“Animal Cell Culture and Cryopreservation”

Cultivo de células animales y Criopreservación

Documento traducido al español del libro:

V. Gupta et al., Basic and Applied Aspects of Biotechnology, Springer Media

Singapore 2017

El cultivo celular es un proceso mediante el cual las células se cultivan fuera de su

entorno natural bajo condiciones de laboratorio. El desarrollo histórico de los
métodos de cultivo celular está estrechamente relacionado con el cultivo de tejidos
y órganos. El cultivo de células animales tiene una larga historia de más de 100
años, aunque se han logrado avances importantes en los últimos 30 años. Se ha
convertido en una de las principales herramientas en las ciencias biomédicas. Casi
el 50% de los productos biológicos producidos hoy o que se prevé producir en un
futuro próximo se basan en el cultivo de células animales. Por lo tanto, existe un
creciente interés en el desarrollo de tecnologías para cultivar y mantener las
células animales. Aparte de desarrollar nuevas tecnologías para cultivar y
manipular células animales para producir biológicos, los investigadores también
están interesados en estudiar procesos de desarrollo utilizando células animales
como un sistema modelo. Este capítulo está diseñado para servir como una
introducción básica al cultivo de células animales para los estudiantes e
investigadores que están interesados en entender los conceptos clave y
terminologías en este campo que se encuentra en continuo crecimiento.

3.1. Introducción

La técnica de cultivo celular comenzó en el siglo XX con el objetivo de estudiar el

comportamiento de las células animales en condiciones de laboratorio (in vitro).
Esta técnica implica la selección adecuada de las células, el aislamiento de su
entorno natural, y la transferencia a una condición in vitro controlada artificialmente
en un medio adecuado. Estas células son estandarizadas para crecer en
condiciones artificiales y tienen enormes aplicaciones en investigación. Los

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cultivos celulares pueden ser extremadamente útiles para sustituir animales de
laboratorio cuando se realizan por ejemplo ensayos para evaluar fármacos, como
modelos para estudiar patógenos humanos y también para el cultivo a gran escala
y la producción de compuestos terapéuticos (Fig. 1.1).

Figura 1.1.

Hoy en día, el 70% de los productos farmacéuticos recombinantes se producen

usando cultivo de células de mamífero. La tecnología ha hecho posible el uso y la
preservación de células madre con fines terapéuticos, su uso futuro para terapia
génica y como material de partida para ingeniería de tejidos. Este capítulo
ayudaría a los lectores a obtener una visión técnica de cultivo, sus requerimientos,
aplicaciones y almacenamiento de los cultivos celulares.

1.2. Preparación y esterilización de los medios

1.2.1 Medios de cultivo celular

El paso más importante para realizar un cultivo celular es seleccionar un medio de

crecimiento apropiado. La selección de los medios se basa en el tipo de célula y el
propósito de cultivo. Los medios utilizados para cultivos celulares incluyen en su
mayoría dos partes principales.
 1. Ingredientes basales esenciales: Esta parte del medio cumple con los
requisitos celulares básicos de los nutrientes y se conoce como medio de
crecimiento basal.

2. Ingredientes suplementarios: Un conjunto de suplementos que satisface el

crecimiento celular específico y permite que un tipo particular de célula crezca.

Los principales componentes para el crecimiento celular en condiciones de

laboratorio incluyen los siguientes:

1. Una fuente de energía

2. Fuente de nitrógeno

3. Vitaminas

4. Grasas, ácidos grasos y componentes liposolubles

5. Sales inorgánicas

6. Ácidos nucleícos

7. Antibióticos

8. Oxígeno

9. Sistemas de amortiguación del pH

10. Hormonas

11. Factor de crecimiento (suero)

Existen dos tipos de medios de cultivo: medios totalmente naturales y medios

artificiales con algunos productos naturales.

Medios Naturales: En los primeros días del cultivo de células animales, utilizaron
medios naturales que se obtuvieron de fuentes biológicas. Sin embargo, en los
últimos años se utilizan para fines específicos tales como pruebas de toxicidad o
esterilidad o se producen comercialmente como medios de cultivo. Algunos de los
ejemplos de medios naturales son:

(A) Fluidos corporales tales como plasma, suero, linfa, y líquido amniótico

(B) Extractos de tejido como los del hígado, bazo, médula ósea o de embrión de
pollo

C) Extracto de embrión bovino

Medios Artificiales: El criterio básico para elegir medios artificiales es que deben
proporcionar todos los nutrientes necesarios para la célula y mantener un pH
fisiológico (pH 7) con la ayuda de un sistema estéril isotónico.

Varios medios artificiales desarrollados para cultivo celular pueden agruparse en

las siguientes tres clases:

(A) Medios que contienen suero

El suero es el componente más importante para el cultivo de células animales.

Aunque su composición y funciones aún no se conocen completamente, se
considera que el suero proporciona nutrientes, hormonas y factores de crecimiento
al medio.

Además de lo mencionado también aporte lo siguiente:

1. Une nutrientes esenciales que son tóxicos cuando están presentes en

cantidades excesivas y los libera lentamente de manera controlada.

2. Modula las propiedades fisicoquímicas del medio (viscosidad, velocidad de

difusión) protegiendo las células cultivadas en agitación.

3. Tiene una función amortiguadora de pH

A pesar de las ventajas, existen limitaciones asociadas al uso del suero:

 1. El suero es el componente más costoso y su composición completa todavía
no se conoce. Es difícil usarlo para cultivar células que necesitan medios definidos
para crecer.

2. Existe la posibilidad de que contenga contaminantes, por ejemplo,

micoplasma y virus.

(B) Medios libres de suero

Se usan varios sustituyentes del suero para reducir la contaminación con

patógenos, tales como:

1. Extracto de pituitaria bovina (BPE)

2. Los hidrolizados de tejidos bovinos o porcinos (Peptonas)

3. Los hidrolizados de soja (peptonas)

C) Mezclas químicamente definidas

En los medios químicamente definidos, la composición se cuantifica con precisión.

Este tipo de medios genera un mínimo riesgo de contaminación biológica. Sin
embargo la mayoría de las líneas celulares crecen muy lentamente.

1.2.2 Esterilización del medio de cultivo celular

Los medios de cultivo celular deben esterilizarse para prevenir el crecimiento de

bacterias y otros microorganismos. El uso del autoclave no está permitido para la
esterilización ya que las altas temperaturas afectan los componentes del medio.
La esterilización se realiza generalmente usando filtros formados con una
membrana microporosa grado esterilización de 0,2 o 0,1 µm. La filtración con
membranas de 0,1 µm (de tamaño del poro) es el método de elección para
eliminar la contaminación por micoplasma, mientras que la irradiación gamma se
utiliza para destruir los virus.

Los micoplasmas carecen de pared celular. Son las bacterias más pequeñas por
lo que no son retenidas en los filtros de 0,2 µm, debido a su tamaño y flexibilidad.
Para reducir virus y priones, la pasteurización (de corta duración) se utiliza a veces
antes de la filtración estéril. Los procesos de pasteurización no causan ningún
cambio significativo en la calidad de los medios. El agua utilizada para los medios
de debe ser libre de pirógenos. Los reactivos químicos utilizados en los medios del
cultivo deben tener un alto grado de pureza, además deben estar certificados para
su uso en medios de cultivo celular. Algunas trazas de contaminantes pueden ser
tóxicos (como el mercurio).

Con respecto a la estabilidad de los componentes de los medios, hay unos

indefinidamente estables. Las vitaminas, las hormonas, los antibióticos y los
factores de crecimiento son menos estables y se recomienda almacenarlos
congelados (-20 °C) o refrigerado (0-4 °C). La mayoría de los factores externos
que afectan la vida útil de los medios son los siguientes:

- La tasas de decaimiento natural de compuestos inestables

- PH
- Humedad
- Temperatura de almacenamiento
- Exposición al oxígeno
- Exposición a la luz diaria, luz ultravioleta o fluorescencia

La mayoría de los medios deben almacenarse a 4 °C y en un lugar oscuro. La

congelación de los medios puede hacer que algunos ingredientes se precipiten.
Los medios cuyos componentes viene en polvo (para ser disueltos posteriormente
y preparar el medio de cultivo) son estables durante varios años a temperatura
ambiente (25 °C).

Los medios basales (DMEM, medio 199, SGM, mezcla de nutrientes Ham F14)
utilizados en el laboratorio de cultivo celular se compran como soluciones

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esterilizadas con rayos gamma y deben estar certificados como libres de
endotoxinas. También se pueden preparar en el laboratorio utilizando
componentes básicos y esterilizar con filtro de 0,22 µm. los

Los medios básicos se compran sin L-glutamina para aumentar la estabilidad ya

que la glutamina es un componente inestable en el medio de cultivo.

La L-glutamina, que se adquiere como una solución estéril libre de endotoxina, se

añade inmediatamente antes de usar.

El suero bovino fetal utilizado en los medios de cultivo celular debe tener un
certificado de que fue evaluado para virus (BVD-IBR-PI3) y micoplasma, así como
el virus de la encefalopatía espongiforme bovina (BSE). Los antibióticos, factores
de crecimiento u otros suplementos deben ser soluciones esterilizadas y libres de
endotoxina o en una concentración menor de 0,1 ng/µg.

El medio de cultivo completo debe prepararse en una cabina de flujo laminar en

condiciones estériles usando material plástico estéril desechable. La tapa y el
cuello de la botella que contiene el medio esterilizado deben ser protegidos con
Parafilm y almacenados a 4 °C. la mayoría de los medios completos son estables
a 4 °C durante 1-2 meses.

La American-type culture collection (ATCC) es una entidad establecida en 1914 y

ayuda en la adquisición, autenticación, producción, preservación, desarrollo y
distribución de líneas celulares. Las líneas celulares son mantenidas y verificadas
por la ATCC desde 1962. Es la mayor colección y uno de los mayores fuentes en
el mundo y mantiene las líneas celulares de humanos, insectos, peces y células
madre. Hay líneas celulares animales de aproximadamente 150 especies
diferentes y casi 4.000 líneas celulares humanas incluyendo modelos para cáncer
(HeLa, OVCAR-3, y muchos más). El Instituto Coriell de Investigación Médica
(ccr.coriell.org) y la ATCC son organizaciones sin ánimo de lucro que proporcionan
líneas celulares auténticas de alta calidad. Aunque teóricamente, las células de
cualquier tipo pueden cultivarse tras la obtención en estado viable de cualquier
órgano o tejido, no todos los tipos de células son capaces de crecer en un entorno

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artificial. Esto ocurre por muchas razones. La principal es que el entorno artificial
no siempre imita los parámetros bioquímicos de la fuente de la cual se tomaron las
células. Algunos ejemplos incluyen la ausencia de reguladores de crecimiento o
moléculas que participan en vías de señalización de célula a célula. El subcultivo
se utiliza a menudo para mantener una línea celular.

Algunas definiciones

Cultivo primario: El tejido se obtiene de los organismos, se trata con enzimas de

digestión como tripsina o colagenasa, y se coloca en un medio de cultivo adecuado donde
pueden dividirse y crecer.

Subcultivo: Cuando en el cultivo primitivo las células crecen y llenan todo el pozo, estas
se pueden disociar enzimáticamente o por raspado suave y algunas de ellas se trasfieren
a un medio fresco bajo condiciones estériles.

Cultivo en monocapa: Monocapa se refiere a una capa de células en la que no hay

células creciendo una encima de la otra, lo que quiere decir que todas están creciendo
una junto a la otra y muchas veces se tocan en la misma superficie de crecimiento.

Cultivo de suspensión: Es un tipo de cultivo en el cual las células se mantienen

en
suspensión en el medio de cultivo para que se distribuyan uniformemente.

Células dependientes del anclaje: Es una célula que crece, sobrevive o mantiene
la
función sólo cuando está unida a una superficie inerte adecuada, como vidrio o plástico.

Células transformadas: Línea celular eucariótica obtenida en una fase quiescente o

estacionaria que experimenta la conversión a un estado de crecimiento no regulado en el
cultivo, parecido a un tumor in vitro. Se produce espontáneamente o a través de la
interacción con virus, oncogenes, radiación, o fármacos/productos químicos.

Líneas celulares finitas: Las células o líneas celulares después de unas pocas
generaciones de crecimiento dejan de dividirse y muestran signos de envejecimiento por
eso se conocen como líneas finitas.
Líneas celulares continuas: Las células que pueden continuar dividiéndose
indefinidamente (o inmortales) son líneas celulares continuas.

Neoplásticamente transformadas: estas células son capaces de formar

tumores
cuando son inyectadas en animales.

Las células que se cultivan se caracterizan en relación a su morfología o sus

propiedades funcionales:

1. Células de tipo epitelial: Son dependientes del anclaje, de forma plana y

poligonal.

2. Células tipo linfoblasto: Están suspendidas y de forma esférica.

3. Células tipo fibroblastos: Son dependientes de anclaje, son alargadas y forman

remolinos en cultivo confluente.

Las condiciones de cultivo afectan en gran medida el tamaño y la forma de las

células (las células en cultivo pueden alcanzar múltiples morfologías).

1.4. Desarrollo de líneas celulares

Las células que se cultivan en los medios se pueden aislar de los tejidos de varias
maneras:

(A) Los glóbulos blancos por ejemplo se pueden purificar fácilmente de la sangre.

(B) Por digestión enzimática de tejidos blandos usando colagenasa o tripsina.

Estas enzimas descomponen la matriz extracelular y liberan las células.

(C) En cultivos de explantos, se coloca un trozo de tejido en medio de crecimiento

y las células que crecen están disponibles para cultivo. La Figura muestra los
pasos básicos requeridos para el cultivo de células primarias.
Fig. 1.2 La figura muestra el cultivo de células. Después del cultivo confluente, las
células son pasadas o crioconservadas para uso posterior

1.5 Células primarias y líneas celulares inmortalizadas

Las células que se cultivan directamente a partir de especímenes animales se

conocen como células primarias. Excepto algunas líneas celulares que se derivan
de tumores, la mayoría de las células primarias tienen una vida útil limitada.
Después de un cierto número de divisiones, las células primarias sufren
senescencia y dejan de dividirse aunque pueden mantener su viabilidad. Las
líneas celulares inmortalizadas adquieren la capacidad de proliferar
indefinidamente (Fig. 1.3). El establecimiento de líneas celulares se puede
conseguir de varias maneras:

1. El método original para generar una línea celular inmortalizada es el aislamiento

de células cancerosas producidas de forma natural. Un ejemplo es la línea celular
HeLa, obtenida de un cáncer cervical.

2. Mutagénesis aleatoria (espontánea o inducida) y selección de células capaces

de sufrir división.
3. Introducción de algún producto en las células que altere el ciclo celular como la
expresión de genes virales (adenovirus E1) o las proteínas clave (telomerasas)
para inmortalizar las líneas celulares.

1.6 Técnicas de cultivo celular

Según sus propiedades de crecimiento se pueden clasificar en dos tipos las

células de mamíferos: células adherentes y células en suspensión. Las células
adherentes se adhieren a una superficie y crecen como una monocapa. Las
células de cultivos en suspensión crecen suspendidas y no se adhieren a la
superficie de las láminas. Ya sea en suspensión o en condiciones adherentes, a
medida que crecen las células, deben ser subcultivadas. La falta de subcultivo
produce células confluentes (en el caso de líneas celulares adherentes) y resulta
en un índice mitótico reducido y finalmente en la muerte celular.

1.6.1 Subcultivo de células (Pasaje)

El primer paso en el subcultivo de células adherentes es separarlas de la

superficie del recipiente de cultivo. Esto puede hacerse agregando tripsina o por
medios mecánicos. La suspensión celular resultante se divide y se pone en cultivo
fresco. Los cultivos secundarios se evalúan periódicamente para su crecimiento
para subsecuentemente ser subcultivados. El tiempo para subcultivar células
depende del tipo de célula y del crecimiento de estas. El subcultivo de células a
partir de cultivos en suspensión es menos complicado que el cultivo adherente ya
que las células ya están suspendidas y no hay necesidad de separarlas
enzimáticamente. Sin embargo, antes de hacer el subcultivo, las células deben
alcanzar la confluencia, es decir, se agrupan y el medio se ve turbio cuando el
matraz se mueve.

1.6.2 Congelación de células

Siempre es deseable almacenar las líneas celulares para futuros estudios. Para
conservar las líneas celulares, se pueden congelar con un agente crioprotector. La
congelación sin agente crioprotector mata las células. Generalmente se usa
dimetilsulfóxido (DMSO) como agente crioprotector junto con medio completo para
conservar las células a -70ºC o menos. La congelación gradual reduce el riesgo de
formación de hielo cristalino y daño celular. El DMSO reduce el punto de
congelación y permite una velocidad de congelamiento más lenta.

1.6.3 Descongelación y recuperación de células

Cuando se usan células congeladas para un estudio, deben ser descongeladas

rápidamente para optimizar la recuperación. El DMSO del medio de congelación
debe ser retirado antes de poner el medio fresco; De lo contrario interferirá con el
crecimiento de las células. Esto puede hacerse centrifugando las células y
retirando el medio que contiene el DMSO.

3.6.4 Determinación de números de células viables

Es importante determinar el número exacto de células en un cultivo para

estandarizar las condiciones de cultivo y también realizar una cuantificación
precisa en los experimentos. El números de células se pueden contar usando un
hemocitómetro que es un diapositivo de cristal grueso con un área central
diseñada como una cámara de recuento. La porción central de la corredera tiene
dos plataformas de recuento divididas. Cada cámara de conteo consta de una
cuadrícula de 3 × 3 mm. Cada cuadrícula se divide además en nueve cuadrados
secundarios de 1 × 1 mm. Los cuatro cuadrados de esquina y el cuadrado central
se utilizan para determinar el recuento de células. Los cuadrados de 4 esquinas se
subdividen en 16 y el cuadrado central en 25 cuadrados terciarios. Cada lado se
acompaña de un cubreobjetos grueso. La suspensión de células aplicada a un
área definida se utiliza para contar la densidad celular.

3.6.5 Preparación de las células para el transporte

Tanto los cultivos monocapa como los cultivos en suspensión pueden enviarse
fácilmente en un recipiente de cultivo de tejidos con medios o en condiciones
congeladas. Para el envío en un envase con medios, es aconsejable utilizar
medios frescos y llenarlo completamente para evitar el secado. Para transportar
cultivos congelados, las células se eliminan del nitrógeno líquido y se colocan
inmediatamente en hielo seco en un recipiente aislado para evitar el deshielo
durante el transporte. Por lo general, los cultivos se transportan por correo de un
día o por la noche con una etiqueta de riesgo biológico fuera del paquete.

3.7. Líneas Celulares y Mantenimiento

Línea celular es un cultivo establecido de células que se inmortalizan y tienen la

capacidad de crecer indefinidamente siempre y cuando tengan los nutrientes
adecuados (medio) y el espacio. Existen varias líneas celulares establecidas a
partir de células humanas y de otras especies de mamíferos.

Las líneas celulares animales se cultivan y mantienen a una temperatura

apropiada ya una mezcla de gases, típicamente de 37ºC y CO 2 al 5% para células
de mamífero en una incubadora. Las condiciones de cultivo y el medio varían de
una línea celular a otra y la variación de la misma puede producir un fenotipo
diferente o pérdida de propiedades. Los medios de cultivo celulares mantienen el
pH apropiado y proporcionan una concentración apropiada de glucosa, factores de
crecimiento y otros nutrientes. Los factores de crecimiento son a menudo
proporcionados por el uso de suero en los medios de cultivo. Pero una dificultad
en el uso de material derivado de sangre animal es la potencial contaminación del
cultivo con virus. Sin embargo, el suero continua siendo la mejor alternativa. Las
líneas celulares siempre deben mantenerse en condiciones asépticas. Para
prevenir el crecimiento bacteriano, se usan antibióticos en los medios. Todos los
procedimientos deben realizarse bajo la campana de flujo laminar que mantiene la
condición aséptica y todo el equipo debe esterilizarse adecuadamente antes y
después de terminar.
 Preguntas de resumen

Responda las siguientes preguntas, sin transcribir; Mínimo 30 palabras por

respuesta; escritas a mano; taller individual.

1. ¿Cuál es la importancia del cultivo de células animales?

2. ¿Por qué es necesaria la esterilización en el cultivo de células de
mamíferos?
3. ¿Por qué es importante la criopreservación?
4. ¿Por qué en la actualidad se busca o se prefiere trabajar con medios de
cultivo libres de suero?

5. Defina cual seria un buen método de esterilización de amplio espectro

6. Por que es importante monitorear la viabilidad de las células

7. ¿ Cuál es la función de los criopreservantes?

8. ¿Cuál es la importancia de la ATCC?

9. Investigar que compuestos o sustancias pueden ser utilizados como fuente

(un ejemplo para cada una) de:

- Fuente de energía

- Fuente de nitrógeno

- Una vitaminas

- Grasas, ácidos grasos y componentes liposolubles

- Sales inorgánicas

- Ácidos nucleícos

- Antibióticos

- Sistemas de amortiguación del pH

- Hormonas

- Factor de crecimiento
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