ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE

CHIMBORAZO

FACULTAD: CIENCIAS
CARRERA:BIOQUÍMICA Y FARMACIA

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA BÁSICA

PARALELOS: A

PRÁCTICA No. 2…..- PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

1. DATOS GENERALES:

NOMBRE: (estudiante(s) CODIGO(S): (de estudiante(s)

Daniel Cueva 3630

Bryan Palacios 3437

GRUPO No.: ………….

FECHA DE REALIZACIÓN: FECHA DE ENTREGA:

23/11/20 24/11/20
INTRODUCCIÓN

El estudio de los microorganismos implica la necesidad de aislarlos de su ambiente natural

y reproducirlos en el laboratorio, donde se debe suministrarles los requerimientos vitales
en cuanto a nutrientes y a condiciones ambientales.
Los medios de cultivo y el ambiente artificial aportan con agua, con los nutrientes
apropiados y las condiciones favorables de pH, presió n osmó tica, gases, humedad,
temperatura, entre otros para que estos seres puedan vivir y desarrollarse “in vitro”
Debido a que las necesidades nutricionales de los microorganismos son tan variadas
existen medios de cultivo con amplia diversidad en su composició n y características.
Así de acuerdo a su estado físico los medios pueden ser líquidos (caldos), só lidos (agares) o
semisó lidos. Los ingredientes varían desde compuestos químicos puros hasta materiales
complejos como los extractos. Los ingredientes má s comunes son la peptona y el extracto
de carne (para los caldos) y los anteriores má s el agar para los medios só lidos. Estos
ingredientes bá sicos pueden ser suplementados para preparar un medio adecuado para el
cultivo o para la demostració n de una reacció n metabó lica para tipos específicos o grupos
de bacterias.
Para el aislamiento de algú n grupo o tipo específico de microorganismos se pueden usar
medios enriquecidos, selectivos y diferenciales. Los medios enriquecidos se preparan
adicionando al caldo o al agar nutritivo nutrientes como sangre o extractos de plantas que
permitan el crecimiento de microorganismos exigentes como los pató genos. Un medio
selectivo tiene un ingrediente que evita el crecimiento de un grupo o especie de
microorganismo sin inhibir otros. Los medios diferenciales permiten observar las
diferencias entre tipos de bacterias gracias a ciertos ingredientes que propician una clase
de crecimiento o cambio del medio luego de la inoculació n e incubació n.
Los medios de cultivo pueden prepararse a partir de sustancias naturales como leche
descremada o a partir de productos comerciales deshidratados que contienen ingredientes
en cantidades exactas a los cuales ú nicamente se les debe adicionar el agua de acuerdo a lo
indicado en la etiqueta.

2. OBJETIVOS:

 Capacitar al estudiante sobre la importancia de la esterilizació n, desinfecció n y el

manejo de la técnica aséptica a través de la preparació n general de medios de
cultivo para aplicar todos estos procedimientos en el trabajo microbioló gico de
rutina.

 Preparar medios de cultivo diferentes y esterilizarlos en el autoclave para

comprender este procedimiento y para utilizar los medios en el ensayo sobre
ubicuidad microbiana

3. INSTRUCCIONES

Materiales necesarios

Cada grupo constituido por 6 alumnos debe reunir los siguientes materiales:
3 erlenmeyers de 250 mL, una probeta de 100 mL, 6 tubos de ensayo de 15 x 160
mm,12 placas Petri, 12 hisopos
Una placa de calentamiento.. Papel kraft para empacar, papel aluminio, cinta
adhesiva, algodó n, 6 hisopos, 6 baja lenguas, 6 tubos 15x 150,lá mpara de alcohol,
fó sforos, marcador permanente
Medios de cultivo: Agar Nutritivo o PCA y Agar MacConkey

Empaque de materiales

 Para el empaque se usa papel kraft o papel aluminio, con papel aluminio no
se usa cinta adhesiva.
 Los hisopos se envuelven en grupo formando con el papel una funda que
cubra a todos o a cada hisopo por separado.
  Las bocas de tubos o erlenmeyers se cubren con algodó n y gasa se forman
cilindros de algodó n que se ajusten a las bocas y a la vez sobresalgan de las
mismas para facilitar su agarre con el dedo meñ ique.
 Se colocan sobretapas de papel aluminio o Kraft antes de llevar a esterilizar
 Las cajas Petri se empacan en papel Kraft de tamañ o apropiado al nú mero de
cajas, se pueden empacar 2 o má s cajas juntas.

Preparación del medio de cultivo, dispensación y control

 El medio de cultivo se selecciona de acuerdo al propó sito del ensayo

 Se debe leer cuidadosamente las instrucciones descritas en la etiqueta del
frasco antes de preparar el medio de cultivo.
 Calcular el volumen del medio que se preparará de acuerdo al nú mero de
placas que se van a llenar, para lo cual se toma en cuenta la cantidad en g
para preparar un litro de medio de cultivo, este dato aparece en la etiqueta.
 Para hacer el cá lculo de la cantidad de medio a preparar es importante
determinar el recipiente en el que se va a dispensar. Por ejemplo la cantidad
de medio necesaria para tubos de 13 x 100 es de 5 mL, para tubos de 16 x
150 mm s de 12 mL, para cajas Petri es de 15-20 mL, generalmente para
placas Petri de vidrio usamos 20 mL.

Ejemplo de cá lculo

Se necesita preparar 15 cajas de agar soya tripticasa. Si para cada caja se necesita 20
mL, para 15 cajas x 20 mL c/u = 300 mL.

La etiqueta del frasco indica que la cantidad de medio deshidratado que se debe
pesar para preparar 1 L es 12 g. El cá lculo será :

1000 mL ----------------12 g
300 mL --------------------X

X= 300 mL x 12 g/1000 mL = 3,6 g

Por lo tanto, 3,6 g de medio soya tripticasa deshidratado se pesa en papel aluminio y
se transfiere a un erlenmeyer de 500 mL que contiene 100 mL de agua destilada. El
volumen de agua para rehidratar un medio se mide con probeta.
Se completa el volumen de agua y se mezcla por agitació n el contenido del
erlenmeyer.
 Se cubre la boca del Erlenmeyer con papel aluminio y se calienta
moderadamente con agitació n constante para impedir que el medio se pegue
en el fondo del matraz .

 Se calienta hasta que empieza la ebullició n, se observa que la suspensió n

(medio má s agua) empieza a aclararse y se forma espuma que se eleva por
las paredes del matraz, en este momento se retira el matraz de la placa para
evitar que se derrame, luego de mantener unos segundos fuera, se regresa a
la placa calentadora.
 Mientras se calienta se espera que suba y baje la espuma 3 veces, la espuma
limpia de partículas las paredes del frasco.

 Se calienta hasta obtener una preparació n completamente transparente.

 Se tapa con algodó n y papel kraft la boca del frasco y se lleva al autoclave
para esterilizar. Si el medio se va a usar inmediatamente se tapa con papel
aluminio
 También el contenido del Erlenmeyer puede verterse en un frasco Schott de
paredes gruesas y tapa rosca para autoclavar. En este caso la tapa rosca debe
cerrarse parcialmente (cerrar totalmente y dar una vuelta para abrir). En
cualquier caso se debe siempre rotular el recipiente con el nombre del medio

o Autoclavar a 121°C, 15 minutos

o Retirar el medio del autoclave, llevar a un bañ o de agua a 47°C.

Cuando haya alcanzado esta temperatura, repartir el medio en las
cajas Petri. Este paso minimizará la condensació n de humedad en la
tapa de las cajas y en la superficie del medio solidificado

o El medio se reparte en condiciones asépticas, en la cá mara de flujo

laminar o frente a la llama de un mechero

o Retire el frasco con el medio del bañ o de agua

o Tome la botella con la mano derecha, retire la tapa con la mano

izquierda, evite la contaminació n de la tapa.

o Flamee el cuello de la botella

o Retire la tapa de la caja Petri con la mano izquierda y deposite el agar

estéril y fundido en la placa Petri

o La base de la caja Petri debe estar cubierta de medio, el agar no debe

tocar la tapa de la caja ni los bordes internos o extenos de la caja

o Flamee el cuello de la botella y continue el reparto del medio en las

cajas
 o Para repartir el medio, se tendrá cuidado de abrir las cajas justo antes
de servir el medio, evitando que este se contamine por contacto con
las manos del operador.

o Al repartir el medio se debe evitar la presencia de burbujas (cuando

se forman, retirarlas rotando la caja o picando la burbuja con una asa
estéril). Se tendrá cuidado de no mover las cajas recién añ adidas de
medio.

o Las cajas permanecerá n tapadas parcialmente en la cá mara aséptica o

en la mesa hasta que el medio solidifique (10 minutos).

o La superficie del agar debe ser suave, homogénea sin burbujas,

granulaciones o arrugas, hú meda pero no mojada. Las rugosidades
pueden hacer vibrar el asa y producir salpicaduras mientras el agua
provoca crecimiento confluente.

o Las placas con medio solidificado se recogen y se colocan invertidas

en la cá mara aséptica mientras se rotulan en el borde o en la base con
el nombre del medio (iniciales) y la fecha de preparació n. Se colocan
en bolsas de plá stico o de tela y se guardan en refrigeració n a 4°C-8°C
con la superficie de agar hacia arriba para evitar condensació n de
agua en la tapa.

o Los medios de cultivo preparados también se pueden almacenar

(corto tiempo) a temperatura ambiente, lejos de la luz solar directa, en
un armario. Para evitar la evaporació n se debe almacenar en botellas
con tapó n de rosca, para usarlos se debe fundirlos en un bañ o de agua
hirviendo, en olla de presió n u horno microonda, después de fundidos
se pasan a un bañ o de agua cerca a 50°C hasta su uso inmediato

o Se hace la prueba de esterilidad, incubando algunos medios a 37°C

durante 24 horas. La ausencia de microorganismos indica que el
medio está libre de microorganismos. En caso contrario estos medios
no se pueden usar y se debe determinar la causa de la contaminació n.

Notas.
Hay medios de cultivo que no necesitan autoclavarse (en este caso se rehidratan con
agua estéril) Otros medio se recomienda esterilizar a 115°C durante 20 minutos y
otros en condiciones especiales Si el medio se va a dispensar en tubos es má s
prá ctico servirlos antes de autoclavar. En algunos casos los tubos deberían
esterilizarse previamente.

4. ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:

1. Limpiar los mesones con alcohol de 70° G.L

2. Lavarse las manos
3. Encender la lá mpara de alcohol
 4. Ubicar los materiales en su zona de trabajo
5. Empacar los materiales (hisopos, tubos, cajas Petri)
6. Calcular las cantidades requeridas de medios de cultivo
7. Preparar los medios de cultivo
8. Esterilizar los medios de cultivo
9. Temperar los medios de cultivo (colocar en bañ o de agua a 47-50°C
10. Servir los medios de cultivo en las cajas Petri
11. Dejar solidificar los medios de cultivo
12. Rotular los medios de cultivo
13. Almacenar los medios de cultivo

5. RESULTADOS OBTENIDOS

Al final de la prá ctica se espera obtener por cada grupo 6 placas de agar nutritivo o
PCA estéril, 6 placas de agar MacConkey, 6 tubos estériles
Los medios de cultivo y las soluciones no deben estar contaminados.
Los medios só lidos deben estar bien preparados y repartidos
El estudiante habrá sido capacitado en la preparació n general de medios de cultivo,
en el procedimiento de esterilizació n y el manejo de la técnica aséptica.

Se necesita preparar 7 cajas de agar soya tripticasa. Si para cada caja se necesita 18
mL, para 7 cajas x 18 mL c/u = 126 mL.

La etiqueta del frasco indica que la cantidad de medio deshidratado que se debe
pesar para preparar 1 L es 12 g. El cá lculo será :

1000 mL ----------------12 g
126 mL --------------------X

X= 126 mL x 12 g/1000 mL = 1,512 g

Por lo tanto, 1,512 g de medio soya tripticasa deshidratado se pesa en papel

aluminio y se transfiere a un erlenmeyer de 500 mL que contiene 100 mL de agua
destilada. El volumen de agua para rehidratar un medio se mide con probeta.
Se completa el volumen de agua y se mezcla por agitació n el contenido del
erlenmeyer.

DISCUSIÓN

Dentro del marco de discusió n podemos enmarcar diversos aspectos importantes y

fundamentales de la prá ctica.Destacamos el resultado positivo sobre los medios de cultivo,
ya que en él aplicamos toda la teoría estudiada en la clase, es decir, los diversos modos de
cultivo fueron necesarios para hacer comparaciones entre ellos, y de esta manera definir el
que se acomodaría de mejor forma a la prá ctica que elaboraríamos. Otro punto a debatir es
la diversidad de microorganismo que creció en el cultivo el resultado que fue de 1,512 g
que son necesarios para prepar 126 ml de medio de cultivo está n correctos segú n nuestra
apreciació n
 6. CONCLUSIONES

 Mediante el desarrollo de esta prá ctica definimos, estudiamos y aplicamos

los procedimientos que se deben realizara para la elaboració n de un medio
de cultivo, es claro que esto es referido para con la unidad que estamos
estudiando, microbiología
 Conocimos y utilizamos la metodología de preparació n de los medios de
cultivo de acuerdo a lo visto en clases y se reafirmo el concepto de la
ubicuidad microbiana .

7.RECOMENDACIONES

 De acuerdo a esta prá ctica se recomienda que potenció metro este calibrado ya
que se pierde tiempo en tratar de calibrarlo, que para la posterior practica se le
apliquen reguladores de crecimiento al medio de cultivo  ya que en esta prá ctica
no se agregaron.

 Utilizar los implementos que se requieren para el correcto desarrollo de la

practica y leer previamente la guía de laboratoeio.

 Acatar las indicaciones del docente encargado puesto que el laboratorio de

microbiología es un lugar donde se pueden proliferar los virus y bacterias.

Dra. Janneth Gallegos N. Ph D

NOMBRE Y FIRMA DEL DOCENTE
DE LA ASIGNATURA

Referencias

1. Escobar D.M. Manual de Técnicas y procedimientos. Facultad Nacional de Salud

Pú blica. Universidad de Antioquia 1991.pp 111
2. Departamento de Microbiología. Universidad de Navarra. 2013. Elsevier. Españ a. Pp
215
3. Gamazo C. Ló pez –Goñ i, Díaz R. Manual prá ctico de Microbiología. Departamento de
Microbiología y Parasitología. Universidad de Navarra. 3er Edició n 2005. Editorial
Masson. Españ a. Pp 231
4. Gaviria B. (2008). Manual de Prá cticas: Control Microbioló gico en la Industria.
Departamento de Microbiología. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad
Javeriana de Bogotá pp 100
 5. Arrieta B., G. Má ttar V Salim. Microbiología Veterinaria. Diagnó stico de Laboratorio.
Universidad de Có rdoba. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Instituto de
Investigaciones Bioló gicas del Tró pico.

Cuestionario anexo.

1. En que consiste la técnica aséptica cuá l es su utilidad para la prá ctica

microbioló gica?
2. Qué se necesita para aislar bacterias de ecosistemas naturales?
3. Có mo se clasifican los medios de cultivo?
4. Cuá les son los problemas que se producen por una reconstitució n incorrecta de los
medios de cultivo?