleico del

genoma del patógeno estaba presente en la muestra analizada también se puede tratar de
una infección latente o incluso puede resultar la presencia de material genético de un agente
no infectivo.

Resultado Negativo De La Prueba PCR: Indicativo de que el ácido nucleico del genoma
del patógeno no pudo ser detectada en el momento de la recogida de muestra o ausente en
el material de ensayo presentado, un resultado negativo de la prueba no debe ser tomada
como una garantía de ausencia de patógeno en el paciente.

El material genético se compara con secuencias de nucleótidos, controles para

determinar o no la presencia de elementos virales. Es importante tener en cuenta que una
PCR positiva no siempre indica infección activa, pues demuestra material genético y se
puede tratar de una infección latente o presencia de material genético de un agente no
infectivo; por tanto su interpretación se hace en el contexto clínico de la persona.
Con RT-PCR (PCR con transcriptasa inversa) puede haber resultados falsos
negativos, debido a recolecciones de muestras indebidas, poco cuidadosas o de una mala
manipulación de la muestra luego de la recolección y antes de la prueba. También puede
haber un resultado negativo en la prueba de una muestra recolectada cuando el paciente ya
no tiene un virus detectable.
Puede haber resultados falsos positivos, aunque se dan muy rara vez (debido a la
contaminación del laboratorio u otros factores).
 AISLAMIENTO VIRAL- CULTIVOS CELULARES.

Es el método de diagnóstico clásico, se utiliza para la detección del virus o de sus

componentes. El aislamiento del virus era la técnica standard de oro sobre la cual se medían
todas las otras pruebas de diagnóstico viral, pero hoy en día con el desarrollo de las nuevas
técnicas de Biología Molecular ya no es la más sensible. De igual forma el aislamiento de
virus tiene una sensibilidad y una especificidad muy alta. Debido a que sólo se amplifica el
virus, se aumenta la sensibilidad sin disminuir la especificidad.

FUNDAMENTO

Los cultivos celulares son los biosubstratos más corrientemente empleados para la
propagación de los virus. Un cultivo celular es obtenido, de explantes de órganos o de
embriones de animales. Estas células obtenidas asépticamente se disocian tratándolas con
una enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La suspensión de células libres así
obtenidas se coloca en la superficie plana de un recipiente de vidrio o plástico en donde las
células se adhieren y multiplican formando una fina capa de células que se llama
“monocapa celular”. Esta monocapa de células crece en un medio de cultivo complejo que
contiene albúmina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema buffer. Se previene la
contaminación bacteriana adicionándole a los medios antibióticos adecuados. Los cultivos
celulares en monocapa son los más usados, aunque hay otros sistemas (cultivos en
suspensión, explantos, cultivos de órganos, cultivos en microcarriers, etc.).

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

1. En periodos cuando la actividad es alta y los virus están en circulación entre

personas de la comunidad, el valor predictivo positivo del resultado de un prueba es
alto (es decir, la posibilidad de que un resultado positivo indique que el paciente
 tiene el virus es alto, posiblemente positivo verdadero), y el valor predictivo
negativo del resultado de una prueba es bajo (la posibilidad de que un resultado
negativo indique el paciente no tiene el virus, analizar la posibilidad de un resultado
falso negativo) si la prueba de detección del virus tiene sensibilidad subóptima
(como una prueba de diagnóstico o un ensayo de inmunofluorescencia)
2. Un resultado positivo en una prueba de detección de antígenos (prueba de
diagnóstico rápida, ensayo de inmunofluorescencia) o un ensayo molecular
probablemente signifique que el paciente tiene o tuvo hace poca infección por un
virus, pero no siempre significa que el paciente sigue teniendo la infección.
Únicamente aislar el virus en cultivo viral permite identificar si el virus infeccioso
sigue presente.

3. Se recomienda que el tratamiento con antivirales se realice cuanto antes en los

siguientes pacientes con presunto virus o un caso confirmado de la enfermedad:
pacientes ambulatorios que corren riesgo alto de sufrir complicaciones un virus,
personas con enfermedad grave o progresiva y todos los pacientes hospitalizados.

VENTAJAS

-Disponibilidad para todos los investigadores de stocks de células idénticas, ya sea

congeladas en ampollas o en monocapa de botella de cultivos, con la posibilidad de
reconstituirlas cuando sea necesario.
-Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento en todos los laboratorios.
-Libre de contaminación con agentes extraños
-Permiten un control preciso y fino del medio ambiente. En un cultivo se pueden controlar
todos los factores del medio: Físico-químicos (pH, temperatura, presión osmótica, niveles
de O2, CO2, tensión superficial.), y fisiológicos (hormonas, factores de crecimiento,
densidad celular.)
-Caracterización y homogeneidad de la muestra. Se pueden obtener con facilidad un
número elevado de réplicas idénticas,
-Economía. Suponen una economía en el uso de reactivos o drogas a estudiar.
-La posibilidad de obtener altas concentraciones de virus completo, para posteriores
estudios de caracterización genómica y antigénica, de sensibilidad antiviral y para
conservación en biorepositorios

DESVENTAJAS

-El proceso suele ser lento, ya que demanda días a semanas para la identificación del virus, y
en consecuencia puede no estar disponible a tiempo para influir en la atención del paciente.
-Es un proceso laborioso y costoso.
-Se requiere el uso de sistemas de cultivos adecuados, por ejemplo: Varias líneas celulares
para la detección óptima de virus.
-Detectar un virus, en relación con las pruebas "estándar de oro", como la RT-PCR o el
cultivo viral.
LIMITACIONES

Se requiere instalaciones de tipo industrial para incrementar el procesamiento de

tejido celular en el laboratorio e incrementar su producción.

UTILIDAD PRÁCTICA

-El aislamiento viral es muy útil porque determina un cambio en la conducta clínica y en el
manejo terapéutico del paciente.
-El diagnóstico viral por el laboratorio es de gran ayuda para confirmar la etiología, así
como para el seguimiento clínico de la enfermedad.
-Permite realizar un diagnóstico adecuado y conocer la epidemiología de la infección viral
y determinar las implicaciones a nivel de salud pública.
 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

-W. Levinson, Microbiología e inmunología médica, McGraw-Hill, 8va edición.2006.

-Jawetz, Microbiología médica, McGraw-Hill, 25° edición.2010.

-Murray, Microbiología Medica, Elsevier, 6ta edición.2013

-Sherris, Microbiología médica, McGraw-Hill, 5ta edición.2010.

-Guía para la Toma, Envió y Conservación de Muestras. Carlos San Martin, 2015.

-C.D.C de Atlanta (Centro de Investigaciones). Manual de Procedimientos Diagnósticos.

Estados Unidos de América.2016.

-El Control de las Enfermedades Transmisibles, David L. Heymann, 20 ed. Washington,

D.C.OPS, 2017.

-Guía para la Toma, Conservación y Envió de Muestras Clínicas, Ministerio del Poder
Popular para la Salud, 2014.

REFERENCIAS ELECTRONICAS

-https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0716864015001509 16-10-2020.

-http://biotech-spain.com/es/articles/tipos-de-elisa-conoces-las-diferencias/ 13-10-2020.

-http://www.higiene.edu.uy/parasito/trabajos/elisa.pdf 13-10-2020.

-https://www.abyntek.com/ventajas-y-desventajas-de-los-distintos-tipos-de-
elisa/#:~:text=en%20el%20procedimiento.,1.,reduce%20la%20sensibilidad%20del
%2oensayo. 15-10-2020.