HUGO Proyecto Terminal

Evaluación de las propiedades antibacterianas del extracto de la raíz
de sangre de grado (Jatropha dioica) frente a aislados de

Staphylococcus aureus y una cepa de Escherichia coli O157:H7
PROYECTO TERMINAL QUE PARA OBTENER EL TÍTULO

DE INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA
P R E S E N T A :
Hugo Jahaziel Salazar Villalobos

Asesor Interno: Dra. Diana Elinos Calderón
Asesor Externo: Dra. Tania Breshkovskaya Ortiz Escobar

M.C. Raúl Antonio Alvarado Arroyo
Evaluación de las propiedades antibacterianas del extracto de la raíz de sangre de grado (Jatropha dioica) frente a
aislados de Staphylococcus aureus y una cepa de Escherichia coli O157:H7
BIOTECNOLOGÍA
Resumen
La raíz de sangre de grado (Jatropha dioica) pertenece a la familia Euphorbiaceae que
es una de las más grandes a nivel mundial y ocupa el sexto lugar en diversidad después
de Orchidaceae, Asteraceae, Fabaceae, Poaceae y Rubiaceae. Su distribución es
subcosmopolita y aunque está mejor representada en las regiones tropicales y
subtropicales, varios representantes se extienden a las zonas templadas de ambos
hemisferios. Esta familia es sumamente importante, ya que muchos de sus miembros se
cultivan para su uso medicinal, industrial, alimenticio y ornamental. Existen muchos
conocimientos rurales e incluso indígenas con respecto al uso de los atributos de esta
planta en el tratamiento de diversas enfermedades. Esta familia también es una de las
más grandes y diversas de México, tiene un potencial curativo desde la cicatrización de
heridas, hasta propiedades anticancerígenas y antimicrobianas, por lo que esta especie
adquiere un interés particular para los seres humanos (Aguilera et al, 2008).
Existen diferentes microorganismos patógenos, dentro de los cuales se encuentra

Staphylococcus aureus, considerado por la Sociedad Americana de Enfermedades
Infecciosas (IDSA) como uno de los 6 microorganismos de mayor importancia en la
práctica médica diaria, es una de las causas frecuentes de infecciones en la comunidad
médica y de un número importante de infecciones relacionadas con los cuidados
médicos. Este microorganismo posee un alto grado de patogenicidad, y es responsable
de una amplia gama de enfermedades, que van desde infecciones leves hasta
infecciones graves que comprometen la vida del paciente[ CITATION Jaw10 \l 2058 ].
Otro microorganismo de gran importancia Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) la
cual es una variedad patógena, que puede causar diarrea o colitis hemorrágica en los
humanos. En ocasiones, la colitis hemorrágica deriva en síndrome urémico hemolítico
(SUH). Una de las causas importantes de insuficiencia renal aguda en niños y morbilidad
en adultos. En los ancianos, la tasa de letalidad por el SUH puede elevarse al 50%. La
E. coli O157:H7 (ECEH O157:H7) ha sido reconocida como la causa de este síndrome
desde la década de 1980. Los reservorios de la ECEH O157:H7 son los rumiantes, en
especial el ganado bovino y las ovejas, que se infectan sin presentar síntomas y
eliminan el organismo en las heces (Jawetz, 2010)
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Evaluación de las propiedades antibacterianas del extracto de la raíz de sangre de grado (Jatropha dioica) frente a
aislados de Staphylococcus aureus y una cepa de Escherichia coli O157:H7
BIOTECNOLOGÍA
Las infecciones por ECEH O157:H7 se producen en todo el mundo, además se han
informado infecciones en todos los continentes, excepto en la Antártida. Otras ECEH
probablemente también estén ampliamente distribuidas, por lo que los serotipos pueden
variar según la región geográfica[ CITATION Jaw10 \l 2058 ].
Por lo que el objetivo principal de este trabajo es presentar un panorama específico

sobre la posible actividad antimicrobiana de un extracto de la raíz de sangre de grado
(Jatropha dioica) frente a aislados de S.aureus y una cepa de E.coli O157:H7
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Agradecimientos
Quiero agradecer al rector de la Universidad Politécnica de Gomez Palacio Durango
Dr. Luis de Villa Barrera por permitirme la estancia de un año completo en las
instalaciones de la Universidad ya que sin su autorización mi proyecto terminal no se
pudiese haber realizado.
Agradezco a el secretario académico Ing. Miguel Ángel Serrano García ya que

gracias la autorización para realizar este proyecto que me permitió ver todas mis
habilidades como estudiante.
Quiero agradecer profundamente a la Dra. Tania Breshkovskaya Ortiz Escobar y

al M.C. Raúl Antonio Alvarado Arroyo excelentes maestros, por darme la
oportunidad de haber dirigido mi tesis, además de recibirme durante un año
completo en las instalaciones del laboratorio de análisis microbiológico ya que me
brindaron de su valioso tiempo y guiarme durante todo este proceso de aprendizaje,
y creo que las enseñanzas y cada corrección que ustedes me hicieron y estoy feliz
de que ustedes hayan sido los directores de mi tesis.
Agradezco a M.C Jaqueline Yadira Andrade Ortiz como la encargada del

laboratorio de análisis microbiológico, todos sus consejos de buenas prácticas de
laboratorio y la elaboración de reportes para pedir el material y equipo a utilizar
gracias. Yadis como se te conoce entre los alumnos, siempre te agradeceré por
todo el apoyo que me brindaste.
Agradezco a la Dra. Diana Elinos Calderón por todo el apoyo brindado

incondicionalmente durante este tiempo, ya que fue significativo para mi vida,
gracias a las retroalimentaciones que usted me brindo puedo decir que son muy
valiosas y sin ellas este proyecto no se hubiese realizado y culminado con éxito,
muchas gracias Dra Diana.
Título del Proyecto Terminal
BIOTECNOLOGÍA
Agradezco a Dios Jehová la vida que me dio las fuerzas para terminar este
proyecto importante en mi vida y se pudiera realizar, gracias a su fuerza infinita y
poderosa, ya que sin ella no pude terminar cada uno de los reportes de mis queridos
profesores.
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BIOTECNOLOGÍA
Dedicatorias
A mi esposa Laura Cecilia, todo el apoyo incondicional que me brindo y estar
siempre a mi lado en las noches de desvelo, gracias a ti pude lograr esta meta tan
importante en la vida eres la mejor compañera, amiga, la mujer de mi vida. Gracias
por todo el apoyo que me brindaste nos solo en este ultimo año donde le dedique
tiempo a culminar mis estudios y que tu hallas comprendido el que en ocasiones no
estuviera al 100% con ustedes y por eso te amo.
A mis dos hermosos hijos, Fernanda Valeria y Jose Manuel ustedes y su mamá
son el amor de mi vida gracias al amor que les tengo pude seguir adelante en esta
etapa difícil pero satisfactoria de culminación y este logro que hemos alcanzado lo
hicimos como familia porque esto es por ustedes y por todo el tiempo que me
estuvieron apoyando para poder cumplir con mis actividades de papá y de
estudiante los amo a los dos.
A mis amados suegros Bruno y Patricia a ustedes porque siempre me instaron a

seguir adelante sin importar los obstáculos que se me presenten siempre me
estuvieron alentando a seguir adelante con mis estudios, hoy gracias a ello puedo
culminar satisfactoriamente una meta que me propuse desde hace años.
A mi querida abuelita María de los Ángeles a usted que siempre supo que
culminaría con éxito este logro, y siempre me estuvo alentando a no desistir y
quedarme en el camino.
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BIOTECNOLOGÍA
Índice
1. Justificación.......................................................................................................................... 7
2. Marco Teórico....................................................................................................................... 9
2.1. Descripción de la sangre de grado (Jatropha dioca).....................................................9
2.1.1. Fisiología........................................................................................................................... 9
2.1.2. Características químicas de la sangre de grado (Jatropha dioica)...................................10
2.2. Características importantes de Escherichia coli..........................................................10

2.2.1. Hábitat............................................................................................................................. 10
2.2.2. Morfología........................................................................................................................ 11
2.2.3. Cultivo para la E. coli.......................................................................................................11
2.2.4. Tratamiento contra las infecciones de E.coli O157:H7.....................................................11
2.2.5. Características de Aztreonam..........................................................................................13
2.2.6. Mecanismos de acción de Aztreonam..............................................................................13
2.3. Staphylococcus aureus...............................................................................................13

2.3.1. Hábitat............................................................................................................................. 14
2.3.2. Morfología de la Staphylococcus aureus..........................................................................14
2.3.3. Cultivo.............................................................................................................................. 14
2.3.4. Tratamiento para S. aureus.............................................................................................15
2.4. Métodos de identificación Bacteriana..........................................................................16

2.4.1. Métodos fenotípicos de identificación..............................................................................16
2.4.2. Métodos moleculares de identificación.............................................................................17
2.4.3. Métodos proteómicos de identificación............................................................................17
2.5. Métodos de estudio de la sensibilidad antibiótica........................................................18

2.5.1. Métodos para la difusión disco.........................................................................................19
2.5.3. Categorías interpretativas para el antibiograma...............................................................20

UnADM | DCSBA | 2019
3. Hipótesis............................................................................................................................. 21
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BIOTECNOLOGÍA
4. Objetivo.............................................................................................................................. 21
4.1. General....................................................................................................................... 21
4.2. Particulares.................................................................................................................21
5. Metodología........................................................................................................................ 22
5.1. Materiales.................................................................................................................... 22
5.1.1. Material Biológico.............................................................................................................22
5.1.2. Equipo de laboratorio.......................................................................................................22
5.1.3. Reactivos......................................................................................................................... 22
5.2. Diagrama general de la metodología...........................................................................23

5.3. Preparación de los extractos fluidos............................................................................24
5.4. Identificación de aislados de S. aureus y cepa de E. coli O157:H7.............................24
5.4.1. Preparación de los medios de cultivo para S. aureus y E. coli O157:H7..........................24
5.4.2. Activación de aislados de referencia de S. aureus y E.coli O157: H7..............................25
5.4.2.1. Tinción de Gram..............................................................................................................26
5.4.3. Pruebas Bioquímicas...............................................................................................26

5.4.3.1. Prueba de la enzima catalasa..........................................................................................26
5.4.3.2. Prueba de la presencia de la enzima coagulasa..............................................................26
5.4.3.3. Preparación de la prueba de medio movilidad, indol, Ornitina (MIO)...............................27
5.4.3.4. Reactivo de Kovacs (Revelador de la prueba de indol)....................................................27
5.4.3.5. Prueba de medio de sulfuro indol para movilidad (SIM)...................................................27
5.4.3.5.1. Prueba de Agar Hierro de Kligler..............................................................................28
5.4.3.6. Prueba de medio Lisina y Hierro (LIA).............................................................................29
5.4.4. Prueba de Urea................................................................................................................ 29
5.3. Preparación de antibiogramas.........................................................................................30

6. Resultados.......................................................................................................................... 31
6.1. Efecto antibacteriano del extracto de raíz de sangre de grado (Jatropha dioica)........31
7. Resultados Obtenidos........................................................................................................31
5
BIOTECNOLOGÍA
7.1. La identificación de aislados de S. aureus y una cepa de E. coli O157:H7 fue positiva
para la morfología macroscópica y pruebas bioquímicas.......................................................31
TABLA 2................................................................................................................................. 32
7.2. Identificación de la actividad antibacteriana de los antibióticos comerciales utilizando la
técnica de antibiograma frente a los aislados de E. coli O157:H7 y S. aureus.......................36
8. Discusión............................................................................................................................ 39
9. Conclusiones...................................................................................................................... 41
10. Bibliografía...................................................................................................................... 42
Índice de tabla
6
BIOTECNOLOGÍA
Figura 1: Principales mecanismos de acción y resistencia antibiótica estudiados en E.

coli....................................................................................................................................12
Figura 2: Principales mecanismos de acción y resistencia antibiótica estudiados en E.
coli....................................................................................................................................32
Figura 3 crecimiento en las placas petri para aislado de S. aureus y cepa de E. coli foto
de Hugo Jahaziel Salazar................................................................................................32
Figura 4 . Tabla de características en placa de cepa de E. coli O157:H7.y aislado de S.
aureus..............................................................................................................................33
Figura 5 Observación macroscópica de medios de EMB para E. coli (A) y sal & manitol
para S. aureus (B)...........................................................................................................33
Figura 6 de tinción de Gram de E. coli O157:H7.y S. aureus.......................................34
Figura 7 Observación microscópica de tinción de Gram para la cepa de E. coli (A) y
asilado de S. aureus (B)..................................................................................................34
Figura 8 Resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas de la cepa de E .coli
O157:H7...........................................................................................................................35
Figura 9 Resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas de aislados de S, aureus.35
Figura 10 En esta tabla se presenta los resultados de los diámetros en cm de los halos
de inhibición de los medicamentos en las cepas............................................................36
Figura 11. En las imágenes se presentan los resultados mostrados en la tabla 5. Para
el inciso A cepas de referencia de E. coli O 157:H7 y asilado de S. aureus..................37
Figura 12 En las imágenes se presentan los resultados mostrados en la tabla 5. Para
el inciso B cepas experimentales de E. coli O 157:H7 y asilado de S. aureus...............37
Figura 13 diámetros de los halos de inhibición de los extractos.....................................38
7
BIOTECNOLOGÍA
1. Justificación
La resistencia bacteriana es utilizada por algunos microorganismos como
mecanismo de defensa; es un fenómeno que existía antes del descubrimiento de los
antibióticos y de su uso, pero que con su introducción en el tratamiento de
enfermedades infecciosas se ha intensificado debido al fenómeno denominado
“presión selectiva” contra las bacterias. La investigación sobre la resistencia
bacteriana a los antibióticos en México se centra inicialmente en las infecciones
gastrointestinales. Por lo que la mayoría de estos microorganismos resistentes a los
tratamientos a las enfermedades de deba al uso desmedido de estos antibióticos sin
una prescripción correcta por un profesional de la salud. De ahí surge la necesidad
de buscar otras alternativas para inhibir los efectos de toxinas que generan estos
agentes microbianos resistentes a antibióticos.
Uno de los principales problemas que se ha enfrentado la comunidad médica en el

sector salud, es que cada vez más microorganismos son resistentes a ciertos
tratamientos por lo que las infecciones de estos microorganismos se agraven aún
más, y esto lleva a utilizar antibióticos que tengas efectos secundarios en los
portadores de estas infecciones.
De ahí que la mayoría de las personas portadoras de infecciones por

microorganismos patógenos busque otras alternativas para el tratamiento de estas
infecciones, sin que efectos secundarios puedan aparecer durante el tratamiento con
antibiótico mas fuerte como lo son algunos betalactámicos, cefalosporinas,
cefalexinas, solo por mencionar algunos.
Un ejemplo de estas alternativas es el uso de la planta de sangre de grado, ya que
es uno de los productos más utilizados a nivel popular en las zonas tropicales
húmedas de Centro y Sudamérica. Esta es muy conocida por las tribus indígenas de
8
BIOTECNOLOGÍA
México, Perú y Ecuador. Se utiliza principalmente como objeto medicinal ya que

tiene propiedades cicatrizantes, antiinflamatorias, antisépticas y hemostáticas, así
como algunos beneficios en el tratamiento para la diarrea, entre otros usos en la
medicina tradicional. Esta planta la podemos encontrar de forma silvestre en la
Región de la Comarca Lagunera, con un costo nulo permitiendo un análisis.
9
BIOTECNOLOGÍA
2. Marco Teórico
2.1. Descripción de la sangre de grado (Jatropha dioca).
Jatropha dioica pertenece a la familia de las Euphorbiaceae que es una de las

angiospermas con más diversidad en cuanto al hábitat. Su morfología puede variar
según la región, desde un árbol como la Havea de la selva amazónica hasta las
plantas pequeñas que se localizan en diferentes regiones templadas de Venezuela,
Ecuador, Perú, Brasil y México. Una de las características principales de este género
es que poseen una gran cantidad de usos a nivel etnobotánico, a nivel popular sus
hojas se usan como agente cicatrizante, además posee propiedades
antiinflamatorias, antisépticas y hemostáticas, así como antidiarreico (Alonso et
al.,2010).
2.1.1. Fisiología
Se conoce comúnmente como sangre de grado o sangre de drago, ambas

denominaciones se refieren a este arbusto y a varias especies relacionadas de
espeso látex color rojo parecido a sangre de ahí el nombre popular. La raíz suele
ser de forma cónica, la raíz principal es mucho más desarrollada que la raíz
secundaria, tiene un peridermis constituido por corcho. Su corteza es de color
grisáceo blanquecino, que segrega látex denso de color rojo vino de naturaleza
viscosa, llamada habitualmente “sangre de grado[ CITATION Art10 \l 2058 ].
El látex de la raíz sangre de grado (Jatropha dioica) es una sustancia líquida

levemente densa y de gran viscosidad, tiene algunas propiedades físicas que al
interactuar con la corriente del aire tiende a solidificarse con rapidez generando una
mancha visible en el lugar donde se aplicó; al ser friccionada en la piel genera
espuma. Las hojas miden de 12 a 20 cm de largo y de 5 a 14 cm de ancho, con
doble glándulas en la base, propia de la especie, las ramas y hojas jóvenes tienen
gran cantidad de indumento, de color marrón rojizo que van descendiendo conforme
se vuelven adultas (Alonso et al.,2010).
10
BIOTECNOLOGÍA
2.1.2. Características químicas de la sangre de grado (Jatropha dioica)
Algunos de los alcaloides encontrados que poseen características como el sabor

amargo, que se forma a partir de los aminoácidos que contienen nitrógeno
heterocíclico, lo que otorga propiedades básicas, la presencia de este metabolito en
el látex es de suma importancia por poseer propiedades farmacológicas
demostradas en diversas investigaciones, características atribuidas principalmente a
la Taspina (Balseca et al., 2015).
Wong Paz (2010), menciona que los alcaloides son solubles en solventes orgánicos
por la presencia de glucósidos y cadenas de ácidos carboxílicos y por lo tanto
solubles en agua. Vaisberg et al, (2007), describe que la actividad antimicrobiana de
los compuestos fenólicos (fenol, hexaclorofenol, timol, listerine, triclosan) están
relacionados en función a su concentración. Su mecanismo de acción consiste en
destruir la pared y membrana celular inactivando los sistemas enzimáticos. Por
tanto, los fenoles tienen actividad bacteriostática o bactericida, fungicida y viricida.
Siendo potentes sobre las bacterias Gram positivas[ CITATION Kar15 \l 2058 ].
Carrión et al., (2010) menciona que, la acción antibacteriana de los polifenoles

contribuye al proceso de cicatrización, por permitir la precipitación de las proteínas
de las células, formando la costra. Esta acción se le atribuye también al alcaloide
taspina, puesto que puede reducir ulceras gástrica agudas aumentado el espesor y
consistencia de la mucosa gástrica.
2.2. Características importantes de Escherichia coli
2.2.1. Hábitat
Este microorganismo coloniza el intestino de un ser humano a pocas horas de haber

nacido y es considerado como microbiota normal del intestino. Las cepas patógenas
de este organismo se distinguen del microbiota normal por poseer factores de
11
BIOTECNOLOGÍA
virulencia, como exotoxinas. Los factores de virulencia específicos pueden verse

junto al tipo de enfermedad, para separar dichos organismos en diferentes tipos. E.
coli enterohemorrágicas son verocitotoxigénica (o verotoxigénica) (ECVT) que
poseen factores de virulencia adicionales, lo que les proporciona la capacidad para
provocar colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico en los humanos. Una
característica fundamental de ECEH, pero que no es exclusiva de estos organismos,
es la capacidad para causar lesiones de adherencia/destrucción (A/E) en el epitelio
intestinal humano[ CITATION Pol09 \l 2058 ].
2.2.2. Morfología
E. coli es un bacilo Gram positivo corto, anaerobio facultativo de la familia

Enterobacteriaceae. No son formadoras de esporas, son móviles con flagelos
perítricos. Miden aproximadamente 0.5 µm de ancho y 3 µm de largo, son catalasa
positivos, oxidasa negativos, además reducen nitratos a nitritos. E. coli no es
exigente en cuanto a nutrimentos, pero fermenta lactosa y glucosa produciendo
gases, Sin embargo, su morfología es variable en muestras clínicas[CITATION
Uni141 \l 2058 ]
2.2.3. Cultivo para la E. coli
E. coli así omo la mayor parte de las otras bacterias entéricas forman colonias
circulares, convexas y lisas con bordes distintivos. Las colonias de Enterobacter son
similares pero un poco más mucoides. Salmonella y Shigella producen colonias
similares a E. coli pero no fermentan lactosa. Algunas cepas de E. coli producen
hemólisis en agar sangre. Las colonias de E. coli en agar E.M.B. (eosina y azul de
metileno) tienen 2 a 4 mm de diámetro, un centro grande de color oscuro e incluso
negro, y tienen brillo verde metálico cuando se observan con luz reflejada. En agar
MacConkey las colonias son rojas con halo turbio [ CITATION Jaw10 \l 2058 ]
12
BIOTECNOLOGÍA
2.2.4. Tratamiento contra las infecciones de E.coli O157:H7
El tratamiento principal contra la infección por ECEH es sintomático. Aunque la E.

coli es sensible a los antibióticos más comúnmente usados, no se ha demostrado
que éstos alivien los síntomas, reduzcan la portación del microorganismo o
prevengan el síndrome urémico hemolítico. Se sospecha que las fluoroquinolonas
aumentan la liberación de enterotoxinas y el riesgo de síndrome urémico-hemolítico.
Dentro de los antibióticos más utilizados para el combate de infección de de E. coli
están los betalactámicos, quinolas, cloramfenicol, trimetropim® sulfametoxazol ®,
En la tabla 1, se describe los mecanismos de acción y de resistencia.
Tabla 1 : Principales mecanismos de acción y resistencia antibiótica estudiados en E. coli
Familia de Mecanismo de acción Mecanismo de resistencia

antibióticos
Betalactámicos Interfiere en las últimas fases de la Betalactamasas: enzimas que se

síntesis del peptidoglicano, componente caracterizan por hidrolizar el enlace
necesario en la formación de la pared amida del núcleo betalactámico,
bacteriana inactivando de esta manera el
antibiótico
Quinolonas Inhibe la acción de las topoisomerasas y Sistema de expulsión
de la ADN girasa bacterianas Presencia de genes plasmídicos de
resistencia antibiótica
Cloramfenicol Inhibidor de la biosíntesis de las proteínas, Inactivación enzimática por
previene la enlogación de la cadena de acetilaión
péptidos al unirse en centro de la Exportadores específicos de
peptidiltranderasa del ribosoma 70S cloranfenicol
Trimetropim® Inhibe la síntesis de la enzima Presencia de genes que codifican
sulfametoxazol dihidropteroato sintasa (sulfametoxazol) y formas mutantes del enzima blanco
® de la enzima dihidrofolato reductasa
(trimetoprim), las cuales son enzimas
necesarias en la ruta del ácido fólico
13
BIOTECNOLOGÍA
2.2.5. Características de Aztreonam
Aztreonam (ATM) pertenece a la clase de los antibióticos betalactámicos conocidos

como monobactams. Su espectro de actividad se limita a las bacterias Gram
negativas aeróbicas, al igual que los aminoglucósidos. Sin embargo, en los últimos
años, debido al aumento creciente de infecciones por microorganismos productores
de carbapenemasas de tipo metalo-β-lactamasas, aztreonam, al ser el único β-
lactámico activo frente a estas enzimas, ha despertado un especial interés como una
de las pocas opciones terapéuticas frente a estos microorganismos. En este mismo
sentido, se encuentran en desarrollo combinaciones de ATM en asociación con
inhibidores de β-lactamasa), con el fin de lograr esquemas útiles en escenarios de
multirresistencia. (Gómez et al, 2015)
2.2.6. Mecanismos de acción de Aztreonam
ATM penetra con facilidad la membrana externa de bacterias Gram negativas, y se

une con gran afinidad a las PBP3, una transpeptidasa que interviene en el
entrecruzamiento de la pared celular. De esta manera se inhibe la síntesis de la
pared, provocando su filamentación, lisis y muerte (actividad bactericida). ATM es
hidrolizado por las β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) de clase A, por lo
que resulta resistente in vitro; lo mismo sucede en el caso de las AmpC cuando se
producen en grandes cantidades. Las carbapenemasas de clase A (ej: KPC) y D (ej:
OXA 48 like) también hidrolizan ATM; pero por el contrario, ATM no es sustrato de
las metalo-β-lactamasas clase B (como las NDM, VIM o IMP) ([CITATION Bus10 \l
2058 ].
14
BIOTECNOLOGÍA
2.3. Staphylococcus aureus
2.3.1. Hábitat
Este microorganismo es la especie más común del género Staphylococcus, por lo

general es patógeno para los seres humanos y otros mamíferos por lo que todos los
mamíferos son portadores y se localiza por lo general en la piel, fosas nasales y
zonas húmedas como los pliegues inguinales y axilas. El género Staphylococcus
contiene 32 especies, de las cuales 16 de ellas se localizan en los humanos,
algunas forman parte de la microbiota de piel y mucosas en humanos, y otras se
encuentran sólo entre la flora de otros mamíferos y aves (Espinoza-Rivera et al,
2018)
2.3.2. Morfología de la Staphylococcus aureus
Los estafilococos son células esféricas Gram positivas facultativas dispuestas en

racimos irregulares, agrupados como células únicas, en pares, tétradas, cadenas
cortas o formando racimos de uvas, aproximadamente con un diámetro de 0.5 µm a
1 µm (Shimoda et al, 1995)
2.3.3. Cultivo
En los medios de cultivo de la mayoría de las especies de Staphylococcus qué

después de incubarse durante 18 a 24 horas, forman colonias de 0.5 a 1.5 mm de
diámetro. Por lo que las colonias se observan lisas, elevadas, brillantes y de bordes
enteros, por lo general presentan consistencia cremosa y pigmentación que va
desde del amarillo a dorado debido a la producción de carotenoides, la mayoría de
las cepas producen β-hemólisis o hemólisis total alrededor de las colonias cuando se
cultivan en agar sangre. S. aureus se diferencia de las demás especies por producir
coagulasa que se manifiesta por su capacidad para coagular el plasma, es resistente
al calor, desecación y puede crecer en medios con grandes cantidades de NaCl
(7.5%) (Balci et al, 2009)
15
BIOTECNOLOGÍA
El medio recomendable y usado por la mayoría de los laboratorios es el agar sal

manitol o medio de Chapman, por su elevado contenido de sal que inhibe el
crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram negativas. Este medio permite
realizar la identificación presuntiva de S. aureus por la pigmentación amarilla
característica de S. aureus. Debido a que esta bacteria fermenta el manitol, se
genera un cambio de color en el medio que vira de rojo pálido a amarillo. Los
Staphylococcus coagulasa negativos no fermentan el manitol y crecen en el medio
formando colonias pequeñas de color que varía de blanco a rosado[ CITATION
JHa10 \l 2058 ].
Otros medios utilizados para el aislamiento de S. aureus son el agar sangre

suplementado con colistina y el ácido nalidíxico y agar feniletanol que también inhibe
el crecimiento de las bacterias Gram negativas. La identificación de S. aureus se
realiza con el empleo de la tinción de Gram, pruebas bioquímicas como: prueba de
la catalasa, fermentación de glucosa, que permite diferenciar al género
Staphylococcus del género Micrococcus, que también se considera una catalasa
positiva pero no fermenta la glucosa. Sin duda, la prueba de la coagulasa sigue
siendo la más utilizada. Se basa en la capacidad de S. aureus para producir la
enzima extracelular que coagula el plasma. La detección de la coagulasa permite
diferenciar S. aureus coagulasa positivo de las demás especies de estafilococos
coagulasa negativos
2.3.4. Tratamiento para S. aureus
El tratamiento que es utilizado para las infecciones de S. aureus son los antibióticos
betalactámicos de los cuales sobresalen: oxacilina, cloxacilina y dicloxacilina
(Linares et al, 2013).
16
BIOTECNOLOGÍA
2.3.4.1. Oxacilina Indicaciones
La oxacilina es un betalactámico (subgrupo isoxazolil penicilina), fármaco de

elección para casi todas las enfermedades estafilocócicas. Es un medicamento
antibiótico bactericida de amplio espectro, principalmente con acción contra
gérmenes Gram positivos, incluyendo cepas de estafilococo productoras de
penicilinasas; es activo contra la mayoría de las cepas de S. aureus, S. epidermidis,
S. pyogenes, S. pneumoniae y Estreptococo Viridans. Está indicada en el
tratamiento de infecciones respiratorias, genitourinarias, óseas, articulares, piel y
tejidos blandos, ocasionadas por gérmenes susceptibles (Mimica, 2007).
2.3.4.2. Mecanismo de acción de Oxacilina
Inhibe la síntesis de peptidoglicano de la pared celular bacteriana; evitando así el

entrecruzamiento de las cadenas de peptidoglicano indispensable para la rigidez y
estabilidad. Tiene acción bactericida, determinada por la capacidad de llegar a
unirse a proteínas ligadoras de penicilina (PBPs), que son enzimas que se
encuentran en la membrana interna de la pared bacteriana y participan en la síntesis
de la pared celular (Calvo 2018).
2.4. Métodos de identificación Bacteriana
2.4.1. Métodos fenotípicos de identificación
La identificación fenotípica bacteriana se basa fundamentalmente en la comparación

de las
características fenotípicas de bacterias desconocidas con aquellas de cultivos tipo.
La fiabilidad de la identificación está en proporción directa al número de
características similares. En Microbiología Clínica, la experiencia y asociación entre
el microorganismo y el sitio y tipo de infección es de gran ayuda en la identificación
preliminar. En el proceso de identificación bacteriana tradicional se establecen tres
niveles de procesamiento: a) Todas las características fenotípicas conocidas son
importantes y hay que tenerlas en cuenta cuando se inicia el proceso de
17
BIOTECNOLOGÍA
identificación, pero en principio se seleccionan aquellas que se consideran pruebas

primarias, que son rápidas y sencillas de realizar, como la morfología en la tinción de
Gram u otras tinciones, crecimiento en diferentes atmosferas de incubación,
crecimiento en varios tipos de medios de cultivo, oxidasa y catalasa (Camacho-
Molina et al, 2004)
A continuación, se pueden seleccionar otros métodos con mayor poder de

discriminación, ya que muchos microorganismos pueden presentar un aspecto muy
similar en el examen macro y microscópico. El segundo nivel de identificación debe
especificar el género al que pertenece el microorganismo. Tanto en este nivel como
en el anterior, la hipóstasis sobre la probable identidad de un microorganismo se
apoya en las características del cultivo (por ejemplo, atmosfera) y en pruebas
primarias, con las cuales se puede determinar el género, grupo de géneros o en
algún caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las pruebas primarias son:
Gram, morfología, catalasa, oxidasa, oxidación-fermentación, fermentación de
glucosa, producción de esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y
movilidad. También deben tenerse en cuenta los datos clínicos. Esto depender·, en
gran medida, de un patrón estable de características fenotípicas y en la experiencia
del microbiólogo. Por último, la conclusión debe hacerse con la identificación a nivel
de especie. El empleo de ciertas pruebas bioquímicas permite identificar con un alto
grado de precisión la mayoría de las bacterias clínicamente significativas. (Lezameta
et al, 2010).
2.4.2. Métodos moleculares de identificación
Las técnicas de identificación molecular en bacterias mediante el análisis del ARNr

16S u otros genes se basa en la amplificación genómica y en la secuenciación de
esos genes o sus fragmentos. El medio de cultivo o las condiciones de incubación no
serán factores determinantes, pero si serán factores críticos la técnica de extracción
del ADN cromosómico y la amplificación. Para confirmar una amplificación óptima,
es imprescindible la electroforesis del producto de PCR en gel de agarosa. Debe
observarse una sola banda (perteneciente a un único amplicón) con el tamaño
18
BIOTECNOLOGÍA
adecuado. En el caso de amplificarse un amplicón con el tamaño deseado y otro con

diferente tamaño, pueden utilizarse diferentes opciones: extracción del amplicón
deseado del gel de agarosa, modificación de las condiciones de PCR o utilización de
nuevos cebadores.
2.4.3. Métodos proteómicos de identificación
La proteómica es el estudio y caracterización del conjunto de proteínas expresadas

por un genoma (proteoma). Las técnicas de proteómica abordan el estudio de este
conjunto de proteínas y las más usadas se basan en la electroforesis y en la
espectrometría de masas. Dependiendo del objetivo del estudio se pueden agrupar
las técnicas de proteómica en los siguientes grupos: Técnicas empleadas para
analizar globalmente el proteoma y separar sus proteínas. Entre ellas destacan la
electroforesis bidimensional, DIGE (electroforesis diferencial en gel), ICAT (marcaje
isotópico diferencial) y MudPIT (tecnología de identificación de proteínas
multidimensional). Técnicas usadas para analizar individualmente
las proteínas. Con este objetivo se utilizan distintos tipos de espectrometría de
masas. Con
ellas se obtiene la huella peptídica que es el conjunto de fragmentos peptídicos que
se obtienen tras tratar una proteína concreta con una proteasa determinada. Las
proteasas son
enzimas que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas. Dependiendo del
enzima que se utilice para fragmentar la proteína se obtienen diferentes huellas
peptídicas (Perea, 2005).
Estas son características de cada proteína. Actualmente hay numerosas bases de

datos que recogen las huellas peptídicas de multitud de proteínas conocidas. Estas
bases de datos se pueden rastrear usando programas bioinformáticos para buscar la
huella peptídica que corresponda con la de aquella proteína que se esté estudiando
y por tanto poder identificarla. Técnicas que se usan para estudiar interacciones
entre proteínas, como los sistema . yeast two hybrids. de alto rendimiento o la
19
BIOTECNOLOGÍA
técnica. Phage Display.. Esta última permite averiguar con qué proteínas
interacciona una proteína problema o sonda. Esta técnica consiste en la expresión
en la superficie de un fago de las proteínas que se quieren analizar (Bellido et al,
2012).
2.5. Métodos de estudio de la sensibilidad antibiótica
La resistencia antimicrobiana es un fenómeno en constante aumento en el ámbito

nacional e internacional. Sin embargo, el desarrollo de nuevos antimicrobianos está
en franco descenso, sin que existan expectativas de desarrollo de nuevas moléculas
en un futuro cercano. A tal grado está llegando este problema que recientemente el
congreso de E.U.A. aprobó la inversión de cuantiosas sumas de dinero para permitir
el desarrollo de nuevas moléculas de antibacterianos y revertir esta lamentable
asociación entre resistencia y ausencia de nuevos fármacos[ CITATION Way04 \l
2058 ].
2.5.1. Métodos para la difusión disco
Este es un método cualitativo, que se caracteriza fácilmente puesto que es

estandarizable por lo que de una muestra clínica siempre se debe realizar un cultivo
puro para poder comenzar el estudio de la sensibilidad antibiótica. Para esto se
utiliza la técnica de aislamiento en placas que contengan un medio adecuado para la
cepa en estudio (al cual además se le deben otorgar las condiciones atmosféricas
específicas de esa cepa). El antibiograma por disco difusión basado en el trabajo de
Bauer, Kirby y colaboradores, es uno de los métodos que el Clinical and Laboratory
Standars Institute (CLSI) comienda para la determinación de la sensibilidad
bacteriana a los antibióticos. [ CITATION Ern02 \l 2058 ]
Para las indicaciones del antibiograma está establecido en las siguientes

situaciones:
20
BIOTECNOLOGÍA
Se aísla una bacteria responsable de un proceso infeccioso y no puede predecirse

su sensibilidad, especialmente si se sabe que este tipo de bacteria puede presentar
resistencia a los antimicrobianos más habituales. En estudios epidemiológicos,
aunque hasta el momento no se halla descrito mecanismos de resistencia para dicho
organismo. Cuando a pesar de conocerse la sensibilidad del germen a drogas
altamente efectivas, el paciente no puede recibir dicha medicación. En el estudio de
nuevos antibióticos
2.5.2. Fundamento
El método de disco difusión consiste en depositar en la superficie de una placa de

agar MH previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel de filtro
impregnados con los diferentes antibióticos. Tan pronto el disco impregnado en
antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe
agua y el antibiótico difunde por el agar, formándose un gradiente de concentración.
Una vez transcurridas 18 a 24 horas de incubación, los discos pueden o no aparecer
rodeados por una zona de inhibición de crecimiento bacteriano (Hernández, 2013).
2.5.3. Categorías interpretativas para el antibiograma
Para la interpretación de resultados del diámetro de los halos de inhibición el CLSI

ha establecido que lo valores críticos del antibiograma se deben de expresar en
categorías que permitan determinar si la cepa bacteriana de importancia clínica es
sensible o resistente a determinados medicamentos de las cuales se tienen 3
categorías: Sensible: Describe que la infección producida por el microorganismo
puede responder al tratamiento con la dosis de antibiótico, por lo que hay inhibición
frente al microorganismo patógeno. Intermedio: Describe que la infección producida
por el microorganismo tiene una velocidad de repuesta lenta al tratamiento con la
dosis administrada, es decir¸ hay eficacia clínica solamente en lugares donde el
antibiótico se encuentra fisiológicamente concentrado. Por tanto, la infección solo
responde con tratamiento a dosis altas del antibiótico de prueba. Resistente: La cepa
21
BIOTECNOLOGÍA
bacteriana es resistente, no hay respuesta terapéutica a la dosis de tratamiento del

antibiótico empleado, por no existir inhibición. [ CITATION Sta10 \l 2058 ]
3. Hipótesis
El extracto de la raíz de sangre de grado (Jatropha dioica) tiene efecto
antibacteriano frente aislados de Staphylococcus aureus y cepasEscherichia coli
O157:H7
4. Objetivo
4.1. General
Evaluar la actividad antibacteriana del extracto de la raíz de sangre de grado

(Jatropha dioca) en la presencia de una cepa de E. coli O157:H7 y asilados de S.
aureus.
4.2. Particulares
1. Aislar, caracterizar e identificar microorganismos de aislados de

Staphyloccocus aureus y una cepa de Escherichia coli O157:H7.
2. Comparar la acción antibacteriana de antibióticos comerciales (Ofloxacin
Piperacillin/ tazobactam, Aztreonam, Ampicillin.) con el efecto antibacteriano contra
los extractos fluidos de la raíz de sangre de grado (Jatropha dioica)
22
BIOTECNOLOGÍA
3. Evaluar el efecto antibacteriano de los extractos fluidos de la raíz de sangre de

grado (Jatropha dioica) en aislados de S. aureus y una cepa E. coli.
5. Metodología
5.1. Materiales
5.1.1. Material Biológico
Aislado de S. auresu
Cepa de E. coli O 157:H7
5.1.2. Equipo de laboratorio.
 Balanza
 Matraz Erlenmeyer de 500 ml, 250 ml,
 Cajas Petri
 Tubos de ensaye de 10 ml
 Microscopio
 Incubadora
 Parrilla
23
BIOTECNOLOGÍA
 Autoclave
 Asa bacteriológica
 Portaobjetos
 Pinzas de disección
 Rotavapor
 Soxhlet
5.1.3. Reactivos
 Caldo nutritivo y Agar bacteriológico

 Agar tripticasa soya
 Agar sal y manitol
 Agar eosina azul de metileno EMB
 Agua destilada
 Kit de tinción de Gram
 Peróxido de Hidrogeno el 30%
 Plasma sanguíneo
 Medio movilidad indol ornitina MIO
 Reactivo de Kovacs (revelador de prueba indol)
 Medio de sulfuro indol para movilidad SIM
 Medio Lisina Hierro Agar LIA
 Medio Urea
 Medio de Citrato de Simons
 Ofloxacin OFX de 5 μg
 Piperacillin/ tazobactam TZP de 40 μg
 Aztreonam ATM de 30 μg
 Ampicillin AM
5.2. Diagrama general de la metodología
Evaluación de las propiedades antibacterianas del extracto de la

raíz de sangre de grado (Jatropha dioca) frente a aislados de 24
Staphylococcus. aureus y Echerichia coli O157:H7
Caracterización de S. aureaus
raíz de sangre de grado Hacer comparativo de la sensibilidad
Preparación de medio estándar de antibiogramas y el extracto de raíz
agar soya y nutritivo Título del Proyecto Terminal de sangre de grado (Jatropha dioica)
Maceración deBIOTECNOLOGÍA
la raíz de sangre de
Preparación de medio grado (Jatropa dioca)
selectivo Agar Sal
Manitol y Agar EMB
Preparación de los solventes para el
extracto de la raíz de sangre de
Realizar Pruebas grado
bioquímicas
respectivamente
Preparación de sensidiscos con extracto
de raíz de sangre de grado ( Jatropha
Preparación de dioca)
antibiogramas
respectivamente
5.3. Preparación de los extractos fluidos
Se prepara el extracto por el método de maceración. Se selecciono y se limpió la

materia prima que es la raíz de sangre de grado. Se pesaron 10 g de raíz para
depositarlos en 5 frascos de vidrio en diferentes concentraciones en 100 mL cada
una.
Se utilizaron 3 solventes orgánicos diferentes: alcohol, cloroformo y benceno.
Se preparan 5 concentraciones diferentes, con 10 gr de la raíz cada una, en frascos
de vidrios.
 Alcohol 100 mL
 Agua destilada y Alcohol 50/50 mL
 Cloroformo 100 mL
 Benceno 15/85 mL
 Agua destilada 100 mL
25
BIOTECNOLOGÍA
Se dejará los frascos con las diferentes concentraciones de agua y solventes

orgánicos en maceración por 15 días en un área fresca y en oscuridad para evitar
que los rayos de la luz afecten a la composición de los extractos.
Posteriormente pasados los 15 días de maceración se filtrará los extractos y se
someterán a la técnica de rota vapor para separar los solventes y la purificación de
estos.
5.4. Identificación de aislados de S. aureus y cepa de E. coli O157:H7
5.4.1. Preparación de los medios de cultivo para S. aureus y E. coli O157:H7
5.4.1.1. Medio de cultivo Estándar: Caldo Nutritivo
La preparación del medio de cultivo consistió en el uso de 8 g de caldo nutritivo

disueltos en 515 mL de agua destilada y 7.7 g de agar bacteriológico para solidificar
el medio. Las condiciones de esterilización se siguieron de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, las cuales fueron repartidos en 17 cajas Petri (30 mL
por caja).
5.4.1.2. Medio selectivo EMB (Eosin Methylene Blue) para E. coli O157:H7
Se prepararon 120 mL de medio EMB disolviendo 4.32 g de polvo para repartirlo en

4 cajas Petri (siguiendo indicaciones que aparecen en el frasco) Las condiciones de
esterilización se siguieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5.4.1.3. Medio Estándar Caldo Soya tripticasa para S. aureus
Se prepararon 0.9 g de caldo en polvo, suspendidos en 30 mL de agua destilada (la

cantidad preparada de caldo Soya tripticasa, es correspondiente a 4 tubos de
ensaye conteniendo cada uno con 7mL aproximadamente) Las condiciones de
esterilización se siguieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante
26
BIOTECNOLOGÍA
5.4.1.4. Medio Selectivo: Agar Sal y Manitol para S. aureus.
Se prepararon 13.32 g del medio, suspendidos en 120 mL de agua destilada. (la

cantidad preparada equivale a 4 cajas Petri, conteniendo cada una con 30 mL
aproximadamente). Las condiciones de esterilización se siguieron de acuerdo con
las instrucciones del fabricante
5.4.2. Activación de aislados de referencia de S. aureus y E.coli O157: H7
Se activaron aislados de referencia de S.aureus y E.coli O157:H7 en caldo

Tripticasa soya para para S. aureus y caldo nutritivo para E.coli O157:H7 una vez
que se haya obtenido crecimiento se pasara a la inoculación en medio selectivos de
sal y manitol para S. aureus y EMB (eosina azul de metileno) para E.coli y las
pruebas bioquímicas.
5.4.2.1. Tinción de Gram
Una vez obtenido el crecimiento en las placas, se realizó tinción de Gram para
determinar bacterias Gram Positivas o Gram Negativas que se describe a
continuación: Se preparó el frotis con cristal violeta para dejarlo interactuar durante
un minuto. Escurrir el colorante y lavar suavemente con agua. Se cubrió el frotis con
la solución de lugol durante un minuto y enjuagar a chorro de agua. Se colocó el
portaobjetos verticalmente y decolorar añadiendo gota a gota alcohol-acetona
durante 40-60 segundos. Se cubrió el frotis con safranina y se dejó actuar durante
un minuto. Se escurrió el colorante y se lavó suavemente al chorro de agua y se dejó
secar al aire (López- Jácome, 2014).
27
BIOTECNOLOGÍA
5.4.3.Pruebas Bioquímicas
5.4.3.1. Prueba de la enzima catalasa
Con un asa bacteriológica, se tomó un inóculo del caldo infusión cerebro corazón
después de su incubación, y se colocó sobre un portaobjetos. Se adicionó una o dos
gotas de peróxido de hidrógeno al 30 %, se mezcló perfectamente bien y se
observaron los resultados. Si se presenta formación de burbujas, se considera
positiva la prueba, esto es que sí contiene la enzima catalasa. En caso de no
formarse burbujas la prueba se interpretará como ausencia de esta enzima (Duarte
et al, 2005)
5.4.3.2. Prueba de la presencia de la enzima coagulasa.
Con una pipeta estéril de 1 mL, se tomaron 0.2 mL de la suspensión del

microorganismo que desarrolló en el caldo de infusión. Se adicionó 0.2 mL de
plasma de sangre humana, dicho plasma previamente diluido con solución salina
estéril. Se Incubó en baño María o en incubadora, entre 35° C y 37º C, se observó
durante 6 h en intervalos de 1 h. En caso de no presentarse formación de coágulo,
se prolongó el período de observación hasta por 24 h. Para comprobar la
coagulabilidad del plasma, se tomó 0.5 mL de plasma reconstituido y se depositó en
un tubo de 13 X 100 mm, para posteriormente añadir una gota de cloruro de calcio al
5%; se debe formar un coágulo entre 10 a 15 segundos [ CITATION Mac03 \l 2058 ].
5.4.3.3. Preparación de la prueba de medio movilidad, indol, Ornitina (MIO)
Se Pesó 31 g del medio MIO y se disolvió en un litro de agua destilada. Se calentó

hasta que hirviera la mezcla durante un minuto, agitando frecuentemente hasta
disolver completamente el agar. Se distribuyó 4 mL del medio en tubos de ensayo
13/100 con tapa de algodón. Se esterilizó en autoclave a 121° C durante 15 minutos.
Se retiró de autoclave y se dejó reposar de forma recta en una gradilla, de tal
28
BIOTECNOLOGÍA
manera que se forme un taco semi sólido. Se Almacenó en nevera 2-8° C. Se dejar
atemperar antes de sembrar la cepa bacteriana. El color del medio deshidratado es
beige y el del medio preparado de color púrpura levemente opalescente. El pH final
del medio preparado es 6.5 ± 0.2. El medio se tornó amarillo con pH ácido y es
morado a pH alcalino (Olmos at el, 2010).
5.4.3.4. Reactivo de Kovacs (Revelador de la prueba de indol)
Se midieron 150 mL de alcohol amílico. En él se disolvieron 10 g de p-

dimetilaminobenzaldehído. Posteriormente se agregaron lentamente 50 mL de ácido
clorhídrico concentrado. El reactivo preparado es incoloro o amarillo claro. Debe
guardarse en frasco ámbar y conservarse en refrigeración. Un color castaño oscuro
evidencia su deterioro[ CITATION Mac03 \l 2058 ].
5.4.3.5. Prueba de medio de sulfuro indol para movilidad (SIM)
El medio SIM es un medio semisólido que es utilizado para la diferenciación de

bacterias entéricas través de la producción de sulfuro, la formación de indol y la
motilidad. La prueba de reducción de azufre es útil para diferenciar organismos
entéricos, especialmente Salmonella y Shigella. La prueba de indol se usa para
diferenciar las enterobacterias. La prueba de motilidad es útil para probar una amplia
variedad de organismos. El medio también es útil en la diferenciación de Klebsiella
de especies de Enterobacter y Serratia ( Díaz et al, 1999)
Las peptonas de Caseína y Carne proporcionan nitrógeno, vitaminas, minerales y

aminoácidos esenciales para el crecimiento. La peptona caseína es rica en
triptófano, que se reduce y produce indol. El tiosulfato de sodio proporciona azufre y
el citrato de amonio férrico es el indicador de la producción de H 2S en condiciones
alcalinas. El agar bacteriológico es el agente solidificante en baja concentración para
permitir que se vea la motilidad. Preparación: Suspender 30 gramos del medio en un
litro de agua destilada. Mezclar bien y disolver calentando con agitación frecuente.
29
BIOTECNOLOGÍA
Hervir durante un minuto hasta disolver por completo. Distribuir en recipientes

apropiados y esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos (López-
Hontangas et al, 2006).
5.4.3.5.1. Prueba de Agar Hierro de Kligler
Agar Hierro de Kligler puede emplearse para diferenciar enterobacterias Gram

negativas sobre la base de la fermentación de carbohidratos y la producción de H 2S.
La mezcla de peptona proporciona nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos
esenciales para el crecimiento. El cloruro de sodio suministra electrolitos esenciales
para el transporte y el equilibrio osmótico. La dextrosa y la lactosa son los
carbohidratos fermentables, que producen el ácido indicado por el rojo fenol. Los
cambios de color resultantes son a color amarillo por la producción de ácido y a rojo
por alcalinización. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno, el cual
reacciona con la sal de hierro para dar sulfuro de hierro negro. El sulfuro de sodio y
el citrato de amonio férrico son indicadores de H 2S. El agar bacteriológico es el
agente solidificante. Los microorganismos no fermentadores de lactosa (p. ej.,
Salmonella y Shigella) producen inicialmente una coloración amarilla causada por la
formación de ácido resultante de la fermentación de la dextrosa. Una vez qué el
suministro de dextrosa se agota en el entorno aeróbico de la coloración, la reacción
vuelve a ser alcalina (coloración roja) debido a la oxidación de los ácidos. Esta
reversión no ocurre en el entorno anaeróbico del extremo, el cual permanece ácido
(fondo amarillo). Los fermentadores de lactosa producen fondo de color amarillo
debido a que se produce suficiente ácido en la pendiente para mantener un pH ácido
en condiciones aeróbicas. Los organismos incapaces de fermentar los hidratos de
carbono generan pendiente y fondo de color rojo. Para obtener mejores resultados,
el Agar Hierro Kligger debe usarse el día de la preparación o derretirse y solidificarse
antes de su uso. La siembra se hace por picadura en el agar y se estría en la
superficie inclinada. Se deja incubar de 18 a 24 h a 37° C en condiciones aerobias
[ CITATION Jea03 \l 2058 ].
30
BIOTECNOLOGÍA
5.4.3.6. Prueba de medio Lisina y Hierro (LIA)
El Medio de Lisina y Hierro (L.I.A.) es un medio de cultivo diferencial ampliamente

utilizado para la diferenciación de bacilos Gram negativos entéricos sobre la base de
la producción de H2S y la actividad de la enzima Lisina decarboxilasa. La técnica
implica inocular el medio de cultivo picando el fondo y extendiendo sobre la
superficie de este. Incubar en aerobiosis, a 35-37° C durante 18 a 24 h. La
descarboxilación de la lisina se detecta en la base mediante una reacción alcalina
(color morado). La desaminación de la lisina se detecta por un agar inclinado de
color rojo. La producción de H2S se detecta mediante la formación de precipitado de
color negro. Una reacción negativa (agar inclinado color morado y base amarilla)
indica fermentación de dextrosa exclusivamente (Olmos at el, 2010).
5.4.4. Prueba de Urea
Se Pesó los gramos necesarios según las indicaciones de la casa comercial. Se

disolvió en agua destilada preferiblemente estéril. No usará calor para disolver, pues
la urea es sensible al calor. Se esterilizó por el método de filtración con membranas.
Para ello se usó un filtro Millipore con poros de 0.45 µm de diámetro. Una vez que se
filtró la solución, se distribuyó en tubos estériles. Para obtener resultados confiables
se trasvasó entre 1.5 mL como cantidad mínima a 3 mL como cantidad máxima por
tubo. Preparación de la solución de urea: Se pesó 29 g de urea deshidratada y se
disolvio en 100 mL de agua destilada. Se utilizó el método de filtración para
esterilizar.
Agar base de urea: Se disolvió 24 g del agar base deshidratado en 950 mL de agua
destilada. Se Esterilizó en la autoclave a 121°C por 15 min. Se dejó reposar hasta
que alcance una temperatura de 50 °C y se agregó la urea anteriormente preparada
de forma aséptica. Se vertieron de 4 a 5 mL en tubos estériles e inclinar hasta que
solidifiquen. Quedó un pico de flauta largo (López-Hontangas et al, 2006).
31
BIOTECNOLOGÍA
5.3. Preparación de antibiogramas
Para la identificación de la actividad antibacteriana se adecuó la técnica de

antibiograma la cual consiste en el uso de sencidiscos que son impregnados por
antibióticos específicos. Inmersos en medio de cultivo sólido. En la prueba de
antibiograma se utilizó medio de cultivo cuenta estándar. Para la preparación del
medio de cultivo de agar cuenta estándar es necesario suspender 23.5 g del medio
en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa
disolución y hervir durante un minuto. Se esterilizó en autoclave a 121 °C y 15 psi
durante 15 minutos. Se dejó enfriar a una temperatura entre 45-50° C y vaciar en
placas de Petri estériles.
Se utilizaron los siguientes medicamentos:
1. Ofloxacin OFX de 5 µg
2. Piperacillin/ tazobactam TZP de 40 µg
3. Aztreonam ATM de 30 µg
4. Ampicillin AM de 25 µg
6. Resultados
6.1. Efecto antibacteriano del extracto de raíz de sangre de grado (Jatropha dioica)
Se espera que la identificación y la caracterización macroscópica, así como la tinción

de Gram y pruebas bioquímicas resulten positivas para aislados de S. aureus y una
cepa de E. coli O157:H7
Se espere observar que antibióticos betalactámicos tengan efecto favorable con

halos de inhibición que estén entre los 1.0 cm a 2.0 cm.
32
BIOTECNOLOGÍA
Se espera que los resultados sean favorables para S. aureus y E.coli O157:H7 por lo
que el tamaño de halo de inhibición deberá de indicarnos si el microorganismo en
estudio es sensible, intermedio y/o resistente, por lo que se comparará con los
sencidiscos que se realizaron en la prueba de resistencia bacteriana.
7. Resultados Obtenidos
7.1. La identificación de aislados de S. aureus y una cepa de E. coli

O157:H7 fue positiva para la morfología macroscópica y pruebas
bioquímicas.
En la tabla 2 se describe la morfología macroscópica de la placa en el medio de Agar

Bacteriológico para E. coli O 157:H7 de Tipticasa Soya para el aislado de S aureus.
Tabla 2 caracteristicas macroscópicas de E. coli O 157:H7 y S. aureus
Crecimiento en placa de medio de E. coli.y S. aureus
Muestra
Morfología
(placa)
33
BIOTECNOLOGÍA
Agar Bacteriológico para Son colonias medianas, circulares, convexas, bordes

E. coli O157:H7 redondeados
Pequeñas, blanquecinas, de forma circular, bordes redondeados,

superficie lisa y convexa. Algunas cepas producen un pigmento
Agar Tripticasa Soya
carotenoide que les da un color dorado (S. aureus)
Tabla 3 crecimiento en las placas petri para aislado de S. aureus y cepa de E. coli foto de
Hugo Jahaziel Salazar
Tabla 4 . Tabla de características en placa de cepa de E. coli O157:H7.y aislado de S. aureus
Crecimiento en placa y tinción de Gram de E. coli.y S. aureus

Muestra Morfología
(placa)
EMB Colonias de color verde metálico.
34
BIOTECNOLOGÍA
Colonias de color crema-amarillentas

Sal & Manitol
A B
B
Tabla 5 Observación macroscópica de medios de EMB para E. coli (A) y sal &
manitol para S. aureus (B)
En la figura 2 se observa la confirmación de los resultados que se presentan en la tabla

3. En la imagen A medio de cultivo de EMB para E. coli, en el cual se pude observar un
color verde metálico que corresponde a las características macroscópicas de la
morfología de E. coli. Para la figura B se observa el medio Sal y manitol para S. aureus
presentado un color amarillento que corresponde a las características de S. aureus.
Tabla 6 de tinción de Gram de E. coli O157:H7.y S. aureus
35
BIOTECNOLOGÍA
Muestra Tinción de Gram de E. coli.y S. aureus
E. coli O157:H7 Bacilos Gram negativos.
Cocos Gran positivos

S. aureus
A B
Tabla 7 Observación microscópica de tinción de Gram para la cepa de E. coli (A) y

asilado de S. aureus (B)
En la imagen A la observación microscopia de 100x de tinción de Gram confirmando

que E. coli es un bacilo Gram negativo. Para la figura B se presenta la observación
microscópica de 100x de tinción de Gram confirmando que S. aureus es un coco
Tabla 8 Resultados
positivo, obtenidos
confirmando de las pruebasque
las características bioquímicas de la
se presentan encepa de E4..coli O157:H7
la tabla
PRUEBAS BIOQUIIMICAS
BACTERIA
Citrato de
MIO TSI LIA Catalasa Urea
Simons
36
BIOTECNOLOGÍA
PRODUCCIÓN DE
FERMENTACIÓN
MOVILIDAD
ORNITINA
INDOL
GAS
Escherichia coli
+ + - + + + + - -
En la tabla 5 se desglosan las pruebas bioquímicas realizadas para los aislados de

E. coli O157:H7. La cual muestra que dio positivo para LIA, TSI, Catalasa y MIO, sin
embargo, mostro negativo para citrato de Simons y Urea.
Tabla 9 Resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas de aislados de S, aureus.

PRUEBAS BIOQUIIMICAS
Citrato de
MIO TSI LIA Catalasa Urea
Simons
BACTERIA
PRODUCCIÓN DE
FERMENTACIÓN
MOVILIDAD
ORNITINA
INDOL
GAS
Staphylococus
+ + - + + + - - -
aureus
En la tabla 5 se desglosan las pruebas bioquímicas realizadas para los aislados de

S. aureus. La cual muestra que dio positivo para LIA, TSI y MIO, sin embargo,
mostro negativo para la enzima catalasa, citrato de Simons y Urea.
37
BIOTECNOLOGÍA
7.2. Identificación de la actividad antibacteriana de los antibióticos

comerciales utilizando la técnica de antibiograma frente a los aislados de
E. coli O157:H7 y S. aureus.
Los resultados del experimento conducido. En todos los casos, los puntos
representan los diámetros de los halos de inhibición que se obtuvieron en el
experimento para cada extracto vegetal considerado. En todos los ensayos se tomó
como patrón de referencia el control positivo para determinar cuál era el que tenía
mayor actividad antimicrobiana.
Tabla 10 En esta tabla se presenta los resultados de los diámetros en cm de los halos de
inhibición de los medicamentos en las cepas.
Diámetros (cm) de los halos de inhibición generados por actividad antimicrobiana de los
antibióticos
BACTERIA OFX TZP ATM AM
EXPERIMENTAL Escherichia coli 1.9 2.6 2.8 1.5
Staphylococcus aureus 1.8 2.8 2.9 1.4
REFERENCIA Escherichia coli 1.9 2.7 2.8 1.3
Staphylococcus aureus 1.7 2,7 2.9 1.5
Como se puede apreciar en la tabla 5 el antibiótico con mayor diametro de halo es el

ATM lo cual demuestra tener una mayor inhibición bacteriana para ambos
microorganismos, en comparación con el AM que es el antibiótico que mostro menor
halo de inhibición de crecimiento bacteriano.
38
BIOTECNOLOGÍA
Tabla 11. En las imágenes se presentan los resultados mostrados en la tabla 5. Para el inciso A
cepas de referencia de E. coli O 157:H7 y asilado de S. aureus.
Tabla 12 En las imágenes se presentan los resultados mostrados en la tabla 5. Para el inciso
B cepas experimentales de E. coli O 157:H7 y asilado de S. aureus.
En la figura 4 y se presentan los halos de inhibición de los antibióticos en aislados

de E. coli y S. aureus y se observó que el crecimiento fue diferente en cada caja de
los aislados en halo del antibiótico ATM fue mínimo el crecimiento y el antibiótico
AMP fue un crecimiento puntiagudo en el radio de los halos como se muestra en
tabla 5.
7.3. Los extractos fluidos de la raíz de sangre de grado (Jatropha dioica)

mostraron actividad antimicrobiana en aislados de S. aureus y E. coli O157:
H7
39
BIOTECNOLOGÍA
Al evaluar el efecto antibacteriano de los extractos fluidos de la raíz de sangre de

grado (Jatropha dioica) en aislados de S. aureus y E. coli.O157:H7 se pudo notar
que el único que se obtuvo resultados favorables fue el extracto obtenido con el
solvente alcohólico el cual mostraron resistencia bacteriana como se muestra en la
figura 5
Tabla 13 diámetros de los halos de inhibición de los extractos
DIÀMETROS DE LOS HALOS DE INHIBICION EN EXTRACTOS.

Agua/
TIPOS Bacteria Etanol Agua Benceno Cloroformo
etanol
Escherichia
coli 1.1 S/C S/C S/C S/C
Experimental
Staphylococcu
s aureus 1.3 S/C S/C S/C S/C
Escherichia
1.2 S/C S/C S/C S/C
coli
Referencia Staphylococcu
s aureus 1.4 S/C S/C S/C S/C
40
BIOTECNOLOGÍA
B
A
. Antibiograma con el extracto fluido alcohólico para: A (S.aureus) y B (E.coli)
Al comparar el extracto fluido de la raíz de sangre de grado (Jatropha dioica) con el

efecto antimicrobiano del antibiótico ATM, se pudo notar que el halo de inhibición del
antibiótico fue de mayor diámetro con respecto al halo de inhibición de extracto fluido
de la raíz sangre de grado (Jatropha dioica), lo que nos indica que el antibiótico tiene
mayor efecto de inhibición bacteriana como se muestra en las tablas anteriores.
8. Discusión
Aguilera et al (2012) mencionaba que cuantificaron uno de los taninos presentes en
Jatropha dioica, específicamente el ácido elágico, reportando una concentración de
0.81 mg/L de planta por lo que puede ser considerada como una importante fuente
alternativa de dicho compuesto debido a sus propiedades relacionadas a la salud,
como acciones antiesteroescleróticas, propiedades anticarcinogénicas resultando en
41
BIOTECNOLOGÍA
una reducción de cáncer de colon humano, próstata, cervical, lengua, esófago y piel
y con propiedades en la industria alimentaria como agente antioxidante. A pesar de
que esta planta contiene ácido elágico, se podría suponer que éste no es uno de sus
compuestos principales debido a las bajas concentraciones en las que se encuentra.
Por lo que es de interés nuestra investigación sobre Jatropha dioica centra en probar
esta cualidad que posee como agente antibacteriano.
Oliveira Simone et al (2018) comenta que la solución alcohólica de raíz y hojas de

sangre de grado (Jatropha dioica) se preparó en agua y 70% de solución de etanol a
una concentración de 450 μg / mL. La J. dioica el polvo se pesó previamente y se
disolvió en el disolvente propuesto (etanol o agua) a una concentración de 450 μg /
mL. Las soluciones se diluyeron en el medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)
y las concentraciones finales de fármaco oscilaron entre 14.06 y 450 μg / mL. Se
hicieron dos réplicas para cada concentración de los compuestos probados, o más
bien, aquellos disueltos en agua. y los disueltos en etanol al 70%, contra las cepas
de Candida albicans mostrando inhibición bacteriana significativa. Gracias a este
estudio pudimos verificar que el método utilizado para la extracción propuesto por
Oliveira fue el mas adecuado a seguir sin embargo en nuestros resultados
encontramos que una concentración mayor a los 450 μg / mL del principio activo los
mecanismos de inhibición bacteriana encontrados nuestro trabajo funciono para una
cepa de E. coli O157:H7 y aislados de S. aureus, lo que confirma la naturaleza
inhibidora de nuestro extracto en cuestión
42
BIOTECNOLOGÍA
9. Conclusiones
La sensibilidad de antibióticos permitió ver que es método de difusión de agar
Nuestros extractos alcohólicos de la raíz de sangre de grado Jatropha dioica mostraron
actividad antimicrobiana, sin embargo, se plantea que se realice una continuación de
este proyecto para poder probar que los principios activos de la raíz de sangre de
grado Jatropha dioica tambien los podemos cuantificar en las hojas y los tallos
43
BIOTECNOLOGÍA
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47

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Evaluación de las propiedades antibacterianas del extracto de la raíz

de sangre de grado (Jatropha dioica) frente a aislados de

PROYECTO TERMINAL QUE PARA OBTENER EL TÍTULO

Hugo Jahaziel Salazar Villalobos

Asesor Externo: Dra. Tania Breshkovskaya Ortiz Escobar

Existen diferentes microorganismos patógenos, dentro de los cuales se encuentra

Por lo que el objetivo principal de este trabajo es presentar un panorama específico

Agradezco a el secretario académico Ing. Miguel Ángel Serrano García ya que

Quiero agradecer profundamente a la Dra. Tania Breshkovskaya Ortiz Escobar y

Agradezco a M.C Jaqueline Yadira Andrade Ortiz como la encargada del

Agradezco a la Dra. Diana Elinos Calderón por todo el apoyo brindado

A mis amados suegros Bruno y Patricia a ustedes porque siempre me instaron a

2.1.2. Características químicas de la sangre de grado (Jatropha dioica)...................................10

2.2. Características importantes de Escherichia coli..........................................................10

2.2.3. Cultivo para la E. coli.......................................................................................................11

2.2.4. Tratamiento contra las infecciones de E.coli O157:H7.....................................................11

2.2.5. Características de Aztreonam..........................................................................................13

2.2.6. Mecanismos de acción de Aztreonam..............................................................................13

2.3. Staphylococcus aureus...............................................................................................13

2.3.2. Morfología de la Staphylococcus aureus..........................................................................14

2.3.4. Tratamiento para S. aureus.............................................................................................15

2.4. Métodos de identificación Bacteriana..........................................................................16

2.4.2. Métodos moleculares de identificación.............................................................................17

2.4.3. Métodos proteómicos de identificación............................................................................17

2.5. Métodos de estudio de la sensibilidad antibiótica........................................................18

2.5.3. Categorías interpretativas para el antibiograma...............................................................20

5.1.2. Equipo de laboratorio.......................................................................................................22

5.2. Diagrama general de la metodología...........................................................................23

5.4.2. Activación de aislados de referencia de S. aureus y E.coli O157: H7..............................25

5.4.2.1. Tinción de Gram..............................................................................................................26

5.4.3. Pruebas Bioquímicas...............................................................................................26

5.4.3.2. Prueba de la presencia de la enzima coagulasa..............................................................26

5.4.3.3. Preparación de la prueba de medio movilidad, indol, Ornitina (MIO)...............................27

5.4.3.4. Reactivo de Kovacs (Revelador de la prueba de indol)....................................................27

5.4.3.5. Prueba de medio de sulfuro indol para movilidad (SIM)...................................................27

5.4.3.5.1. Prueba de Agar Hierro de Kligler..............................................................................28

5.4.3.6. Prueba de medio Lisina y Hierro (LIA).............................................................................29

5.4.4. Prueba de Urea................................................................................................................ 29

5.3. Preparación de antibiogramas.........................................................................................30

Figura 1: Principales mecanismos de acción y resistencia antibiótica estudiados en E.

Uno de los principales problemas que se ha enfrentado la comunidad médica en el

De ahí que la mayoría de las personas portadoras de infecciones por

México, Perú y Ecuador. Se utiliza principalmente como objeto medicinal ya que

Jatropha dioica pertenece a la familia de las Euphorbiaceae que es una de las

Se conoce comúnmente como sangre de grado o sangre de drago, ambas

El látex de la raíz sangre de grado (Jatropha dioica) es una sustancia líquida

2.1.2. Características químicas de la sangre de grado (Jatropha dioica)

Algunos de los alcaloides encontrados que poseen características como el sabor

Carrión et al., (2010) menciona que, la acción antibacteriana de los polifenoles

2.2. Características importantes de Escherichia coli

Este microorganismo coloniza el intestino de un ser humano a pocas horas de haber

virulencia, como exotoxinas. Los factores de virulencia específicos pueden verse

E. coli es un bacilo Gram positivo corto, anaerobio facultativo de la familia

2.2.3. Cultivo para la E. coli

2.2.4. Tratamiento contra las infecciones de E.coli O157:H7

El tratamiento principal contra la infección por ECEH es sintomático. Aunque la E.

Tabla 1 : Principales mecanismos de acción y resistencia antibiótica estudiados en E. coli

Familia de Mecanismo de acción Mecanismo de resistencia

Betalactámicos Interfiere en las últimas fases de la Betalactamasas: enzimas que se

2.2.5. Características de Aztreonam

Aztreonam (ATM) pertenece a la clase de los antibióticos betalactámicos conocidos

2.2.6. Mecanismos de acción de Aztreonam

ATM penetra con facilidad la membrana externa de bacterias Gram negativas, y se