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Epidemiologa molecular y bases

genticas de la resistencia y
virulencia de Staphylococcus aureus
de diferente origen

Tesis Doctoral
Universidad de Oviedo

Mara de los ngeles Argudn Regueiro


Junio, 2011

Epidemiologa molecular y bases


genticas de la resistencia y
virulencia de Staphylococcus aureus
de diferente origen

Mara de los ngeles Argudn Regueiro


Tesis Doctoral
Universidad de Oviedo
Departamento Biologa Funcional
Junio, 2011

Vicerrectorado de Ordenacin Acadmica y Nuevas Titulaciones

AUTORIZACIN PARA LA PRESENTACIN DE LA TESIS DOCTORAL


Curso: 2010/2011
Datos personales:
Apellidos:
ARGUDIN REGUEIRO

Nombre:

MARIA DE LOS
ANGELES

FOR-OFE-VCE-021

D.N.I. 71887079G

Datos Acadmicos:
Programa de Doctorado cursado: Biologa Funcional y Molecular
Departamento responsable: BIOLOGIA FUNCIONAL
Departamento en el que presenta la tesis doctoral: BIOLOGIA FUNCIONAL
Ttulo definitivo de la Tesis: Epidemiologa molecular y bases genticas de la resistencia y virulencia
de Staphylococcus aureus de diferente origen
Autorizacin del director/es de la tesis
RODICIO RODICIO, MARIA DEL ROSARIO
D/D:
Departamento: BIOLOGIA FUNCIONAL
MARTIN MARTIN, MARIA CRUZ
D/D:
csic
Universidad:

Autoriza la presentacin de la tesis doctoral en cumplimiento de lo establecido en el Art. 35.1a de


la Modificacin del Reglamento del tercer ciclo de estudios universitarios, la obtencin y
expedicin del ttulo de doctor y otros cursos de postgrado, aprobada por el Consejo de
Gobierno, en su sesin del da 23 de octubre de 2008 (BOPA del 19 de diciembre de 2008).

Oviedo, 31 de mayo de 2011


Director de la Tesis

Fdo: RODICIO RODICIO, MARIA DEL


ROSARIO

Director de la Tesis

Fdo: MARTIN MARTIN, MARIA CRUZ

SR. DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA FUNCIONAL

Vicerrectorado de Ordenacin Acadmica y Nuevas Titulaciones

AUTORIZACIN PARA PRESENTACIN DE TESIS DOCTORAL


Curso: 2010/2011
Nombre: MARIA DE LOS ANGELES

Datos del alumno:


Apellidos: ARGUDIN REGUEIRO
DNI: 71887079G

FOR-OFE-VCE-024

Datos Acadmicos:
Programa de Doctorado cursado: Biologa Funcional y Molecular
Departamento responsable: BIOLOGIA FUNCIONAL
BIOLOGIA FUNCIONAL
Departamento en que presenta la tesis doctoral:
Ttulo definitivo de la Tesis: Epidemiologa molecular y bases genticas de la resistencia y virulencia de
Staphylococcus aureus de diferente origen
Autorizacin del director/es de la tesis
MARIA DEL ROSARIO RODICIO RODICIO
D/D:
Departamento: BIOLOGIA FUNCIONAL
MARIA CRUZ MARTIN MARTIN
D/D:
csic
Universidad:

Resolucin
El Departamento BIOLOGIA FUNCIONAL en su reunin de fecha 8 de Abril de 2011, acord dar su
conformidad para la presentacin de la tesis doctoral a la Comisin de Doctorado, en cumplimiento de lo
establecido 35.2 de la Modificacin del Reglamento del tercer ciclo de estudios universitarios, la obtencin y
expedicin del ttulo de doctor y otros cursos de postgrado, aprobada por el Consejo de Gobierno, en su sesin
del da 23 de octubre de 2008 (BOPA del 19 de diciembre de 2008).

Asimismo el director/directores de la tesis doctoral, cumplen con el requisito establecido en el artculo 2 de


la Modificacin del Reglamento del tercer ciclo de estudios universitarios, la obtencin y expedicin del
ttulo de doctor y otros cursos de postgrado, aprobada por el Consejo de Gobierno, en su sesin del da 23
de octubre de 2008 (BOPA del 19 de diciembre de 2008).

Oviedo, 8 de Abril de 2011

El Director del Departamento

Fdo.: ANTONIO FUEYO SILVA

SR./SRA. PRESIDENTE/A DE LA COMISIN DE DOCTORADO DE LA UNIVERSIDAD DE OVIEDO

Agradecimientos

I have climbed the highest mountains


I have run through the fields
Only to be with you
Only to be with you.
I have run, I have crawled
I have scaled these city walls
These city walls
Only to be with you.
But I still haven't found
What I'm looking for.
But I still haven't found
What I'm looking for.
I have kissed honey lips
Felt the healing in her finger tips
It burned like fire
(I was) burning inside her.
I have spoke with the tongue of angels
I have held the hand of a devil
It was warm in the night
I was cold as a stone.
But I still haven't found
What I'm looking for.
But I still haven't found
What I'm looking for.
I believe in the Kingdom Come
Then all the colours will bleed into one
Bleed into one.
But yes, I'm still running.
You broke the bonds
And you loosed the chains
Carried the cross of my shame
Oh my shame, you know I believe it.
But I still haven't found
What I'm looking for.
But I still haven't found
What I'm looking for.
But I still haven't found
What I'm looking for.
But I still haven't found
What I'm looking for.
I Still Haven't Found What I'm Looking For
1987 The Joshua Tree U2

Deseo expresar mi agradecimiento:


De manera muy especial a las Dras. M del Rosario Rodicio Rodicio y M Cruz
Martn Martn, bajo cuya direccin se ha realizado este trabajo. A Charo por ser mi madre
en la ciencia y una excelente mentora, de la que ha aprendido tanto y seguir aprendiendo.
Y a M Cruz por su asesoramiento cientfico y por la confianza depositada en mi para la
realizacin de este trabajo. Gracias por brindarme la oportunidad de iniciar mi formacin el
campo de la investigacin.
A M Carmen Mendoza que inicio la lnea de investigacin en Staphylococcus aureus,
por su consejo, ayuda, paciencia y sobretodo su cario.
A todos los investigadores que han colaborado en la realizacin de esta Tesis
Doctoral cediendo aislamientos, asesorndome cientficamente y dndome su apoyo
incondicional. Aqu se incluyen los Drs. Francisco Javier Mndez, Fernando Vzquez y la
Dra. M ngeles Gonzlez-Hevia por la colaboracin prestada y su continua ayuda; y la
Dra. Rosaura Rodicio y el Dr. Felipe Lmbo por sus consejos e ideas.
A la Dra. Beatriz Guerra por ser una excelente cientfica, jefa y una gran amiga. Im
also really grateful with all the members from the Staphylococci and Salmonella groups of
the Federal Institute for Risk Assessment in Berlin, thank you for helping me and for your
kindness. Special thanks to my labmates Janine, Jana, Dilek and Silke.
A todos mis compaeros del rea de Microbiologa, muy especialmente a mis
compaeros de laboratorio del ayer (Bibi, Cris, Ana, Irene, Maite y Virginia), del hoy
(Mateo, Patricia, Nacho, Vane, y Mara) y de siempre (Marga), por todos los momentos que
he pasado junto a ellos. Gracias sobretodo a esos frikis a lo Monty Python y a esa futura
mami por ser como son, unos grandes amigos.
A mis amigos y amigas, muy especialmente a mis compaeras de profesin y a esas
hermanas. La separacin generada por nuestros trabajos nos hace mantenernos ms
unidos.
A mi familia por ser el mayor apoyo tanto en esta Tesis como en mi vida. Sin vosotros
esta Tesis no seria posible.
A U2 por ser parte de m.
Muy especialmente a Jorge, por ser l.
El presente trabajo ha sido financiado en la Universidad de Oviedo gracias a los proyectos del Fondo de
Investigacin Sanitaria PI052489 y PI080656; en el Federal Institute for Risk Assessment (Berln) gracias al
proyecto 2808HS032 del Ministerio Federal de Alimentacin, Agricultura y Proteccin del Consumidor de
Alemania y a los proyectos BfR-41-001, BfR-45-004, BfR-45-005 y BfR-46-001; y por el Ministerio de
Educacin (Beca FPU AP-2004-3641).

A mis padres

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ndice

Abreviaturas

vii

Resumen
Espaol
English

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1. Introduccin
1. 1. Caractersticas microbiolgicas de Staphylococcus aureus
1. 2. Epidemiologa
1. 3. Factores de virulencia
1.3.1. Componentes de la pared celular
1.3.2. Enzimas
1.3.3. Toxinas
1.3.3.1. Citotoxinas
1.3.3.2. Exfoliatinas
1.3.3.3. Superantgenos
1.3.4. Bacteriocinas
1.3.5. Regulacin
1. 4. Resistencia a antimicrobianos
1.4.1. Antecedentes histricos
1.4.2. Bases bioqumicas y genticas de la resistencia a antimicrobianos
1.4.2.1. Resistencia a antimicrobianos que inhiben la sntesis de la pared bacteriana
1.4.2.2. Resistencia a antimicrobianos que alteran la membrana citoplasmtica
1.4.2.3. Resistencia a antimicrobianos que inhiben la sntesis proteica
1.4.2.4. Resistencia a antimicrobianos que alteran la sntesis de cidos nucleicos
1.4.2.5. Resistencia a antimicrobianos que bloquean rutas metablicas
1.4.2.6. Resistencia a biocidas
1.5. Estructura poblacional
1.5.1. Tcnicas de tipificacin
1.5.2. Evolucin de los linajes de S. aureus

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2. Objetivos

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3. Resultados
3.1. Captulo 1: Staphylococcus aureus procedentes de hospitales del Principado de
Asturias
3.1.1. Artculo 1
Argudn MA, Mendoza MC, Mndez FJ, Martn MC, Guerra B, Rodicio, MR. Clonal
complexes and diversity of exotoxin gene profiles in methicillin-resistant and methicillinsusceptible Staphylococcus aureus isolates from patients in a Spanish hospital. J Clin
Microbiol 2009, 47(7): 2097-2105.
3.1.2. Artculo 2
Argudn MA, Mendoza MC, Vzquez F, Guerra B, Rodicio MR. Molecular typing of
Staphylococcus aureus bloodstream isolates from geriatric patients attended at a long-term
care Spanish hospital. J Med Microbiol 2010 60: 172-179.

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ndice

3.1.3. Artculo 3
Argudn MA, Mendoza MC, Vzquez F, Rodicio MR. Exotoxin gene backgrounds of
bloodstream and wound Staphylococcus aureus isolates from geriatric patients attending a
long-term care Spanish hospital (en preparacin).
3.2. Captulo 2: Staphylococcus aureus procedentes de portadores sanos del
Principado de Asturias
3.2.1. Artculo 4
Argudn MA, Mendoza MC, Rodicio MR. Genomic diversity of methicillin-susceptible
Staphylococcus aureus strains from young healthy carriers(en preparacin).
3.2.2. Artculo 5
Argudn MA, Mendoza MC, Argumosa V, Rodicio MR. Virulence profiles of
Staphylococcus aureus isolates from young healthy carriers (en preparacin).
3.2.3. Artculo 6
Argudn MA, Mendoza MC, Martn MC, Rodicio MR. Molecular basis of antimicrobial
drug resistance of Staphylococcus aureus isolates recovered from university students in a
Spanish region (en preparacin).
3.3. Captulo 3: Staphylococcus aureus procedentes de alimentos y manipuladores de
alimentos del Principado de Asturias
3.3.1. Artculo 7
Argudn MA, Mendoza MC, Gonzlez-Hevia MA, Bances M, Rodicio MR.
Characterization of food-borne Staphylococcus aureus from a Spanish region (en
preparacin).
3.3.2. Artculo 8
Martn MC, Argudn MA, Mendoza MC, Rodicio MR. Characterization of pUO-SaSED3, a virulence-resistance plasmid from Staphylococcus aureus (en preparacin).
3.3.2. Artculo 9
Argudn MA, Mendoza MC, Rodicio MR. Food poisoning and Staphylococcus aureus
enterotoxins. Toxins 2010, 2: 1751-1773.
3.4. Captulo 4: Staphylococcus aureus procedentes de animales de Alemania
3.4.1. Artculo 10
Argudn MA, Rodicio MR, Guerra B. The emerging methicillin-resistant Staphylococcus
aureus ST398 clone can easily be typed using the Cfr9I SmaI-neoschizomer. Lett App
Microbiol 2010, 50: 127-130.
3.4.2. Artculo 11
Argudn MA, Fetsch A, Tenhagen BA, Hammerl JA, Hertwig S, Kowall J, Rodicio MR,
Ksbohrer A, Helmuth R, Schroeter A, Mendoza MC, Brunig J, Appel B, Guerra B. High
heterogeneity within methicillin-resistant Staphylococcus aureus ST398 isolates defined by
Cfr9I macrorestriction-PFGE profiles, spa- and SCCmec types. App Environ Microbiol
2010, 76(3): 652-658.
3.4.3. Artculo 12
Argudn MA, Tenhagen BA, Fetsch A, Sachsenrder J, Ksbohrer A, Schroeter A,
Hammerl JA, Hertwig S, Helmuth R, Brunig J, Mendoza MC, Appel B, Rodicio MR,
Guerra B. Virulence and resistance determinants in German Staphylococcus aureus ST398
isolates from non-human origin App Environ Microbiol, 2011, 77(9): 3052-3060.

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4. Discusin
4.1. Objetivo 1. Identificar los linajes y clones de S. aureus de distinto origen
(hospitales, portadores sanos y relacionados con alimentos) que han estado circulando
del Principado de Asturias, y sub-tipificacin del linaje ST398 de origen animal.
4.1.1. Comparacin de las tcnicas de tipificacin utilizadas
4.1.1.1. Tipificacin mediante electroforesis en campo pulsante (PFGE)
4.1.1.2. Tipificacin mediante secuenciacin del gen de la protena A (spa)
4.1.1.3. Tipificacin por secuenciacin de mltiples loci (MLST)
4.1.1.4. Tipificacin mediante el test RM
4.1.2. Linajes circulantes en el Principado de Asturias
4. 2. Objetivo 2. Identificar determinantes de virulencia en los linajes encontrados en
el Principado de Asturias y en el clon ST398, y establecer su relacin con elementos
genticos mviles.
4.2.1. Determinantes de virulencia en las poblaciones de Staphylococcus aureus de
distinto origen y su relacin con elementos genticos
4.2.2. Distribucin de tipos del sistema de regulacin agr en las poblaciones de
Staphylococcus aureus de distinto origen
4.3. Objetivo 3. Determinar los fenotipos y genotipos de resistencia (prestando
especial atencin al SCCmec) en los linajes encontrados en el Principado de Asturias y
en el clon ST398.
4.3.1. Resistencia a antimicrobianos en las poblaciones de Staphylococcus aureus de
distinto origen
4.3.2. Clones MRSA
4.3.3. Determinantes de resistencia en poblaciones de Staphylococcus aureus de
distinto origen
4.4. Objetivo 4. Caracterizar mediante tcnicas moleculares el plsmido hibrido de
virulencia-resistencia pUO-Sa-SED3
4. 5. Consideraciones generales

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5. Conclusiones

201

6. Bibliografa

205

7. Anexos
Anexo I. Oligonucletidos utilizados en este trabajo.
Tabla Ia. Oligonucletidos utilizados para la identificacin de complejos clnales (RM
test).
Tabla Ib. Oligonucletidos utilizados para la identificacin de tipos spa y secuencias tipo
(ST, MLST).
Tabla Ic. Oligonucletidos utilizados para la caracterizacin de sistemas de restriccinmodificacin.
Tabla Id. Oligonucletidos utilizados para la identificacin de MRSA
Tabla Ie. Oligonucletidos utilizados para la identificacin de SCCmec.
Tabla If. Oligonucletidos utilizados para identificacin de determinantes de resistencia.
Tabla Ig. Oligonucletidos utilizados para identificacin de determinantes de virulencia.
Tabla Ih. Oligonucletidos utilizados para la deteccin de islas de patogenicidad.

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Tabla Ii. Oligonucletidos utilizados para identificacin del tipo de sistema de regulacin
agr.
Tabla Ij. Oligonucletidos utilizados para la caracterizacin de plsmidos pUO-Sa-SED.
Anexo II. Caractersticas de los aislamientos de S. aureus utilizados en este trabajo.
Tabla IIa. Caractersticas de los aislamientos de S. aureus procedentes del Hospital
Universitario Central de Asturias durante el periodo 2005-2006.
Tabla IIb. Caractersticas de los aislamientos de S. aureus procedentes del Hospital Monte
Naranco durante el periodo 1996-2006.
Tabla IIc. Caractersticas de los aislamientos de S. aureus procedentes de portadores sanos
durante el periodo 1997-2002.
Tabla IId. Caractersticas de los aislamientos de S. aureus procedentes de portadores sanos
durante el periodo 2004-2006.
Tabla IIe. Caractersticas de los aislamientos de S. aureus procedentes de alimentos, brotes
y manipuladores de alimentos durante el periodo 1997-2008.
Tabla IIf. Caractersticas de los aislamientos de S. aureus procedentes de animales durante
el periodo 2004-2008.

Tablas
Tabla 1. Patologas asociadas a colonizacin/infeccin por Staphylococcus aureus.
Tabla 2. Determinantes de patogenicidad o factores de virulencia de Staphylococcus
aureus.
Tabla 3. Elementos genticos que codifican SAgs en Staphylococcus aureus.
Tabla 4. Determinantes de resistencia a antimicrobianos en Staphylococcus aureus
Tabla 5. Clones MRSA de distribucin mundial.
Tabla 6. Complejos clonales, secuencias tipo y tipos spa encontrados en las poblaciones
de Staphylococcus aureus estudiadas en esta Tesis doctoral.
Tabla 7. Resolucin de las distintas tcnicas utilizadas para la tipificacin de
Staphylococcus aureus.
Tabla 8. Distribucin de determinantes de virulencia en distintas poblaciones y
complejos clonales.
Tabla 9. Distribucin de elementos genticos mviles en distintas poblaciones y
complejos clonales de Staphylococcus aureus estudiados en esta Tesis doctoral.
Tabla 10. Distribucin de tipos agr en distintas poblaciones y complejos clonales de
Staphylococcus aureus estudiados en esta Tesis doctoral.
Tabla 11. Porcentajes de resistencia a diferentes antimicrobianos en las poblaciones y
complejos clonales de Staphylococcus aureus estudiados en esta Tesis doctoral.
Tabla 12. Clones MRSA presentes en las poblaciones de Staphylococcus aureus
estudiadas en esta Tesis Doctoral.
Tabla 13. Genes de resistencia en las poblaciones y complejos clonales de
Staphylococcus aureus estudiados en esta Tesis doctoral.
Figuras
Figura 1. Morfologa y agrupacin de Staphylococcus aureus.
Figura 2. Modo de unin de un superantgeno y de un antgeno convencional a molculas
del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (Class II MHC) de una clula
presentadora de antgenos y al receptor de un linfocito T colaborador (TCR).
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Figura 3. Estructura de las SaPIs de Staphylococcus aureus portadoras de genes de SAgs.


Figura 4. Estructura de las vSa de Staphylococcus aureus.
Figura 5. Comparacin de las dos formas allicas de elementos SCC asociados con seh.
Figura 6. Distribucin geogrfica del porcentaje de bacteriemias de MRSA durante el ao
2008 en Europa.
Figura 7. Dianas en la clula bacteriana de los agentes antimicrobianos ms utilizados
contra S. aureus.
Figura 8. Estructura bsica de los tipos de SCCmec de Staphylococcus aureus.
Figura 9. Agrupacin BURP de los tipos spa del CC398.
Figura 10. Comparaciones de las secuencias de los genes sau1hsdS de los linajes CC5 y
CC25.
Figura 11. Comparaciones de las secuencias de los genes sau1hsdS de los linajes CC5 y
CC8.
Figura 12. Representacin de los complejos clonales encontrados en el PA mediante
eBURST.
Figura 13. Distribucin en complejos clonales de los aislamientos encontrados en el
Principado de Asturias.
Figura 14. Distribucin de determinantes de virulencia dependiendo del linaje y la
poblacin en estudio.
Figura 15. Distribucin de grupos agr en los distintos complejos clonales.
Figura 16. Distribucin de las resistencias a antimicrobianos dependiendo del linaje y la
poblacin en estudio.
Figura 17. Distribucin de genes de resistencia a antimicrobianos en diferentes
complejos clonales
Figura 18. Organizacin gentica de los plsmidos sed-seljser secuenciados.
Figura 19. Organizacin gentica de los tres tipos de plsmidos sed-seljser
encontrados en el Principado de Asturias.

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Abreviaturas

Abreviaturas
AAC, acetiltransferasas
AAD, adenililtransferasas o nucleotidiltransferasas
ALM, aislamientos procedentes de alimentos y manipuladores de alimentos del PA implicados o no en
brotes de intoxicacin alimentaria
AMK, amikacina
AMP, ampicilina
AN, aislamientos procedentes de animales (muestras nasales de cerdos asintomticos, muestras
clnicas de cerdos enfermos, muestras de polvo de granjas de crianza y muestras de alimentos)
APH, fosfotransferasas
agr, accessory gene regulator (gen regulador accesorio)
ATCC, american type culture collection
BfR, Federal Institute for Risk Assessment (Bundesinstitut fr Risikobewertung)
BURP, Based Upon Repeat Pattern
BURST, Based Upon Related Sequence Types
CA-MRSA, community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus
CAT, cloranfenicol acetiltransferasas
CC, clonal complex (complejo clonal)
CHIPS, chemotaxis inhibiting protein (protena inhibidora de la quimiotaxis)
CHL, cloranfenicol
CI, intervalos de confianza del ndice de discriminacin
CIP, ciprofloxacina
CLIC, clindamicina constitutiva
CLII, clindamicina inducible
CMI, concentracin mnima inhibitoria
egc, enterotoxin gene cluster
ERY, eritromicina
ET, exfoliatina
Dsg1, desmogleina 1
GEN, gentamicina
HA-MRSA, healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus
Hl, hemolisina
HMN, Hospital Monte Naranco
HUCA, Hospital Universitario Central de Asturias
hVISA, heterogeneous vancomycin intermediate Staphylococcus aureus
ID, ndice de discriminacin de Simpson
Ig, inmunoglobulina
KAN, kanamicina
LMUO, Laboratorio de Microbiologa de la Universidad de Oviedo
Luk, leucotoxinas
MET, meticilina
MFS, major facilitator superfamily
MGE, mobile genetic element (elemento gentico movil)
MLS, macrlidos, lincosaminas y estreptograminas
MLST, multilocus sequence typing (secuenciacin de mltiples loci)
vii

Abreviaturas
MOX, moxifloxacina
MRSA, methicillin-resistant Staphylococcus aureus
MSSA, methicillin-susceptible Staphylococcus aureus
MSCRAMMs, microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules (componentes
de la superficie bacteriana que reconocen las molculas de adhesin de la matriz celular)
MUP, mupirocina
NCBI, National Center for Biotechnology Information
NRL-Staph, National Reference Laboratory for coagulase positive staphylococci
OXA, oxacilina
PA, Principado de Asturias
PABA, cido paraaminobenzoico
PBP, penicillin-binding protein
PCR, polymerase chain reaction
PEN, penicilina
PFGE, pulse field gel electrophoresis (electroforesis en campo pulsante)
PMN, polimorfonucleares
PS, aislamientos procedentes de portadores sanos (estudiantes de biologa)
RIF, rifampicina
RM, restriccin y modificacin
SAgs, superantgenos
SaPI, Staphylococcus aureus pathogenicity island (isla de patogenicidad de Staphylococcus aureus)
SCC, staphylococcal cassette chromosome (cassette cromosmico estafiloccico)
SE, enterotoxina estafiloccica
SEl, enterotoxina estafiloccica-like
SNP, single nucleotide polymorphism
SMR, small multidrug resistance family
SpA, Staphylococcal protein A
Spl, serin proteasa
SSSS, staphylococcal scalded-skin sndrome (sndrome de la piel escaldada)
ST, sequence type (secuencia tipo)
TCR, receptor de linfocito T colaborador
TET, tetraciclina
Tn, transposn
TOB, tobramicina.
TSS, sndrome del shock txico
TSST, toxina del sndrome del shock txico
UE, Unin Europea
UPGMA, unweighted pair group matching analysis
VISA, vancomycin intermediate Staphylococcus aureus
VRSA, vancomycin resistant Staphylococcus aureus

viii

Resumen

Resumen

Staphylococcus aureus es una bacteria comensal y patgena, que se encuentra en el ser


humano y en animales tanto en estado portador como causando enfermedad. Su estructura poblacional
es altamente clonal, lo que est facilitado por la presencia de sistemas de restriccin-modificacin
(RM) que modulan el intercambio gentico. A pesar de ello, existen fenmenos de transferencia
horizontal que permiten la dispersin o intercambio de elementos genticos mviles (EGM) y sistemas
reguladores entre clones del mismo linaje e incluso de diferentes linajes. La presente Tesis Doctoral
analiza la estructura poblacional de una amplia coleccin de aislamientos de S. aureus de diverso
origen (humano, alimentos y animales) y examina la distribucin de determinantes de resistencia y
virulencia entre los linajes encontrados. Los aislamientos analizados proceden de pacientes de dos
hospitales, de portadores sanos, de muestras de alimentos y de manipuladores de alimentos, todos ellos
del Principado de Asturias (PA). Tambin se incluyeron en el estudio aislamientos de origen animal de
Alemania, pertenecientes al clon emergente ST398/CC398. Los aspectos desarrollados fueron los
siguientes:
1. Identificacin de los linajes circulantes en el PA y de su variabilidad interna mediante el
uso de distintas tcnicas de tipificacin: electroforesis en campo pulsante (PFGE), secuenciacin de
mltiples loci (MLST), secuenciacin del gen de la protena A (spa) y amplificacin de los genes
sau1hsdS1 y sau1hsdS2 del sistema RM Sau1. Se estableci la presencia de 15 linajes en la regin
(CC1, CC5, CC8, CC9, CC12, CC15, CC22, CC25, CC30, CC45, CC59, CC72, CC88, CC97, CC121)
siendo mayoritarios CC5, CC30 y CC45. Adems, se desarroll un protocolo para la tipificacin por
PFGE del clon emergente ST398 no tipificable anteriormente con esta tcnica.
2. Deteccin de determinantes de virulencia y de EGM implicados en su dispersin. A
diferencia del clon ST398, los aislamientos del PA presentaron un nmero muy elevado de
determinantes de virulencia asociados a EMG (islas genmicas, islas de patogenicidad, profagos, y
plsmidos), combinados en numerosos perfiles. Estos resultados ponen de manifiesto la elevada
plasticidad del genoma de S. aureus, lo cual facilita su adaptacin a los distintos nichos ecolgicos que
ocupa. Este apartado se complet con la caracterizacin molecular de un plsmido hibrido de
virulencia-resistencia, que representa un interesante ejemplo de ingeniera evolutiva.
3. Estudios de resistencia. Se encontraron elevados porcentajes de resistencia, especialmente
frente a -lactmicos, aminoglicosidos, macrlidos y lincosamidas, y de multirresistencia, en
aislamientos clnicos del PA y en CC398, con respecto a los aislamientos recogidos en la comunidad.
Se identificaron los genes responsables de las resistencias y los EGM implicados en su dispersin
(transposones y plsmidos), y se estableci su distribucin en los diferentes linajes. La determinacin
de los tipos SCCmec en aislamientos resistentes a meticilina permiti identificar los clones MRSA
circulantes en la regin y dentro del CC398.
La Tesis Doctoral amplia el conocimiento sobre la estructura poblacional de S. aureus, y sobre
las propiedades de resistencia y virulencia de los linajes y clones detectados. Adems, identific los
clones epidmicos, espordicos y emergentes que han estado circulando en el PA, cuyo seguimiento
epidemiolgico debe continuar en el futuro.

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Resumen

Staphylococcus aureus is both a commensal and a pathogenic bacterium, able to cause disease
or to establish a carrier state in humans and animals. S. aureus has a highly clonal population structure,
which is facilitated by the presence of restriction-modification (RM) systems that modulate the genetic
exchange. However, horizontal transfer events can occur allowing the spread or exchange of mobile
genetic elements (MGE) and regulatory systems between clones of the same and even different
lineages. This Doctoral Thesis analyzes the population structure of a large collection of isolates of S.
aureus from different origins (human, animal and food), and examines the distribution of resistance
and virulence determinants among different lineages. The isolates analyzed were recovered from
human clinical samples in two hospitals, healthy carriers, food samples and food handlers in the
Principality of Asturias (PA). Isolates collected in Germany from animal samples and belonging
mainly to the emerging ST398/CC398 clone were also analyzed. The main objectives of the Thesis
were the following:
1. Identification of the clones and lineages which have been circulating in the PA, both in
nosocomial and community settings, and its internal variability using different typing techniques:
pulsed field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST), protein A gene (spa)
typing, and PCR amplification of the sau1hsdS1 and sau1hsdS2 of the Sau1 RM system. By these
means, 15 lineages (CC1, CC5, CC8, CC9, CC12, CC15, CC22, CC25, CC30, CC45, CC59, CC72,
CC88, CC97, CC121) were detected in our region, with CC5, CC30 and CC45 being predominant.
Moreover, we developed a new typing PFGE protocol for CC398, which was previously untypeable by
this technique.
2. Detection of virulence determinants and MGEs involved in their spread. In contrast to
CC398, the isolates from the PA carried a large number of virulence genes, associated with MGEs,
such as genomic islands, pathogenicity islands, prophages and plasmids, and arranged in many
different combinations. These results reveal the high plasticity of the S. aureus genome, which can be
viewed as a means of adaptation to the different ecological niches that can be colonized by this
bacterium. These studies were complemented with the characterization of a hybrid virulence-resistance
plasmid, which represents an interesting example of evolutionary engineering in S. aureus.
3. Resistance studies. High rates of resistance, particularly against -lactams,
aminoglycosides, macrolides and lincosamides, as well as multidrug resistance, were found in clinical
isolates recovered in the PA and the CC398 clone, in comparison to isolates recovered in the
community. The genes responsible for the resistances detected, and the MGEs involved in their spread
(transposons and plasmids), were identified and their distribution among different lineages and clones
was established. Determination of the SCCmec types in methicillin-resistant isolates led to the
identification of the MRSA clones circulating in the PA and within CC398.
This Doctoral Thesis increases the existing knowledge on the population structure of S.
aureus, and on its resistance and virulence properties. It supplies information on the epidemic,
sporadic and emerging clones which have been circulating in the PA, and highlights the importance of
further epidemiological surveillance.

1.Introduccin

1. Introduccin

1. 1. Caractersticas microbiolgicas de Staphylococcus aureus


El trmino Staphylococcus viene del griego staphyle = racimo de uvas y kokkos =
granulado, denominacin otorgada por Alexander Ogston en 1882, quien tambin demostr
su patogenicidad encontrando que era causante de ciertos abscesos pigenos en el hombre
(Ogston, 1883). En 1884, Rosenbach aisl esta bacteria de abscesos y la denomin
Staphylococcus aureus por el color de amarillo-naranja a dorado que presentaban sus colonias
(Rosenbach, 1884). Desde entonces se ha relacionado con un amplio espectro de cuadros
infecciosos y toxignicos, y se ha visto implicado en brotes y epidemias hospitalarios y
comunitarios (Lowy, 1998; Mandell et al., 2000).
El gnero Staphylococcus pertenece al Dominio Bacteria y se clasifica dentro del
Phylum 2 (Firmicutes), Clase Bacilli, Orden Bacillales, y Familia Staphylococcaceae
(Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 2001). Son cocos Gram-positivos de 0,8-1 m
de dimetro, y pueden encontrarse aislados o agrupados en parejas, ttradas o formando
racimos irregulares debido a su capacidad para dividirse en tres planos (Figura 1). Son
bacterias de bajo contenido en guanina-citosina (GC), inmviles, aerobias o anaerobias
facultativas, no formadoras de esporas y generalmente no capsuladas. El gnero incluye 35
especies y 17 subespecies, de las que algunas son patgenas oportunistas para el hombre y
animales.
A.

B.

Figura 1. Morfologa y agrupacin de Staphylococcus aureus. A. Tincin Gram que muestra las
formas cocceas agrupadas en racimos y de color violeta debido a la retencin del colorante primario
cristal violeta. B. Microfotografa electrnica de barrido (http://phil.cdc.gov).

La especie tipo es S. aureus (estafilococo dorado), que es anaerobio facultativo,


mesfilo, requiere aminocidos y vitaminas para su crecimiento, fermenta glucosa y manitol
(con produccin de cido) y tolera condiciones ambientales muy variables. As, puede crecer
a temperaturas entre 6 y 46C (ptimo 30-37C) y pH entre 4,0 y 9,8 (ptimo en torno a 7).
Igualmente presenta una alta tolerancia a la sal, al resistir concentraciones de hasta un 20% de
NaCl, propiedad til para su aislamiento selectivo en medios de cultivo especficos. Adems,
este carcter permite su crecimiento en alimentos con muy baja actividad del agua (aw), hasta
0,83 (rango 0,83-0.99; ptimo 0,94). Por otro lado, tambin es resistente a la desecacin, la

1. Introduccin

congelacin y el calor aunque no tanto como las endosporas bacterianas (Mandell et al.,
2000).

1. 2. Epidemiologa
S. aureus es un comensal y un patgeno, cuyo hbitat primario en el hombre es la
mucosa nasofarngea, donde forma parte de la microbiota normal persistente o transente, sin
causar sintomatologa. De la nasofaringe pueden pasar a otras reas corporales como la piel,
el tracto respiratorio, las glndulas mamarias y los aparatos genitourinario e intestinal
(Wertheim et al., 2005; Harbarth et al., 2007; Acton et al., 2009). La tasa de portadores
adultos se estima alrededor del 20-30%, lo que depende de factores estacionales y
epidemiolgicos locales (Kluytmans et al., 1997; Kluytmans y Wertheim, 2005; Wertheim et
al., 2005). Estudios longitudinales estiman que un 20% (rango 12-30%) de personas son
portadores persistentes de S. aureus, un 30% (rango 16-70%) son portadores intermitentes y
un 50% (rango 16-69%) no portadores (Wertheim et al., 2005). Algunos grupos de personas
parecen ser ms susceptibles a la colonizacin que otros y es posible que haya varias cepas en
un mismo hospedador. Los portadores persistentes suelen estar colonizados por una sola cepa
de S. aureus, mientras que los portadores intermitentes pueden contener varias cepas (Eriksen
et al., 1995; VandenBergh et al., 1999; Wertheim et al., 2005). En el personal sanitario,
pacientes crnicos e infantes la tasa de portadores es mayor que en la poblacin general
(Wertheim et al., 2005; Albrich y Harbarth, 2008; Shinefield y Ruff, 2009). Mamferos y aves
son tambin reservorios y hospedadores sensibles a infecciones por S. aureus (Lloyd, 2007;
Cuny et al., 2009; Morgan et al., 2009). La colonizacin aumenta significativamente el riesgo
de infeccin, ya que sirve de reservorio del patgeno para su introduccin en el hospedador
cuando sus defensas estn comprometidas (Kluytmans et al., 1997; von Eiff et al., 2001;
Safdar y Bradley, 2008).
S. aureus es agente etiolgico de un amplio espectro de infecciones de origen
comunitario y nosocomial (adquiridas en hospitales), desde simples abscesos a sepsis
mortales; y de distintas enfermedades causadas por toxinas: intoxicaciones alimentarias,
sndrome del shock txico y sndrome de la piel escaldada (Tabla 1). La lesin anatmica
bsica producida por S. aureus, ya sea un exudado pigeno o absceso, es consecuencia de una
infeccin focal. Desde ah, por rotura profunda de la piel u otra lesin, la bacteria puede llegar
a atravesar las defensas del organismos hasta ocasionar una infeccin sistmica y/o
metastsica (Mandell et al., 2000). Los individuos proclives a infecciones estafiloccicas son
recin nacidos e infantes, mujeres en periodos de lactancia, enfermos crnicos y personas con
sistemas inmunolgicos deprimidos (Mandell et al., 2000; Shinefield y Ruff, 2009).

1. 3. Factores de virulencia
La diversidad de patologas producidas por S. aureus se debe a que este patgeno
posee una amplia gama de factores de virulencia, que abarcan desde componentes de la pared
celular a una gran variedad de exoprotenas, lo cual contribuye a su habilidad para colonizar y
2

1. Introduccin

causar enfermedad en mamferos (Tabla 2). En algunos casos, como intoxicaciones


alimentarias, el shock txico o la neumona necrotizante, la enfermedad esta mediada por un
factor de virulencia concreto, mientras que otras enfermedades resultan de la accin
combinada de varios factores de virulencia (Ferry et al., 2005). Adems, en el desarrollo y
pronstico de las enfermedades causadas por S. aureus tambin son determinantes factores
dependientes del hospedador (Mandell et al., 2000).
Tabla 1. Patologas asociadas a colonizacin/infeccin por Staphylococcus aureus.
Estado de portador: nasofaringe, piel, tracto respiratorio, glndulas mamarias y aparatos
genitourinario e intestinal.
Infeccin directa
- Infecciones superficiales de la piel: foliculitis, fornculos, carbunco, imptigo, hidradenitis
supurada, celulitis, mastitis, infeccin de herida.
- Infecciones profundas, a consecuencia de traumatismos, ciruga, insercin de cuerpos extraos:
artritis, bursitis, osteomielitis.
Infeccin hematgena secundaria a infeccin directa
- Bacteriemia/Sepsis con/sin infeccin metastsica, con/sin vasculitis y coagulopatia con/sin
sndrome inflamatorio y fallo multiorgnico.
- Infeccin metastsica: artritis, osteomielitis, piomiositis, meningitis, endocarditis, pericarditis,
infeccin pulmonar (sinusitis, neumona, enfisema).
Enfermedades mediadas por toxinas (asociadas a estado de portador o infeccin directa)
- Sndrome de la piel escaldada, sndrome del shock txico menstrual y no menstrual, intoxicacin
alimentaria.
Adaptado de Mandell et al. (2000).

La exposicin inicial de las clulas epiteliales de piel o mucosas y de los fagocitos del
hospedador a los productos bacterianos y al dao tisular producido por S. aureus, activa al
sistema inmune. Molculas como el peptidoglicano y la lipoprotena son reconocidas por el
mismo, aumentando la seal proinflamatoria y estimulando el reclutamiento de neutrfilos y
macrfagos. S. aureus es capaz de sobrevivir tanto dentro como fuera de las clulas del
hospedador. En el exterior celular, la bacteria evita la opsonizacin por el sistema del
complemento y por anticuerpos mediante la cpsula, el factor de agregacin (coagulasa
ligada), la protena A e inhibidores del complemento (Liu, 2009). Adems, resiste la accin
de los leucocitos polimorfonucleares (PMN, que incluyen los basfilos, eosinfilos y
neutrfilos) gracias a la protena de adherencia extracelular y la protena inhibitoria de la
quimiotaxis. Los neutrfilos en el sitio de infeccin secretan una serie de sustancias
antimicrobianas, como pptidos y especies reactivas de oxgeno que S. aureus es capaz de
neutralizar mediante diferentes enzimas. Por otro lado la toxina del sndrome del shock txico
(TSST) y las enterotoxinas secretadas por la bacteria actan como superantgenos
estimulando de forma inespecfica a un nmero muy elevado de linfocitos T colaboradores
(Liu, 2009).

1. Introduccin

Tabla 2. Determinantes de patogenicidad o factores de virulencia de Staphylococcus aureus.


Determinante
Funcin
Componentes de la pared celular
Peptidoglicano

Protenas de superficie
Cpsula externa

Actividad de tipo endotoxina, activacin del complemento,


induccin de la produccin de anticuerpos e interleucina-1,
atraccin de leucocitos polimorfonucleares.
Adherencia, accin antifagocitaria, induccin de la
produccin de anticuerpos.
Adherencia, colonizacin.
Adherencia, accin antifagocitaria.

Enzimas
Catalasa
Coagulasa
Estafiloquinasas
Hialuronidasa
Lipasa
Proteasa
Termonucleasa

Supervivencia durante fagocitosis.


Formacin de abscesos, proteccin frente fagocitosis.
Destruccin de cogulos.
Invasin hstica.
Invasin-colonizacin.
Invasin-colonizacin.
Hidrlisis del ADN.

Toxinas
Citotoxinas
Exfoliatinas
Toxina TSST-1
Enterotoxinas

Alteracin de membranas celulares.


Epidermlisis.
Shock txico.
Intoxicacin alimentaria.

Bacteriocinas

Matar a otras bacterias.

cidos teicoicos

Adaptado de Mandell et al. (2000).

1.3.1. Componentes de la pared celular


El componente bsico de la pared celular de S. aureus, que le da forma y estabilidad
osmtica, es el peptidoglicano (o peptidoglucano). Este polmero polisacardico constituye
un 50% de la pared y est compuesto por largas cadenas de glcidos, formadas por la
repeticin de molculas de cido N-acetilmurmico y N-acetilglucosamina, unidas por enlace
-1,4-glicosdico. El cido N-acetilmurmico esta unido a cadenas peptdicas laterales (Lalanina-D-glutmico-L-lisina-D-alanina), ligadas de forma cruzada por un pentapptido de
glicina. Tiene importantes propiedades biolgicas como presentar actividad de tipo
endotoxina (ya que estimula la produccin de pirgenos endgenos), desencadenar la
produccin de interleucina-1 por monocitos, estimular la quimiotaxis y agregacin de los
leucocitos PMN (proceso que origina la formacin de abscesos), activar el sistema del
complemento e inducir la produccin de anticuerpos opsonizantes (Mandell et al., 2000;
Murray et al., 2009).
Otro componente de la pared celular, que constituye entre un 30% a un 50% de la
misma son los cidos teicoicos y lipoteicoicos (Murray et al., 2009). Son polmeros de
polialcohol fosfatados que pueden esta unidos de forma covalente al cido N-acetilmurmico
de la capa de peptidoglicano o ligados a lpidos de la membrana celular (cidos lipoteicoicos).
Sus funciones incluyen (i) la proteccin frente a molculas potencialmente dainas
4

1. Introduccin

(antimicrobianos, lisozima) y condiciones de estrs (calor, baja osmolaridad); (ii) el control


de actividades enzimticas y concentracin de cationes en el exterior celular; y (iii) unin a
receptores y superficies (incluyendo bacterifagos y clulas del hospedador) (Xia et al.,
2009). Aunque los cidos teicoicos son poco inmunognicos, estimulan una respuesta
humoral especifica cuando se encuentran unidos al peptidoglicano (Murray et al., 2009).
S. aureus posee adems, varias protenas que secretadas o asociadas a la pared celular
se unen a las clulas del hospedador y a componentes del plasma. Generalmente son
conocidas como componentes de la superficie bacteriana que reconocen las molculas de
adhesin de la matriz celular (microbial surface components recognizing adhesive matrix
molecules, MSCRAMMs) (Clarke et al., 2006). Las MSCRAMMs se unen a colgeno
(protena fijadora de colgeno, Cna), fibronectina (protenas fijadoras de fibronectina, FnBPA
y FnBPB), fibringeno (factores de agregacin, ClfA y ClfB) y elastina (protena de unin a
elastina, EbpS) (Ferry et al., 2005). La protena de adherencia extracelular (Eap) es otra
MSCRAMMs que adems de ser capaz de unirse a fibringeno, fibronectina, vitronectina,
sialoprotena y trombospondina, contribuye a la formacin de biofilms e interacciona con la
molcula de adhesin intercelular 1 (ICAM-1), inhibiendo su unin a los neutrofilos y
evitando as su reclutamiento (Sun et al., 2009; Thompson et al., 2010). La protena
inhibidora de la quimiotaxis (CHIPS), es una protena secretada por S. aureus que tambin
inhibe la migracin y activacin de los neutrofilos al unirse al receptor del pptido
quimiotctico C5a presente en su superficie (de Haas et al., 2004).
Dentro de la familia de protenas MSCRAMMs se incluye tambin la protena A
(Staphylococcal protein A, SpA), que se une al factor von Willebrand, una glicoprotena que
media la adhesin plaquetaria en zonas con dao endotelial (Hartleib et al., 2000). Adems,
SpA tiene otras propiedades: (i) bloquea la fraccin Fc de las inmunoglobulinas (IgG1, IgG2
y IgG4, pero no a la IgG3) inhibiendo la fagocitosis (Foster, 2005); (ii) mimetiza al factor de
necrosis tumoral alfa activando al receptor 1 del mismo (TNRF1) produciendo una seal
proinflamatoria (Gmez et al., 2007); y (iii) acta como superantigeno de clulas B
ocasionando una pobre respuesta especifica de estas clulas (Janson et al., 1998).
La mayora de los estafilococos producen una cpsula o capa externa de polisacridos
que recubre la pared celular. Se han descrito 11 tipos polisacardicos de cpsula, siendo los
tipos 5 y 8 los responsables de la mayora de las infecciones humanas. Adems, la mayora de
los S. aureus resistentes a meticilina (methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)
son del tipo capsular 5 (Ferry et al., 2005). La cpsula est formada por monosacridos,
protenas y pequeos pptidos en una cantidad que depende de factores genticos y de las
condiciones de crecimiento. Esta sustancia extracelular une a las bacterias a tejidos y cuerpos
extraos, como catteres, injertos, prtesis valvulares y articulares. Adems inhibe la
quimiotaxis y la fagocitosis (Murray et al., 2009).
Dentro del estudio de la patogenia de los Staphylococcus, el biofilm como factor de
virulencia ha recibido gran atencin en los ltimos aos, debido a la elevada incidencia de
infecciones asociadas a dispositivos plsticos. Respuestas inadecuadas al tratamiento

1. Introduccin

antimicrobiano ante la presencia de biofilm aumentan el riesgo de complicaciones en los


pacientes afectados e incrementa los costos de atencin. La produccin de biofilm fue
descrita inicialmente en estafilococos coagulasa negativos. Su produccin se debe a la
presencia del operon ica (intercellular cluster adhesin), que consiste en un gen regulador
(icaR) y varios genes (icaADBC) para la biosntesis del polisacrido de adherencia
intercelular (PIA), un polmero de glucosamina con una estructura bioqumica de -1, 6-Nacetil-glucosamina, que constituye el biofilm (Gtz et al., 2002; Diemond Hernndez y
Novales, 2007). Otras protenas influyen en la produccin del biofilm, como la protena
asociada a la acumulacin (AAO), el factor de agregacin A (CflA), la protena estafiloccica
de superficie (SSP1) y una protena de la isla SaPIbov denominada Bap (biofilm-associated
protein) (Gtz et al., 2002; Diemond Hernndez y Novales, 2007). Se ha demostrado que el
opern ica es bastante frecuente en S. aureus y esta regulado por el opern sigB (Kim et al.,
2008).

1.3.2. Enzimas
Los estafilococos producen varios enzimas que contribuyen a la patognesis, como
coagulasas, hialuronidasas, estafiloquinasas, proteasas, lipasas, y termonucleasas (DNasa). La
deteccin de algunos de estos enzimas se utiliza como carcter diferencial en medios de
cultivo para la identificacin de S. aureus.
La coagulasa de S. aureus existe en dos formas, una unida a la pared celular del
estafilococo (coagulasa ligada, que se corresponde con el factor de agregacin nombrado
anteriormente) y una libre. El factor de agregacin se une a la protrombina, complejo que
trasforma el fibringeno en fibrina insoluble provocando la aglomeracin de los
estafilococos. La coagulasa libre reacciona con el factor reactivo de la coagulasa (CRF),
presente en el plasma, dando lugar a un complejo anlogo a la trombina que reacciona con el
fibringeno formando el cogulo de fibrina. Ambas acciones producen un capa de fibrina
alrededor del absceso estafiloccico, localizando la infeccin y protegiendo a la bacteria de la
fagocitosis (Mandell et al., 2000).
Otros enzimas intervienen en la degradacin de tejidos y macromolculas, facilitando
la liberacin de nutrientes para el crecimiento de la bacteria, la diseminacin de la infeccin a
los tejidos adyacentes y provocando diversos sntomas.
La estafiloquinasa es una fibrinolisina cuya funcin bsica es la destruccin de
cogulos. Se une al plasmingeno formando un complejo que se une a fibrina y la hidroliza
para facilitar la entrada de S. aureus en tejidos ms profundos. Adems la interaccin de
estafiloquinasa con -defensinas origina resistencia bacteriana a la fagocitosis. El gen que
codifica esta enzima (sak) se encuentra en diversos profagos, y es regulado por el gen
regulador accesorio (accessory gene regulation, agr) como muchos otros factores de
patogenicidad de esta bacteria (Bokarewa y Tarkowski, 2006; apartado 1.3.5.).

1. Introduccin

La hialuronidasa degrada el cido hialurnico que se encuentra en la matriz


extracelular del tejido conjuntivo, facilitando la propagacin de la infeccin (Mandell et al.,
2000). Ms del 90% de las cepas de S. aureus producen este enzima (Murray et al., 2009).
Todas las cepas de S. aureus y ms del 30% de las cepas de Staphylococcus coagulasa
negativo producen diferentes lipasas. Como indica su nombre, estas enzimas hidrolizan los
lpidos, una funcin esencial para garantizar la supervivencia de los estafilococos en las zonas
sebceas del organismo. La presencia de estos enzimas puede ser necesaria para que la
bacteria pueda invadir tejidos cutneos y subcutneos, y para el desarrollo de infecciones
cutneas superficiales, como fornculos o carbunco (Murray et al., 2009).
La nucleasa termoestable es otro marcador de S. aureus, aunque otras especies
producen esta enzima (Murray et al., 2009).
Adems, todos los estafilococos producen catalasa que cataliza la conversin del
perxido de hidrgeno en agua y oxgeno, lo cual aumenta la supervivencia en macrfagos
(Mandell et al., 2000).

1.3.3. Toxinas
S. aureus puede producir un gran nmero de toxinas, incluyendo citotoxinas,
exfoliatinas, toxina del sndrome del shock txico y enterotoxinas. Los dos ltimos tipos
pertenecen a la familia de los superantgenos (SAgs).
1.3.3.1. Citotoxinas
Una de las caractersticas ms importantes de S. aureus es la capacidad de secretar
citotoxinas o toxinas citolticas que alteran la membrana celular de las clulas del hospedador
formando poros que causan la fuga del contenido celular y la lisis (Kaneco y Kamio, 2004).
Entre este tipo de toxinas se encuentran las hemolisinas y las leucotoxinas.
Las hemolisinas se detectan fcilmente en medio agar sangre por el dao que causan
a las membranas celulares de los glbulos rojos. La mayora de las cepas de S. aureus
produce alguna hemolisina, habindose descrito cinco tipos: alfa (-hemolisina, codificada
por el gen hla), beta (-hemolisina, hlb), delta (-hemolisina, hld), gamma (-hemolisina,
hlg), y gamma-variante (hlg variant o hlg-2). Su amplia distribucin en S. aureus se debe en
parte a que los genes que las codifican se encuentran en regiones estables del cromosoma
(Kaneco y Kamio, 2004).
La hemolisina mejor estudiada es la -hemolisina que acta sobre membranas de una
gran variedad de clulas eucariotas (eritrocitos, leucocitos, plaquetas, fibroblastos, monocitos,
trombocitos, clulas endoteliales) pero no sobre membranas celulares bacterianas (Mandel et
al., 2000; Menestrina et al., 2001; Murray et al., 2009). La sensibilidad a -hemolisina
depende de la especie animal (los eritrocitos de conejo son 1000 veces ms sensibles que los
del ser humano) y del tipo de clula (los fibroblastos pueden reparar la membrana celular de
una forma ms eficaz que los eritrocitos) (Menestrina et al., 2001; Murray et al., 2009).
Adems tiene actividad dermonecrtica y neurotxica (Dinges et al., 2000). El gen que la
7

1. Introduccin

codifica (hla) es cromosmico y su expresin est regulada por el locus agr (Dinges et al.,
2000; apartado 1.3.5.).
La -hemolisina, tambin conocida como esfingomielinasa C, produce su efecto
citotxico al degradar la esfingomielina y la lisofosfatidilcolina, por lo que es activa frente a
una gran variedad de clulas incluyendo eritrocitos, leucocitos, fibroblastos y macrfagos
(Murray et al., 2009). Cataliza la hidrlisis de fosfolpidos en la membrana de clulas
susceptibles, y la lisis es proporcional a la concentracin y distribucin de esfingomielina en
la superficie celular. Junto con la -hemolisina es responsable de la destruccin celular y la
formacin de abscesos (Murray et al., 2009). La expresin del gen que la codifica (hlb)
tambin depende del locus agr, aunque hlb suele estar truncado por la insercin de profagos
(Feng et al., 2008).
La -hemolisina acta como un surfactante que altera las membranas celulares
mediante una accin de tipo detergente. Tiene un amplio espectro de actividad citoltica,
afectando a eritrocitos y otras clulas de mamferos, y tambin a diversas estructuras
subcelulares como protoplastos, esferoplastos y lisosomas (Verdon et al., 2009). El gen que la
codifica (hld) forma parte del locus agr, y est regulado por el mismo (Verdon et al., 2009).
Por otro lado, se ha demostrado que esta toxina tiene cierta actividad antimicrobiana sobre
Legionella (Verdon et al., 2009).
La -hemolisina es capaz de lisar eritrocitos y otras clulas de mamferos, y al igual
que otras toxinas citolticas como las leucotoxinas, es una toxina bi-componente: un
componente proporciona adherencia a la clula del hospedador y el otro es txico o citoltico
(Kaneco y Kamio, 2004).
En S. aureus se han descritos tres tipos de leucotoxinas: la leucocidina de PantonValentine (LukS-PV/LukF-PV, pvl), la LukE/LukD (lukED) y la LukM/LukF-PV (lukM).
La leucocidina de Panton-Valentine tiene una actividad citoltica especfica sobre
macrfagos, monocitos y leucocitos PMN. A diferencia de las hemolisinas, que estn
ampliamente distribuidas en S. aureus, la Panton-Valentine se encuentra slo en un bajo
porcentaje (2-3%) de cepas (Dinges et al., 2000). Sin embargo, es relativamente frecuente en
S. aureus de adquisicin comunitaria y su presencia se ha asociado con lesiones (furnculos y
abscesos) e infecciones necrticas cutneas y tambin con neumona necrtico-hemorrgica
severa, aunque su relacin con patogenicidad es variable dependiendo de los modelos
animales en estudio (Patel, 2009). A pesar de las discrepancias en los estudios, aunque la
Panton-Valentine no resulte el factor de virulencia determinante en este tipo de cepas, sirve
como marcador epidemiolgico de las mismas aunque no en todos los casos (Rossney et al.,
2007). El gen pvl ( lukPV) est presente en profagos de la familia Siphoviridae con integrasa
de tipo Sa2, que bsicamente se dividen en dos grupos: los de tipo SLT y los de tipo PVL
(Canchaya et al., 2003; Goerke et al., 2009).
La leucotoxina LukE/LukD produce dermonecrosis en conejos pero tiene una dbil
actividad leucocitoltica y carece de actividad hemoltica. Se ha descrito una variante con ms
actividad leucocitoltica y una debil actividad hemoltica en la cepa ATCC 27733 de S.

1. Introduccin

aureus (Kaneco y Kamio, 2004). El gen que codifica esta toxina (lukED) se ha identificado en
islas genmicas vSa junto con otros factores de virulencia (ver apartado 1.3.3.3.).
Los leucocitos PMN de rumiantes son altamente sensibles a la leucotoxina
LukM/LukF-PV, y su presencia se ha asociado a casos de mastitis en bvidos. El gen que la
codifica (lukM) est en el profago PV83-pro, de la familia Siphoviridae con integrasa de
tipo Sa5, que fue originariamente descrito en la cepa P83 (ATCC 31890) de S. aureus aislada
de la ubre infectada de un bvido (Kaneco y Kamio, 2004).
1.3.3.2 Exfoliatinas
Las exfoliatinas (ETs), toxinas epidermoliticas o exfolitativas son los factores de
virulencia asociados a infecciones directas en piel tipo imptigo y con el sndrome de la piel
escaldada (staphylococcal scalded-skin sndrome, SSSS). Ambas enfermedades son ms
frecuentes en nios, aunque tambin adultos inmunocomprometidos pueden padecerlas. El
imptigo es altamente contagioso y se caracteriza por la presencia de ampollas llenas de pus
(pstulas), mientras que en el SSSS o enfermedad de Ritter la piel presenta reas eritematosas
muy sensibles.
Las exfoliatinas son serin proteasas especificas de glutamato, que actan cortando un
nico enlace peptdico entre dominios extracelulares de la desmogleina 1 (Dsg1) (Nishifuji et
al., 2008), protena transmembrana de la familia de las cadherinas que forma parte de los
desmosomas que unen las clulas epiteliales. Dsg1 predomina en las capas superficiales de la
epidermis, mientras que otras desmogleinas son ms abundantes en capas basales y mucosas.
Al hidrolizar el enlace peptdico de Dsg1 se pierde la adhesin celular entre los queratinocitos
producindose el desprendimiento de las capas superficiales de la epidermis, de modo que la
piel adquiere un aspecto que recuerda al que presentan las quemaduras. La funcin de Dsg1
no puede ser compensada por otras isoformas de desmogleinas, lo que propicia la
epidermlisis (Nishifuji et al., 2008; Bukowski et al., 2010).
Estudios iniciales sugirieron que las ETs se comportaban como superantgenos y
estimulaban la mitogenia de linfocitos humanos y de ratn. Sin embargo investigaciones ms
recientes han demostrado que su actividad superantgnica es muy inferior a la que presentan
los autnticos superantgenos, y en exmenes histopatolgicos de lesiones cutneas asociadas
a SSSS no se ha observado un incremento importante de linfocitos en la epidermis, como
cabra esperar de unos verdaderos superantgenos (Nishifuji et al., 2008; Bukowski et al.,
2010).
Se han descritos 3 isoformas de exfoliatinas en S. aureus: ETA (eta), ETB (etb), y
ETD (etd). Estudios iniciales determinaron que ETA es ms frecuente en aislamientos de
Europa y Amrica, mientras que ETB es ms frecuente en Japn. A, su vez, esta ltima es
predominante en casos de SSSS, aunque las diferencias regionales y su asociacin con
enfermedades an no han sido del todo determinadas (Nishifuji et al., 2008; Bukowski et al.,
2010). ETA y ETB estn asociadas slo a casos de imptigo y SSSS, mientras que ETD se ha
relacionado tambin con otras infecciones, como abscesos y furnculos (Nishifuji et al.,

1. Introduccin

2008; Bukowski et al., 2010). Estas toxinas son relativamente especificas, afectando a
humanos y ratones pero no a otras especies, aunque ETB y ETD tambin actan sobre la
Dgs1 presente en la epidermis del ganado porcino (Nishifuji et al., 2008). En infecciones de
caballos causadas por S. aureus se describi una cuarta exfoliatina, denominada ETC, pero su
estructura no corresponde a la de una serin proteasa y su actividad sobre Dgs1 an no ha sido
determinada (Sato et al., 1994).
En cuanto a la localizacin gentica de los genes que codifican este tipo de toxinas,
eta se encuentra en el cromosoma y est asociado con la presencia de profagos de la clase
Siphoviridae con integrasa de tipo Sa1 (Canchaya et al., 2003) y con la isla genmica vSa
(Gill et al., 2005). El gen etb esta localizado en plsmidos (O'Toole y Foster, 1996;
Yamaguchi et al., 2001) y el gen etd en una isla tipo SaPI (Yamaguchi et al., 2002; apartado
1.3.3.3.).
1.3.3.3. Superantgenos
Los SAgs bacterianos son protenas exocelulares con la capacidad de estimular no
especficamente a un nmero elevado de linfocitos T en el hospedador, provocando la
produccin de citoquinas hasta niveles txicos (Fraser y Proft, 2008; Ortega et al., 2010). Los
SAgs se unen a regiones de las molculas del complejo mayor de histocompabilidad de clase
II (MHC) de las clulas presentadores de antgenos y a los receptores de los linfocitos T
colaboradores (TCR) en lugares diferentes a los de reconocimiento de antgenos
convencionales (Figura 2). Esta interaccin da lugar a la proliferacin de los linfocitos T
diana y a la liberacin de grandes cantidades de diversas citoquinas y otros efectores por parte
de las clulas inmunes. Los factores ms txicos son la interleucina-2, el interferon gamma y
el factor de necrosis tumoral, que en exceso producen sntomas como nuseas, vmitos
(actividad emtica), fiebre y, en casos extremos, incluso shock, insuficiencia multiorgnica y
muerte (Mandell et al., 2000). Dentro de la familia de los SAgs se encuentra la toxina del
sndrome del shock toxico (TSST-1), las enterotoxinas estafiloccicas (SEs) y las
enterotoxinas estafiloccicas-like (SEls).
Estudios cristalogrficos han demostrado que las estructuras tridimensionales de
TSST-1 y varias SEs y SEls estn conservadas, aunque la interaccin con las molculas MHC
as como la especificidad por TCR es diferente (Fraser y Proft, 2008). Cada molcula est
constituida fundamentalmente por lminas beta, aunque tambin incluye algunas hlices alfa
(Fraser y Proft, 2008, Larkin et al., 2009). La presencia de un bucle disulfuro dentro del
dominio N-terminal en las SEs se ha relacionado con las propiedades emticas de muchas de
estas toxinas (Thomas et al., 2007).
La capacidad emtica es la caracterstica utilizada en la nomenclatura que diferencia
entre SEs y SEls. Slo aqullas enterotoxinas que producen vmitos tras administracin oral
en modelos animales de primates se consideran SEs. Sin embargo, aquellas que no tienen
actividad emtica en dicho modelo o no se han comprobado se consideran SEls. Hasta ahora
(Diciembre 2010) la familia de SEs/SEls incluye 22 miembros, excluyendo variantes

10

1. Introduccin

moleculares: i) las clsicas SEA, SEB, SEC (con las variantes SEC1, SEC2 y SEC3, SEC
ovina y SEC bovina), SED y SEE; ii) y los nuevos tipos de SEs (SEG, SEH, SEI, SER, SES,
SET) y SEls (SElJ, SElK, SElL, SElM, SElN, SElO, SElP, SElQ, SElU, SElU2, SElV)
(Jarraud et al., 2001; Letertre et al., 2003; Munson et al., 1998; Omoe et al., 2005a; Ono et
al., 2008; Orwin et al., 2001; Orwin et al., 2002; Orwin et al., 2003; Su y Wong, 1995;
Thomas et al., 2006; Zhang et al., 1998). TSST-1 que fue inicialmente denominada SEF,
carece de actividad emtica (Bergdoll et al., 1981; Reuiser et al., 1983).

Antgeno
convencional

Superantigeno

Antgeno
convencional
Superantigeno

Clase II MHC

Clula presentadora
de antgenos
Pptido de un
antgeno
convencional

Lisosoma

Clase II
MHC

Superantigeno

TCR TCR

Linfocito T
colaborador

Figura 2. Modo de unin de un superantgeno y de un antgeno convencional a molculas


del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (Class II MHC) de una clula
presentadora de antgenos y al receptor de un linfocito T colaborador (TCR). A diferencia de
los antgenos convencionales, los superantgenos se unen a la regin V de TCR, que est fuera del
lugar de unin del antgeno convencional.

Entre las enfermedades que producen los SAgs de S. aureus destaca el sndrome del
shock txico y las intoxicaciones alimentarias. El sndrome del shock txico (TSS) cursa
con fiebre, hipotensin, erupciones cutneas, inflamacin, disfuncin multiorgnica e incluso
muerte. En el caso del sndrome del shock txico menstrual, TSST-1 es la nica toxina
responsable, ya que es la nica capaz de atravesar las mucosa vaginal (Fraser y Proft, 2008).
En los casos de TSS no menstrual adems de TSST-1, otras SEs (SEA, SEB y SEC) pueden
producir la enfermedad (Thomas et al., 2007). La intoxicacin alimentaria resulta del
consumo de alimentos en los que S. aureus se ha multiplicado y ha producido enterotoxinas
(SEs). Sus sntomas incluyen nuseas, vmitos, dolor abdominal y diarrea tras un periodo
corto de incubacin (aproximadamente 4 horas tras la ingestin de los alimentos
contaminados) (Ortega et al., 2010). Otras enfermedades que se han relacionado con este tipo
de SAgs incluyen artritis, dermatitis atpica, enfermedad intestinal inflamatoria,
11

1. Introduccin

enfermedad vascular del colgeno, enfermedad de Kawasaki y enfermedad autoinmune


(Thomas et al., 2007; Larkin et al., 2009).
Los genes que codifican SAgs de S. aureus se localizan en elementos genticos
mviles (mobile genetic elements, MGEs), o se encuentran prximos a los mismos. Entre
ellos se incluyen plsmidos, profagos, islas de patogenicidad (Staphylococcus aureus
pathogenicity islands, SaPIs), islas genmicas (vSa) y casetes cromosmicos estafiloccicos
(Staphylococcal cassette chromosome, SCCs) (Tabla 3). La movilidad de estos elementos
contribuye a la dispersin de los factores de virulencia asociados y a su evolucin, mejorando
la habilidad del patgeno para producir enfermedad.
Tabla 3. Elementos genticos que codifican SAgs en Staphylococcus aureus.
Toxina/Gen Elemento gentico
Referencia
TSST-1/tst
SaPI1, SaPI2, SaPIbov1, SaPIm1, SaPIn1,
Novick y Subedi, 2007c
SEA/sea
252B, Mu50a, NM3, Sa3ms, Sa3mw Goerke et al., 2009
SEB/seb
pZA10; SaPI3
Altboum et al., 1985; Novick y Subedi, 2007c
SEC/sec
SaPIbov1, SaPIn1, SaPIm1, SaPImw2
Novick y Subedi, 2007c
SED/sed
pIB485-like
Bayles y Iandolo, 1989; Omoe et al., 2003
Couch et al., 1988
SEE/see
Sab
SEG/seg
egc1 (vSa I), egc2 (vSa III), egc3, egc4
Baba et al., 2008; Collery et al., 2009;
Thomas et al., 2006
SEH/seh
MGEmw2/mssa476 seh/seo
Noto y Archer, 2006
SEI/sei
egc1 (vSa I), egc2 (vSa III), egc3
Baba et al., 2008; Collery et al., 2009
SElJ/selj
pIB485-like, pF5
Zhang et al., 1998; Omoe et al., 2003
SElK/selk
Sa3ms, Sa3mw
Goerke et al., 2009;
SaPI1, SaPI3, SaPI5, SaPIbov1
Novick y Subedi, 2007c
a
SElL /sell
SaPIbov1, SaPIn1, SaPIm1, SaPImw2
Novick y Subedi, 2007c
SElM/selm
egc1 (vSa I), egc2 (vSa III)
Baba et al., 2008
SElN/seln
egc1 (vSa I), egc2 (vSa III), egc3, egc4
Baba et al., 2008; Collery et al., 2009;
Thomas et al., 2006
SElO/selo
egc1 (vSa I), egc2 (vSa III), egc3, egc4,
Baba et al., 2008; Collery et al., 2009;
MGEmw2/mssa476 seh/seo
Thomas et al., 2006; Noto y Archer, 2006
Mu3A, N315
Goerke et al., 2009
SElPa/selp
SElQ/selq
Sa3ms, Sa3mw, SaPI1, SaPI3, SaPI5
Goerke et al., 2009; Yarwood et al., 2002;
Novick y Subedi, 2007c
SER/ser
pIB485-like, pF5
Zhang et al., 1998; Omoe et al., 2003
SES/ses
pF5
Ono et al., 2008
SET/set
pF5
Ono et al., 2008
SElU/selu
egc2 (vSa III), egc3
Baba et al., 2008; Collery et al., 2009
SElU2/selu2 egc4
Thomas et al., 2006
SElV/selv
egc4
Thomas et al., 2006
a

Actividad emtica demostrada en conejos (SElL; Orwin et al., 2003) o en el insectvoro Suncus murinus
(SElP; Omoe et al., 2005a) pero no en modelo de primates. bLocalizacin hipottica en un profago (Couch et
al., 1988). cRevisin.

Entre los SAgs de codificacin plasmdica se incluyen SEs y SEls como SEB, SED,
SElJ, SER, SET y SES. El gen seb se localiza en plsmidos como el pZA10 (Altboum et al.,
1985), aunque tambin se ha descrito en SaPIs. Los genes de las otras toxinas se encuentran
en una familia de plsmidos relacionados que incluyen al inicialmente descrito pIB485

12

1. Introduccin

(Bayles y Iandolo, 1989; Zhang et al., 1998), a sus variantes (pIB485-like, Omoe et al., 2003;
Fueyo et al., 2005a) y al pF5 (Ono et al., 2008).
Los genes de las toxinas SEA, SEP, SEK y SEQ se localizan en profagos de la familia
Siphoviridae dentro del subgrupo que tiene la integrasa de tipo Sa3. Estos profagos suelen
incluir adems genes que codifican otros factores de virulencia como chp y sak, para la
produccin de CHIPS y estafiloquinasa, respectivamente (Goerke et al., 2009). La integracin
de este tipo de profagos en el genoma de S. aureus interrumpe el gen de la -hemolisina (hlb)
(Lindsay et al., 2008).

Las SaPIs con genes que codifican SAgs son MGEs ampliamente distribuidos en
S. aureus, tienen un tamao entre 15 a 27 kb y presentan una organizacin muy
conservada, paralela a la de bacterifagos temperados (Figura 3).

attL

attR

SaPI1
attL

attR

SaPI2
attL

attR

SaPI3
attL

attR

SaPI5
attL

attR

attL

attR

SaPIm1/n1
SaPImw2
attL

attR

SaPIbov1
600-800 nt
genes de PTSAgs

genes de la protena iniciadora (helicasa o primasa)

genes de integrasas

gen para resistencia a ampicilina en Escherichia coli

genes de terminasas

genes comunes entre los distintos tipos de SaPIs

otros

Figura 3. Estructura de las SaPIs de Staphylococcus aureus portadoras de genes de SAgs.


Basado en Novick y Subedi (2007).

Las islas genmicas, a diferencia de las SaPIs no proceden de bacterifagos, y se han


relacionado con la presencia de recombinasas (Baba et al., 2008). Se han descrito varios
tipos: vSa, vSa y vSa (Figura 4), que estn presentes en todos los genomas de S. aureus
secuenciados hasta la fecha, y que se diferencian por los factores de virulencia que codifican.
Las islas de los tipos vSa y vSa contienen genes de exotoxinas [staphylococcal exotoxin
(set), ms adelante denominadas superantigen-like exotoxins ( ssl)]. Adems, en vSa hay un
cluster de genes de lipoprotenas (lpl), y en vSa hay genes para la exfoliatina A (eta), la 13

1. Introduccin

hemolisina (hla) y el cluster de las modulinas solubles en fenol (staphylococcal phenolsoluble modulins, PSM). Las islas tipo vSa contienen genes de serin proteasas (spl),
leucotoxinas (lukED), lantibiticos (bsa), el cluster egc (enterotoxin gene cluster) que
contiene diferentes genes de enterotoxinas (Figura 4, apartado 1.3.). Tanto vSa y vSa,
contienen genes que codifican las subunidades de reconocimiento y modificacin del sistema
de restriccin y modificacin (RM) SauI (apartado 1.5.).

tRNA

tRNA

II
tRNA

III

600-800 nt
genes de enterotoxinas

genes para biosntesis de lantibitico

genes del sistema de restriccin-modificacin tipo I SauI

genes de leucotoxinas

genes de serin proteasas

genes comunes entre los distintos tipos de vSa

otros

Figura 4. Estructura de las vSa de Staphylococcus aureus. Basado en Baba et al., 2008.

Se ha sugerido que el cluster egc procede, por duplicacin, de un gen se ancestral,


hiptesis apoyada en el hecho de que la recombinacin gentica entre los componentes de
este cluster es relativamente frecuente, habiendo sido descritas un gran nmero de variantes
(Jarraud et al., 2001; Thomas et al., 2006; Fitzgerald et al., 2001). El primer egc (egc1) fue
descubierto en 2001 y consista en dos genes para SEs (seg y sei), tres para SEls (selm, seln y
selo), y dos pseudogenes (ent1 y ent2) (Jarraud et al., 2001; Letertre et al., 2003, Monday
et al., 2001). Ms adelante se describi una variante (egc2 egc-like), con el gen selu que se
haba generado por la fusin de los dos pseudogenes. Variaciones allicas de los genes de
egc2 dieron lugar a egc3 (Collery et al., 2009; Holden et al., 2004; Letertre et al., 2003),
mientras que en egc4 hay una nueva variante de selu (selu2) y un nuevo gen (selv) resultante
de la recombinacin entre selm y sei (Thomas et al., 2006). Tambin se han descrito clusters
egc incompletos, as como variantes que contienen secuencias de insercin (Omoe et al.,
2005b; Thomas et al., 2006).
El gen que codifica SEH (seh) se ha encontrado junto con un selo truncado en la
proximidad de elementos SCC presentes en los genomas secuenciados de las cepas MSSA476
y MW2 de S. aureus (Figura 5, Noto y Archer, 2006). En el caso de MW2 el elemento SCC
confiere resistencia a meticilina (SCCmec), y se ha sugerido que la asociacin con seh ha
podido estabilizar su integracin, ya que este SCCmec es incapaz de escindirse (Noto y
Archer, 2006).

1.3.4. Bacteriocinas
Las bacteriocinas, en general, son pptidos antimicrobianos que inhiben el
crecimiento de cepas y especies de bacterias diferentes pero relacionadas con la bacteria
14

1. Introduccin

productora. El estudio de las bacteriocinas se ha centrado en especies de inters en


microbiologa alimentaria, aunque su produccin tambin se ha demostrado en patgenos
como S. aureus. En especies patgenas las bacteriocinas aportan a las cepas productoras
ventajas tanto en la colonizacin de la mucosa nasal de portadores sanos como en procesos
infecciosos mixtos (poliinfecciones), y se ha demostrado que tambin han favorecido la
dispersin de las cepas de S. aureus de adquisicin comunitaria (Daly et al., 2010). En S.
aureus destaca la produccin de lantibiotico por el cluster bsa presente en el tipo II de la isla
vSa (Figura 4) (Baba et al., 2008).

attL

attR

attL

genes de enterotoxinas
genes de recombinasas
genes de resistencia

attR

genes de un sistema de restriccin-modificacin

otros

600-800 nt

gen de una transposasa


secuencias de insercin

Figura 5. Comparacin de las dos formas allicas de elementos SCC asociados con seh.
Basado en Noto y Archer (2006).

1.3.5. Regulacin
La expresin de los factores de virulencia en S. aureus esta controlada por las
condiciones ambientales (pH y concentracin de CO2) y por la concentracin de pptidos
autoinductores dependientes de la densidad bacteriana. Cada una de estas seales controla
diferentes sistemas reguladores, que incluyen sistemas reguladores de dos componentes como
el agr, el sistema accesorio regulador estafiloccico (staphylococcal accessory regulator,
sarA) y el factor sigma B (B) (Novick et al., 2003; Bronner et al., 2004).
El sistema regulador de S. aureus que ha sido ms estudiado es el codificado por el
opern agr. Este sistema tiene una accin dual ya que reprime la transcripcin de genes que
codifican protenas asociadas a la pared (protena A, coagulasa, protenas de unin a
fibronectina) y activa la transcripcin de genes de varias exoprotenas (hemolisinas, TSST-1,
enterotoxinas, exfoliatinas, leucotoxinas) durante la fase estacionaria de crecimiento (Bronner
et al., 2004). El opern agr est compuesto por cinco genes (agrA, agrC, agrD, agrB, hld) y
produce dos transcritos divergentes, denominados RNAII y RNAIII. RNAII codifica los
distintos componentes del sistema, mientras que RNAIII es el efector del locus agr y tambin
codifica la -hemolisina (Bronner et al., 2004; George et al., 2007). Variaciones en los genes
agrC, agrD y agrB determinan los cuatros tipos de sistemas agr existentes (comnmente
denominados agrI, agrII, agrIII y agrIV) (Novick et al., 2003), aunque se han descrito tipos
mixtos (Goerke et al., 2005; Robinson et al., 2006). Ciertas enfermedades, resistencias y
factores de virulencia se han relacionado con la presencia de un determinado sistema agr.
15

1. Introduccin

As, el sistema agrIII se asocia con cepas productoras de TSST-1 (Ji et al., 1997) y con
aislamientos LukPV positivos causantes de neumona necrotizante (Gillet et al., 2002). El
tipo agrIV se asocia con cepas productoras de exfoliatinas (Jarraud et al., 2000; McDowell et
al., 2001) y los tipos agrI y agrII con cepas que muestran susceptibilidad reducida a
vancomicina (Sakoulas et al., 2002).
Otros sistemas reguladores de dos componentes [como el regulador de la expresin de
exoprotenas (S. aureus exoprotein expression, sae), la respuesta respiratoria estafiloccica
(Staphylococcal respiratory response, srrAB) y el locus relacionado a autolisis (Autolysisrelated locus, ArlSR)] tambin actan a nivel de la transcripcin de genes de virulencia
(Bronner et al., 2004).
El sistema sarA es otro regulador que influye en la expresin de exoprotenas
(hemolisinas, TSST-1, enterotoxinas, leucotoxinas) y protenas de superficie celular (protena
A, protenas de unin a fibronectina), adems de incrementar la expresin de los transcritos
del sistema agr (Novick et al., 2003; Bronner et al., 2004). Y por ltimo, B regula la
expresin de genes conservados y de genes involucrados en respuestas al estrs (Bronner et
al., 2004).

1. 4. Resistencia a antimicrobianos
1.4.1. Antecedentes histricos
En la era pre-antibitica la mortalidad de pacientes con bacteriemia por S. aureus se
situaba entre el 70-80%. Con el descubrimiento y aplicacin teraputica de las primeras
penicilinas, las infecciones estafiloccicas pudieron ser controladas. Sin embargo, poco
despus Spink y Ferris (1945) describieron el primer aislamiento de una cepa resistente a
penicilina por produccin de una -lactamasa (apartado 1.4.2.1.). Dos dcadas despus, ms
del 80% de las cepas intrahospitalarias y procedentes de la comunidad eran ya resistentes a
penicilina y actualmente, lo son ms del 95% (Mandell et al., 2000). En el ao 1959 se
introdujo en la prctica clnica la meticilina, una penicilina semisinttica diseada para
combatir cepas de S. aureus productoras de -lactamasas y, posteriormente, otras penicilinas
semisintticas que escapaban tambin a la inactivacin, como la oxacilina y la dicloxacilina.
Al igual que anteriormente, al poco tiempo de su introduccin comenzaron a aparecer cepas
resistentes a los nuevos agentes, las cuales se denominaron cepas MRSA (Jevons, 1961). La
mayora de estas cepas presentaban tambin resistencia a otros antimicrobianos como
eritromicina, tetraciclina, estreptomicina y clindamicina. Las cepas MRSA se extendieron
rpidamente por Europa y Estados Unidos siendo causa de importantes brotes de infeccin
nosocomial, y creando serios problemas en el tratamiento de las infecciones estafiloccicas
(Kluytmans y Struelens, 2009). A partir del ao 1989 empezaron a diagnosticarse infecciones
con cepas MRSA adquiridas en la comunidad por individuos sanos, sin relacin, directa o
indirecta, con instalaciones hospitalarias, lo que plante un nuevo problema de salud pblica
de gran magnitud (Udo et al., 1993). Estas cepas MRSA asociadas a la comunidad son
epidemiolgicamente y genticamente distintas a las nosocomiales, por lo que se conocen
16

1. Introduccin

como CA-MRSA (community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus),


mientras que las hospitalarias se denominan HA-MRSA (healthcare-associated methicillinresistant Staphylococcus aureus) (Patel, 2009).
El aumento de resistencias est relacionado con el consumo inadecuado de agentes
antimicrobianos. Se ha demostrado que existe una correlacin entre el uso de antibiticos en
pacientes no hospitalizados y la resistencia a los mismos, y que la diferente presin selectiva
en cada pas es responsable de las variaciones en las tasas de resistencia entre pases europeos
(Goossens, 2009). En el caso de la meticilina, la prevalencia de MRSA causantes de
bacteriemia es ms alta en pases del sureste de Europa (Figura 6; EARSS, 2008), en los
cuales tambin hay un mayor consumo de antibiticos (Goossens, 2009). Adems, el uso en
veterinaria o como promotores de crecimiento en la cra de animales para consumo humano,
de agentes antimicrobianos utilizados o anlogos a los utilizados en clnica, ha contribuido
tambin al aumento de resistencias (Errecalde, 2004; Collignon et al, 2009).

Figura 6. Distribucin geogrfica del porcentaje de bacteriemias de MRSA durante el ao 2008 en


Europa. LU, Luxemburgo, MT, Malta (EARRS, 2008).

Esta situacin ha puesto de manifiesto la importancia del uso apropiado de los agentes
antimicrobianos, tanto en clnica como en veterinaria y ganadera (Collignon et al, 2009),
adems de la necesidad de contar con nuevos frmacos. Ante este panorama, la industria
farmacutica retom el inters por la investigacin en antimicrobianos, y ms concretamente
en aquellos con actividad frente a bacterias Gram positivas. Durante esta dcada, se han
empezado a comercializar nuevos agentes antimicrobianos contra S. aureus (como linezolid,
tigeciclina y daptomicina), que se sumaron a los glucopptidos (vancomicina y teicoplanina),
y a las estreptograminas (quinupristina-dalfopristina), conformando el actual arsenal
teraputico para el tratamiento de las infecciones por cocos Gram positivos, incluidas las
cepas multirresistentes (Eliopoulos et al., 2009). Sin embargo, ya se han encontrado cepas
resistentes a estos nuevos agentes antimicrobianos, lo que puede dificultar seriamente el
tratamiento de las infecciones por S. aureus en algunos casos, llegando a convertirse en un
17

1. Introduccin

problema de primera magnitud sobre todo cuando se habla de ambientes hospitalarios


(Eliopoulos et al., 2009).

1.4.2. Bases bioqumicas y genticas de la resistencia a antimicrobianos


Los antimicrobianos daan a las bacterias interfiriendo en diferentes procesos
celulares esenciales (Figura 7), lo que puede conllevar a la muerte del microorganismo (si se
trata de un antimicrobiano bactericida) o al cese reversible de su crecimiento (antimicrobiano
bacteriosttico). Las cepas resistentes pueden mantener su crecimiento incluso en presencia
de antibiticos afines (resistencia cruzada). La resistencia a antibiticos puede ser intrnseca
(resistencia innata) o adquirida (mediante mutacin o transferencia gentica horizontal). Esta
ltima juega un papel ms relevante, destacando sobre todo la transferencia gentica
horizontal que, aunque depende de los elementos que controlan la transferencia fsica de
ADN (a travs de transformacin, transduccin o conjugacin) as como de la capacidad de
las clulas para replicar y expresar el ADN exgeno, tiene una prevalencia muy alta en las
poblaciones bacterianas (Barlow, 2009).
En esta seccin nos centraremos en los mecanismos de accin de los agentes
antimicrobianos ms utilizados contra S. aureus, as como del soporte gentico y las
estrategias bioqumicas (Tabla 4) que ha desarrollado esta bacteria para eludir la accin de
dichos agentes.
Sntesis de cidos nucleicos

Sntesis de la pared bacteriana


-lactmicos
Glucopptidos

Quinolonas
Rifamicinas

ADN

Sntesis proteica

THFA
ARNm

Membrana citoplasmtica

50
30

Rutas metablicas
Sulfonamidas

Diaminopirimidinas

Ribosomas

DHFA

Lipopptidos

PABA

50
30

50
30

Aminoglicsidos
Fenicoles
Macrlidos
Lincosamidas
Estreptograminas
Mupirocina
Oxazolidinonas
Tetraciclinas
Glicilciclinas

Figura 7. Dianas en la clula bacteriana de los agentes antimicrobianos ms utilizados contra


Staphylococcus aureus. Basado en Pratt y Cornely (2004).

1.4.2.1. Resistencia a antimicrobianos que inhiben la sntesis de la pared bacteriana


La pared celular protege la integridad anatomofisiolgica de la bacteria y soporta su
gran presin osmtica interna (mayor en las bacterias Gram positivas). Este tipo de
antibiticos necesitan, para ejercer su accin, que la bacteria se halle en fase de crecimiento
activo, y para su accin bactericida requieren que el medio en el que se encuentre sea
isotnico o hipotnico, lo que conlleva la destruccin del microorganismo por lisis osmtica,
cuando la pared celular se pierde o se desestructura (Calvo y Martnez-Martnez, 2009).
18

1. Introduccin

Tabla 4. Determinantes de resistencia a antimicrobianos en Staphylococcus aureus.


Antimicrobianos
Mecanismo de resistencia
Determinante de
resistencia

Localizacina

-lactmicos
Penicilinas
Penicilinas de espectro
extendido

-lactamasa
PBP de baja afinidad (PBP2a)

blaZ
mecA

Tn::P, Tn::C
SCC::C

Precursor de peptidoglicano con


terminal D-Ala-D-Lac

vanA

Tn::P

Adeniltransferasa
Adeniltransferasa
Adeniltransferasa
Acetiltransferasa
Fosfotransferasa
Adeniltransferasa

spc
str
aadE
sat4
aphA-3
aadD

Tn::C
P
Tn::P, Tn::C
Tn::P, Tn::C
Tn::P, Tn::C
P, P::C

Acetiltransferasa y fosfotransferasa

aacA-aphD

Tn::P, Tn::C

Acetiltransferasa
Bomba de expulsin

cat
fexA

P
Tn::P, Tn::C

Metiltransferasa

ermA
ermB
ermC
vatA, vatB
vgaA, vgaB, vgaC
vgbA, vgbB
msrA, msrB
linA/linA

Tn::C
Tn::P
P
P
P
P
P
P

Mutaciones en isoleucil tRNA


sintetasa
Isoleucil tRNA sintetasa insensible

ileS

mupA

P, P::C

Oxazolidinonas

Mutaciones en gen ARNr 23S

Gen ARNr 23S

Fenicoles, estreptograminas A,
lincosamidas, oxazolidinonas

Metiltransferasa del ARNr 23S

cfr

P, P::C

Tetraciclinas y glicilciclinas
Tetraciclina, minociclina

Protena de proteccin ribosomal

Tetraciclina

Bomba de expulsin

Tigeciclina

Bomba de expulsin

tetM
tetO
tetK
tetL
mepA

Tn::C
C
P, P::C
P
C

Glucopptidos
Aminoglucsidos
Espectinomicina
Estreptomicina
Estreptotricina
Neomicina, kanamicina
Amikacina, kanamicina,
neomicina y tobramicina
Amikacina, kanamicina,
gentamicina y tobramicina
Fenicoles
MLS
Macrolidos, lincosamidas,
estreptograminas
Estreptograminas A
Estreptograminas B
Macrolidos
Lincosamidas
Mupirocina

Acetiltransferasa
Bomba de expulsin
Liasa
Bomba de expulsin
Nucleotidiltransferasa

19

1. Introduccin

Tabla 4 (continuacin). Determinantes de resistencia a antimicrobianos en Staphylococcus aureus.


Antimicrobianos
Mecanismo de resistencia
Determinante de
Localizacina
resistencia
Quinolonas

Mutaciones en genes topoisomerasa


IV
Mutaciones en genes ADN girasa
Bomba de expulsin

grlA, grlB

gyrA, gyrB
norA, norB, norC, mepA,
sdrM

C
C

Rifamicinas

Subunidad de ARN polimerasa

rpoB

Diaminopirimidinas

Dihidrofolato reductasa insensible

dfrA, dfrK
dfrB, dfrG

P
C

Sulfonamidas

Dihidropteroato sintetasa insensible

sulA

Biocidas

Bomba de expulsin

qacA, qacB, qacC


norA, norB, norC, mdeA,
mepA, sepA, sdrM,

P
C

C, Cromosoma; P, plsmido; Tn, transposn; SCC, cassette cromosmico estafiloccico; Tn::P, transposn
de localizacin plasmdica; Tn::C, transposn de localizacin cromosmica; P::C, plsmido integrado en el
cromosoma. Basado en Dale et al. (1995), Derbise et al. (1997), Kadlec y Schwarz, (2009a y 2009b), Jensen
y Lyon (2009), Malachowa y De Leo (2010), Roberts (2008), Patel et al. (2009) y Sekiguchi et al. (2005).

-lactmicos
Los -lactmicos constituyen una amplia familia de antibiticos de gran uso en
clnica, que se caracterizan por presentar un anillo -lactmico en su estructura qumica. Este
componente va unido generalmente a un anillo secundario, cuya composicin determina los
distintos grupos de compuesto que incluye esta familia (penicilinas, cefalosporinas,
carbapenemes y monobactmicos) (Calvo y Martnez-Martnez, 2009).
Los antibiticos -lactmicos son agentes bactericidas que inhiben la sntesis de la pared
celular bacteriana, al bloquear la ltima etapa de sntesis del peptidoglucano (la
transpeptidacin). Estos antibiticos se asocian covalentemente a las PBPs (penicillin-binding
proteins), que son los enzimas (transpeptidasas, transglucosilasas y carboxipeptidasas)
encargadas de entrelazar los componentes del peptidoglucano. Los -lactmicos bloquean las
PBPs ya que el anillo -lactmico es un anlogo estructural del sustrato de las mismas (el
residuo acil-D-alanin-D-alanina de las cadenas de peptidoglucano). La afinidad por las
distintas PBPs determina la actividad de los distintos grupos de -lactmicos. Por otro lado,
estos antibiticos tienen efecto autoltico, al activar autolisinas que estn implicadas en la
degradacin del peptidoglucano. La rotura del equilibrio entre la sntesis y degradacin de
este compuesto por accin de los -lactmicos, provoca la muerte celular. En bacterias que
carecen de autolisinas, se detiene el crecimiento (efecto bacteriosttico) pero no son
destruidas (Marn y Gudiol, 2003).
S. aureus ha desarrollado varios mecanismos de resistencia frente a -lactmicos (Tabla 4):
a) Inactivacin enzimtica: Las -lactamasas (penicilinasas) son enzimas que
destruyen por hidrlisis el anillo -lactmico, originando derivados inactivos. Se clasifican
20

1. Introduccin

segn su estructura molecular (Ambler et al., 1991) o en base a caractersticas estructurales y


funcionales (Bush et al., 1995). Las -lactamasas estafiloccicas pertenecen generalmente a
la clase molecular A y al grupo 2a de Bush (Livermore et al., 1995). Esta clase de enzima es
el producto del gen blaZ, el cual est bajo el control de los productos de dos genes
reguladores adyacentes: blaR1 y blaI, que codifican el antirrepresor y el represor,
respectivamente. El opern bla ha sido identificado en transposones de la familia Tn552,
usualmente presentes en plsmidos de 15 a 45 kb (Jensen y Lyon, 2009). Estos enzimas se
inactivan al unirse irreversiblemente a inhibidores de -lactamasas (cido clavulnico,
sulbactam y tazobactam), y no son activas frente a penicilinas de espectro extendido
(meticilina, oxacilina, etc), cefalosporinas, carbapenemes y monobactmicos (Torres et al.,
2000). Sin embargo, se han descrito cepas BORSA (bordeline oxacillin resistant
Staphylococcus aureus) que hiperproducen penicilinasa confiriendo cierta resistencia
[concentracin mnima inhibitoria (CMI) para oxacilina mayor o igual a 4 g/ml] a las
penicilinas de espectro extendido (Jorgensen, 1991).
b) Modificacin de la diana: La resistencia intrnseca a todos los -lactmicos se
debe a la adquisicin del gen mecA, que codifica una PBP accesoria, denominada PBP2a
PBP2, que posee una afinidad reducida por estos antibiticos. El gen mecA est localizado en
el cromosoma formando parte de una familia de islas de patogenicidad, denominada SCCmec
(International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome
Elements, 2009). Se han descrito 8 tipos de elementos SCCmec estructuralmente diferentes
(Figura 8) pero que comparten varias caractersticas: (i) se insertan en el cromosoma en una
localizacin especifica; (ii) contienen el gen mecA dentro de un complejo mec (con o sin los
genes reguladores mecRI y mecI); y (iii) poseen un complejo ccr con uno o ms genes de
recombinasas (ccrAB y/o ccrC) (International Working Group on the Classification of
Staphylococcal Cassette Chromosome Elements, 2009).
Diferencias entre las regiones que flanquean los complejos mec y ccr [conocidas
como junkyard or joining regions (J)] determinan variantes de los SCCmec principales. Se
han descrito dos variantes para los SCCmec tipo I (I y I.2), tipo III (III y IIIA) y tipo V [V
(5C2) y V (5C2&5)], cinco para el tipo II (II, IIb, IIB, IIE y II.4.1.1) y 12 para el tipo IV
[IVa, IVb, IVc, IVc (con Tn4001), IVA, IVE, IVd, IVg, IVh, IVi, IVj y IV (2B&5)]
(International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome
Elements, 2009). Inicialmente, los SCCmec de mayor tamao (tipos I, II y III) se describieron en
HA-MRSA, mientras que los tipos de menor tamao (IV a VII) se hallaron en cepas de
adquisicin comunitaria (CA-MRSA). Pero, ms adelante, ya se encontraron los tipos IV y V en
cepas hospitalarias y tipos I, II y III en CA-MRSA (Deurenberg y Stobberingh, 2009).
Por otro lado, tambin se han descrito cepas MODSA (modified oxacillin resistant
Staphylococcus aureus) que carecen de mecA pero presentan modificaciones en la expresin
o mutaciones en las PBPs, que confieren una resistencia de bajo nivel a penicilinas de
espectro extendido (Jorgensen, 1991).

21

1. Introduccin

SCCmec I (34.3 kb)


clase B
J1
SCCmec II (53.0 kb)

J2

J3
Tn554

pUB110

Clase A
Tn554

SCCmec III (66.9 kb)

Opero n mer

Tn554

pT18 1

Clase A

SCCHg

SCCmec IV (20.9-24.3 kb)


clase B

SCCmec V (28 kb)


Clase C2

SCCmec VI (20.9 kb)


clase B
SCCmec VII (35.9 kb)
Clase C1
10 kb
Tn554

SCCmec VIII (32.2 kb)


Clase A
genes de resistencia

transposones

genes de recombinasas

plsmidos integrados

secuencias de insercin

otros

genes de un sistema de restriccin-modificacin

Figura 8. Estructura bsica de los tipos de SCCmec de Staphylococcus aureus. Basado en


International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome Elements
(2009) y Deurenberg y Stobberingh (2008).

Glucopptidos
Este grupo est integrado por dos antibiticos de uso clnico (vancomicina y
teicoplanina). Actan a nivel de la biosntesis de la pared celular de bacterias en divisin,
inhibiendo la sntesis del peptidoglucano en un estadio previo a los -lactmicos. Los
glucopptidos se unen a los residuos D-alanin-D-alanina del extremo del precursor del
peptidoglucano situado en la membrana plasmtica, evitando la accin de las
glucosiltransferasas y transpeptidasas, y por tanto impidiendo la elongacin de la cadena
(Calvo y Martnez-Martnez, 2009).
En S. aureus se han descrito dos mecanismos de resistencia a glucopptidos:
a) Engrosamiento de la pared celular: La rotura del balance entre sntesis y
degradacin del peptidoglucano por autolisisnas, aumenta el grosor de la pared celular, que
22

1. Introduccin

contiene un nmero mayor de residuos D-alanin-D-alanina, los cuales retienen las molculas
de antibitico, impidiendo su difusin por la pared celular. Numerosos genes tanto
reguladores como de protenas de superficie se han relacionado con este fenotipo (Howden et
al., 2010). Los aislamientos con esta caracterstica se denominan VISA (vancomycin
intermediate Staphylococcus aureus), o hVISA (heterogeneous vancomycin intermediate
Staphylococcus aureus). Las cepas VISA presentan una CMI a vancomicina entre 4 y 8
g/ml, mientras que las hVISA tendran una CMI propia de cepas susceptibles (igual o
inferior a 2 g/ml) pero una proporcin de la poblacin estara dentro del rango para VISA
(Howden et al., 2010). Las primeras cepas de ambos tipos se aislaron en Japn, y
posteriormente en otros pases siendo responsables de fallos teraputicos en el tratamiento de
S. aureus (Howden et al., 2010).
b) Modificacin de la diana: La resistencia de nivel elevado (CMI mayor o igual a
32 g/ml) se debe a la adquisicin a partir de Enterococcus spp. del transposon Tn1546 que
contiene el opern vanA (Tabla 4). Los transposones de la familia Tn1546, contienen
operones vanRS y vanHAXYZ que codifican varios enzimas implicados en la regulacin y
produccin de un precursor de peptidoglucano con residuos D-alanin-D-lactato con baja
afinidad por glucopptidos (Prichon y Courvalin, 2009). La primera cepa clnica de S.
aureus resistente a vancomicina (vancomycin resistant Staphylococcus aureus, VRSA), se
aisl en 2002 de un paciente de Michigan, y posteriormente se aislaron otras cepas VRSA de
EEUU, India e Irn (Prichon y Courvalin, 2009). La prevalencia de VRSA es mucho menor
que los fenotipos VISA y hVISA, que adems han sido detectados en ms pases (Howden et
al., 2010).
1.4.2.2. Resistencia a antimicrobianos que alteran la membrana citoplasmtica
La membrana citoplasmtica es vital para todas las clulas, ya que interviene
activamente en los proceso de difusin y transporte activo, y de esta forma controla la
composicin del medio interno celular. Las sustancias que alteran esta estructura modifican la
permeabilidad, y provocan la salida de iones, elementos esenciales para la vida bacteriana, o
la entrada de otros que a altas concentraciones alteran el metabolismo bacteriano normal. Los
antibiticos que actan en esta estructura son bactericidas, incluso en bacterias en reposo
(Calvo y Martnez-Martnez, 2009).
Lipopptidos
La daptomicina es el primer agente de la clase de lipopptidos cclicos, es de reciente
introduccin en clnica y posee una gran actividad frente a bacterias Gram positivas pero no
es activa frente a las Gram negativas (no atraviesa su pared). Es una gran molcula cclica
peptdica (parte hidroflica) unida a una cadena lateral de acido graso (parte lipoflica). Su
actividad depende de la presencia de calcio, que favorece la unin de la parte lipoflica de la
molcula a la membrana citoplasmtica. Varias molculas de daptomicina se insertan en la
membrana tras una serie de cambios conformacionales, formando canales que producen la

23

1. Introduccin

salida de iones potasio al exterior, provocando una rpida despolarizacin de la membrana


con alteracin del potencial elctrico. Se cree que este fenmeno interfiere en la sntesis de
macromolculas, ya que como consecuencia de la perdida de potasio, se produce un bloqueo
de la sntesis de proteica y de cidos nucleicos, que provoca la muerte bacteriana. Tiene una
potente actividad bactericida con efecto postantibitico (Straus y Hancock, 2006; Hernndez
Mart el al., 2007; Calvo y Martnez-Martnez, 2009).
El mecanismo de resistencia es multifactorial, existiendo una correlacin con
resistencia intermedia a vancomicina. Mutaciones cromosmicas en genes que influencian el
contenido de fosfolpidos de la membrana celular afectan a la sensibilidad a este antibitico
(Jensen y Lyon, 2009).
1.4.2.3. Resistencia a antimicrobianos que inhiben la sntesis proteica
La sntesis proteica es uno de los procesos ms frecuentemente afectados por la
accin de los antimicrobianos, y su inhibicin selectiva es posible gracias a las diferencias
estructurales entre los ribosomas bacterianos [constituidos por las subunidades 30S, formadas
por ARNr 16S y protenas S (small) y 50S, formadas por ARNr 5S, ARNr 23S y protenas L
(large)], y eucariotas. La mayora de los antibiticos de este grupo tiene actividad
bacteriosttica, aunque los aminoglucsidos se comportan como bactericidas.
Aminoglucsidos
Los aminoglucsidos aminoglicsidos fueron introducidos en clnica en 1943, son
importantes agentes antimicrobianos, generalmente utilizados en combinacin con
glucopptidos y -lactmicos (Gold y Pillai, 2009). Su estructura qumica se compone de
aminoazcares unidos por enlaces glucosdicos a un alcohol cclico hexagonal con grupos
amino (aminociclitol). Se clasifican en dos grandes grupos segn que el componente
aminociclitol sea la estreptidina (estreptomicina) o la desoxiestreptamina (ej. amikacina,
kanamicina, neomicina, gentamicina, tobramicina), siendo la espectinomicina un compuesto
peculiar sin componente aminoglucsido (slo compuesta por aminociclitol).
Su diana primaria de actuacin son los ribosomas, pero tambin alteran la
permeabilidad de la membrana plasmtica al ingresar en la clula (Torres et al., 2000). Se
unen de manera irreversible a protenas S y al ARNr 16S de la subunidad 30S del ribosoma
bacteriano, bloqueando la actividad normal del complejo de iniciacin, impidiendo el inicio
de la sntesis proteica y causando tambin una lectura errnea del ARNm (Calvo y MartnezMartnez, 2009).
Los mecanismos defensivos que desarrollan los microorganismos frente a los
aminoglucsidos son de tres tipos: modificacin enzimtica, alteracin de la difusin y
mutaciones ribosmicas que disminuyen la afinidad del antibitico (Palomino y Pachn,
2003). De todos ellos, la modificacin enzimtica es el mecanismo ms frecuente, ya que los
genes que codifican enzimas modificadores de aminoglucsidos suelen encontrarse en
plsmidos y/o transposones, lo que facilita su transferencia entre bacterias. Diversos enzimas

24

1. Introduccin

como acetiltransferasas (AAC, acetilan grupos amino), adeniltransferasas o


nucleotidiltransferasas (AAD, adenilan grupos hidroxilo) y fosfotransferasas (APH, fosforilan
grupos hidroxilo) modifican grupos sustituyentes de las molculas, dando lugar a compuestos
con baja afinidad por el ribosoma bacteriano. En S. aureus la resistencia se debe a:
a) Modificacin de la diana: Mutaciones en los genes que codifican protenas
ribosmicas disminuyen la afinidad por estreptomicina y espectinomicina, pero no por otros
aminoglcosidos (Palomino y Pachn, 2003; Jensen y Lyon, 2009).
b) Inactivacin enzimtica: En S. aureus se han descrito varios enzimas
modificadores de aminoglucsidos (Tabla 4), entre ellos destacan tres por su alta prevalencia
en aislamientos nosocomiales:

AAC(6)-APH(2) (aminoglicsido-6-N-acetiltransferasa/2-O-fosforiltransferasa):
enzima bifuncional codificado por el gen aacA-aphD [ aac(6)-aph(2)] asociado al
transposon Tn4001 (Shaw et al., 1993; Jensen y Lyon, 2009).

ANT(4)-I o AAD(4)(4)-I (aminoglicsido-4-O-nucleotidiltransferasa I): Est


codificado por el gen aadD [tambin denominado ant(4)-Ia aad(4)(4)] asociado
a plsmidos de gran y pequeo tamao (Shaw et al., 1993; Jensen y Lyon, 2009).

APH(3)III (aminoglicsido-3-O-fosforiltransferasa III): Codificado por el gen aphA3 [ aph(3)-IIIa], asociado al transponsn Tn5405, que tambin contiene otros genes
modificadores de aminoglucsidos (Shaw et al., 1993; Jensen y Lyon, 2009).

Fenicoles
El florfenicol, cloranfenicol, y su derivado el tianfenicol, son antibiticos
bacteriostticos con un amplio espectro de actividad. Bloquean la sntesis proteica bacteriana
al unirse reversiblemente a la protena L16 de la subunidad 50S del ribosoma bacteriano,
impidiendo la fijacin del ARNt a la enzima peptidiltransferasa, y por tanto, inhibiendo la
formacin de los enlaces peptdicos en la cadena de elongacin (Calvo y Martnez-Martnez,
2009). Compite con otros antibiticos que se unen a la misma subunidad (macrlidos y
lincosaminas) y por ello no deben asociarse (Torres et al., 2000).
Los mecanismos de resistencia frente a fenicoles son (Tabla 4):
a) Modificacin de la diana: El enzima metiltransferasa codificado por el gen cfr,
metila el ARNr 23S en posicin A2503, disminuyendo la afinidad de la droga por el
ribosoma, confiriendo resistencia a fenicoles as como a otras familias de antibiticos que
actan en la subunidad 50S del ribosoma bacteriano (Jensen y Lyon, 2009).
b) Inactivacin enzimtica: Es el mecanismo ms frecuente, y ocurre a travs de la
accin de cloranfenicol acetiltransferasas (CAT), que acetilan la molcula del antibitico
impidiendo su unin al ribosoma. Los genes que las codifican (cat) en S. aureus se
encuentran en plsmidos de 2.9 a 5.1 kb (pC221, pC223, pC194 y pUB112) (Jensen y Lyon,
2009).
c) Expulsin del antimicrobiano: Mediante un transportador de la superfamilia MFS
(major facilitator superfamily), codificado por el gen fexA que forma parte del transposn
25

1. Introduccin

Tn558 (Hassssan et al., 2007). Este gen, as como cfr, son ms frecuentes en aislamientos
procedentes de animales que en aislamientos humanos (Kehrenberg y Schwarz, 2006).
Macrlidos, lincosaminas y estreptograminas
Los macrlidos, las lincosaminas y las estreptograminas constituyen un grupo de
antibiticos conocido como MLS, que a pesar de tener estructuras qumicas diferentes, se
estudian en conjunto por poseer indicaciones clnicas, mecanismos de accin y mecanismos
de resistencia semejantes. Presentan un efecto bacteriosttico al unirse a la subunidad 50S del
ribosoma bacteriano, inhibiendo la sntesis de protenas, aunque pueden ser bactericidas
dependiendo del microorganismo, la concentracin y el tiempo de exposicin (Torres et al.,
2000).
Los macrlidos se caracterizan por la presencia de un anillo lactnico macrocclico al
que se le unen uno o varios azcares. Dependiendo del nmero de elementos contenidos en el
anillo se clasifican en macrlidos de 14 (ej. eritromicina), 15 (ej. azitromicina) y 16 (ej.
josamicina) tomos de carbono. Se unen de forma reversible al dominio V del centro
peptidiltransferasa, en el ARNr 23S de la subunidad 50S del ribosoma, interfiriendo en la
elongacin de la sntesis proteica (Calvo y Martnez-Martnez, 2009).
Las lincosamidas (lincomicina y su derivado clindamicina) tienen la estructura de un
aminocido unido a un aminoazcar. Inhiben la sntesis proteica al unirse reversiblemente a la
subunidad 50S del ribosoma, en un lugar prximo al de unin de macrlidos o cloranfenicol,
impidiendo la accin de la peptidiltransferasa (Calvo y Martnez-Martnez, 2009).
Las estreptograminas, tambin llamadas sinerginas, tienen una estructura compleja
constituida por una macrolactona (en estreptograminas del grupo A) o un polipptido cclico
(en estreptograminas del grupo B). Ambos compuestos actan sinrgicamente de forma
bactericida (por separado son bacteriostticos), bloqueando la accin de la peptidiltransferasa
en diferentes puntos. Su principal representante es la asociacin quinupristina-dalfopristina.
Las estreptograminas A (dalfopristina) se unen al ARNr 23S, modificando la estructura
terciaria de ciertas protenas ribosmicas, de manera que aumentan su afinidad por las
estreptograminas B (quinupristina) (Calvo y Martnez-Martnez, 2009).
En Staphylococcus la resistencia a antibiticos del grupo MLS, puede ser debida a
varios mecanismos (Tabla 4):
a) Modificacin de la diana: Es el tipo de resistencia ms extendida, consiste en la
6
N -dimetilacin de un residuo de adenina en el ARNr 23S, que produce un cambio
conformacional en el ribosoma, reduciendo su afinidad por el antibitico. Se han identificado
numerosos genes que codifican metilasas del ARNr 23S en distintos gneros bacterianos,
pero los ms frecuentes en estafilococos son ermA, ermB y ermC (Roberts, 2008). Otros
genes erm descritos en S. aureus, pero menos frecuentes, son ermF, ermY y erm33 (Roberts,
2008). Generalmente se consideraba que las metilasas ErmA y ErmC eran ms comunes en
cepas clnicas, mientras que la ErmB era ms comn en aislamientos de animales (Fluit et al.,
2001), pero recientemente sta tambin se ha encontrado con gran frecuencia en aislamientos

26

1. Introduccin

clnicos (Zmantar et al., 2008). Los genes erm se encuentran en transposones (ermA en Tn554
y ermB en Tn551) o en plsmidos multicopia de pequeo tamao (ermC). La expresin de los
genes erm puede ser constitutiva: resistencia cruzada a macrlidos, lincosaminas y
estreptograminas B (fenotipo MLSB); o inducible: por separado slo confiere resistencia a
macrolidos de 14 y 15 tomos, pero la presencia de estos induce el fenotipo MLSB. Este
ltimo tipo de resistencia se debe a un proceso de atenuacin de la traduccin en la expresin
de los genes, pero mutaciones, deleciones o duplicaciones en la regin reguladora hacen que
la expresin pase a ser constitutiva (Werckenthin et al., 2001). Por otro lado, la
metiltransferasa codificada por el gen cfr, confiere resistencia a lincosamidas y
estreptograminas tipo A.
b) Inactivacin enzimtica: Se han descrito varios enzimas que inactivan
macrolidos: esterasas (genes ereA y ereB) y fosfotransferas (gen mphC); estreptograminas A:
acetiltransferasas (genes vatA y vatB); estreptograminas B: liasas (genes vgbA y vgbB); y
lincosamidas: nucleotidiltransferasas (gen linA/linA) (Fluit et al., 2001; Matsuoka y Sasaki,
2004; Roberts, 2008).
c) Expulsin del antimicrobiano: Se han descrito sistemas de transporte activo de
ATPasas del tipo ABC (ATP-binding cassette) que confieren resistencia a macrlidos de 14 y
15 tomos de carbono y estreptograminas tipo B (genes msrA y msrB) o a estreptograminas
tipo A (genes vgaA, vgaB y vgaC) (Hassssan et al., 2007; Kadlec y Schwarz, 2009b).
Mupirocina
La mupirocina (cido pseudomnico A) es un antibitico bactericida obtenido de
especies de Pseudomonas spp., que inhibe competitivamente la enzima isoleucil-ARNt
sintetasa, con lo cual no puede incorporarse el aminocido isoleucina al pptido en formacin
y la sntesis de protenas se interrumpe (Calvo y Martnez-Martnez, 2009). Se usa
fundamentalmente en el tratamiento tpico de infecciones cutneas o para la erradicacin del
estado de portador de S. aureus (McConeghy et al., 2009).
El mecanismo de resistencia a mupirocina en Staphylococcus consiste en la
modificacin de la diana (Tabla 4). La resistencia de bajo nivel (CMI = 8 a 64 g/ml), se
debe a la alteracin de la isoleucil ARNt sintetasa nativa como consecuencia de mutaciones
espontneas en el gen ileS. Es el mecanismo de resistencia ms prevalente en aislamientos
clnicos, y aunque no esta clara su relacin con fallo en la descolonizacin, puede contribuir
al mantenimiento del estado de portador (Patel et al., 2009). La resistencia de alto nivel (CMI
512 g/ml), que teraputicamente implica fallo en la descolonizacin (Patel et al., 2009), se
debe a la adquisicin del gen mupA (o ileS2) que codifica una isoleucil ARNt sintetasa con
reducida afinidad por la mupirocina, la cual presenta slo un 30% de homologa con el
enzima nativo (Patel et al., 2009). Este gen se ha identificado en plsmidos de diferente
tamao en S. aureus, aunque tambin se ha descrito en el cromosoma (Patel et al., 2009).

27

1. Introduccin

Oxazolidinonas
Las oxazolidinonas representan una de las ltimas familias de antimicrobianos
incorporadas a la prctica clnica. Son compuestos obtenidos por sntesis (quimioterpicos),
con una estructura bsica bicclica, la feniloxazolidin-2-ona. El representante en uso es el
linezolid, que est compuesto por un nico enantimero de centro asimtrico en el anillo de
oxazolidinona y acta como bacteriosttico frente a bacterias Gram positivas (Calvo y
Martnez-Martnez, 2009). Las oxazolidinonas inhiben la sntesis proteica e impiden la
formacin del complejo de iniciacin 70S, formado por formilmetionil-ARNt, ARNm,
diversas protenas y las subunidades ribosmicas 30S y 50S. Se fijan a la subunidad
ribosmica 50S, en el centro peptidiltransferasa dentro del ARNr 23S (dominio V),
distorsionando as el punto de unin del formilmetionil-ARNt, y evitando por tanto, la
formacin del complejo de iniciacin (Calvo y Martnez-Martnez, 2009).
La resistencia a linezolid se debe a modificacin de la diana, concretamente a
mutaciones en los genes ARNr 23S que disminuyen la afinidad por la droga. En casi todas las
bacterias, el gen del ARNr 23S se presenta en mltiples copias (5 a 6 en S. aureus). Las cepas
resistentes a linezolid presentan ms de una copia mutada, de hecho se ha observado que a
medida que aumenta el nmero de copias mutadas se incrementa el nivel de resistencia (Meka
y Gold, 2004). Adems, las mutaciones en estos genes confieren resistencia cruzada frente a
otros antibiticos que actan a nivel de la subunidad 50S, como los del grupo MLS y los
fenicoles (Besier et al., 2008). La mutacin ms frecuente asociada con resistencia a linezolid
en varios gneros bacterianos, es la sustitucin G2576T en el centro peptidiltransferasa,
aunque en S. aureus se han descrito otras mutaciones en el dominio V responsables de
resistencia a linezolid como T2500A y G2576T (Meka y Gold, 2004; Besier et al., 2008). Por
otro lado, la metiltransferasa codificada por el gen cfr, descrita en el apartado de resistencia a
fenicoles, tambin confiere resistencia a las oxazolidinonas.
Tetraciclinas y glicilciclinas
Las tetraciclinas son molculas naturales o semisintticas con un ncleo
hidronaftaceno, que contiene cuatro anillos fundidos al que se pueden unir distintos radicales
que darn lugar a las diferentes tetraciclinas (Calvo y Martnez-Martnez, 2009). Penetran en
el citoplasma bacteriano de bacterias Gram positivas mediante sistemas de transporte activo,
y una vez en el citoplasma se unen de forma reversible a la subunidad 30S del ribosoma
(protenas S7, S14 y S19), bloqueando el acceso de los complejos aminoacil-ARNt, e
impidiendo la continuacin de la sntesis proteica (Calvo y Martnez-Martnez, 2009). El
compuesto ms usado en clnica es la doxiciclina, aunque tambin estn disponibles otras
tetraciclinas (minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina) (Gold y Pillai, 2009).
S. aureus ha desarrollado varios mecanismos de resistencia a tetraciclinas (Tabla 4):
a) Modificacin de la diana: La resistencia a tetraciclinas (incluyendo la
minociclina) puede deberse a protenas de proteccin ribosomal (asociadas a los genes tetM,
tetO, tetU y tetW en Staphylococcus) (Roberts, 2005). Estas protenas interaccionan con

28

1. Introduccin

protenas del ribosoma, y cambian su conformacin causando una disrupcin alostrica en el


sitio de unin de las tetraciclinas, provocando por tanto la separacin de estos antibiticos del
ribosoma. A continuacin el ribosoma volvera a su conformacin estndar continuando con
la sntesis de protenas. De estos genes el ms frecuente en aislamientos de S. aureus, tanto
clnicos como procedentes de animales, es el gen tetM que se encuentra en transposones de la
familia Tn916 (Jensen y Lyon, 2009).
b) Expulsin del antimicrobiano: La resistencia a tetraciclinas (pero no a
minociclina) tambin puede darse mediante bombas de expulsin dependientes de energa,
concretamente transportadores de la superfamilia MFS, codificados por los genes tetK y tetL
localizados en plsmidos de diverso tamao (Hassssan et al., 2007). Mutaciones que
incrementan la expresin de bombas de expulsin cromosmicas, como Tet38, tambin
median resistencia a tetraciclina (Jensen y Lyon, 2009).
Las glicilciclinas son compuestos sintticos derivados de las tetraciclinas, y por tanto
poseen el mismo mecanismo de accin. Dentro de este grupo est comercializada la
tigeciclina, un derivado de la minociclina, que adems de unirse al ribosoma con una afinidad
5 veces superior no es afectado por los mecanismos de resistencia a tetraciclinas (Calvo y
Martnez-Martnez, 2009). La resistencia a tigeciclina se debe a mutaciones en el gen
regulador de la expresin del gen mepA que codifica un transportador de la familia MATE
(multidrug and toxic compound extrusin) (McAleese et al., 2005).
1.4.2.4. Resistencia a antimicrobianos que alteran la sntesis de cidos nucleicos
La replicacin y la transcripcin del ADN se realizan en varias fases, con la
participacin de diferentes enzimas y sustratos, adems del ADN molde, que constituyen
dianas para la accin de diversos antibiticos. La mayora de antimicrobianos que actan
sobre estos procesos son bactericidas, normalmente independientes de la fase de crecimiento
bacteriano (Calvo y Martnez-Martnez, 2009).
Quinolonas
Las quinolonas constituyen en la actualidad, junto con los -lactmicos, los
antimicrobianos de mayor uso. Se clasifican en generaciones segn su espectro de actividad y
propiedades farmacocinticas, siendo las de tercera (ciprofloxacino, levofloxacino) y cuarta
(moxifloxacino, gemifloxacino) generacin las ms activas frente a bacterias Gram positivas
(Calvo y Martnez-Martnez, 2009).
Estos antimicrobianos ejercen su accin bloqueando las topoisomerasas II (ADN
girasa) y IV. El cromosoma bacteriano est constituido por una doble cadena de ADN ms
larga que la propia bacteria, por lo que se encuentra plegado sobre si mismo en forma
superenrollada. Esta configuracin no es accesible para la realizacin de las funciones de
replicacin y transcripcin, por lo que debe desenrollarse. Las topoisomerasas son las
enzimas encargadas del superenrollamiento y desenrollamiento del ADN, as como del corte,
unin y separacin de las hebras de ADN y de particin del cromosoma a las clulas hijas

29

1. Introduccin

cuando la bacteria se divide (Calvo y Martnez-Martnez, 2009). Las topoisomerasas II y IV,


son enzimas tetramricas compuestas por 2 subunidades A y 2 subunidades B, codificadas
por los genes gyrA y gyrB en el caso de la ADN girasa, y parC y parE (denominados grlA y
grlB en S. aureus) en el caso de la topoisomerasa IV. Estas enzimas se acoplan al ADN,
provocando un corte en las hebras que posteriormente es reparado, quedando de nuevo libres.
Las quinolonas, se unen al ADN roto y a la topoisomerasa formando un complejo ternario
quinolona-ADN-topoisomerasa de forma irreversible, impidiendo que el proceso de la
transcripcin o replicacin continen. Este fenmeno, junto con la activacin de mutaciones
SOS confiere una potente accin bactericida a estos antimicrobianos (Calvo y MartnezMartnez, 2009).
Los mecanismos de resistencia que ha desarrollado S. aureus frente a las quinolonas
son (Tabla 4):
a) Modificacin de la diana: La resistencia se debe a mutaciones en los genes que
codifican la ADN girasa (gyrA y gyrB) y la topoisomerasa IV (grlA y grlB) que impiden la
unin de las quinolonas a los enzimas. El grado de resistencia se relaciona con el nmero y
tipo de mutaciones (Fluit et al., 2001).
b) Expulsin del antimicrobiano: Niveles altos de expresin, debidos a mutaciones
en promotores o en genes reguladores, de transportadores de la superfamilia MFS
(codificados por los genes norA, norB, norC, mepA y sdrM) confieren resistencia a
quinolonas (Hassan et al., 2007).
Rifamicinas
La rifampicina, derivado semisinttico de la rifamicina B, es el antibitico
representativo de este grupo, tiene accin bactericida frente a bacterias Gram positivas, y se
usa como tratamiento oral para la descolonizacin por S. aureus (McConeghy et al., 2009).
Inhibe la sntesis de ARNr y ARNm al bloquear la subunidad del enzima ARN polimerasa
ADN-dependiente bacteriana, codificada por el gen rpoB. La resistencia se debe a
modificacin de la diana, concretamente a mutaciones en el gen rpoB. La tasa de mutacin es
elevada para bacterias como S. aureus y Streptococcus spp., entre otras, por lo que no se usa
en monoterapia y siempre se utiliza asociada a otras drogas (Mandell et al., 2000;
McConeghy et al., 2009).
1.4.2.5. Resistencia a antimicrobianos que bloquean rutas metablicas
A diferencia de las clulas eucariotas, algunas bacterias son incapaces de obtener del
medio elementos esenciales, como aminocidos o bases pricas y pirimidnicas de los
nucletidos. Por ello requieren una ruta de sntesis de folatos, necesarios para la sntesis de
estos compuestos, en la que el primer paso consiste en la formacin de cido dihidropteroico
a partir de una molcula de pteridina y de cido paraaminobenzoico (PABA) reaccin
catalizada por la enzima dihidropteroato sintetasa. En el segundo paso, por adicin de cido
glutmico se forma el cido dihidroflico (cido flico) que, al ser reducido por la enzima

30

1. Introduccin

dihidrofolato reductasa, formar el cido tetrahidroflico (cido folnico) (Calvo y MartnezMartnez, 2009).
Sulfonamidas y diaminopirimidinas
El compuesto base de las sulfonamidas (sulfametoxazol) es la sulfanilamida, cuya
estructura qumica es similar al PABA, por lo que al ser anlogos de ste compiten por la
enzima dihidropteroato sintetasa impidiendo as la formacin del cido dihidropteroico,
precursor del cido flico. Las diaminopirimidinas (trimetoprima y pirimetamina), compiten
por el enzima dihidrofolato reductasa, impidiendo la formacin del cido flico. En clnica se
utiliza el cotrimoxazol (combinacin de trimetoprima y sulfametoxazol en proporcin 1:5), ya
que la sinergia entre sus dos componentes bacteriostticos puede llegar a tener efecto
bactericida (Calvo y Martnez-Martnez, 2009).
Para ambos antimicrobianos la resistencia de S. aureus consiste en la modificacin de
la diana. La resistencia a sulfonamidas se debe a mutaciones cromosmicas en el gen de la
dihidropteroato sintetasa (sulA), que reduce su afinidad por estas drogas (Jensen y Lyon,
2009). La resistencia a diaminopirimidinas es de nivel bajo a intermedio cuando se debe a
mutaciones en el gen cromosmico de la dihidrofolato reductasa (dfrB), y de nivel alto (CMI
> 800 g/ml) cuando la resistencia se debe a una dihidrofolato reductasa con baja afinidad a
trimetoprima de codificacin plasmdica (dfrA, tambin denominado dfrS1, asociado a
Tn4003) (Jensen y Lyon, 2009). En S. aureus se han descrito otros genes que codifican
dihidrofolato reductasas con baja afinidad a trimetoprima: dfrK (asociado a plsmidos) y dfrG
(localizado en el cromosoma formando parte de una secuencia de insercin adquirida de
Enterococcus faecium) (Sekiguchi et al., 2005; Kadlec y Schwarz, 2009a).
1.4.2.6. Resistencia a biocidas
En aislamientos clnicos de S. aureus se han encontrado determinantes de resistencia
frente a biocidas (compuestos de amonio cuaternario), que generalmente son bombas de
expulsin que confieren resistencia cruzada a numerosos antibiticos. Entre ellas destacan
transportadores de la superfamilia MFS (QacA y QacB) y de la familia de pequeas bombas
de flujo multidrogas SMR (small multidrug resistance family), como QacC, que confieren
resistencia a cationes lipoflicos y los genes que los codifican estn asociados a distintos
plsmidos (Jensen y Lyon, 2009). Por otro lado, la expresin elevada de bombas de expulsin
cromosmicas de la familia MFS (NorA, NorB, NorC, MdeA y SdrM), MATE (MepA) y
SMR (SepA), ya sea por mutaciones en las regiones promotoras de sus genes codificantes o
en sus genes reguladores, tambin confiere resistencia a biocidas y a antimicrobianos como
glicilciclinas (MepA), novobiocina y cido fusdico (MdeA), y quinolonas (NorA, NorB,
NorC, MepA y SdrM) (Jensen y Lyon, 2009).

31

1. Introduccin

1. 5. Estructura poblacional
La variacin existente entre cepas de S. aureus se debe a cambios en los tres
componentes que conforman su genoma: el genoma conservado, el variable o flotante y los
MGEs (Lindsay, 2008). El genoma conservado o core, esta relativamente conservado entre
cepas aunque puede tener pequeas variaciones denominadas SNPs (single nucleotide
polymorphisms). El genoma variable (core variable) se corresponde con genes que varan de
acuerdo con los distintos linajes. Los MGEs se mueven de unas cepas a otras y codifican
genes de virulencia o resistencia (Lindsay, 2008). En base a la variacin observada, los
aislamientos de S. aureus se distribuyen en linajes o complejos clonales (CCs). Los
aislamientos procedentes de humanos pertenecen a diez linajes mayoritarios que se han
mantenido estables durante los ltimos 40 aos (Feil et al., 2003; Gomes et al., 2006). La
mayora de los aislamientos clnicos se asignan a cinco de ellos (CC5, CC8, CC22, CC30 y
CC45). La seleccin de estos CCs se debi, en parte, a la interaccin con el hospedador
humano, ya que los aislamientos procedentes de animales pertenecen a linajes diferentes
(Sung y Lindsay, 2007). Adems, los proyectos de secuenciacin de genomas y la utilizacin
de microarrays han demostrado que cientos de genes varan entre CCs y han confirmado la
relativa estabilidad intra-linaje. Este fenmeno se atribuy a la divergencia existentes en el
sistema de RM Sau1 de diferentes linajes. En la mayor parte de los genomas de S. aureus
secuenciados, el sistema de RM de tipo 1 Sau1, consiste en una subunidad enzimtica de
restriccin (codificada por el gen sau1hsdR), dos copias de la subunidad de modificacin
(codificadas por sau1hsdM1 y sau1hsdM2) y dos copias de la subunidad que determina la
especificidad de reconocimiento de secuencia (sau1hsdS1 y sau1hsdS2). Cada pareja de
genes sau1hsdM y sau1hsdS se localiza en una isla genmica (vSa o vSa; apartado
1.3.3.3.) (Waldron y Lindsay, 2006; Lindsay, 2008). Debido a las diferencias existentes entre
las subunidades de reconocimiento de secuencia, el sistema Sau1 limita el intercambio
gentico entre aislamientos de distintos linajes, pero no entre miembros de un mismo linaje
(Waldron y Lindsay, 2006; Lindsay, 2008).
La importancia de la distincin entre linajes de S. aureus radica en que algunos de
ellos han adquirido el casete SCCmec y se han dispersado mundialmente, en hospitales, en la
comunidad o en poblaciones animales, siendo responsables de un elevado nmero de
infecciones cuyo tratamiento se complica a consecuencia de la resistencia a meticilina
(Deurenberg y Stobberingh, 2009).

1.5.1. Tcnicas de tipificacin


Las diferencias existentes entre aislamientos de S. aureus pusieron de manifiesto la
necesidad de poder establecer una subdivisin o diferenciacin intra-especie, por lo que se
desarrollaron diferentes tcnicas de tipificacin. Esta metodologa, aplicada a estudios
epidemiolgicos ha permitido el establecimiento de linajes prevalentes y endmicos frente a
los espordicos y emergentes de S. aureus en una determinada comunidad, pas o regin
geogrfica. Las tcnicas ms utilizadas se basan en i) patrones de bandas, generadas mediante
32

1. Introduccin

digestin con enzimas de restriccin: macrorrestricin-electroforesis en campo pulsante


(pulsed field gel electrophoresis, PFGE) o mediante la reaccin en cadena de la polimerasa
(polymerase chain reaction, PCR): test RM, tipos de SCCmec y tipos de sistema agr, o ii) en
la secuenciacin de uno o ms genes: secuenciacin del gen que codifica la protena A de S.
aureus (gen spa; apartado 1.3.1.) y secuencia de multiples loci (multilocus sequencing
typing, MLST).
La diferenciacin intra-especie, objetivo de los mtodos de tipificacin, tiene una gran
utilidad en la investigacin epidemiolgica de cepas, linajes o clones patgenos para el
hombre, puesto que ayuda a establecer relaciones entre las mismas, como puede ser la
asociacin de diferentes casos clnicos o la determinacin de la fuente de infeccin en un
brote. Adems, la aplicacin de esta metodologa puede proporcionar informacin sobre la
cadena epidemiolgica (rutas de transmisin y reservorios), las posibles medidas de control,
as como datos relevantes acerca de la evolucin del patgeno en el espacio y el tiempo.
Electroforesis en campo pulsante (PFGE)
La tcnica PFGE todava se ha considerado durante mucho tiempo como el marcador
gentico de eleccin (gold standard) para la tipificacin de S. aureus (Cookson et al., 2007).
Esta metodologa, se basa en la generacin de fragmentos de gran tamao, obtenidos al
digerir el DNA intacto de S. aureus (embebido en bloques de agarosa) con la endonucleasa de
restriccin SmaI, de baja frecuencia de corte, seguido de una electroforesis en gel de agarosa
en campo pulsante. Los patrones obtenidos se analizan con un programa informtico
(software) que permite su comparacin en base a ndices de similitud (coeficientes de Dice o
de Jaccard) y su agrupacin en clusters, en base al grado de similitud, utilizando para ello el
anlisis UPGMA; (unweighted pair group matching analysis) que permite, adems,
representar grficamente los resultados mediante dendogramas (Murchan et al., 2003;
Deurenberg y Stobberingh, 2009). Existe un protocolo consenso para su aplicacin que
garantiza su reproducibilidad y buena resolucin (Murchan et al., 2003). Esta tcnica tiene un
alto poder discriminatorio que permite subdividir los aislamientos bacterianos dentro de un
mismo linaje. Y por otro lado, puede ser utilizada con otras aplicaciones, como el clculo del
tamao aproximado del genoma de un aislamiento y la localizacin o mapeo de plsmidos,
transposones y/o genes en los patrones de bandas mediante hibridacin con sondas
especficas. Sin embargo, como en todos los mtodos basados en la generacin de patrones de
bandas, la comparacin de resultados entre distintos laboratorios es difcil, de ah la necesidad
de tcnicas ms objetivas como las basadas en secuenciacin de ADN.
Tipificacin por secuenciacin de mltiples loci (MLST)
La tcnica MLST se basa en la secuenciacin y posterior anlisis de fragmentos de
aproximadamente 500 pb de siete genes conservados que presentan variaciones entre
aislamientos (arcC, aroE, gplF, gmk, pta, tpi y yquiL). Las diferentes secuencias de cada gen
se denominan alelos, y el perfil allico de cada cepa determina la secuencia tipo (sequence

33

1. Introduccin

type, ST) (Enright et al., 2000). Los clones endmicos, tanto HA-MRSA como CA-MRSA, se
corresponden con un ST concreto que porta un determinado SCCmec (Murchan et al., 2003;
Deurenberg y Stobberingh, 2009). Al igual que en el anlisis de clusters revelados por
macrorrestriccin-PFGE, los STs pueden agruparse segn el nmero de alelos que tienen en
comn, lo que permite diferenciar distintos linajes. Generalmente, se considera que los STs
que comparten 5 o ms alelos pertenecen al mismo CC. El ST con mayor nmero de variantes
en un solo alelo (single locus variant, SLV) se considera el antecesor del grupo y su nmero
se corresponde con el asignado al CC. Adems, un SLV o un ST con variaciones en dos
alelos (double locus variant, DLV) puede ser fundador de un subgrupo si se ha diversificado
lo suficiente como para tener sus propios SLVs y DVLs (Enright et al., 2000; Enright et al.,
2002; Spratt et al., 2004). La estructura clonal de una poblacin de S. aureus puede
determinarse mediante el anlisis eBURST, un algoritmo implementado en el anlisis
BURST (Based Upon Related Sequence Types) (Feil et al., 2004; http://eburst.mlst.net/). Las
secuencias allicas, as como los STs, estn disponibles en una base de datos global
(http://www.mlst.net/) que se actualiza constantemente, permitiendo comparaciones interlaboratorio. Sin embargo, en comparacin con otras tcnicas de tipificacin, la secuenciacin
de varios genes es laboriosa y de alto coste. Adems de que no aporta datos sobre la
heterogeneidad dentro de cada ST.
Secuenciacin del gen de la protena A (spa)
La tcnica spa-typing se basa en la secuenciacin de la regin polimrfica X del gen
que codifica para la protena A de S. aureus (apartado 1.3.1.). El anlisis del nmero de
repeticiones y su variabilidad permite identificar distintos tipos (spa tipos) (Frenay et al.,
1996). Para la designacin de los tipos spa se usan dos sistemas de nomenclatura, lo que
dificulta la comparacin de resultados publicados (Koreen et al., 2004 ; Harmsen et al.,
2003). El ms utilizado est disponible online en la base de datos de SpaServer
(http://www.spaserver.ridom.de), sincronizada con el programa informtico Ridom
StaphType. El anlisis BURP (Based Upon Repeat Pattern) ha demostrado que existe una
elevada correlacin entre los resultados obtenidos con las tcnicas de tipificacin
macrorrestriccin-PFGE, MLST y spa (Cookson et al., 2007; Hallin et al., 2007b), siendo la
tipificacin spa ms simple que los PFGE y MLST, y presentando mayor poder
discriminatorio que este ltimo (varios tipos spa pueden corresponderse con un mismo ST,
pero siempre dentro del mismo CC) (Enright et al., 2002; Robinson y Enright, 2004).
Generalmente presenta una gran concordancia con el CC, aunque se han descrito excepciones
en las que mismos tipos spa pertenecen a CCs diferentes, o aislamientos de un mismo grupo
contenan tipos spa no relacionados (Koreen et al., 2004; von Eiff et al., 2008).
Test RM
Las divergencias existentes entre linajes en los genes sau1hsdS1 y sau1hsdS2, que
codifican las subunidades de reconocimiento de secuencia del sistema Sau1, han permitido

34

1. Introduccin

desarrollar una tcnica basada en la reaccin en cadena de la polimerasa que distingue los
linajes HA-MRSA ms frecuentes (CC1, CC5, CC8/239, CC22, CC30/ST36, CC45)
(Waldron y Lindsay, 2006; Cockfield et al., 2007). Esta tcnica, aunque es menos
discriminatoria que las basadas en secuenciacin, es ms rpida y tiene menor coste,
aportando una primera aproximacin a la estructura clonal de una poblacin de S. aureus
antes del uso, si compensa, de tcnicas mas laboriosas.
Tipificacin del SCCmec
Los clones MRSA se caracterizan por poseer un determinado SCCmec, por lo que se
han desarrollado numerosas tcnicas basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa para
la distincin de estos casetes. Estas tcnicas basadas en diferencias estructurales, permiten
diferenciar los tipos principales (ej. Zhang et al., 2005; Milheirio et al., 2007a) o ciertos
subtipos (ej. deteccin de subtipos del SCCmec IV en Milheirio et al., 2007b), pero ninguna
incluye todas las variantes posibles, por lo que a veces se deben aplicar varias metodologas
para la determinacin de los SCCmec de una poblacin MRSA. En la pgina web
http://www.staphylococcus.net, se muestra un compendio de las metodologas basadas en
PCR para una clasificacin exhaustiva de los SCCmec.
Tipificacin del sistema agr
El sistema regulador codificado por el opern agr modula la expresin de genes de
virulencia en S. aureus (apartado 1.3.5.). Existen cuatro variantes de este sistema (agrI,
agrII, agrIII y agrIV) mutuamente excluyentes, ya que cada uno inhibe la actividad
regulatoria de los otros. Se ha sugerido que esta interferencia en la expresin de genes de
virulencia entre grupos agr sirve como mecanismo de aislamiento de poblaciones y
subdivisin de especies (Novick et al., 2003; Robinson et al., 2006). De hecho, existe una
gran correlacin entre tipo agr y linaje, por lo que se ha propuesto que en la evolucin de S.
aureus primero hubo una diferenciacin en bases a grupos agr seguida de la diversificacin
de linajes (Novick et al., 2003; Wright et al., 2005). Sin embargo, se han descrito excepciones
de linajes con aislamientos pertenecientes a distintos grupos agr (Robinson et al., 2006;
Wright et al., 2005). De hecho, se ha demostrado que existen fenmenos de recombinacin de
tipos agr entre linajes (Robinson et al., 2006). Por lo que se ha sugerido que, ya que este
sistema de regulacin acta sobre la expresin de varios genes de virulencia, la
recombinacin puede proporcionar nuevos y ventajosos patrones de expresin de los mismos
beneficiando a la bacteria. A pesar de este fenmeno, el grupo agr suele ser una caracterstica
relativamente estable de cada CC, por lo que se utiliza junto con otras tcnicas para la
determinacin y caracterizacin de linajes.

1.5.2. Evolucin de los linajes de S. aureus


En 1961, dos aos despus de la introduccin de la meticilina, se describi en
Inglaterra el primer aislamiento MRSA (Jevons, 1961). En los aos siguientes las cepas
35

1. Introduccin

MRSA se extendieron por Europa, y en la dcada de los 70s se dispersaron mundialmente,


llegando a pases como Australia, Japn y EEUU. Actualmente, las cepas HA-MRSA son la
causa ms frecuente de infecciones nosocomiales (Grundmann et al., 2006). El xito de estas
cepas se asocia a la diseminacin de un nmero limitado de clones que adquirieron el
SCCmec, definindose un clon como un grupo de cepas aisladas en uno o ms pases que
poseen el mismo ST y tipo de SCCmec (Tabla 5). La primera teora sobre la evolucin de los
HA-MRSA, sugera que todos ellos procedan de un nico antecesor MSSA que haba
adquirido el SCCmec (Kreiswirth et al., 1993). Sin embargo, la teora ms avalada (teora
multi-clon) acepta la repetida introduccin de distintos tipos de SCCmec en diferentes linajes
(Deurenberg y Stobberingh, 2009). Esta teora se apoya en el hecho de que los aislamientos
MRSA de un mismo ST pueden portar distintos SCCmec, y viceversa. Por otro lado, la
distribucin de clones HA-MRSA en los diferentes pases y hospitales ha demostrado ser
cambiante a lo largo del tiempo, sustituyndose unos clones por otros. Por ejemplo, durante
los aos 80-90 el clon MRSA ms prevalente en Espaa fue el denominado clon Ibrico
(ST247 SCCmec I), que fue sustituido por el clon ST36 SCCmec II entre 1998 y 2002 (PerezRoth et al., 2004), y posteriormente por ST125 SCCmec IV (Vindel et al., 2009). Aunque
actualmente los clones prevalentes en Espaa son el Peditrico (ST5, SCCmec IV) y el
EMRSA-15 (CC22/ST22 SCCmec IV) (Manzur et al., 2010; Montesinos et al., 2010).
Los clones MRSA no slo se localizan en hospitales, sino que tambin se han
encontrado en la comunidad. Las cepas CA-MRSA, aunque presentan menos resistencias a
antimicrobianos que las clsicas HA-MRSA son ms virulentas, afectando a personas sin
factores de riesgo conocidos. Los aislamientos CA-MRSA suelen ser causa de infecciones de
piel y partes blandas del cuerpo, aunque tambin han producidos cuadros graves de neumona
(Patel, 2009). La elevada frecuencia de la leucocidina Panton-Valentine, la -hemolisina y del
elemento gentico mvil que lleva genes implicados en el catabolismo de la arginina
(arginine catabolic mobile element, ACME) se han relacionado con la mayor virulencia de
estos aislamientos (Patel, 2009). Adems, los clones CA-MRSA son fenotpica y
genotpicamente diferentes a los HA-MRSA, y pertenecen a distintos linajes (Tabla 5) que
actualmente estn desplazando a los clsicos HA-MRSA en el ambiente hospitalario, sobre
todo en pases con una alta prevalencia de CA-MRSA (como EEUU y Taiwn) (Deurenberg y
Stobberingh, 2009).
Como ya se coment, actualmente se acepta que los aislamientos MRSA proceden de
aislamientos MSSA por adquisicin de de diferentes tipos de SCCmec. De hecho, existen
aislamientos MSSA pertenecientes a los mismos linajes que los clones MRSA (CC1, CC5,
CC8, CC2, CC30, CC45) (Hallin et al., 2007a; Nulens et al., 2008). Sin embargo, la
poblacin de MSSA es ms heterognea incluyendo otros CCs cuya gentica no proporciona
un entorno estable para la integracin de SCCmec (CC7, CC9, CC12, CC15, CC25, CC51,
CC101) (Katayama et al., 2005). Con todo, ya se han descritos excepciones de clones CC12 y
CC15 con SCCmec (Fossum y Bolkum, 2006; Campanile et al., 2009; Ho et al., 2007).

36

1. Introduccin

Tabla 5. Clones MRSA de distribucin mundial.


CC

Nombre clon

Tipo
SARM

1
5

USA400
Alemania-Sur
Nueva York/Japn (USA100)
Peditrico (USA800)
UK-EMRSA-3
Arcaico
Brasileo/Hngaro
Ibrico
Irlandes-1
UK EMRSA-2/-6 (USA500)
USA300
UK EMRSA-15
Sudoeste Pacifico (USA1100)
UK EMRSA-16 (USA200)
Berln (USA600)
USA1000
Europeo

CA
HA
HA
HA
HA
HA
HA
HA
HA
HA
CA
HA
CA
HA
HA
CA
CA

22
30
36
45
59
80

ST

SCCmec

Tipo spa
ms
frecuente

Distribucin geogrfica

1
228
5
5
5
250
239
247
8
8
8
22
30
36
45
59
80

IV
I
II
IV
I
I
III
I
II
IV
IV
IV
IV
II
IV
IV VII
IV

t127
t001
t001, t002
t001, t002
t001, t002
t008
t037
t008, t051
t008
t008
t008
t032
t012
t018
t004
t216
t044

As, Eu, NA, Oc, SA


Eu
As, Eu, NA, Oc, SA
Af, As, Eu, NA, Oc, SA
As, Eu, SA
Af, Eu, NA, Oc
Af, As, Eu, NA, Oc, SA
As, Eu, NA
Eu, NA, Oc
As, Eu, NA, Oc
As, Eu, NA, Oc
As, Eu, NA, Oc
Af, As, Eu, NA, Oc, SA
Eu, NA, Oc, SA
As, Eu, NA, Oc
As, Eu, NA, Oc
Af, As, Eu

Af, frica; As, Asia; CA, de adquisicin comunitaria; CC, complejo clonal (linaje); Eu, Europa; HA,
nosocomial; NA, Norte-Amrica; Oc, Oceana; SA, Sud-Amrica. Basado en Deurenberg y Stobberingh
(2009).

Cabe destacar, finalmente, que estudios recientes basados en la deteccin de SNPs,


han demostrado la existencia de variaciones dentro de lo que se considerara un mismo clon,
las cuales guardan relacin con el origen geogrfico de los aislamientos (Nbel et al., 2008;
Smyth et al., 2010). En el estudio de Nbel et al. (2008) se determin la existencia de 89
variantes (haplotipos) dentro del clon ST5 en una coleccin de aislamientos de distinto origen
geogrfico. Los haplotipos se organizaban en clados asociados a regiones geogrficas, aunque
existan excepciones debidas a posibles eventos de migracin. Este estudio propuso que ms
que una dispersin global de determinados clones MRSA, la introduccin de elementos
SCCmec en cepas MSSA podra ocurrir con una frecuencia ms alta que la estimada
previamente, lo que complica an ms la epidemiologa y evolucin de S. aureus. Al igual
que el ST5, se determin que el grupo clonal ST239 SCCmec III tambin esta dividido en
haplotipos (28 variantes) distribuidos en clados con una gran correlacin con regiones
geogrficas. Sin embargo, en este caso, se determin la existencia de unas cinco variantes
altamente transmisibles presentes en varios continentes posiblemente expandidas por
fenmenos de migracin (Gray et al., 2011; Smyth et al., 2010).

37

1. Introduccin

38

2.Objetivos

2. Objetivos

2. Objetivos
El trabajo de esta Tesis Doctoral se enmarca en la lnea de investigacin
Epidemiologa molecular de Staphylococcus aureus que desde hace diez aos se desarrolla
en el rea de Microbiologa de la Universidad de Oviedo. El trabajo se centr en la
caracterizacin epidemiolgica y de factores de resistencia y virulencia en varias poblaciones
de S. aureus de distinto origen. S. aureus es un organismo comensal, cuyo hbitat primario en
el hombre y animales es la mucosa nasofarngea, formando parte de la microbiota normal
(estado de portador). Sin embargo, tambin es un importante patgeno responsable de un
amplio espectro de infecciones (localizadas o sistmicas) de origen comunitario y
nosocomial, as como enfermedades mediadas por toxinas. La poblacin de S. aureus es
altamente clonal, siendo determinados linajes los responsables de la mayora de las
infecciones tanto a nivel hospitalario como en la comunidad.
En este trabajo se determin la estructura poblacional de colecciones de S. aureus
procedentes no slo de hospitales y la comunidad, sino tambin de animales y alimentos. Esto
permiti identificar los linajes y clones circulantes en el Principado de Asturias, as como las
variaciones existentes en un determinado clon (ST398) prevalente en ganadera porcina en
Europa. Adems, se ha estudiado la resistencia y establecido sus bases genticas, y se
identificaron potenciales factores de virulencia en los distintos aislamientos.
De acuerdo con lo expuesto, los objetivos generales de esta tesis doctoral son:
Objetivo 1. Identificar los linajes y clones de S. aureus de distinto origen (hospitales,
portadores sanos y relacionados con alimentos) que han estado circulando en el Principado de
Asturias, y sub-tipificar el linaje ST398 de origen animal (Artculos 1, 2, 4, 7, 10 y 11).
Objetivo 2. Identificar determinantes de virulencia en los linajes encontrados en el
Principado de Asturias y en el clon ST398, y establecer su relacin con elementos genticos
mviles (Artculos 1, 3, 5, 7, 8 y 12).
Objetivo 3. Determinar los fenotipos y genotipos de resistencia (prestando especial atencin
al SCCmec) en los linajes encontrados en el Principado de Asturias y en el clon ST398
(Artculos 1, 2, 6, 7, 11 y 12).
Objetivo 4. Caracterizar mediante tcnicas moleculares el plsmido hibrido de virulenciaresistencia pUO-Sa-SED3 (Artculo 8).
Teniendo en cuenta que los distintos objetivos se abordaron en diferentes poblaciones
de S. aureus, la seccin de resultados se dividi en captulos segn el origen de los
aislamientos:

39

2. Objetivos
Capitulo 1: Aislamientos clnicos de S. aureus del Principado de Asturias procedentes del
Hospital Universitario de Asturias y del Hospital Monte Naranco (Artculos 1, 2 y3).
Capitulo 2: Aislamientos de S. aureus del Principado de Asturias procedentes de portadores
sanos sin relacin con el medio hospitalario: estudiantes de biologa de la Universidad de
Oviedo (Artculos 4, 5 y6).
Capitulo 3: Aislamientos de S. aureus del Principado de Asturias procedentes de alimentos,
manipuladores alimentarios y brotes de intoxicacin alimentaria (Artculo 7). En este
captulo tambin se incluye la caracterizacin del plsmido hibrido de resistencia y virulencia
pUO-Sa-SED3 detectado en un aislamiento de alimentos (Artculo 8) y una revisin sobre
enterotoxinas e intoxicaciones alimentarias producidas por S. aureus (Artculo 9).
Capitulo 4: Aislamientos del clon ST398 de S. aureus de Alemania, procedentes
fundamentalmente de animales sanos o enfermos, pero tambin de alimentos y del ambiente
(Artculos 10, 11 y12). Este captulo, se llev a cabo en el marco de una estancia realizada
en el Federal Institut for Risk Assessment (BfR) de Berln, Alemania.

40

3.Resultados

3.1.Capitulo 1
Staphylococcus aureus procedentes de hospitales
del Principado de Asturias

3. Resultados

3.1. Captulo 1: Staphylococcus aureus procedentes de hospitales


Los estafilococos son una de las principales causas de infecciones en humanos, tanto
en el medio hospitalario como en la comunidad. Estos microorganismos son responsables
principalmente de infecciones de la piel y partes blandas del cuerpo, bacteriemia, endocarditis
y neumona, que pueden estar relacionadas con la utilizacin de diferentes tipos de catteres,
prtesis articulares y vasculares, equipos de respiracin asistida y otros dispositivos mdicos.
La mayora de los estudios de S. aureus asociados a infecciones hospitalarias se centran en
cepas MRSA ya que, aunque las MSSA tambin son causa de infecciones nosocomiales, las
primeras estn ligadas a estancias hospitalarias ms largas y a una mayor mortalidad
(Cosgrove et al., 2003). Debido a ello, en Espaa se han realizado varios estudios de
vigilancia de la resistencia a antimicrobianos, as como de la dispersin de clones MRSA en
el ambiente hospitalario (Cuevas et al., 2004; Perez-Roth et al., 2004; Vindel et al., 2006;
Cuevas et al., 2007; Cuevas et al., 2008; Prez-Vzquez et al., 2009; Vindel et al., 2009;
Manzur et al., 2010). Estos estudios demostraron que, aunque la resistencia a meticilinaoxacilina aument considerablemente en el periodo 1986-2006 (de 1.5% a 29.2%), se ha
estabilizado entre 2002 y 2008 (Cuevas et al., 2004; Cuevas et al., 2007; Cuevas et al., 2008;
EARRS, 2008). Por otro lado, el clon Ibrico (ST247-SCCmec I), responsable de la mayora
de los brotes MRSA hospitalarios entre 1985 y 1995, ha disminuido frente a nuevos clones
MRSA, sensibles a un mayor nmero de antibiticos que el Ibrico, especialmente clones
pertenecientes al CC5 (Vindel et al., 2006; Vindel et al., 2009; Prez-Vzquez et al., 2009).
La informacin sobre la situacin de S. aureus en hospitales del Principado de
Asturias (PA) se limitaba a dichos estudios de vigilancia a nivel nacional. Para ampliar dicha
informacin, el primer capitulo de esta Tesis Doctoral se centr en el estudio exhaustivo de S.
aureus procedentes de dos hospitales del Principado de Asturias:

Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA), est ubicado en Oviedo,


pertenece al rea Sanitaria IV, y es el hospital de referencia del Servicio de Salud del
Principado de Asturias (SESPA). Gracias a una colaboracin con el Dr. Mndez, que
fue Jefe del Servicio de Microbiologa del HUCA, y actualmente es Catedrtico
vinculado del Departamento de Biologa Funcional (rea de Microbiologa) de la
Universidad de Oviedo, se analizaron aislamientos de S. aureus que causaron distintas
enfermedades entre finales del 2005 y finales del 2006 en el HUCA.

Hospital Monte Naranco (HMN), tambin ubicado en Oviedo, es un centro de


atencin especializada integrado en el SESPA, dedicado fundamentalmente a
pacientes geritricos. Mediante una colaboracin con el Dr. Vzquez, jefe de Seccin
de los Servicios Bsicos del HMN y profesor titular del Departamento de Biologa
Funcional (rea de Microbiologa) de la Universidad de Oviedo, se pudieron analizar
todos los aislamientos de S. aureus procedentes de casos de bacteriemia durante los
aos 1996 a 2006, junto con una muestra representativa de aislamientos procedentes
de infecciones en heridas quirrgicas del mismo periodo.

41

3. Resultados

Para el estudio de estas poblaciones de S. aureus se aplicaron varias tcnicas de


tipificacin molecular (spa y MLST en ambos casos; SmaI-PFGE en aislamientos del HUCA;
test RM en los del HMN). Adems, mediante amplificacin por PCR, se estudi la resistencia
a antimicrobianos (SCCmec) y la presencia de factores de virulencia. Los oligonucletidos
utilizados en las tcnicas basadas en PCR se muestran en el Anexo I, mientras que los
resultados correspondientes al primer captulo se resumen en las Tablas IIa y IIb del Anexo
II. Los diferentes estudios dieron lugar a tres artculos, dos ya publicados y uno en fase de
preparacin:
Artculo 1: Argudn MA, Mendoza MC, Mndez FJ, Martn MC, Guerra B, Rodicio,
MR. Clonal complexes and diversity of exotoxin gene profiles in methicillin-resistant and
methicillin-susceptible Staphylococcus aureus isolates from patients in a Spanish hospital. J
Clin Microbiol 2009, 47(7): 2097-2105.
Artculo 2: Argudn MA, Mendoza MC, Vzquez F, Guerra B, Rodicio MR.
Molecular typing of Staphylococcus aureus bloodstream isolates from geriatric patients
attended at a long-term care Spanish hospital. J Med Microbiol 2011, 60: 172-179.
Artculo 3: Argudn MA, Mendoza MC, Vzquez F, Rodicio MR. Exotoxin gene
backgrounds of bloodstream and wound Staphylococcus aureus isolates from geriatric
patients attending a long-term care Spanish hospital (en preparacin).

42

3. Resultados

3.1.1. Artculo 1

43

3. Resultados

44

3. Resultados

45

3. Resultados

46

3. Resultados

47

3. Resultados

48

3. Resultados

49

3. Resultados

50

3. Resultados

51

3. Resultados

52

3. Resultados

3.1.2. Artculo 2

53

3. Resultados

54

3. Resultados

55

3. Resultados

56

3. Resultados

57

3. Resultados

58

3. Resultados

59

3. Resultados

60

3. Resultados

3.1.3. Artculo 3

Exotoxin gene backgrounds in bloodstream and wound


Staphylococcus aureus from geriatric patients attending a longterm care Spanish hospital
M. A. Argudn1, M. C. Mendoza1, Fernando Vzquez1,2 and M. R. Rodicio1
Department of Functional Biology. Laboratory of Microbiology. University of Oviedo. Oviedo, Spain1; Monte Naranco
Hospital. Oviedo, Spain2
The exotoxin gene content was established for 62 Staphylococcus aureus isolates causing bloodstream (31)
and wound (31) infections in geriatric patients attending a long-term care Spanish hospital during 1996 to 2006.
This was based on PCR-screening of genes encoding five haemolysins, three exfoliatins, three leukotoxins, and 21
pyrogenic toxin superantigens (PTSAgs), in addition to markers of genomic (Sa) and pathogenicity (SaPIs)
islands. Exotoxin genes were abundant in both bloodstream (11 to 23 genes) and wound (8 to 19 genes) isolates,
and they were arranged in 55 combinations with only two represented in both groups. All isolates were positive
for genes encoding haemolysins (hl; 3 to 5) and PTSAgs (tst, se and sel; 5 to 14), while exfoliatin (et) and
leukotoxins (luk) genes appeared in 98.4% and 51.6% of the isolates, respectively. The hlg, lukPV, tst, sec and
selu genes were significantly more frequent in bloodstream than in wound isolates, while hlg-variant, sea, seb, see
and selk-selq were so in wound isolates (P < 0.05). Distinctive exotoxin-gene combinations could be potentially
associated with specific mobile genetic elements (MGEs), including genomic islands: lukED, egc1 (seg, seln, sei,
selm, selo) and egc2 (seg, seln, selu, sei, selm, selo); pathogenicity islands: etd, seb, sec, sell, selq, selk and tst;
bacteriophages: eta, lukPV, sea, selp, selk, selq and see; and plasmids: sed, selj, ser, ses, set. The abundance of
exotoxin genes and variety of arrangements shown by S. aureus from geriatric patients could play a role in the
adaptation of the pathogen.
Keywords: Staphylococcus aureus, bacteraemia, wound infection, exotoxin genes, lukPV, tst, egc cluster, se genes,
geriatric patients.
INTRODUCTION
Staphylococcus aureus has long been recognized as
an important human pathogen causing disease both in
hospitals and the community. The relative importance of
host factors versus bacterial virulence determinants in the
outcome of the disease is not well known, but it is
accepted that bacterial components and products,
including the capsule, surface-associated adhesins,
secreted proteins and exotoxins play a role in the process
(Ferry et al., 2005). The vast majority of S. aureus
isolates produce cytotoxins, such as haemolysins
(encoded by hl genes), as well as enzymes whose main
function is to convert local host tissues into nutrients
required for bacterial growth, and to promote spreading
of the pathogen through the human body. Some isolates
also secrete other toxins, like bi-component leukotoxins
(LukS-LukF, encoded by luk genes) (Kaneco and Kamio,
2004), exfoliatins (ET, et genes) (Nishifuji et al., 2008),
toxic shock syndrome toxin (TSST-1, tst gene),
enterotoxins (SEs, se genes), and enterotoxin-like toxins
(SEls; sel genes), with TSST-1, SEs and SEls belonging
to the pyrogenic toxin superantigens (PTSAgs) (Larkin et
al., 2009; Argudn et al., 2010). Exotoxin encoding genes
are variably represented in S. aureus isolates, and most
are carried by mobile genetic elements, including
genomic islands (Sa), pathogenicity islands (SaPIs),
prophages and plasmids (Novick and Subedi, 2007; Baba
et al., 2008; Ono et al., 2008; Goerke et al., 2009).
Specific exotoxins appear to be responsible for some
syndromes caused by S. aureus. For instance, scalded

skin syndrome has been associated with ETA and ETB


(Nishifuji et al., 2008); toxic-shock syndrome with
TSST-1; SEB and SEC (Dinges et al., 2000); food
poisoning with SEA (Dinges et al., 2000); hemolytic
pneumonia and skin and soft tissue infections with
LukPV (Lina et al., 1999); and allergic syndromes,
including asthma, chronic rhinitis and dermatitis with
SEB (Bachert et al., 2008). However, other S. aureus
diseases are probably due to the cumulative effects of
multiple virulence factors, and the precise contribution of
different exotoxins to clinical presentation remains
largely unknown (Peacock et al., 2002; Becker et al.,
2003). To address this question, a better knowledge of
the exotoxin gene content of S. aureus from different
sources and associated with different types of infection is
required. In the present work, we have compared the
exotoxin gene profiles of S. aureus cultured from
bloodstream and infected wounds of geriatric patients
attending a long-term care Spanish hospital during 1996
to 2006 (Argudn et al., 2011a). The association of
individual genes and gene combinations with known
mobile genetic elements (MGEs) was inferred, and their
distribution between MRSA (methicillin-resistant S.
aureus) and MSSA (methicillin-sensitive S. aureus), and
between clonal complexes (CCs) was established.
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains. Sixty two S. aureus isolates,
collected in the Monte Naranco Hospital (MNH) over the
1996 to 2006 period (Argudn et al., 2011a) were

61

3. Resultados
Table 1. Distribution of exotoxin genes, and SaPIs and Sa markers, among MRSA and MSSA isolates recovered
from blood and wound infections affecting geriatric patients (1996-2006).

Gene

Total
isolates
n (%)

Total Bisolates
n (%)

Total Wisolates
n (%)

P valuea

MRSA
isolates
n (%)

MSSA
isolates
n (%)

P valuea

hla
hlb
hld
hlg
hlg-v
eta
etb
etd
lukED
lukPV
lukM
tst
sea
seb
sec
sed
see
seg
seh
sei
selj
selk
sell
selm
seln
selo
selp
selq
ser
selu
ses
set
ear
splF
bsaB

62 (100)
40 (64.5)
62 (100)
22 (35.5)
53 (85.5)
16 (25.8)
3 (4.8)
18 (29)
61 (98.4)
17 (27.4)
18 (29)
40 (64.5)
15 (29.2)
42 (67.7)
11 (17.7)
4 (6.5)
62 (100)
2 (3.2)
62 (100)
11 (17.7)
7 (11.3)
6 (9.7)
62 (100)
62 (100)
62 (100)
6 (9.7)
7 (11.3)
10 (16.1)
18 (29)
2 (3.2)
2 (3.2)
41 (66.1)
45 (56.5)
23 (37.1)

31 (100)
17 (54.8)
31 (100)
20 (64.5)
22 (71)
11 (35.5)
3 (9.7)
10 (32.3)
31 (100)
12 (38.7)
18 (58)
14 (45)
2 (6.5)
27 (87)
5 (16)
31 (100)
2 (6.5)
31 (100)
6 (19.4)
1 (3.2)
5 (16)
31 (100)
31 (100)
31 (100)
3 (9.7)
1 (3.2)
5 (16)
17 (54.8)
1 (3.2)
1 (3.2)
11 (35.5)
18 (58)
5 (16)

31 (100)
23 (74.2)
31 (100)
3 (9.7)
31 (100)
5 (16)
8 (25.8)
30 (96.8)
5 (16)
26 (83.9)
13 (41.9)
15 (48.4)
5 (16)
4 (12.9)
31 (100)
31 (100)
5 (16)
6 (19.4)
1 (3.2)
31 (100)
31 (100)
31 (100)
3 (9.7)
6 (19.4)
5 (16)
1 (3.2)
30 (96.8)
27 (87.1)
18 (58.1)

na
0.11
na
<0.01
<0.01
0.08
0.076
0.58
0.31
0.046
na
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
1.0
0.038
na
0.15
na
0.74
0.044
0.08
na
na
na
na
0.044
1.0
<0.01
0.31
0.31
<0.01
0.01
<0.01

21 (100)
16 (76.2)
21 (100)
1 (4.8)
20 (64.5)
2 (9.5)
10 (47.6)
21 (100)
5 (23.8)
2 (9.5)
17 (81)
7 (33.3)
12 (57.1)
4 (19)
2 (9.5)
21 (100)
21 (100)
4 (19)
5 (23.8)
21 (100)
21 (100)
21 (100)
4 (19)
5 (23.8)
3 (14.3)
4 (19)
16 (76.2)
17 (81)
11 (52.4)

41 (100)
24 (58.5)
41 (100)
22 (53.7)
33 (80.5)
14 (34.1)
3 (7.3)
8 (19.5)
40 (97.6)
12 (29.3)
16 (39)
23 (56.1)
8 (19.5)
30 (73.2)
6 (14.6)
2 (4.9)
41 (100)
2 (4.9)
41 (100)
7 (17.1)
2 (4.9)
6 (14.6)
41 (100)
41 (100)
41 (100)
2 (4.9)
2 (4.9)
7 (17.1)
14 (34.1)
1 (2.5)
1 (2.5)
21 (51.2)
28 (68.3)
12 (29.3)

na
0.92
na
<0.01
0.12
0.04
0.20
0.02
0.47
0.65
na
0.02
0.053
0.23
0.20
0.65
0.48
na
0.30
na
0.85
0.03
0.07
na
na
na
0.07
0.03
0.78
0.22
0.47
0.47
0.06
0.29
0.075

Statistically significant results are highlighted in bold. na, P value not applicable; -, negative for the indicated gene or marker.

analyzed for virulence gene content and for the


correlation of certain genes or gene combinations with
known MGEs. All isolates involved in bloodstream
infections (31, each from a different patient; B-group),
and an equal number of isolates collected from patients
with infected wounds, associated with chronic vascular
conditions or traumatological surgery (W-group), were
included in the study. The same isolates have been
previously characterized by staphylococcal protein A
gene (spa) typing, multilocus sequencing typing (MLST),
accessory gene regulator system, and methicillin
resistance (Argudn et al., 2011a). The frequency of
MRSA was 16.1% (5/31) and 51.6% (16/31) for
bloodstream and wound isolates, respectively.
PCR amplification. Detection of exotoxin genes was
achieved by polymerase chain reaction (PCR) using
primers and protocols previously reported for genes
encoding haemolysins (hla, hlb, hld, hlg, hlg-2),
exfoliatins (eta, etb, etd), leukotoxins (lukED, lukM,
lukPV), toxic shock syndrome toxin (tst), SEs (sea, seb,
sec, sed, see, seg, seh, sei, ser), SELs (selj, selk, sell,
selm, seln, selo, selp, selq, selu), and for markers of
SaPIs (ear), Sa types I, II and III (splF) and Sa type
II (bsaB) (Argudn et al., 2009; Argudn et al., 2011b).
Oligonucleotides for the novel ses and set enterotoxin-

62

encoding genes were designed for this study: ses-1:


5AATGCAATTTGCCCCATAGT3,
ses-2
5AACTTCATATTCGCAGGACA3
set-1
5CGGGTGTTACTTCTGTTTGC3,
set-2
5ATGTAGATGCTTGGGGACAT3. In all PCR-assays
positive and negative controls were always included
(Fueyo et al., 2005a, Argudn et al., 2009; Argudn et al.,
2011b).
Statistical methods. For each trait, statistical
comparison between B- and W-isolates was performed
using the 2 test. Differences between groups were
considered statistically significant if P values were <
0.05. The discrimination index (DI; the probability that
two unrelated isolates would be assigned to different
virulence profiles) was calculated using Simpsons index
of diversity (Struelens et al., 1996).
RESULTS
The S. aureus isolates were screened for genes
encoding 32 exotoxins, including five haemolysins, three
exfoliatins, three leukotoxins, and 21 PTSAgs (Table 1).
All isolates were positive for three to five haemolysin
genes, all except one carried the leukotoxin lukED gene,
27.4% carried lukPV, and lukM was the only gene absent

3. Resultados
Table 2. Exotoxin gene profiles of S. aureus recovered from blood.
Isolate/Year
Virulence
Exotoxin genes
(CC)a
profile
C16/96 (CC5)
V1
hla/b/d/gv-lukED/PV-etd-sea/c/lp-egc2
C17/97 (CC45) V2
hla/d/g-lukED-sea/b/c/ll-egc1
C18/97 (CC15) V3
hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sec-egc2
C19/98 (CC45) V4
hla/d/gv-lukED/PV-sec-egc1
C20/98 (CC8)
V5
hla/d/g/gv-lukED/PV-sea-egc1
C21/98 (CC45) V6
hla/d/g-lukED-eta-tst-sec/ll-egc1
C22/98 (CC45) V7
hla/d/g-lukED-etd-tst-sea/c/ll-egc2
C24/99 (CC45) V6
hla/d/g-lukED-eta-tst-sec/ll-egc1
C25/99 (CC15) V8
hla/d/g/gv-lukED-sec-egc1
C26/99 (CC1)
V9
hla/b/d/gv-lukED/PV-eta/d-tst-sea/c/d/h/lj/lk/lq/r-egc2
C27/00 (CC5)
V10
hla/b/d/gv-lukED/PV-etd-tst-sea/c/lj/r/s/t-egc2
C28/00 (CC5)
V11
hla/b/d/g-lukED-etd-tst-sec/h-egc2
C29/00 (CC30) V12
hla/d/g-lukED-etd-sea-egc2
C30/01 (CC121) V13
hla/d/gv-lukED/PV-eta-tst-sec-egc2
C31/01 (CC121) V14
hla/b/d/g/gv-lukED-eta-tst-sec-egc2
C32/01 (CC30) V15
hla/d/g-lukED-tst-sea/c-egc2
C33/01 (CC5)
V16
hla/d/gv-lukED-eta-tst-sea-egc1
C34/03 (CC45) V17
hla/d/g-lukED-sec-egc2
C35/01 (CC5)
V18
hla/b/d/g/gv-lukED-eta-tst-sea/c-egc1
C36/02 (CC5)
V19
hla/b/d/g/gv-lukED-sec/d/lj/r-egc2
C38/02 (CC88) V20
hla/b/d/g/gv-lukED-etd-tst-sec-egc2
C39/02 (CC88) V21
hla/b/d/gv-lukED/PV-eta/b-tst-sea/c-egc1
C40/02 (CC88) V22
hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta/b-tst-sea/c-egc1
C42/03 (CC45) V23
hla/d/g/gv-lukED-sec/ll-egc1
C43/03 (CC45) V24
hla/b/d/g-lukED-sec-egc1
C44/03 (CC8)
V25
hla/b/d/gv-lukED/PV-eta-sea/c/d/lj/r-egc2
C47/03 (CC5)
V26
hla/b/d/gv-lukED/PV-etd-tst-sec-egc2
C50/04 (CC5)
V27
hla/d/gv-lukED-etd-tst-sea/c/d/lj/lp-egc2
C51/04 (CC5)
V28
hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta-seb/c/d/lj/r-egc1
C53/05 (CC5)
V29
hla/b/d/g/gv-lukED/PV-etb-tst-sec/lp-egc1
C57/06 (CC25) V30
hla/b/d/gv-lukED-etd-egc2
a
Methicillin-resistant isolates are shown in bold. The CC (clonal complex) is shown in parenthesis
2011a).

in all isolates. With regard to exfoliatin genes, eta and etd


appeared at similar frequencies (25.8 and 29%,
respectively), while etb was less common (4.8%). Five to
14 PTSAgs genes were detected in each isolate. All
carried an enterotoxin gene cluster (egc1 or egc2,
including seg, sei, selm, seln, selo selu), all except three
were positive for some classic enterotoxin gene (sea, seb,
sec, sed), and 29% carried tst.
As shown in Table 1, hlg, lukPV, tst, sec and selu
were significantly more frequent in B- than in W-isolates,
and hlg-, sea, seb, see, selk and selq were so in the latter
(P < 0.05). When the total MRSA and MSSA isolates
were compared (21 and 41, respectively), significant
differences were found for etd and selk and selq, more
frequent in MRSA, and for hlg, eta and tst, more frequent
in MSSA. At all, exotoxin genes were abundant in both
B- (11 to 23 genes) and W-isolates (8 to 19 genes), and
were arranged in 55 combinations (Tables 2 and 3).
Thus, typing based on exotoxin gene content was highly
discriminative, yielding a DI of 0.996.
To investigate possible associations between
exotoxin gene(s) and MGEs, the bsaB, splF and ear
genes were also screened as markers of Sa types I, II
and III, and SaPIs. These genes appeared in 35.5, 58 and
16% of the B-isolates, and in 96.8, 87.1 and 58% of the
W-isolates, respectively (Table 1). Distinct combinations
of splF, bsaB, lukED and egc clusters (Table 4), detected
at variable frequencies in the B-group versus (vs) the Wgroup could be correlated with Sa type I (splF, lukED
and egc1; 25.8% vs 35.5%), and type III (splF, egc2;
25.8% vs 0%). However, all isolates with the latter genes
carried the lukED gene which has not been reported in
Sa type III, and the splF, bsaB, lukED combination

Sa/SaPI markers
splF-ear
splF
splF
splF-bsaB
ear
ear
ear
splF
splF-bsaB
bsaB
splF
splF
splF
splF
splF
splF
splF-ear
splF
ear
splF-ear
splF-ear
ear
bsaB
splF
ear
splF
ear
bsaB
for of each isolate (Argudn et al.,

associated with Sa type II (6.5% vs 48.4%) co-exited


with the egc1 or egc2 found in Sa types I and III,
respectively. These new combinations could correspond
to unreported MGEs or to variants of those already
known. Other gene arrangements are compatible with
SaPI2 (tst; 58% vs 0%), SaPI3 (ear, seb, selq and selk;
0% vs 9.7%), SaPI5 (ear, selq and selk; 0% vs 9.7%),
SaPIm1/SaPIn1 (sell, sec, ear and tst; 9.7% vs 0%),
SaPImw2 (ear, sell and sec; 16.1% vs 3.2%), and etdSaPI
(32.3% vs 25.8%).
The eta, lukPV, sea, selk, selq and selp genes are
known to be carried by a variety of prophages of the
Siphoviridae family, assigned to subgroups Sa1, Sa2 and
Sa3 based on integrase gene polymorphism (Table 4).
These prophages would be present in different
percentages of B- and W-isolates: Sa1 (eta, 32.3% vs
16.1%), Sa2 (lukPV, 38.7% vs 16.1%), Sa3 (sea,
41.9% vs 83.9%; selp, 9.7% vs 9.7%; selk, selq and sea,
3.2% vs 19.4%). The see gene (0% vs 12.9%) could also
be carried by a prophage. Six bloodstream and five
wound isolates were positive for sed-selj, combined
either with ser (ten isolates) or ses and set (one isolate).
These enterotoxin gene combinations have been reported
in pIB485-like and pF5-like plasmids, respectively
(Table 4). Finally, seb without ear-selq-selk (0% vs
9.7%), etb (9.7% vs 0%), and seh (6.5% vs 0%) could be
located on plasmids pZA10, pETB and on the
MGEmw2/mssa476 element, respectively (Table 4).
DISCUSSION
In this study, the exotoxin gene content was
established for a collection of well-characterized

63

3. Resultados
Table 3. Exotoxin gene profiles of S. aureus recovered from wound.
Isolate/Year
Virulence
(CC)a
profile
C258/96 (CC8) V31
C259/96 (CC45) V32
C260/96 (CC5) V33
C261/96 (CC8) V34
C262/96 (CC8) V35
C263/96 (CC8) V36
C264/96 (CC59) V37
C265/96 (CC5) V38
C266/97 (CC8) V39
C267/97 (CC5) V40
C268/97 (CC5) V41
C269/97 (CC5) V42
C270/97 (CC8) V43
C271/98 (CC8) V43
C272/99 (CC15) V8
C273/99 (CC45) V44
C274/00 (CC8) V37
C275/00 (CC5) V45
C276/00 (CC5) V36
C277/01 (CC8) V46
C278/01 (CC5) V47
C279/02 (CC5) V48
C280/02 (CC15) V49
C281/02 (CC15) V50
C282/03 (CC8) V51
C283/03 (CC15) V38
C284/04 (CC15) V52
C285/06 (CC25) V30
C286/06 (CC5) V53
C287/06 (CC5) V54
C289/03 (CC72) V55
a
Methicillin-resistant isolates are shown in bold.
2011a).

Exotoxin genes

hla/d/gv-lukED-etd-sea/b-egc1
ear-splF-bsaB
hla/d/g/gv-lukED-sea/b/c/ll-egc1
ear-splF
hla/b/d/gv-lukED-sea/c-egc1
ear-splF-bsaB
hla/b/d/gv-lukED-etd-sea/c-egc1
ear-splF-bsaB
hla/b/d/gv-lukED-etd-sea/lk/lq-egc1
ear-splF-bsaB
hla/b/d/gv-lukED-sea/b/lk/lq-egc1
ear-splF-bsaB
hla/b/d/gv-lukED-sea/lk/lq-egc1
ear-bsaB
hla/b/d/gv-lukED-sea/b/c-egc1
ear-splF-bsaB
hla/d/gv-lukED-sea/c-egc1
ear-splF-bsaB
hla/b/d/g/gv-lukED-sea-egc1
ear-splF
hla/b/d/gv-lukED-eta-sea/b/c-egc1
ear-splF-bsaB
hla/b/d/gv-lukED-sea/e-egc1
ear-splF-bsaB
hla/b/d/gv-lukED-sea-egc1
ear-splF-bsaB
hla/b/d/gv-lukED-sea-egc1
ear-splF
hla/d/g/gv-lukED-sec-egc1
splF
hla/b/d/gv-lukED-etd-sea/b/c/lk/lq-egc1
ear-splF-bsaB
hla/b/d/gv-lukED-sea/lk/lq-egc1
ear-splF-bsaB
hla/b/d/gv-lukED/PV-sea-egc1
ear-splF
hla/b/d/gv-lukED-sea/b/lk/lq-egc1
ear-splF
hla/b/d/gv-lukED/PV-sea/c-egc1
ear-splF
hla/b/d/gv-lukED-etd-sea/b/d/e/lj/lp/r-egc1
ear-splF-bsaB
hla/b/d/gv-lukED/PV-eta/d-seb/d/lj/r-egc1
ear-bsaB
hla/d/gv-lukED/PV-sea/b/c/e-egc1
ear-splF-bsaB
hla/b/d/gv-lukED-sea/b-egc1
ear-splF
hla/b/d/gv-lukED/PV-eta-sea/c/d/lj/r-egc1
ear-splF-bsaB
hla/b/d/gv-lukED-sea/b/c-egc1
ear-splF
hla/d/gv-lukED-eta-sea/b/c-egc1
ear-splF
hla/b/d/gv-lukED-etd-egc2
bsaB
hla/b/d/gv-lukED-eta/d-sea/c/d/e/lj/lp/r-egc1 splF
hla/d/gv-lukED-sec/d/lj/lp/r-egc1
hla/d/gv-egc1
splF
The CC (clonal complex) is shown in parenthesis for of each isolate (Argudn et al.,

S. aureus isolates obtained from geriatric patients with


bloodstream or wounds infections (Argudn et al.,
2011a). A high number of exotoxin genes were carried
by each isolate, independently of whether they were
recovered from blood (11-23 genes) or wounds (8-19
genes). Numerous virulence genes were also reported in
S. aureus from other hospitals (Monk et al., 2004;
Campbell et al., 2008; Holtfreter et al., 2007; Argudn et
al., 2009; Varshney et al. 2009). In the present work, the
detected genes appeared in many different combinations,
with nearly each isolate showing a distinct pattern. In
agreement with this, typing based on exotoxin gene
content was highly discriminative, even more than spa
typing (0.99 vs 0.98; Argudn et al., 2011a).
All isolates tested in this study proved to contain
either egc1 or egc2, with the latter being nearly restricted
to the B-group. In fact, only one W-isolate, also
recovered from blood of the same patient (Argudn et al.,
2011a), carried egc2. In addition, all except one isolate
were positive for lukED, hla and hld. High frequencies of
lukED and egc were also observed in S. aureus from a
general universitary hospital located in the same city
(Argudn et al., 2009). Interestingly, significant
differences between invasive and non-invasive isolates
were found for several exotoxin genes, including hlg,
lukPV, tst, sec and selu (more frequent in B-isolates), and
for hlg-, sea, seb, see and selk-selq (more common in
W-isolates). As far as we know, this is the first
comparison of the prevalence of exotoxin genes in S.
aureus causing invasive and non-invasive isolates in
geriatric patients. However, a recent study has compared
the enterotoxin gene content of S. aureus strains derived
from blood and wound infections affecting a

64

SaPI/Sa markers

heterogeneous population in New York (Varsney et al.,


2009). In the latter study, a high number of se genes
arranged in many different combinations were also
observed, but the prevalence rates in blood and wound
isolates were comparable for most of the genes. In fact,
only sed and selj in combination with ser were
significantly more common in blood isolates. These
genes, carried by pIB485-like plasmids, were infrequent
in S. aureus from geriatric patients, and similarly
distributed between the two groups. In addition, selk was
more common in MRSA and seln in MSSA from New
York, while selk-selq and etd were significantly more
frequent in the MRSA, and hlg, eta and tst in the MSSA
tested in the present study. The observed discrepancies
may be due to differences in age, ethnics and/or
geographical origin of the patients: Spanish geriatric
patients in the MNH, and heterogeneous (hispanic, black,
caucasian and unknown) patients of different ages from
hospitals in New York. However, as indicated by
Varshney et al. (2009), the abundance of exotoxin genes
and diversity of arrangement, demand the examination of
very large samples in order to establish confident
correlations with clinical presentations. The present study
included all invasive S. aureus recovered from geriatric
patients in the MNH over one decade, and an equal
number of W-isolates. Since the number was relatively
low, the observed correlations have to be taken with
caution, but they can serve as a bases for further
evaluation of virulence genes which might play a role in
severe and less severe infections affecting geriatric
patients.
MLST supported by other typing techniques has
previously assigned the B- and W-isolates from the MNH

3. Resultados
Table 4. Distribution of suspected mobile genetic elements among clonal complexes.
Suspected MGEa
Sa I (splF-lukED-egc1)
Sa II (splF-bsaB-lukED)+egc1
Sa II (splF-bsaB-lukED)+egc2
Sa III (splF-egc2)+lukED
SaPI2 (tst)
SaPI3 (ear-seb-selq-selk)d
SaPI5 (ear-selq-selk)d
SaPIm1/SaPIn1 (sell-sec-ear-tst)e
SaPImw2 (ear-sell-sec)
etdSaPI (etd)

Sa1 (eta)
Sa2 (lukPV)
Sa3 (sea)
Sa3 (sea-selk-selq)
Sa3 (selp)
Sa (see)

Total isolates (N/%)

CCsb
Bloodstream isolates (N)

CC5 (7/31.8), CC8 (2/16.7), CC15 (5/71.4),


CC45 (4/44.4), CC88 (1/33.3)
CC5 (5/22.7), CC8 (9/75.0), CC15 (1/14.3),
CC45 (1/11.1)
CC1 (1/100)
CC5 (2/9.1), CC15 (1/14.3), CC30 (2/100),
CC88 (1/33.3), CC121 (2/100)
CC1 (1/100), CC5 (7/31.8), CC15 (1/14.3),
CC30 (1/50), CC45 (3/33.3), CC88 (3/100),
CC121 (2/100)
CC5 (1/4.5), CC8 (1/8.3), CC45 (1/11.1)
CC8 (2/16.7), CC59 (1/100)
CC45 (3/33.3)
CC45 (3/33.3)
CC1 (1/100), CC5 (8/36.4), CC8 (3/25),
CC25 (2/100), CC30 (1/50), CC45 (2/22.2),
CC88 (1/33.3)
CC1 (1/100), CC5 (6/27.3), CC8 (2/16.7),
CC15 (1/14.3), CC45 (2/22.2), CC88 (2/66.7),
CC121 (2/100)
CC1 (1/100), CC5 (7/31.8), CC8 (4/33.3),
CC15 (1/14.3), CC45 (1/11.1), CC88 (2/66.7),
CC121 (1/50)
CC5 (14/63.6), CC8 (12/100), CC15 (4/57.1),
CC30 (2/100), CC45 (4/44.4), CC88 (2/66.7),
CC59 (1/100)
CC1 (1/100)
CC5 (6/27.3)
CC5 (3/13.6), CC15 (1/14.3)

CC5 (3), CC15, CC45 (3),


CC88
CC8
CC1
CC5(2), CC15, CC30 (2),
CC88, CC121 (2)
CC1, CC5 (7), CC15, CC30,
CC45 (3), CC88 (3), CC121
(2)
CC45 (3)
CC45 (2)
CC1, CC5 (5), CC25, CC30,
CC45, CC88

Wound isolates (N)


CC5 (4), CC8 (2), CC15 (4),
CC45
CC5 (5), CC8 (8), CC15,
CC45
CC5, CC8, CC45
CC8 (2), CC59
CC45
CC5 (3), CC8 (3), CC25,
CC45

CC1, CC5 (3), CC8, CC45


(2), CC88 (2), CC121 (2)

CC5 (3), CC8, CC15

CC1, CC5 (5), CC8 (2),


CC45, CC88 (2), CC121

CC5 (2), CC8 (2), CC15

CC5 (5), CC8 (2), CC30 (2),


CC45 (2), CC88 (2)

CC5 (9), CC8 (10), CC15 (4),


CC45 (2), CC59

CC1
CC5 (3)
-

CC5 (3)
CC5 (3), CC15

pIB458 family (sed-seljser)


pF5 (selj-ser-ses-set)
pETB (etb)
pZA10 (seb)

CC1 (1/100), CC5 (7/31.8), CC8 (2/16.7)


CC5 (1/4.5)
CC5 (1/4.5), CC88 (2/66.7)
CC5 (5/22.7), CC8 (1/8.3), CC15 (4/57.1),
CC45 (2/22.2)

CC1, CC5 (3), CC8


CC5
CC5, CC88 (2)
CC5, CC45

CC5 (4), CC8


CC5 (4), CC8, CC15 (4),
CC45

MGEmw2/mssa476 (seh)

CC1 (1/100), CC5 (1/4.5)

CC1, CC5

Genomic islands according to Baba et al. (2008); pathogenicity islands according to Novick and Subedi (2007) and Yamaguchi et al.
(2002); prophage types according to Couch et al. (1988) and Goerke et al. (2009); plasmids according to Altboum et al. (1985), Bayles
and Iandolo (1989); Fueyo et al. (2005b), Ono et al. (2008) and Yamaguchi et al. (2001); MGEmw2/mssa476 element according to
Noto and Archer (2006).
b
Clonal complexes as in Argudn et al. (2011a).
c
Percentages calculated with respect to the total number of isolates within each CC: CC1 (1), CC5 (22), CC8 (12), CC15 (7), CC25 (2),
CC30 (2), CC45 (9), CC59 (1), CC72 (1), CC88 (3), CC121 (2).
d
These isolates also carried sea and could be positive for Sa3 (sea) or Sa3 (sea-selk-selq).
e
These isolates could carry SaPImw2 (ear-sec-sell).
MGE, mobile genetic element; N, number of isolates when more than one.

to nine (CC1, CC5, CC8, CC15, CC25, CC30, CC45,


CC88 and CC121), and seven (CC5, CC8, CC15, CC25,
CC45, CC59 and CC72) CCs, respectively (Tables 2 and
3; Argudn et al., 2011a). Four of them (CC5, CC8,
CC15 and CC45), out of the total of eleven, included
80.6% of the isolates, and were represented in both
groups. The distribution of exotoxin genes and exotoxin
gene combinations associated with known MGEs
between CCs is shown in Table 4. Although most of the
detected associations have previously been reported
(Baba et al., 2002; Monk et al., 2004; Gill et al., 2005;
Holtfreter et al., 2007; Tristan et al., 2007; Argudn et
al., 2009; Ghebremedhin et al., 2009; Goerke et al.,
2009; Monecke et al., 2009; Ozaki et al., 2009; Peck et
al., 2009; Varshney et al., 2009), new correlations were
found in the present work. These include CC88 and
CC121 with the tst-carrying SaPI2; CC45 with selq-selk,
known to be located on SaPI3, SaPI5 and Sa3, although

selk without selq has been already found in this CC


(Varshney et al., 2009); and CC5 and CC15 with the seecarrying prophage. It is of note that this is the first time
in which the see gene, present in 13% of the wound
isolates, was detected in our laboratory, in which more
than 400 S. aureus isolates of different origins (clinical,
healthy carriers, foodstuffs and food-handlers) have been
tested (Fueyo et al., 2001; Fueyo et al., 2005a; Fueyo et
al., 2005b; Fueyo et al., 2005c; Argudn et al., 2009). In
other studies, the see gene was either not detected
(Peacock et al. 2002; Hu et al., 2008) or uncommon
(frequency of about 1%; Becker et al., 2003; Nashev et
al., 2007; Baba-Moussa et al., 2008). However, between
20 to 40% of S. aureus associated with steroid-resistant
atopic dermatitis, healthy woman vagina and a general
population of patients were recently reported to carry see
(Schlievert et al., 2008).

65

3. Resultados
Some of the inferred MGEs, including Sa type I
(lukED-egc1), Sa type II (lukED), Sa type III (egc2),
or variants therein, SaPI2 (tst), etdSaPI, Sa1 (eta),
Sa2 (lukPV), and Sa3 (sea), were widely distributed,
being present in five to seven CCs. Other SaPIs (like
SaPI3, SaPI5, and the sec-carrying SaPIs), prophages
(sea-selk-selq- and selp-carrying Sa3, and the seecarrying Sa), the seh-carrying MGE, as well as
plasmids of the pIB458 and pF5 families, were restricted
to one to three CCs. The bases for the different
distribution of MGEs, and toxin genes therein, between
S. aureus lineages remains unknown, but the high
number and variety of exotoxin genes found in the
nosocomial isolates characterized in this study, together
with the expected differences in gene expression
(Robinson et al., 2005; Varshney et al., 2009), could play
a role in the adaptation of this highly versatile pathogen.
Moreover, successful combinations of virulence genes
can be among the factors leading to the increase in
frequency of certain strains, and their epidemic spread
within and outside the nosocomial setting.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by the Spanish Ministry of
Science and Innovation (project FIS-PI080656). M. A.
Argudn was supported by grant FPU AP-2004-3641
from the Ministry of Science and Innovation, Spain, cofunded by the European Social Fund.
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67

3. Resultados

68

3.2.Capitulo 2
Staphylococcus aureus procedentes de portadores
sanos del Principado de Asturias

3. Resultados

3.2. Captulo 2: Staphylococcus aureus procedentes de portadores sanos


El hombre es un importante reservorio de S. aureus, siendo la mucosa nasal su hbitat
primario, desde donde puede pasar a otras reas corporales, como la cavidad orofarngea, las
vas respiratorias altas, la piel, las glndulas mamarias y los aparatos genitourinarios e
intestinal (Acton et al., 2009). La tasa de portadores nasales adultos se estima entre un 2030%, siendo algunos grupos de personas ms susceptibles a la colonizacin que otros
(Wertheim et al., 2005). Los portadores actan como reservorio del patgeno, por lo que la
colonizacin aumenta el riesgo de infeccin por autoinoculacin o por transmisin a otros
hospedadores (Safdar y Bradley, 2008; von Eiff et al., 2001). La importancia de este tipo de
aislamientos ha dado lugar a varios estudios en los que se ha demostrado su heterogeneidad
en cuanto a linajes y se ha determinado la presencia de factores de virulencia (ej. Bania et al.,
2006; Becker et al., 2003; Holtfreter et al., 2007).
En el segundo capitulo de la Tesis Doctoral se caracteriz una coleccin de
aislamientos recogidos durante el periodo 1997-2006, a partir de muestras nasales de
portadores sanos en concreto, alumnos de prcticas de la asignatura Microbiologa
Sanitaria, de la Licenciatura de Biologa, sin relacin conocida con el medio hospitalario.
Los aislamientos correspondientes al periodo 1997-2002 fueron previamente tipificados
mediante SmaI-PFGE) y caracterizados en base a presencia de factores de virulencia, por
nuestro grupo (Fueyo et al., 2001; Fueyo et al., 2005a; Fueyo et al., 2005b). En esta Tesis
Doctoral se aplicaron nuevas tcnicas de tipificacin (spa, MLST, RM test) y se investig la
presencia de determinantes de resistencia. En cuanto a los nuevos aislamientos,
correspondientes al periodo 2004-2006, se analizaron con las distintas tcnicas de tipificacin
molecular disponibles en nuestro laboratorio, y se investigaron las bases genticas de la
virulencia y resistencia. Los oligonucletidos utilizados en las tcnicas basadas en PCR se
muestran en el Anexo I, mientras que los resultados de este captulo se resumen en las Tablas
IIc y IId del Anexo II. Los diferentes estudios dieron lugar a tres artculos, que se encuentran
en fase de preparacin:
Artculo 4: Argudn MA, Mendoza MC, Martn MC, Rodicio MR. Genomic
diversity of methicillin-susceptible Staphylococcus aureus strains from young healthy carriers
(en preparacin).
Artculo 5: Argudn MA, Mendoza MC, Argumosa V, Rodicio MR. Virulence
profiles of Staphylococcus aureus isolates from young healthy carriers (en preparacin).
Artculo 6: Argudn MA, Mendoza MC, Martn MC, Rodicio MR. Molecular basis
of antimicrobial drug resistance of Staphylococcus aureus isolates recovered from university
students in a Spanish region (en preparacin).

69

3. Resultados

70

3. Resultados

3.2.1. Artculo 4

Genomic diversity of methicillin-susceptible Staphylococcus


aureus strains from young healthy carriers
M. A. Argudn1, M. C. Mendoza1 and M. R. Rodicio1
Department of Functional Biology. Laboratory of Microbiology. University of Oviedo. Oviedo, Spain1
The population structure of 111 methicillin-susceptible Staphylococcus aureus (MSSA), recovered from the
nasal cavities of young healthy and risk-free carriers during 1997 to 2006 in a northern Spanish region, was
investigated using pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), spa (staphylococcal protein A) typing, multi locus
sequence typing (MLST), and accessory gene regulator (agr) typing. Results from the different methods were
highly concordant, and revealed twelve CCs: CC30 (27%), CC5 (18.9%), CC45 (16.2%), CC15 (11.7%), CC25
(8.1%), CC1, CC9 (3.6% each), CC59, CC97 and CC121 (2.7% each), CC72 (1.8%) and CC8 (0.9%). Isolates
with genetic backgrounds of hospital-acquired MRSA (methicillin-resistant S. aureus), community-acquired
MRSA, and livestock-associated S. aureus were detected. Moreover, consistent with the ability of diverse MSSA
to act as recipients of the SCCmec cassette, a MSSA isolate from a healthy carrier shared the spa-type, ST and
agr type of a MRSA clone (ST72-SCCmec IVc of the sporadic CC72), detected in the central universitary
hospital of the same region. The PGFE-profiles were also identical except for a single fragment which, in the
MRSA isolate, carried mecA. The obtained results highlight the importance of nasal colonization in the
epidemiology of S. aureus.
Keywords: S. aureus; healthy carriers, PFGE; spa-typing; MLST; clonal complexes; agr typing
INTRODUCTION
Staphylococcus aureus is an important human
pathogen capable of causing a wide variety of diseases,
ranging from mild skin infections and food poisoning to
life-threatening conditions, such as deep abscesses,
osteomyelitis, pneumonia, infective endocarditis and
sepsis (Lowy, 1998). Despite of this, S. aureus is
primarily a member of the natural microbiota of the skin
and mucosa of human beings, with estimations of about
20% (range 12-30%) and 30% (range 16-70%) for
persistent and intermittent colonization (Wertheim et al.,
2005). The anterior nares are considered as the main
ecological niche of S. aureus, and nasal carriage is an
important risk factor for the development of infections
through autoinoculation with the own resident strain
(Kluytmans et al., 1997; Kluytmans and Wertheim,
2005). To understand the relationship between nasal
carriage and subsequent disease, insights into the
diversity and population structure of S. aureus collections
derived from healthy people are essential (van Belkum et
al., 2009). In addition, strong evidence supports the
frequent emergence and limited geographical spread of
methicillin-resistant S. aureus (MRSA) (Nbel et al.,
2008), highlighting the importance of methicillinsusceptible S. aureus (MSSA) isolates which are locally
circulating and could eventually act as recipients of
staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec)
elements (Gomes et al., 2006). Of particular interest are
the community-associated MRSA (CA-MRSA) strains,
which emerged in the early 1990s, and have since been
associated with infections in populations lacking
previous contact with healthcare facilities (Patel, 2009).
Children and young adults are the age groups
predominantly affected by CA-MRSA, which are
genetically characterized by the presence of SCCmec IV,
V or VII, and the frequent production of PantonValentine leucocidin (PVL) encoded by the lukS-PV and

lukF-PV operon. These strains show genetic backgrounds


unrelated to health-care-associated MRSA (HA-MRSA),
and have a larger diversity, supporting that different
MSSA clones have the potential to become CA-MRSA
(Lina et al., 1999; Tristan et al., 2007; Patel, 2009;
Deurenberg and Stobberingh, 2009; Kck et al., 2010).
New livestock-associated lineages have recently emerged
in the European Union and other parts of the world, but
the impact of this reservoir on public health remains
unclear (Kck et al., 2010). Within this scenario, the aim
of the current study was to establish the genomic
diversity and population structure of methicillinsusceptible S. aureus (MSSA) recovered in a Northern
Spanish region from young healthy carriers, with not
known association with health-care facilities. For this,
pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) was used in
combination with spa (staphylococcal protein A) typing,
multi locus sequence typing (MLST), and agr typing
(Murchan et al., 2003; Shopsin et al., 1999; Enright et
al., 2000; Moore and Lindsay, 2001; Tenover et al.,
2006). Results obtained with the different techniques
were correlated, and the population structure of the
sample was compared with data available for other S.
aureus collections, both from healthy carriers and healthcare facilities, including the major tertiary care hospital
(HUCA) and a long-term care hospital (MNH) from the
same region.
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains. The 111 isolates analyzed in this
study have been collected from the nasal cavities of
young healthy carriers (students at the Faculty of
Biology, University of Oviedo, Spain), during 1997 to
2006 (68 isolates from 1997 to 2002 and 43 from 2004 to
2006). Isolates from the 1997 to 2002 period have been
previously typed by SmaI-PFGE and characterized with
regard to exotoxin gene content (Fueyo et al., 2005a). All

71

3. Resultados
isolates have been previously tested for antimicrobial
drug resistance and exotoxin gene content. None of them
was resistant to methicillin and only one was positive for
lukPV (Argudn et al., Article 5; Argudn et al., Article
6).

Negative and positive controls were included in all PCR


reactions (Argudn et al., 2009). The discrimination
index (DI; the probability that two unrelated isolates
would be assigned to different types) was calculated
using the Simpson's index of diversity (Struelens et al.,
1996).

SmaI-PFGE analysis. Whole DNA from the S.


aureus isolates recovered between 2004 and 2006 was
analyzed by SmaI digestion followed by PFGE,
performed by means of the CHEF-DRIII SYS220/240
system (Bio-Rad Laboratories, S.A., Madrid, Spain)
(Murchan et al., 2003). The resulting profiles were
analyzed, recording the presence or absence of each
fragment. Profiles showing one or more mismatching
bands were considered as different. The discrimination
index (DI) (i.e., the probability that two unrelated isolates
obtained from the population would be placed into
different SmaI-PFGE profiles) was calculated using the
Simpson's index of diversity (Struelens et al., 1996).
Relationships between profiles were established by the
unweighted pair method with arithmetic averages
(UPGMA), using the Jaccard's coefficient of similarity
(J) in the software Program MVSP version 3.1
(Multivariate Statistics Package for PCs; RockWare Inc).
NCTC (National Collection of Type Cultures, United
Kingdom) 8325 was used as control strain for PFGE
analysis. Selected PFGE profiles were transferred onto
membranes and hybridised with a mecA probe (PCR DIG
Labelling Mix, Roche Diagnostics, Spain).

RESULTS
The 43 isolates recovered from healthy carriers
during 2004 to 2006 generated 33 SmaI-PFGE profiles
(Figure 1). Eight of them (S3, S11, S31, S33, S51, S52,
S55, S70) were identical, and five (S126, S127, S133,
S135, S148) closely related to profiles generated from
isolates of the 1997 to 2002 period (labelled as S3 to S75
by Fueyo et al., 2005a), while the remaining 20 were
clearly different. At all, 61 distinct PFGE profiles were
recognized among all analyzed isolates collected from
1997 to 2006, yielding a DI of 0.97. A dendrogram of
similarity grouped 54 of them within one out of eleven
clusters, and the remaining seven appeared as
independent branches (Figure 2). Using sequencingbased methods the 111 isolates were further distributed
into 49 spa types (DI of 0.97), two of them of new
description (t6489, t6490), and representative isolates
were assigned to 14 STs by MLST. The latter technique,
supported by spa typing, identified twelve CCs: CC1 (4
isolates; 3.6%), CC5 (21 isolates; 18.9%), CC8 (1
isolates; 0.9%), CC9 (4 isolates; 3.6%), CC15 (13
isolates; 11.7%), CC25 (9 isolates; 8.1%), CC30 (30
isolates; 27%), CC45 (18 isolates; 16.2%), CC59 (3
isolates; 2.7%), CC72 (2 isolates, 1.8%), CC97 (3
isolates; 2.7%) and CC121 (3 isolates; 2.7%). With few
exceptions, isolates belonging to eight out of the twelve
CCs grouped within a single SmaI-PFGE cluster.
However, most CC30 isolates were distributed into two
clusters, one including ST30 and the other ST34 (a single
locus variant of ST30 with arcC 8 instead of arcC 2).
However, a number of isolates from CC1 (ST3 and
ST188), CC9 (ST109) and CC97 (ST97) showed
relatively close SmaI-PFGE profiles, grouping together
in a single PFGE cluster. ST109 and ST97 share four
alleles with ST1, the founder of CC1. The independent
branches in the PFGE dendogram corresponded to CC1
(one), CC5 (two), CC30 (one) and CC45 (three) isolates
(Figure 2).

Sequencing-based typing methods and agr-typing.


All isolates were analyzed by spa typing and 19 isolates,
including one or two representatives belonging to each
SmaI-PFGE cluster, and showing different spa types,
were also typed by MLST. spa- and MLST-PCR
products were sequenced by Secugen S.L (Madrid,
Spain).
The
Ridom
Spa
Server
(http://spaserver.ridom.de/) and the MLST website
(http://www.mlst.net) were used to identify spa types
(termed according to the nomenclature of the spa server),
and sequence types (ST), respectively. Isolates were
grouped into a single CC when at least five of the seven
housekeeping genes used in the MLST scheme were
identical (Enright et al., 2000). The agr groups were
determined by PCR amplification using previously
reported primers and conditions (McClure et al, 2006;
Moore and Lindsay, 2001; Tenover et al., 2006).

S150

S149

S148

S147

S146

S145

S144

S142
S143

S141

S139
S140

S138

S137

S136

S135

S133
S134

S132

S128
S129
S130
S131

S126
S127

S70

S55

S51
S52

S33

S31

S11

S3

S0

kb
582.0
398.0
242.5
194.0
145.5
97.0
48.5

Figure 1. SmaI-PFGE analysis of S. aureus isolates recovered between 2004 and 2006 from healthy nasal carriers. Lane , lambda
ladder PFG Marker (New England Biolabs); lanes S, SmaI profiles, continuing the nomenclature used by Fueyo et al. (2005a, 2005b
and 2005c). S0, SmaI profile of strain NCTC 8325 used as control.

72

3. Resultados

CC121
CC30

CC30

CC59

CC15

CC25

CC5

CC45

CC8
CC72
CC1/9/97

J
0,28

0,4

0,52

0,64

0,76

0,88

SmaI-PFGE (N)
S58
S57
S28
S143
S142
S136
S25
S13
S127 (3)
S5
S7
S11 (3)
S9
S4
S126 (2)
S3 (11)
S138
S75
S134
S27
S26
S146
S139
S62 (2)
S70 (6)
S73 (2)
S71 (2)
S65
S72
S148
S63
S23
S131 (2)
S56
S55 (4)
S149
S129
S128
S130
S52 (4)
S53
S51 (6)
S54
S42 (3)
S140
S132
S33 (2)
S32
S31 (11)
S18
S0
S144
S145
S141
S137
S74 (2)
S60
S133 (2)
S150
S147
S15
S135

spa-type (N)
t159
t159
t375
t6490
t166
t166
t012
t021
t012, t6713, t7785
t012
t122
t018 (3)
t942
t012
t1515 (2)
t012 (2), t017 (2), t021, t253 (2), t275 (2), t7785
t026
t002
t216
t3952
t216
t1618
t002
t018, t275
t084 (3), t085, t346, t7756
t346, t2949
t2949, t7248
t2949
t346
t346
t3201
t6489
t078 (2)
t1054
t167 (2), t287 (2)
t078
t548
t548
t306
t002, t1340
t242
t002 (5), t071
t002
t002 (3)
t179
t050
t015, t026
t015
t015 (4), t040 (3), t798, t1618 (3)
t008
t211
t026
t148
t148
t209
t267, t1877
t267
t209 (2)
t209
t177
t177
t189

MLST (N)
ST121
ST34
ST34
ST30

ST30

ST59

ST15

ST1
ST25
ST25

ST5 (2)
ST45
ST8
ST8
ST72
ST97
ST3

agr (N)
IV
IV
III
I
III
III
III
I
III (3)
III
III
III (3)
III
III
III (2)
III (11)
I
II
IV
IV
IV
I
II
III (2)
II (6)
II (2)
II (2)
II
II
II
II
IV
I, IV
IV
IV (4)
I
II
II
II
II (4)
II
II (6)
II
II (3)
II
I
I (2)
I
I (10), IV
I
IV
I
I
I
II
I, II
I
II (2)
II
III
III
I

Isolation Year (N)


02
01
01
05
05
04
97
99
04, 05 (2)
97
99
01, 02, 05
01
01
05 (2)
99, 01 (3), 02 (3), 04, 05 (3)
05
02
05
02
01
05
05
01 (2)
01 (3), 02, 04, 05
01 (2)
01 (2)
01
01
05
01
97
05 (2)
01
01 (2), 02, 06
06
06
05
05
01, 02 (2), 05
01
01 (3), 02, 05 (2)
01
02 (3)
05
06
01, 05
99
01 (5), 02 (5), 05
02
05
05
05
05
02 (2)
02
05 (2)
05
06
99
04

Figure 2. Dendrogram showing the relatedness between SmaI-PFGE profiles, spa types, multi locus sequence types (ST), agr types
and the year(s) of isolation (between 1997 and 2006) of S. aureus recovered from nasal carriers. S0 corresponds to the SmaI profile of
strain NCTC 8325. 11 clusters associated with 12 clonal complexes were established at Jaccards coefficients of similarity (J) of 0.58
(CC1/CC9/CC97, CC30/ST30); 0.59 (CC30/ST34); 0.61 (CC25); 0.67 (CC59, CC121); 0.70 (CC5, CC45); 0.71 (CC72); 0.76 (CC8);
and 0.78 (CC15). Only seven profiles appeared as independent branches outside the corresponding cluster.

Among the 111 isolates from young healthy carriers,


the four types of agr system were represented; agrII (40
isolates, 36%) was the most frequent, followed by agrIII
(31 isolates, 27.9%), agrI (27 isolates, 24.3%), and agrIV
(13 isolates, 11.7%). A strong correlation of agrI with
CC8 and CC45, agrII with CC5, CC9 and CC15, agrIII
with CC30, and agrIV with CC121 was detected.
However, some CCs were associated with more than one
type: CC1 with agrI, agrII or agrIII; CC25 with agrI or
agrIV; CC30 with agrI or agrIII, CC45 with agrI or
agrIV; CC97 with agrI and agrII, CC121 with agrIII or
agrIV. A single isolate, recovered in 2005 (SmaI PFGE
S144; t026; CC45), was positive for lukPV (not shown).
DISCUSSION
The 111 isolates recovered from healthy carriers in a
Northern region of Spain (Asturias) were assigned to 61
SmaI-PFGE and 40 spa-types (both with DI of 0.97),
hence displaying a great diversity. Substantial diversity

of carriage isolates was also detected in previous studies,


using not only PFGE and spa-typing but also doublelocus sequence typing (DLST), which appears to be as
discriminative as PFGE, and MLST (Feil et al., 2003;
Kuehnert et al., 2006; Holtfreter et al., 2007; Collery et
al., 2008; Melles et al., 2008; Ruimy et al., 2009;
Sakwinska et al., 2009; Lozano et al., 2011). In the
present study, MLST distributed the isolates among
twelve CCs, and most of them were associated with a
particular PFGE cluster. As exceptions, CC30 was
separated into two PFGE-clusters grouping ST30 and
ST34 isolates, respectively, while three related CCs:
CC1, CC9 and CC97, coincided in a single PFGE cluster.
Accordingly, a high degree of concordance was found
between the results obtained by PFGE and MLST, as
previously reported in other studies (Cookson et al.,
2007; Hallin et al., 2007; Argudn et al., 2009). It is also
of note that spa types within each CC were closely
related, and accurately predicted the experimentally
determined STs.

73

3. Resultados
Table 1. Clonal complexes in S. aureus from young healthy carriers in comparison with two nosocomial settings in
Asturias.
Nosocomial isolates
Clonal
Healthy carriers
complexa
(1997-2006; 111)bN (%)
HUCA (2005-2006; 81)bN (%)
MNH (1996-2006; 62)bN (%)
CC1
4 (3.6)
1 (1.6)
CC5
21 (18.9)
45 (55.6)
22 (35.5)
CC8
1 (0.9)
1 (1.2)
12 (19.4)
CC9
4 (3.6)
CC12
3 (3.7)
CC15
13 (11.7)
3 (3.7)
7 (11.3)
CC25
9 (8.1)
2 (2.5)
2 (3.2)
CC30
30 (27)
15 (18.5)
2 (3.2)
CC45
18 (16.2)
9 (11.1)
9 (14.5)
CC59
3 (2.7)
1 (1.2)
1 (1.6)
CC72
2 (1.8)
1 (1.2)
1 (1.6)
CC88
3 (4.8)
CC97
3 (2.7)
CC121
3 (2.7)
1 (1.2)
2 (3.2)
a
Clonal complexes (CCs) are based on MLST and supported by other typing techniques (see test for details).
b
Period of isolation and total number of S. aureus from healthy carriers (this work), the "Hospital Universitario Central de Asturias"
(HUCA; Argudn et al., 2009), and the Monte Naranco Hospital (MNH; Argudn et al., 2011). Isolates from the HUCA that did not
grouped within SmaI-PFGE clusters in Argudn et al. (2009) were later analyzed by spa-typing or by spa-typing and MLST to
determined CCs (M. A. Agudn and M. R. Rodicio, unpublished results).

74

CC5

CC30

CC45

CC59 CC72

HUCA-S7
HC-S129
HUCA-S26
HC-S127
HUCA-S33
HC-S5
HUCA-S4
HC-S33
HUCA-S49
HC-S31
HUCA-S19
HC-S26
HUCA-S48
HC-S145
S0

Ruimy et al. (2009) have anticipated that a single CC


within carriage samples can not include more than about
one third of the population, because competition between
lineages limits the frequency of any single genotype.
Consistent with this, the frequencies of the CCs detected
in our collection ranged between 0.9 and 27%. In several
European countries, including UK, Ireland and France, as
well as in another Spanish region (La Rioja), the highest
frequency corresponded to CC30, which included 20 up
to 33% of the analyzed isolates (Feil et al., 2003; Collery
et al., 2008; Ruimy et al., 2009; Lozano et al., 2011),
while in Switzerland CC30 and CC45 were detected at
the same frequency of 24% (Sakwinska et al., 2009). In
Asturias, CC30 (27%) was also the most common,
followed by CC5, CC45, CC15 and CC25 (18.9 to 8.1%),
and by other infrequent lineages (CC1, CC8, CC9, CC59,
CC72, CC97 and CC121; 3.6 to 0.9%).
Several CCs found in young healthy carriers from
Asturias have also been circulating, at different
frequencies, in two hospitals located in the same region:
the central universitary hospital of Asturias (HUCA), and
a long-term care facility (MNH) (Table 1). In both, CC5
was clearly predominant (55.6 and 35.5%, respectively),
followed by CC30 and CC45 in the HUCA (18.5 and
11.1%, respectively), and by CC8, CC45 and CC15 in
the MNH (19.4, 14.5 and 11.3%, respectively) (Argudn
et al., 2009; Argudn et al., 2011). Interestingly, identical
SmaI-PFGE types were shown by MSSA from healthy
carriers in the community and clinical samples in the
HUCA (Argudn et al., 2009). These included S5, S31,
S33, S26, S127, S129 (using the numbers assigned to
SmaI-PFGE profiles here reported), within the CC5,
CC30, CC45 and CC59 clonal complexes (Figure 3).
Moreover, consistent with the ability of diverse MSSA to
act as recipients of the SCCmec cassette (Nbel et al.,
2008), the S48 profile, shown by a MRSA ST72SCCmec IVc clone (CC72) of the HUCA, was similar to
the S145 generated from a MSSA isolate in the
community. These profiles differed in a single fragment,
of 143.8 and 196.2 kb in the MSSA and MRSA strains,
respectively, being of note that the 196.2 kb fragment
hybridized with a mecA probe (Figure 3).
The genetic relatedness between MSSA strains
circulating in the community and CA-MRSA clones has

kb
582.0
398.0
242.5
194.0

mecA

145.5
97.0
48.5

Figure 3. Identical or similar SmaI-PFGE profiles generated


from S. aureus isolates recovered from healthy carriers (HC) in
the community and clinical samples in the Hospital
Universitario Central de Asturias (HUCA). S0 corresponds to
the SmaI profile of strain NCTC 8325. The 196.2 kb fragment of
the HUCA-S48 profile which hybridized with the mecA probe is
indicated on the gel.

also been demonstrated (Gomes et al., 2006), and it is


widely accepted that the pool of circulating MSSA
strains is an important parameter with regard to the
epidemiology of MRSA clones in the community (Layer
et al., 2006; Lamers et al., 2010). In the present study,
MSSA clones sharing spa-types/STs of major CA-MRSA
clones have been detected, namely t012, t021 and
t028/ST30, t008/ST8 and t216/ST59, associated with the
Southwest Pacific, USA300 and USA1000 MRSA
clones, respectively. In contrast, isolates with the genetic
backgrounds of the European (ST80) and USA400 (ST1)
clones (Patel, 2009; Deurenberg and Stobberingh, 2009)
were not found. With regard to livestock associatedlineages, t267/ST97, pertaining to CC97, was represented

3. Resultados
among S. aureus from healthy carriers both in Asturias
and La Rioja (Lozano et al., 2011). Isolates within CC97
have been recovered from cattle, being responsible for
most cases of bovine mastitis, and they were recently
reported in pigs (Rabello et al., 2007; Gmez-Sanz et al.,
2010). In contrast, ST398/CC398 was not present in
young healthy carriers from Asturias. ST398 MRSA
isolates are widely associated with food-producing
animals, particularly pigs, in many European countries,
including Spain (Lozano et al., 2009; Gmez-Sanz et al.,
2010), and have also been detected in healthy carriers
(Lozano et al., 2011).
In summary, results of the present study revealed the
high diversity of MSSA isolates found in healthy carriers
from Asturias, and corroborated CC30, CC5 and CC45 as
the most successful colonizers. It was also shown that
apparently identical isolates, as well as MSSA and
MRSA counterparts, are circulating in the nosocomial
setting and the community, highlighting the role of nasal
colonization in the epidemiology of S. aureus.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by the Spanish Ministry of
Science and Innovation (project FIS-PI080656). M. A.
Argudn was the recipient of grant FPU AP-2004-3641
from the Ministry of Science and Innovation, Spain, cofunded by the European Social Fund.
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Staphylococcus aureus infections. Lancet Infect Dis 2005, 5: 751762.

76

3. Resultados

3.2.2. Artculo 5

Virulence profiles of Staphylococcus aureus isolates from young


healthy carriers
M. A. Argudn1, Argumosa V1, M. C. Mendoza1, and M. R. Rodicio1
Department of Functional Biology. Laboratory of Microbiology. University of Oviedo. Oviedo, Spain1
The S. aureus isolates from healthy carriers were analysed for the presence of 35 putative virulence (V)
determinants. All isolates were positive for two to five haemolysins, and most carried the leukotoxin lukED genes
(86.1%) and some superantigen toxin genes (between 1 to 16). None of the isolates was positive for lukM, see, ses
and set. 38 isolates (88.4%) carried an enterotoxin gene cluster (egc or egclike, including seg, sei, sem, sen, seo
seu), and 40 (93%) were positive for some classic enterotoxin gene (sea, seb, sec, sed), sometimes together with
other infrequent se-genes. In addition, 67% (29/43) of the strains generated positive agglutination with one up to
four sera specific for SEA, SEB, SEC and SED, and all of them contained the corresponding se genes, as
determined by the PCR method. Accordingly, a good corelation between immunological and PCR detection of
SEs was found. As exceptions, three sea-sec, six sea, and four sec positive isolates were negative for agglutination
with sera against the encoded SEs. Particular gene combinations were compatible with the presence of mobile
genetic elements like prophages, different types of the Sa genomic island, pathogenicity islands (SaPIs), and
plasmids. The nasal S. aureus population appears to be different from the S. aureus circulating in hospitals, but
nasal colonization with strains carrying numerous virulence determinants could be considered as a risk for
public health.
Keywords: exotoxin genes, lukPV, tst, egc cluster, se genes.
INTRODUCTION
The pathogen Staphylococcus aureus is a member of
the natural microbiota of the skin and mucosa of humans
and animals. A high proportion of healthy humans carry
this bacterium persistently (rate 10-35%) or
intermittently (rate 16-75%) Kluytmans et al., 1997;
Kluytmans and Wertheim, 2005). The carriage of S.
aureus has been recognized as a risk factor for
opportunistic infections, and a large proportion of
hospital infections are of endogenous origin (Wertheim
et al., 2005). The ability of S. aureus to cause disease
depends on the presence of virulence (V) determinants,
many of them located on mobile genetic elements like
genomic islands (Sa), pathogenicity islands (SaPIs),
bacteriophages and plasmids (Lindsay et al., 2008). The
vast majority of S. aureus isolates produce cytotoxins
(i.e. haemolysins) and enzymes whose main function is
to convert local host tissues into nutrients required for
bacterial growth, and to promote spreading of the
pathogen through the host body. Some isolates secrete
more additional toxins, such as bicomponent leukotoxins
(LukF-LukS, encoded by luk-genes) (Kaneco and Kamio,
2004); toxic shock syndrome toxin (TSST-1, tst gene)
and enterotoxins (SEs, se-genes), belonging the last two
to the pyrogenic toxin superantigens (PTSAgs) (Larkin et
al., 2009; Argudn et al., 2010). Most cases of severe S.
aureus disease are due to the cumulative effects of
several virulence (V-) determinants (Becker et al., 2003,
Peacock et al., 2002), and the S. aureus isolates from
healthy carriers have been demonstrated to be toxigenic,
contributing to the pool of virulence determinants (Fueyo
et al., 2001; Fueyo et al., 2005a; Fueyo et al., 2005b;
Bania et al., 2006; Becker et al., 2003; Holtfreter et al.,
2007; Lozano et al., 2011). However, some differences in
the toxin carriage have been found, depending of the
origin of the population under study. To reinforce the
knowledge of the distribution of V-determinants among

isolates from healthy carriers, in the present study a


series of forty-three isolates, recovered between 2004 and
2006 from the nasal cavities of healthy students at the
Faculty of Biology of the University of Oviedo, Spain,
were analysed for production of classic enterotoxins
(SEA to SED), and for distribution of 35 genes encoding
haemolysins, leukotoxins, exfoliatins, the toxic shock
syndrome toxin, enterotoxins (SEs), enterotoxin-like
toxins (SEls), and markers of mobile genetic elements.
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains. The forty-three S. aureus isolates
included in this study were collected from the nasal
cavities of healthy carriers, with not known association
with nosocomial settings (students at the Faculty of
Biology, University of Oviedo, Spain), during 2004 to
2006. These isolates have been previously characterized
by means of SmaI-Pulsed-Field Gel Electroforesis
(PFGE), spa-typing and Multi Locus sequencing typing
MLST (Argudn et al., Article 4), and for antimicrobial
susceptibility (Argudn et al., Article 6).
PCR amplification. Detection of V-determinants
was achieved by polymerase chain reaction (PCR) using
the primers and protocols previously reported for
screening of genes encoding haemolysins (hla, hlb, hld,
hlg, hlg-2), leukotoxins (lukED, lukM, lukPV), exfoliatins
(eta, etb, etd), toxic shock syndrome toxin (tst), SEs (sea,
seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, ser, ses, set), SELs (selj,
selk, sell, selm, seln, selo, selp, selq, selu), and markers
of pathogenicity and genomic islands (ear, splB, bsaB)
(Argudn et al., 2009; Argudn et al., 2011; Argudn et
al., Article 3). In all PCR-assays positive and negative
controls were included (Fueyo et al., 2005a, Argudn et
al., 2009; Argudn et al., 2011).

77

3. Resultados
Table 1. Virulence gene profiles of Staphylococcus aureus isolates recovered from healthy carriers.
Isolates /Year

Genotype

CCa

LMUO1/04
LMUO2/04
LMUO3/04
LMUO4/04
LMUO5/04
LMUO1/05
LMUO2/05
LMUO3/05
LMUO4/05
LMUO5/05
LMUO6/05
LMUO7/05
LMUO8/05
LMUO9/05
LMUO10/05
LMUO11/05
LMUO12/05
LMUO13/05
LMUO14/05
LMUO15/05
LMUO16/05
LMUO17/05
LMUO18/05
LMUO19/05
LMUO20/05
LMUO21/05
LMUO22/05
LMUO23/05
LMUO24/05
LMUO25/05
LMUO26/05
LMUO27/05
LMUO28/05
LMUO29/05
LMUO30/05
LMUO31/05
LMUO32/05
LMUO33/05
LMUO1/06
LMUO2/06
LMUO3/06
LMUO4/06
LMUO5/06

hla/d/g/gv-lukED-sea/c-splF
hla/b/d/g/gv-lukED-sea-splF
hla/b/d/g-lukED-tst-sea/c/h-egc2-splF
hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sea/h-egc2-splF
hla/d/g-lukED-tst-sea/c-egc2
hla/b/d/g/gv-lukED-eta-sea/d/h/lj/r-egc2
hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sea/c/lk/ll/lq-egc1
hla/b/d/g/gv-lukED-eta-sea-egc2
hla/b/d/g/gv-lukED-eta-tst-sea/h-egc2
hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b/d-sea/b/c-egc2-ear-splF-bsaB
hla/d/g/gv-lukED-eta/d-sea/c/ll-egc1
hla/b/d/g/gv-lukED-sea/c/ll/lp-egc1
hla/d/gv-sea
hla/d/g/gv-lukED-eta/d-tst-sea/b/c/h-egc1
hla/b/d/g/gv-lukED-eta/d-tst-sea/b-egc2
hla/b/d/g/gv-lukED-sea-egc1
hla/d/g-tst-sea-egc2
hla/b/d/g-lukED-eta/d-tst-sea/c/h/lp-egc2
hla/b/d/g/gv-lukED-eta-tst-sea-egc2
hld/g-egc1-ear
hla/b/d/g/gv-lukED-etd-sed/lj/r-egc1-splF
hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sea/c-egc2-splF
hla/b/d/g/gv-lukED-egc1-splF
hla/b/d/g/gv-lukED-sea/b/h
hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sea/b/c/d/lj/lk/ll/lq/r-egc2-ear-bsaB
hla/b/d/g/gv-lukED-etd-tst-sea/b/c/d/h/lj/lk/lq/r-egc2-ear
hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sea/c/d/lj/r-egc2
hla/d/g/gv-lukED-etb-tst-sea/h-ear
hla/b/d/g/gv-tst-sea/b/d/lj/r-egc2
hla/b/d/g/gv-lukED-etd-seb-egc1
hla/b/d/g/gv-lukED-etd-sea/b/c/ll-egc1-ear
hla/b/d/g-lukED-etd-tst-seh-egc2
hla/b/d/g-lukED-tst-sea-egc2-splF
hla/b/d/g-sea-egc2
hla/b/d/g/gv-lukED-etb/d-sea/lp-egc2-splF
hla/d/g/gv-lukED/PV-etb/d-tst-sea/h/lp/-egc2
hla/b/d/gv-lukED-sea/c/lp-egc2-splF
hla/b/d/gv-lukED-tst-sea/c-egc2
hla/b/d/g/gv-lukED-etb-sed/lj/lk/lp/lq/r-egc1-ear-splF
hla/b/d/g/gv-lukED-etd-sec/d/ll/lp/lj/r-egc1-ear-splF
hla/d/g-lukED-sec/d/lj/ll/r-egc1-ear
hla/b/d/g/gv-etb/d-seb/c/d/h/lj/r-egc1-splF-bsaB
hla/d/gv-lukED-etd-sed/lj/r-egc1-splF

CC15
CC1
CC30
CC30
CC30
CC9
CC9
CC9
CC9
CC25
CC5
CC5
CC15
CC45
CC30
CC5
CC30
CC5
CC30
CC45
CC5
CC30
CC5
CC30
CC59
CC30
CC30
CC15
CC30
CC25
CC72
CC30
CC30
CC45
CC5
CC45
CC72
CC45
CC5
CC25
CC45
CC1
CC25

Clonal complexes determined in Argudn et al., Article 4.


egc1, cluster with seg, sei selm, seln and selo genes; egc2, cluster with seg, sei selm, seln, selo and selu genes; LMUO, Laboratory of
microbiology of the University of Oviedo; N, number of isolates when more than one; nd, not-determined.

Detection of enterotoxins. Production of classic


enterotoxins (SEA, SEB, SEC and SED) was detected by
reverse passive latex agglutination, using following the
manufacturers instructions (Oxoid). All isolates were
tested at least twice to ensure the results.
Statistical methods. For each trait, statistical
comparison between B- and W-isolates was performed
using the 2 test. Differences between groups were
considered statistically significant if P values were <
0.05. The discrimination index (DI; the probability that
two unrelated isolates would be assigned to different
virulence profiles) was calculated using Simpsons index
of diversity (Struelens et al., 1996).
RESULTS
As shown in Table 1, each of the analyzed isolates
has a unique V-profile. All of them were positive for two
to five haemolysins, and most carried the leukotoxin

78

lukED genes (86.1%, 37/43) as well as some


superantigen toxin genes (between 1 to 16; average of
8.4). Thirty eight isolates (88.4%) carried an enterotoxin
gene cluster (egc1 or egc2, including seg, sei, selm, seln,
selo seu), and 40 (93%) tested positive for some classic
enterotoxin gene (sea, seb, sec, sed), sometimes together
with other infrequent se-genes. In addition, 67% (29/43)
of the strains generated positive agglutination with one
up to four sera specific for SEA, SEB, SEC and SED,
and all of them contained the corresponding se gene(s),
as determined by PCR. Accordingly, a good correlation
between immunological and PCR detection of SEs was
found. However, three sea-sec, six sea, and four sec
positive isolates were negative for agglutination with sera
against the encoded SEs. Of all the exotoxin genes
screened, only four: lukM, see, ses and set, were not
detected in any isolate.
The percentages of individual V-genes were: hla
(97.7%, 42/43), hlb (74.4%, 32/43),hld (100%, 43/43),
hlg (90.7%, 39/43), hlg-variant (79.1%, 34/43), lukPV

3. Resultados
Table 2. Distribution of suspected mobile genetic elements: genomic islands, pathogenicity islands, prophages and
plasmids, among clonal complexes associated with S. aureus isolates from nasal healthy carriers.
Gene or gene combinations

Mobile genetic elementa

CCs (N)b

lukED
egc1
egc2
lukED-egc1
lukED-egc2
lukED-splF
lukED-egc1-splF
lukED-egc2-bsaB
egc2-splF + lukED
lukED-bsaB-splF / egc2-splF

nd
nd
nd
nd
nd
nd
Sa I
nd
Sa III + nd
Sa II / Sa III

CC15, CC30
CC1, CC45
CC30 (2), CC45
CC5 (3), CC9, CC25, CC45 (2), CC72
CC5, CC9 (3), CC30 (6), CC45 (2)
CC1, CC15
CC5 (3), CC25 (2)
CC59
CC5,CC30 (4), CC72
CC25

etd
ear-tst-selk-selq
tst
ear-seb-selk-selq + sea
ear-selk-selq
ear-sec-sell
ear-sec-sell / ear-tst-sec-sell

etd SaPI
SaPI1
SaPI2
SaPI3 + Sa3
SaPI5
SaPImw2
SaPImw2/ SaPIn1 / SaPIm1

CC1, CC5 (4), CC25 (4), CC30 (3), CC45 (2), CC72
CC30, CC59
CC5, CC9 (2), CC15, CC30 (11), CC45 (3)
CC30, CC59
CC5
CC25, CC45, CC72
CC59

eta
lukPV
sea

Sa1
Sa2
Sa3

selp
sea-selk-selq

Sa3
Sa3

CC5 (2), CC9 (3), CC25, CC30 (2), CC45


CC45
CC1, CC5 (5), CC9 (3), CC15 (3), CC25, CC30 (11), CC45 (4),
CC72 (2)
CC5 (4), CC25, CC45, CC72
CC9

etb
seb
sed-selj-ser

pETB
pZA10
pIB458 family

CC1, CC5 (2), CC15, CC25, CC45


CC1, CC25 (2), CC30 (4), CC45, CC72
CC1, CC5 (2), CC9, CC25 (2), CC30 (3), CC45, CC59

seh

MGEmw2/mssa476

CC1, CC5, CC9 (2), CC15, CC30 (5), CC45 (2)

The nomenclature is based in Baba et al. (2008) for genomic islands (vSa and vSa), Novick and Subedi (2007) and Yamaguchi et
al. (2002) for pathogenicity islands (SaPIs), Goerke et al. (2009) for prophage types, Noto and Archer (2006) for the
MGEmw2/mssa476 element and Altboum et al, (1985), Yamaguchi et al. (2001); Ono et al. (2008) for plasmids.
b
Clonal complexes determined in Argudn et al., Article 4.
egc1, cluster with seg, sei selm, seln and selo genes; egc2, cluster with seg, sei selm, seln, selo and selu genes; N, number of isolates
when more than one; nd, not-determined.

(2.3%, 1/43), eta (20.9%, 9/43), etb (14%, 6/43), etd


(34.9%, 15/43), tst (46.5%, 20/43), sea (76.7%, 33/43),
seb (23.3%, 10/43), sec (44.2%, 19/43), sed-selj-ser
(25.6%, 11/43), seg-sei-seln-selm-selo (88.4%, 38/43),
seh (27.9%, 12/43), selk-selq (9.3%, 4/43), sell (16.3%,
7/43), selp (16.3%, 7/43), and selu (53.5%, 23/43). Three
other genes screened as markers of SaPIs or Sa: ear,
splF and bsaB, appeared in 20.9% (9/43), 34.9% (15/43)
and 7% (3/43) of isolates. The presence of certain gene or
gene combinations could be associated with known
genomic or pathogenicity islands, prophages or plasmids
(Table 2). Different combinations of lukED, egc-genes,
splF and bsaB support the presence of reported variants
of Sa: type 1 (lukED-egc-splF, 5 isolates), type 2
(lukED-bsaB-splF, one isolate) and type 3 (egclike-splF, 7
isolates). The isolates with tst showed gene combinations
compatible with the presence of SaPI1 (ear-tst-selk-selq,
2 isolates), SaPIn1/SaPIm1 (ear-tst-sec-sel, one isolate)
or with SaPI2 (tst, 18 isolates). Other gene combinations
were consistent with SaPImw2 (ear-sec-sel, 4 isolates),
SaPI3 (ear-seb-selk-selq, 2 isolates) or SaPI5 (ear-selkselq, one isolate). The ETA prophage (eta), and Sa
prophages carrying lukPV, sea, selp, and sea-selk-selq, as
well as plasmids carrying etb, seb, sed-selj-ser and seh
could be also represented (Table 2).

DISCUSSION
In the present study 35 exotoxin genes were screened
in isolates collected from young healthy students without
relationship with the hospital setting during 2004 to 2006
in Asturias (a region located in the North of Spain). A
previous study was performed with nasal S. aureus
recovered between 1997 and 2002 in the same region
(Fueyo et al., 2005a). Interestingly, most exotoxin genes
were more frequent during the 2004-2006 period than in
the previous period: eta (20.9% vs. 0%), etb (14% vs.
0%), etd (34.9% vs. 0%), tst (46.5% vs. 22%), sea
(76.7% vs. 7%), seb (23.3% vs. 7%), sec (44.2% vs.
4.7%), sed-selj-ser (25.6% vs. 5.8%), selk-selq (9.3% vs.
3.5%), seh (27.9% vs. 7%), sell (16.3% vs. 2.3%), selp
(16.3% vs. 0%) and egc2 (53.5% vs. 23.3%). All
differences, except selk-selq, were statistically
significative (p-value < 0.05), underlying the capacity of
commensal S. aureus to acquire and act as a reservoir of
virulence determinants.
When isolates collected during 2006 in the central
univerisity hospital of Asturias (Argudn et al., 2009)
were compared with the healthy carrier isolates analyzed
in the present study, the hospital isolates had higher
percentages of etb (89% vs. 14%), sec (80.2% vs. 44.2%),
egc1 (71.6% vs. 32.6%), selp (24.7% vs. 16.3%) and eta

79

3. Resultados
(43.2% vs. 20.9%), and lower percentages of sea (55.6%
vs. 76.7%), egc2 (28.4% vs. 53.5%), etd (17.3% vs.
34.9%), seh (12.3% vs. 27.9%), sell (2.5% vs. 16.3%),
selq (3.7% vs. 9.3%), and selk (2.5% vs. 9.3%). The
differences were statistically significative (p-value <
0.05) for eta, etb, sec and egc1 in the first group, and for
etd, sea, seh, sell and egc2 in the second group. Similar
percentages were only found for seb (27.2% vs. 23.3%)
and sedseljser (24.7% vs. 25.6%).
Differences in exotoxin gene carriage between nasal
and invasive isolates have been reported in other studies
(Nashev et al., 2004; Nashev et al., 2007; Peacock et al.,
2002; Becker et al., 2003; Holtfreter et al., 2007;
Lawrynowicz-Paciorek et al. 2007). In general, the genes
for the egc locus are usually more common among nasal
isolates than invasive isolates, and it has been proposed
that the egc-encoded toxins could enhance the carriage
potential of S. aureus (van Belkum et al., 2006; Peacock
et al., 2002; Becker et al., 2003). In Asturias, however,
100% of the nosocomial isolates and 86.1% of the nasal
isolates carried egc1 or egc2, with the latter being
significantly more frequent in nasal isolates. Interestingly
all isolates, except one, carried sea together with egc2, a
combination that was reported in other nasal isolates
(Lawrynowicz-Paciorek et al. 2007).
Individual exotoxin genes or some groups of genes
could be carried by well known mobile genetic elements,
including genomic islands, pathogenicity islands,
prophages, and plasmids (Table 2). However, new
exotoxin gene combinations were also found, and these
could correspond to variants which can be originated
through deletions or recombination, as reported (Hu et
al., 2008; Collery et al., 2008; Collery et al., 2009). This
is particularly true in the case of Sa, the genomic
island where the egc1 and egc2 clusters have been
located (Baba et al., 2008). In the present work, only
27.9% of the analyzed isolates carried gene combinations
consistent with Sa type 1 (egc1) and Sa type 3
(egc2), while 88.3% of the isolates tested positive for
egc1/egc2 genes.
The distribution of suspected mobile genetic
elements (and exotoxin genes herein), among the clonal
complexes which include S. aureus from young healthy
carriers (Argudn et al., Article 4) is shown in Table 2.
The majority of the detected genes were previously
reported in the corresponding CC (Argudn et al., 2009;
Argudn et al., Article 3; Holtfreter et al., 2007;
Varshney et al., 2009; Monecke et al., 2009, Monk et al.,
2004, Schlebusch et al., 2009; Peck et al., 2009; Lozano
et al., 2011), but new associations were also found. For
instance, CC1 with seb and etb, CC25 with eta and etb,
and CC72 with lukED, etd and seb. It is of note that a
single isolate within CC45 carried the lukPV genes,
which encode the bi-component Panton-Valentine
leukocidin and are located in a prophage. This toxin has
been associated with severe skin and pulmonary
infections caused by community acquired MRSA (Patel
et al., 2009). Detection of lukPV in commensal S. aureus
is important, because of its possible transfer to CAMRSA (Deurenberg et al., 2010). The frequency of tst in
isolates from healthy students analyzed in the present
work (46.5%) was considerably higher than in healthy
individuals from other studies (20-30%; Mgevand et al.,
2010; Lozano et al., 2011). This gene, carried by
different SaPIs, has been mainly associated with CC30,
one of the most successful lineages in human
colonization, but here it was also found in CC5, CC9,

80

CC15, CC45 and CC59. The eta, etb and etd exfoliatin
genes, reported in SaPIs, prophages and plasmids (Table
2), were also frequent (20.9, 14 and 34.9%, respectively)
and widely distributed, appearing in five (eta and etb) or
six (etd) CCs. In contrast with our results, the prevalence
of exfoliatin genes in S. aureus from healthy carriers is
generally low (Becker et al., 2003; Lozano et al., 2011).
Since exfoliatins have been associated with scalded skin
syndrome and bulbous impetigo (Nishifuji et al., 2008),
their relatively high incidence in commensal S. aureus
from Asturias is worrisome. Other mobile genetic
elements, including the Sa3NM3u prophage carrying
sea, and the pIB458-like plasmids carrying sed-selj-ser
were also common and widely spread, appearing in nine
and seven CCs, respectively (Table 2).
In summary, nasal S. aureus from young healthy
carriers in Asturias were highly diverse with regard to
exotoxin gene content. In fact, each isolate showed a
distinct profile and thus, genotyping by this means has a
DI of 1. The number of exotoxin genes per isolate ranged
from 4 up to 23, and the presence of antibiotic resistance
determinants in these isolates has also been demonstrated
(Argudin et al., Article 6). Nasal colonization with strains
resistant to antimicrobials and carrying numerous
virulence genes can be considered as a risk for public
health, underlying the potential problems associated with
their dispersion among the healthy population.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by the Spanish Ministry of
Science and Innovation (project FIS-PI080656). M. A.
Argudn was the recipient of grant FPU AP-2004-3641
from the Ministry of Science and Innovation, Spain, cofunded by the European Social Fund.
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81

3. Resultados

82

3. Resultados

3.2.3. Artculo 6

Molecular basis of antimicrobial drug resistance of


Staphylococcus aureus isolates recovery from university
students in a Spanish region
M. A. Argudn1, M. C. Mendoza1, M. Cruz Martn2 and M. R. Rodicio1
Department of Functional Biology. Laboratory of Microbiology. University of Oviedo. Oviedo, Spain1; Instituto de
Productos Lcteos de Asturias (CSIC). Villaviciosa. Asturias, Spain.2
The frequency and genetic basis of antimicrobial drug resistance were determined for 111 Staphylococcus
aureus isolates recovered from young healthy human carriers, during 1997 to 2006. The highest frequency of
individual resistances corresponded to ampicillin-penicillin (84.7%), followed by kanamycin (27%),
erythromycin (25.2%), clindamycin (22.5%;7.2% constitutive, 10.8% inducible and 4.5% alone), tetracycline
(11.7%), amikacin and tobramycin (6.3% each), gentamicin (5,4%), chloramphenicol (2.7%), ciprofloxacinmoxifloxacin (0.9%; MIC 4 g/ml) and mupirocin (0.9%; MIC 60 g/ml). None of the isolates was resistant to
oxacillin, trimethoprim-sulfamethoxazole, rifampicin, vancomycin, tigecycline and linezolid. The number of
resistances to unrelated antimicrobial per isolate was zero (6.3%), one (49.6%), two (27%), three (15.3%), and
four (1.8%, here considered as multiresistant). The resistant isolates were distributed into 31 profiles, most
shown by a single isolate (67.7%). In nearly all S. aureus with phenotypic resistance, at least one gene accounting
for such resistance was identified. The detected resistance determinants were blaZ; ermA-ermB-ermC-msrAmsrB-linA/linA; aphA-aadE-sat4-aacA+aphD-aadD; tetK; cat::pC194-cat::pC221; and qacA/B, for ampicillinpenicillin, macrolides and/or lincosamides, aminoglycosides, tetracycline, chloramphenicol, and compounds of
quaternary ammonium, respectively. In all isolates carrying cat::pC194 or cat::pC221, and in most isolates
positive for blaZ, blaZ::Tn552, ermC, mrsA, mrsB and/or tetK, the gene(s) mapped on plasmids, which have
probably contributed to the spread of antimicrobial resistance in commensal S. aureus.
Keywords: healthy carriers, resistance; plasmid.
INTRODUCTION
Along the last decades the World Health
Organization (WHO), the European Commission and the
European Antimicrobial Resistance Surveillance System
have recognized the importance of studying the
emergence of antimicrobial resistance in different
pathogen bacteria, and the genetic determinants involved,
in order to provide the basis for prevention programs and
assessment
of
their
effectiveness
(http://www.who.int/en/; http://ec.europa.eu/index_en.
htm; http://www.rivm.nl/earss/). Staphylococcus aureus
is one of the indicator organisms, due to its relevance as a
major and versatile human pathogen, capable of causing
superficial and deep, often life threatening, infections
(Lowy, 1998), and to the gradual evolution of resistance
towards the major classes of antimicrobial agents, which
impairs their treatment (Woodford, 2005; Gold and
Pillai, 2009).
Despite this, S. aureus is primarily a commensal
organism which inhabits a high proportion of healthy
humans, with estimations of about 10-35% and 16-75%
for persistent and intermittent colonization, respectively
(Kluytmans et al., 1997; Kluytmans and Wertheim,
2005). The anterior nares are the main ecological niche
of the bacterium, which can also be found in several
other sites, including the throat, skin and gastrointestinal
tract (Kluytmans et al., 1997). The carriage state has long
been recognized as a risk factor for opportunistic
infections, which occur when the pathogen enters in
contact with breached mucosal or cutaneous barriers
(Wertheim et al., 2005). It has been estimated that a large
percentage of S. aureus infections happening in hospitals,

including those affecting surgical wounds and causing


bacteraemia, are of endogenous origin, and some studies
have also identified nasal carriage as a risk for
community-onset infections (Wertheim et al., 2005).
The relevance of S. aureus as a major human
pathogen has prompted a wealth of studies on its
epidemiology, virulence and resistance, both in hospital
setting and the community, paying special attention to
the emergent and pandemic methicillin resistant S.
aureus (MRSA) clones (i.e, Enright et al., 2002; Oliveira
et al., 2002; Deurenberg and Stobbering, 2009).
However, studies on commensal S. aureus are
comparatively scarce, although they can be critical to our
understanding on the evolution and dissemination of this
important pathogen (i.e. Sa-Leao et al. 2001; Fueyo et
al., 2005; Melles et al., 2008; Ruimy et al., 2009; van
Belkum et al., 2009; Sakwinska et al., 2009; Lozano et
al., 2011). Within this scenario, the present study aimed
to establish the frequency, phenotypic patterns and
genetic basis of antimicrobial drug resistance for a
collection of S. aureus recovered from young healthy
human carriers with not known association with healthcare facilities, during a period of ten years (1997 to
2006).
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains. The 111 S. aureus isolates
analyzed in this study have been collected from the nasal
cavities of young healthy carriers (students at the Faculty
of Biology of the University of Oviedo; Spain), between
1997 and 2006. The isolates were characterized by means
of SmaI-PFGE profiles, spa-typing and multilocus

83

3. Resultados
sequence typing (MLST) in previous studies (Fueyo et
al., 2005, Argudn et al., Article 4).
Antimicrobial susceptibility testing. All isolates
were tested for antimicrobial susceptibility by the disk
diffusion method, using commercially available discs
(Oxoid), or by the agar dilution method for tested
minimal inhibitory concentrations. In both cases, the
medium used was Mueller-Hinton agar and the results
were scored according to the Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI, 2009). The families and
antimicrobials tested included: beta-lactams [ampicillin
(AMP), penicillin (PEN), and oxacillin (OXA, used as a
substitute for methicillin)], MLS group [erythromycin
(ERY) and clindamycin (CLI)], aminoglycosides
[gentamicin (GEN), tobramycin (TOB), kanamycin
(KAN), and amikacin (AMK)], tetracycline (TET),
chloramphenicol (CHL), trimethoprim-sulfamethoxazole
(SXT), quinolones [ciprofloxacin (CIP) and moxifloxacin
(MXF)], rifampicin (RIF), mupirocin (MUP),
vancomicin (VAN), tigecycline (TGC) and linezolid
(LZD). MICs for ciprofloxacin (Sigma-Aldrich, Spain),
mupirocin (GlaxoSmithKline, Spain) and vancomycin
(Laboratorios Normon SA, Madrid, Spain) were
determined by the agar dilution method using ranges
from 0 to 8 g/ml, 0 to 80 g/ml and 0 to 4 g/ml
respectively. The breakpoints in the case of mupirocin
resistance were categorized as low (MIC 8 to 64 mg/l)
and high ( 512 g/ml) (Patel et al., 2009). To estimate
the
rate
of
inducible
macrolide-lincosamidestreptogramin B (MLS) resistance, the double-disk
diffusion test (D-Zone test) was performed on isolates
that were susceptible to clindamycin and resistant to
erythromycin, as reported (Steward et al., 2005). S.
aureus ATCC 29213, NCTC 8325 and several resistant
isolates were included as controls in different
experiments (Argudn et al., 2009; Argudn et al., 2011).
Isolation of genomic DNA, PCR amplification,
and DNA sequencing of resistance determinants.
DNA was extracted as reported (Martin et al., 2003), and
PCR assays always included negative and positive
controls. Primers were selected according to the
resistance phenotypes of the isolates, and were
previously described for genes conferring resistance to

aminoglycosides (aacA+aphD, aadD and aphA; Schmitz


et al., 1999), chloramphenicol (fexA; Kehrenberg and
Schwarz, 2005), disinfectant compounds (qacA/B; Sidhu
et al., 2002), MLS group (ermC, msrB and linA/linA;
Lina et al., 1999), and tetracycline (tetK, tetL and tetO;
Strommenger et al., 2003, Ng et al., 2001 and Huys et
al., 2005, respectively), or designed for this study (Table
1). The mechanism of resistance to ciprofloxacin was
also addressed by sequencing of DNA fragments
including the quinolone-resistance determining region
(QRDR) of the DNA gyrase (gyrA and gyrB),
topoisomerase IV (grlA and grlB) genes and a region of
the promoter of the NorA transporter (PnorA) (Horii et
al., 2003). The nucleotide sequences were determined at
SECUGEN S.L. (Madrid, Spain), and the generated
sequences
were
analyzed
with
BlastN
and
ClustalW
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
(http://www.ebi.ac.uk).
Plasmid analysis. Plasmid DNA was extracted by
the alkaline lysis method with lysostaphin (Sigma, St.
Louis, USA) (Sambrook and Russell, 2000), and digested
with HindIII following to the manufacturers instructions
(Takara Bioquemicals, France). The generated fragments
were separated by electrophoresis on agarose gels (0.75%
w/v in TBE buffer), transferred onto nylon membranes
by Southern blotting (Sambrook and Russell, 2000), and
hybridized with probes specific for blaZ, p480 (Tn552),
ermC, msrA, msrB, aacA+aphD, aadD, aphA, tetK,
cat::pC194 or cat::pC221. The probes were generated
with the PCR DIG labelling mix (Roche Diagnostics,
Barcelona, Spain), which includes digoxigenin-labelled
dUTP in addition to the four dNTPs. The amplicons were
then purified with the GFXTM DNA and Gel Band
Purification Kit (VWR, Barcelona, Spain), and the
hybridizing fragments were detected with the "DIG
Nucleic Acid Detection Kit" (Roche).
RESULTS
Antimicrobial drug resistance in S. aureus isolates
from young healthy carriers. The 111 isolates were
susceptible to oxacillin, trimethoprim-sulfamethoxazole,
rifampicin, vancomycin (MICs of 1 g/ml), tigecycline
and linezolid. Only seven isolates were susceptible to all

Table 1. Oligonucleotides designed for the present study.


a

Gene

Forward / Reverse (5-3)

blaZ
blaZ::Tn552
p480 (Tn552)
mecA
msrA
ermA
ermB
sat4
aadE
tetM
cat::pC221
cat::pC194
cat::pC223
mupA

ATGTAATTCAAACAGTTCACATGCC / ATAGGTTCAGATTGGCCCTTAGG
GAATTACATGCACTTAAAACTAAAGC / AAAAATTAGTTAGATACTTCTCCTTG
CTAACTAATTTTTCTGAAGCCAAACG / TTTAAGTGTTTTCTTCTCTGACTACG
CCCTCAAACAGGTGAATTATTAGC / TATCTTGTAACGTTGTACCCACCCC
CTCCATATACCTATGCATACAACC / CTAACGATAATTTCGTTCTTTCCCC
CCAGAAAAACCCTAAAGACACGC / TGTCTCAGATGTGAACCGAATCC
GCCATGCGTCTGACATCTATCTG / ACAATACTTGCTCATAAGTAACGG
GCAGAGCACCTGAAAGATATCG / GCGTATAACATAGTATCGACGG
AGTTAGATAATTACCTAAAGGGCG / ATATCAGCGGCATATGTGCTATCC
AATATAGGGATTGATAACCTTATAGAAG / TATCTCCAAGAACACTATTTAACTTC
TGGAAGTTGTAAATAAAAATAAAGTG / CAATCCAAGGAATCATTGAAATCGG
CAAGGGTGATAAACTCAAATACAGC / AAAGCCAGTCATTAGGCCTATCTG
AGGATATGAACTGTATCCTGCTTTG / AATAATGAAACATGGTAACCATCAC
GGTGACTCCTTATTGTACACATG / AGAAATTTCCCATTCTCCCTTCC

Amplicon (bp)
701
3151
1360
284
985
499
347
480
564
319
269
472
464
778

The genes screened in this study conferred resistance to ampicillin and penicillin (blaZ), oxacillin (mecA), erythromycin (msrA),
erythromycin and clindamycin (ermA and ermB), streptomycin (aadE), streptothricin (sat4), tetracycline (tetM), chloramphenicol
(cat::pC194, cat::pC221 and cat::pC223) and mupirocin (mupA). p480 encodes the transposase of Tn552, which can be associated with
blaZ.

84

3. Resultados
Table 2. Resistance profiles shown by single Staphylococcus aureus recovered from healthy carriers and distribution
among clonal complexes.
RProfile
R2
R4
R6
R9
R10
R12
R13
R15
R16
R17
R18
R19
R20
R22
R23
R26
R27
R28
R29
R30
R31

R-phenotype/R-genotypea

Isolate/year

ERY/[msrA-msrB] + qacA/Bd
CLI/linA
[AMK-KAN]/[aphA/nd-aadE-sat4]
AMP-[ERY-CLIC]/blaZ::Tn552-[msrB-ermC]
AMP-CLI/blaZ::Tn552-linA
AMP-KAN-AMK /blaZ::Tn552-[ aphA-aadE-sat4]
AMP-[AMK-GEN-KAN-TOB]/blaZ::Tn552-[aacA+aphD]
ERY-KAN//msrA-[aphA-aadE-sat4]
TET-ERY-CLIC/blaZ::Tn552-ermC-tetK
AMP-[ERY-CLIC]-KAN/blaZ::Tn552-[msrB-ermC]-[aphA-aadE-sat4]
AMP-[ERY-CLIC]-[GEN-KAN-TOB]/blaZ::Tn552-[msrB-ermC]-aacA+aphD
AMP-[ERY-CLII]-KAN/blaZ::Tn552l-[msrB-ermC]-[aphA-aadE-sat4]
AMP-[ERY-CLII]-[AMK-GEN-KAN-TOB]/blaZ::Tn552-[msrB-ermC]-[aphAaadE-sat4-aacA+aphD-aadD]
AMP-[ERY-CLII]-CHL/blaZ-ermC-cat::pC194
AMP-[ERY-CLIC]-[CIP-MXF]/blaZ-[msrB-ermB-ermC] ]-[glrA (Ile45 to Met)glrB (Asp422 to Glu)]
AMP-[AMK-KAN-TOB]-TET/blaZ::Tn552-[aphA-aadE-sat4-aadD]-tetK
AMP-[GEN-KAN-TOB]-TET(I)/blaZ::Tn552-tetK-[aacA+aphD]
AMP-[KAN-AMK-GEN-KAN-TOB]-TET/blaZ::Tn552-[ aphA-aadE-sat4aacA+aphD]-tetK
AMP-KAN-CHL/blaZ::Tn552]-[aphA-aadE-sat4]-cat ::pC194
AMP-ERY-[KAN-APR]-CHL/blaZ::Tn552-msrB-[aphA-aadE-sat4]cat::pC221
AMP-[ERY-CLIC]-[AMK-GEN-KAN-TOB]-MUP/blaZ-[msrA-msrB-ermClinA]-[aphA-aadE-sat4-aacA+aphD-aadD]-nd + qacA/Bd

Plasmid
profileb

Clonal
complexc

13/05
21/01
23/05
11/01
2/06
4/05
7/02
36/01
24/01
35/01
14/02
20/05
5/05

pR18
pR3
pR10
pR27
pR21
pR21
pR14
pR35

CC5
CC121
CC15
CC25
CC25
CC9
CC5
CC5
CC30
CC5
CC5
CC59
CC25

1/05
6/02

pR39
pR16

CC9
CC45

2/04
95/99
9/02

pR34
pR26
pR31

CC1
CC30
CC30

4/02
25/01

pR38
pR37

CC97
CC15

5/06

pR40

CC25

Resistance to clindamycin could be constitutive (C) or inducible (I). AMK, amikacin; AMP, ampicillin and penicillin; CHL,
chloramphenicol; CIP, ciprofloxacin; CLI, clindamycin; ERY, erythromycin; GEN, gentamicin; (I), intermediate resistance; KAN,
kanamycin; MXF, moxifloxacin; MUP, mupirocin; TET, tetracycline; TOB, tobramycin.
b
Profiles generated by digestion of plasmid DNA with HindIII, and shown to hybridize with probes for antimicrobial resistance genes.
c
Clonal complexes (CCs) as reported by Argudn et al. (Article 4).
d
Resistance to quaternary ammonium compounds was not tested.
N, number of isolates when more than 1.

tested compounds (6.3%; S-profile), the remaining


isolates were grouped into 31 R-profiles: R1 to R31
(summarised in Table 2 and 3 and detailed in Table S1
of supplementary material). The number of resistances to
unrelated antimicrobials per isolate were one (49.6%),
two (27%), three (15.3%) and four (1.8%, here
considered as multiresistant). Most R-profiles were
shown by a single isolate (Table 2), and only nine were
shared by two or more (2 up to 46 isolates; Table 3). The
highest incidence of individual resistance corresponded
to ampicillin-penicillin (84.68%), followed by
kanamycin (27%), erythromycin (25.2%), clindamycin
[22.5%; differentiated in constitutive (7 isolates);
inducible (12 isolates) or alone (5 isolates)], tetracycline
(11.7%), amikacin and tobramycin (6.3%; each),
gentamicin
(5.4%),
chloramphenicol
(2.7%),
ciprofloxacin and mupirocin (0.9%; each). The
ciprofloxacin resistant isolate has a MIC of were 4 g/ml
(profile R23), and the mupirocin resistant isolates has a
MIC of 60 g/ml (profile R31).
Genetic basis of antimicrobial drug resistance. As
shown in Tables 2, 3 and S1, all isolates resistant to
ampicillin-penicillin (83.8%) carried the blaZ lactamase gene, which was in most cases (79.6%)
associated with transposon Tn552. In fact, the expected
amplicon linking blaZ and the tranposase p480 of Tn552
was obtained in the latter isolates. One out of three
qacA/B positive isolates carried blaZ (R31), another
blaZ::Tn552 (profile R11c), and the last was susceptible

to ampicillin (R2). The genes qacA and qacB genes are


often detected in -lactamase/heavy metal resistance
plasmids that carry blaZ.
Six genes implicated in the MLS phenotype, and five
genes encoding aminoglycoside-modifying enzymes
were also tested. Regard the MLS group, resistance to
erythromycin was detected either alone or together with
clindamycin resistance (Tables 2, 3 and S1). Resistance
to only erythromycin (8 isolates; profiles R2, R7a-R7e,
R15 and R30) was associated with msr genes (which
mediate efflux of the drug). In fact, msrA, msrB, and
msrA together with msrB were present in one, five and
two of these isolates, respectively. Resistance to
erythromycin was accompanied by either inducible (12
isolates; profiles R3a-R3c, R8a-R8f, R19, R20 and R22)
or constitutive (8 isolates; profiles R9, R16, R17, R18,
R21a-R21b, R23 and R31) resistance to clindamycin.
Both phenotypes were always conferred by ermC,
although some isolates carried this gene in addition to
msrB (11 isolates), msrA+msrB (1), ermB+msrB (2) or
msrA+msrB+linA/linA (1). Five isolates were resistant to
clindamycin but susceptible to erythromycin, and they
were positive for linA/linA (profiles R4, R10 and R24aR24c).
The aacA+aphD gene [also known as aac(6)Ie+aph(2)], encoding a bi-functional aminoglycosidemodifying enzyme, was found in 5.4% (6/111) of the
isolates (profiles R13, R18, R20, R27, R28 and R31;
Table 2), all resistant to gentamicin, kanamycin and
tobramycin. The aadD gene [also termed ant(4)-Ia],

85

3. Resultados
Table 3. Resistance profiles shown by two or more Staphylococcus aureus recovered from healthy carriers and
distribution among clonal complexes.
R-Profile
(N)
S (7)
Sensible

R-phenotype/R-genotypea

R1 (46)

AMP/blaZ Tn552 msrB

R3 (3)

[ERY-CLII]/blaZ::Tn552-[ermC msrB]

Year of isolation
(N)
99, 01, 02, 04, 05
(3)
97 (3), 99, 01
(18), 02 (4), 04
(2), 05 (17), 06
99, 01, 05

R-plasmid profilesb
(N)
pR1, pR2 (2), pR3 (6),
pR4 (11), pR5, pR6,
pR7, pR10, pR11,
pR12, pR13, pR15
pR4, pR16, pR20

Clonal complexc (N)


CC5 (2), CC15, CC30,
CC45 (3)
CC1, CC5 (7), CC9,
CC15 (3), CC25 (4),
CC30 (18), CC45 (8),
CC59 (2), CC97
CC1, CC5, CC30

R5 (2)

KAN/[aphA-aadE-sat4] blaZ::Tn552

02, 05

CC5 (2)

R7 (5)

AMP-ERY/blaZTn552-[msrB msrA]

01 (2), 05 (2), 06

R8 (6)
R11 (9)

AMP-[ERY-CLII]/blaZTn552-[ermC msrB
msrA]
AMP-KAN/blaZTn552-[aphA-aadE-sat4] qacA/B

R14 (5)

AMP-TET/blaZTn552/pl-tetK

01 (2), 02, 05 (2),


06
99, 01 (4), 02 (3),
04
01 (3), 02, 05

pR9, pR22, pR23,


pR24
pR16, pR17, pR19,
pR21, pR25
pR4, pR8, pR10 (2),
pR12
pR26 (2), pR28, pR32,
pR36
pR30, pR31

CC5, CC15 (2), CC30,


CC45
CC1, CC5, CC9, CC15,
CC45, CC72
CC5 (2), CC25, CC30
(4), CC45, CC121
CC8, CC15 (3), CC45

AMP-[ERY-CLIC]-TET/blaZ::Tn552-[msrB-ermC
02 (2)
CC45 (2)
ermB]-tetK
R24 (3)
AMP-CLI-KAN/blaZTn552/pl-linA-[aphA-aadE02 (3)
pR1, pR5
CC15, CC30, CC121
sat4]
R25 (2)
AMP-KAN-TET/blaZ::Tn552-[aphA-aadE-sat4
02 (2)
pR29, pR33
CC30, CC97
aacA+aphD]-tetK
a
Resistance to clindamycin could be constitutive (C) or inducible (I). AMP, ampicillin and penicillin; CLI, clindamycin; ERY,
erythromycin; KAN, kanamycin; TET, tetracycline.
b
Profiles generated by digestion of plasmid DNA with HindIII, and shown to hybridize with probes for antimicrobial resistance genes.
c
Clonal complexes (CCs) as reported by Argudn et al. (Article 4).
N, number of isolates when more than 1.
R21 (2)

encoding an nucleotidyltransferase, was found in three


isolates (2.7%) with resistance to amikacin, kanamycin
and tobramycin (profiles R20, R26 and R31; Table 2).
The gene aphA [also known as aph(3)-IIIa],
encoding a phosphoryltransferase, was the most frequent,
being detected in 27 (24%) isolates resistant to
kanamycin. These isolates were also positive for the
aadE [also known as ant(6)] and sat4 genes, (both
encoding other aminoglycoside resistances), and their
presence was associated with transposon Tn5405. This
gene cluster was also found in profiles with other
aminoglicosyde resistance genes (profiles R20, R26, R28
and R31).
With regard to other antimicrobials (Tables 2, 3 and
S1), i) all tetracycline resistant isolates contained the
gene tetK (encoding an efflux protein); ii) the three
chloramphenicol resistant isolates carried cat genes
(encoding a chloramphenicol acetyl transferase)
associated with two types of previously reported
plasmids (cat::pC194 or cat::pC221); iii) the isolate with
moxifloxacin and ciprofloxacin (MIC 4 g/ml) resistance
contained mutations in both grlA (Ile45-Met) and grlB
(Asp422-Glu); and iv) the mupirocin resistant isolate
showed low level resistance (MIC 60 g/ml) and was
hence negative for the mupA gene, which confers high
level resistance.
Identification of resistance plasmids in S. aureus
isolates from young healthy carriers. 53 different
plasmid profiles were identified among the resistant
isolates, with the remaining 18 being negative for
plasmid extraction. Forty plasmid profiles (termed pR)
were associated with resistance through hybridization
with relevant probes (Tables 2, 3 and S1; Figure 1):
Each of the probes tested mapped on one or more HindIII
fragments: i) in 36.8% and 68.4% of the blaZ and

86

blaZ::Tn552-positive isolates, the corresponding probes


(blaZ and p480), mapped on fragments ranging from 1.5
up to 14 kb; ii) in 85% of the ermC, 72.7% of the msrB,
and 20% of the msrA positive isolates probes for these
genes mapped on fragments of 1.9-2.5 kb, 1.9-10 kb and
5.1 kb, respectively; iii) in 92.3% of the isolates carrying
tetK, the probe mapped on fragments of about 1.9 and 3
kb; iv) the genes aacA+aphD and aphA mapped on
fragments of 2.5 to 8 kb and of 2.5 to 14 kb in 66.7% and
18.5% of the positive isolates, respectively; and v) in the
three isolates carrying cat genes the cat::pC194 and
cat::pC221 probes mapped on fragments of 2.1 and 4 kb,
respectively.
DISCUSSION
Nowadays, there is limited knowledge concerning the
frequency of antimicrobial drug resistance in S. aureus
from healthy carriers, without association with hospitals
or health-care facilities, and the resistant determinants
involved (Alghaithy et al., 2008, Oguzkaya-Artan et al.,
2008, Rijal et al., 2008; Lozano et al., 2011). In fact,
these studies have been focused on S. aureus colonizing
staff and patients in nosocomial settings (i.e. Manzur et
al., 2008, Lederer et al., 2007).
The S. aureus isolates from young healthy carriers
analyzed in this study were highly heterogeneous with
regard to resistance phenotypes and genotypes. The
isolates were distributed into 31 resistance profiles,
involving 13 genes. The frequencies of individual
resistances were similar to those reported for clinical
isolates obtained in Spanish hospitals during 1986 to
2006 (Cuevas et al., 2008), with a notable exception:
none of the 111 isolates from healthy carriers was
resistant to methicillin, while the frequency of MRSA in
hospitals ranged from 1.5% up to 29.2% in the

3. Resultados
pR profile
kb

1 2

z
t

5 6

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

14.211.5-

5.14.52.82.52.1-

z
t

z
t

t
z

tz

z
t

z
t

z
b

tz

tz

bc c bc bc ctz bctz

zt

1.7-

1.1-

pR profile
kb

24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
p

z
14.211.5z
5.14.52.82.52.1-

tz

btz tz
ab

k
k

ctz
ktz

pz
z

t
pz

z z
hpt

k
t
k hkp k ktz k
bc k
bc

b
1
2

1.71.1-

Figure 1. HindIII plasmid profiles of antimicrobial resistant S. aureus from healthy carriers. Lanes , lambda digested with PstI; lines
1 to 43, profiles pR1 to pR40. Italic letters indicate the probes that mapped on the different fragments: 1, cat::pC194; 2, cat::pC221; a;
msrA; b, msrB; c, ermC; d, aadD; h, accA+aphD; k, tetK; p, aphA; t, p480 Tn552; z, blaZ.

multicentre report, during the period under study.


Nevertheless, one out of 53 isolates recovered from
healthy carriers in another Spanish region (La Rioja) was
MRSA (0.4%; Lozano et al., 2011).
The frequency of erythromycin and clindamycin
resistance in our study (25.2% and 22.5%, respectively)
was similar to values reported for Spanish hospitals
(averages of 29.2% and 17%, respectively). Because of
the prevalence of resistance in MRSA and many MSSA,
currently available macrolides are rarely if ever
appropriate agents for empiric treatment of S. aureus
infections. Clindamycin has a wider use, for instance in
the case of patients with hypersensitivity to -lactams,
the treatment of infections caused isolates resistant to
alternative agents, and in the treatment of staphylococcal
toxin-mediated disease (Gold and Pillai, 2009).
With regard to aminoglycosides, resistance to
gentamicin and tobramycin was lower in isolates from
healthy carriers (5.4% and 6.3%, respectively) than in
nosocomial isolates (average of 15% for gentamicin, and
27% in 2006 for tobramycin with information not
available from previous years; Cuevas et al., 2008).
Interestingly, a reduction in gentamicin resistance was
observed along the time in both settings. This fact is
important, because these are the most active

aminoglycosides against staphylococci, and they are still


used in combination with either a -lactam or a
glycopeptide, particularly in the treatment of
staphylococcal endocarditis (Gold and Pillai, 2009).
Resistance to chloramphenicol and mupirocin was
low in both settings (< 9%), while resistance to
ciprofloxacin was about 20 times higher in hospital
isolates than in S. aureus from healthy carriers (0.9% vs.
25.7%). Resistances to rifampicin and linezolid which
were not detected in the latter isolates, are still very rare
in Spanish hospitals (0.6% and 0.2%, respectively), and
resistance to vancomycin and tigecycline have not yet
been reported in any of the two settings.
In the present study, the overall number of resistance
genes per isolate ranged between one up to 11. In nearly
all S. aureus with phenotypic resistance to any of the
compounds tested, at least one gene accounting for such
resistance was identified, and the presence of more than
one gene conferring resistance to the same antimicrobial,
or to antimicrobials belonging to the same family, was
rather common. For instance, between three and five
genes were implicated in resistance to aminoglycosides,
and between two and four genes in resistance to
macrolides and/or lincosamides. As a relevant example, a
single multiresistant isolate (R31 profile) carried five

87

3. Resultados
(aphA, aadE, sat4, aacA+aphD and aadD) and four
(ermC, mrsA, mrsB and linA/linA) determinants
conferring resistance to aminoglycosides and MLS,
respectively. Gathering of multiple resistant determinants
in the same isolate is commonly mediated by stepwise
acquisition of mobile genetic elements, such as
transposons and plasmids (Fluit et al., 2001; Jensen and
Lyon, 2009), and this appeared to be the case in the
present study. For instance, i) in most penicillin resistant
isolates the blaZ gene was associated with Tn552; ii) in
all except one of the tetracycline resistant isolates the
tetK efflux gene was plasmid-borne; iii) in all
chloramphenicol resistant isolated, the cat genes were
also carried by plasmids; and iv) ermC and msrB, the
prevalent MLS resistance determinants in MSSA isolates
(Fluit et al., 2001), were also the most common in the
present work, and mapped on plasmids in most positive
isolates. The high number of profiles including genes
conferring resistance to aminoglycosides is also of note,
being aphA the gene most commonly found followed by
aacA+aphD and aadD. The simultaneous presence of
aadE and sat4 in all aphA-positive isolates strongly
support the location of the three genes within Tn5405
(Derbise et al., 1996). Detection of some of these
plasmids (CC1, CC5, CC8, CC9, CC15, CC25, CC30,
CC45, CC59, CC72, CC97) and transposons (CC1, CC5,
CC9, CC15, CC25, CC30, CC45, CC59, CC97) in the
indicated CCs (Tables 1, 2 and 3), emphasises their role
in the spread of resistance.
In conclusion, the young healthy carriers in this study
do not constitute a reservoir of MRSA, but they represent
a reservoir of multiple determinants conferring resistance
to old antimicrobials. Some of them have still clinical
applications and, considering the increasing resistance to
new antimicrobials, none of them can be disregarded. In
addition, these commensal MSSA can eventually be
involved in disease, or act as recipients of SCCmec,
stressing the importance of the study of the reservoir S.
aureus in the healthy carriers.
ACKNOWLEDMENTS
This work was supported by project FIS-06PI052489 from the Spanish Ministry of Science and
Innovation. M. A. Argudn was the recipient of grant
FPU AP-2004-3641 from the Ministry of Science and
Innovation, Spain, co-funded by the European Social
Fund. We thank to the GlaxoSmithKline Company for
the mupirocin samples.
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3. Resultados
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Wertheim HFL, Melles DC, Vos MC, van Leeuven W, van Belkum
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Staphylococcus aureus infections. Lancet Infect Dis 2005, 5: 751-762.
Woodford N. Biological counterstrike: antibiotic resistance
mechanisms of Gram-positive cocci. Clin Microbiol Infect 2005, 11: 221.

89

3. Resultados
Table S1. Resistance and plasmid profiles of Staphylococcus aureus recovered from healthy carriers assigned to
different clonal complexes.
Isolate/Year

RProfilea

LMUO5/97
LMUO 6/97
LMUO 10/97
LMUO 3/99
LMUO 8/99
LMUO 12/99
LMUO 15/99
LMUO 95/99
LMUO 1/01
LMUO 2/01
LMUO 3/01
LMUO 4/01
LMUO 5/01
LMUO 6/01
LMUO 7/01
LMUO 8/01
LMUO 9/01
LMUO 10/01
LMUO 11/01
LMUO 12/01
LMUO 13/01
LMUO 14/01
LMUO 15/01
LMUO 16/01
LMUO 17/01
LMUO 18/01
LMUO 19/01
LMUO 20/01
LMUO 21/01
LMUO 22/01
LMUO 23/01
LMUO 24/01
LMUO 25/01

R1c
R1d
R1a
R11c
R1d
S
R3b
R27
R1c
R1c
R1d
R1d
R1d
R7a
R8d
R11b
R1c
R1d
R9
R1b
R1c
R1d
R1d
R1d
R1d
R14b
R11a
R1d
R4
R11b
R1d
R16
R30

LMUO 26/01
LMUO 27/01
LMUO 28/01
LMUO 29/01
LMUO 30/01
LMUO 31/01
LMUO 32/01
LMUO 33/01
LMUO 34/01
LMUO 35/01
LMUO 36/01
LMUO 1/02
LMUO 2/02
LMUO 3/02
LMUO 4/02
LMUO 5/02
LMUO 6/02

R8c
R1d
R14b
R14b
S
R1c
R7e
R1d
R3a
R17
R15
R25
R8e
R11b
R29
R21b
R23

LMUO 7/02
LMUO 8/02
LMUO 9/02

R13
R11b
R28

LMUO 10/02
LMUO 11/02
LMUO 12/02
LMUO 13/02
LMUO 14/02

R1d
R1d
R21a
R24c
R18

LMUO 15/02
LMUO 16/02
LMUO 17/02
LMUO 18/02
LMUO 19/02
LMUO 20/02

S
R11b
R1d
R1d
R24a
R14a

90

R-phenotypeb // R-genotypec
AMP // blaZ::Tn552/nd
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP // blaZ/nd
AMP-KAN // blaZ::Tn552/nd-[ aphA/nd-aadE-sat4] + qacA/Bf
AMP // blaZ::Tn552/pl
Susceptible// [ERY-CLII] // blaZ::Tn552/nd-[msrB/pl-ermC/pl]
AMP-[GEN-KAN-TOB]-TET(I) // blaZ::Tn552/pl-[aacA+aphD/nd]- tetK/pl
AMP // blaZ::Tn552/nd
AMP // blaZ::Tn552/nd
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP-ERY // blaZ/nd-msrB/nd
AMP-[ERY-CLII] // blaZ::Tn552/nd-ermC/pl
AMP-KAN // blaZ::Tn552/nd-[aphA/nd-aadE-sat4]
AMP // blaZ::Tn552/nd
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP-[ERY-CLIC] // blaZ::Tn552/pl-[msrB/pl-ermC/pl]
AMP // blaZ/pl
AMP // blaZ::Tn552/nd
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP-TET // blaZ::Tn552/pl-tetK/pl
AMP-KAN // blaZ/nd-[aphA/nd-aadE-sat4]
AMP // blaZ::Tn552/pl
CLI // linA/linA
AMP-KAN // blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]
AMP // blaZ::Tn552/pl
TET-[ERY-CLIC] // blaZ::Tn552/pl-ermC/pl-tetK/nd
AMP-ERY-KAN-CHL // blaZ::Tn552/pl-msrB/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]cat::pC221/pl
AMP-[ERY-CLII] // blaZ/pl-[msrB/pl-ermC/pl]
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP-TET // blaZ::Tn552/pl-tetK/pl
AMP-TET // blaZ::Tn552/pl-tetK/pl
Susceptible// AMP // blaZ::Tn552/nd
AMP-ERY // blaZ::Tn552/pl--[msrA/nd-msrB/nd]
AMP // blaZ::Tn552/pl
[ERY-CLII] // blaZ::Tn552/pl-ermC/pl
AMP-[ERY-CLIC]-KAN // blaZ::Tn552/pl-[msrB/pl-ermC/pl]-[aphA/nd-aadE-sat4]
ERY-KAN // msrA/nd-[aphA/nd-aadE-sat4]
AMP-KAN-TET // blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]-tetK/pl
AMP-[ERY-CLII] // blaZ::Tn552/pl-[msrB/pl- ermC/pl]
AMP-KAN // blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]
AMP-KAN-CHL // [blaZ/nd-Tn552/pl]-[aphA/pl-aadE-sat4]-cat ::pC194/pl
AMP-[ERY-CLIC]-TET // [blaZ::Tn552/nd]-[msrB/pl-ermB/nd-ermC/pl]-tetK/pl
AMP-[ERY-CLIC]-[CIP-MXF] // blaZ/nd-[msrB/pl-ermB/nd-ermC/pl] ]-[glrA (Ile45
to Met)-glrB (Asp422 to Glu)]
AMP-[AMK-GEN-KAN-TOB] // blaZ::Tn552/pl-[ aacA+aphD/nd]
AMP-KAN // blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]
AMP-[AMK-GEN-KAN-TOB]-TET // blaZ::Tn552/pl-[ aphA/pl-aadE-sat4aacA+aphD/pl]-tetK/pl
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP-[ERY-CLIC]-TET // blaZ::Tn552/pl-[msrB/pl-ermC/pl]-tetK/pl
AMP-CLI-KAN // blaZ/nd-linA/linA-[aphA/nd-aadE-psat4]
AMP-[ERY-CLIC]-[GEN-KAN-TOB] // blaZ::Tn552/pl-[msrB/pl-ermC/pl][aacA+aphD/nd]
Susceptible// AMP-KAN // blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP-CLI-KAN // blaZ/pl-linA/linA-[aphA/nd-aadE-sat4]
AMP-TET // blaZ/nd-tetK/pl

Plasmid
profiled

Clonal
complexe

p0
pR3
p0
p0
pR4
pR16
pR26
pc1
p0
pR5
pR4
pR6
pc13
pR17
pc2
p0
pR4
pR18
pR1
p0
pR7
pR3
pR3
pR3
pR26
p0
pR4
pc3
pR8
pR4
pR27
pR37

CC30
CC25
CC30
CC30
CC30
CC45
CC1
CC30
CC30
CC30
CC25
CC45
CC5
CC30
CC15
CC25
CC30
CC45
CC25
CC5
CC30
CC59
CC45
CC45
CC45
CC15
CC121
CC15
CC121
CC30
CC15
CC30
CC15

pR19
pR4
pR26
pR28
p0
pR9
pR4
pR20
pR21
pc10
pR29
pR21
pR10
pR38
pR30
pR16

CC1
CC45
CC15
CC15
CC5
CC30
CC15
CC15
CC5
CC5
CC5
CC97
CC5
CC5
CC97
CC45
CC45

pR10
pR10
pR31

CC5
CC30
CC30

pR11
pR3
pR31
pc4
pR21

CC5
CC97
CC45
CC121
CC5

pR4
pR10
pR12
pR1
pR32

CC45
CC45
CC25
CC59
CC30
CC8

3. Resultados
Table S1 (continuation). Resistance and plasmid profiles of Staphylococcus aureus recovered from healthy carriers
assigned to different clonal complexes.
Isolate/Year

R-Profilea

LMUO 21/02
LMUO 22/02
LMUO 23/02
LMUO 24/02
LMUO 1/04
LMUO 2/04
LMUO 3/04
LMUO 4/04
LMUO 5/04
LMUO 1/05
LMUO 2/05
LMUO 3/05
LMUO 4/05
LMUO 5/05

R25
R24b
R11b
R5a
S
R26
R11b
R1c
R1c
R22
R1a
R8a
R12
R20

LMUO 6/05
LMUO 7/05
LMUO 8/05
LMUO 9/05
LMUO 10/05
LMUO 11/05
LMUO 12/05
LMUO 13/05
LMUO 14/05
LMUO 15/05
LMUO 16/05
LMUO 17/05
LMUO 18/05
LMUO 19/05
LMUO 20/05
LMUO 21/05
LMUO 22/05
LMUO 23/05
LMUO 24/05
LMUO 25/05
LMUO 26/05
LMUO 27/05
LMUO 28/05
LMUO 29/05
LMUO 30/05
LMUO 31/05
LMUO 32/05
LMUO 33/05
LMUO 1/06
LMUO 2/06
LMUO 3/06
LMUO 4/06
LMUO 5/06

R1c
R5b
R7c
S
S
R1b
R1c
R2
R1c
R1d
R1d
R1c
S
R1d
R19
R3c
R1e
R6
R1c
R1d
R8b
R1c
R1c
R1a
R1b
R7b
R1a
R14b
R7d
R10
R8f
R1d
R31

R-phenotypeb // R-genotypec
AMP-KAN-TET // blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]-tetK/pl
AMP-CLI-KAN // blaZ::Tn552/pl-linA/linA-[aphA/nd-aadE-sat4]
AMP-KAN // blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]
KAN // [aphA/nd-aadE-sat4]
Susceptible// AMP-[AMK-KAN-TOB]-TET // blaZ::Tn552/pl-[aphA/pl-aadE-sat4-aadD/nd]-tetK/pl
AMP-KAN // blaZ::Tn552/nd-[aphA/nd-aadE-sat4]
AMP // blaZ::Tn552/nd
AMP // blaZ::Tn552/nd
AMP-[ERY-CLII]-CHL // blaZ/nd-ermC/nd-cat::pC194/pl
AMP // blaZ/nd
AMP-[ERY-CLII] // blaZ/nd-ermC/nd
AMP-[AMK-KAN] // blaZ-Tn552/nd-[aphA/nd-aadE-sat4]
AMP-[ERY-CLII]-[AMK-GEN-KAN-TOB] // blaZ::Tn552/pl-[msrB/pl-ermC/pl][aphA/pl-aadE-sat4-aacA+aphD/pl-aadD/nd]
AMP // blaZ::Tn552/nd
KAN // blaZ::Tn552/nd-[aphA/nd-aadE-sat4]
AMP-ERY // blaZ/pl-msrB/pl
Susceptible// Susceptible// AMP // blaZ/pl
AMP // blaZ::Tn552/nd
ERY // [msrA/nd-msrB/nd]-qacA/B
AMP // blaZ::Tn552/nd
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP // blaZ::Tn552/nd
Susceptible// AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP-[ERY-CLII]-KAN // blaZ::Tn552/pl-[msrB/nd-ermC/nd]-[aphA/nd-aadE-sat4]
[ERY-CLII] // blaZ-Tn552/nd-[msrB/nd-ermC/pl]
AMP-(OLE) // blaZ::Tn552/nd-msrB/nd
[AMK-KAN] // [aphA/nd-aadE-sat4]
AMP // blaZ::Tn552/nd
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP-[ERY-CLII] // blaZ/nd-[msrB/pl-ermC/pl]
AMP // blaZ::Tn552/nd
AMP // blaZ::Tn552/nd
AMP // blaZ/nd
AMP // blaZ/pl
AMP-ERY // blaZ/nd-msrB/pl
AMP // blaZ/nd
AMP-TET // blaZ::Tn552/pl- tetK/pl
AMP-ERY // blaZ::Tn552/pl-msrB/pl
AMP-CLI // blaZ::Tn552/pl-linA/linA
AMP-[ERY-CLII] // blaZ::Tn552/pl-[msrA/pl-msrB/pl-ermC/pl]
AMP // blaZ::Tn552/pl
AMP-[ERY-CLIC]-[AMK-GEN-KAN-TOB]-MUP // blaZ/pl-[msrA/nd-msrB/nd-ermC/pllinA/linA]-[aphA/pl-aadE-sat4-aacA+aphD/nd-aadD/nd]-qacA/B

Plasmid
profiled

Clonal
complexe

pR33
pR5
pR12
p0
pR34
p0
p0
p0
pR39
pc5
pc11
pc6
pR35

CC30
CC15
CC5
CC5
CC15
CC1
CC30
CC30
CC30
CC9
CC9
CC9
CC9
CC25

pc7
pc8
pR22
pR2
p0
pc12
p0
pR4
pR13
p0
pR4
pR14
pR4
pR4
p0
pR4
pR3
pR16
pc9
p0
p0
pR2
pR23
pc2
pR36
pR24
pR3
pR25
pR15
pR40

CC5
CC5
CC15
CC45
CC30
CC5
CC30
CC5
CC30
CC45
CC5
CC30
CC5
CC30
CC59
CC30
CC30
CC15
CC30
CC25
CC72
CC30
CC30
CC45
CC5
CC45
CC72
CC45
CC5
CC25
CC45
CC1
CC25

Resistance (R-) profiles are numbered according to R-phenotypes, and subtypes are according to R-genotypes.
Resistance to clindamycin can be constitutive (C) or inducible (I). AMK, amikacin; AMP, ampicillin and penicillin; CHL,
chloramphenicol; CIP, ciprofloxacin; CLI, clindamycin; ERY, erythromycin; GEN, gentamicin; (I), intermediate resistance; KAN,
kanamycin; LZD, linezolid; MXF, moxifloxacin; MUP, mupirocin; OLE, oleandomycin; OXA, oxacillin; PEN, penicillin; RIF,
rifampicin; SXT, trimethoprim-sulfamethoxazole; TET, tetracycline; TMP, trimethoprim; TOB, tobramycin.
c
PCR amplification was used for detection of resistance genes for disinfectant compounds (qacA/B), ampicillin and penicillin (blaZ
and Tn552), erythromycin (msrA and msrB), erythromycin and clindamycin (ermA, ermB and ermC), clindamycin (linA/linA),
kanamycin, gentamicin and tobramycin (aacA+aphD), kanamycin, tobramycin and amikacin (aadD), kanamycin (aphA), streptomycin
(aadE), streptothricin (sat4), tetracycline (tetK, tetL, tetM and tetO), chloramphenicol (cat::pC194, cat::pC221, cat::pC223 and fexA),
ciprofloxacin (grlA, grlB, gyrA, gyrB and PnorA) and mupirocin (mupA). Plasmid location was determined by southern and
hybridization of HindIII plasmid profiles with probes for blaZ, p480 (Tn552), msrA, msrB, ermC, aphA, accA+aphD, aadD, tetK,
cat::pC194, cat::pC221. nd, not determined location; ni; not identified; pl, plasmid location.
d
p0, no plasmid(s) found; pC, cryptic plasmid(s) profiles which did not hybridized with probes for resistance genes; pR, plasmid
profiles which hybridized with probes for resistance genes. Cryptic and resistant plasmid profiles were generated through digestion of
the extracted DNA with HindIII.
e
Clonal complexes (CCs) were previously reported for this isolates (Argudn et al., Article 4).
f
Resistance to quaternary ammonium compounds was not tested.
b

91

3. Resultados

92

3.3.Capitulo 3
Staphylococcus aureus procedentes de alimentos y
manipuladores de alimentos del
Principado de Asturias

3. Resultados

3.3. Captulo 3: Staphylococcus aureus procedentes de alimentos y casos de


intoxicaciones alimentarias
S. aureus, adems de los seres humanos, tiene un amplio reservorio animal, siendo de
especial inters su presencia en animales utilizados en alimentacin. La Reglamentacin
Tcnico Sanitaria recomienda cuantificar la presencia de S. aureus enterotoxigenicos en
alimentos de origen animal, siendo la normativa ms rigurosa para derivados lcteos, carne y
sus subproductos, artculos de bollera-pastelera, pastas alimenticias, huevos cocidos y yema
salada (Pascual y Caldern, 2000). Para dicha cuantificacin existe un protocolo de trabajo
(ISO 6888-3:2003), as como lmites recomendados para los diferentes alimentos de riesgo
(Moragas y de Pablo, 2010). Adems existen redes internacionales de vigilancia de patgenos
en alimentos [Eurosurveillance (http://www.eurosurveillance.org/); Centers for Disease
Control and Prevention (http://www.cdc.gov/)]. A pesar de esos controles, S. aureus llega a
los alimentos, produce SEs y origina intoxicaciones alimentarias. El cuadro clnico no es
grave, y se caracteriza por un periodo de incubacin corto (2-6 horas), seguido de una
sintomatologa que incluye nauseas, vmitos, dolor abdominal y diarrea. La mayora de los
casos aislados y brotes de intoxicacin por S. aureus no se notifican, siendo su frecuencia real
infravalorada. En Espaa, slo los brotes son notificados a los centros de Microbiologa y
Epidemiologia, habindose registrado 465 brotes entre 1993 y 2007 (media de 31 brotes/ao)
(Hernndez-Pezzi et al., 2004; Cevallos et al., 2005; Martnez et al., 2008). Adems, los
exmenes mdicos/microbiolgicos a manipuladores de alimentos slo se realizan antes
sospechas de brotes o situaciones epidmicas (Reglamento de manipuladores de alimentos,
Real Decreto 202/2000).
Nuestro grupo de trabajo, adems de aislamientos de portadores sanos haba
caracterizado S. aureus procedentes de manipuladores de alimentos y de alimentos,
implicados o no en brotes de intoxicacin (Fueyo et al., 2001; Martn et al., 2004; Fueyo et
al., 2005a). Siguiendo esa lnea de investigacin, en la Tesis Doctoral se ampli el estudio de
este tipo de aislamientos, en cuanto a tipificacin y deteccin de factores de resistencia y
virulencia. Los aislamientos fueron recogidos en distintos laboratorios durante el periodo
1997-2008, y cedidos a nuestro grupo. La mayor parte de los aislamientos de alimentos y
manipuladores sanos relacionados con brotes de intoxicacin alimentaria, junto con S. aureus
procedentes de de alimentos analizados dentro del Programa de Seguridad Alimentaria de la
Agencia de Sanidad Ambiental y Consumo, pertenecen al Laboratorio de Salud Publica del
Principado de Asturias (LSP) y fueron cedidos por la Dra. M. A. Gonzlez-Hevia y por M.
Banzes, de dicho laboratorio. Otros S. aureus de muestras de alimentos se obtuvieron durante
clases prcticas de la asignatura Microbiologa de los Alimentos de la Licenciatura de
Biologa de la Universidad de Oviedo, y se incorporaron a nuestra coleccin. Finalmente,
aislamientos de muestras nasales de manipuladores de alimentos, recogidos en el curso de
"Tcnico de Calidad de la Industria Alimentaria", organizado por la Consejera de Educacin
y Ciencia, fueron cedidos por M. Alonso. Los oligonucletidos utilizados en las tcnicas
basadas en PCR se muestran en el Anexo I, mientras que los resultados correspondientes a
93

3. Resultados

este captulo se resumen en la Tabla IIe del Anexo II. Este estudio ha dado lugar a dos
artculos que estn en fase de preparacin:
Artculo 7: Argudn MA, Mendoza MC, Gonzlez-Hevia MA, Bances M, Rodicio
MR. Characterization of food-borne Staphylococcus aureus from a Spanish region (en
preparacin).
Artculo 8: Martn MC, Argudn MA, Mendoza MC, Rodicio MR. Characterization
of pUO-Sa-SED3, a virulence-resistance plasmid from Staphylococcus aureus (en
preparacin).
Por otro lado, a lo largo de la Tesis doctoral se ha realizado una revisin sobre
intoxicaciones alimentarias en S. aureus, que tambin se incluye en este captulo:
Artculo 9: Argudn MA, Mendoza MC, Rodicio MR. Food poisoning and
Staphylococcus aureus enterotoxins. Toxins 2010, 2: 1751-1773.

94

3. Resultados

3.3.1. Artculo 7

Characterization of food-borne Staphylococcus aureus from a


Spanish region
M. A. Argudn1, M. C. Mendoza1, M. A. Gonzlez-Hevia2, Margarita Bances2 and M. R. Rodicio1
Department of Functional Biology. Laboratory of Microbiology. University of Oviedo. Oviedo, Spain1;
Laboratorio de Salud Pblica. Consejera de Salud y Servicios Sanitarios. Oviedo, Spain2
A series of 64 isolates recovered from food handlers, foods and food poisoning outbreaks in a Northern
Spanish region during recent years were investigated for genomic relatedness, via spa typing and multi locus
sequence typing (MLST), exotoxin gene content, and antimicrobial resistance. On these bases, the isolates were
assigned to 31 strains distributed among ten CCs: CC5 (29.0%), CC30 (25.8%), CC45 (16.1%), CC8, CC15 (two
strains each), CC1, CC22, CC25, CC59 and CC121 (one strain each). The strains contained haemolysin (hl)
genes (90.3%; two up to five); lukED (77.4%); exfoliatin (et) genes: eta, etd (6.5% each) and etb (3.2%); tst
(25.8%); as well as enterotoxin (se) or enterotoxin-like (sel) genes or clusters: sea (38.7%), seb (12.9%), sec
(16.1%), sed-sejser (22.9%), selk-selq (6.5%), seh, sell, selp (9.7% each), egc1 (32.3%) or egc2 (48.4%). The
number of se/sel genes ranged from 0 (4 strains) up to 12 (1 strain), with an average of 6.2. The isolates showed
resistance to ampicillin-penicillin (61.3%), erythromycin (25.8%), clindamycin (16.1%), tetracycline (3.2%) and
amikacin-gentamicin-kanamycin-tobramycin (6.5%), conferred by blaZ, ermA-ermC/ermC and msrAmsrB/msrB, tetK and aacA+aphD-aphA genes, respectively. Six isolates (19.4%) were resistant to mupirocin, but
only one of them (t120/ST45; CC15), obtained from a food handler, showed high level resistance (MIC 1250
g/ml) and carried mupA. Two CC5 isolates from hamburgers (t002/ST5 and t2173/ST5; CC5) were resistant to
methicillin, mediated by SCCmec IVd. Detection in foods and food handlers of S. aureus strains containing
virulence and antimicrobial determinants constitutes a risk for public health, and highlights the importance of
implementing measures in order to interrupt their transmission through the food chain.
Keywords: resistance; virulence; spa-typing; MLST; agr typing
INTRODUCTION
Staphylococcal food poisoning (SFP) is a common
intoxication which results from consumption of foods
containing sufficient amounts of one or more preformed
enterotoxin(s) (Le Loir et al., 2003; Argudn et al.,
2010). Symptoms have a rapid onset, and comprise
nausea and violent vomiting, with or without diarrhea
(Tranter, 1990). The illness is usually self-limiting but
occasionally it can be severe enough to warrant
hospitalization, particularly in infants, elderly and
debilitated people (Murray et al., 2005). The real
incidence of SFP is underestimated, mainly due to
misdiagnosis and because sporadic episodes and minor
outbreaks are not reported. Despite of this, 29 outbreaks
were communicated in 2008 in the European Union, 414
persons were affected and 26 required hospitalization
(Anonymous, 2010). With regard to Spain, 431 outbreaks
have been recorded during the 1994-2008 period
(Hernndez-Pezzi et al., 2004; Cevallos et al., 2005;
Martnez et al., 2008; Anonymous, 2010). Four of them
occurred in Asturias (a Northern Spanish region of
10,604 km2) in three different restaurants in 2002 (Martn
et al., 2004), and an elderly nursing home in 2006.
Staphylococcus aureus, the casual agent of SFP, is a
common commensal of the skin and mucosal membranes
of humans. Food handlers carrying enterotoxinproducing strain(s) in their noses or hands are regarded as
the main source of food contamination, via manual
contact or through respiratory secretions (Stewart, 2005).
S. aureus enterotoxins (SEs) belong to the broad family
of pyrogenic toxin superantigens (PTSAgs), and have
demonstrated emetic activity (Balaban and Rasooly,

2000; Frazer and Proft, 2008). Of these, the classical SEs


(SEA, SEB, SEC, SED and SEE) have been discovered
in studies of S. aureus strains involved in SFP outbreaks,
and are classified in distinct serological types (Dinges et
al., 2000). Related toxins that lack emetic activity or
have not been tested for it are designated as
staphylococcal enterotoxin-like (SEls) (Lina et al., 2004).
All se and sel genes are located on mobile genetic
elements, including Sa genomic island, which carries
the enterotoxin gene clusters known as egc1 (seg, seln,
sei, selm, selo; Sa type I), egc2 (seg, seln, selu, sei,
selm, selo; Sa type I) and variants therein (Thomas et
al., 2006; Baba et al., 2008; Collery et al., 2008); S.
aureus pathogenicity islands (SaPIs); prophages and
plasmids (Bayles and Iandolo; 1989; Novick and Subedi,
2007; Ono et al., 2008; Goerke et al., 2009).
In order to broad the knowledge on the S. aureus
clones which are circulating through the food chain, a
collection of S. aureus recovered in Asturias from
manually handled foods and food-handlers, associated or
not with SFP outbreaks, were subjected to spa typing and
multilocus sequence typing (MLST) typing (Harmsen et
al., 2003; Enright et al., 2000). The exotoxin gene
profiles of the isolates and their resistance properties,
including methicillin resistance, were also investigated.
The food-related isolates were then compared with
isolates that have been circulating as commensals in the
community or causing disease in hospitals of the same
region (Argudn et al., 2009; Argudn et al; 2011a;
Argudn et al., Article 4; Argudn et al., Article 5;
Argudn et al., Article 6).

95

3. Resultados
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains. The S. aureus isolates analyzed in
this study (64) have been collected from food handlers
(14 isolates) and manually handled foods (50 isolates) in
Asturias, Spain (Table 1). Thirty seven isolates were
recovered from foods and restaurant employees during
three poisoning outbreaks (outbreaks 1 to 3) which
occurred at different restaurants of Asturias during 2002,
have been partially characterized in a previous study by
means of PFGE, randomly amplified polymorphic DNA,
plasmid content, and enterotoxin gene profile (see
below), and biochemical properties (Martn et al., 2004).
New isolates (27) were tested for haemolytic (on sheep
blood agar; Oxoid, Madrid, Spain), thermonuclease (on
DNase test agar; Oxoid) and coagulase (Slidex Staph
Plus, bioMerieux, Marcy-lEtolie, France) activities, and
identification as S. aureus was biochemically confirmed
with the API Staph system (bioMerieux). They were
recovered from foodstuffs associated with a fourth
outbreak (outbreak 4) which took place at an elderly
nursing home in 2006 in Asturias. Clinical isolates are
not available for any of the outbreaks. S. aureus collected
from a variety of foods (cakes, stuffed eggs, hamburgers
and cheese) within the Security Food Program of the
Agencia de Sanidad Ambiental y Consumo of Asturias,
and from healthy carriers attending a teaching course for
food handlers organized by the Consejera de Educacin
y Ciencia of the same region, were also included in this
study. Well characterized isolates from human clinical
samples, animals and healthy carriers were used as
controls (Argudn et al., 2009; Argudn et al., 2011a;
Argudn et al., 2011b; Argudn et al., Article 4; Argudn
et al., Article 5; Argudn et al., Article 6).
Antimicrobial susceptibility testing. All isolates
were also tested for antimicrobial susceptibility by the
disk diffusion method, using Mueller-Hinton agar and
commercially available discs (Oxoid). The antimicrobial
agents tested were ampicillin, penicillin, oxacillin,
methicillin,
gentamicin,
amikacin,
kanamycin,
tobramycin, tetracycline, erythromycin, clindamycin,
chloramphenicol,
ciprofloxacin,
moxifloxacin,
rifampicin,
linezolid,
vancomycin,
tigecycline,
mupirocin,
trimethoprim
and
trimethoprimsulfamethoxazole.
MICs
for
mupirocin
(GlaxoSmithKline, United Kigndom) and vancomycin
(Laboratorios Normon SA, Madrid, Spain) were
determined by the agar dilution method in MuellerHinton (Oxoid), with concentrations ranging from 0 to
1500 g/ml and from 0 to 4 g/ml, respectively. The
results were scored according to the Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI, 2009), except in
the case of mupirocin for which the breakpoints were
categorized as low (MIC 8 to 64 mg/l) and high ( 512
g/ml) resistance (Patel et al., 2009). S. aureus ATCC
29213 and NCTC 8325 were included as controls. To
estimate the rate of inducible macrolide-lincosamidestreptogramin B (MLSB) resistance, the double-disk
diffusion test (D-Zone test) was performed on isolates
that were susceptible to clindamycin and resistant to
erythromycin, as reported (Steward et al., 2005).
Isolation of genomic DNA and PCR amplification
assays. Genomic DNA was purified as reported (Martn
et al., 2003). Genes encoding antimicrobial resistance
and virulence factors were detected by conventional and

96

multiplex polymerase chain reaction (PCR) as previously


reported (Argudn et al., 2009; Argudn et al., 2011b;
Argudn et al., Article 6). All isolates were tested for
genes which confer resistance to ampicillin-penicillin
(blaZ), methicillin-oxacillin (mecA and SCCmec type),
macrolides (msrA, msrB), lincosamides (linA/linA),
macrolides-lincosamides-streptogramins
B
[MLSB
(ermA, ermB, ermC)], tetracyclines [tet(K), tet(L),
tet(M), tet(O)], aminoglycosides (aacA+aphD, aadD,
aphA), phenicols (cat::pC194, cat::pC221, cat::pC223,
fexA) and mupirocin (mupA). The isolates were also
tested for virulence determinants encoding haemolysins
(hla, hlb, hld, hlg, hlg-variant), leukotoxins (lukED,
lukM, lukPV), exfoliatins (eta, etb, etd), toxic shock
syndrome toxin (tst), SEs (sea, seb, sec, sed, see, seg,
seh, sei, ser, ses, set) and SEls (selj, selk, sell, selm, seln,
selo, selp, selq, selu), or identified the type of accessory
gene regulatory system agr (agrI, agrII, agrIII, agrIV).
Markers for the Sa genomic island of types I and III
(splF), and type II (splF, bsaB), as well as for S. aureus
pathogenicity islands (SaPIs; ear) were also screened.
The sea to see, selj and seg to sei genes have previously
been tested in isolates associated with outbreaks 1 to 3
(Martn et al., 2004), but all other genes were screened in
the present work. Positive and negative controls were
always included in PCR assays.
Typing techniques. All isolates were subjected to
spa typing, and at least one representative of each spa
type was also analyzed by MLST (Harmsen et al., 2003;
Enright et al., 2000). Sequencing of the PCR products
generated by both techniques was carried out either at
Secugen S.L. (Madrid, Spain) or at Macrogen (Seoul,
Korea).
The
Ridom
Spa
Server
(http://spaserver.ridom.de/) and the MLST website
(http://www.mlst.net) were used to assign spa types and
sequence types (ST), respectively. Isolates were grouped
into a single CC when at least five of the seven
housekeeping genes included in the MLST scheme were
identical (Enright et al., 2000).
Strain assignment and frequencies determination.
Isolates with the same spa-type, ST, agr-type, virulence
profile and resistance profile were considered as a single
strain, independently of their origin. Percentages reported
on the Results and Discussion sections were calculated
with respect to the total number of strains (31 strains;
Table 1).
RESULTS
Exotoxin gene profiles and mobile genetic
elements. As shown in Table 1, the majority of the
strains included in this study carried haemolysin genes
(90.3%; two to five) and the lukED leukotoxin gene
(77.4%); less strains carried tst (25.8%) or the eta, etd
(6.5% each) and etb (3.2%) exfoliatin encoding genes;
and none of them tested positive for lukPV or lukM.
Genes for classical enterotoxins were detected in most
strains: sea (38.7%), seb (12.9%), sec (16.1%) and sed
(22.9%). Many other enterotoxin genes were also
represented, including selj (22.9%), selk-selq (6.5%), seh,
sell and selp (9.7% each) and ser (16.1%), but see, ses
and set were absent. Most strains (80.7%) carried the
egc1 (32.3%) or the egc2 cluster (48.4%). At all, the
number of enterotoxin genes ranged from 0 (4 strains
from food handlers) up to 12 (1 strain), with an average
of 6.2.

26

27

28
29
30
31

Hamburger

Hamburger

TC-FH10
TC-FH11
TC-FH12
TC-FH13

hla/b/d/g-lukED-tst-egc2-splF-agrIII
hla/d/gv-lukED-ear-agrII
hla/b/d/gv-etb-egc2-agrIV
hla/b/d/g-tst-seh-egc2-splF-agrIII

hla/b/d/g/gv-lukED-sea/d/j/r-egc2-splF-agrII

hla/b/d/gv-lukED-sed/j/r-egc1-splF-agrII

hla/b/d/g-lukED-egc1-splF-agrIII
hla/d/gv-lukED-splF-agrII
hla/d/g-lukED-sec/l-egc1-ear-agrI
hla/d/g-lukED-sec/l-egc1-ear-agrI
hla/d/g-lukED-sec/l-egc1-ear-agrI
hla/d/g-lukED-sec/l-egc1-ear-agrI
hla/d/g/gv-eta-agrIII
hla/d/g/gv-eta-lukED-tst-sea-egc2-splF-agrIII
lukED-tst-seh-egc2-splF-agrIII
hla/b/d/g/gv-lukED-seh-egc2-agrIV
hla/b/d/gv-sea-bsaB-splF-agrIV
hla/b/d/g/gv-lukED-sec-egc1-ear-agrI
hla/b/d/g/gv-lukED-sec-egc1-ear-agrI
hla/b/d/gv-sea-bsaB-splF-agrIV
lukED-sek/q-ear-bsaB-splF-agrIV
hla/d/gv-etd-lukED-seb-egc1-ear-bsaB-splF-agrIV
hla/b/d/gv-sea-bsaB-splF-agrIV
hla/b/d/gv-sea-bsaB-splF-agrIV
hla/d/gv-lukED-egc1-splF-agrII
hla/b/d/gv-lukED-egc1-splF-agrII
hla/b/d/gv-lukED-egc1-splF-agrII
hla/b/d/gv-lukED-egc1-splF-agrII
hld/g-tst-sea-egc2-agrIII
hla/b/d/g/gv-lukED-etd-sea/b/d/j/p/r-egc2-ear-agrII
hla/b/d/g/gv-lukED-sea/b/d/j/p-egc2-agrIV
hla/d/gv-lukED-sed/j/p-egc1-ear-splF-agrII
hla/b/d/g/gv-lukED-sea/c/l-egc2-ear-agrI
hld/g-lukED-sea/c/l-egc2-ear-agrI
hld/g-lukED-tst-sea-egc2-agrIII
hla/b/d/g/gv-sea/b/c/k/q-egc2-ear-agrIV
agrIII
hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sea/d/j/r-egc2-ear-agrI
hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sea/d/j/r-egc1-agrIII

Virulence profile
AMP / blaZ::Tn552
MUP / mupA
AMP / blaZ::Tn552
AMP / blaZ::Tn552
AMP / blaZ::Tn552
AMP / blaZ::Tn552
AMP-[ERY-CLII]-MUP / blaZ::Tn552-[ermA-ermC]
AMP-[ERY-CLII]-MUP / blaZ::Tn552-ermC
AMP-[ERY-CLII]-MUP / blaZ::Tn552-ermC
AMP-ERY / blaZ-[msrA-msrB]
AMP-[ERY-CLII]-TET / blaZ::Tn552-ermC-tetK
AMP/blaZ
AMP/blaZ
AMP-[ERY-CLII]-TET / blaZ::Tn552-ermC-tetK
AMP / blaZ
AMP / blaZ::Tn552
AMP-[ERY-CLII]-TET / blaZ::Tn552-ermC-tetK
AMP-[ERY-CLII]-TET / blaZ::Tn552-ermC-tetK
AMP / blaZ
AMP / blaZ
AMP / blaZ::Tn552
ERY / msrB
AMP / blaz
ERY / msrA-msrB-linA/linA'
AMP-[ERY-CLII] / blaZ::Tn552-[ermA-ermC]
AMP / blaZ::Tn552
AMP / blaZ::Tn552
AMP / blaZ::Tn552
[AMP-OXA]-[AMK-GEN-KAN-TOB]-MUP / [blaZ-SCCmec
IVd]-[aacA+aphD-aphA]
[AMP-OXA]-CLI-[AMK-GEN-KAN-TOB]-MUP / [blaZSCCmec IVd]-nd-[aadD-aphA]
-

Resistance profilec

CC30
CC15
CC121
CC30

CC5

CC5

CC30
CC15
CC45
CC45
CC45
CC45
CC1
CC30
CC30
CC5
CC5
CC22
CC22
CC5
CC8
CC25
CC5
CC5
CC5
CC5
CC5
CC5
CC30
CC5
CC8
CC5
CC45
CC45
CC30
CC59
CC30
CC45
CC45

CCd

t166
t3474
t272
t166

t2173

t002

t021
t120
t050
t050
t050
t050
t177
t012
t136
t616
t701
t790
t790
t701
t008
t7125
t701
t701
t1560
t1560
t1560
t1560
t012
t002
t008
t002
t015
t015
t840
t216
t012
t015
t604

spa
type

ST34
ST15
ST51
nd

ST5

ST5

ST30
ST15
ST45
nd
nd
nd
ST3
nd
ST34
ST1619
ST6
ST217
ST217
nd
ST8
ST26
nd
nd
ST146
nd
nd
nd
nd
nd
nd
ST5
ST45
nd
ST30
ST59
nd
nd
ST546

MLST

The order corresponds to the year of isolation. 36 isolates from foods (26) and food handlers (FH; 10) were recovered during four poisoning outbreaks (Martn et al., 2004). Three of them (O1 to O3) occurred in different restaurants
during 2002, and the fourth (O4) happened in an olds people home in 2006; 24 isolates were collected from non-outbreak associated foods during 1997, 2006 and 2007; four isolates were recovered from the nasal cavities of healthy
carriers attending a teaching course (TC) for food handlers in 2008. N, number of isolates when more than one.
b
The 64 food-borne isolates were assigned to 31 strains.
c
The antimicrobial agents tested were ampicillin-penicillin (AMP), oxacillin-methicillin (OXA), gentamicin (GEN), amikacin (AMK), kanamycin (KAN), tobramycin (TOB), tetracycline (TET), erythromycin (ERY), clindamycin
(CLI; being CLII, inducible), chloramphenicol, ciprofloxacin, moxifloxacin, rifampicin, linezolid, vancomycin, tigecycline, mupirocin (MUP), trimethoprim and trimethoprim-sulfamethoxazole.
d
CC, clonal complex according to MLST and supported by spa typing.
nd, not determined.

O4-Russian salad
Cake
Cake
Cake
Stuffed eggs
Sponge cake (5)
Sponge cake (5)
Swiss roll (5)
Cheese
Hamburger
Hamburger

O3-Cream-cake (2)

O2-Beef
O3-FH6
O3-FH7
O3-FH8
O3-FH9
O3-Stuffed crab
O3-Shellfish salad (2)

1
2
3
3
3
3
4
5
6
7
8
9
9
8
10
11
8
8
12
13
14
13
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25

Strainb

O1-FH1 (2)
O1-FH2
O1-Cooked lamb (5)
O1- Shellfish salad (5)
O1- Paella (4)
O1-Cream-cake (2)
O2-FH3
O2-FH4
O2-FH5
O2-Cream cake
O2-Vegetables (2)

Source (N)a

Table 1. Features of food-related S. aureus isolates analyzed in this work.

3. Resultados

97

3. Resultados
Table 2. Clonal complexes, sequence types and spa-types found in food-related S. aureus strains.
CC (N/%)a

ST (n)

CC5 (9/29.0)
CC30 (8/25.8)
CC45 (5/16.1)
CC8 (2/6.5)
CC15 (2/6.5)
CC1 (1/3.2)
CC22 (1/3.2)
CC25 (1/3.2)
CC59 (1/3.2)
CC121 (1/3.2)

ST5 (3), ST6, ST146, ST1619


ST30 (2), ST34 (2)
ST45 (2), ST546
ST8
ST15 (2)
ST3
ST217
ST26
ST59
ST51

spa type (n)

Origin (n)

t002 (3), t616, t701 (1), t1560 (3), t2173


t012 (3), t021, t136, t166 (2), t840
t015 (3), t050, t604
t008 (2)
t120, t3474
t177
t790
t7125
t216
t272

O2-F (2), O3-F/FH (3), F (4)


O1-FH, O2-FH (2), O4-F, F (4)
O1-F, F (4)
O3-FH, F
O1-FH, TC-FH
O2-FH
O2-F
O3-FH
F
TC-FH

CC, clonal complex; ST, sequence type; N, number of strains; n, number of strains when more than one; O1-O4, food poisoning
outbreaks; F, foods; FH, food handlers; TC, teaching course.

Markers for Sa (splF and bsaB) and SaPIs (ear)


were found in 35.5%, 48.4% and 9.7% of the strains,
respectively (Table 1). Different combinations of lukED,
egc-genes, splF and bsaB suggests the occurrence of
Sa of type 1 (splF-lukED-egc1; 6 strains), type 2
(bsaB-splF-lukED; 1), and type 3 (splF-egc2; 1).
Additional combinations, like splF-bsaB-lukED-egc1
(one strain), lukED-egc1 without splF (3), lukED-egc2
(7), splF-lukED without bsaB (5), splF-bsaB without
lukED (1); lukED alone (1); and egc2 alone (2), suggest
deletions in known types of Sa or the existence of new
variants. On the other hand, detection of ear together
with certain se/sel genes is consistent with the presence
of SaPI3 (ear-seb-selk-selq; 1), SaPI5 (ear-selk-selq; 1),
and SaPImw2 (ear-sec-sell; 3). In other cases, the
presence of se/sel genes could be presumptively
associated with prophages, which are known to carry sea
(12), selp (3), or with plasmids of the pIB485 type where
sed/sej ser have been located (7). The four groups of
agr system were represented in the food-related strains
(Table 1): agrI (16.1%), agrII (29.0%), agrIII (32.3%)
and agrIV (22.6%).
Antimicrobial drug resistance. Nine out of the 31
strains (29.0%) were susceptible to all tested compounds,
and none of them was resistant to chloramphenicol,
ciprofloxacin, moxifloxacin, rifampicin, linezolid,
vancomycin, tigecycline, trimethoprim and trimethoprimsulfamethoxazole. The remaining strains were resistant to
three (16.1%; here considered as multiresistant), two
(9.7%) or one (45.2%) types of antimicrobials (Table 1).
The frequencies of individual resistances (in parenthesis)
were: ampicillin-penicillin (61.3%), oxacillin-methicillin
(6.5%), erythromycin (25.8%), clindamycin inducible
(16.1%), tetracycline (3.2%), amikacin-gentamicinkanamycin-tobramycin (6.5%), and mupirocin (19.4%).
The MICs for mupirocin were 40 g/ml (three strains
from food handlers associated with outbreak 2), 60 g/ml
(two strains recovered from hamburgers), and 1250
g/ml (one strain from a food handler associated with
outbreak 1). As shown in Table 1, all strains resistant to
ampicillin-penicillin carried the blaZ gene which encodes
a -lactamase, and in most of them (12/19; 63.2%) the
gene was associated with transposon Tn552, as
demonstrated by PCR amplification of a region spanning
between blaZ and the tranposase gene (p480) of Tn552.
The two oxacillin-methicillin resistant strains (MRSA),
both from hamburgers, carried SCCmec IVd. The genes
implicated in erythromycin resistance together with
inducible resistance to clindamycin were ermC (3 strains)
or ermA and ermC (two strains), while resistance to only

98

erythromycin was associated with the presence of msrB


or msrA and msrB (one and two strains, respectively).
The gene aphA was found in the two aminoglycoside
resistant strains together with aacA+aphD or aadD, and
the plasmid associated tetK gene was responsible for
tetracycline resistance (one strain). The strain with high
level resistance to mupirocin (MIC 1250 g/ml) carried
mupA, while the low level resistant strains lacked this
gene.
Clones and clonal complexes. The strains were
assigned to 21 spa types and 15 STs, and distributed
among 10 CCs (Tables 1 and 2). The most frequent CCs
were CC5 (29.0%), CC30 (25.8%) and CC45 (16.1%),
although CC8, CC15 (two strains each), CC1, CC22,
CC25, CC59 and CC121 (one strain each) were also
represented. As previously reported, a strong correlation
between different CCs and certain agr groups was found:
CC1-agrIII, CC5-agrII, CC15-agrII, CC22-agrI, CC30agrIII, CC45-agrI y agrIII, CC121-agrIV (Robinson et
al., 2005; Wright et al., 2005). The agrIV group was also
found in CC5, CC8 and CC25, as previously reported for
CC5 and CC25 in the Principality of Asturias (Argudin et
al., 2009, Argudin et al., 2011a). The two MRSA strains,
recovered from hamburgers, had different spa types (t002
and t2173) but shared ST5 within CC5, and the agrII
system.
DISCUSSION
In the present study, 64 food-related isolates could be
assigned to 31 strains on the bases of virulence and
resistance properties in conjunction with molecular
typing. The 31 strains belonged to ten CCs (Table 2),
and all except one (CC22) were also represented in
isolates from hospitals and healthy carriers recovered in
the same geographical region (Argudn et al., 2009;
Argudn et al., 2011a; Argudn et al., Article 6). In
addition, the most frequent CCs in food-related isolates
(CC5, CC30 and CC45) were also the most common in
isolates from healthy carriers of the region, and the three
included potential outbreak strains. Strain 3, which was
collected four different foods, served at the outbreak 1
restaurant, was t050/ST45 within CC45. It carried the sec
gene and was resistant to ampicillin. This strain was not
found in two food-handlers working at the restaurant,
although both were S. aureus carriers. In the case of
outbreak 3, strain 8 (t701/ST6; CC5) was recovered from
stuffed crab and two food-handlers. This strain, which
was positive for sea, and resistant to ampicillin,
erythromycin, clindamycin (inducible) and tetracycline,

3. Resultados
was probably the cause of the outbreak, as already
proposed by Martn et al. (2004). Strain 8 was also
present in vegetables at the outbreak 2 restaurant, but a
total of six strains (4 to 9), belonging to four CCs (CC1,
CC5, CC22 and CC30), were recovered from foods and
food-handlers at this restaurant and all, except one from a
food handler, carried at least one enterotoxin gene
(namely sea, sec or seh with or without egc1 or egc2).
With regard to outbreak 4, a single isolate (strain 15), is
available. It was recovered from Russian salad served at
an elderly nursing home, proved to be positive for sea,
resistant to ampicillin, and belonged to t012 (ST30)
within CC30. It is of note that the lack of clinical isolates
associated with the four outbreaks precluded the
identification of the responsible strain(s), with the
probable exception of outbreak 3 (see above).
SEA, followed by SED, are the enterotoxins most
frequently associated with SFP, although outbreaks
caused by SEB, SEC, SEE and SEH have also been
reported (Le Loir et al., 2003; Argudn et al., 2010). In
the food-related strains characterized in this study, sea
was the most common (38.7%), seb, sec and seh
appeared at a lower frequency (12.9, 16.1 and 9.7%,
respectively), and see was not detected. Like the former
enterotoxins, egc-encoded SEG and SEI, and the
plasmid-borne SER, SES and SET, were shown to be
emetic after oral administration in a primate model
(Munson et al., 1998; Ono et al., 2008). In the present
work, a high percentage of strains contained one of the
two egc clusters (32.3 or 48.4%), which are located in
Sa type 1 (egc1) or Sa type 3 (egc2). The sed and ser
genes, carried by plasmids of the pIB485 family, were
also frequent (22.9 and 16.1%, respectively), and
appeared in most of the not-outbreak-associated food
isolates.
The use of antimicrobial agents in veterinary
medicine, animal husbandry and other agricultural
activities has contributed to an alarming increase in
antimicrobial resistance. Transmission of resistant
bacteria from farm animals to humans can occur through
ingestion of food products of animal origin. In addition,
ingested resistant bacteria can transfer resistance genes,
as well as virulence genes, to the human commensal
microbiota (Kluytmans, 2010). Thus, study of the
resistance and virulence properties of S. aureus isolates
present in the food chain is an important issue of public
health.
Like in S. aureus from other sources, resistance to
ampicillin-penicillin was high (61.3%) in food-related
isolates tested in this study, and the responsible gene,
blaZ, was often associated with Tn552 (Jensen and Lyon,
2009). The frequency of other resistances, including
oxacillin/methicillin (6.5%), erythromycin (25.8%),
clindamycin (16.1%), and gentamicin-tobramycin
(6.5%), was lower than that reported in Spanish hospitals
(averages of 30.2%, 31.7%, 20% and 20-27% during the
2002 to 2006 period) (Cuevas et al., 2008). The two
MRSA isolates detected (t002/ST5 and t2173/ST5;
strains 26 and 27) belonged to CC5, carried SCCmec IVd
and were recovered from hamburgers acquired at a local
supermarket. This type of SCCmec is uncommon in
Spain, and was only associated with CC8 (accounting for
0.8% of a sample of 135 MRSA isolates, Vindel et al.,
2009). The presence of MRSA in hamburgers was
probably due to contamination by food handlers, since
their preparation requires several steps of human
involvement, including processing at the supermarket.

Mupirocin is the antibiotic of choice for eradication


of S. aureus carriage, and resistance has been implicated
in failure of the treatment (Patel et al., 2009). In this
study, six isolates were resistant to mupirocin, which
gives a frequency of 19.4%, higher than that reported for
nosocomial S. aureus in Spain (8.9%; Cuevas et al.,
2008). Four of the isolates were recovered from food
handlers, and one (t120/ST15; CC15; strain 2) contained
the mupA gene which confers high level resistance. The
remaining two strains (26 and 27) were the MRSA
collected from in hamburgers.
In conclusion, this study highlights the presence of
resistant and potentially virulent S. aureus strains in the
food chain. Of particular concern are i) the high number
of exotoxin genes, including not only enterotoxins but
also tst and exfoliatin genes; and ii) the detection of
MRSA in supermarket-acquired hamburgers. MRSA has
become a pathogen of increasing importance not only in
hospitals but also in the community and livestock (Voss
et al., 2005; Diederen and Kluytmans, 2006; Lozano et
al., 2009). MRSA is found in foods of animal origin
(Kluytmans, 2010), and have already been implicated in
SFP outbreaks which occurred both in nosocomial and
community settings (Kluytmans et al. 1995; Jones et al.
2002). Within this scenario, characterization of the
strains which are circulating along the food chain is
important, not only for general knowledge, but also to
avoid the dispersion of potentially dangerous MRSA and
MSSA clones.
ACKNOWLEDMENTS
This work was supported by the Spanish Ministry of
Science and Innovation (project FIS-PI080656). M. A.
Argudn was supported by grant FPU AP-2004-3641
from the Ministry of Science and Innovation, Spain, cofunded by the European Social Fund. We are grateful to
the GlaxoSmithKline Company for the kind gift of
mupirocin.
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3. Resultados

3.3.2. Artculo 8

Characterization of pUO-Sa-SED3, a virulence-resistance


plasmid from Staphylococcus aureus
M.C. Martn1, M. A. Argudn2, M. C. Mendoza2, and M. R. Rodicio2
Instituto de Productos Lcteos de Asturias (CSIC). Villaviciosa. Asturias, Spain1; brea de Microbiologa.
Department of Functional Biology. Laboratory of Microbiology. University of Oviedo. Oviedo, Spain 2
pUO-Sa-SED3 is a virulence-resistance plasmid from Staphylococcus aureus originated from a pIB485-like
plasmid through insertion of resistance genes and a bipartite translocation system possibly involved in persistent
nasal carriage. The occurrence of resistance, virulence and carriage determinants on the same mobile genetic
element allows co-selection and co-transfer of these properties, potentially increasing health risks.
Staphylococcal food poisoning (SFP) in an
intoxication that results from the consumption of food
containing one or more preformed enterotoxins (Argudn
et al., 2010). Staphylococcus aureus produces a wide
variety of enterotoxins and enterotoxin-like proteins -the
latter without demonstrated emetic activity-, which are
encoded by se and sel genes, respectively. Classical
enterotoxins, like SEA, SEB, SEC and SED, are reported
as the most common causes of SFP. The sed gene is
located on plasmids of the pIB485-like family, together
with selj and ser (Bayles y Iandolo, 1989; Zhang et al.,
1998; Ono et al., 2008; Kennedy et al., 2010). The selj
and ser genes have been also described in pF5-like
plasmids, associated with ses and set (Ono et al., 2008).
In 2005, three types of sed plasmids were detected in S.
aureus from food samples recovered in Asturias (a
Northern region of Spain), and termed pUO-Sa-SED1,
pUO-Sa-SED2 and pUO-Sa-SED3 (33, 36 and 53.5 kb,
respectively) (Fueyo et al., 2005). Initial characterization
of
these
plasmids
was
performed
by
restriction/hybridization (Fueyo et al., 2005) and by PCR
amplification using the primers shown in Table 1. The
primers were designed from the complete sequence of a
pIB485-like plasmid (p19321-P03, accession number:
CP002147.1; Kennedy et al., 2010), and the partial
sequence of pF5 (accession number: AB075606.1,
AB330135.1; Ono et al., 2008). The obtained results

revealed that pUO-Sa-SED1 and pUO-Sa-SED2 were


typical pIB485-like plasmids, while pUO-SA-SED3 was
different. Accordingly, the genetic organization of pUOSa-SED3 was further established by cloning and
sequencing. The plasmid was subjected to single and
double digestions with the endonucleases EcoRI and
HindIII. The generated fragments were ligated into the
corresponding sites of pUK1921, a cloning vector that
contains a kanamycin resistance gene as selectable
marker (Heinisch, 1993). The obtained libraries were
transformed into Escherichia coli DH5 (Invitrogen)
(Sambrook and Russell, 2001). Relevant insertions were
sequenced at Macrogen Inc. (Seoul, Korea).
Sequence analysis, together with PCR mapping,
revealed the presence in pUO-Sa-SED3 of several genes
characteristically carried by pIB485-like plasmids,
including pUO-Sa-SED1 and pUO-Sa-SED2. In fact,
pUO-Sa-SED3 was positive for sed and selj, cadD
(cadmium resistance), repA (similar to replication genes
of other multiresistance plasmids of S. aureus; Weaver et
al., 2009), ftsK [with FtsK belonging to a family of
proteins which are homologous to the type VII secretion
system (T7SS) of Mycobacterium; Burts et al., 2005;
Sivaraman et al., 2008], and abiK (for a phage
abortiveinfection mechanism in Lactococcus lactis,
which was also found in plasmid pETB of S. aureus;
Emond et al., 1997; Yamaguchi et al., 2001), sin

Table 1. Oligonucleotides designed for characterization of pUO-Sa-SED plasmids.


Gen

Oligonucleotide sequence 5 3 Forward/Reverse

Size (pb)

repA
cadD
abiK
blaZ
blaRI
blaI
bin
sin
marR-like
AD
Bacteriocin
ABC transport
ses
set

CTCGAAGAATTGCCACAACA/TGCATAGCTTCAACGGTTTC
AAGTTGTGGCGCCGATAATA/TTTCTCCAATTCCTGGGATA
AGCTACGGTAAATCAGATGC/TCTTGCATGAAAAACATCAA
ATAGGTTCAGATTGGCCCTTAGG/ATGTAATTCAAACAGTCCACATGCC
GCCCTTACAGAACGATCACC/ATGGTCAAGTCCAAACATCG
GCGATAAAACGATTAGAACA/AACTTTTCATGTCCCCTCCA
CATTGAATTTGCGAGGTCAG/CTGCAAATGCTGCGAATAAA
AATGGGAGATCGATTCGTTG/ACCTTGAGCTTGTCGACGTT
TGGCCATAAGTCTTTTGCTT/TGGTGTTTTGAATTGCTTGA
GATGTCGGCGTGACACATAC/ACCACCTGTAGCCCCAGAC
GCCAATCCCGATAAAAACAA/AGTCAATCCATCCTTGGTGA
TCTCTAAGCGGTGGTGAACA/ACATCAAATCGTTTCGCAAG
CGGGTGTTACTTCTGTTTGC/ATGTAGATGCTTGGGGACAT
AATGCAATTTGCCCCATAGT/AACTTCATATTCGCAGGACA

217
154
223
701
183
170
199
243
176
198
201
205
162
214

AD, alcohol dehydrogenase

101

3. Resultados
A.
pIB485-like plasmid

mer region

ORF-1 ORF-2 ORF-3

pIB485-like plasmid

ORF-4
IS431 merR

merT merA

merB IS431

msrA mphC

sin

AD

B.
traG-ftsK element
ORF-5
ftsK

pIB485-like plasmid

ORF-6 ORF-7
traG

ORF-8

IS30B/C/D ser selj

sed

Figure 1. Schematic representation of two gene arrays of pUO-Sa-SED3. A. Fragment of 16.3 kb with the insertion of the mer operon
and macrolide resistance genes upstream of sin and the alcohol dehydrogenase gene. B. Fragment of 10.4 kb with the insertion of the
traG-fstK element that truncates the ser gene.

(recombinase
gene
previously
reported
in
multiresistance plasmids; Rowland and Dyke, 1989), and
genes which encode a putative alcohol dehydrogenase
and a MarR-like factor (Cheung et al., 2004; Cheung et
al., 2008; Korem et al., 2010). pUO-Sa-SED1 and pUOSa-SED2, but not pUO-Sa-SED3, were also PCRpositive for ser, for the bla operon (for -lactams
resistance) (Bayles y Iandolo, 1989; Zhang et al., 1998),
and for the bin recombinase gene, previously found in
Tn552 (Mouw et al., 2008). It is also of note that none of
the three plasmids found in S. aureus recovered from
foods in Asturias contained the genes for the enterotoxins
ses and set, the genes for bacteriocin production, or for
an ABC transporter, all characteristically present in pF5like plasmids (Ono et al., 2008).
Interestingly, sequence analysis revealed that the ser
gene of pUO-Sa-SED3 was truncated by insertion of a
traG-ftsK element (Figure 1). It has been shown that the
ftsK and traG products act as a bipartite translocation
system in an E. coli plasmid (Gunton et al., 2007), and a
mobile genetic element carrying the two genes has been
reported in the genome of S. aureus recovered from
persistent nasal carriers (Burts et al., 2005; Sivaraman et
al., 2008). The presence of the traG and ftsK region in
pUO-Sa-SED3, is particularly interesting, due to its
possible role in persistent colonization. This plasmid also
contains macrolide resistance genes (msrA and mphC), as
well as an additional insertion of 7 kb consisting of two
copies of IS431 which flank, in the same orientation, a
mer operon similar to that of the SAP105A plasmid of S.
epidermidis (accession number: GQ900452.1) (Figure
1).
Based on structural and functional properties, three
groups of large staphylococcal multiresitance plasmids
have been recognized: the pSK1 family, pSK41-like
conjugative plasmids, and -lactamase-heavy metal
resistance plasmids (Firth et al., 2000). The pIB485-like
plasmids carry cadmium and -lactams resistance genes,
and could therefore have originated from -lactamaseheavy metal resistance plasmids, which acquired
enterotoxin genes. As a member of the pIB485-like
family, pUO-Sa-SED3 constitutes an interesting example
of further evolution, through acquisition of new
resistance genes and of an element possibly involved in
persistent carriage. This element could contribute to the
maintenance of potential dangerous strains in the human
host, which represents a hazard to human health.
Moreover, linkage of resistance and virulence genes in
plasmids of the pIB485-like family, including pUO-SaSED3, is a cause of concern, since the use of

102

antimicrobials can provide a positive selection pressure


for virulence.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by the Spanish Ministry of
Science and Innovation (project FIS-PI080656). M. A.
Argudn was the recipient of grant FPU AP-2004-3641
from the Ministry of Science and Innovation, Spain, cofunded by the European Social Fund.
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Zhang S, Iandolo JJ, Stewart GC. The enterotoxin D plasmid of
Staphylococcus aureus encodes a second enterotoxin determinant (sej).
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103

3. Resultados

104

3. Resultados

3.3.3. Artculo 9

105

3. Resultados

106

3. Resultados

107

3. Resultados

108

3. Resultados

109

3. Resultados

110

3. Resultados

111

3. Resultados

112

3. Resultados

113

3. Resultados

114

3. Resultados

115

3. Resultados

116

3. Resultados

117

3. Resultados

118

3. Resultados

119

3. Resultados

120

3. Resultados

121

3. Resultados

122

3. Resultados

123

3. Resultados

124

3. Resultados

125

3. Resultados

126

3. Resultados

127

3. Resultados

128

3.4.Capitulo 4
Staphylococcus aureus procedentes de animales de
Alemania

3. Resultados

3.4. Captulo 4: Staphylococcus aureus procedentes de animales


Adems del ser humano, otros mamferos y aves son reservorios y hospedadores
sensibles a infecciones por S. aureus (Morgan et al., 2009). Este fenmeno tiene especial
relevancia cuando se trata de ganado o aves de corral, al ser reservorios relacionados con la
alimentacin humana. En este sentido, en el 2004, emergi en los Pases Bajos un clon
MRSA (CC398/ST398) asociado con ganadera porcina (Voss et al., 2005). Estudios
posteriores mostraron la alta prevalencia de este clon en animales (ganado porcino, equino,
vacuno y avcola) y humanos, tanto enfermos como sanos, en diversos pases de la Unin
Europea (UE) (Monecke et al., 2007; Witte et al., 2007; Nemati et al., 2008; Loeffler et al.,
2009; Cuny et al., 2010; Graveland et al., 2010; Mulders et al., 2010; Otter et al., 2010;
Vanderhaeghen et al., 2010; Broens et al., 2011), incluyendo Espaa (Lozano et al., 2009;
Aspiroz et al., 2010; Gmez-Sanz et al., 2011; Lozano et al., 2011a; Lozano et al., 2011b).
Tambin se ha encontrado fuera de la UE, en pases como la Republica Dominicana, Estados
Unidos, Canad, China y Malasia (Yu et al., 2008; Bath et al., 2009; Neela et al., 2009; Cui
et al., 2009; Golding et al., 2010), e incluso en productos crnicos (van Loo et al., 2007; de
Boer et al., 2009; Lozano et al., 2009). Los aislamientos ST398 son raramente toxignicos,
aunque se han descrito cepas portadoras de la leucotoxina de Panton-Valentine en animales y
pacientes humanos (Yu et al., 2008, van Belkum et al., 2008). Se caracterizan, adems, por
presentar resistencia a la restriccin por la endonucleasa SmaI, utilizada en la tipificacin de
S. aureus mediante la tcnica de PFGE. Esto es debido a la presencia en el clon de un nuevo
sistema RM de tipo II (Bens et al., 2006; Stegger et al., 2010). La mayora de los estudios
relativos a ST398 se han realizado con aislamientos MRSA, aunque tambin se han descrito
cepas MSSA (Guardabassi et al., 2007; van Belkum et al., 2008; Grundman et al., 2010).
En Europa, la produccin de ganado porcino se concentra en Dinamarca, Alemania,
Espaa, Francia y en los Pases Bajos, responsables de ms de las dos terceras partes de la
produccin europea (Eurostat, 2010), siendo estos pases los ms afectados en cuanto a la
dispersin del clon ST398. Existe cierta especializacin entre dichos pases, siendo la cra
ms frecuente en Dinamarca y el engorde en Espaa, mientras que el resto son productores
mixtos. Espaa importa ganado porcino procedente de Alemania y los Pases Bajos para su
engorde (Eurostat, 2010).
Desde la deteccin del clon ST398, el National Reference Laboratory for Coagulase
Positive Staphylococci (NRL-Staph) del BfR, de Berln, lleva a cabo una monitorizacin de la
presencia de MRSA en ganado porcino de Alemania. El estudio es de gran inters, ya que
ms de un 98% de los cerdos analizados a nivel de matadero y granja son portadores de
MRSA. Adems, debido a que Alemania es uno de los principales exportadores de este tipo
de ganado a Espaa (Eurostat, 2010) se plante la caracterizacin de ST398 procedente de
animales, para completar la Tesis Doctoral. Los aislamientos caracterizados en este capitulo
pertenecen a la coleccin del NRL-Staph, proceden de varios estudios y proyectos realizados
en ese laboratorio durante el periodo 2004-2008, y se obtuvieron de muestras nasales de
cerdos asintomticos, muestras clnicas de cerdos enfermos, muestras de polvo de granjas de
129

3. Resultados

crianza y muestras de alimentos (carnes y leche) de varios animales. La caracterizacin de


estos aislamientos se llev a cabo en el marco de una estancia corta realizada en el BfR bajo
la direccin de la Dra. B. Guerra. Se aplicaron tcnicas de tipificacin, incluyendo una
variacin del PFGE original, utilizando un isoesquizomero de SmaI, adems de estudiarse las
bases genticas de la resistencia a antimicrobianos y la presencia de factores de virulencia.
Los oligonucletidos utilizados en las tcnicas basadas en PCR se muestran en el Anexo I,
mientras que los resultados de este captulo se resumen en la Tabla IIf del Anexo II. Los
diferentes estudios de aislamientos del clon ST398 dieron lugar a tres artculos ya publicados:
Artculo 10: Argudn MA, Rodicio MR, Guerra B. The emerging methicillinresistant Staphylococcus aureus ST398 clone can easily be typed using the Cfr9I SmaIneoschizomer. Lett App Microbiol 2010, 50: 127-130.
Artculo 11: Argudn MA, Fetsch A, Tenhagen BA, Hammerl JA, Hertwig S,
Kowall J, Rodicio MR, Ksbohrer A, Helmuth R, Schroeter A, Mendoza MC, Brunig J,
Appel B, Guerra B. High heterogeneity within methicillin-resistant Staphylococcus aureus
ST398 isolates defined by Cfr9I macrorestriction-PFGE profiles, spa- and SCCmec types.
App Environ Microbiol 2010, 76(3): 652-658.
Artculo 12: Argudn MA, Sachsenrder J, Fetsch A, Tenhagen BA, Hammerl JA,
Hertwig S, Kowall J, Rodicio MR, Ksbohrer A, Helmuth R, Schroeter A, Mendoza MC,
Brunig J, Appel B, Guerra B. Virulence and resistance determinants in German and Dutch
Staphylococcus aureus ST398 isolates. App Environ Microbiol 2011, 77(9): 3052-3060.

130

3. Resultados

3.4.1. Artculo 10

131

3. Resultados

132

3. Resultados

133

3. Resultados

134

3. Resultados

3.4.2. Artculo 11

135

3. Resultados

136

3. Resultados

137

3. Resultados

138

3. Resultados

139

3. Resultados

140

3. Resultados

141

3. Resultados

142

3. Resultados

3.4.3. Artculo 12

143

3. Resultados

144

3. Resultados

145

3. Resultados

146

3. Resultados

147

3. Resultados

148

3. Resultados

149

3. Resultados

150

3. Resultados

151

3. Resultados
Table S1. Oligonucleotides used in this study.
Group
Haemolysins

Gene

HLA-1
HLA-2
hlb
HLB-1
HLB-2
hld
HLD-1
HLD-2
hlg
mpHLG-1
mpHLG-2
hlg-variant mpHLG2-1
mpHLG2-2
Leucotoxins
lukM
LUKM-1
LUKM-2
lukED
LUKDE-1
LUKDE-2
lukPV
Luk-PV-1
Luk-PV-2
Exfoliative toxins
eta
ET-1
ET-2
etb
ET-3
ET-4
etd
ET-14
ET-15
Toxic shock syndrome toxin tst
TST-1
TST-2
Enterotoxins
sea
se[adej]-f
sea-r
seb
se[bc]-f
seb-r
sec
se[bc]-f
sec-r
sed
SED-3
SED-4
see
se[adej]-f
see-r
seg
SEG1
SEG2
seh
SEH1
SEH2
sei
SEI-1
SEI-2
sej
SEJ-1
SEJ-2
sek
SEK-3
SEK-4
sel
SEL-1
SEL-2
sem
SEM-1
SEM-2
sen
mpSEN-1
mpSEN-2
seo
SEO-1
SEO-2
sep
SEP-1
SEP-2
seq
SEQ-1
SEQ-2
ser
SER-1
SER-2
seu
PSE-2
PSE-6
Island markers
ear
ear-1
ear-2
splF
splF-1
splF-2
bsaB
bsaB-1
bsaB-2

152

hla

Name

Sequence 5-3
CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG
CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT
GTGCACTTACTGACAATAGTGC
GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT
AAGAATTTTTATCTTAATTAAGGAAGGAGTG
TTAGTGAATTTGTTCACTGTGTCGA
GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA
CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG
GACATAGAGTCCATAATGCATTYGT
ATAGTCATTAGGATTAGGTTTCACAAAG
TGGATGTTACCTATGCAACCTAC
GTTCGTTTCCATATAATGAATCACTAC
TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG
TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA
ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA
GCATCAAGTGTATTGGATAGCAAAAGC
CTATTTACTGTAGGAGCTAG
ATTTATTTGATGCTCTCTAT
ATACACACATTACGGATAAT
CAAAGTGTCTCCAAAAGTAT
AACTATCATGTATCAAGG
CAGAATTTCCCGACTCAG
AGCATCTACAAACGATAATATAAAGG
CATTGTTATTTTCCAATAACCACCCG
AAAGATTTGCGAAAAAAGTGTGAATT
TAAATCGTAATTAACCGAAGGTTCTG
TATGATGATAATCATGTATCAGCAA
CCAAATAGTGACGAGTTAGGTAA
TATGATGATAATCATGTATCAGCAA
TAAGTACATTTTGTAAGTTCCCATT
CTAGTTTGGTAATATCTCCTTTAAACG
TTAATGCTATATCTTATAGGGTAAACATC
AAAGATTTGCGAAAAAAGTGTGAATT
TTGCACCTTACCGCCAAAGCTG
TGCTATCGACACCTACAACC
CCAGATTCAAATGCAGAACC
CGA AAGCAGAAGATTTACACG
GACCTTTACTTATTTCGCTGTC
CTCAAGGTGATATTGGTGTAGG
AAAAAACTTACAGGCAGTCCATCTC
CTCCCTGACGTTAACACTACTAATAA
TTGTCTGGATATTGACCTATAACATT
ACCGCTCAAGAGATTGAT
TTATATCGTTTCTTTATAAGAA
AATATATAACTAGTGATCTAAAGGG
TATGGAATACTACACACCCCTTATA
ATGCTGTAGATGTATATGGTCTAAG
CGTCCTTATAAGATATTTCTACATC
ATGAGATTGTTCTACATAGCTGCAAT
AACTCTGCTCCCACTGAAC
TGTAGTGTAAACAATGCATATGCAAATG
TTATGTAAATAAATAAACATCAATATGATGTC
TTAGACAAACCTATTATCATAATGG
TATTATCATGTAACGTTACACCGCC
AAGAGGTAACTGCTCAAG
TTATTCAGTCTTCTCATATG
AAACCAGATCCAAGGCCTGGAG
TCACATTTGTAGTCAGGTGAACTT
TAAAATAAATGGCTCTAAAATTGATGG
ATCCGCTGAAAAATAGCATTGAT
ACATTGATAGCAAGTGCTTTAG
CTTTYAATTTKTCWGTTAATTTTTTCCATG
GTTACTAAGATTGTAGATTATCCTGG
CTCTTGTGCTTTCACCTGATGGC
CATTGTTATTAGTCCTTTAACGGCG
ATTCGTGTCATATTCAAAG AAGGC

Size (pb) Referencea


209

(6)

309

(6)

111

(6)

535

(6)

390

(6)

780

(6)

269

(6)

433

(13)

741

(18)

629

(18)

376

(18)

481

(3)

669

(11)

424

(11)

315

(11)

319

(1)

512

(11)

704

(14)

495

(14)

576

(5)

641

(1)

278

(19)

359

(3)

473

(3)

680

(6)

722

(3)

272

(3)

285

(19)

700

(4)

141

(9)

374

This study

1200

This study

350

This study

3. Resultados
Table S1 (continuation). Oligonucleotides used in this study.
Group
SCCmec
typing

Gene
SCCmec I

Name
Type I-F

GCTTTAAAGAGTGTCGTTACAGG
GTTCTCTCATAGTATGACGTCC
CGTTGAAGATGATGAAGCG
CGAAATCAATGGTTAATGGACC
CCATATTGTGTACGATGCG
CCTTAGTTGTCGTAACAGATCG
GCCTTATTCGAAGAAACCG
CTACTCTTCTGAAAAGCGTCG
TCTGGAATTACTTCAGCTGC
AAACAATATTGCTCTCCCTC
ACAATATTTGTATTATCGGAGAGC
TTGGTATGAGGTATTGCTGG
CTCAAAATACGGACCCCAATACA
TGCTCCAGTAATTGCTAAAG
GAACATTGTTACTTAAATGAGCG
TGAAAGTTGTACCCTTGACACC
CCCTTTTTATACAATCTCGTT
ATATCATCTGCAGAATGGG
TATTTTTGGGTTTCACTCGG
CTCCACGTTAATTCCATTAATACC
ATTGCCTTGATAATAGCCITCT
AACCTATATCATCAATCAGTACGT
ATTGCCTTGATAATAGCCITCT
TAAAGGCATCAATGCACAAACACT
ATTGCCTTGATAATAGCCITCT
AGCTCAAAAGCAAGCAATAGAAT
ATGAATTCAAAGAGCATGGC
GATTTAGAATTGTCGTGATTGC
ATGTAATTCAAACAGTTCACATGCC

(20)

398

(20)

280

(20)

776

(20)

493

(20)

200

(20)

881

(20)

325

(20)

146

(20)

1305

(20)

700

(20)

1000

(20)

1600

(20)

336

(20)

701

This study

ATAGGTTCAGATTGGCCCTTAGG
TCCAATCATTGCACAAAATC

163

(12)

595

(10)

323

(10)

linA/linA-Rw GCTTCTTTTGAAATACATGGTATTTTTCGATC
vatA1
CAATGACCATGGACCTGATC
614

(17)

AmpicillinPenicillin
resistance

blaZ

Macrolide
resistance

msrA

blaZ-2
msrA Fw

SCCmec III
SCCmec IVa
SCCmec IVb
SCCmec IVc
SCCmec IVd
SCCmec V
mec clase A
mec clase B
ccr type 1
ccr type 2
ccr type 3
ccr type 5

msrB
Lincosamide
resistance

linA/linA

Streptogramin vatA
A resistance
vatB
vatC
vgaA
vgaB
vgaC
Streptogramin vgbA
B resistance
vgbB
Macrolidelincosamidestreptogramin
B (MLSB)
resistance

ermA

ermB
ermC

Size (pb) Referencea


613

Type I-R
Type II-F
Type II-R
Type III-F
Type III-R
Type IVa-F
Type IVa-R
Type IVb-F
Type IVb-R
Type IVc-F
Type IVc-R
Type IVd-F
Type IVd-R
Type V-F
Type V-R
mecI-F
mecI-R
IS1272-F
mecR1-R
ccrAB-b2
ccrAB-a2
ccrAB-b2
ccrAB-a3
ccrAB-b2
ccrAB-a4
ccrC-F
ccrC-R
blaZ-1

SCCmec II

Sequence 5-3

msrA Rv
AATTCCCTCTATTTGGTGGT
msrB-Fw
TATGATATCCATAATAATTATCCAATC
msrB-Rv
AAGTTATATCATGAATAGATTGTCCTGTT
linA/linA-Fw GGTGGCTGGGGGGTAGATGTATTAACTGG

vatA2
vatB1
vatB2
vatC1
vatC2
vgaA1
vgaA2
vgaB1
vgaB2
vgaC1
vgaC2
vgbA1

AGCATTTCGATATCTCC
CCTGATCCAAATAGCATATATCC
CTAAATCAGAGCTACAAAGTG
TGGCAAAATCAGCAAGG
TCGTCTCTATCTCTAGGTCC
AGTGGTGGTGAAGTAACACG
CTTGTCTCCTCCGCGAATAC
TCTCTCAATTAGAAGAACC
TTATCTATTCGTGTTTCC
AGCTGGAGAAAGCAATCCAA
TCTTGCTGAAAATCCCGTTC
CCAGATTCAGCACCCTACG

vgbA2
vgbB1
vgbB2
ermA Fw

CCCCCCATTCAGTAAACC
CAGCAGTCTAGATCAGAGTGG
CATACGGATCCATCTTTTCC
TATCTTATCGTTGAGAAGGGATT

ermA Rv
ermB Fw
ermB Rv
ermC Fw
ermC Rv

CTACACTTGGCTTAGGATGAAA
CTATCTGATTGTTGAAGAAGGATT
GTTTACTCTTGGTTTAGGATGAAA
CTTGTTGATCACGATAATTTCC
ATCTTTTAGCAAACCCGTATTC

600

(17)

573

(17)

659

(17)

579

(17)

885

This study

427

(17)

728

(17)

139

(12)

142

(12)

190

(12)

153

3. Resultados
Table S1 (continuation). Oligonucleotides used in this study.
Group
Tetracycline resistance

Gene
tet(K)

Name
tet(K) Fw

tet(K) Rv
tet(M) Fw
tet(M) Rv
tet(O)
tet(O) Fw
tet(O) Rv
tet(L)
tet(L) Fw
tet(L) Rv
aac(6)-Ie-aph(2)-Ia aac6-aph2-1

tet(M)

Aminoglycoside
resistance

ant(4)-Ia
aph(3)-IIIa
Phenicol resistance

cat::pC221
cat::pC194
cat::pC223
fexA

Trimethoprim
resistance

dfrD
dfrK
dfrG
dfrS1(dfrA)

Phenicol, lincosamide,
oxazolidinone,
pleuromutilin and
streptogramin A
resistance

cfr

Sequence 5-3
TCGATAGGAACAGCAGTA
CAGCAGATCCTACTCCTT
GTGGACAAAGGTACAACGAG
CGGTAAAGT TCG TCACACAC
AACTTAGGCATTCTGGCTCAC
TCCCACTGT TCCATATCGTCA
TCGTTAGCGTGCTGTCATTC
GTATCCCACCAATGTAGCCG
CCAAGAGCAATAAGGGCATACC

aac6-aph2-2
ant4-1
ant4-2
aph3-1
aph3-2
cat-1
cat-2
cat-3
cat-4
cat-5
cat-6
fex-A-fw
fexA-rv
P1

CACACTATCATAACCATCACCG
CTGCTAAATCGGTAGAAGC
CAGACCAATCAACATGGCACC
CTGATCGAAAAATACCGCTGC
TCATACTCTTCCGAGCAAAGG
TGGAAGTTGTAAATAAAAATAAAGTG
CAATCCAAGGAATCATTGAAATCGG
CAATCCAAGGAATCATTGAAATCGG
AAAGCCAGTCATTAGGCCTATCTG
AGGATATGAACTGTATCCTGCTTTG
AATAATGAAACATGGTAACCATCAC
GTACTTGTAGGTGCAATTACGGCTGA
CGCATCTGAGTAGGACATAGCGTC
CCCTGCTATTAAAGCACC

P2
dfrK-1
dfrK-2
dfrG-1
dfrG-2
dfrS1-1
dfrS1-2
cfr-fw
cfr-rv

CATGACCAGATAACTC
CAAGAGATAAGGGGTTCAGC
ACAGATACTTCGTTCCACTC
TGCTGCGATGGATAAGAA
TGGGCAAATACCTCATTCC
CACTTGTAATGGCACGGAAA
CGAATGTGTATGGTGGAAAG
TGAAGTATAAAGCAGGTTGGGAGTCA
ACCATATAATTGACCACAAGCAGC

Size (pb) Referencea


169

(15)

406

(15)

515

(15)

267

(15)

347

(16)

172

(16)

268

(16)

269

This study

472

This study

464

This study

1272

(7)

606

(2)

229

This study

405

This study

270

This study

746

(8)

a
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Clin. Microbiol. 43:50265033.

Table S2. Resistance profiles of ST398 and outgroup S. aureus isolates, and their relationships with spa types and
PFGE profiles (n = 113).
Rgenotypea
R0
R1
R2e
R3e
R4
R5
R6e
R7
R8a

No

R-phenotypeb

StrainGroup

(2)

Susceptible
[AMP-PEN]
TET
[AMP-PEN]-TET
[AMP-PEN]-TET-ERY-CLI
[AMP-PEN]-TET-[ERY-CLI-QUI/DAL]
[AMP-PEN]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[AMP-PEN]-GEN-TET-[ERY-CLI]
[MET-OXA]-TET

ST8, ST433
ST5
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST9
ST398

NCTC, CP
ATCC
M
CP
CP
CP
CP
CP
M

ST398

AP (6), CP,
FPf, M (2)

ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST217
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398

CP, M
D
D
AP
FPf
AP (3)
MC
CP
MP
MP
CP, MP
CP
AP
AP
AP
D
AP
D
MP
CH
FPf
MB
D
FPf
AP
AP
AP, CP, MP
AP
AP
AP
AP
CP
CP, D
D

b (10) [MET-OXA]-TET
c
R9
R10
R11a
b
c
d
e
f
g
h
R12
R13
R14
R15a
b
c
d
e
R16
R17
R18a
b
R19
R20a
b
R21a
b
c
d
e
f
g
h

(2)

(3)

(2)

(3)

(2)

[MET(I)-OXA]-TET
[MET-OXA]-KAN(I)-TET
[MET-OXA]-[GEN-KAN]-TET
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]
[MET(I)-OXA]-TET-[ERY-CLI]
[MET(I)-OXA]-TET-[ERY-CLI]
[MET(I)-OXA]-KAN-TET
[MET-OXA]-TET-CHL
[MET-OXA]-TET-CIP
[MET-OXA]-TET-TMP
[MET-OXA]-TET-TMP
[MET-OXA]-TET-TMP
[MET(I)-OXA]-TET-TMP
[MET(I)-OXA]-TET-TMP
[MET-OXA]-QUI/DAL-CIP
[MET-OXA]-GEN-TET-[ERY-CLI]
[MET-OXA]-KAN-TET-[ERY-CLI]
[MET-OXA]-KAN(I)-TET-[ERY-CLI]
[MET-OXA]-KAN(I)-TET-TMP
[MET-OXA]-[GEN-KAN]-TET-TMP
[MET-OXA]-[GEN-KAN]-TET-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-TMP

Originc

spa type
t211, t318
t002
t011
t011
t034
t108
t034
t337
t011
t011 (3), t1451 (2),
t1457, t1580, t2346,
t2576 (2)
t011 (2)
t011
t011
t108
t108
t1255, t1451, t2346
t011
t034
t034
t108
t011 (2)
t011
t108
t011
t011
t011
t034
t011
t034
t032
t011
t011
t011
t011
t011
t034
t034 (3)
t2970
t1985
t011
t034
t034
t034 (2)
t2510

PFGE profiled
Control, S1
Control
C18
C6
C16
C32
C27
S2
C6
C5 (2), C6 (3),
C8 (2), C10,
C12 (2)
C6, C18
C18
C19
C2
C2
C6 (2), C10
C6
C9
C16
C12
C18 (2)
C6
C12
C6
C6
C5
C7
C21
C14
S5
C34
C12
C18
C35
C15
C3
C1, C5, C14
C6
C6
C6
C1
C16
C1 (2)
C1

155

3. Resultados
Table S2 (continuation). Resistance profiles of ST398 and outgroup S. aureus isolates, and their relationships with spa
types and PFGE profiles (n = 113).
R-genotypea
i
j
k
l
m
n
o
R22
R23
R24
R25a
b
c
d
e
R26
R27
R28a
b
c
d
e
f
g
h
i
R29a
b
c
d
e
R30
R31a
b
R32
R33
R34
R35a
b
R36
R37
R38a
b
R39
R40
R41
a

No R-phenotypeb

(3)
(2)

(2)

(2)

(2)

[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET(I)-OXA]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET(I)-OXA]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-TET-CIP-TMP
[MET(I)-OXA]-TET-SXT(I)-TMP
[MET-OXA]-GEN(I)-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-KAN-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-KAN-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-KAN-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-KAN-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-KAN-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-KAN-TET-CIP-TMP
[MET(I)-OXA]-KAN(I)-TET-[ERY-CLI]-CHL
[MET-OXA]-[GEN-KAN]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-[GEN-KAN]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-[GEN-KAN]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-[GEN-KAN]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-[GEN-KAN]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-[GEN-KAN]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-[GEN-KAN]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET(I)-OXA]-[GEN-KAN]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET(I)-OXA]-[GEN-KAN]-TET-[ERY-CLI]-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-QUI/DAL-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-QUI/DAL-TMP
[MET(I)-OXA]-TET-[ERY-CLI]-QUI/DAL-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-QUI/DAL(I)-TMP
[MET(I)-OXA]-TET-[ERY-CLI]-QUI/DAL(I)-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-[SXT-TMP]
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-CIP-TMP
[MET(I)-OXA]-TET-[ERY-CLI]-CIP-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-CHL-CIP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI]-CHL-TMP
[MET-OXA]-TET-[ERY-CLI- QUI/DAL(I)]-[SXT-TMP]
[MET(I)-OXA]-TET-CHL-CIP-TMP
[MET(I)-OXA]-TET-CHL-CIP-TMP
[MET-OXA]-KAN-TET-[ERY-CLI]-CIP
[MET-OXA]-KAN-[ERY-CLI]-CIP-MUP
[MET-OXA]-KAN-TET-[ERY-CLI]-CIP-TMP
[MET(I)-OXA]-KAN-TET-[ERY-CLI]-CIP-TMP
[MET-OXA]-KAN(I)-TET-[ERY-CLI]-CHL-TMP
[MET-OXA]-KAN-TET-[ERY-CLI- QUI/DAL]-CHL-TMP
[MET(I)-OXA]-KAN(I)-TET-[ERY-CLI]-CHL-[SXT(I)TMP]

StrainGroup

Originc

spa type

PFGE
profiled

ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST398
ST5
ST225
ST9
ST398
ST398
ST398

AP
CP
AP
AP, CP, MP
AP
CP
CP, MP
FPf
CP
AP
AP
AP
D
CP
AP (2)
AP
CP
MT
AP
AP
MT
AP
AP
AP
CP, D
CP
AP
CP
MP
D
MT (2)
AP
AP
CP
AP
CP
AP
CP
CP
MT
CH
MB
CP
CP
AP

t2011
t011
t1928
t034, t571 (2)
t1793
t011
t034 (2)
t011
t108
t2576
t108
t2576
t034
t034
t034, t1250
t011
t011
t779
t034
t011
t011
t011
t011
t011
t011 (2)
t011
t034
t034
t034
t034
t034, t5210
t108
t034
t034
t108
t011
t034
t011
t1451
t002
t003
t1430
t108
t034
t034

C6
C25
C11
C9 (2), C11
C3
C5
C1 (2)
C14
C26
C12
C12
C12
C9
C11
C16, C17
C14
C5
C30
C9
C15
C30
C4
C3
C15
C20, C33
C28
C1
C24
C1
C20
C24, C31
C1
C9
C23
C13
C22
C1
C14
C5
S4
S6
S3
C12
C29
C5

ST398

CP

t108

C14

The subtyping of the R-patterns was according to the presence of a genetic background, as shown in Figure 2.
MET, methicillin; OXA, oxacillin; TET, tetracycline; GEN, gentamicin; KAN, kanamycin; ERY, erythromycin; CLI, clindamycin; MUP,
mupirocina; QUI/DAL; quinupristin-dalfopristin; CHL, chloramphenicol; CIP, ciprofloxacin; TMP, trimethoprim; SXT, trimethoprimsulfamethoxazole; (I), intermediate susceptibility. Susceptible methicillin and oxacillin isolates were also tested for ampicillin (AMP) and
penicillin (PEN).
c
ATCC, American Type Culture Collection; CH, human clinical sample; AP, asymptomatic carrier pig; CP, pig clinical sample; D, dust
(from pig farms); FP, Dutch pig faecal sample; M, milk; MC, meat from cattle; MB, meat from broiler; MP, meat from pig; MT, meat from
turkey; NCTC, National Collection of Type Cultures.
d
C, Cfr9I-PFGE profile; S, SmaI-PFGE profile.
e
Isolates mecA positive (MRSA).
f
ST398 isolates kindly provided by D. Mevius (Central Veterinary Institute of Waningen, Lelystad, The Netherlands), used as control
strains.
Number of isolates in brackets when n>1.
b

156

4.Discusin

4. Discusin

La seccin de discusin se ha dividido en apartados en base a los cuatro objetivos de


la presente Tesis Doctoral. En los tres primeros apartados se comparan los resultados
obtenidos en las poblaciones de S. aureus de distinto origen procedentes del PA, que incluyen
muestras clnicas de dos hospitales (HUCA y HMN), muestras nasales de portadores sanos,
muestras de alimentos con alguna fase de procesado manual y muestras nasales de
manipuladores de alimentos. Por otro lado, el anlisis de distintas muestras relacionadas con
animales: nasales de cerdos asintomticos, clnicas de cerdos enfermos, de polvo de granjas
de crianza y de alimentos, se centra en el linaje CC398/ST398. Los resultados de los
diferentes estudios se recopilan en las tablas recogidas en el Anexo II.

4. 1. Objetivo 1. Identificar los linajes y clones de S. aureus de distinto origen


(hospitales, portadores sanos y relacionados con alimentos) que han estado
circulando del Principado de Asturias, y sub-tipificacin del linaje ST398 de
origen animal.
El presente apartado recoge los datos obtenidos de la aplicacin de tcnicas de
tipificacin (PFGE, RM test, spa y MLST) para la determinacin de clusters y linajes en las
distintas poblaciones de S. aureus analizadas.

4.1.1. Comparacin de las tcnicas de tipificacin utilizadas


En general, se observ una buena correlacin entre las tcnicas de tipificacin
utilizadas, lo que permiti asignar aislamientos a CCs sin necesidad de realizar el MLST para
todos ellos, como se muestra en la Tabla 6 y en el Anexo II.
4.1.1.1. Tipificacin mediante electroforesis en campo pulsante (PFGE)
La tcnica PFGE, aunque es laboriosa, es el mtodo ms habitualmente utilizado para
el estudio de epidemiologa local de S. aureus, en brotes o en periodos cortos de tiempo
(Cookson et al., 2007). Al basarse en patrones de bandas, tiene un elevado poder de
discriminacin (Tabla 7), ya que es muy sensible a cambios genticos menores. Permite
analizar el genoma completo, detectar variacin en periodos cortos de tiempo, establecer la
distribucin temporal y espacial de los distintos pulsotipos, y determinar si son espordicos,
asociados a brotes, endmicos o epidmicos. Sin embargo, aunque existe un protocolo
consenso para S. aureus (Murchan et al., 2003), y se ha diseado software de anlisis (Duck
et al., 2003; BioNumerics V51 Applied Maths), la interpretacin de los patrones de bandas es
relativamente subjetiva y la comparacin entre laboratorios no es fcil.
La tcnica PFGE se aplic en esta Tesis Doctoral para el estudio de aislamientos
procedentes del HUCA, de portadores sanos y de animales (Artculos 1, 4, 10 y 11). El
anlisis UPGMA llevado a cabo en cada poblacin mostr que generalmente la tcnica
agrupa en un mismo cluster pulsotipos correspondientes a aislamientos de un mismo CC
(establecido por MLST). Sin embargo existieron casos en los que pulsotipos de un mismo CC
se separaron en ms de un cluster. Este fenmeno se observ en linajes mayoritarios en
157

4. Discusin

humanos, como CC1, CC5, CC30 y CC45 (Artculos 1 y 4). Las excepciones pueden deberse
a variaciones en los puntos de corte de la endonucleasa en el cromosoma bacteriano o a la
presencia de bandas correspondientes a plsmidos. De hecho dentro del linaje CC5, ST5 ha
demostrado ser bastante variable en cuanto a SNPs (Nbel et al., 2008). Otros autores
tambin han encontrado casos de perfiles PFGE asignados a CC1, CC5 CC30 y/o CC45 que
se distanciaban en el dendograma de otros perfiles del mismo CC (Rabello et al., 2007;
Bartels et al., 2008; Vainio et al., 2008). Este fenmeno tambin se ha sido observado por
otros autores en otros CCs mayoritarios, como CC8, (Shabir et al., 2010), pero no en nuestros
estudios. Por otro lado, los pulsotipos de aislamientos de portadores sanos pertenecientes a
CC1, CC9 y CC97 se agruparon en un mismo cluster por PFGE, fenmeno posiblemente
debido a que estos linajes estn relativamente relacionados (Artculo 4). El fundador del
CC1, es ST1 (arcC 1, aroE 1, gplF 1, gmk 1, pta 1, tpi 1, yqiL 1) que comparte 4 de los 7
alelos utilizados para definir el ST con los correspondientes a los linajes CC9 (ST109: arcC

3, aroE 27, gplF 1, gmk 1, pta 1, tpi 1, yqiL 10) y CC97 (ST97: arcC 3, aroE 1, gplF 1,
gmk 1, pta 1, tpi 5, yqiL 3).
Por otro lado, ciertos perfiles de restriccin fueron idnticos en aislamientos
procedentes del HUCA y de PS (Artculo 4), destacando el hecho de que entre estos perfiles
se encontraban algunos de los ms frecuentes en los linajes CC5/ST5, CC30 y CC45. Como
en este caso, otros estudios han demostrado que los mismos linajes (Day et al., 2001; Feil et
al., 2003; Hotfreter et al., 2007; Lamers et al., 2011) y perfiles PFGE (Peacock et al., 2002)
tienen xito tanto en la colonizacin de seres humanos como en la produccin de enfermedad.
De hecho, la colonizacin por S. aureus es uno de los mayores factores de riesgo de
infeccin, siendo el 80% de las infecciones nosocomiales de origen endgeno (Wertheim et
al., 2005). En este mismo sentido, el perfil HUCA-S48, generado por un aislamiento
MRSA SCCmec IVc del CC72, es casi idntico al perfil PS-S145 de un aislamiento
MSSA del mismo linaje. Estos perfiles slo se diferencian en una banda, de 143,8 kb en
el aislamiento MSSA y de 196,2 kb en el MRSA (Artculo 4). La hibridacin de esta
ltima banda con una sonda para mecA apoya la avalada teora multiclon, que propone la
repetida introduccin de distintos tipos de SCCmec en aislamientos de un mismo o de
diferentes linajes como origen de los clones MRSA (Deurenberg y Stobberingh, 2009). De
hecho ya se ha demostrado que los linajes MSSA presentes en una comunidad constituyen un
reservorio para la captacin de SCCmec (Gomes et al., 2006; Layer et al., 2006). Adems,
anlisis recientes de SNPs en poblaciones de S. aureus estiman que la introduccin de
elementos mec en MSSA es ms comn de lo que se pensaba anteriormente lo que genera una
mayor diversidad de clones MRSA (Nbel et al., 2008).

158

4. Discusin

Tabla 6. Complejos clonales, secuencias tipo y tipos spa encontrados en


Staphylococcus aureus estudiadas en esta Tesis doctoral.
HUCA
HMN
PS
CCa
STa
Tipos spaa
(N=81) (N=62) (N=111)
n (%)
n (%)
n (%)
CC1

CC5

ST1
ST3
ST188
Total
ST5
ST6
ST125
ST146
ST228
ST1619
nd

Total
ST8
ST239
ST247
nd
Total
CC9 ST9
ST109
Total
CC12 ST12
nd
Total
CC15 ST14
ST15
CC8

ST582
ST620
nd
Total
CC22 ST217
CC25 ST25
ST26
nd
Total
CC30 ST30
ST34
ST433
ST605
nd

Total

t127, t3201
t177
t189
t001, t002, t045, t179,
t548, t2173, t6488
t701
t067, t3734
t002, t1560
t109
t166
t001, t002, t067, t071,
t242, t306, t1340
t008, t024, t351
t037
t051
t008, t051
t337, t1430
t209
t160
t1381

las poblaciones de
ALM
(N=64)
n (%)

1 (1,2)

1 (1,6)
1 (1,6)
10 (16,1)

1 (0,9)
2 (1,8)
1 (0,9)
4 (3,6)
5 (5,5)

1 (1,6)
1 (1,6)
3 (4,7)

4 (4,9)
3 (3,7)
37 (45,7)

5 (8,1)
2 (3,2)
1 (1,6)
4 (6,5)

16 (14,4)

4 (6,3)
4 (6,3)
1 (1.6)
1 (1,6)

45 (55,6)
1 (1,2)
1 (1,2)
1 (1,2)
2 (2,5)
3 (3,7)
2 (2,5)

22 (35,5)
2 (3,2)
3 (4,8)
6 (9,7)
1 (1,6)
12 (19,4)
1 (1,6)
5 (8,1)

21 (18,9)
1 (0,9)
1 (0,9)
4 (3,6)
4 (3,6)
2 (1,8)

13 (20.3)
1 (1,6)
1 (1,6)
2 (3,1)
2 (3,1)

1 (1,6)
7 (11,3)
2 (3,2)
2 (3,2)
2 (3,2)

4 (3,6)
7 (6,3)
13 (11,7)
4 (3,6)
5 (4,5)
9 (8,1)
5 (4,5)

2 (3,1)
2 (3,1)
1 (1,6)
1 (1,6)
7 (10,9)

t279
t084, t085, t120, t279,
t547, t3474, t5111
t085
t346
t084, t2949, t7248, t7756 1 (1,2)
3 (3,7)
t790
t078, t081, t167, t1054
1 (1,2)
t7125
t078, t081, t287, t6489
2 (2,5)
3 (3,7)
t012, t017, t018, t021,
2 (2,5)
t122, t840
t136, t166, t6490
1 (1,2)
t318
t275
t018, t012, t021, t253,
12 (14,8)
t942, t1515, t6713, t7785
15 (18,5)

2 (3,2)

AN
(N=109)
n (%)
1 (0,9)
-

1 (0,9)
2 (1,8)
2 (1,8)
-

3 (2,7)
3 (4,7)
3 (2,7)
19 (17,1) 3 (4,7)

1 (0,9)
-

30 (27,0) 13 (20,3)

1 (0,9)

159

4. Discusin

Tabla 6 (continuacin). Complejos clonales, secuencias tipo y tipos spa encontrados en las
poblaciones de Staphylococcus aureus estudiadas en esta Tesis doctoral.
HUCA HMN
PS
ALM
AN
a
a
a
CC
ST
Tipos spa
(N=81) (N=62) (N=111) (N=64)
(N=109)
n (%)
n (%)
n (%)
n (%)
n (%)
t015, t026, t040, t050,
t065, t350, t1078, t1618
ST47 t383
ST546 t604
nd
t015, t026, t050, t282,
t798, t1618, t1494, t1618
Total
CC59 ST59 t216
nd
t3952
Total
CC72 ST72 t148
nd
t148
Total
CC88 ST88 t1814
CC97 ST97 t267
nd
t1877
Total
CC121 ST121 t159, t272
ST51 t272
nd
t159, t375
Total
CC398 ST398 t011, t034, t108, t571,
t779, t1250, t1255, t1451,
t1457, t1580, t1793, t1928,
t1985, t2011, t2346, t2576,
t2970, t5210
CC45

ST45

1 (1,2)

6 (9,7)

4 (3,6)

6 (9,4)

1 (1,2)
6 (7,4)

3 (4,8)

14 (12,6)

1 (1,6)
17 (26,6)

8 (9,9)
1 (1,2)
1 (1,2)
1 (1,2)
1 (1,2)
1 (1,2)
1 (1,2)
-

9 (14,5)
1 (1,6)
1 (1,6)
1 (1,6)
1 (1,6)
3 (4,8)
2 (3,2)
2 (3,2)
-

18 (16,2)
2 (1,8)
1 (0,9)
3 (2,7)
1 (0,9)
1 (0,9)
2 (1,8)
2 (1,8)
1 (0,9)
3 (2,7)
1 (0,9)
2 (1,8)
3 (2,7)
-

24 (37,5)
5 (7,8)
5 (7,8)
1 (1,6)
1 (1,6)
105 (96,3)

Las secuencias tipo (ST) y los tipos spa se determinaron por MLST y tipificacin spa,
respectivamente. Los complejos clonales (CC) se establecieron en base a STs, tipos spa y/o a los
resultados del test RM. bLos tipos spa t6488, t6489 y t6490 son de nueva descripcin. AN,
aislamientos procedentes de animales; ALM, aislamientos procedentes de alimentos y manipuladores
de alimentos; HMN, aislamientos procedentes del Hospital Monte Naranco; HUCA, aislamientos
procedentes del Hospital Universitario Central de Asturias; PS, aislamientos procedentes de portadores
sanos; N, nmero total de aislamientos; n, nmero de aislamientos de cada grupo y tipo; nd, no
determinado.

En el ao 2004, se detect en los Pases Bajos un clon MRSA (CC398/ST398)


relacionado con ganadera porcina que no poda ser tipificado mediante SmaI-PFGE (Voss et
al., 2005). Aislamientos de este clon, tipificables mediante SmaI-PFGE, haban sido
detectados previamente causando bacteriemia en humanos en China (Ip et al., 2005), pero los
procedentes de ganado en Europa posean un nuevo sistema RM de tipo II que impeda su
tipificacin utilizando SmaI-PFGE (Bens et al., 2006). En el 2008 cuando se plante el
trabajo a realizar durante una estancia breve en el BfR (Berln) no se haba conseguido un
mtodo equiparable al SmaI-PFGE para la tipificacin de este clon (Bens et al., 2006;
Rasschaert et al., 2009). Nosotros nos planteamos la utilizacin de un isoesquizmero de
SmaI, el Cfr9I (Artculo 10). Ambos enzimas reconocen y cortan dentro de la secuencia 5'160

4. Discusin

CCCGGG-3', generando patrones de bandas idnticos cuando dicha secuencia no est


metilada. Sin embargo, presentan distinta actividad dependiendo de la base o bases metiladas
dentro de la secuencia de reconocimiento (www.rebase.neb.com). Al mismo tiempo, otros
autores tambin procedieron al estudio del clon ST398 mediante Cfr9I-PFGE (Bhat et al.,
2009; Fanoy et al., 2009) y actualmente este mtodo se ha utilizado para la tipificacin de
distintas colecciones de aislamientos del clon (Artculo 11; Bosch et al., 2010). En nuestro
estudio, el anlisis UPGMA distribuy los perfiles Cfr9I-PFGE de aislamientos del CC398 en
dos clusters ligados al tipo de SCCmec y claramente separados de perfiles de otros linajes.
Por otro lado, aislamientos MSSA presentaban perfiles similares a aislamientos MRSA, lo
que apoya la repetida adquisicin de elementos mec por cepas MSSA. Cabe destacar que la
utilidad de Cfr9I se haba demostrado anteriormente en aislamientos de Streptococcus
pyogenes cuyo DNA era resistente a la digestin por SmaI (Silva-costa et al., 2006; Euler et
al., 2007; Silva-costa et al., 2008). En esta bacteria, la resistencia frente a la restriccin por
SmaI se debe a la presencia de un elemento quimrico denominado 10394.4, con
caractersticas tanto de profago como de transposn, que contiene un gen de resistencia a
macrlidos (mefA) y un sistema RM de tipo II (SpyI) que incluye una C5-citosinametiltransferasa (spyIM). El estudio de la presencia de este elemento en aislamientos del
CC398, nos permiti identificar una nueva C5-citosina-metiltransferasa (Artculo 10), lo cual
se confirm con la posterior secuenciacin del genoma de una cepa de este clon (Schijffelen
et al., 2010). Cabe destacar, sin embargo, que la C5-citosina-metiltransferasa de CC398 es
distinta de la codificada por spyIM y que, adems, los aislamientos ST398 carecen de mefA y
el elemento 10394.4 (Artculo 10).
Tabla 7. Resolucin de las distintas tcnicas utilizadas para la tipificacin de
Staphylococcus aureus.
N
% de aislamientos del
Tcnica de tipificacin
N
DI (95% CI)a
tipos
tipo ms frecuente
PFGE
spa
MLST
RM test

301
403
135
237

144
107
34
7

5,3
9,7
14,1
27,0

0,987 (0,984-0,990)
0,969 (0,963-0,976)
0,946 (0,960-0,932)
0,800 (0,783-0,817)

El ndice de discriminacin (ID) da la probabilidad de que dos cepas no relacionadas, tomadas de la


poblacin analizada, se siten en diferentes grupos y viene determinado por el nmero de tipos
definidos por el mtodo aplicado y la frecuencia relativa de estos tipos. Se calcul mediante el ndice
de diversidad de Simpson (Simpson, 1949; Hunter y Gastn, 1998). Sus intervalos de confianza (CI)
se establecieron en base a Grundmann et al. (2001). N, nmero de aislamientos analizados por cada
una de las tcnicas de tipificacin.

4.1.1.2. Tipificacin mediante secuenciacin del gen de la protena A (spa)


La tcnica de secuenciacin del gen spa se ha popularizado a lo largo de los ltimos
aos, debido a que es menos laboriosa y costosa que el MLST y el PFGE. Al igual que este
ltimo permite el estudio de brotes, y como el MLST es una herramienta para determinar la
evolucin de S. aureus (Koreen et al., 2004). Tiene un poder de discriminacin intermedio
161

4. Discusin

entre PFGE y MLST (Tabla 7), existiendo una gran correlacin con ambas tcnicas
(Cookson et al., 2007; Hallin et al., 2007b). Durante un tiempo, la comparacin de datos spa
resultaba complicada debido a la existencia de dos nomenclaturas: la americana basada en el
estudio de Koreen et al. (2004) y la europea propuesta por Harmsen et al. (2003).
Actualmente, la nomenclatura europea es la ms utilizada ya que existe un software (Ridom
StaphType, Ridom GmbH) para su determinacin, el cual est conectado a una amplia base de
datos disponible en la web (Friedrich et al., 2006; http://www.seqnet.org/;
http://www.spaserver.ridom.de/).
En esta Tesis doctoral la tipificacin spa ha permitido, en la mayora de los casos,
asignar correctamente los aislamientos a los CCs establecidos por MLST (Tabla 6). Los
linajes CC5, CC15, CC25, CC30, CC45 y CC398 de dispersin mundial, incluyeron un
mayor nmero de tipos spa. Por otro lado, la mayora de los STs identificados se asociaron a
varios tipos spa y en ocasiones el mismo spa apareci ligado a ms de un ST dentro del
mismo CC.
Respecto a la poblacin del HUCA, mediante PFGE se agruparon en un cluster de
CC45/ST47, dos aislamientos con tipo spa t081, el cual est relacionado con CC25. Este
fenmeno se debe probablemente a que la tcnica PFGE no gener un cluster homogneo de
aislamientos CC45 (Bartels et al., 2008; Vainio et al., 2008), y no a la adquisicin de este spa
por dichos aislamientos. As, aunque estudios de tipificacin spa y posterior anlisis BURP
han demostrado que los tipos spa dentro del CC45 se distribuyen en varios spa-CCs, que en
muchos casos incluyen aislamientos de otros CCs, como CC1, CC5, CC15 o CC30 (Nulens et
al., 2008, von Eiff et al., 2008, Deurenberg et al., 2009), el anlisis MLST de una de las cepas
t081 del HUCA demostr su adscripcin a ST25 (Anexo II).
El linaje CC398 fue el ms heterogneo en cuanto a tipos spa. Este fenmeno se debe
en parte a la seleccin de la muestra analizada, que pretenda abarcar la mayor diversidad. Sin
embargo, el 77% de los aislamientos estudiados presentaron los tipos t011, t034 y t108,
mayoritarios de este linaje (Rasschaert et al., 2009; Graveland et al., 2010; Hasman et al.,
2010), mientras que el resto slo apareci en 1, 2 o 4 aislamientos. El anlisis BURP de todos
los tipos spa detectados en los aislamientos CC398 analizados en nuestro trabajo indic que
el 80% estaban relacionados, siendo t011 el fundador ms probable (Figura 9). Estos datos,
estn de acuerdo con los obtenidos por el NRL-Staph de Alemania, que en una muestra ms
amplia encontr una gran variabilidad de tipos spa menos frecuentes, la mayora relacionados
con los mayoritarios (Tenhagen et al., 2009).

4.1.1.3. Tipificacin por secuenciacin de mltiples loci (MLST)


El MLST ha sido ampliamente utilizado para estudiar la epidemiologia y
evolucin de S. aureus (Cookson et al., 2007). Aunque aporta menos informacin que el
PFGE sobre la diversidad gentica y tiene un menor ndice de discriminacin (Tabla 7),
presenta una clara ventaja frente al estudio de patrones de bandas, ya que la secuenciacin
de ADN genera informacin inequvoca, fcilmente almacenable y comparable (Cookson
162

4. Discusin

et al., 2007; Melles et al., 2007). Adems, es una tcnica relativamente fcil de aplicar
cuya base de datos est continuamente aumentado, y actualizndose debido al
descubrimiento de nuevos STs (http://www.mlst.net/). Sin embargo, se trata de una
tcnica costosa que no est al alcance de cualquier laboratorio.
El MLST se ha utilizado en aislamientos representativos de cada poblacin
estudiada en esta Tesis Doctoral para establecer su pertenencia a un determinado linaje
y/o clon MRSA (Anexo II, Apartados 4.1.2. y 4.3.2.).

Figura 9. Agrupacin BURP de los tipos spa del CC398. El diagrama fue realizado utilizando el
software Ridom Staphtype (Ridom GmbH; Wrzburg), y se bas en el sistema BURP (based upon
repeat pattern) sin excluir tipos spa con menos de cinco repeticiones. El 80% de los tipos spa del
CC398 (correspondientes al 91% de los aislamientos) se agruparon en un nico cluster, siendo t011
(08-16-02-25-34-24-25) el tipo spa fundador (color azul). Varios tipos infrecuentes: t2510 (08-1725), t2576 (08-12-16-02-25-34-24-25), t2970 (08-16-02-25-34-34-24-25) y t5210 (08-16-02-25-2534-24-25) no se incluyeron en este cluster. El tamao de los crculos es proporcional al nmero de
aislamientos que pertenece al tipo spa indicado.

4.1.1.4. Tipificacin mediante el test RM


El test RM es una tcnica de reciente introduccin, diseada para la rpida deteccin
de los principales linajes de aislamientos MRSA (CC1, CC5, CC8, CC22, CC30 y CC45),
que son los de mayor inters clnico (Cockfiel et al., 2007; Lindsay et al., 2010). Se basa en
tres reacciones de PCR para la deteccin de fragmentos de los genes sau1hsdS
correspondientes a dichos linajes. En esta Tesis Doctoral se utiliz en aislamientos de HMN,
portadores sanos, alimentos/manipuladores, sirviendo como primera aproximacin al estudio
de la estructura poblacional (Artculo 2, Anexo II). Esta tcnica estableci correctamente el
linaje de la mayora de los aislamientos, aunque existieron excepciones en las poblaciones de
portadores sanos y alimentos/manipuladores, en las cuales aislamientos CC1, CC30 y CC45
no fueron tipificables y la asignacin a CC9, CC25, CC97, y ST6/CC5 demostr ser inexacta
(Anexo II). La no tipificacin de algunos aislamientos CC1, CC30 y CC45, y la asignacin
errnea de aislamientos CC9 y CC97 a CC1, puede deberse a que el test fue inicialmente
diseado para la deteccin rpida de los CCs-MRSA predominantes en hospitales, lo que no
abarca la enorme variabilidad de S. aureus existente. Debido a los errores de asignacin a
linajes, los resultados de esta tcnica no se han incluido en la elaboracin de los artculos
relativos a muestras de portadores sanos y alimentos/manipuladores (Artculos 4 y 7).
Hay que indicar, adems, que todos los aislamientos CC25 analizados en esta Tesis
Doctoral mediante el test RM originaron el amplicn de 1071 pb caracterstico del gen
163

4. Discusin

sau1hsdS2 de CC5 (Artculo 2, Anexo II). La secuenciacin de un fragmento de 1190 bp


correspondiente al gen sau1hsdS2 de aislamientos CC25 del HMN y de portadores sanos, y su
comparacin con el gen sau1hsdS2 (1230 pb) de un aislamiento del linaje CC5 (N315; ST5,
NC_002745.2) mostr que las dos secuencias eran idnticas en un 96% y que los
oligonucletidos diseados para la deteccin de CC5 (Cockfiel et al., 2007) tambin anillan
con la secuencia de CC25 (Figura 10). Sin embargo, comprobamos que estos linajes difieren
en el gen sau1hsdS1, lo que nos permiti el diseo de nuevos oligonucletidos que permiten
distinguir CC5 y CC25 mediante et test RM (Figura 10).
A.
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-LMUO25/05
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-LMUO25/05
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-LMUO25/05
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-LMUO25/05
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-LMUO25/05

1
1
91
43
177
125
260
209
327
299

sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-LMUO25/05
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-LMUO25/05
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-LMUO25/05
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-LMUO25/05
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-LMUO25/05
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-LMUO25/05
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-LMUO25/05
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-LMUO25/05
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-LMUO25/05
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-LMUO25/05

416
389
502
462
588
552
678
642
768
732
858
822
948
912
1038
1002
1128
1092

B.

sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-LMUO25/05
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-LMUO25/05
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-LMUO25/05
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-LMUO25/05
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-LMUO25/05
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-LMUO25/05
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-LMUO25/05
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-LMUO25/05
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-LMUO25/05
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-LMUO25_05
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-LMUO25/05
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-LMUO25/05
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-LMUO25/05
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-LMUO25/05

1182

AF5 AGGGTTTGAAGGCGAATGGG
ATGAGTAATACACAAAAGAAAAATGTGCCAGAGTTGAGATTCCCAGGGTTTGAAGGCGAATGGGAAGAGAAGCAGTTGGGGGATCTTACA
------------------------------------------------TTTGAAGGCGAATGGGAAGAAAAGAAGTTAGGGAATCTTACT
GATAGAGTAATTAGGAAAAATAA----AAACTTAGAATCGAAAAAGCCTTTAACAATATCCGGACAGTTAGGTTTAATTGATCAAACAGA
ACCAAAATAGGTAGTGGAAAGACTCCCAAAGGTGGAAGTGAAAA---CTATACAAACAAAGGCATA-CCATTTTTAAGGAGTCAAA---ATATTTTAGTAAA--TCAGTTTCGTCGAAAAATCTAGAAAATTATACACTAATAAAGA-----ATGGAGAATTCGCGTATAACAAAAGTT
--ATATTAGAAATGGTAAATTAAATCTTAATGACT----TAGTTTATATTAGTAAAGATATAGATGATGAGATGAAAAATAGTAGAACGT
ATTCTAATGGA-------TACCCATTAGGGGCT-ATTAAAAG-----------ATTAACTAGATA--TGATAGTGGTGT--ATTGTCCTC
ACTATGGTGATGTTCTTTTAAATATTACAGGAGCATCAATAGGTAGAACAGCCATTAATTCGATAGTTGAAACGCATGCTAATTTAAATC
TTTGTATATTTGTTTTTCTATTAAAAGTGAAATGTC-TAAAGACTTCATGGAAGCATATTTTGATTCGACACACTGGTATAGAGAAGTTT
AACATGTATGTATTATTAGATTAAAAAAAGAGTATTATTATAATTTTTTTGGACAGTATCTATTATCAAGAAAAGGTAAAAGAAAAATTT
AR5 CGTCAACTCCCACGTTCTTTAG
CTGGAATTGCAGTTGAGGGTGCAAGAAATCACGGATTATTAAATGTTTCTGTGAATGATTTTTTTACTATTCTAATTAAATATCCA------TCCTTGCAC---AAAGTGGAGGTAGTCGAGAAGGACTAAA--CTTCAAAGAA-------ATTGCTAATTTAA--AAATCTTCACCCC
----AGTTTAGAAGAACAGCAAAAAATAGGCAAGTTCTTCAGCAAACTCGACCGACAAATTGAATTAGAAGAACAAAAGCTTGAATTACT
AACTATATTTGAAGAACAACAAAAAATAGGACAATTCTTCAGCAAACTTGACCAACAAATTGAATTAGAAGAACAAAAACTTGAATTACT
TCAACAACAGAAAAAAGGCTATATGCAGAAAATTTTCTCACAGGAACTGCGATTCAAAGATGAGAATGGTGAAGATTATCCAGATTGGGA
TCAACAACAGAAAAAAGGCTATATGCAGAAAATCTTCTCACAGGAACTGCGATTCAAAGATGAGAATAGTGAAGATTATCCACATTGGGA
AAATAGCAAAATAGAAAAATATTTAAAAGAGAGAAACGAACGTTCTGACAAAGGGCAAATGCTTTCAGTAACTATAAATAGTGGCATTAT
AAGTAGCAAAATAGAAAAATATTTAAAAGAGAGAAACGAACGTTCTGACAAAGGTCAAATGCTTTCAGTAACTATAAATAGTGGCATTAT
AAAATTTAGTGAATTGGATAGAAAAGATAATTCAAGTAAAGATAAAAGTAATTATAAAGTAGTTAGGAAAAATGATATTGCATATAATTC
AAAATTTAGTGAATTGGATAGAAAAGATAATTCAAGTAAAGATAAAAGTAATTATAAAGTAGTTAGGAAAAATGATATTGCATATAATTC
TATGAGAATGTGGCAAGGGGCTAGTGGTAAATCAAATTATAATGGGATTGTTAGCCCTGCATATACTGTGCTTTATCCAACACAAAATAC
TATGAGAATGTGGCAAGGGGCTAGTGGTAAATCAAATTATAATGGGATTGTTAGCCCTGCATATACTGTGCTTTATCCAACACAAAATAC
TAGCTCATTATTTATTGGATATAAGTTTAAAACACATAGAATGATTCATAAATTTAAAATTAATTCACAAGGATTAACATCAGATACATG
TAGCTCATTATTTATTGGATATAAGTTTAAAACACATAGAATGATTCATAAATTTAAAATTAATTCACAAGGATTAACATCAGATACATG
GAACTTAAAATATAAACAATTAAAAAATATAAATATAGATATACCTGTATTGGAGGAACAAGAAAAGATAGGTGATTTCTTTAAAAAAAT
GAACTTAAAATATAAACAATTAAAAAATATAAATATAGATATACCTGTATTGGAGGAACAAGAAAAGATAGGTGATTTCTTTAAAAAAAT
GGATATATTGATAAGTAAACAGAAAATGAAAATTGAAATATTAGAAAAAGAGAAACAATCCTTTTTACAAAAAATGTTCTTATAA----GGATATATTGATAAGTAAACAGAAAATGAAAATTGAAATATTAGAAAAAGAGAAACAATCCTTTTTACAAAAAATGTTCTTATAACTTTG
---------------------------------------------------------------ATAAATACATAGATTGCATAAGAATAAAATTTGTATAATTTAACATATAAGTGTAAAAGTAAAA

1 ATGAGTAATACACAAACGAAAAATGTGCCAGAGTTGAGATTCCCAGGATTTGAGGGCGAATGGGAAGAGAAGAAGTTAGGGAATCTTACT
1 ---AGT-ATACACAA---AGAAATTTGCCAGAGTTGAGATTCCCAGGGTTTGAAGGCGAATGGGAAGAAAAGAAGTTAGGGAATCTTACT
BF CCCAAAGGTGGAAGTGAAAA
ACCAAAATAGGTAGTGGAAAGACTCCCAAAGGTGGAAGTGAAAACTATACAAACAAAGGCATACCATTTTTAAGGAGTCAAAATATTAGA
ACCAAAATAGGTAGTGGAAAGACTCCCAAAGGTGGAAGTGAAAACTATACAAACAAAGGCATACCATTTTTAAGGAGTCAAAATATTAGA
AATGGTAAATTAAATCTTAATGACTTAGTTTATATTAGTAAAGATATAGATGATGAGATGAAAAATAGTAGAACGTACTATGGTGATGTT
AATGGTAAATTAAATCTTAATGACTTAGTTTATATTAGTAAAGATATAGATGATGAGATGAAAAATAGTAGAACGTACTATGGTGATGTT
CTTTTAAATATTACAGGAGCATCAATAGGTAGAACAGCCATTAATTCGATAGTTGAAACGCATGCTAATTTAAATCAACATGTATGTATT
CTTTTAAATATTACAGGAGCATCAATAGGTAGAACAGCCATTAATTCGATAGTTGAAACGCATGCTAATTTAAATCAACATGTATGTATT
ATTAGATTAAAAAAAGAGTATTATTATAATTTTTTTGGACAGTATCTATTATCAAGAAAAGGTAAAAGAAAAATTTTCCTTGCACAAAGT
ATTAGATTAAAAAAAGAGTATTATTATAATTTTTTTGGACAGTATCTATTATCAAGAAAAGGTAAAAGAAAAATTTTCCTTGCACAAAGT
GGAGGTAGTCGAGAAGGACTAAACTTCAAAGAAATTGCTAATTTAAAAATCTTCACCCCAACTATATTTGAAGAACAACAAAAAATAGGA
GGAGGTAGTCGAGAAGGACTAAACTTCAAAGAAATTGCTAATTTAAAAATCTTCACCCCAACTATATTTGAAGAACAACAAAAAATAGGA
CAATTCTTCAGCAAACTTGACCAACAAATTGAATTAGAAGAACAAAAACTTGAATTACTTCAACAACAGAAAAAATGCTATATACAGAAA
CAATTCTTCAGCAAACTTGACCAACAAATTGAATTAGAAGAACAAAAACTTGAATTACTTCAACAACAGAAAAAATGCTATATACAGAAA
ATCTTCTCACAAGAATTACGATTCAAAGATGAAGAAGGTAATTACTATAAAGGATGGAACAAAAAGCAATTAAAAGATGTATTAGAATTT
ATCTTCTCACAAGAATTACGATTCAAAGATGAAGAAGGTAATTACTATAAAGGATGGAACAAAAAGCAATTAAAAGATGTATTAGAATTT
AGTAATAAAAGAACTATTAATGAAAATGAATATCCTGTTTTAACATCGTCAAGACAAGGTTTAATACTTCAGTCAGACTACTATAAAGAT
AGTAATAAAAGAACTATTAATGAAAATGAATATCCTGTTTTAACATCGTCAAGACAAGGTTTAATACTTCAGTCAGACTACTATAAAGAT
AGGAAAACTTTTGCAGAGAGTAATATTGGGTATTTCATACTCCCTAAAAATCATATAACATACCGTTCAAGAAGCGACGATGGAATTTTT
AGGAAAACTTTTGCAGAGAGTAATATTGGGTATTTCATACTCCCTAAAAATCATATAACATACCGTTCAAGAAGCGACGATGGAATTTTT
AAGTTTAATTTAAATCTAATGATTGATGTAGGTATTATTAGTAAATATTACCCTGTCTTTAAAGGGATAGATGCAAATCAATATTATTTA
AAGTTTAATTTAAATCTAATGATTGATGTAGGTATTATTAGTAAATATTACCCTGTCTTTAAAGGGATAGATGCAAATCAATATTATTTA
ACATTACACTTAAACTATCAACTGAAAAAAGAATATATTAAATATGCAACTGGTACATCACAATTGGTACTCTCACAAAAAGACTTGCAA
ACATTACACTTAAACTATCAACTGAAAAAAGAATATATTAAATATGCAACTGGTACATCACAATTGGTACTCTCACAAAAAGACTTGCAA
BR5 GTTAGA
1081 AACATAAAGACTAAATTGCCATCTTATGAAGAACAACAAAAAATCGGTGATTTTTTCAGTGAAATAGATAGATTGGTTGAAAAACAATCT
1074 AACATAAAGACTAAATTGCCATCTTATGAAGAACAACAAAAAATCGGTGATTTTTTCAGTGAAATAGATAGATTGGTTGAAAAACAATCT
AGTTTTCAGCCTGCT
1171 TCAAAAGTCGGACGATTAAAAGTACGTAAAAAAGAACTATTACAAAAAATGTTTGTTTAA
1164 TCAAAAGTCGGACGATTAAAAGTACGT--------------------------------91
84
181
174
271
264
361
354
451
444
541
534
631
624
721
714
811
804
901
894
991
984

Figura 10. Comparaciones de las secuencias de los genes sau1hsdS de los linajes CC5 y
CC25. A. Comparacin de las secuencias de los genes sau1hsdS1 de CC5 (N315, NC_002745.2) y
CC25 (obtenida a partir de los aislamientos: C57, C285, LMUO 8/01, LMUO 25/05 y LMUO 2/06).
Se indican los oligonucletidos (AF y AR5) diseados para distinguir aislamientos de uno y otro linaje
en base al gen sau1hsdS1 (Anexo I). B. Comparacin de las secuencias de los genes sau1hsdS2 de
CC5 (N315, NC_002745.2) y CC25 (obtenida a partir de los aislamientos: C57, C285, LMUO 8/01,
LMUO 25/05 y LMUO 2/06). Se incluyen los oligonucletidos (BF y BR5) propuestos para la
deteccin de CC5 (Cockfiel et al., 2007).

164

4. Discusin

A.

sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02

1 ATGAGTAATACACAAAAGAAAAATGTGCCAGAGTTGAGATTCCCAGGGTTTGAAGGCGAATGGGAAGAGAAGCAGTTGGGGGATCTTACA
1 ATGAGTAATACACAAAAGAAAAATGTGCCAGAATTGAGGTTCCCAGGGTTTGAAGGCGAATGGGAAGAGAAGCAGTTAGGGGATCTTACA
1 ----------------AAAGAAATGTGCCAGAGTTGAGGTTCCTAGGGTTTGAAGGCGAATGGGAAGAGAAGCAGTTAGGGGATATTATA
91 GATAGAGT-AATTAGGAAAAA---TAAAAACTTAGAATCGAAAAAGCC--TTTAACAATATCCGGACAGTTAGGTTTAATTGATCAAA-91 GATAGAGT-AATTAGGAAAAA---TAAAAACTTAGAATCGAAAAAGCC--TTTAACAATATCCGGACAGTTAGGTTTAATTGATCAAA-75 ---AAAGTTAATTCTGGAAAAGATTATAAACAT---TTGGATAAAGGCGATATACCAGTCTATGGT-ACTGGCGGTTATATGA-CAAGTG
173 ---CAGAATATTTTAGTAAATCAGTTTC-GTCGAAAAATCTAGAAAATTATACACTAATAAAGAATGGAGAATTCGCGTATAACAAAAGT
173 ---CAGAATATTTTAGTAAATCAGTTTC-GTCGAAAAATCTAGAAAATTATACACTAATAAAGAATGGAGAATTCGCGTATAACAAAAGT
157 TTTCAGAACCACTAAGTGAAATTGATGCTGTTGGTATTGGGAGAAAAGGGACTATAAACAAACCAT-----ATTTGCTTGAGGCGCCGTT
259 TATTCTAATGGATACCCATTAGGGGCTATTAAAAGATTAACTAGATATGATAGTGGTGTATTGTCCTCTTTGTATATTTGTTTTTCTATT
259 TATTCTAATGGATACCCATTAGGGGCTATTAAAAGATTAACTAGATATGATAGTGGTGTATTGTCCTCTTTGTATATTTGTTTTTCTATT
242 TTGGACGGTGGATA--CATTA------TTTTATTGTACACCTAAAAAAGAAACAGACATA-------CTATTTATATTAAGTTTATTTAG
349 AAAAGTGAAATGTCTAAAGACTTCATGGAAGCATATTTTGATTCGACACACTGGTATAGAGAAGTTTCTGGAATTGCAGTTGAGGGTGCA
349 AAAAGTGAAATGTCTAAAGACTTCATGGAAGCATATTTTGATTCGACACACTGGTATAGAGAAGTTTCTGGAATTGCAGTTGAGGGTGCA
317 AAAAATAAACTG--------------GAAAGTATACGATGAATCAACA----GGTGT-GCCAAGCTTAAGCA-----------------A
439 AGAAATCACGGATTATTAAATGTTTCTGTGAATGATTTTTTTACTATTCTAATTAAATATCCAAGTTTAGAAGAACAGCAAAAAATAGGC
439 AGAAATCACGGATTATTAAATGTTTCTGTGAATGATTTTTTTACTATTCTAATTAAATATCCAAGTTTAGAAGAACAGCAAAAAATAGGC
371 ACAAACC----ATTAATAAA-------ATAAATAGATTTGTCCCTA-------CAAATA-----------AAGAGCAGCAAAAAATAGGC
529 AAGTTCTTCAGCAAACTCGACCGACAAATTGAATTAGAAGAACAAAAGCTTGAATTACTTCAACAACAGAAAAAAGGCTATATGCAGAAA
529 AAGTTCTTCAGCAAACTCGACCGACAAATTGAATTAGAAGAACAAAAGCTTGAATTACTTCAACAACAGAAAAAAGGCTATATGCAGAAA
432 AAGTTCTTCAGCAAACTCGACCGGCAAATTGAATTAGAAGAACAAAAACTTGAATTACTTCAACAACAGAAAAAAGGCTATATGCAGAAA
619 ATTTTCTCACAGGAACTGCGATTCAAAGATGAGAATGGTGAAGATTATCCAGA---------TTGGGAAAATAGCAAAATAGAAAAATAT
619 ATTTTCTCACAGGAACTGCGATTCAAAGATGAGAATGGTGAAGATTATCCAGA---------TTGGGAAAATAGCAAAATAGAAAAATAT
522 ATCTTCTCGCAAGAATTGCGATTCAAAGATGAGAATGGTAATGATTATCCGGAAAGTCTACTTTATAAACTTAGCGAGATTG--GAACAT

sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02
sau1hsdS1-N315
sau1hsdS1-COL
sau1hsdS1-B2-5/02

700
700
610
775
775
699
857
857
787
929
929
877
1013
1013
952
1103
1103
1036
1192
1192
1125

sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-COL
sau1hsdS2-B2-5/02

1 ATGAGTAATACACAAACGAAAAATGTGCCAGAGTTGAGATTCCCAGGATTTGAGGGCGAATGGGAAGAGAAGAAGTTAGGGAATCTTACT
1 ATGAGTAATACACAAAAGAAAAATGTGCCAGAATTGAGATTCCCAGGATTTGAAGGCGAATGGGAAGAGAAGAAGTTAGGGAATCTTACT
1 --------------------AAATGTGCCAGAGTTGAGATTCCCAGGATTTGAGGGCGAATGGGAAGAGAAGAAGTTAGGGAATCTTACT
BF CCCAAAGGTGGAAGTGAAAA
91 ACCAAAATAGGTAGTGGAAAGACTCCCAAAGGTGGAAGTGAAAACTATACAAACAAAGGCATACCATTTTTAAGGAGTCAAAATATTAGA
91 ACCAAAATAGGTAGTGGAAAGACTCCCAAAGGTGGAAGTGAAAACTATACAAACAAAGGCATACCATTTTTAAGGAGTCAAAATATTAGA
71 ACCAAAATAGGTAGTGGAAAGACTCCCAAAGGTGGAAGTGAAAACTATACAAACAAAGGCATACCATTTTTAAGGAGTCAAAATATTAGA
181 AATGGTAAATTAAATCTTAATGACTTAGTTTATATTAGTAAAGATATAGATGATGAGATGAAAAATAGTAGAACGTACTATGGTGATGTT
181 AATGGTAAATTAAATCTTAATGACTTAGTTTATATTAGTAAAGATATAGATGATGAGATGAAAAATAGTAGAACGTACTATGGTGATGTT
161 AATGGTAAATTAAATCTTAATGACTTAGTTTATATTAGTAAAGATATAGATGATGAGATGAAAAATAGTAGAACGTACTATGGTGATGTT
271 CTTTTAAATATTACAGGAGCATCAATAGGTAGAACAGCCATTAATTCGATAGTTGAAACGCATGCTAATTTAAATCAACATGTATGTATT
271 CTTTTAAATATTACAGGAGCATCAATAGGTAGAACAGCCATTAATTCGATAGTTGAAACGCATGCTAATTTAAATCAACATGTATGTATT
251 CTTTTAAATATTACAGGAGCATCAATAGGTAGAACAGCCATTAATTCGATAGTTGAAACGCATGCTAATTTAAATCAACATGTATGTATT
361 ATTAGATTAAAAAAAGAGTATTATTATAATTTTTTTGGACAGTATCTATTATCAAGAAAAGGTAAAAGAAAAATTTTCCTTGCACAAAGT
361 ATTAGATTGAAAAAAGAGTATTATTATAATTTTTTTGGACAGTATCTATTATCAAGAAAAGGTAAAAGGAAAATTTTCCTTGCACAAAGT
341 ATTAGATTGAAAAAAGAGTATTATTATAATTTTTTTGGACAGTATCTATTATCAAGAAAAGGTAAAAGGAAAATTTTCCTTGCACAAAGT
451 GGAGGTAGTCGAGAAGGACTAAACTTCAAAGAAATTGCTAATTTAAAAATCTTCACCCCAACTATATTTGAAGAACAACAAAAAATAGGA
451 GGAGGTAGTCGAGAAGGTCTAAACTTCAAAGAAATTGCTAATTTAAAAATCTTCACCCCAACTATATTTGAAGAACAGCAAAAAATAGGC
431 GGAGGTAGTCGAGAAGGTCTAAACTTCAAAGAAATTGCTAATTTAAAAATCTTCACCCCAACTATATTTGAAGAACAGCAAAAAATAGGC
541 CAATTCTTCAGCAAACTTGACCAACAAATTGAATTAGAAGAACAAAAACTTGAATTACTTCAACAACAGAAAAAATGCTATATACAGAAA
541 AAGTTCTTCAGCAAACTCGACCGACAAATTGAATTAGAAGAACAAAAACTTGAATTGCTTCAACAACAGAAAAAAGGCTATATGCAGAAA
521 AAGTTCTTCAGCAAACTCGACCGACAAATTGAATTAGAAGAACAAAAACTTGAATTGCTTCAACAACAGAAAAAAGGCTATATGCAGAAA
631 ATCTTCTCACAAGAATTACGATTCAAAGATGAAGAAGGTAATTACTATAAAGGATGGAACAAAAAGCAATTAAAAGATGTATTAGAATTT
631 ATCTTCACACAAGAATTGCGATTCAAAGATGAGAATGGTGAAGAATATCCAGAGTGGGAAAACAAATTCATAAAAGACATCTTTATCTTT
611 ATCTTCACACAAGAATTGCGATTCAAAGATGAGAATGGTGAAGAATATCCAGAGTGGGAAAACAAATTCATAAAAGACATCTTTATCTTT
BR8
ATG
GGAATGATACCAC
721 AGTAATAAAAGAACTATTAATGAAAATGAATATCCTGTT--TTAACATCGTCAAGACAAGGTTTAATACTTCAGTCAGACTACTATAAAG
721 GAAAATAATAGAA--------GAAAACCAATTACTTCTTCATTAA-------GAGAAAAGGGGTTATAC--------CCTTACTATGGTG
701 GAAAATAATAGAA--------GAAAACCAATTACTTCTTCATTAA-------GAGAAAAGGGGTTATAC--------CCTTACTATGGTG
GTTGACC
809 ATAGGAAAACTTTTGCAGA-GAGTAATATTGGGTATTTCATACTCCCTAAAAATCATATAACAT------ACCGTTCAAGAAGCGACGAT
788 CAACTGGAATTATTGATTACGTAAAAGATTATTTATTCAATAATGAAGAACGATTA-CTAATAGGAGAAGATGGTGCAAAATGGG----768 CAACTGGAATTATTGATTACGTAAAAGATTATTTATTCAATAATGAAGAACGATTA-CTAATAGGAGAAGATGGTGCAAAATGGG----892 GGAATTTTTAA--GTTTAATTTAAAT-CTAATGATTGATGTAGGTATTATTAGTAAATATTACCCTGTCTTTAAAGGGATAGATGCAAAT
872 GGCAGTTTGAGACGAGTAGCTTTATTGCTAATGGGCAATACTGG----GTAAATAATCATGCGCATGTAGTTAAAAGTAATGATCATAAT
852 GGCAGTTTGAGACGAGTAGCTTTATTGCTAATGGGCAATACTGG----GTAAATAATCATGCGCATGTAGTTAAAAGTAATGATCATAAT
979 CAATATTATTTAACATTACACTTAAACTATCAACTGAAAAAAGAATATATTAAATATGCAACTGGTACATCACAATTGGTACTCTCACAA
958 TTGTTTTTTATGAATTATTATTTAAATTTT---------AAAGAACTACGAGCATTTGTCACAGGTAATGCACCAGCTAAATTAACTCAT
938 TTGTTTTTTATGAATTATTATTTAAATTTT---------AAAGAACTACGAGCATTTGTCACAGGTAATGCACCAGCTAAATTAACTCAT
1069 AAAGACTTGCAAAACATAAAGACTAAATTGCCATCTTATGAAGAACAACAAAAAATCGGTGATTTTTTCAGTGAAATAGATAGATTGGTT
1039 GCGAACTTATGCAATATAAATCTTAAAATACCTTGTCTCACTGAACAAGATAAAGTAAGTGCATTGT----TAAAATCTATAGA---CAA
1019 GCGAACTTATGCAATATAAATCTTAAAATACCTTGTCTCACTGAACAAGATAAAGTAAGTGCATTGT----TAAAATCTATAGA---CAA
BR5 GTTAGAAGTTTTC
AGCCTGCT
1159 GAAAAACAATCTTCAAAAG-------TCGGACGATTAAAAGTACGTAAAAAAGAACTATTACAAAAAATGTTTGTTTAA
1122 TAAAATGAATAATCAAATGAATAGAATTGAGTTATTAAAAGAACGTAAAAAAGGACTATTACAAAAAATGTTTATTTAA
1102 TAAAATGAATAATCAAATG-----------------------------AATAGAA---------------TTCAATTA-

B.

sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-COL
sau1hsdS2-B2-5/02
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-COL
sau1hsdS2-B2-5/02
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-COL
sau1hsdS2-B2-5/02
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-COL
sau1hsdS2-B2-5/02
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-COL
sau1hsdS2-B2-5/02
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-COL
sau1hsdS2-B2-5/02
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-COL
sau1hsdS2-B2-5/02
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-COL
sau1hsdS2-B2-5/02
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-COL
sau1hsdS2-B2-5/02
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-COL
sau1hsdS2-B2-5/02
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-COL
sau1hsdS2-B2-5/02
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-COL
sau1hsdS2-B2-5/02
sau1hsdS2-N315
sau1hsdS2-COL
sau1hsdS2-B2-5/02

TTAAAAGAGAGAAACGAACGTTCTGACA---------------AAGGGCAAATGCTTTCAGTAACTATAAATAGTGGCATTATAAAATTT
TTAAAAGAGAGAAACGAACGTTCTGACA---------------AAGGGCAAATGCTTTCAGTAACTATAAATAGTGGCATTATAAAATTT
TTAATACTG-GTATTGGATTTCCTGAAAGTTTACAGGGTGGGAAAGAAGGAATACCTTTCTTTAAAATTTCTGATATGAATAATAAAGGC
AGTGAATTGGATA---GAAAAGATAATTCAAGTAAAGATAAAA-GTAATTATAAAGT---AGTTAGGAAAAATGATATTGCATATAAT-T
AGTGAATTGGATA---GAAAAGATAATTCAAGTAAAGATAAAA-GTAATTATAAAGT---AGTTAGGAAAAATGATATTGCATATAAT-T
AATGAAATAATTATGAGAAATGCTAAT--AACTACGTTTCAAATGGGATTATAGAGTCTAAAAAATGGAAAATTATAACTAACGTACCAT
CTATGAG--------AATGTGGCAAGGGGCTAGTGGTAAATCAAATTATAATGGG---------ATTGTTAGCCCTGCATA-TACTGTGC
CTATGAG--------AATGTGGCAAGGGGCTAGTGGTAAATCAAATTATAATGGG---------ATTGTTAGCCCTGCATA-TACTGTGC
CTATGATTTTTGCTAAAGTTGGAGCTGCAATAATGTTGAATCGAAAAAGATTAGTTTTAGAACCATTTTTAATCGATAACAATACTATGA
TTTATCCAACA-CAAAATACTAGCTCATTATTTATTGGATATAA--GTTTAAAACACATAGAATGATTCATAAATTTA---AAATTAATT
TTTATCCAACA-CAAAATACTAGCTCATTATTTATTGGATATAA--GTTTAAAACACATAGAATGATTCATAAATTTA---AAATTAATT
GTTATTCATTTTCGCAAGAATGGAACATTAATTTTGGAAGAACATTGTTTCAAAC-------------CATTTATTTACCTAAAT--ATG
CACAAGGATTAACATCAGATACATGGAACTTAAAATATAAACAATTAAAAAATATAAATATAGATATACCTGTATTGGAGGAACAAGAAA
CACAAGGATTAACATCAGATACATGGAACTTAAAATATAAACAATTAAAAAATATAAATATAGATATACCTGTATTGGAGGAACAAGAAA
CCCAGGTTGGTGCACTTCCATCATACAATGCAAAAGATATTGGATTA------ATTAAAATAGAATTACCTGTCAAAGAGGAACAAAAAA
AGATAGGTGATTTCTTTAAAAAAATGGATATATTGATAAGTAAACAGAAAATGAAAATTGAAATATTAGAAAAAGAGAAACA-ATCCTTT
AGATAGGTGATTTCTTTAAAAAAATGGATATATTGATAAGTAAACAGAAAATGAAAATTGAAATATTAGAAAAAGAGAAACA-ATCCTTT
GAATAGGTGACTTTTTTGTTTGGTTTGAAGAATTAATTGAAAGACAGATATTAAAACTAGATTTATTA-AAAGAGAGAAAAAGAGCGATT
TTACAAAAAATGTTCTTATAA--------------------------------------------------------------------TTACAAAAAATGTTCTTATAA--------------------------------------------------------------------TTACAGAAAATGTTTATTTAATTTGTCGCTACAATATAGTTTTAATTATTTGTTTATTTCAGCTGTTTCATCACACGATATAACTTTATA
------------------------------------1215 AATAAGATGTAAATTTATC

Figura 11. Comparaciones de las secuencias de los genes sau1hsdS de los linajes CC5 y CC8.
A. Comparacin de la secuencia del gen sau1hsdS1 de aislamientos CC5 (N315, NC_002745.2) y
CC8 (COL, CP000046.1) con la secuencia parcial obtenida de un aislamiento ST6/CC5 (B2-5/02). B.
Comparacin de la secuencia del gen sau1hsdS2 de aislamientos CC5 (N315, NC_002745.2) y CC8
(COL, CP000046.1) con la secuencia parcial obtenida de un aislamiento ST6/CC5 (B2-5/02). Se
indican los oligonucletidos (BF, BR5 y BR8) utilizados para la deteccin del linaje CC5 y CC8
mediante el test RM (Cockfiel et al., 2007).

165

4. Discusin

Por otro lado, todos los aislamientos ST6 del linaje CC5, amplificaron el producto de
680 pb esperado para el gen sau1hsdS2 de aislamientos del CC8 en el test RM (Anexo II). La
secuenciacin de los genes sau1hsdS1 y sau1hsdS2 de un aislamiento ST6 (1233 pb de
sau1hsdS1 y 1135 pb de sau1hsdS2) y su comparacin con las secuencias correspondientes a
aislamientos CC5 (N315; ST5, NC_002745.2) y CC8 (COL; ST8, CP000046.1), mostr que
el gen sau1hsdS1 de ST6 slo comparta un 53% de la secuencia con los genes sau1hsdS1 de
CC5 y CC8, mientras que el gen sau1hsdS2 de ST6 era ms similar al de CC8 (94%) que al
de CC5 (72%). De hecho, los oligonucletidos para la deteccin de CC8 tambin reconocen
la secuencia del sau1hsdS2 de ST6 (Figura 11).
A pesar de estos problemas, es necesario destacar que el test RM es una tcnica
rpida, sencilla y de bajo coste, que identifica correctamente los CCs de la mayor parte de los
MRSA que estn circulando actualmente en hospitales. Adems, su combinacin con la
secuenciacin del gen spa puede resolver los falsos negativos del test RM, e identificar otros
linajes que escapan a la deteccin con esta ltima tcnica. Una mejor caracterizacin de los
genes sau1hdsS de los distintos CCs de S. aureus permitir extender an ms la aplicacin del
test RM y solventar los problemas existentes actualmente para la tipificacin de MSSA. En
este sentido, recientemente se ha diseado un nueva reaccin de PCR, basada en sau1hsdS1,
para la deteccin del CC398 (Stegger et al., 2010) y se est intentando ampliar a otros linajes
como CC12, CC15, CC25 y CC59 (Lindsay et al., 2010).

4.1.2. Linajes circulantes en el Principado de Asturias


Los aislamientos de S. aureus procedentes de humanos pertenecen a diez linajes
mayoritarios (CC1, CC5, CC8, CC12, CC15, CC22, CC25, CC30, CC45 y CC51) (Feil et al.,
2003; Gomes et al., 2006). En total, en las poblaciones del PA se estableci la presencia de
quince linajes (CC1, CC5, CC8, CC9, CC12, CC15, CC22, CC25, CC30, CC45, CC59,
CC72, CC88, CC97, CC121), donde se incluyen todos los mayoritarios excepto CC51.
Adems, al igual que en otros aislamientos de humanos, CC5, CC8, CC22, CC30 y CC45
fueron los ms frecuentes (Tabla 6, Figura 12).
Las muestras nosocomiales analizadas en esta Tesis Doctoral se obtuvieron en dos
hospitales (HUCA y HMN) durante diferentes periodos distintos. La muestra del HUCA
incluy aislamientos implicados en infecciones graves durante un ao: finales 2005 a finales
2006, mientras que en el HMN se analizaron todos los aislamientos causantes de bacteriemia
durante el periodo 1997-2006, junto con una muestra representativa de aislamientos obtenidos
de heridas quirrgicas en los mismos aos (Artculos 1 y 2). En el HMN se encontr mayor
diversidad y se pudo observar la evolucin de los linajes a lo largo de una dcada. En este
sentido se observ que desde 1996 al 2000 predomin CC8, para luego ser sustituido por CC5
(Artculo 2). Este ltimo, asociado principalmente a ST5 y ST125, ha sido el linaje ms
comn en hospitales espaoles, incluidos el HMN y el HUCA, en los ltimos aos (Figura
13, Prez-Vzquez et al., 2008; Vindel et al., 2009), aunque actualmente tambin se ha
observado un incremento de CC22 (Manzur et al., 2010; Montesions et al., 2010). Del total
166

4. Discusin

de linajes encontrados en los dos hospitales de Asturias, CC5, CC8, CC12, CC15, CC25,
CC30, CC45, CC72, CC88 y CC121, pero no CC59, CC72 y CC88, ya haban sido descritos
en hospitales en Espaa (Prez-Roth et al., 2004; Vindel et al., 2006; Potel et al., 2007;
Prez-Vzquez et al., 2008; Manzur et al., 2010; Montesinos et al., 2010). De ellos, CC5,
CC8, CC30 y CC45 fueron los ms comunes, pudiendo considerarse endmicos en uno o
ambos hospitales, mientras que CC12, CC15, CC25, CC59, CC72, CC88, CC121 (Figura 13)
aparecieron con baja frecuencia, por lo se consideran espordicos. Cabe destacar, que
aislamientos del CC72 y CC88 se han detectado recientemente en pacientes portadores de S.
aureus (Montesinos et al., 2010).
188

247

228
146

1619
5

125

239

605

546

15

30

45

14

34

47

582

620

Grupos menores

Singletones

Figura 12. Representacin de los complejos clonales encontrados en el PA mediante


eBURST. Los nmeros corresponden a cada secuencia tipo (ST). El rea de cada crculo es
proporcional al nmero de cepas que se agrupan en cada ST. Las lneas moradas conectan o rodean
STs que se diferencian en un alelo (SLV) y las lneas azules conectan o rodean STs que se diferencian
en dos alelos (DLV).

Todos los linajes encontrados en el HUCA y HMN estuvieron tambin representados


en portadores sanos (periodo 1997-2006), a excepcin de CC12 y CC88 (Artculo 4, Figura
13). Esto coincide con otros estudios en los que se determin que los CCs causantes de
167

4. Discusin

enfermedad estn tambin presentes en la comunidad (Day et al., 2001; Lamers et al., 2011).
Sin embargo, las frecuencias de los distintos linajes varan considerablemente, siendo las
muestras de portadores sanos ms heterogneas (Day et al., 2001; Feil et al., 2003; Holtfreter
et al., 2007; Lozano et al., 2011b). En Asturias, el linaje ms frecuente en estos ltimos fue
CC30 (27%), al igual que en otros estudios, donde oscil entre el 20 y el 33% (Feil et al.,
2003; Collery et al., 2008; Ruimy et al., 2009). CC5, CC15, CC25 y CC45 son tambin
frecuentes en portadores, mientras que el resto de CCs encontrados en estudiantes de Asturias
(CC1, CC8, CC9, CC59, CC72, CC121) son menos comunes (Feil et al., 2003; Holtfreter et
al., 2007; Ruimy et al., 2009; Sakwinska et al., 2009; Ruimy et al., 2010; Lozano et al.,
2011b). Al igual que CC398, CC97 es un linaje asociado principalmente a animales (Sung et
al., 2008). En Espaa ha sido descrito en ganado porcino (Gmez Sanz et al., 2010). CC97,
pero no CC398, apareci con baja frecuencia en portadores del PA (2,7%), y ambos CCs lo
hicieron en portadores de la Rioja (Lozano et al., 2011b).
En general, los aislamientos obtenidos en el PA a partir de alimentos pertenecen a
CCs previamente encontrados en portadores sanos de esta comunidad (Artculo 7, Figura
13). Los linajes ms comunes fueron CC45, CC5 y CC30, que incluyeron el 37,5%, 20,3% y
20,3% de los aislamientos analizados, respectivamente. Otros CCs aparecieron con menor
frecuencia (1,6% a 7,8%), destacando la deteccin de CC22 (ST217) en alimentos implicados
en un brote, ya que este CC no se encontr en ninguna otra muestra del PA. Un aislamiento
MRSA del mismo ST se encontr recientemente en muestras de carne de jabal salvaje en
Espaa (Lozano et al., 2009), pero al ser una variante del actual clon epidmico EMRSA-15
(CC22/ST22 SCCmec IV; Manzur et al., 2010; Montesinos et al., 2010), los autores sugieren
que fue trasmitido a la muestra por manipuladores del alimento.
En la Figura 13 B. se observa la distribucin temporal de los distintos linajes
encontrados en el PA. La mayora de los aislamientos analizados se recogieron entre 20012006, periodo en el que se detect mayor heterogeneidad. El resto de aos fueron ms
homogneos debido al menor nmero de muestras analizadas. En este sentido, los aos 2007
y 2008 son poco representativos ya que slo incluyen muestras de alimentos/manipuladores
de alimentos por lo que no se han incluido en la grfica. Aunque la representacin est
sesgada debido al diferente nmero de aislamientos recogidos cada ao, y las frecuencias de
los distintos linajes son diferentes dependiendo de la poblacin, se observa una evolucin
temporal comn. Centrndonos en el periodo 2001-2006 se observa como los linajes CC5,
CC30 y CC45, que se incluyen entre los ms frecuentes en aislamientos clnicos (Feil et al.,
2003; Gomes et al., 2006), se han mantenido en porcentajes altos, destacando el hecho de que
todos ellos fueron frecuentes en las distintas poblaciones analizadas en el PA (Figura 13 A.).
Respecto a la distribucin del CC8, en la grfica se aprecia que fue inicialmente muy
frecuente entre 1996-1998, y aunque se mantuvo durante 2001-2003, en los ltimos aos casi
ha desaparecido. CC15, que se corresponde con uno de los linajes MSSA ms ampliamente
distribuidos a nivel mundial (Deurenberg y Stobberingh, 2008), se ha mantenido desde 1997,
al igual que CC5, CC30 y CC45. La proporcin de aislamientos de los dems linajes fue

168

4. Discusin

inferior, pero algunos permanecieron durante largos periodos (CC1, CC25, CC59, CC72,
CC121), mientras que otros se detectaron de forma espordica (CC88, CC97).
A.
HMN (N=62)

HUCA (N=81)
CC88

CC121 CC1

CC59

CC72

CC121

CC72

CC59

CC45
CC5

CC45

CC30
CC30

CC5

CC25
CC15

CC25
CC15

CC8

CC12

ALM (N=64)

PS (N=111)
CC97
CC59

CC8

CC121

CC1

CC121

CC72

CC59

CC1

CC5

CC5

CC45
CC8
CC9

CC8

CC45

CC15

CC15

CC22

CC30

CC25

CC25

CC30

B.
100

CC121

90

CC97
CC88

80

CC72
70

CC59

60

CC45
CC30

50

CC25

40

CC22

30

CC15
CC12

20

CC9

2006

2005

2004

2003

2002

2001

2000

1999

CC5
1998

0
1997

CC8
1996

10

CC1

Figura 13. Distribucin en complejos clonales de los aislamientos encontrados en el


Principado de Asturias. A. Distribucin por porcentajes de los complejos clonales (CCs, en
distintos colores) en las distintas poblaciones. HUCA, aislamientos procedentes del Hospital
Universitario Central de Asturias; HMN, aislamientos procedentes del Hospital Monte Naranco; PS,
aislamientos procedentes de portadores sanos; ALM, aislamientos procedentes de alimentos y
manipuladores de alimentos; N, nmero de aislamientos. B. Distribucin de los CCs encontrados en el
PA en relacin al periodo de estudio. Distribucin por porcentajes, incluyendo todos los aislamientos
de las distintas poblaciones (HUCA, HMN, ALM, PS).
169

4. Discusin

Por ltimo, la poblacin procedente de muestras animales recogidas en Alemania fue


ms homognea que las procedentes del PA, ya que los aislamientos fueron inicialmente
seleccionados en base a resistencia a meticilina, tipo de SCCmec y tipo spa para incluir la
mayor diversidad posible dentro del clon ST398. A pesar de ello, adems de CC398, se
detectaron aislamientos de los linajes CC5, CC9 y CC30, que tambin se han descrito en
ganadera porcina (Armand-Lefevre et al., 2005).

4. 2. Objetivo 2. Identificar determinantes de virulencia en los linajes


encontrados en el Principado de Asturias y en el clon ST398, y establecer su
relacin con elementos genticos mviles.
S. aureus es causante de una gran variedad de patologas, siendo algunas de ellas
causa directa de la secrecin por parte de este patgeno de una o mltiples toxinas, en cuya
dispersin pueden intervenir elementos genticos mviles. Para completar el estudio
epidemiolgico de las distintas poblaciones analizadas en esta Tesis Doctoral, en todas ellas
se determin el tipo del sistema de regulacin agr as como la presencia/ausencia de genes de
virulencia y de marcadores de elementos genticos mviles (Anexos II).

4.2.1. Determinantes de virulencia en las poblaciones de Staphylococcus de distinto


origen y su relacin con elementos genticos
Se investig la presencia de genes de virulencia en todos los aislamientos de
hospitales, alimentos, manipuladores de alimentos y animales, as como en los aislamientos
de portadores sanos recogidos en el periodo 2004-2006. Estudios previos con aislamientos de
S. aureus procedentes de portadores sanos, alimentos, manipuladores de alimentos y
asociados con mastitis bovina en el PA haban demostrado la capacidad toxigenica de los
mismos (Fueyo et al., 2001; Fueyo et al., 2005a; Fueyo et al., 2005b; Fueyo et al., 2005c). En
estos estudios se encontraron porcentajes del 31,2%, 26% y 14,3% de aislamientos
procedentes de muestras humanas, bovinas y de alimentos, respectivamente, que producan
una o ms SEs clsicas y/o TSST. Los aislamientos contenan de 0 a 9 genes de SAgs y entre
0 y 2 genes de leucotoxinas, destacando la elevada presencia del egc1 y egc2 en los tres tipos
de muestras y la distribucin desigual de lukED y lukM en aislamientos humanos (39,7% y
0%, respectivamente) y bovinos (98,8% y 50%, respectivamente). En esta Tesis, se determin
la presencia de 32 factores de virulencia, incluyendo 5 hemolisinas (hla, hlb, hld, hlg, hlgvariante), 3 exfoliatinas (eta, etb, etd), 3 leucotoxinas (lukED, lukPV, lukM), la toxina del
sndrome del shock txico (tst) y 20 enterotoxinas estafiloccicas (sea, seb, sec, sed, see, seg,
seh, sei, selj, selk, sell, selm, seln, selo, selp, selq, ser, ses, set, selu). Los resultados se
resumen en las Tabla 8 y en la Figura 14. Adems de factores de virulencia, tambin se
investig la presencia de tres marcadores de islas de patogenicidad (ear, splF, bsaB) (Anexo
II) que junto con los datos de presencia/ausencia de determinados genes de virulencia
sugieren, en algunos casos, la presencia de elementos genticos mviles ya descritos (Tabla
9).
170

4. Discusin

Tabla 8. Distribucin de determinantes de virulencia en distintas poblaciones y complejos


clonales.
Gen
Poblacin [n (%)]a
CC [n (%)]b
hla

HUCA [81 (100)]; HMN [62 (100)];


PS [42 (97,7)]; ALM [50 (78,1)];
AN [109 (100)]

hlb

HUCA [79 (97,5)]; HMN [41 (66,1)];


PS [32 (74,4)]; ALM [27 (42,2)];
AN [108 (99,1)]

hld

HUCA [80 (98,8)]; HMN [62 (100)];


PS [43 (100)]; ALM [61 (95,3)];
AN [109 (100)]

hlg

HUCA [78 (96,3)]; HMN [22 (35,5)];


PS [39 (90,7)]; ALM [47 (73.4)];
AN [104 (95,4)]

hlg-v

HUCA [81 (100)]; HMN [53 (85,5)];


PS [34 (79,1)]; ALM [30 (46,9)];
AN [3 (2,8)]

eta

HUCA [35 (43,2)]; HMN [16 (25,8)];


PS [9 (20,9)]; ALM [2 (3,1)]

etb

HUCA [72 (88,9)]; HMN [3 (4,8)];


PS [6 (14,0)]; ALM [1 (1,6)]

etd

HUCA [14 (17,3)]; HMN [18 (29,0)];


PS [15 (48,8)]; ALM [2 (3,1)]

lukED HUCA [80 (98,8)]; HMN [61 (98,4)];


PS [37 (86,1)]; ALM [50 (78,1)];
AN [1 (0,9)]
lukPV HUCA [21 (25,9)]; HMN [17 (27,4)];
PS [1 (2,3)]
lukM
tst

AN [1 (0,9)]
HUCA [42 (51,9)]; HMN [18 (29,0)];
PS [20 (46,5)]; ALM [12 (18,8)]

CC1 [4 (100)]; CC5 [89 (100)]; CC8 [14 (93,3)];


CC9 [6 (100)]; CC12 [3 (100)]; CC15 [15 (100)];
CC22 [2 (100)]; CC25 [10 (100)]; CC30 [36 (81,8)];
CC45 [41 (87,2)]; CC59 [8 (100)]; CC72 [4 (100)];
CC88 [3 (100)]; CC121 [4 (100)]; CC398 [105 (100)]
CC1 [3 (75,0)]; CC5 [79 (88,8)]; CC8 [11 (73,3)];
CC9 [6 (100)]; CC12 [3 (100)]; CC15 [6 (40,0)];
CC22 [2 (100)]; CC25 [8 (80,0)]; CC30 [31 (70,5)];
CC45 [15 (31,9)]; CC59 [8 (100)]; CC72 [3 (75,0)];
CC88 [3 (100)]; CC121 [3 (75,0)]; CC398 [105 (100)]
CC1 [4 (100)]; CC5 [89 (100)]; CC8 [14 (93,3)];
CC9 [6 (100)]; CC12 [3 (100)]; CC15 [15 (100)];
CC22 [2 (100)]; CC25 [10 (100)]; CC30 [42 (95,5)];
CC45 [46 (97,9)]; CC59 [8 (100)]; CC72 [4 (100)];
CC88 [3 (100)]; CC121 [4 (100)]; CC398 [105 (100)]
CC1 [3 (75,0)];CC5 [60 (67,4)]; CC8 [3 (20,0)];
CC9 [4 (66,7)]; CC12 [3 (100)]; CC15 [9 (60,0)];
CC22 [2 (100)]; CC25 [6 (60,0)]; CC30 [42 (95,5)];
CC45 [45 (95,7)]; CC59 [7 (87,5)]; CC72 [1 (25,0)];
CC88 [2 (66,7)]; CC121 [2 (50,0)]; CC398 [103 (98,1)]
CC1 [4 (100)]; CC5 [87 (97,8)]; CC8 [14 (93,3)];
CC9 [6 (100)]; CC12 [3 (100)]; CC15 [15 (100)];
CC22 [2 (100)]; CC25 [10 (100)]; CC30 [24 (54,5)];
CC45 [17 (36,2)]; CC59 [8 (100)]; CC72 [4 (100)];
CC88 [3 (100)]; CC121 [4 (100)]
CC1 [2 (50,0)]; CC5 [23 (25,8)]; CC8 [3 (20,0)];
CC9 [3 (50,0)]; CC12 [2 (66,7)]; CC25 [2 (20,0)];
CC15 [3 (20,0)]; CC30 [10 (22,7)]; CC45 [9 (19,1)];
CC72 [1 (25,0)]; CC88 [2 (66,7)]; CC121 [2 (50,0)]
CC1 [1 (25,0)]; CC5 [43 (48,3)]; CC8 [1 (6,7)];
CC12 [3 (100)]; CC15 [4 (26,7)]; CC25 [4 (40,0)];
CC30 [13 (29,5)]; CC45 [8 (17,0)]; CC59 [1 (12,5)];
CC72 [1 (25,0)]; CC88 [2 (66,7)]; CC121 [1 (25,0)]
CC1 [2 (50,0)]; CC5 [17 (19,1)]; CC8 [4 (26,7)];
CC15 [1 (6,7)]; CC25 [10 (100)];CC30 [4 (9,1)];
CC45 [8 (17,0)]; CC72 [1 (25,0)]; CC88 [1 (33,3)];
CC121 [1 (25,0)]
CC1 [2 (50,0)]; CC5 [85 (95,5)]; CC8 [15 (100)];
CC9 [4 (66,7)]; CC12 [2 (66,7)]; CC15 [14 (93,3)];
CC22 [2 (100)]; CC25 [10 (100)]; CC30 [38 (86,4)];
CC45 [45 (95,7)]; CC59 [3 (37,5)]; CC72 [3 (75,0)];
CC88 [3 (100)]; CC121 [3 (75,0)]
CC1 [1 (25,0)]; CC5 [19 (21,3)]; CC8 [5 (33,3)];
CC12 [1 (33,3)]; CC15 [2 (13,3)]; CC30 [6 (13,6)];
CC45 [2 (4,3)]; CC88 [2 (66,7)]; CC121 [1 (25,0)]
CC30 [1 (2,3)]
CC1 [1 (25,0)]; CC5 [25 (28,1)]; CC8 [1 (6,7)];
CC9 [2 (33,3)]; CC12 [3 (100)]; CC15 [3 (20,0)];
CC25 [1 (10,0)]; CC30 [37 (84,1)]; CC45 [12 (25,5)];
CC59 [1 (12,5)]; CC88 [3 (100)]; CC121 [3 (75,0)]

171

4. Discusin

Tabla 8 (continuacin). Distribucin de determinantes de virulencia en distintas poblaciones


y complejos clonales.
Gen
Poblacin [n (%)]a
CC [n (%)]b
sea

seb
sec

sed

see
egc1

egc2

seh
selj

selk
sell
selp
selq
ser

172

HUCA [45 (72,6)]; HMN [42 (67,7)]; CC1 [2 (50,0)]; CC5 [48 (53,9)]; CC8 [13 (86,7)];
PS [33 (76,7)]; ALM [27 (42,2)]
CC9 [4 (66,7)]; CC12 [3 (100)]; CC15 [8 (53,3)];
CC25 [3 (30,0)]; CC30 [33 (75,0)]; CC45 [18 (38,3)];
CC59 [8 (100)]; CC72 [2 (50,0)]; CC88 [2 (66,7)];
CC121 [1 (25,0)]
HUCA [22 (27,2)]; HMN [16 (25,8)]; CC1 [1 (25,0)]; CC5 [19 (21,3)]; CC8 [3 (20,0)];
PS [10 (23,3)]; ALM [8 (12,5)]
CC15 [6 (40,0)]; CC25 [5 (50,0)]; CC30 [5 (11,4)];
CC45 [7 (14,9)]; CC59 [7 (87,5)]; CC72 [2 (50,0)]
HUCA [65 (80,2)]; HMN [42 (67,7)]; CC1 [2 (50,0)]; CC5 [55 (61,8)]; CC8 [6 (40,0)];
PS [18 (41,9)]; ALM [29 (45,3)]
CC9 [1 (16,7)]; CC12 [3 (100)]; CC15 [9 (60,0)];
CC22 [2 (100)]; CC25 [5 (50,0)];CC30 [17 (38,6)];
CC45 [39 (83,0)]; CC59 [7 (87,5)]; CC72 [3 (75,0)];
CC88 [3 (100)]; CC121 [3 (75,0)]
HUCA [20 (24,7)]; HMN [10 (16,1)]; CC1 [2 (50,0)]; CC5 [24 (27,0)]; CC8 [4 (26,7)];
PS [11 (25,6)]; ALM [7 (10,9)]
CC9 [1 (16,7)]; CC15 [1 (6,7)]; CC25 [3 (30,0)];
CC30 [4 (9,1)]; CC45 [5 (10,6)]; CC59 [2 (25,0)];
CC72 [1 (25,0)]; CC121 [1 (25,0)]
HMN [4 (6,5)]
CC5 [3 (3,4)]; CC15 [1 (6,7)]
HUCA [57 (70,4)]; HMN [45 (72,6)]; CC1 [1 (25,0)]; CC5 [65 (73,0)]; CC8 [12 (80,0)];
PS [15 (34,9)]; ALM [28 (43,8)];
CC9 [3 (50,0)]; CC12 [2 (66,7)]; CC15 [8 (53,3)];
AN [3 (2,8)]
CC22 [2 (100)]; CC25 [7 (70,0)]; CC30 [6 (13,6)];
CC45 [34 (72,4)]; CC59 [2 (25,0)]; CC72 [3 (75,0)];
CC88 [2 (66,7)]
HUCA [24 (29,6)]; HMN [17 (27,4)]; CC1 [1 (25,0)]; CC5 [20 (22,5)]; CC8 [2 (13,3)];
PS [23 (53,5)]; ALM [27 (42,2)];
CC9 [3 (50,0)]; CC12 [1 (33,3)]; CC15 [2 (13,3)];
AN [1 (0,9)]
CC25 [3 (30,0)]; CC30 [36 (81,8)]; CC45 [13 (27,7)];
CC59 [6 (75,0)]; CC72 [1 (25,0)]; CC88 [1 (33,3)];
CC121 [4 (100)]
HUCA [10 (12,3)]; HMN [2 (3,2)];
CC1 [2 (50,0)]; CC5 [7 (7,9)]; CC9 [2 (33,3)];
PS [12 (27,9)]; ALM [3 (4,7)]
CC12 [1 (33,3)]; CC15 [2 (13,3)]; CC25 [1 (10,0)];
CC30 [9 (20,5)]; CC45 [3 (6,4)]
HUCA [19 (23,5)]; HMN [11 (17,7)]; CC1 [2 (50,0)]; CC5 [25 (28,1)]; CC8 [4 (26,7)];
PS [11 (25,6)]; ALM [7 (10,9)]
CC9 [1 (16,7)]; CC15 [1 (6,7)]; CC25 [3 (30,0)];
CC30 [3 (6,8)]; CC45 [5 (10,6)]; CC59 [2 (25,0)];
CC72 [1 (25,0)]; CC121 [1 (25,0)]
HUCA [2 (2,5)]; HMN [7 (11,3)];
CC1 [1 (25,0)]; CC5 [2 (2,2)]; CC8 [4 (26,7)];
PS [4 (9,3)]; ALM [6 (9,4)];
CC9 [1 (16,7)]; CC30 [2 (4,5)]; CC45 [1 (2,1)];
CC59 [8 (100)]
HUCA [2 (2,5)]; HMN [6 (9,7)];
CC5 [2 (2,2)]; CC9 [1 (16,7)]; CC25 [1 (10,0)];
PS [7 (16,3)]; ALM [22 (34,4)]
CC45 [31 (66,0)]; CC59 [1 (12,5)]; CC72 [1 (25,0)]
HUCA [20 (24,7)]; HMN [6 (9,7)];
CC5 [30 (33,7)]; CC8 [1 (6,7)]; CC25 [1 (10,0)];
PS [7 (16,3)]; ALM [3 (4,7)]
CC45 [2 (4,3)]; CC59[1 (12,5)]; CC72 [1 (25,0)]
HUCA [3 (3,7)]; HMN [7 (11,3)];
CC1 [1 (25,0)]; CC5 [3 (3,4)]; CC8 [4 (26,7)];
PS [4 (9,3)]; ALM [6 (9,4)]
CC9 [1 (16,7)]; CC30 [2 (4,5)]; CC45 [1 (2,1)];
CC59 [8 (100)]
HUCA [15 (18,5)]; HMN [10 (16,1)]; CC1 [2 (50,0)]; CC5 [20 (22,5)]; CC8 [3 (20,0)];
PS [11 (25,6)]; ALM [5 (7,8)]
CC9 [1 (16,7)]; CC15 [1 (6,7)]; CC25 [3 (30,0)];
CC30 [4 (9,1)]; CC45 [5 (10,6)]; CC59 [1 (12,5)];
CC121 [1 (25,0)]

4. Discusin

Tabla 8 (continuacin). Distribucin de determinantes de virulencia en distintas poblaciones


y complejos clonales.
Gen
Poblacin [n (%)]a
CC [n (%)]b
ses
set
ear

splF

bsaB

HMN [1 (1,6)]
HMN [1 (1,6)]
HUCA [41 (50,6)]; HMN [39 (62,9)];
PS [9 (20,9)]; ALM [36 (56.3)]

CC5 [1 (1,1)]
CC5 [1 (1,1)]
CC5 [42 (47,2)]; CC8 [11 (73,3)]; CC12 [1 (33,3)];
CC15 [8 (53,3)]; CC22 [2 (100)]; CC25 [5 (50,0)];
CC30 [5 (11,4)]; CC45 [36 (76,7)]; CC59 [7 (87,5)];
CC72 [2 (50,0)]; CC88 [2 (66,7)]; CC121 [1 (25,0)]
HUCA [53 (65,4)]; HMN [45 (72,6)]; CC1 [3 (75,0)]; CC5 [64 (71,9)]; CC8 [13 (86,7)];
PS [15 (34,9)]; ALM [20 (31,3)]
CC12 [3 (100)]; CC15 [11 (73,3)]; CC25 [6 (60,0)];
AN [2 (1,8)]
CC30 [22 (50,0)]; CC45 [6 (12,8)]; CC72 [2 (50,0)];
CC88 [2 (66,7)]; CC121 [3 (75,0)]
HUCA [17 (21,0)]; HMN [23 (37,1)]; CC1 [2 (50,0)]; CC5 [14 (15,7)]; CC8 [12 (80,0)];
PS [3 (7,0)]; ALM [6 (9,4)]
CC12 [2 (66,7)]; CC15 [2 (13,3)]; CC25 [7 (70,0)];
CC30 [1 (2,3)]; CC45 [6 (12,8)]; CC59 [2 (25,0)];
CC121 [1 (25,0)]

Porcentajes respecto al nmero total de aislamientos de cada poblacin (HUCA: 81; HMN: 62; ALM:
64; PS: 43; AN: 109). HUCA, aislamientos procedentes del Hospital Universitario Central de
Asturias; HMN, aislamientos procedentes del Hospital Monte Naranco; PS, aislamientos procedentes
de portadores sanos; ALM, aislamientos procedentes de alimentos y manipuladores de alimentos; AN,
aislamientos procedentes de animales. bPorcentajes respecto al nmero total de aislamientos de cada
linaje (CC1: 4; CC5: 89; CC8: 15; CC9: 6; CC12: 3; CC15: 15; CC22: 2; CC25: 10; CC30: 44; CC45:
47; CC59: 8; CC72: 4; CC88: 3; CC121: 4; CC398: 105). Los porcentajes superiores al 30% se
muestran en negrilla.

Los genes de hemolisinas se encuentran en regiones estables del cromosoma de S.


aureus (Kaneco y Kamio, 2004), por lo que estn ampliamente distribuidos en todos los
aislamientos, independientemente del origen o linaje (Tabla 8, Figura 14). Destaca el hecho
de que estos genes aparecen incluso en el poco toxignico CC398, lo que muestra su
dispersin dentro de la especie.
El resto de genes codificantes de toxinas, exceptuando aquellos ligados a la isla
genmica Sa, se encontraron en proporcin menor que los genes de hemolisinas en los
distintos linajes (Figura 14). Muchos de los genes detectados en los CCs representados en
nuestras poblaciones, ya haban sido descritos en esos mismos por otros autores (Monk et al.,
2004; Cha et al., 2006; Holtfreter et al., 2007; Tristan et al., 2007; Larsen et al., 2008;
Lindsay et al., 2008; Sola et al., 2008; Ellington et al., 2009; Ghebremedhin et al., 2009;
Goerke et al., 2009; Kadlec et al., 2009; Monecke et al., 2009; Varshney et al., 2009;
Ellington et al., 2010; Ghasemzadeh-Moghaddam et al., 2011; Hisata et al., 2011; Lozano et
al., 2011b; Yeung et al., 2011), destacando el hecho de que la presencia/ausencia y las
proporciones de las distintas toxinas dependen del origen geogrfico de la poblacin en
estudio, as como de si su origen es nosocomial o comunitario. Adems, en nuestro trabajo se
han encontrado nuevas relaciones entre toxinas y linajes, sobre todo en cuanto a los genes de
exfoliatinas y a la distribucin de toxinas en general en linajes minoritarios. En ambos casos,
los nuevos datos aportados en este trabajo probablemente se deben a la escasez de estudios al
respecto.
173

174

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC5

CC1

100

sed

50

0
seb
sec

100

100

50

50

HUCA

HMN

PS

ALM

AN

CC88
CC121
CC398

CC88

CC121

CC398

CC72

CC72

0
CC59

50

CC59

tst

CC45

50
CC88
CC121
CC398

CC398

CC72

CC72
CC121

sea

CC88

CC59

CC59

CC30
CC45

lukPV

CC45

CC30

CC25

CC22

etb

CC45

100
CC15

CC398

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC12

CC398

CC121

eta

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC12

hlgv

CC30

100
CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC5

hla

CC30

0
CC25

lukED

CC25

0
CC9

hld

CC25

50

CC22

50

CC22

100

CC22

100
CC12

CC15

CC15

50

CC12

50

CC15

100
100

CC12

CC9

CC12

50

CC9

50

CC9

100

CC8

100

CC9

CC8

CC9

50

CC8

50

CC8

100

CC8

100

CC8

CC1

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC5

CC1

CC5

CC1

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC5

CC1

CC5

CC1

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC5

CC1

50

CC5

CC1

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC5

CC1

50

CC5

CC1

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC5

CC1

100

CC5

CC1

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC5

CC1

100

CC5

CC1

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC5

CC1

4. Discusin
hlb

hlg

etd

4. Discusin
see

selq

bsaB

CC398

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC121

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC59

CC72

CC88

CC121

CC59

CC72

CC88

CC121

CC398

CC45

CC45

CC30

CC398

CC30

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC5

CC1

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

0
CC22

50

CC15

50

CC12

100

CC9

100

CC25

splF

ear

CC8

CC25

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC1

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

0
CC12

0
CC9

50

CC8

50

CC5

100

CC5

ser

100

CC1

CC30

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC5

CC1

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

0
CC15

0
CC12

50

CC9

50

CC8

100

CC5

100

CC25

selp

sell

CC5

CC30

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC5

CC1

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC12

0
CC9

0
CC8

50

CC5

50

CC1

100

CC25

selk

selj

100

CC1

CC30

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC5

CC1

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC12

0
CC9

0
CC8

50

CC5

50

CC1

100

CC25

seh

egc2

100

CC1

CC25

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC1

CC398

CC88

CC121

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC9

0
CC12

0
CC8

50

CC5

50

CC1

100

CC5

egc1

100

HUCA

100

HMN
PS

50

ALM

CC398

CC121

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC5

CC1

AN

Figura 14. Distribucin de determinantes de virulencia dependiendo del linaje y la


poblacin en estudio. La distribucin se basa en los porcentajes de aislamientos resistentes respecto
al total de aislamientos dentro de cada linaje (CC1: 4; CC5: 89; CC8: 15; CC9: 6; CC12: 3; CC15: 15;
CC22: 2; CC25: 10; CC30: 44; CC45: 47; CC59: 8; CC72: 4; CC88: 3; CC121: 4; CC398: 105). Los
colores representan las distintas poblaciones en estudio: HUCA, aislamientos procedentes del Hospital
Universitario Central de Asturias; HMN, aislamientos procedentes del Hospital Monte Naranco; PS,
aislamientos procedentes de portadores sanos; ALM, aislamientos procedentes de alimentos y
manipuladores de alimentos; AN, aislamientos procedentes de animales.

175

4. Discusin

El gen lukM de la leucotoxina LukM/LukF-PV, asociada a mastitis en bvidos (Fueyo


et al., 2005c), se encontr slo en un aislamiento de procedencia animal (Tabla 8). Los
aislamientos positivos para la leucotoxina codificada por lukPV, de importancia mdica
debido a su asociacin con CA-MRSA (Patel, 2009), fueron generalmente de origen
nosocomial, aunque un aislamiento de un portador sano fue positivo para al misma (Tabla 8,
Figura 14). Los aislamientos lukPV pertenecieron a los linajes CC1, CC5, CC8, CC12,
CC15, CC45, CC88 y CC121 asociados previamente con esta leucotoxina o con profagos del
tipo Sa2 que portan los genes que la codifican (Monk et al., 2004; Tristan et al., 2007;
Ghebremedhin et al., 2009; Goerke et al., 2009). El gen lukPV se encontr tanto en MSSA
como MRSA, incluyendo estos ltimos aislamientos de los clones ST5 (un aislamiento del
HUCA y tres del HMN), ST125 (6 aislamientos del HUCA), ST228 (un aislamiento del
HMN) y ST239 (un aislamiento del HMN). Aunque lukPV, junto a los SCCmec IV, V y VII,
se han utilizado como marcadores de CA-MRSA, en los ltimos aos la presencia de estos
elementos en HA-MRSA ha complicado la distincin entre uno y otro tipo de MRSA
(Deurenberg y Stobberingh, 2009), mostrando lo interrelacionados que estn los ambientes
comunitario y hospitalario.
El gen lukED y los clusters egc1 y egc2 fueron muy frecuentes, debido probablemente
a su asociacin con diferentes tipos de la isla genmica Sa (Baba et al., 2008). Sin
embargo, la utilizacin de stos y otros marcadores de Sa, en concreto splF y bsaB, no
siempre permiti identificar el tipo de Sa (Tabla 9). En algunos aislamientos varias
opciones son posibles mientras que en otros la presencia de genes no concuerda con ninguna
de las tres organizaciones descritas. Este fenmeno puede deberse a deleciones,
recombinacin, e incluso a la existencia de nuevas variantes, que posiblemente se irn
descubriendo a medida que se secuencien ms genomas de S. aureus. Los distintos tipos de
Sa se encontraron en distintos linajes a diferentes frecuencias (Tabla 9), destacando el
predomino de Sa I en linajes con mayor proporcin de egc1 (CC5 y CC15), y de Sa III
en linajes con mayor proporcin de egc2 (CC30 y CC121). De cualquier manera, se
determin la presencia de un mismo tipo de Sa en ms de un linaje, como tambin se ha
visto en genomas secuenciados, lo que segn Baba et al. (2008) indica una posible evolucin
independiente de estas islas. Cabe destacar, adems, que CC398 careci de todos los
marcadores utilizados para la deteccin de Sa en este trabajo y que la secuenciacin del
genoma de un miembro de este linaje demostr la ausencia de esos marcadores y la presencia
en Sa de un opern para la sntesis de hialuronidasa (Schijffelen et al., 2010).
Algunos autores han encontrado diferencias en el contenido de genes de virulencia
entre aislamientos de origen invasivo y nasales, destacando las diferencias en cuanto al
cluster egc, que se ha propuesto que fomenta el estado de portador (Peacock et al., 2002; van
Belkum et al., 2006; Nashev et al., 2007). En nuestro caso, aunque si ha habido diferencias
respecto al potencial toxignico entre aislamientos nosocomiales y de origen nasal y/o
alimentario (Artculos 5 y 7), e incluso entre aislamientos nosocomiales de los dos hospitales
(Artculos 1 y 3), los genes de exotoxinas localizados en egc1 o egc2 se encontraron

176

4. Discusin

ampliamente distribuidos en todas las poblaciones. En esta lnea, otros autores no han
encontrado diferencias respecto al cluster egc entre aislamientos de origen invasivo y nasal,
pero si en cuanto a genes de otras toxinas (Becker et al., 2003). Las diferencias entre estudios
ponen de manifiesto nuevamente la importancia del origen geogrfico de los aislamientos, no
slo en la distribucin de linajes sino tambin de factores de virulencia.
Tabla 9. Distribucin de elementos genticos mviles en distintas poblaciones y complejos clonales
de Staphylococcus aureus estudiados en esta Tesis doctoral.
EGMa
Poblacin [n (%)]b
CC [n (%)]c
Sa3d
Sa Id
Sa IId
Sa IIId
SaPI1d
SaPI3d
SaPI5 d
SaPImw2 d
SaPIn1/SaPIm1d
pIB485

pUO-Sa-SED3
pF5

HUCA [2 (2,5)]; HMN [7 (11,3)];


PS [3 (7,0)]; ALM [5 (7,8)]

CC1 [1 (25,0)]; CC5 [1 (1,1)]; CC8 [3 (20,0)];


CC9 [1 (16,7)]; CC30 [2 (4,5)]; CC45 [1 (2,1)];
CC59 [8 (100)]
HUCA [40 (49,4)]; HMN [35 (56,5)]; CC5 [52 (58,4)]; CC8 [12 (80,0)]; CC12 [2 (66,7)];
PS [5 (11,6)]; ALM [9 (14,1)];
CC15 [7 (46,7)]; CC25 [5 (50,0)]; CC30 [5 (11,4)];
AN [1 (0,9)]
CC45 [6 (12,8)], CC88 [1 (33,3)]
HUCA [9 (11,1)]; HMN [17 (27,4)]; CC1 [1 (25,0)]; CC5 [6 (6,7)]; CC8 [11 (73,3)];
PS [1 (2,3)]; ALM [2 (3,1)]
CC12 [1 (33,3)]; CC15 [1 (6,7)]; CC25 [5 (50,0)];
CC30 [1 (2,3)]; CC45 [3 (10,6)]; CC121 [1 (25,0)]
HUCA [13 (16,0)]; HMN [9 (14,5)]; CC1 [1 (25,0)]; CC5 [8 (9,0)]; CC12 [1 (33,3)];
PS [7 (16,3)]; ALM [5 (7,8)];
CC15 [2 (13,3)]; CC25 [1 (10,0)]; CC30 [16 (36,4)];
AN [1 (0,9)]
CC72 [1 (25,0)]; CC88 [1 (33,3)]; CC121 [4 (100)]
PS [2 (4,7)]
CC30 [1 (2,3)]; CC59 [1 (5,6)]
HMN [3 (4,8)]; PS [2 (4,7)];
CC5 [1 (1,1)]; CC8 [1 (6,7)]; CC30 [1 (2,3)];
ALM [5 (7,8)]
CC45 [1 (2,1)]; CC59 [6 (75,0)]
HMN [3 (4,8)]; PS [3 (7,0)];
CC5 [1 (1,1)]; CC8 [3 (20,0)]; CC59 [7 (87,5)]
ALM [6 (9,4)]
HUCA [2 (2,5)]; HMN [6 (9,7)];
CC25 [1 (10,0)]; CC45 [31 (66,0)]; CC59 [1 (12,5)];
PS [4 (9,3)]; ALM [22 (34,4)]
CC72 [1 (25,0)]
HUCA [1 (1,2)]; HMN [3 (4,8)];
CC45 [4 (8,5)]; CC59 [1 (5,6)]
PS [1 (2,3)]
HUCA [14 (17,3)]; HMN [9 (14,5)]; CC1 [2 (50,0)]; CC5 [19 (21,4)]; CC8 [3 (20,0)];
PS [11 (25,6)]; ALM [5 (7,8)]
CC9 [1 (16,7)]; CC15 [1 (6,7)]; CC25 [3 (30,0)];
CC30 [3 (6,8)]; CC45 [5 (10,6)]; CC59 [1 (12,5)];
CC121 [1 (25,0)]
HUCA [5 (6,2)]; HMN [1 (1,6)];
CC5 [5 (5,6)]; CC8 [1 (6,7)]; CC59 [1 (5,6)];
ALM [2 (3,1)]
CC72 [1 (25,0)]
HMN [1 (1,6)]
CC5 [1 (1,1)]

Cada elemento gentico mvil (EGM) contiene varios determinantes de virulencia: Sa3 (sea-selk-selq), Sa
I (lukED-egc1-splF), Sa II (splF-lukED-bsaB), Sa III (splF-egc2), SaPI1 (ear-tst-selk-selq); SaPI3 (earseb-selk-selq), SaPI5 (ear-selk-selq), SaPImw2 (ear-sec-sell), SaPIn1/SaPIm1 (ear-tst-sec-sell) pIB485 (sedselj-ser), pF5 (selj-ser-ses-set). bPorcentajes respecto al nmero total de aislamientos de cada poblacin (AA:
109; AB: 64; HMN: 62; HUCA: 81; PS: 43). HUCA, aislamientos procedentes del Hospital Universitario
Central de Asturias; HMN, aislamientos procedentes del Hospital Monte Naranco; PS, aislamientos
procedentes de portadores sanos; ALM, aislamientos procedentes de alimentos y manipuladores de alimentos;
AN, aislamientos procedentes de animales. cPorcentajes respecto al nmero total de aislamientos de cada
linaje (CC1: 4; CC5: 90; CC8: 15; CC9: 6; CC12: 3; CC15: 15; CC22: 1; CC25: 10; CC30: 44; CC45: 47;
CC59: 8; CC72: 4; CC88: 3; CC97: 3; CC121: 4; CC398: 105). dEn varios casos distintas combinaciones son
posibles. Los porcentajes superiores al 30% se muestran en negrilla.

Generalmente, los genes de exfoliatinas son infrecuentes en S. aureus (Peacock et al.,


2002; Becker et al., 2003; Monk et al., 2004; Holtfreter et al., 2007; Larsen et al., 2008;
177

4. Discusin

Goerke et al., 2009; Monecke et al., 2009; Ghasemzadeh-Moghaddam et al., 2011; Hisata et
al., 2011; Lozano et al., 2011b). De hecho, en este trabajo su frecuencia fue inferior a la
encontrada para genes de la mayora de las dems toxinas, aunque superior a la descrita por
otros autores (Figura 14). El gen eta estudiado se encuentra asociado a un profago tipo Sa1,
y se ha detectado con baja frecuencia en aislamientos de distintos linajes (Monk et al., 2004;
Goerke et al., 2009; Monecke et al., 2009; Ghasemzadeh-Moghaddam et al., 2011; Hisata et
al., 2011; Lozano et al., 2011b), mientras que el gen etb, localizado en un plsmido, es an
menos frecuente (Becker et al., 2003; Larsen et al., 2008). Sin embargo, este ltimo gen
apareci con elevada frecuencia en aislamientos de distintos linajes del HUCA (Tabla 8,
Artculo 1), probablemente debido a la dispersin del plsmido entre el nmero limitado de
linajes detectados en este hospital. El gen etd, asociado a una SaPI, ha sido menos estudiado
que los anteriores, aunque cabe destacar que en nuestras poblaciones, al igual que en otros
estudios, los aislamientos del linaje CC25 presentan este gen en elevada proporcin
(Holtfreter et al., 2007; Monecke et al., 2009). La mayora de aislamientos de este linaje
portan agrIV, que se ha relacionado con una mayor presencia de genes para la produccin de
exfoliatinas, as como de enfermedades mediadas por este tipo de toxinas, respecto a los otros
tipos de agr (Jarraud et al., 2000; Jarraud et al., 2002).
El gen de la toxina tst, localizado en varios tipos de islas (Apartado 1.3.3.3.) se
encontr en distintos linajes (Tabla 8), destacando su asociacin con el CC30, uno de los
mayoritarios en las poblaciones estudiadas. Estudios previos han determinado que los
aislamientos productores del sndrome del shock txico, y por tanto portadores de tst, suelen
pertenecer a agrIII (Jarraud et al., 2002) y a su vez la mayora de aislamientos agrIII-tst
pertenecen al CC30 (Holtfreter et al., 2007; Monecke et al., 2009). Sin embargo, tst se ha
encontrado tambin en otros linajes con otros tipos de agr (Holtfreter et al., 2007;
Ghebremedhin et al., 2009; Monecke et al., 2009; Varshney et al., 2009; GhasemzadehMoghaddam et al., 2011; Lozano et al., 2011b), destacando el hecho de que en nuestras
poblaciones incluso apareci en linajes minoritarios como CC9, CC12, CC25 y CC88.
La toxina SEA se ha relacionado con la mayora de casos de intoxicacin alimentaria
por S. aureus, ya que tiene una extraordinaria resistencia a la actividad proteoltica y, al ser de
las primeras enterotoxinas descritas en esta bacteria, su presencia ha sido intensivamente
investigada (Artculo 9). El gen sea se localiza en profagos de tipo Sa3, que portan sea o la
combinacin sea-selk-selq (Tabla 9). Este gen fue uno de los ms frecuentes en los
aislamientos analizados, encontrndose en varios linajes ya relacionados previamente con su
presencia (Monk et al., 2004; Cha et al., 2006; Holtfreter et al., 2007; Monecke et al., 2009;
Varshney et al., 2009; Ghasemzadeh-Moghaddam et al., 2011), as como en linajes
minoritarios (CC9, CC72, CC88).
El gen de la toxina SEB (seb), descrito tanto en plsmidos como en SaPIs (Apartado
1.3.3.3.), se encontr en varios linajes (Holtfreter et al., 2007; Tristan et al., 2007; Collery et
al., 2008; Ghebremedhin et al., 2009; Monecke et al., 2009; Ellington et al., 2010;
Ghasemzadeh-Moghaddam et al., 2011), incluido el poco toxignico CC398 (Artculo 12;

178

4. Discusin

Kadlec et al., 2009), apareciendo adems en el linaje minoritario CC72 en esta Tesis
Doctoral. En los aislamientos seb positivos, sin ningn otro gen perteneciente a SaPI3, seb
podra localizarse en plsmidos (Altboum et al., 1985), mientras que la presencia de seb junto
con selk y selq apoya la presencia de SaPI3 (Tabla 9). Entre estos ltimos, destaca la gran
proporcin de aislamientos del linaje CC59, de acuerdo con lo descrito por otros autores
(Monk et al., 2004; Tristan et al., 2007; Ellington et al., 2009; Varshney et al., 2009).
La mayora de los aislamientos selk-selq positivos podran asociarse con un EGM
previamente descrito (Tabla 9), exceptuando un aislamiento CC5 procedente del HUCA que
fue sea-seb-selq positivo. Otros estudios encontraron slo seb-selq y combinaciones
adicionales (Holtfreter et al., 2007; Varshney et al., 2009; Lozano et al., 2011b), lo que indica
la posible participacin de nuevos elementos en la dispersin de estas toxinas.
Con anterioridad al 2009 pocos estudios haban examinado los determinantes de
virulencia en CC398 (Huijsdens et al., 2006, Monecke et al., 2007; Witte et al., 2007). Los
datos aqu presentados, as como en otros trabajos recientes (Kadlec et al., 2009; Lozano et
al., 2011b; Lozano et al., 2011c) han mostrado que los aislamientos de este clon de origen
animal carecen generalmente de factores de virulencia distintos a hemolisinas. Sin embargo,
dos aislamientos de los Pases Bajos examinados en esta Tesis poseen la enterotoxina seb, y a
su vez otros aislamientos de Alemania presentaron las toxinas seb o selk y selq (Kadlec et al.,
2009). Estos datos, juntos a la adquisicin de otras toxinas como sec y ser por aislamientos
CC398 de origen humano (Varshney et al., 2009; Yeung et al., 2011), y de lukPV por
aislamientos de origen humano y animal (Yu et al., 2008, van Belkum et al., 2008), ponen de
manifiesto la capacidad de este clon emergente, al principio poco toxignico, de ir
acumulando factores de virulencia anteriormente ausentes en el linaje.
El gen sec se ha descrito co-localizado con otros genes de toxinas en SaPImw2 (secsell junto con ear) y SaPIn1/SaPIm1 (tst-sec-sell junto con ear). Este gen se ha encontrado en
todas las poblaciones analizadas del PA y en todos los linajes, lo que muestra su elevada
dispersin en esta regin geogrfica. Un estudio reciente ha determinado que sec tiende a ser
ms frecuente en aislamientos causantes de infecciones graves (incluyendo sepsis severa,
shock sptico, fallo multiorgnico o TSS) que en infecciones menos complicadas (sepsis no
severa) (Nhan et al., 2011). Se ha descrito anteriormente en varios linajes (Ellington et al.,
2009; Monecke et al., 2009; Varshney et al., 2009; Ellington et al., 2010; GhasemzadehMoghaddam et al., 2011), incluyndose ahora tambin en otros minoritarios (CC9, CC72 y
CC88). Un hecho que muestra la capacidad de dispersin de este tipo de genes es la reciente
descripcin de una isla de patogenicidad en S. epidermidis (SePI) que contiene sec y sell
(Madhusoodanan et al., 2011). En esta Tesis, se ha podido identificar la posible isla portadora
de sec en algunos linajes, destacando la presencia de SaPImw2 en CC45 (Tabla 9). Otros
autores tambin haban detectado un alto porcentaje de aislamientos sec-sell en CC45
(Holtfreter et al., 2007). Sin embargo, en varios aislamientos sec positivos no se ha podido
encontrar el gen sell, el cual ha sido menos investigado que sec en S. aureus. Trabajos previos
de nuestro grupo (Martn et al., 2004; Fueyo et al., 2005b), as como de otros autores

179

4. Discusin

(Varshney et al., 2009), ya haban descrito aislamientos sec positivos sin sell, e incluso sell
positivos sin sec, lo cual puede indicar la presencia de nuevos EGM sin sell o sec, o la
existencia de nuevas variantes allicas en estos genes. De hecho, para sec ya se han descrito
al menos cinco variantes (Apartado 1.3.3.3.).
El gen see se ha encontrado en muy baja frecuencia en S. aureus, aunque la toxina
SEE ha sido responsable de algunos brotes de intoxicacin alimentaria (Artculo 9). El gen
see, posiblemente situado en un profago (Couch et al., 1988), no fue encontrado en
aislamientos procedentes de portadores sanos, alimentos/manipuladores, ni asociados con
mastitis bovina en el PA (Artculos 5 y 7; Fueyo et al., 2001; Fueyo et al., 2005a; Fueyo et
al., 2005b; Fueyo et al., 2005c), pero s en cuatro aislamientos del HMN procedentes de
herida quirrgica (Artculo 3).
La toxina SEH se detect en varios casos de intoxicacin alimentaria (Artculo 9) y,
en esta Tesis, el gen que la codifica se encontr en varios linajes, adems de CC1, CC5 y
CC30 donde ya se haba descrito (Cha et al., 2006; Monecke et al., 2009; Varshney et al.,
2009; Lozano et al., 2011b).
De la misma manera, el gen selp, asociado a profagos Sa3, se encontr en linajes
donde haba sido descrito previamente (Holtfreter et al., 2007; Varshney et al., 2009; Lozano
et al., 2011b), as como en el minoritario CC72. En cuanto a la distribucin de este gen,
destaca su asociacin con CC5, que incluy aislamientos positivos de todas las poblaciones
estudiadas (Figura 14).
Los genes sed, selj y ser asociados a plsmidos tipo pIB485 se han encontrado
anteriormente en los linajes CC1, CC5, CC8, CC15, CC30, CC45, CC59 (Holtfreter et al.,
2007; Varshney et al., 2009; Lozano et al., 2011b), incluyendo este estudio su descripcin en
los linajes minoritarios CC9, CC25, CC72 y CC121. Aunque los porcentajes de aislamientos
positivos dentro de cada linaje son bajos (Tabla 9), cabe destacar el hecho de que adems de
la combinacin prototipo de pIB485 (sed-selj-ser), se encontraron otras combinaciones como
las correspondientes al plsmido pUO-Sa-SED3 (sed-selj) y pF5 (selj-ser-ses-set) (Tabla 9;
Fueyo et al., 2005a; Ono et al., 2008).

4.2.2. Distribucin de tipos del sistema de regulacin agr en las poblaciones de


Staphylococcus aureus de distinto origen
El sistema regulador agr modula la expresin de genes de virulencia en S. aureus
(apartado 1.3.5.). Generalmente, la mayora de los linajes estn relacionados con una de las
cuatro variantes del sistema (agrI, agrII, agrIII y agrIV), aunque existen fenmenos de
recombinacin de tipos agr entre linajes (apartado 1.5.1.). En las poblaciones analizadas la
mayor parte de los linajes se asociaron principalmente con un tipo concreto: CC1-agrIII,
CC5-agrII, CC8-agrI, CC9-agrII, CC15-agrII, CC22-agrI, CC25-agrIV, CC30-agrIII, CC45agrI, CC59-agrI, CC72-agrI, CC88-agrIII, CC97-agrI, CC121-agrIV, CC398-agrI (Tabla
10, Figura 15). La mayora de estas relaciones son las ms frecuentemente encontradas
(Wright et al., 2005; Robinson et al., 2006; Collery et al., 2008; Ghebremedhin et al., 2009;
180

4. Discusin

Kadlec et al., 2009; Smyth et al., 2009). Sin embargo, se observaron varias excepciones ya
descritas: CC1-agrI, CC1-agrII, CC5-agrI, CC25-agrIV, CC12-agrIV, CC30-agrI, CC45agrIII, CC45-agrIV, CC59-agrI/IV, CC121-agrII (Wright et al., 2005; Robinson et al., 2006,
Prez-Vzquez et al., 2008), y otras de nueva descripcin: CC5-agrIII, CC5-agrIV, CC8agrIV, CC9-agrII, CC12-agrIII, CC15-agrIV, CC25-agrII, CC121-agrIII, CC97-agrII.
Tabla 10. Distribucin de tipos agr en distintas poblaciones y complejos clonales de
Staphylococcus aureus estudiados en esta Tesis doctoral.
Tipo
CC [n (%)]b
Poblacin [n (%)]a
agr
I

HUCA [7 (8,6)]; HMN [21 (33,9)];


PS [27 (24,3)]; ALM [23 (35,9)];
AN [105 (96,3)]

CC1 [1 (16,7)]; CC5 [1 (1,0)]; CC8 [14 (87,5)];


CC22 [2 (100)]; CC25 [4 (26,7)]; CC30 [4 (6,6)];
CC45 [49 (83,1)]; CC72 [3 (75,0)];
CC97 [2 (66,7)]; CC398 [105 (100)]

II

HUCA [45 (55,6)]; HMN [28 (45,2)];


PS [40 (36,0)]; ALM [10 (15,6)]

CC1 [1 (16,7)]; CC5 [86 (84,3)]; CC9 [4 (66,7)];


CC12 [1 (33,3)]; CC15 [24 (96,0)]; CC25 [1 (6,7)];
CC45 [4 (6,8)]; CC97 [1 (33,3)]; CC121 [1 (14,3)]

III

HUCA [19 (23,5)]; HMN [6 (9,7)];


PS [31 (27,9)]; ALM [15 (23,4)];
AN [3 (2,8)]

CC1 [4 (66,7)]; CC5 [5 (4,9)]; CC9 [2 (33,3)];


CC12 [1 (33,3)]; CC30 [57 (93,4)]; CC45 [1 (2,0)];
CC88 [3 (100)]; CC121 [1 (14,3)]

IV

HUCA [10 (12,3)]; HMN [5 (8,1)];


PS [13 (11,7)]; ALM [14 (21,9)];
AN [1 (0,9)]

CC5 [10 (9,8)]; CC8 [2 (12,5)]; CC12 [1 (33,3)];


CC15 [1 (4,0)]; CC25 [10 (66,7)]; CC45 [5 (8,5)];
CC59 [9 (90,0)]; CC121 [5 (71,4)]

I/IV

HMN [2 (3,2)]

CC59 [1 (10,0)]; CC72 [1 (25,0)]

Porcentajes respecto al nmero total de aislamientos de cada poblacin (HUCA: 81; HMN: 62;
PS: 111; ALM: 64; AN: 109). ALM, aislamientos procedentes de alimentos y manipuladores de
alimentos; AN, aislamientos procedentes de animales; HMN, aislamientos procedentes del Hospital
Monte Naranco; HUCA, aislamientos procedentes del Hospital Universitario Central de Asturias;
PS, aislamientos procedentes de portadores sanos. bPorcentajes respecto al nmero total de
aislamientos de cada linaje (CC1: 6; CC5: 102; CC8: 16; CC9: 6; CC12: 3; CC15: 25; CC22: 2;
CC25: 15; CC30: 61; CC45: 59; CC59: 10; CC72: 4; CC88: 3; CC97: 3; CC121: 7; CC398: 105).
Los porcentajes superiores al 30% se muestran en negrilla.

Dentro de las excepciones, cabe destacar el hecho de que la mayora de los


aislamientos del CC25 detectados en este trabajo presentaron agrIV, a pesar de que este linaje
se asocia ms con agrI (Wright et al., 2005). Sin embargo, en Espaa se han encontrado
aislamientos CC25-agrI y CC25-agrIV (Prez-Vzquez et al., 2008). CC72-agrI/IV, al igual
que CC59-agrI/IV, fue positivo mediante PCR para ambos tipos agr (Artculo 2). Aunque no
se ha investigado a fondo, este hecho puede ser consecuencia de un fenmeno de
recombinacin, ya descrito entre sistemas agr (Gilot et al., 2002; Goerke et al., 2005;
Robinson et al., 2006). Por ejemplo, Robinson et al. (2006) describieron un agrI/IV
recombinante presente en CC59, que tenia ciertas caractersticas nicas (en porciones de agrB
y el extremo 5 de agrC) y otras compartidas con agrI (de agrB a agrD) y agrIV (de agrC a
agrA). Otro ejemplo de recombinacin agrI/IV fue encontrado por Goerke et al. (2005),
181

4. Discusin

presentando este sistema hbrido porciones similares a agrI y a agrIV en el gen agrC.
Adems, se han descrito dos aislamientos con un caso ms extremo de recombinacin,
implicando tres tipos de sistemas al presentar homologas con agrI en agrC y con agrII y
agrIII en agrD (Gilot et al., 2002). Otros autores han encontrado aislamientos positivos para
agrI/agrII y agrI/agrIII (Yoon et al., 2007), y en otros casos no fue posible determinar el tipo
de sistema agr de algunos aislamientos. Esto ltimo puede deberse a la delecin de locus del
sistema o a la existencia de nuevas variantes (Holfreter et al., 2007, OBrien et al., 2009;
Megevand et al., 2010). El locus agr, fue inicialmente considerado una caracterstica estable
de cada linaje y, de hecho, generalmente hay una gran correlacin entre ambos. Sin embargo,
estudios ms amplios sobre la distribucin del mismo, as como las excepciones y la
deteccin de sistemas hbridos, indican que con cierta frecuencia existe recombinacin entre
linajes, lo cual puede originar nuevos tipos agr cuyos efectos sobre la regulacin de la
virulencia y posible potenciacin de la patogenicidad de la bacteria deben ser investigados.
100

agrI

80

agrII

60

agrIII

40

agrIV

20

agrI/IV

CC398

CC121

CC97

CC88

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC15

CC12

CC9

CC8

CC5

CC1

Figura 15. Distribucin de grupos agr en los distintos complejos clonales. Porcentajes
respecto al nmero total de aislamientos en cada complejo clonal (CC1: 6; CC5: 102; CC8: 16; CC9:
6; CC12: 3; CC15: 25; CC22: 2; CC25: 15; CC30: 61; CC45: 59; CC59: 10; CC72: 4; CC88: 3;
CC97: 3; CC121: 7; CC398: 105).

4. 3. Objetivo 3. Determinar los fenotipos y genotipos de resistencia


(prestando especial atencin al SCCmec) en los linajes encontrados en el
Principado de Asturias y en el clon ST398.
La extensiva aplicacin de los agentes antimicrobianos ha tenido como consecuencia
la seleccin de cepas resistentes a las molculas en uso. Por ello, la determinacin de la
susceptibilidad de patgenos humanos a dichos agentes es importante, no slo para el
tratamiento de cada paciente, sino tambin para monitorizar la diseminacin de organismos
multirresistentes y genes de resistencia tanto en hospitales como en la comunidad. En este
apartado, se resumen los resultados fenotpicos de susceptibilidad a antimicrobianos
obtenidos en todas las poblaciones estudiadas, as como las bases moleculares de las
resistencias encontradas en S. aureus procedentes de portadores sanos,
alimentos/manipuladores de alimentos, y animales.

182

4. Discusin

4.3.1. Resistencia a antimicrobianos en las poblaciones de Staphylococcus aureus de


distinto origen
En la Tabla 11 y en la Figura 16 se comparan los resultados de resistencia a
antimicrobianos entre las poblaciones estudiadas, y entre los linajes a los que pertenecen los
distintos aislamientos.
Tabla 11. Porcentajes de resistencia a diferentes antimicrobianos en las poblaciones y
complejos clonales de Staphylococcus aureus estudiados en esta Tesis doctoral.
Antimicrobianosa Poblacinb [n (%)]
CCc [n (%)]
-lactmicos
[AMP-PEN]
HUCA [73 (90,1)];
CC1 [5 (83,3)]; CC5 [84 (82,4)]; CC8 [16 (100)];
HMN [57 (91,9)];
CC9 [6 (100)]; CC12 [2 (66,7)]; CC15 [19 (76,0)];
PS [94 (84,7)];
CC22 [2 (100)]; CC25 [15 (100)]; CC30 [54 (88,5)];
ALM [48(75,0)];
CC45 [53 (89,8)]; CC59 [4 (40,0)]; CC72 [4 (100)];
AN [107 (98,2)]
CC88 [3 (100)]; CC97 [3 (100)]; CC121 [5 (71,4)];
CC398 [104 (99,0)]
[MET-OXA]
HUCA [26 (32,1)];
CC5 [36 (35,3)]; CC8 [9 (56,3)]; CC9 [1 (16,7)];
HMN [21 (33,9)];
CC15 [1 (4,0)]; CC45 [3 (5,1)]; CC72 [1 (25,0)];
ALM [2 (3,1)];
CC398 [100 (95,2)]
AN [102 (93,6)]
Aminoglucsidos
HUCA [15 (18,5)];
CC1 [1 (16,7)]; CC5 [23 (22,6)];CC9 [1 (16,7)];
AMKd
HMN [8 (12,9)];
CC8 [2 (12,5)]; CC15 [1 (4,0)]; CC25 [2 (13,3)];
PS [7 (6,3)];
CC30 [1 (1,6)]; CC45 [1 (1,7)]
ALM [2 (3,1)]
GEN
HUCA [9 (11,1)];
CC5 [25 (24,5)]; CC8 [10 (62,5)]; CC9 [1 (16,7)]
HMN [25 (40,3)];
CC25 [2 (13,3)]; CC30 [2 (3,3)]; CC45 [2 (3,4)];
PS [6 (5,4)];
CC59 [1 (10,0)]; CC398 [15 (14,3)]
ALM [2 (3,1)];
AN [16 (14,4)]
KAN
HUCA [32 (39,5)];
CC1 [1 (16,7)]; CC5 [59 (57,8)]; CC8 [10 (62,5)];
HMN [32 (51,6)];
CC9 [2 (33,3)]; CC15 [4 (16,0)]; CC25 [3 (20,0)];
PS [30 (27,0)];
CC30 [10 (16,4)]; CC45 [3 (5,1)]; CC59 [1 (10,0)];
ALM [2 (3,1)];
CC72 [1 (25,0)]; CC97 [2 (66,7)]; CC121 [2 (28,6)];
AN [32 (28,8)]
CC398 [30 (28,6)]
HUCA [24 (29,7)];
CC1 [1 (16,7)]; CC5 [42 (41,2)], CC8 [10 (62,5)];
TOBd
HMN [29 (46,8)];
CC15 [1 (4,0)]; CC25 [2 (13,3)]; CC30 [3 (4,9)];
PS [7 (6,3)];
CC45 [2 (3,4)]; CC72 [1 (25,0)]
ALM [2 (3,1)]
Fenicoles
CHL
HUCA [14 (17,3)];
CC5 [17 (16,7)]; CC9 [1 (16,7)]; CC15 [1 (4,0)];
HMN [4 (6,5)];
CC45 [1 (1,7)]; CC97 [1 (33,3)]; CC398 [9 (8,6)]
PS [3 (2,7)];
AN [9 (8,3)]
Grupo MLS
HUCA [27 (33,3)];
CC5 [34 (33,3)]; CC8 [10 (62,5)]; CC9 [2 (33,3)];
[ERY-CLIC]
HMN [22 (35,5)];
CC25 [4 (26,7)]; CC30 [3 (4,9)]; CC45 [6 (10,2)];
PS [8 (7,2)];
CC59 [1 (10,0)]; CC398 [72 (68,6)]
AN [75 (68,8)]
HUCA [4 (4,9)];
CC1 [3 (50)]; CC5 [10 (9,8)]; CC8 [1 (6,3)];
[ERY-CLII]
HMN [4 (6,5)];
CC9 [2 (33,3)]; CC15 [2 (8,0)];CC25 [1 (6,7)];
PS [12 (10,8)];
CC30 [3 (4,9)]; CC45 [3 (5,1)]; CC59 [2 (20,0)];
ALM [8 (12,5)]
CC72 [1 (25,0)]

183

4. Discusin

Tabla 11 (continuacin). Porcentajes de resistencia a diferentes antimicrobianos en las


poblaciones y complejos clonales de Staphylococcus aureus estudiados en esta Tesis
doctoral.
Antimicrobianoa Poblacin [n (%)]b
CC [n (%)]c
Grupo MLS
ERY
HUCA [6 (7,4)];
CC5 [14 (13,7)]; CC15 [3 (12,0)]; CC30 [1 (1,6)];
HMN [3 (4,8)];
CC45 [1 (1,7)]; CC72 [1 (25,0)]
PS [8 (7,2)];
ALM [3 (4,7)]
CLI
PS [5 (4,5)];
CC5 [1 (1.0)]; CC15 [1 (4,0)]; CC25 [1 (6,7)];
ALM [1 (1,6)]
CC30 [1 (1,6)]; CC121 [2 (28,6)]
Mupirocina
MUP
HUCA [11 (13,6)];
CC1 [1 (16,7 )]; CC5 [14 (13,7)]; CC8 [1 (6,3)];
HMN [6 (9,7)];
CC15 [1 (4,0)]; CC25 [1 (6,7)]; CC30 [3 (4,9)];
PS [1 (0,9)];
CC45 [2 (3,4)]; CC72 [1 (25,0)]
ALM [6 (9,4)]
Tetraciclinas
TET
HUCA [1 (1,2)];
CC1 [1 (16,7)]; CC5 [8 (7,8)]; CC8 [9 (56,3)];
HMN [11 (17,7)];
CC9 [1 (16,7)]; CC15 [3 (12,0)]; CC30 [5 (8,2)];
PS [13 (11,7)];
CC45 [3 (5,1)]; CC97 [1 (33,3)]; CC398 [105 (100)]
ALM [4 (6,3)];
AN [108 (99,1)]
Quinolonas
CIP
HUCA [33 (40,7)];
CC5 [44 (43,1)]; CC8 [10 (62,5)]; CC9 [1 (16,7)];
HMN [24 (38,7)];
CC15 [1 (4,0)]; CC45 [3 (5,1)]; CC72 [1 (25,0)];
PS [1 (0,9)];
CC398 [9 (8,6)]
AN [11 (10,1)]
HUCA [26 (32,1)];
CC5 [32 (31,4)]; CC8 [6 (37,5)]; CC15 [1 (4,0)]
MOXd
HMN [13 (21,0)]
Rifamicinas
RIF
HUCA [3 (3,7)];
CC5 [5 (4,9)]
HMN [2 (3,2)]
Diaminopirimidinas y sulfonamidas
AN [68 (62,4)]
CC9 [1 (16,7)]; CC398 [67 (63,8)]
TMPd
SXT
HMN [6 (9,7)];
CC5 [2 (2,0)]; CC8 [2 (12,5)]; CC15 [1 (4,0)];
AN [4 (3,7)]
CC45 [1 (1,7)]; CC398 [4 (3,8)]
a

AMK, amikacina; AMP, ampicilina; CHL, cloranfenicol; CIP, ciprofloxacina; CLIC, clindamicina
constitutiva, CLII, clindamicina inducible; ERY, eritromicina; GEN, gentamicina; KAN,
kanamicina; MET, meticilina; MOX, moxifloxacina; MUP, mupirocina; OXA, oxacilina; PEN,
penicilina; RIF, rifampicina; SXT, sulfametoxazol/trimetoprima; TET, tetraciclina; TMP,
trimetoprima; TOB, tobramicina. bPorcentajes respecto al nmero total de aislamientos de cada
poblacin (HUCA: 81; HMN: 62; PS: 111; ALM: 64; AN: 109). HUCA, aislamientos procedentes
del Hospital Universitario Central de Asturias; HMN, aislamientos procedentes del Hospital Monte
Naranco; PS, aislamientos procedentes de portadores sanos; ALM, aislamientos procedentes de
alimentos y manipuladores de alimentos; AN, aislamientos procedentes de animales. n, nmero de
aislamientos resistentes, incluyendo las resistencias intermedias. cPorcentajes respecto al nmero
total de aislamientos de cada linaje (CC1: 6; CC5: 102; CC8: 16; CC9: 6; CC12: 3; CC15: 25;
CC22: 2; CC25: 15; CC30: 61; CC45: 59; CC59: 10; CC72: 4; CC88: 3; CC97: 3; CC121: 7;
CC398: 105). dLos aislamientos AN no fueron analizados para susceptibilidad frente a AMK, TOB
y MOX y los aislamientos HUCA y HMN no fueron analizados para TMP. Los porcentajes
superiores al 30% se muestran en negrilla.

184

CC1
CC5
CC8
CC9
CC12
CC15
CC22
CC25
CC30
CC45
CC59
CC72
CC88
CC97
CC121
CC398

100
80
60
40
20
0

100
80
60
40
20
0

100
80
60
40
20
0

100
80
60
40
20
0

SXT

CC1
CC5
CC8
CC9
CC12
CC15
CC22
CC25
CC30
CC45
CC59
CC72
CC88
CC97
CC121
CC398

CC1
CC5
CC8
CC9
CC12
CC15
CC22
CC25
CC30
CC45
CC59
CC72
CC88
CC97
CC121
CC398

100
80
60
40
20
0

CC1
CC5
CC8
CC9
CC12
CC15
CC22
CC25
CC30
CC45
CC59
CC72
CC88
CC97
CC121
CC398

CC1
CC5
CC8
CC9
CC12
CC15
CC22
CC25
CC30
CC45
CC59
CC72
CC88
CC97
CC121
CC398

CC1
CC5
CC8
CC9
CC12
CC15
CC22
CC25
CC30
CC45
CC59
CC72
CC88
CC97
CC121
CC398

CC1
CC5
CC8
CC9
CC12
CC15
CC22
CC25
CC30
CC45
CC59
CC72
CC88
CC97
CC121
CC398

100
80
60
40
20
0

CC1
CC5
CC8
CC9
CC12
CC15
CC22
CC25
CC30
CC45
CC59
CC72
CC88
CC97
CC121
CC398

CC1
CC5
CC8
CC9
CC12
CC15
CC22
CC25
CC30
CC45
CC59
CC72
CC88
CC97
CC121
CC398

CC1
CC5
CC8
CC9
CC12
CC15
CC22
CC25
CC30
CC45
CC59
CC72
CC88
CC97
CC121
CC398

CC1
CC5
CC8
CC9
CC12
CC15
CC22
CC25
CC30
CC45
CC59
CC72
CC88
CC97
CC121
CC398

100
80
60
40
20
0

CC1
CC5
CC8
CC9
CC12
CC15
CC22
CC25
CC30
CC45
CC59
CC72
CC88
CC97
CC121
CC398

CC1
CC5
CC8
CC9
CC12
CC15
CC22
CC25
CC30
CC45
CC59
CC72
CC88
CC97
CC121
CC398

4. Discusin

AMPPEN

100
80
60
40
20
0
METOXA

GEN

100
80
60
40
20
0
KAN

CHL

100
80
60
40
20
0
ERY

CLI

100
80
60
40
20
0
MUP

TET

100
80
60
40
20
0
CIP

RIF

100
80
60
40
20
0
TMP

HUCA

HMN

ALM

PS

AN

185

4. Discusin

Figura 16 (pgina anterior). Distribucin de las resistencias a antimicrobianos dependiendo


del linaje y la poblacin en estudio. La distribucin se basa en los porcentajes de aislamientos
resistentes respecto al total de aislamientos dentro de cada linaje (CC1: 6; CC5: 102; CC8: 16; CC9: 6;
CC12: 3; CC15: 25; CC22: 2; CC25: 15; CC30: 61; CC45: 59; CC59: 10; CC72: 4; CC88: 3; CC97: 3;
CC121: 7; CC398: 105). Los colores representan las distintas poblaciones en estudio: AN,
aislamientos procedentes de animales; ALM, aislamientos procedentes de alimentos y manipuladores
de alimentos; HMN, aislamientos procedentes del Hospital Monte Naranco; HUCA, aislamientos
procedentes del Hospital Universitario Central de Asturias; PS, aislamientos procedentes de portadores
sanos. AMP-PEN, ampicilina-penicilina; CHL, cloranfenicol; CIP, ciprofloxacina; CLI, clindamicina
constitutiva e inducible; ERY, eritromicina; GEN, gentamicina; KAN, kanamicina; MET-OXA,
meticilina-oxacilina; MUP, mupirocina; RIF, rifampicina; SXT, sulfametoxazol/trimetoprima; TET,
tetraciclina; TMP, trimetoprima.

En S. aureus la resistencia a -lactmicos tipo penicilina y ampicilina suele ser muy


elevada, en torno al 80-95% (Mandell et al., 2000; Cuevas et al., 2008; Gold y Pillai, 2009).
De la misma manera, todas las poblaciones estudiadas en esta Tesis presentaron altos
porcentajes de resistencia frente a dichos antibiticos (70-100%), incluyendo no slo los
aislamientos nosocomiales sino tambin los procedentes de portadores sanos,
alimentos/manipuladores de alimentos.
En general, los porcentajes de resistencia encontrados en el HUCA fueron ligeramente
superiores a los recogidos en el informe sobre resistencia de S. aureus en hospitales espaoles
para 2006: PEN: 89,0%, OXA: 29,2%, GEN: 8,6%, TOB: 27%, CHL: 4,1%, ERY: 43,2%,
CLI: 19,9%, MUP: 9,5%, CIP: 37,4%, RIF: 0,6 (Cuevas et al., 2008). En el HMN los
aislamientos tambin presentaron porcentajes de resistencia algo superiores a la media de
1996 a 2006 recogida en dicho informe: PEN: 90,1%, OXA: 26,1%, GEN: 14,0%, CHL:
2,6%, ERY: 29,2%, CLI: 19,6%, MUP: 8,9%, CIP: 30,4%, RIF: 3,1 (Cuevas et al., 2008). En
aislamientos de portadores sanos as como de alimentos/manipuladores los porcentajes de
resistencia fueron considerablemente inferiores a los hospitalarios (Artculos 6 y 7). De
hecho, los porcentajes de multiresistencia (resistencia a cuatro o ms grupos de
antimicrobianos) fueron del 1,8 y 3,2% en portadores sanos y alimentos/manipuladores,
respectivamente, frente al 42,0 y 46,8% del HUCA y HMN. De entre todas las resistencias
encontradas, destacan en muestras clnicas los elevados porcentajes de resistencia a
aminoglicsidos, antimicrobianos del grupo MLS y quinolonas, de uso frecuente en el
tratamiento de infecciones por S. aureus (Gold y Pillai, 2009). Los aislamientos del HUCA y
de portadores sanos con pulsotipos relacionados (apartado 4.1.1.1.) mostraron resistencia a
PEN-AMP, aunque en algunos casos se encontraron resistencias adicionales, incluyendo a
antibiticos del grupo MLS (perfiles HUCA-S26 y PS-S127) y multiresistencia (perfiles
HUCA-S48 y PS-S31).
En cuanto a la mupirocina, antibitico de eleccin para erradicar el estado de portador
(McConeghy et al., 2009; Potel et al., 2009; Lozano et al., 2011c), se encontraron
aislamientos resistentes en todas las poblaciones del PA. Aunque el 65,2% presentaron
resistencia de bajo nivel (CMI entre 8 y 60 g/ml), 2 aislamientos del HUCA mostraron
resistencia intermedia (CMI de 80 a 100 g/ml) y 5 del HMN, as como uno de un

186

4. Discusin

manipulador de alimentos mostraron resistencia de alto nivel (CMI superior a 1000 g/ml)
(Anexo II).

4.3.2. Clones MRSA


Todos los aislamientos de portadores sanos fueron susceptibles a meticilina, mientras
que las dems poblaciones incluyeron aislamientos MRSA. El 96,7% perteneci a CC5, CC8
y CC398, aunque tambin se detectaron MRSA en CC9, CC15, CC45 y CC72 (Apartado
4.3.1.). Los aislamientos de animales, en su mayora del CC398, fueron casi todos MRSA,
debido a la pre-seleccin llevada a cabo por NRL-Staph dentro del programa de
monitorizacin de MRSA.
El tipo de SCCmec se determin en los MRSA de las distintas poblaciones utilizando
el protocolo descrito por Zhang et al. (2005). Esta informacin, junto con la tipificacin por
MLST, permiti identificar los clones que estuvieron circulando en nuestra regin (Tabla
12). En el HMN durante el periodo 1996 a 2001 se encontraron dos clones CC8: el Ibrico
(ST247-SCCmec I) y el Brasileo/Hngaro (ST239-SCCmec III), que fueron prevalentes en
Espaa durante la dcada de los 90 (Prez-Roth et al., 2004; Vindel et al., 2006; Cuevas et
al., 2007; Potel et al., 2007). Por otro lado, en los dos hospitales de Asturias, as como en
alimentos/manipuladores de alimentos se detectaron clones CC5, incluyendo: Nueva
York/Japn (ST5-SCCmec II), Peditrico (ST5-SCCmec IV), Alemania-Sur (ST228-SCCmec
I) y ST125-SCCmec IVa. El clon Nueva York/Japn fue descrito por primera vez en Espaa
en 1998, siendo relativamente frecuente hasta el 2000, para luego encontrarse de forma ms
espordica (Vindel et al., 2006; Prez-Vzquez et al., 2008; Vindel et al., 2009). Los dos
aislamientos de este clon detectados en el presente trabajo proceden de muestras clnicas
recogidas en 1993 y 1998 en el HMN, lo que demuestra su presencia en Espaa mucho antes
de lo descrito (Artculo 2). Durante 2006, ST125-SCCmec IV pas a ser el clon MRSA
predominante en nuestro pas (Vindel et al., 2006; Vindel et al., 2009), siendo ms frecuentes
los aislamientos con SCCmec IVa (Prez-Vzquez et al., 2009). En el HUCA, el clon
mayoritario durante ese ao fue ST125-SCCmec IVc, ocupando SCCmec IVc el segundo
lugar en frecuencia en Espaa (Artculo 1; Prez-Vzquez et al., 2009). Adems, en el HMN
se describieron dos nuevos clones CC5, ST125-SCCmec III y ST125-SCCmec V (Artculo
2). Con menor frecuencia se haban encontrado en Espaa otros clones CC5, como el Nueva
York/Japn (ST5-SCCmec II), el Peditrico (ST5-SCCmec IV), el ST125-SCCmec I y el
Alemania-Sur (ST228 SCCmec I) (Vindel et al., 2006; Vindel et al., 2009). Todos excepto
ST125-SCCmec I aparecieron tambin en muestras de Asturias. Cabe destacar que el clon
Alemania-Sur, aunque infrecuente, fue causante de una elevada morbilidad en pacientes con
fibrosis qustica en el Hospital Universitario Ramn y Cajal (Madrid) durante 1994-2006
(Molina et al., 2008). Por otro lado, el clon Peditrico junto con el EMRSA-15 (ST22SCCmec IV) son actualmente los clones ms comunes en hospitales espaoles (Manzur et al.,
2010; Montesinos et al., 2010).

187

4. Discusin

Tabla 12. Clones MRSA presentes en las poblaciones de Staphylococcus aureus estudiadas en
esta Tesis Doctoral.
CCa
Clon
STb
tipo spa
SCCmec Poblacin [n (%)c]
CC5

Nueva York/Japn (USA 100)


Peditrico (USA 800)

5
5

t001, t045
t002, t045, t6488

II
IVc

Peditrico (USA 800)


-

5
5
125
125
125

t002, t2173
t002
t067
t067
t067, t3734

IVd
nd
III
IVa
IVc

Alemania-Sur

125 t067
228 t109

V
I

239
247
9
14
45
45
47
72
398
398

III
I
IVa
V
III
IVc
IVc
IVc
IVa
V

HMN [2 (9,5)]
HUCA [1 (3,8)];
HMN [2 (9,5)]
ALM [2 (100)]
AN [1 (1)]
HMN [1 (4,8)]
HMN [1 (4,8)]
HUCA [20 (77)];
HMN [1 (4,8)]
HMN [1 (4,8)]
HUCA [3 (11,5)];
HMN [1 (4,8)]
HMN [3 (11,5)]
HMN [6 (23)]
AN [1 (1)]
HMN [1 (4,8)]
HMN [1 (4,8)]
HMN [1 (4,8)]
HUCA [1 (4,8)]
HUCA [1 (4,8)]
AN [5 (4,8)]
AN[80 (76,2)]

V*
nd

AN[11 (10,5)]
AN [7 (6,7)]

Brasileo/Hngaro
Ibrico
CC9
CC15 CC45 Berln (USA 600)
CC72 USA700
CC398 CC8

t037
t051
t1430
t279
t1078
t065
t383
t148
t011, t779
t011, t034, t108, t1255
t1451, t1457, t1580,
t1985, t2011, t2346,
t2510, t2576, t2970,
t5210
398 t034, t108, t571, t1928
398 t011, t034, t1250, t1753

CC, complejo clonal. bST, Secuencia Tipo. cLos porcentajes estn calculados en base al nmero total de
aislamientos MRSA en cada poblacin (HUCA: 26; HMN: 21; AN: 105, ALM: 2). HUCA, aislamientos
procedentes del Hospital Universitario Central de Asturias; HMN, aislamientos procedentes del Hospital
Monte Naranco; ALM, aislamientos procedentes de alimentos y manipuladores de alimentos; AN,
aislamientos procedentes de animales; n, nmero de aislamientos de cada clon. Los porcentajes superiores
al 30% se muestran en negrilla.

Dentro del linaje CC45 se encontr el clon Berln (ST45-SCCmec IV), que ha sido
descrito con baja frecuencia en Espaa (Vindel et al., 2006), as como el ST45-SCCmec III
previamente encontrado en un hospital de los Pases Bajos (Nulens et al., 2009). El ST47SCCmec IVc es de nueva descripcin en Espaa, ya que slo se haba encontrado en muestras
clnicas y de portadores en el Reino Unido (Day et al., 2001) y en aislamientos BORSA de
Canad (Nadarajah et al., 2006). Segn estos ltimos autores ST47, como progenitor del clon
Berln, proporcionara un ambiente estable para la integracin del SCCmec (Nadarajah et al.,
2006), como lo demuestra el aislamiento ST47-SCCmec IVc (Artculo 1). En relacin a
CC72, el clon ST72-MRSA-IV encontrado en el HUCA, que es muy frecuente en Corea (Kim
et al., 2007; Bae et al., 2010), fue descrito por primera vez en Espaa en 2006 en pacientes
con fibrosis qustica (Molina et al., 2008), y recientemente se ha encontrado en portadores

188

4. Discusin

sanos y pacientes en Portugal y las Islas Canarias (Montesinos et al., 2010; Tavares et al.,
2010).
Por otro lado, CC15 es un linaje MSSA distribuido mundialmente (Deurenberg y
Stobberingh, 2008). Al igual que otros linajes MSSA, se considera que CC15 no proporciona
un ambiente estable para la integracin del SCCmec (Katayama et al., 2005). Sin embargo se
han descrito varias excepciones no slo en CC15 (Ho et al., 2007; Campanile et al., 2009)
sino tambin en CC12, otro linaje MSSA (Fossum y Bukholm, 2006). El clon ST14-SCCmec
V del linaje CC15 hallado en el HMN constituira otra excepcin (Artculo 2).
Respecto a los aislamientos procedentes de Alemania, se encontraron 4 clones ST398,
siendo el mayoritario el portador de SCCmec V. Otros autores tambin han identificado este
tipo de SCCmec como el ms frecuente en ST398, siendo menor la proporcin de
aislamientos con SCCmec IVa (de Neeling et al., 2007; Witte et al., 2007; Fesler et al.,
2010). En el presente trabajo, 11 aislamientos de este clon adscritos al SCCmec III por el
protocolo de Zhang et al. (2005), fueron sometidos a un anlisis ms exhaustivo para
determinar la posible presencia de SCCmec V (Artculo 11). De hecho, en el 2009 se haba
determinado que los aislamientos ST398 identificados como SCCmec III por el protocolo de
Zhang et al. (2005) realmente contenan SCCmec V (Jansen et al., 2009). Los aislamientos
adscritos a SCCmec III en nuestra serie contienen el gen que codifica la transposasa A del
Tn554 integrado en la regin J2 del SCCmec III, pero carecen del ccrA/B3 de este casete y
poseen el ccrC del SCCmec V. La posesin de un gen de recombinasa de SCCmec V pude
indicar que estos aislamientos poseen algn tipo nuevo de SCCmec que ha adquirido parte de
las regiones junkyard del SCCmec III. Adems, 7 aislamientos fueron no tipificables con los
mtodos utilizados, lo que muestra la posibilidad de nuevas variantes SCCmec en la
poblacin del ST398. De hecho, otros autores tambin han encontrado elementos SCCmec
atpicos y/o no tipificables en este linaje (Kadlec et al., 2009; Fesler et al., 2010). En las
muestras de animales tambin se observ un clon ST5 con SCCmec no tipificable, as como
un ST9-SCCmec IVa, aunque el ST9 se asocia fundamentalmente con SCCmec V (Neela et
al., 2009).
Por ltimo, cabe destacar que el 80,7% de los aislamientos MRSA de hospitales fue
multirresistente, lo que dificultara su tratamiento y/o eliminacin dependiendo del caso.
Dentro del linaje CC398, el 70% de los MRSA fueron multirresistentes y a diferencia del
resto de poblaciones y linajes presentaron un alto porcentaje de resistencia a trimetoprima
(Artculo 12). La resistencia a este antimicrobiano es infrecuente en otros MRSA pero parece
ser una caracterstica frecuente en CC398 (Kadlec et al., 2009; Fesler et al., 2010). Por otro
lado, los linajes CC5 y CC8 presentaron altos porcentajes de resistencia frente a otros
antimicrobianos como GEN, KAN, ERY-CLIC, TET y/o CIP. Cabe destacar que la mayora
de aislamientos CC5 y CC8 proceden de muestras hospitalarias (66.3% y 81.3%,
respectivamente). Sin embargo, para estos aislamientos an dispondramos de alternativas
teraputicas, ya que tanto los multirresitentes, como el resto de los analizados en esta Tesis
fueron sensibles a linezolid, vancomicina y tigeciclina.

189

4. Discusin

4.3.3. Determinantes de resistencia en poblaciones de Staphylococcus aureus de


distinto origen
Los determinantes implicados en resistencia a antimicrobianos han sido extensamente
investigados en aislamientos nosocomiales de S. aureus (Fluit et al., 2001; Roberts, 2005;
Laplana et al., 2007; Gherardi et al., 2008; Hauschild et al., 2008; Roberts, 2008; Emaneini et
al., 2009; Fatholahzadeh et al., 2009). Por ello, el estudio de determinantes de resistencia,
distintos al SCCmec (Apartado 4.3.2.), se centr en las poblaciones de portadores sanos,
alimentos, manipuladores de alimentos y animales, peor caracterizadas. De hecho, en el 2008
cuando se plante el trabajo a realizar durante la estancia breve en el BfR la informacin
sobre genes de resistencia en CC398 era muy limitada (Huijsdens et al., 2006, Monecke et
al., 2007; Witte et al., 2007). Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 13.
Tabla 13. Genes de resistencia en las poblaciones y complejos clonales de Staphylococcus
aureus estudiados en esta Tesis doctoral.
Resistenciaa
Gen(es)
Poblacin [n (%)b] CC [n (%)c]
[PEN-AMP]

blaZ

PS [99 (89,2)];
ALM [48 (75)];
AN [102 (93,6)]

[AMK-GEN-KAN-TOB] aacA-aphD PS [6 (5,4)];


ALM [1 (1,6)];
AN [13 (11,9)]
[AMK-KAN-TOB]
aadD
PS [3 (2,7)];
ALM [1 (1,6)];
AN [39 (35,8)]
KAN
aphA-3
PS [27 (24,3)];
ALM [2 (3,1)];
AN [3 (2,8)]
CHL

[ERY-CLIC]

catpC194
catpC221
fexA
cfrd
ermA
ermB
ermC

[ERY-CLII]

190

ermA
ermC

PS [2 (1,8)]
PS [1 (0,9)]
AN [2 (3,1)]
AN [1 (1,6)]
AN [37 (33,9)]
PS [2 (1,8)];
AN [33 (30,3)]
PS [8 (7,2)];
AN [43 (39,4)]
ALM [2 (3,1)]
PS [12 (10,8)];
ALM [8 (12,5)]

CC1 [5 (100)]; CC5 [26 (74,3)];


CC8 [3 (100)]; CC9 [6 (100)];
CC15 [11 (73,3)]; CC22 [2 (100)];
CC25 [10 (100)]; CC30 [39 (88,6)];
CC45 [38 (90,5)]; CC59 [3 (37,5)];
CC72 [2 (100)]; CC97 [3 (100)];
CC121 [2 (50,0)]; CC398 [99 (94,3)]
CC5 [3 (8,6)]; CC25 [2 (20,0)];
CC30 [2 (4,5)]; CC398 [13 (12,4)]
CC1 [1 (20,0)]; CC5 [1 (2,9)];
CC9 [1 (16,7)]; CC25 [2 (20,0)];
CC59 [1 (12,5)]; CC398 [38 (36,2)]
CC1 [1 (20,0)]; CC5 [9 (26,7)];
CC9 [1 (16,7)]; CC15 [3 (20,0)];
CC25 [3 (30,0)]; CC30 [7 (15,9)];
CC45 [1 (2,4)]; CC97 [2 (66,7)];
CC121 [2 (50,0)]; CC398 [2 (1,9)]
CC9 [1 (16,7)]; CC97 [1 (33,3)]
CC15 [1 (6,7)]
CC398 [2 (1,9)]
CC398 [1 (0,9)]
CC5 [1 (2,9)]; CC398 [36 (34,3)]
CC9 [1 (16,7)]; CC45 [2 (4,8)];
CC398 [32 (30,5)]
CC5 [2 (5,7)]; CC9 [1 (16,7)];
CC25 [2 (20,0)]; CC30 [1 (2,3)];
CC45 [3 (7,1)]; CC398 [42 (40,0)]
CC1 [1 (20,0)]; CC45 [1 (2,4)]
CC1 [3 (60,0)]; CC5 [6 (17,1)];
CC9 [2 (33,3)]; CC15 [1 (6,7)];
CC25 [1 (10,0)]; CC30 [3 (6,8)];
CC45 [2 (4,8)]; CC59 [1 (12,5)];
CC72 [1 (50,0)]

4. Discusin

Tabla 13 (continuacin). Genes de resistencia en las poblaciones y complejos clonales de


Staphylococcus aureus estudiados en esta Tesis doctoral.
Resistenciaa
Gen(es)
Poblacin [n (%)b] CC [n (%)c]
ERY

msrA
msrB

CLI

linA/linA

MUP
TET

mupA
tetK

TMP

PS [5 (4,5)];
ALM [2 (3,1)]
PS [23 (20,7)];
ALM [3 (4,7)]
PS [6 (5,4)];
ALM [1 (1,6)];
AN [4 (3,7)]
ALM [1 (1,6)]
PS [13 (11,7)];
ALM [4 (6,3)]
AN [76 (69,7)]

tetL
tetM

AN [42 (38,5)]
AN [107 (98,2)]

dfrA/S1d
dfrDd
dfrGd
dfrKd

AN [1 (1,6)]
AN [1 (1,6)]
AN [24 (22,0)]
AN [44 (40,4)]

CC5 [4 (11,4)]; CC15 [1 (6,7)];


CC25 [1 (10,0)]; CC45 [1 (2,4)]
CC1 [2 (40,0)]; CC5 [8 (22,9)];
CC15 [3 (20,0)]; CC25 [3 (30,0)];
CC30 [3 (6,8)]; CC45 [5 (11,9)];
CC59 [1 (12,5)]; CC72 [1 (50,0)]
CC5 [1 (2,9)]; CC15 [1 (6,7)];
CC25 [2 (20,0)]; CC30 [1 (2,3)];
CC121 [2 (50,0)]; CC398 [4 (3,8)]
CC15 [1 (6,7)]
CC1 [1 (20,0)]; CC5 [5 (14,3)];
CC8 [1 (33,3)]; CC9 [1 (16,7)];
CC15 [3 (20,0)]; CC30 [4 (9,1)];
CC45 [3 (7,1)]; CC97 [1 (33,3)];
CC398 [74 (70,5)]
CC9 [1 (16,7)]; CC398 [41 (39,1)]
CC5 [1 (2,9)]; CC9 [1 (16,7)];
CC398 [105 (100)]
CC398 [1 (0,9)]
CC398 [1 (0,9)]
CC398 [24 (22,9)]
CC9 [1 (16,7)]; CC398 [43 (41,0)]

AMK, amikacina; AMP, ampicilina; CC, complejo clonal; CHL, cloranfenicol; CIP, ciprofloxacina;
CLIC, clindamicina constitutiva, CLII, clindamicina inducible; ERY, eritromicina; GEN, gentamicina;
KAN, kanamicina; MUP, mupirocina; PEN, penicilina; PS, aislamientos procedentes de portadores
sanos; RIF, rifampicina; TET, tetraciclina; TMP, trimetoprima; TOB, tobramicina. bPorcentajes
respecto al nmero total de aislamientos de cada poblacin (PS: 111; ALM: 64; AN: 109). ALM,
aislamientos procedentes de alimentos y manipuladores de alimentos; n, nmero de aislamientos;
AN, aislamientos procedentes de animales; PS, aislamientos procedentes de portadores sanos.
c
Porcentajes respecto al nmero total de aislamientos de cada linaje (CC1: 5; CC5: 35; CC8: 3; CC9:
6; CC15: 15; CC22: 2; CC25: 10; CC30: 44; CC45: 42; CC59: 8; CC72: 2; CC97: 3; CC121: 4;
CC398: 105). dGenes analizados slo en la poblacin AN. nd, no determinado. Los porcentajes
superiores al 30% se muestran en negrilla.

En todas las poblaciones se encontr un alto porcentaje del gen blaZ, que codifica una
-lactamasa que confiere resistencia a -lactmicos tipo penicilina y ampicilina (Figura 17).
Este gen, generalmente localizado en plsmidos, est muy extendido en las poblaciones de S.
aureus de procedencia clnica, comunitaria y animal (Mandell et al., 2000; Werckenthin et
al., 2001; Gold y Pillai, 2009; Jensen y Lyon, 2009). Adems, en las poblaciones de
portadores sanos y alimentos/manipuladores, se determin que este gen estaba asociado al
transposn Tn552 en un 79,6% y 81% de los aislamientos blaZ positivos, respectivamente
(Artculos 6 y 7).
Respecto a la resistencia a aminoglicsidos, en aislamientos clnicos generalmente el
aacA-aphD es el determinante ms frecuente seguido de aadD o aphA, dependiendo de la
poblacin bajo estudio (Fluit et al., 2001; Hauschild et al., 2008; Emaneini et al., 2009;
Fatholahzadeh et al., 2009). Sin embargo, existen poblaciones en las que aphA (Monecke y

191

4. Discusin

Ehricht, 2005) o aadD (Laplana et al., 2007; Prez-Vzquez et al., 2008) son ms frecuentes
que aacA-aphD. En este sentido, los estudios sobre la distribucin de estos genes en
aislamientos clnicos espaoles apuntan a un elevado porcentaje de aadD frente a los otros
determinantes de resistencia (Laplana et al., 2007; Prez-Vzquez et al., 2008). Este hecho se
debe a la asociacin de aadD con ST125-SCCmec IV, que era el clon ms frecuente en
hospitales espaoles durante los aos en que se llevaron a cabo dichos estudios (Laplana et
al., 2007; Prez-Vzquez et al., 2008; Vindel et al., 2009). Ninguno de los aislamientos
encontrados en portadores sanos o alimentos/manipuladores, se pudo asignar a este clon y,
aunque en ambas poblaciones hubo aislamientos CC5, stos fueron ST5. De acuerdo con ello,
los porcentajes de aadD hallados en aislamientos de las dos poblaciones fueron muy bajos,
del 3,6 y 1,6%, respectivamente. Estos datos contrastan con el 24,3% de aphA y el 5,4% de
aacA-aphD en S. aureus de portadores sanos, pero no con los inferiores porcentajes
observados en aislamientos de alimentos/manipuladores (3,1% de aphA y 1,6% de aacAaphD) (Figura 17). Estos datos son interesantes ya que, al igual que en MRSA de origen
hospitalario en Alemania (Monecke y Ehricht, 2005) y en estafilococos coagulasa negativos
(Fluit et al., 2001), el gen aphA es frecuente en la poblacin de portadores sanos del PA. Los
aislamientos aphA positivos tanto de portadores sanos como de alimentos/manipuladores
fueron tambin positivos para los genes aadE y sat4 (Artculos 6 y 7), que se localizan junto
a aphA-3 en el transposn Tn5404 (Derbise et al., 1997), lo que apoya la posible implicacin
de este elemento gentico mvil en la dispersin de aphA en Asturias. A diferencia de las
poblaciones de portadores sanos y de alimentos/manipuladores de Asturias, un alto porcentaje
de los aislamientos del CC398 fueron positivos para aacA-aphD y aadD, mientras que slo
dos tenan aphA-3, lo que tambin se ha descrito en otras series de CC398 (Figura 17, Kadlec
et al., 2009; Fesler et al., 2010). Un hecho interesante fue que muchos aislamientos CC398
fenotpicamente susceptibles portaban genes de resistencia (Artculo 12). Este fenmeno se
ha dado en S. aureus en otros estudios, y se ha atribuido a fenmenos de induccin de la
transcripcin o a la presencia de genes inactivos (Monecke y Ehricht, 2005; Hauschild et al.,
2008; Fatholahzadeh et al., 2009).
El cloranfenicol, debido a sus efectos secundarios, es un antibitico poco utilizado
para el tratamiento de infecciones en humanos (Torres et al., 2000), por lo que hay pocos
estudios sobre la incidencia de genes de resistencia a fenicoles en S. aureus de origen clnico
(Fluit et al., 2001). Sin embargo, el uso del florfenicol est aprobado para el tratamiento de
animales, incluyendo el ganado porcino (Kehrenberg y Schwarz, 2006). De hecho, en nuestro
estudio slo tres aislamientos de la poblacin de portadores sanos fueron positivos para genes
cat, destacando el hecho de que dos de ellos pertenecen a los linajes CC9 y CC97 asociados a
animales (Sung et al., 2008; Neela et al., 2009; Gmez Sanz et al., 2010; Ruimy et al., 2010).
A pesar de su uso en ganadera porcina, pocos aislamientos CC398 fueron resistentes a
cloranfenicol (8,6%), y slo en dos se pudo identificar el determinante de resistencia
implicado (Artculo 12). El resto de aislamientos pueden poseer otros mecanismos de
resistencia; de hecho este clon parece ser prolfico en nuevos genes de resistencia como ya se

192

4. Discusin

ha demostrado para trimetoprima (Kadlec y Schwarz, 2009a), estreptograminas (Kadlec y


Schwarz, 2009b) y apramicina (Fesler et al., 2011).
AMPPEN blaZ

Aminoglsidos

100
80
60
40
20
0
CC398

CC97

CC121

CC59

CC45

CC30

CC25

CC9

CC15

CC5

CC398

CC121

CC97

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

tetM

CC15

linA/linA'

tetL

CC9

CC398

CC121

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC15

msrB

tetK

CC8

msrA

Tetraciclina

100
80
60
40
20
0

CC5

ermC

CC9

aphA

CC1

ermB

CC5

aadD

ermA

100
80
60
40
20
0

CC1

aacAaphD

CC1

CC398

CC97

MLS

CC121

CC72

CC59

CC45

CC30

CC25

CC22

CC9

CC15

CC8

CC5

CC1

100
80
60
40
20
0

Figura 17. Distribucin de genes de resistencia a antimicrobianos en diferentes complejos


clonales. Las barras representan el porcentaje de aislamientos positivos respecto al total de
aislamientos de cada complejo clonal (CC). (CC1: 5; CC5: 35; CC8: 3; CC9: 6; CC15: 15; CC22: 2;
CC25: 10; CC30: 44; CC45: 42; CC59: 8; CC72: 2; CC97: 3; CC121: 4; CC398: 105). Los datos
corresponden a la suma de aislamientos de S. aureus procedentes de tres poblaciones: portadores
sanos, alimentos y manipuladores de alimentos, y animales.

En las distintas poblaciones analizadas se encontraron varios determinantes de


resistencia a antimicrobianos del grupo MLS. Destaca el hecho de que en un 39,2% de los
aislamientos con esta resistencia los genes responsables aparecieron de forma redundante (dos
o ms). En aislamientos de portadores sanos y alimentos/manipuladores, se encontraron tanto
genes erm, confiriendo resistencia constitutiva o inducible, como msr, mientras que en los
aislamientos de animales no se encontraron genes mrs y los genes erm conferan resistencia
constitutiva (Figura 17). Este fenmeno de diversas combinaciones de genes erm y msr en
aislamientos de portadores sanos se ha observado tambin en La Rioja (Lozano et al., 2011b).
Los genes ermA y ermB se asocian normalmente con fenotipos de resistencia constitutivos,
mientras que ermC suele originar fenotipos inducibles (Fluit et al., 2001). Sin embargo,
ambos fenotipos pueden ser conferidos tanto por ermA como por ermC en S. aureus (Gherardi
et al., 2008) y por ermB en otras bacterias (Teng et al., 2001; Min et al., 2008). En todas las
poblaciones se encontraron aislamientos con ermC mediando tanto resistencia constitutiva
como inducible, siendo esta ltima ms frecuente en aislamientos de portadores sanos. Los
datos de los aislamientos de portadores sanos y de alimentos/manipuladores, estn en lnea
con los descritos para aislamientos clnicos de Espaa, siendo ermC el gen ms frecuente en
estos ltimos, seguido de ermA, msrA y ermB (Laplana et al., 2007), aunque en aislamientos
de portadores sanos de La Rioja ermA fue ms frecuente que ermC (Lozano et al., 2011b).
Altos porcentajes de msrA y msrB tambin se han encontrado en el clon ST125 (PrezVzquez et al., 2008) y en menor proporcin en portadores sanos (Lozano et al., 2011b),
indicando que estos genes estn circulando en las poblaciones comunitaria y nosocomial de

193

4. Discusin

Espaa. El gen ermB es uno de los genes de resistencia frente a antibiticos MLS ms
extendido ya que se ha encontrado en varios gneros bacterianos (Roberts, 2005; Roberts,
2008), siendo en S. aureus ms frecuente en aislamientos de origen animal (Werckenthin et
al., 2001). Sin embargo, en Espaa parece ser frecuente en aislamientos clnicos (Laplana et
al., 2007), aunque en Asturias, al igual que en la Rioja, apareci en pocos aislamientos de
origen comunitario (Tabla 13; Lozano et al., 2011b). La resistencia slo a clindamicina, as
como el gen linA/linA se encontr con baja frecuencia en las poblaciones estudiadas. En
general existe poca informacin sobre la incidencia de este gen en S. aureus, a pesar de la
existencia de homlogos en otros gneros bacterianos, debido a la alta dispersin de genes
erm que confieren resistencia a todo el grupo MLS (Fluit et al., 2001). Por otro lado, en los
aislamientos de animales tambin se estudio la resistencia a estreptrogaminas, as como la
presencia de posibles determinantes, aunque ninguno de los genes descritos pudo ser
detectado en la serie (Artculo 12).
La resistencia a tetraciclina en aislamientos de portadores sanos se present con baja
frecuencia, siempre asociada al gen tetK (Figura 17). Este gen se ha encontrado, slo o junto
con tetM, en aislamientos clnicos espaoles (Laplana et al., 2007). El linaje CC398 est
asociado a altos porcentajes de resistencia a tetraciclina, debido al uso indiscriminado de este
antibitico en ganadera porcina (MARAN, 2007; DANMAP, 2008; Broens et al., 2011).
Todos los aislamientos CC398 analizados en esta Tesis doctoral posean el gen tetM y el
91,4% fue positivo para uno o dos genes ms de resistencia a tetraciclinas (tetK y/o tetL), lo
que muestra la extensin de esta resistencia en CC398. En general, se han descrito muy pocos
aislamientos de este complejo clonal que carecen del gen tetM (Kadlec et al., 2009; Kadlec y
Schwarz, 2009a; Lozano et al., 2011b; Lozano et al., 2011c).

La resistencia a trimetoprima tambin fue alta en CC398, asocindose en la


mayora de los casos a la presencia de los genes dfrG y dfrK como en otras series de este
clon (Kadlec et al., 2009; Fesler et al., 2010; Lozano et al., 2011c). El dfrK se ha
localizado en un plsmido junto con tetL (Kadlec y Schwarz, 2009a) y, de hecho, el 86%
de los aislamientos positivos para dfrK en la poblacin analizada fueron tambin positivos
para tetL.
Un aislamiento procedente de un manipulador de alimentos fue positivo para el gen
mupA (Patel et al., 2009), asociado a la alta resistencia a mupirocina que dicho aislamiento
posee (CMI: 1250g/ml). El resto de aislamientos resistentes a mupirocina de portadores
sanos y alimentos/manipuladores fueron negativos para mupA y presentaron resistencia de
bajo nivel o intermedia (CMI inferiores a 256 g/ml) que se asocian a mutaciones en el gen
ileS.
Por ltimo, en la poblacin de portadores sanos se demostr la localizacin en
plsmidos de varios genes de resistencia (Artculo 6). La extraccin de DNA plasmdico y su
digestin con HindIII revel 53 perfiles distribuidos entre el 77,5% de los aislamientos. De
los 53 perfiles, 40 (que incluyen el 64,9% de los aislamientos) se asociaron a plsmidos de
resistencia mediante experimentos de hibridacin. Los genes blaZ, blaZ::Tn552, aacA-aphD,
194

4. Discusin

aphA-3, ermC, mrsA, msrB, y tetK hibridaron en estos perfiles en el 36.8%, 68.4%, 66.7%,
18.5%, 85%, 20%, 72.7% y 92.3% de los aislamientos positivos para cada uno de los genes
indicados. Los genes blaZ, blaZ::Tn552, aacA-aphD, aphA-3, y tetK se han descrito tanto en
plsmidos como en el cromosoma (ver apartado 1.4.2.). Sin embargo los genes ermC, msrA
y msrB se localizan generalmente en plsmidos, aunque se han descrito aislamientos con
msrA y ermC de localizacin o posible localizacin cromosmica (Wondrack et al., 1996;
Tenover et al., 2006). Cabe destacar que muchos perfiles plasmdicos fueron similares en
aislamientos de distintos linajes, siendo la mayora de ellos portadores de blaZ (pR1 en CC5 y
CC30) o blaZ::Tn552 (pR3 en CC25, CC45 y CC97; pR4 en CC15, CC30 y CC45; pR5 en
CC15 y CC25; pR10 en CC5, CC25 y CC30; pR12 en CC5 y CC59), mientras que otros
conferan resistencia a antibiticos del grupo MLS (pR16 en CC1, CC45 y CC72) o a varios
antimicrobianos (pR26 en CC15 y CC30; pR31 en CC30 y C4C5) (Artculo 6). Este
fenmeno muestra la importancia de los plsmidos en la trasmisin de resistencias, y sugiere
su capacidad de superar la barrera impuesta por el sistema RM Sau1 al intercambio de
informacin gentica entre linajes (Lindsay, 2008).

4.4. Objetivo 4. Caracterizacin molecular del plsmido hibrido de virulenciaresistencia pUO-Sa-SED3.


En 2005 nuestro grupo de investigacin estableci la existencia de tres tipos de
plsmidos portadores de genes para las toxinas sed-seljser (pUO-Sa-SED1, pUO-Sa-SED2 y
pUO-Sa-SED3, de 33, 36 y 53.5 kb, respectivamante) en aislamientos procedentes de
alimentos procesados manualmente, en concreto pasteles (Fueyo et al., 2005a). Los plsmidos
pUO-Sa-SED1 y pUO-Sa-SED2 contenan las toxinas sed, selj y ser y presentaban tamaos y
perfiles similares a pIB485 (27,6 kb; Bayles y Iandolo, 1989; Zhang et al., 1998; Fueyo et al.,
2005a), hecho que se confirm mediante mapeo por PCR (Artculo 8).
Utilizando
la
herramienta
BLAST
(Basic
Local
Alignment
Tool;
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) se encontraron en bases de datos varios plsmidos de tipo
pIB485 ya secuenciados [nmeros de acceso: CP002147.1 (Kennedy et al., 2010),
FR714929.1 (Lindqvist y colaboradores, no publicado), GQ900377.1, GQ900398.1,
GQ900406.1, GQ900416.1, GQ900426.1, GQ900447.1 (Summers y colaboradores, no
publicado)]. Todos ellos muestran una organizacin comn, diferencindose slo por la
duplicacin o delecin de algunos genes (Figura 18). Todos los plsmidos secuenciados y/o
caracterizados de tipo pIB485 poseen un opern de resistencia al cadmio (genes cadD y
cadX) y en la mayora tambin se encuentra el opern blaZ-blaRI-blaI de resistencia a lactmicos.
En S. aureus existen tres grandes grupos de plsmidos de multirresitencia: la familia
pSK1, los plsmidos conjugativos de tipo pSK41 y los plsmidos de resistencia a lactmicos y metales pesados (Firth et al., 2000). Mediante BLAST, comprobamos que las
secuencias del gen de replicacin repA que poseen los plsmidos relacionados con pIB485
son similares a las de plsmidos conjugativos de tipo pSK41 y a las de plsmidos de
195

4. Discusin

resistencia a -lactmicos y metales pesados (Weaver et al., 2009), por lo que podran
considerarse miembros de esta ltima familia, dada la presencia de los genes bla y cad. Sin
embargo, como tambin contienen genes de enterotoxinas (sed, selj y ser) se pueden
considerar plsmidos hbridos de virulencia-resistencia. Estos plsmidos portan, adems, el
gen ftsK, que codifica una protena de membrana que se asocia a sistemas de secrecin en
micobacterias (Abdallah et al., 2007). Por otro lado, poseen el gen abiK, que confiere
resistencia a fagos mediante un mecanismo de infeccin abortiva, descrito inicialmente en un
plsmido de Lactococcus lactis (Emond et al., 1997) y posteriormente en pETB de S. aureus
(Yamaguchi et al., 2001). Adems, todos los plsmidos tipo pIB485 secuenciados contienen
i) el gen sin que codifica una resolvasa de la familia de las serina recombinasas (enzimas que
introducen roturas bicatenarias en el ADN y luego intercambian cadenas para promover la
recombinacin), y est presente en muchos plsmidos de multirressitencia de S. aureus
(Mouw et al., 2008); ii) un gen que codifica un regulador transcripcional de tipo MarR,
estando este tipo de reguladores implicados en la expresin de factores de virulencia en S.
aureus (Cheung et al., 2004; Cheung et al., 2008); y iii) un gen que codifica una alcohol
deshidrogenasa, que puede contribuir a resistir el estrs oxidativo dentro de macrfagos. Este
fenmeno es destacable, ya que recientemente se ha descrito que el etanol, adems de inducir
la respuesta frente estrs oxidativo, afecta a la expresin de mltiples toxinas aumentando el
potencial patognico de S. aureus (Korem et al., 2010). La mayora de plsmidos tipo pIB485
secuenciados, tambin contienen el gen bin que codifica una invertasa de la familia de
recombinasas sitio-especificas inicialmente descrita en Tn552 que porta el operon bla
(Rowland y Dyke, 1989).
En esta Tesis se disearon oligonucletidos para la deteccin por PCR de los genes
presentes en plsmidos de tipo pIB485, para determinar la estructura de pUO-Sa-SED1 y
pUO-Sa-SED2 (Anexo I). Como se observa en la Figura 19, ambos presentaron todos los
genes analizados, confirmndose su relacin con pIB485. Por otro lado, la estructura de pUOSa-SED3 se investig no slo mediante PCR sino tambin por clonacin y secuenciacin. As
se confirm que pUO-Sa-SED3 comparte caractersticas con los plsmidos de tipo pIB485 (el
gen repA, cadD, sin y los genes que codifican MarR y la alcohol deshidrogenasa), pero que,
de acuerdo con su mayor tamao contiene varias inserciones de ADN adicional (Artculo 8).
Destaca la adquisicin del opern mer (de resistencia a mercurio), posiblemente a partir de un
plsmido de S. epidermidis [nmero de acceso: GQ900452.1 (Summers y colaboradores, no
publicado)], as como la presencia de genes de resistencia a macrolidos (msrA y mphC que
codifican una bomba de expulsin y una macrlido fosfotransferasa que inactiva al
antibitico, respectivamente). Adems, se ha podido determinar que el gen ser, presente en
otros plsmidos de tipo pIB485, se encuentra truncado por la insercin de un elemento
cromosmico que contiene genes para una lipoprotena, traG y ftsK. Este hecho es
interesante, ya que los productos de traG y ftsK actan como un sistema de translocacin
bipartito en un plsmido de E. coli (Gunton et al., 2007), mientras que la protena FtsK
presenta homologa con un sistema de secrecin de tipo VII (el sistema Esx) de

196

4. Discusin

micobacterias, implicado en virulencia (Abdallah et al., 2007). Un estudio posterior demostr


que el sistema Esx est presente en S. aureus y es esencial para la patognesis de la cepa S.
aureus Newman (Bust et al., 2005). Adems, ftsK y traG estn presentes en el genoma de una
cepa de S. aureus utilizada como modelo de comensal, pero no en cepas no comensales, por
lo que se sugiri un papel de los productos de estos genes en la persistencia del estado de
portador (Sivaraman et al., 2008).
A. Plsmidos tipo pIB485
p19321-P03 (27.4Kb)
pLUH02 (27.2 Kb)
pSK67 (27.4Kb)
pWBG744 (27.3Kb)
SAP012A (27.3Kb)
SAP048A (27.3Kb)
SAP074A (27.3Kb)
SAP060A (22.9Kb)

B. Plsmidos tipo pF5


pF5 (?Kb)

SAP047A (28.9Kb)

otros genes

gen es de enterotoxinas

genes de resistencia

gen de un regulador transcripcional MarR-like

genes para biosntesis de lantibitico

genes de protenas de replicacin

gen de una alcohol deshidrogenasa

gen de un transportador ABC

genes de recombinasas

600-800 nt

Figura 18. Organizacin gentica de los plsmidos sed-seljser secuenciados. Los plsmidos
secuenciados estn depositados en bases de datos con los siguientes nmeros de acceso: p19321-P03
(CP002147.1). pIB485 (AF053140.1 y M94872.1), pF5 (AB075606.1 y AB330135.1) pLUH02
(FR714929.1), pSK67 (GQ900447.1), pWBG744 (GQ900398.1), SAP012A (GQ900377.1), SAP047A
(GQ900405.1), SAP048A (GQ900406.1), SAP074A (GQ900426.1).

Los diferentes plsmidos de tipo pIB485 no slo son interesantes por las funciones de
resistencia y virulencia que aportan, sino tambin desde un punto de vista evolutivo. Como ya
se ha indicado, posiblemente proceden de plsmidos de resistencia a -lactmicos y metales
pesados que han adquirido genes para enterotoxinas. Estos plsmidos presentan una
organizacin comn, pero han ido evolucionando y dando lugar a nuevas variantes por
adquisicin y/o prdida de determinantes de resistencia y virulencia. Los resultados de este
trabajo sugieren la presencia de estos plsmidos en S. aureus de distinto origen y
pertenecientes a CCs, sugiriendo que son capaces de superar las barreras que limitan el
intercambio de informacin gentica entre linajes.

197

4. Discusin
A. Comparacin con plsmidos tipo pIB485
SAP048A (27.3Kb)
repA-Fw3

2156 pb
cad-Fw2

blaZ-Fw2

cad-Rv2
2485 pb

1219 pb

ftsK-Rv
1560 pb

AD-Fw2
blaRI-Rv2
966 pb
bin-Fw
sin-Rv

1458 pb

ser-Rv2

868 pb
1016 pb
ser-Fw
selj-Rv
blaI-Rv
abiK-Rv2 blaRI-Fw
1876 pb
1115 pb
sin-Fw
MarR-Rv
abiK-Fw
blaZ-Rv2
1411 pb
935 pb
blaI-Fw
bin-Rv
selj-Fw2
sed-Rv2
908 pb
MarR-Fw
AD-Rv

ftsK-Fw

pUO-Sa-SED1

+ +

+ +

+ +

pUO-Sa-SED2

+ +

+ +

+ +

pUO-Sa-SED3

+ +

+ +

pUO-Sa-SED4

+ +

+ +

B. Comparacin con plsmidos tipo pF5


pF5
ses-Fw2

2271 pb
bact-Fw2

bact-Rv2
1387 pb

pUO-Sa-SED1

pUO-Sa-SED2

pUO-Sa-SED3

pUO-Sa-SED4

ABCtranp-Rv2

SAP047A (28.9Kb)
repA-Fw4

4175 pb

selj-Fw

TnaseIS431-Rv
cad-Fw2

1135 pb

TnaseIS431-Rv
1180 pb
TnaseIS431-Fw
blaZ1-Rv2

1379pb

set-Fw

set-Rv

1429 pb

ses-Fw2

ses-Rv
3800 pb

pUO-Sa-SED1

pUO-Sa-SED2

pUO-Sa-SED3

pUO-Sa-SED4

otros genes

gen es de enterotoxinas

genes de resistencia

gen de un regulador transcripcional MarR-like

genes para biosntesis de lantibitico

genes de protenas de replicacin

gen de una alcohol deshidrogenasa

gen de un transportador ABC

genes de recombinasas

ABCtransp-Rv2

600-800 nt

Figura 19. Organizacin gentica de los tres tipos de plsmidos sed-seljser encontrados en
el Principado de Asturias. Las secuencias de pF5 (AB075606.1 y AB330135.1), SAP047A
(GQ900405.1) y SAP048A (GQ900406.1) se tomaron como modelo para el diseo de PCRs para
determinar la estructura de los distintos plsmidos. Se indican los oligonucletidos de las PCR de
anclaje (Anexo I), as como el tamao esperado de los amplicones en cada caso. +, amplificacin
positiva, -, amplificacin negativa.

En el 2008, se estableci la existencia de otro tipo de plsmidos, denominados pF5,


que carecan de sed pero contenan selj y ser junto con otros dos genes: ses y set que
codifican nuevas enterotoxinas (Ono et al., 2008). La secuencia de uno de ellos [nmero de
acceso: GQ900405.1 (Summers y colaboradores, no publicado)] revel la presencia de los
operones de resistencia cad y bla, los genes de las toxinas selj y ser, los genes de las
recombinasas sin y bin, el gen del posible regulador de tipo MarR y el gen para la alcohol
deshidrogenasa (Figura 18). Sin embargo, el plsmido pF5 secuenciado se diferencia de los
plsmidos de tipo pIB485, no slo por poseer ser y set, sino tambin porque el gen repA es
198

4. Discusin

ms similar al de plsmidos de S. epidermidis, como el pSERP, que a su vez se agrupan con


plsmidos no conjugativos de tipo pSK1 (Weaver et al., 2009). Adems, pF5 posee un gen
que codifica un transportador de tipo ABC, transportadores que en S. aureus estn
generalmente relacionados con resistencia a antimicrobianos (Otto y Gtz, 2001). El pF5
original, descrito por Ono et al. (2008), ha sido parcialmente secuenciado, detectndose en l
adems de los genes que codifican las enterotoxinas, MarR y la alcohol deshidrogenasa,
genes relacionados con la produccin de bacteriocinas. El plsmido de tipo pF5, denominado
a partir de aqu pUO-Sa-SED4, y encontrado en un aislamiento del HMN, fue tambin
caracterizado mediante PCR, demostrndose que su estructura es similar a la de los plsmidos
de esta familia (Figura 19).

4. 5. Consideraciones generales
Los procesos de recombinacin y mutacin son las fuerzas que inducen a la
diversificacin de clones bacterianos. En las poblaciones de tipo clonal en las que la
diversidad gentica es debida principalmente a procesos de mutacin, se muestran
asociaciones entre los alelos de los diversos loci (desequilibrio de ligamiento). Sin embargo,
en las poblaciones donde predominan los fenmenos de recombinacin se detectan bajos
niveles de asociacin entre alelos de los diferentes loci (equilibrio de ligamiento) (Spratt et
al., 2001). La estructura poblacional de S. aureus se describe como altamente clonal, y esto se
ha relacionado con las diferencias existentes en el sistema RM Sau1, que limita el
intercambio gentico entre aislamientos de distintos linajes, pero no entre miembros de un
mismo linaje (Waldron y Lindsay, 2006; Lindsay, 2008). Sin embargo, estudios recientes
apoyan la existencia de tasas de recombinacin entre linajes superiores a las que se asuman
anteriormente, hecho que podra facilitar la emergencia de clones ms virulentos (BasicHammer et al., 2010). En esta lnea, los estudios con SNPs sugieren que la introduccin de
elementos SCCmec en cepas MSSA ocurren con una frecuencia ms elevada que la estimada
previamente (Nbel et al., 2008; Smyth et al., 2010). Los resultados del presente trabajo
apoyan esta idea, ya que aunque se han detectado factores de virulencia y resistencia muy
vinculados a determinados linajes, generalmente aparecen en varios CCs. Estos fenmenos
potenciaran la generacin de bacterias ms patgenas y resistentes, incluso imbatibles con el
arsenal teraputico actual. Por tanto, la identificacin de los linajes que estn circulando en
una regin, no slo en hospitales sino tambin en la comunidad, y de los determinantes de
resistencia y virulencia que portan, son importantes ya que pueden ayudar a establecer
mejores estrategias para el control de este verstil patgeno.

199

4. Discusin

200

5.Conclusiones

5. Conclusiones
1. La aplicacin de distintas tcnicas de tipificacin molecular: macrorrestriccin genmica
con SmaI seguida de electroforesis en campo pulsante (PFGE), secuenciacin del gen de la protena A
(spa), secuenciacin de multiples loci (MLST) y amplificacin por PCR de los genes sau1hsdS1 y
sau1hsdS2 del sistema de restriccin-modificacin Sau1, permiti establecer la estructura poblacional
de los aislamientos de Staphylococcus aureus que han estado circulando en el Principado de Asturias
(PA), tanto en hospitales como en la comunidad.
2. Se detectaron quince linajes o complejos clonales (CCs): CC1, CC5, CC8, CC9, CC12,
CC15, CC22, CC25, CC30, CC45, CC59, CC72, CC88, CC97, CC121, la mayora presentes, aunque
en proporciones variables, en todas las poblaciones analizadas. Estas incluyeron aislamientos de dos
hospitales: Hospital Universitario Central de Asturias y Hospital Monte Naranco; de portadores sanos,
de alimentos y manipuladores de alimentos. En todos los casos, CC5, CC30 y CC45 fueron linajes ms
frecuentes, poniendo de manifiesto su xito en diferentes ambientes.
3. La tipificacin molecular demostr el intercambio de aislamientos entre el medio
hospitalario y la comunidad. Esto se puso de manifiesto, por ejemplo, mediante la tcnica SmaI-PFGE,
que fue altamente discriminativa y mostr una elevada correlacin con las tipificaciones spa y MLST.
4. En las poblaciones analizadas la mayor parte de los linajes se asoci con un tipo concreto
del sistema agr regulador de virulencia. Sin embargo, se encontraron excepciones que apoyan la
existencia de intercambio gentico entre linajes, lo que podra introducir variaciones en la expresin de
las funciones de virulencia.
5. Todas las poblaciones del PA estudiadas presentaron altos porcentajes de genes de
hemolisinas, lukED, genes sea, sec y de los clsters egc1 y egc2 de enterotoxinas. Los genes de
exfoliatinas y de la leucotoxina Panto-Valentine fueron ms frecuentes en aislamientos clnicos que en
aislamientos comunitarios.
6. La combinacin de genes de virulencia y marcadores de distintos elementos genticos
mviles (EGMs) revel la presencia de distintos tipos de isla genmica Sa, de islas de patogenicidad
(SaPIs), de profagos y de plsmidos en los aislamientos del PA, y apoy la existencia de nuevas islas o
variantes que pudieron surgir por procesos de delecin y/o recombinacin.
7. Algunos genes y/o EGMs fueron ms frecuentes en determinados linajes, destacando las
asociaciones etd-CC25, sep-CC5, tst-CC30, SaPImw2-CC45, SaPI3-CC59, Sa I-CC5 y CC15, Sa
III-CC30 y CC121. Sin embargo, la amplia dispersin de determinantes de virulencia entre los
aislamientos analizados indica la existencia de fenmenos de transferencia horizontal, no slo dentro
de un mismo linaje sino tambin entre linajes.
8. Todas las poblaciones del PA presentaron altos porcentajes de resistencia a ampicilinapenicilina, kanamicina, eritromicina y clindamicina, pero la multirresistencia fue ms frecuente en los
aislamientos nosocomiales que en los comunitarios (44 y 2,5%, respectivamente). Adems, los
aislamientos CC5 y CC8 de procedencia hospitalaria mostraron elevados porcentajes de resistencia a
gentamicina y ciprofloxacina.
9. La frecuencia total de aislamientos de S. aureus resistentes a meticilina (MRSA) fue del
15,4%, siendo la mayora de origen hospitalario (95,9%). Los restantes se hallaron en muestras de
manipuladores de alimentos (4,1%).
10. En las poblaciones del PA se identificaron 15 clones MRSA, siendo tres ellos: ST14SCCmec V, ST125-SCCmec III y ST125-SCCmec V, de nueva descripcin. Los clones MRSA ms
frecuentes fueron el Peditrico (ST5, SCCmec IV) y el ST125-SCCmec IV, coincidiendo con lo
descrito en Espaa durante el periodo de estudio.
201

5. Conclusiones
11. En S. aureus de origen comunitario destaca el elevado porcentaje del gen aphA (24,3%),
que confiere resistencia a kanamicina, en aislamientos de portadores sanos y la redundancia de genes
de resistencia a antimicrobianos del grupo MLS en poblaciones procedentes de portadores sanos,
alimentos y manipuladores de alimentos.
12. En todas las poblaciones se encontraron aislamientos resistentes a mupirocina, el
antibitico de eleccin para la erradicacin del estado de portador. La resistencia a mupirocina fue de
nivel bajo (65,2%), intermedio (8,3%) o alto (25%).
13. El 64,9% de los aislamientos presentaron plsmidos de resistencia, muchos de ellos
compartidos por distintos linajes. Mediante experimentos de hibridacin se comprob la localizacin
plasmdica de la mayora de los determinantes de resistencia encontrados en S. aureus de portadores
sanos.
14. Los plsmidos hbridos de virulencia-resistencia pUO-Sa-SED constituyen un ejemplo de
evolucin bacteriana y plasmdica, destacando pUO-Sa-SED3 que contiene, no slo genes de
virulencia y resistencia, sino tambin genes implicados en colonizacin y procesos de conjugacin.
Estos ltimos facilitaran la persistencia de la bacteria en el hospedador y la dispersin del plsmido
entre bacterias. La co-seleccin de las distintas funciones codificadas por el mismo EGM constituye
un importante problema de salud pblica.
15. La sustitucin del enzima de restriccin SmaI por el isosquizmero Cfr9I permiti la
tipificacin del clon ST398 (CC398) mediante PFGE. A pesar de su reciente emergencia, la
tipificacin Cfr9I-PFGE puso de manifiesto la existencia de variabilidad intra-clon, asociada al tipo de
SCCmec. Una C5-citosina-metiltransferasa es responsable de la resistencia del genoma de ST398 a la
digestin por SmaI.
16. La mayora de los aislamientos MRSA del CC398 contienen SCCmec V y ms de la mitad
fueron multiresistentes. Destaca la redundancia de genes de resistencia a antibiticos del grupo MLS y
tetraciclina y la presencia de genes de resistencia a aminoglicsidos en cepas susceptibles.
17. Por el momento, el potencial toxignico del CC398 es muy limitado. De 30 genes de
virulencia analizados slo se detect el gen de la enterotoxina SEB en dos aislamientos.

202

5. Conclusiones
1. The application of different molecular typing techniques: genomic macrorestriction with
SmaI followed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), protein A gene (spa) sequencing, multi
locus sequence typing (MLST), and PCR amplification of the sau1hsdS1 and sau1hsdS2 genes of the
SauI restriction-modification system; established the population structure of Staphylococcus aureus
isolates that have been circulating in the Principality of Asturias (PA), both in hospital and community
settings.
2. Fifteen lineages or clonal complexes (CCs): CC1, CC5, CC8, CC9, CC12, CC15, CC22,
CC25, CC30, CC45, CC59, CC72, CC88, CC97, CC121, were detected. The majority were found at
different frequencies in all populations, which included isolates from two hospitals: Hospital
Universitario Central de Asturias and Monte Naranco Hospital; healthy carriers, foodstuffs and food
handlers. CC5, CC30 and CC45 were the most frequent lineages in all samples, indicating their
success in different environments.
3. Molecular typing of the isolates demonstrated the exchange of strains between hospital and
community settings. This was for instance revealed by the SmaI-PFGE technique, which was highly
discriminative and showed a good correlation with spa and MLST typing.
4. Most lineages were associated with a certain type of agr virulence regulatory system.
However, exceptions were found and were consistent with a possible exchange of genetic information
between lineages, which can lead to changes the expression patterns of virulence determinants.
5. All the PA populations had high percentages of haemolysin genes, lukED, sea and sec
genes, and the egc1 and egc2 clusters of enterotoxin genes. Exfoliatin genes and the Panto-Valentine
leukotoxin gene were more frequently found in clinical than in community isolates.
6. Combinations of virulence factors and markers of different mobile genetic elements
(MGEs) supported the presence of different types of the Sa genomic island, pathogencity islands
(SaPIs), prophages and plasmids in PA isolates. However, the existence of new islands or variants,
which could have originated through deletion and/or recombination events, was also possible.
7. Some genes and/or MGEs were more frequent in certain lineages, as: etd-CC25, sep-CC5,
tst-CC30, SaPImw2-CC45, SaPI3-CC59, Sa I-CC5 and CC15, Sa III-CC30 and CC121.
However, the wide dispersion of virulence determinants among the analysed isolates indicates the
existence of horizontal transfer events that contribute to their spread within and between lineages.
8. All the PA populations showed high rates of resistance to ampicillin, penicillin, kanamycin,
erythromycin and clindamycin, but multidrug resistance was more common in hospitals than in
community populations (percentages of 44 and 2.5%, respectively). In addition, the frequency of
gentamicin and ciprofloxacin was high in CC5 and CC8 isolates from nosocomial settings.
9. The overall frequency of methicillin resistant S. aureus (MRSA) was 15.4%, being the
majority from hospital origin (95.9%). The remaining MRSA were recovered from food handlers
(4.1%).
10. Fifteen MRSA clones were identified in the PA populations, and three were of new
description (ST14-SCCmec V, ST125-SCCmec III and ST125-SCCmec V). The most common MRSA
clones were the Pediatric clone (ST5, SCCmec IV) and ST125-SCCmec IV, which have also been the
most frequent MRSA clones in Spain during the period of study.
11. With regard to community isolates, the high percentage of the aphA gene (24.3%), which
confers resistance to kanamycin, in S. aureus from healthy carriers, and the redundancy of MLS
resistance gene in S. aureus from healthy carriers, foodstuffs and food handlers, is significant.

203

5. Conclusiones
12. Mupirocin resistant isolates were detected in all populations, being the antibiotic of choice
for the eradication of carrier state. Mupirocin resistance was low (65.2%), intermediate (8.3%) or high
(25%). In one isolate from a food handler, which showed high level of resistance, the mupA
responsible for such resistance was detected.
13. 64.9% of the isolates carried resistance plasmids, many of them shared by different
lineages. Hybridization experiments demonstrated the plasmid location of most resistance
determinants detected in healthy carrier isolates.
14. The pUO-Sa-SED resistance-virulence hybrid plasmids constitute an example of bacterial
and plasmid evolution. pUO-Sa-SED3 is particularly interesting, since it does not only contain
resistance and virulence genes, but also genes involved in colonization and conjugation processes. The
latter could facilitate persistence of the bacteria in their host, and spread of the plasmid dispersion
between bacteria. Co-selection of different functions encoded by the same EGM represents a major
problem of public health.
15. Replacement of SmaI restriction enzyme for its Cfr9I isoesquizomer allowed the typing of
CC398 by PFGE. Although CC398 is an emergent lineage, typing by Cfr9I-PFGE showed internal
variation that was linked to SCCmec type. A C5-cytosine-methyltransferase is responsible for the
resistance of CC398 genome to SmaI digestion.
16. Most CC398 MRSA isolates contained SCCmec V, and more than a half were
multiresistant. Redundancy of MLS and tetracycline resistance genes and the presence of
aminoglycoside resistance genes in susceptible strains must be highlighted.
17. Nowadays, the toxigenic potential of CC398 is very limited. From 30 virulence genes
analysed, only SEB enterotoxin gene was detected in two isolates.

204

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219

6. Bibliografa

220

Anexos

7. Anexos

ANEXO I. Oligonucletidos utilizados en este trabajo.

Tabla Ia. Oligonucletidos utilizados para la identificacin de complejos clnales (RM test).
CC
identificado

Cebador

CC1

AF

AGGGTTTGAAGGCGAATGGG

AR1

GGGTTGCTCCTTGCATCATA

CC5
CC5

Secuencia 5 3

BF

CCCAAAGGTGGAAGTGAAAA

BR8

CCAGTTGCACCATAGTAAGGGTA

AF

AGGGTTTGAAGGCGAATGGG

AR5

GATTTCTTGCACCCTCAACTGC

BF

CCCAAAGGTGGAAGTGAAAA

BR5

TCGTCCGACTTTTGAAGATTG

CC8

BF

CCCAAAGGTGGAAGTGAAAA

BR8

CCAGTTGCACCATAGTAAGGGTA

CC22

AF

AGGGTTTGAAGGCGAATGGG

AR22

TCAGAGCTCAACAATGATGC

CC30
CC45

AF

AGGGTTTGAAGGCGAATGGG

AR30

CAACAGAATAATTTTTTAGTTC

AF

AGGGTTTGAAGGCGAATGGG

AR45

GGAGCATTATCTGGTGTTTTCC

Tamao
amplicn (pb)

T
(C)

1037

55

Cockfield et al., 2007

680

55

Cockfield et al., 2007

445

55

Este trabajo (BA000017)

1071

55

Cockfield et al., 2007

680

55

Cockfield et al., 2007

203

55

Cockfield et al., 2007

990

55

Cockfield et al., 2007

722

55

Cockfield et al., 2007

Referencia

Tabla Ib. Oligonucletidos utilizados para la identificacin de tipos spa y secuencias


tipo (ST, MLST).
Gen
spa
arcC
aroE
gplF
gmk
pta
tpi
yquiL

Cebador

Secuencia 5 3

1095F

AGACGATCCTTCGGTGAGC

1517R

GCTTTTGCAATGTCATTTACTG

arcC-Up

TTGATTCACCAGCGCGTATTGTC

arcC-Dn

AGGTATCTGCTTCAATCAGCG

aroE-Up

ATCGGAAATCCTATTTCACATTC

aroE-Dn

GGTGTTGTATTAATAACGATATC

glpF-Up

CTAGGAACTGCAATCTTAATCC

glpF-Dn

TGGTAAAATCGCATGTCCAATTC

gmk-Up

ATCGTTTTATCGGGACCATC

gmk-Dn

TCATTAACTACAACGTAATCGTA

pta-Up

GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG

pta-Dn

GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAA

tpi-Up

TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA

tpi-Dn

TTTGCACCTTCTAACAATTGTAC

yqiL-Up

CAGCATACAGGACACCTATTGGC

yqiL-Dn

CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC

Tamao
amplicn (pb)

T
(C)

422

60

Harsem et al., 2003

456

50

Enright et al., 2000

456

50

Enright et al., 2000

485

50

Enright et al., 2000

429

50

Enright et al., 2000

474

50

Enright et al., 2000

402

50

Enright et al., 2000

516

50

Enright et al., 2000

Referencia

A1

7. Anexos

Tabla Ic. Oligonucletidos utilizados para la caracterizacin de sistemas de restriccin-modificacin.


Gen

Cebador

sau1/hsdS1

sau1/hsdS1-Fw

AATGCATACCTGAAAGAACTTGG

sau1/hsdS1-Rv

GACACTGCGCTTTCACAGTGCC

sau1/hsdS2
spyIM

Secuencia 5 3

sau1/hsdS2-Fw

ATGCATACCTGAAAGAACTTGG

sau1/hsdS2-Rv

CAATTAATAGGTTGTTATCAGG

MetFI

ATGACCTTTGATAGACACATTTTAG

MetR

CTATTTTTTTAGGACGGCTAGTAT

spyIMF

ACTCGTTGCTGGTTTTCCTT

spyIMR

TCCTTTCTCTATTTTGTGGT

ADNpol

dnapF

CCCTTTACTTGTCCGTTTTC

10394.4

dnapR

CCGTTTCATCTTCCGTCA

mefA

mefA-M2F

AGTATCATTAATCACTAGTGC

mefA-M2R

TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG

spyIM

Tamao
amplicn (pb)

T
(C)

1200-1500

52

Sung et al., 2008

1200-1500

52

Sung et al., 2008

1227

58

Euler et al., 2007

275

50

Este trabajo (MGAS10394)

224

55

Este trabajo (MGAS10394)

346

50

Euler et al., 2007

Referencia

Tabla Id. Oligonucletidos utilizados para la identificacin de MRSA.


Gen
ADNr 16S
mecA
nuc

Cebador

Secuencia 5 3

16Sup1

GTGCCAGCAGCCGCGGTAA

16Sup2

AGACCCGGGAACGTATTCAC

mecup1

GGGATCATAGCGTCATTATTC

mecup2

AACGATTGTGACACGATAGCC

nucPCR1

TCAGCAAATGCATCACAAACAG

Tamao
amplicn (pb)

T
(C)

886

55

Poulsen et al., 2003

527

55

Poulsen et al., 2003

255

55

Poulsen et al., 2003

Referencia

nucPCR2 CGTAAATGCACTTGCTTCAGG

Tabla Ie. Oligonucletidos utilizados para la identificacin de los tipos de SCCmec.


Gen
SCCmec I
SCCmec II
SCCmec III
SCCmec IVa
SCCmec IVb
SCCmec IVc
SCCmec IVd
SCCmec V
mecA
mec clase A

A2

Cebador

Secuencia 5 3

Type I-F

GCTTTAAAGAGTGTCGTTACAGG

Type I-R

GTTCTCTCATAGTATGACGTCC

Type II-F

CGTTGAAGATGATGAAGCG

Type II-R

CGAAATCAATGGTTAATGGACC

Type III-F

CCATATTGTGTACGATGCG

Type III-R

CCTTAGTTGTCGTAACAGATCG

Type IVa-F

GCCTTATTCGAAGAAACCG

Type IVa-R

CTACTCTTCTGAAAAGCGTCG

Type IVb-F

TCTGGAATTACTTCAGCTGC

Type IVb-R

AAACAATATTGCTCTCCCTC

Type IVc-F

ACAATATTTGTATTATCGGAGAGC

Type IVc-R

TTGGTATGAGGTATTGCTGG

Type IVd-F

CTCAAAATACGGACCCCAATACA

Type IVd-R

TGCTCCAGTAATTGCTAAAG

Type V-F

GAACATTGTTACTTAAATGAGCG

Type V-R

TGAAAGTTGTACCCTTGACACC

MecA147-F

GTGAAGATATACCAAGTGATT

MecA147-R

ATGCGCTATAGATTGAAAGGAT

mecI-F

CCCTTTTTATACAATCTCGTT

mecI-R

ATATCATCTGCAGAATGGG

Tamao
amplicn (pb)

T
(C)

613

60

Zhang et al., 2005

398

52

Zhang et al., 2005

280

52

Zhang et al., 2005

776

52

Zhang et al., 2005

493

50

Zhang et al., 2005

200

54

Zhang et al., 2005

881

52

Zhang et al., 2005

325

58

Zhang et al., 2005

147

52

Zhang et al., 2005

146

50

Zhang et al., 2005

Referencia

7. Anexos

Tabla Ie (continuacin). Oligonucletidos utilizados para la identificacin de los tipos de SCCmec.


Gen
mec clase B

Cebador

Secuencia 5 3

IS1272-F

TATTTTTGGGTTTCACTCGG

mecR1-R

CTCCACGTTAATTCCATTAATACC

ccr type 1

ccrAB-b2

ATTGCCTTGATAATAGCCITCT

(SCCmec I)

ccrAB-a2

AACCTATATCATCAATCAGTACGT

ccr type 2

ccrAB-b2

ATTGCCTTGATAATAGCCITCT
TAAAGGCATCAATGCACAAACACT

(SCCmec II, IV)

ccrAB-a3

ccr type 3

ccrAB-b2

ATTGCCTTGATAATAGCCITCT

(SCCmec III)

ccrAB-a4

AGCTCAAAAGCAAGCAATAGAAT

ccr type 5

ccrC-F

ATGAATTCAAAGAGCATGGC

(SCCmec V)

ccrC-R

GATTTAGAATTGTCGTGATTGC

ccrB

ccrB F1

CGWYTRGCWMGWAAYACHTC

ccrB R1

CTTTTCGWCKYTTWTCRYTCC

ccrA/B Type 3

mN1

TGGAGAATATGAAGATTACATTCA

(SCCmec III)

mN2

TTTTGACGATGAAGGTCTTCA

ccrC

ccrC-Fw

CGTCTATTACAAGATGTTAAGGATAAT
CCTTTATAGACTGGATTATTCAAAATAT

(SCCmec V)

ccrC-Rv

tnpB-Tn55

mN3

AGTAACGCAACGGGTATGATTA

(SCCmec III)

Tn554(171-146)

TACGGCTTATTCTCCACTTCTATCCT

tnpA

TnpA1016

TGTGATGTAAATTCTATTCCAGT

(SCCmec III)

TnpA636

TGAGATCAAAGGAAGTTAAGCAAATTATTGATG

merA

merA2

TCTTCACAGCCTGTGCATGTCATGCCT

(SCCmec III)

merN

ACGGATTGCTGTACGCCTCCAGA

Tamao
amplicn (pb)

T
(C)

1305

52

Zhang et al., 2005

700

56

Zhang et al., 2005

1000

56

Zhang et al., 2005

1600

56

Zhang et al., 2005

336

52

Zhang et al., 2005

496

42

Oliveira et al., 2008

1958

58

Ito et al., 2001

520

58

Ito et al., 2004

220

58

Ito et al., 2001

402

56

Ito et al., 2001

169

62

Ito et al., 2001

Referencia

Tabla If. Oligonucletidos utilizados para identificacin de determinantes de resistencia.


Grupo
resistencia/Gen

Cebador

Secuencia 5 3

Tamao
amplicn (pb)

T
(C)

701

60

Este trabajo

1360

55

Este trabajo

3151

50

Este trabajo

491

54

Este trabajo

347

58

Schmitz et al., 1999

462

50

Este trabajo

172

52

Schmitz et al., 1999

382

50

Este trabajo

Referencia

-lactamicos
blaZ
p480
p480-blaZ

blaZ-1

ATGTAATTCAAACAGTTCACATGCC

blaZ-2

ATAGGTTCAGATTGGCCCTTAGG

Tn552-1

CTAACTAATTTTTCTGAAGCCAAACG

Tn552-2

TTTAAGTGTTTTCTTCTCTGACTACG

blaZ-3

GAATTACATGCACTTAAAACTAAAGC

Tn552-3

AAAAATTAGTTAGATACTTCTCCTTG

aacA-aphD

aac6-1

GAAGTACGCAGAAGAGA

[aac(6)-Ie+aph(2)]

aac6-2

ACATGGCAAGCTCTAGGA

aac6-aph2-1

CCAAGAGCAATAAGGGCATACC

aac6-aph2-2

CACACTATCATAACCATCACCG

aadD-1

TTGGTCGTCAGACTGATGGGCCC

Aminoglicosidos

aadD (ant(4)-Ia)

aadD-2

CAGTTAAGACCGAAGCGCTCGTCG

ant4-1

CTGCTAAATCGGTAGAAGC

ant4-2

CAGACCAATCAACATGGCACC

aphA

aph3-1

ACAGCCGGTATAAAGGGACCACC

(aph(3)-IIIa)

aph3-2

AAAATCATACAGCTCGCGCGGATC

A3

7. Anexos
Tabla If (continuacin). Oligonucletidos utilizados para identificacin de determinantes de resistencia.
Grupo
resistencia/Gen

Cebador

Secuencia 5 3

Tamao
amplicn (pb)

T
(C)

268

58

Schmitz et al., 1999

564

60

Este trabajo

480

50

Este trabajo

269

50

Este trabajo

269

50

Este trabajo

472

50

Este trabajo

464

50

Este trabajo

1272

50

Kehrenberg y Schwarz, 2005

499

54

Este trabajo

139

55

Martineau et al., 2000

347

54

Este trabajo

142

55

Martineau et al., 2000

295

54

Lina et al., 1999

190

55

Martineau et al., 2000

985

54

Este trabajo

163

55

Martineau et al., 2000

595

62

Lina et al., 1999

323

78

Lina et al., 1999

614

50

Werner et al., 2001

600

50

Werner et al., 2001

573

50

Werner et al., 2001

659

55

Werner et al., 2001

579

50

Werner et al., 2001

Referencia

Aminoglicosidos
aphA

2aph3-1

CTGATCGAAAAATACCGCTGC

(aph(3)-IIIa)

2aph3-2

TCATACTCTTCCGAGCAAAGG

aadE

aadE-1

AGTTAGATAATTACCTAAAGGGCG

aadE-2

ATATCAGCGGCATATGTGCTATCC

Psat1

GCAGAGCACCTGAAAGATATCG

Psat2

GCGTATAACATAGTATCGACGG

cat-1

TGGAAGTTGTAATAAAAATAAAGTG

psat4
Fenicoles
cat (pC221)
cat (pC221)
cat (pC194)
cat (pC223)
fexA

cat-2

CAATCCAAGGAATCATTGAAATCGG

cat-1Fw 2

TGGAAGTTGTAAATAAAAATAAAGTG

cat-2

CAATCCAAGGAATCATTGAAATCGG

cat-3

CAAGGGTGATAAACTCAAATACAGC

cat-4

AAAGCCAGTCATTAGGCCTATCTG

cat-5

AGGATATGAACTGTATCCTGCTTTG

cat-6

AATAATGAAACATGGTAACCATCAC

fex-A-fw

GTACTTGTAGGTGCAATTACGGCTGA

fexA-rv

CGCATCTGAGTAGGACATAGCGTC

ermA-1

CCAGAAAAACCCTAAAGACACGC

ermA-2

TGTCTCAGATGTGAACCGAATCC

MLS
ermA

ermB

ermC

msrA

msrB
linA/linA
vatA
vatB
vatC

ermA Fw

TATCTTATCGTTGAGAAGGGATT

ermA Rv

CTACACTTGGCTTAGGATGAAA

ermB-3

GCCATGCGTCTGACATCTATCT

ermB-4

ACAATACTTGCTCATAAGTAACGG

ermB Fw

CTATCTGATTGTTGAAGAAGGATT

ermB Rv

GTTTACTCTTGGTTTAGGATGAAA

ermC-1

AATCGTCAATTCCTGCATGT

ermC-2

TAATCGTGGAATACGGGTTTG

ermC Fw

CTTGTTGATCACGATAATTTCC

ermC Rv

ATCTTTTAGCAAACCCGTATTC

msrA-1

CTCCATATACCTATGCATACAACC

msrA-2

CTAACGATAATTTCGTTCTTTCCCC

msrA Fw

TCCAATCATTGCACAAAATC

msrA Rv

AATTCCCTCTATTTGGTGGT

msrB-Fw

TATGATATCCATAATAATTATCCAATC

msrB-Rv

AAGTTATATCATGAATAGATTGTCCTGTT

linA/linA-Fw

GGTGGCTGGGGGGTAGATGTATTAACTGG

linA/linA-Rv

GCTTCTTTTGAAATACATGGTATTTTTCGATC

vatA1

CAATGACCATGGACCTGATC

vatA2

AGCATTTCGATATCTCC

vatB1

CCTGATCCAAATAGCATATATCC

vatB2

CTAAATCAGAGCTACAAAGTG

vatC1

TGGCAAAATCAGCAAGG

vatC2

TCGTCTCTATCTCTAGGTCC

vgaA

vgaA1

AGTGGTGGTGAAGTAACACG

vgaA2

CTTGTCTCCTCCGCGAATAC

vgaB

vgaB1

TCTCTCAATTAGAAGAACC

vgaB2

TTATCTATTCGTGTTTCC

A4

7. Anexos

Tabla If (continuacin). Oligonucletidos utilizados para identificacin de determinantes de resistencia.


Grupo
resistencia/Gen

Cebador

Secuencia 5 3

Tamao
amplicn (pb)

T
(C)

885

50

Este trabajo

427

55

Werner et al., 2001

728

50

Werner et al., 2001

778

54

Este trabajo

746

48

Kehrenberg y Schwarz, 2005

360

58

Strommenger et al., 2003

169

55

Ng et al., 2001

319

54

Este trabajo

406

55

Ng et al., 2001

781

54

Huys et al., 2005

515

55

Ng et al., 2001

267

55

Ng et al., 2001

602

50

Horii et al., 2003

Referencia

MLS
vgaC
vgbA
vgbB

vgaC1

AGCTGGAGAAAGCAATCCAA

vgaC2

TCTTGCTGAAAATCCCGTTC

vgbA1

CCAGATTCAGCACCCTACG

vgbA2

CCCCCCATTCAGTAAACC

vgbB1

CAGCAGTCTAGATCAGAGTGG

vgbB2

CATACGGATCCATCTTTTCC

MUP-1

GGTGACTCCTTATTGTACACATG

MUP-2

AGAAATTTCCCATTCTCCCTTCC

Mupirocina
mupA

Fenicoles, estreptograminas A, lincosamidas, oxazolidinonas


cfr

cfr-fw

TGAAGTATAAAGCAGGTTGGGAGTCA

cfr-rv

ACCATATAATTGACCACAAGCAGC

tetK-1

GTAGCGACAATAGGTAATAGT

tetK-2

GTAGTGACAATAAACCTCCTA

Tetraciclinas
tetK

tetM

tetO

tetL

tet(K) Fw

TCGATAGGAACAGCAGTA

tet(K) Rv

CAGCAGATCCTACTCCTT

tetM-1

AATATAGGGATTGATAACCTTATAGAAG

tetM-2

TATCTCCAAGAACACTATTTAACTTC

tet(M) Fw

GTGGACAAAGGTACAACGAG

tet(M) Rv

CGGTAAAGT TCG TCACACAC

TetO-Fw1

AATGAAGATTCCGACAATTT

TetO-Rv1

CTCATGCGTTGTAGTATTCCA

tet(O) Fw

AACTTAGGCATTCTGGCTCAC

tet(O) Rv

TCCCACTGT TCCATATCGTCA

tet(L) Fw

TCGTTAGCGTGCTGTCATTC

tet(L) Rv

GTATCCCACCAATGTAGCCG

grlA-Fw2

GATGAGGAGGAAATCTAG

grlA-Rv

TTAGGAAATCTTGATGGCAA

Quinolonas
grlA (parC)
grlB (parE)
gyrA
gyrB
norA (Promotor)

grlB-Fw

GACAATTGTCTAAATCACTTGTG

grlB-Rv

CATCAGTCATAATAATTACAC

gyrA-Fw

GCGATGAGTGTTATCGTTGCT

gyrA-Rv

CAGGACCTTCAATATCCTCC

gyrB-Fw

CAGCGTTAGATGTAGCAAGC

gyrB-Rv

CGATTTTGTGATATCTTGCTTTCG

PnorA-1

TTCTTCGTATTGTTTCGTTG

PnorA-2

TTTGCTCTATGTTGCTTTTC

dfrS1-Fw

CACTTGTAATGGCACGGAAA

dfrS1-Rv

CGAATGTGTATGGTGGAAAG

dfrD-Fw

CCCTGCTATTAAAGCACC

dfrD-Rv

CATGACCAGATAACTC

Schmitz et al., 1998


384

50

Horii et al., 2003

554

56

Horii et al., 2003

267

56

Horii et al., 2003

1535

50

Horii et al., 2003

270

55

Este trabajo

606

55

Dale et al., 1995

405

55

Este trabajo

229

50

Este trabajo

Diaminopirimidinas
dfrS1
dfrD
dfrG
dfrK

dfrG-Fw

TGCTGCGATGGATAAGAA

dfrG-Rv

TGGGCAAATACCTCATTCC

dfrK-Fw

CAAGAGATAAGGGGTTCAGC

dfrK-Rv

ACAGATACTTCGTTCCACTC

A5

7. Anexos

Tabla If (continuacin). Oligonucletidos utilizados para identificacin de determinantes


de resistencia.
Grupo
resistencia/Gen

Cebador

Secuencia 5 3

Tamao
amplicn (pb)

T
(C)

217

50

Referencia

Biocidas
qacA/B

qacA/B F

ATTCCATTGAGTGCCTTTGC

qacA/B

RTGGCCCTTTCTTTAGGGTTT

Sidhu et al., 2002

Tabla Ig. Oligonucletidos utilizados para identificacin de determinantes de virulencia.


Grupo/Gen

Cebador

Secuencia 5 3

Tamao
amplicn (pb)

T
(C)

209

64

Jarraud et al., 2002

309

60

Jarraud et al., 2002

111

64

Jarraud et al., 2002

535

60

Jarraud et al., 2002

390

64

Jarraud et al., 2002

269

60

Jarraud et al., 2002

780

50

Jarraud et al., 2002

433

70

McClure et al, 2006

741

45C

Yamaguchi et al., 2002

629

50C

Yamaguchi et al., 2002

376

45C

Yamaguchi et al., 2002

481

58

Fueyo et al., 2005b

669

58

Martn et al., 2003

424

60

Martn et al., 2003

315

56

Martn et al., 2003

401

50

Martn et al., 2003

319

68

Becker et al., 1998

Referencia

Hemolisinas
hla (Hl)
hlb (Hl)
hld (Hl)
hlg (Hl)
hlgv (Hl-variante)

HLA-1

CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG

HLA-2

CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT

HLB-1

GTGCACTTACTGACAATAGTGC

HLB-2-2

GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT

HLD-1

AAGAATTTTTATCTTAATTAAGGAAGGAGTG

HLD-2

TTAGTGAATTTGTTCACTGTGTCGA

mpHLG-1

GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA

mpHLG-2

CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG

mpHLG2-1 GACATAGAGTCCATAATGCATTYGT
mpHLG2-2 ATAGTCATTAGGATTAGGTTTCACAAAG

Leucotoxinas
lukED

LUKDE-1

TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG

(LukE-LukD)

LUKDE-2

TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA

lukM

LUKM-1

TGGATGTTACCTATGCAACCTAC

(LukM-LukF'-PV)

LUKM-2

GTTCGTTTCCATATAATGAATCACTAC

lukPV

LukPV-1

ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA

(LukS-PV-LukF-PV)

LukPV-2

GCATCAAGTGTATTGGATAGCAAAAGC

Exfoliatinas
eta

ET-1

CTATTTACTGTAGGAGCTAG

ET-2

ATTTATTTGATGCTCTCTAT

etb

ET-3

ATACACACATTACGGATAAT

ET-4

CAAAGTGTCTCCAAAAGTAT

etd

ET-14

AACTATCATGTATCAAGG

ET-15

CAGAATTTCCCGACTCAG

TST-1

AGCATCTACAAACGATAATATAAAGG

TST-2

CATTGTTATTTTCCAATAACCACCCG

se[adej]-f

AAAGATTTGCGAAAAAAGTGTGAATT

sea-r

TAAATCGTAATTAACCGAAGGTTCTG

TSST-1
tst
Enterotoxinas
sea
seb
sec
sed

A6

se[bc]-f

TATGATGATAATCATGTATCAGCAA

seb-r

CCAAATAGTGACGAGTTAGGTAA

se[bc]-f

TATGATGATAATCATGTATCAGCAA

sec-r

TAAGTACATTTTGTAAGTTCCCATT

se[adej]-f

AAAGATTTGCGAAAAAAGTGTGAATT

sed-r

GAACTTTATCTAAAGAAACTTCT

sed-f3

CTAGTTTGGTAATATCTCCTTTAAACG

sed-r3

TTAATGCTATATCTTATAGGGTAAACATC

7. Anexos

Tabla Ig (continuacin). Oligonucletidos utilizados para identificacin de determinantes de virulencia.


Grupo/Gen

Cebador

Secuencia 5 3

Tamao
amplicn (pb)

T
(C)

239

50

Este trabajo

512

62

Martn et al., 2003

704

50

McLauchlin et al., 2000

495

50

McLauchlin et al., 2000

576

60

Jarraud et al., 2001

648

60

Martn et al., 2003

641

64

Becker et al., 2003

248

50

Este trabajo

278

48

Yaewood et al., 2002

359

60

Fueyo et al., 2005b

473

60

Fueyo et al., 2005b

680

54

Jarraud et al., 2001

722

70

Fueyo et al., 2005b

272

60

Fueyo et al., 2005b

285

48

Yaewood et al., 2002

700

60

Fueyo et al., 2005a

209

52

Este trabajo

Referencia

Enterotoxinas
sed
see
seg

sed-Fw

GCCAATGAAAACATTGATTC

sed-Rv

TGTTGAGCCATTTCTTTTGA

se[adej]-f

AAAGATTTGCGAAAAAAGTGTGAATT

see-r

TTGCACCTTACCGCCAAAGCTG

SEG1

TGCTATCGACACCTACAACC

SEG2

CCAGATTCAAATGCAGAACC

seh

SEH1

CGA AAGCAGAAGATTTACACG

SEH2

GACCTTTACTTATTTCGCTGTC

sei

SEI-3

CTCAAGGTGATATTGGTGTAGG

SEI-4

AAAAAACTTACAGGCAGTCCATCTC

se[adej]-f

AAAGATTTGCGAAAAAAGTGTGAATT

sej-r

ATGCATGTTTTCAGATTCTATGA

sej-f3

CTCCCTGACGTTAACACTACTAATAA

sej
sej

sek
sel
sem

sej-r3

TTGTCTGGATATTGACCTATAACATT

selj-Fw

AACCAACGGTTCTTTTGAGG

selj-Rv

CACTGCATGAAAACAATCAA

SEK-3

ACCGCTCAAGAGATTGAT

SEK-4

TTATATCGTTTCTTTATAAGAA

SEL-1

AATATATAACTAGTGATCTAAAGGG

SEL-2

TATGGAATACTACACACCCCTTATA

SEM-1

ATGCTGTAGATGTATATGGTCTAAG

SEM-2

CGTCCTTATAAGATATTTCTACATC

sen

SEN-1

ATGAGATTGTTCTACATAGCTGCAAT

SEN-2

AACTCTGCTCCCACTGAAC

seo

SEO-1

TGTAGTGTAAACAATGCATATGCAAATG

SEO-2

TTATGTAAATAAATAAACATCAATATGATGTC

sep

SEP-1

TTAGACAAACCTATTATCATAATGG

SEP-2

TATTATCATGTAACGTTACACCGCC

seq

SEQ-1

AAGAGGTAACTGCTCAAG

SEQ-2

TTATTCAGTCTTCTCATATG

ser

SER-1

AAACCAGATCCAAGGCCTGGAG

SER-2

TCACATTTGTAGTCAGGTGAACTT

ser-Fw

CATATACGGGGGCGTTACA

ser-Rv

TCTCATATGCCGACCCATC

seu

PSE-2

TAAAATAAATGGCTCTAAAATTGATGG

141

55

Letertre et al., 2003

set

PSE-6
set-1

ATCCGCTGAAAAATAGCATTGAT
CGGGTGTTACTTCTGTTTGC

162

55

Este trabajo

set-2

ATGTAGATGCTTGGGGACAT
214

55

Este trabajo

ses

ses-1

AATGCAATTTGCCCCATAGT

ses-2

AACTTCATATTCGCAGGACA

A7

7. Anexos
Tabla Ih. Oligonucletidos utilizados para la deteccin de islas de patogenicidad.
Gen
ear

Cebador

Secuencia 5 3

ear-1

ACATTGATAGCAAGTGCTTTAG

ear-2

CTTTYAATTTKTCWGTTAATTTTTTCCATG

bsaB

epiB-1

CATTGTTATTAGTCCTTTAACGGCG

(epiB)

epiB-2

ATTCGTGTCATATTCAAAGAAGGC

splF

splF-1

GTTACTAAGATTGTAGATTATCCTGG

splF-2

CTCTTGTGCTTTCACCTGATGGC

Tamao
amplicn (pb)

T
(C)

374

50

Este trabajo

1200

60

Este trabajo

350

66

Este trabajo

Referencia

Tabla Ii. Oligonucletidos utilizados para identificacin del tipo de sistema de


regulacin agr.
Gen

agrI
agrII

Cebador

agr I-Fw

Secuencia 5 3

CCACTAATTATAGCTGG

agr II-Fw

GTAGAGCCGTATTGATTCC

agr II-Rv

GTATTTCATCTCTTTAAGG

agr III-Rv

T
(C)

Referencia

351

46

Moore y Lindsay, 2001

464

46

Moore y Lindsay, 2001

558

42

Moore y Lindsay, 2001

876

46

Tenover et al., 2006

CACTTATCATCAAAGAGCC

agr I-Rv

agrIII agr III-Fw

Tamao
amplicn (pb)

CTGCATTTATTAGTGGAATACG
GTTTCATTTCTTTAAGAG

agrIV agr IV-Fw

CACTTATCATCAAAGAGC

agr IV-Rv

GTATTTCATCTCTTTAAGG

Tabla Ij. Oligonucletidos utilizados para la caracterizacin de plsmidos pUO-Sa-SED.


Gen
repA
cadD
abiK
blaZ
blaRI
blaI
bin
sin
marR

Cebador

Secuencia 5 3

repA-Fw

CTCGAAGAATTGCCACAACA

repA-Rv

TGCATAGCTTCAACGGTTTC

cad-Fw

AAGTTGTGGCGCCGATAATA

cad-Rv

TTTCTCCAATTCCTGGGATA

abiK-Fw

AGCTACGGTAAATCAGATGC

abiK-Rv

TCTTGCATGAAAAACATCAA

blaZ-Fw

ATAGGTTCAGATTGGCCCTTAGG

blaZ-Rv

ATGTAATTCAAACAGTCCACATGCC

blaRI-Fw

GCCCTTACAGAACGATCACC

blaRI-Rv

ATGGTCAAGTCCAAACATCG

blaI-Fw

GCGATAAAACGATTAGAACA

blaI-Rv

AACTTTTCATGTCCCCTCCA

bin-Fw

CATTGAATTTGCGAGGTCAG

bin-Rv

CTGCAAATGCTGCGAATAAA

sin-Fw

AATGGGAGATCGATTCGTTG

sin-Rv

ACCTTGAGCTTGTCGACGTT

MarR-Fw

TGGCCATAAGTCTTTTGCTT

MarR-Rv

TGGTGTTTTGAATTGCTTGA

Alcohol

AD-Fw

GATGTCGGCGTGACACATAC

Deshidrogenasa

AD-Rv

ACCACCTGTAGCCCCAGAC

Bacteriocina

Bact-Fw

GCCAATCCCGATAAAAACAA

Bact-Rv

AGTCAATCCATCCTTGGTGA

Transportador

ABCtransp-Fw

TCTCTAAGCGGTGGTGAACA

tipo ABC

ABCtransp-Rv

ACATCAAATCGTTTCGCAAG

A8

Tamao
amplicn (pb)

T (C)

217

54

Este trabajo

154

52

Este trabajo

223

50

Este trabajo

701

64

Este trabajo

183

54

Este trabajo

170

50

Este trabajo

199

50

Este trabajo

243

54

Este trabajo

176

50

Este trabajo

198

58

Este trabajo

201

52

Este trabajo

205

52

Este trabajo

Referencia

7. Anexos

Tabla Ij (continuacin). Oligonucletidos utilizados para la caracterizacin de plsmidos pUO-SaSED.


Anclaje

ftsK-abiK
abiK-blaZ
blaZ-blaRI
blaRI-blaI
blaI-bin
bin-sin
sin-marR
marR-AD
AD-ser
ser-selj
selj-sed
selj-set
set-ses
ses-bacteriocina

Cebador

Secuencia 5 3

ftsk-Fw

TGCAATATAGCCAATGTTATAAAACA

abiK-Rv2

GCATCTGATTTACCGTAGCT

abiK-Fw2

TTGATGTTTTTCATGCAAGA

blaZ-Rv2

CCTAAGGGCCAATCTGAACCTAT

blaZ-Fw2

GGCATGTGGACTGTTTGAATTACAT

blaRI-Rv2

GGTGATCGTTCTGTAAGGGC

blaRI-Fw

GCCCTTACAGAACGATCACC

blaI-Rv

AACTTTTCATGTCCCCTCCA

blaI-Fw

GCGATAAAACGATTAGAACA

bin-Rv

CTGCAAATGCTGCGAATAAA

bin-Fw

CATTGAATTTGCGAGGTCAG

sin-Rv

ACCTTGAGCTTGTCGACGTT

sin-Fw

AATGGGAGATCGATTCGTTG

MarR-Rv

TGGTGTTTTGAATTGCTTGA

MarR-Fw

TGGCCATAAGTCTTTTGCTT

AD-Rv

ACCACCTGTAGCCCCAGAC

AD-Fw2

GTCTGGGGCTACAGGTGGT

ser-Rv2

TGTAACGCCCCCGTATATG

ser-Fw

CATATACGGGGGCGTTACA

selj-Rv

CACTGCATGAAAACAATCAA

selj-Fw2

TTGATTGTTTTCATGCAGTG

sed-Rv2

GAATCAATGTTTTCATTGGC

selj-Fw

AACCAACGGTTCTTTTGAGG

set-Rv

ATGTAGATGCTTGGGGACAT

set-Fw

CGGGTGTTACTTCTGTTTGC

ses-Rv

AACTTCATATTCGCAGGACA

ses-Fw2

TGTCCTGCGAATATGAAGTT

Bact-Rv2

TTGTTTTTATCGGGATTGGC

bacteriocina-

Bact-Fw-2

TCACCAAGGATGGATTGACT

transp. ABC

ABCtransp-Rv2

TGTTCACCACCGCTTAGAGA

ses-transp. ABC
repA-cad
repA-TnIS431
cad-TnaseIS431
Tn1S431-blaZ
cad-ftsK

ses-Fw2

TGTCCTGCGAATATGAAGTT

ABCtransp-Rv2

TGTTCACCACCGCTTAGAGA

repA-Fw3

GAAACCGTTGAAGCTATGCA

cad-Rv2

TATTATCGGCGCCACAACTT

repA-Fw4

GGCTATTCAGAGGCGAAAGA

Tn15431-Rv

TTCAACGAAGGTAGCAATGG

cad-Fw2

TATCCCAGGAATTGGAGAAA

Tn1S431-Rv

TTCAACGAAGGTAGCAATGG

Tn1S431-Fw

CATGGCGAAAATCCGTAGAT

blaZ-Rv2

CCTAAGGGCCAATCTGAACCTAT

cad-Fw2

TATCCCAGGAATTGGAGAAA

ftsK-Rv

TGTTTTATAACATTGGCTATATTGCA

Tamao
amplicn
(pb)

T (C)

1560

54

Este trabajo

1876

50

Este trabajo

1219

54

Este trabajo

1016

54

Este trabajo

935

50

Este trabajo

966

54

Este trabajo

1115

50

Este trabajo

908

56

Este trabajo

1458

52

Este trabajo

868

50

Este trabajo

1411

50

Este trabajo

1379

54

Este trabajo

1429

52

Este trabajo

2271

52

Este trabajo

1387

54

Este trabajo

3800

52

Este trabajo

2156

54

Este trabajo

4175

54

Este trabajo

1135

52

Este trabajo

1180

50

Este trabajo

2485

52

Este trabajo

Referencia

A9

7. Anexos
Bibliografa Anexo I:
Becker K, Roth R, Peters G. Rapid and specific detection of toxigenic Staphylococcus aureus: use of two
multiplex PCR enzyme immunoassays for amplification and hybridization of staphylococcal
enterotoxin genes, exfoliative toxin genes, and toxic shock syndrome toxin 1 gene. J Clin
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Becker K, Friedrich AW, Lubritz G, Weilert M, Peters G, von Eiff C. Prevalence of genes encoding
pyrogenic toxin auperantigens and exfoliative toxins among strains of Staphylococcus aureus
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Jarraud S, Peyrat MA, Lim A, Tristan A, Bes B, Mougel C, Etienne J, Vandenesch F, Bonneville M,
Lina G. egc, a highly prevalent operon of enterotoxin gene, forms a putative nursery of
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Kehrenberg C, Schwarz, S. Florfenicol-chloramphenicol exporter gene fexA is part of the novel
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Kehrenberg C, Schwarz, S. Distribution of florfenicol resistance genes fexA and cfr among
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Letertre C, Perelle, S, Dilasser F, Fach, P. Identification of a new putative enterotoxin SEU encoded by
the egc cluster of Staphylococcus aureus. J Appl Microbiol 2003, 95: 38-43.
Lina G, Quaglia A, Reverdy ME, Vandenesch RLF, Etienne J. Distribution of genes encoding
resistance to macrolides, lincosamides, and streptogramins among Staphylococci. Antimicrob
Agents Chemother 1999, 43:1062-1066.

A10

7. Anexos
Martn MC, Gonzlez-Hevia MA, Mendoza, MC. Usefulness of a two-step PCR procedure for detection
and identification of enterotoxigenic staphylococci of bacterial isolates and food samples. Food
Microbiol 2003, 20: 605-610.
Martineau F, Picard FJ, Lansac N, Menard C, Roy PH, Ouellette M, Bergeron MG. Correlation
between the resistance genotype determined by multiplex PCR assays and the antibiotic
susceptibility patterns of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrob
Agents Chemother 2000, 44: 231-238.
McClure JA, Conly JM, Lau V, Elsayed S, Louie T, Hutchins W, Zhang K. 2006. Novel multiplex
PCR assay for detection of the staphylococcal virulence marker Panton-Valentine leukocidin genes
and simultaneous discrimination of methicillin-susceptible from -resistant staphylococci. J Clin
Microbiol 2006, 44: 1141-1144.
McLauchlin J, Narayanan GL, Mithani V, O'Neill G. The detection of enterotoxins and toxic shock
syndrome toxin genes in Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction. J Food Prot 2000,
63:479488.
Moore PCL, Lindsay JA. Genetic variation among hospital isolates of methicillin-sensitive
Staphylococcus aureus: Evidence for horizontal transfer of virulence genes. J Clin Microbiol 2001,
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Ng, LK, Martin I, Alfa M, Mulvey M. Multiplex PCR for the detection of tetracycline resistant genes.
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Oliveira DC, Santos M, Milheirio C., Carrio JA, Vinga S, Oliveira AL, de Lencastre H. ccrB typing
tool: an online resource for staphylococci ccrB sequence typing. J Antimicrob Chemoter 2008, 61:
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and in staphylococci directly from simulated blood cultures using the EVIGENE MRSA Detection
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Schmitz FJ, Jones ME, Hofmann B, Hansen B, ScheuringS, Lckefahr M, Fluit A, Verhoef J,
Hadding U, Heinz HP, Khrer K. Characterization of grlA, grlB, gyrA, and gyrB mutations in
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Schmitz F J, Fluit AC, Gondolf M, Beyrau, Lindenlauf RE, Verhoef J, Heinz HP, Jones ME. The
prevalence of aminoglycoside resistance and corresponding resistance genes in clinical isolates of
staphylococci from 19 European hospitals. J Antimicrob. Chemother 1999, 43: 253-259.
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compounds and beta-lactam antibiotics in food-related Staphylococcus spp. Microb Drug Resist
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Strommenger B, Kettlitz, C, Werner G, Witte W. Multiplex PCR assay for simultaneous detection of
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2003, 41: 4089-4094.
Sung, JML, Lloyd DH, Lindsay JA. Staphylococcus aureus host specificity: comparative genomics of
human versus animal isolates by multi-strain microarray. Microbiol 2008, 154: 1949-1959.
Tenover FC, McDougal LK, Goering RV, Killgore G, Projan SJ, Patel JB, Dunman PM.
Characterization of a strain of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus
widely disseminated in the United States. J Clin Microbiol 2006, 44: 108-118.
Werner G, Cuny C, Schmitz FJ, Witte W. Methicillin-resistant, quinupristin-dalfopristin-resistant
Staphylococcus aureus with reduced sensitivity to glycopeptides. J Clin Microbiol 2001, 39: 35863590.
Yamaguchi T, Nishifuji K, Sasaki M, Fudaba Y, Aepfelbacher M, Takata T, Ohara M, Komatsuzawa
H, Amagai M, Sugai M. Identification of the Staphylococcus aureus etd pathogenicity island
which encodes a novel exfoliative toxin, ETD, and EDIN-B. Infect Immun 2002, 70: 5835-5845.
Yarwood JM, McCormick JK, Paustian ML, Orwin PM, Kapur V, Schlievert PM. Characterization
and expression analysis of Staphylococcus aureus pathogenicity island 3. Implications for the
evolution of staphylococcal pathogenicity islands. J Biol Chem 2002, 277: 13138-13147.
Zhang K, McClure JA, Sameer E, Louie T, Conly JM.. Novel multiple PCR assay for characterization
and concomitant subtyping of Staphylococcal Cassette Chromosome mec types I to IV in
methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2005, 43: 5026-5033.

A11

7. Anexos

A12

ANEXO II. Caractersticas de los aislamientos de S. aureus utilizados en este trabajo.


Tabla IIa. Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes del Hospital Universitario Central de Asturias durante el periodo 2005-2006
(Articulo 1).
C2/05

Tipo
Cuadro PFGE Clster Tipo
Perfil Resistenciad/SCCmec
MLSTb CCc
agr
clnicoa SmaI PFGE
spa
SP
S1
G2
t3734 ST125
5
II
[AMP-OXA]-[AMK-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-[CIP-MOX]/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-etb-tst-sea/c-egc1-splF

Cepa/Ao

Perfil Virulenciae

C3/05

SP

S2

12

IV

AMP

hla/b/d/g/gv-lukPV-eta/b-tst-sea/c-egc2-splF-bsaB

C4/05

SSSS

S3

t547

ST15

15

IV

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta/b-tst-sea/c-egc2-splF-bsaB

C5/05

SP

S4

t1618 ST45

45

IV

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta/b-tst-sea/c/l-egc2-ear-bsaB

C6/05

HQ

S5

t012

(ST30)

30

III

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta/b-tst-sea/c-egc2-splF

C7/05

ID

S6

G2

t067

(ST125) 5

IV

[AMP-OXA]-[AMK-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-[CIP-MOX]/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta/b-tst-sea-egc1-ear-bsaB
hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta/b-tst-sea/c-egc1-ear-splF-bsaB

C8/05

HQ

S5

t012

(ST30)

III

AMP

C9/06

HQ

S6

G2

t067

(ST125) 5

30

III

[AMP-OXA]-[AMK-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-[CIP-MOX]/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-etb-tst-sea/c-egc2-ear-splF

C10/06

SP

S7

G1

t002

ST5

II

AMP

hla/d/g/gv-lukED/PV-eta/b-sea/c-egc1-splF

C13/06

SP

S8

G2

t067

ST125

II

[AMP-OXA]-[AMK-GEN-KAN-TOB]-CHL-MUP-[CIP-MOX(I)]/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta/b-tst-sea/c/d/j/p/r-egc2-ear

C45/06

SP

S6

G2

III

[AMP-OXA]-[AMK-KAN-TOB]-ERY-CHL-[CIP-MOX(I)]/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED-etb/d-sec/p-egc2-ear-bsaB

C55/06

SP

S9

G2

II

[AMP-OXA]-[AMK-GEN-KAN-TOB]-CHL-[CIP-MOX(I)]/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta/b-sea/c/d/j-egc2

C56/06

SP

S10

t067

ST125

IV

[AMP-OXA]-[AMK-KAN-TOB]-[ERY-CLI ]-CHL-[CIP-MOX]/IVc

C59/06

HQ

S11

IV

AMP-KAN-[ERY-CLII]-TET

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-etd-tst-sea/c/d/j/r-egc2-bsaB

C60/06

SP

S12

t159

(ST121) 121

II

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-etd-tst-sea/c/d/j/r-egc2-ear-splF-bsaB

C61/06

SP

S13

t067

(ST125) 5

II

[AMP-OXA]-[AMK-GEN-KAN-TOB]-CHL-MUP-[CIP-MOX]/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED-etb/d-tst-sec-egc2-ear

C62/06

SP

S14

t067

(ST125) 5

IV

[AMP-OXA]-[AMK-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-CHL-[CIP-MOX]/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-sec/p-egc1-ear-splF
hla/b/d/g/gv-lukED-etb-tst-sea/c-egc2-splF

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta/b/d-tst-sea/c-egc2-ear-splF

SP

S15

III

AMP

SP

S25

t109

ST228

II

[AMP-OXA]-[AMK-GEN-KAN-TOB]- [ERY-CLIC]-MUP-[CIP-MOX(I)]/I

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-tst-sea/c-egc1-splF

C66/06

SP

S5

30

III

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-tst-sea-egc2

C67/06

HQ

S16

G2

t3734 (ST125) 5

II

AMK-[ERY-CLIC]-CHL-[CIP-MOX(I)]

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-tst-sea/c/d/j/r-egc1-ear-splF

C68/06

SP

S17

t1381 (ST12)

12

III

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-tst-sea/c/h-egc1-splF-bsaB

C69/06

SP

S18

G1

t002

(ST5)

III

AMP-[ERY-CLIC]

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-tst-sea/c/d/h/j-egc1-splF

C70/06

SP

S19

59

IV

[ERY-CLIC]

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-sea/b/c/d/j/k/q/p-egc1

C71/06

PN

S20

t067

(ST125) 5

II

[AMP-OXA]-[KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-CIP/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-tst-sea/c/h-egc1-splF

C72/06

SP

S21

t1618 (ST45)

II

hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sep-egc1

45

A13

7. Anexos

C64/06
C65/06

Tabla IIa (Continuacin). Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes del Hospital Universitario Central de Asturias durante el
periodo 2005-2006 (Articulo 1).
Cepa/Ao
C76/06

Cuadro PFGE Clster Tipo MLSTb CCc Tipo


agr
clnicoa SmaI PFGE spa
SSSS/SP S7
G1
5
II
-

Perfil Resistenciad/SCCmec

Perfil Virulenciae
hla/b/d/g/gv-lukED-etb-sec/p-egc1-ear-splF

C77/06

SP

S22

G2

t067

(ST125) 5

II

[AMP-OXA]-[AMK-KAN-TOB]-[ERY-CLI ]-CHL-[CIP-MOX(I)]/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-tst-sec/p-egc1-ear-splF

C78/06

SP

S23

G1

II

AMP-KAN-[ERY-CLII]-CHL-[CIP-MOX(I)]

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-seb/c/p-egc1-ear-splF

C79/06

SP

S24

G2

II

[AMP-OXA]-[KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-[CIP-MOX(I)]/IVc

hla/b/d/gv-lukED-sec-egc1-ear-splF

C80/06

SP

S8

G2

t067

(ST125) 5

II

[AMP-OXA]-[AMK-GEN-KAN-TOB]-CHL-MUP-[CIP-MOX(I)]/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-sec/d/j/r-egc1-ear-splF

C81/06

PN

S25

t109

(ST228) 5

II

[AMP-OXA]-[AMK-GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-[CIP-MOX]/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-sea/c-egc1-ear-splF

C82/06

SP

S26

30

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-tst-sec/d/r-egc2-ear
hla/b/d/g/gv-lukED-etb-tst-sec/p-egc1-splF

C83/06

SP

S27

G2

II

AMP-[KAN-TOB]-ERY-[CIP-MOX]-FOS

C84/06

SP

S28

G1

II

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b-tst-sep-egc1-splF

C87/06

HQ

S29

G2

II

AMP-KAN-[ERY-CLIC]-CHL-MUP-[CIP-MOX]-FOS

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta/b-sea/b/c-egc1-ear-splF

C93/06

HQ

S26

t012

ST30

30

III

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-etb-tst-sea/c-egc2-splF

C103/06

HQ

S26

30

III

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b-tst-sea/c-egc2-ear-splF
C

C112/06

SP

S6

G2

II

AMP-[KAN-TOB]-[CIP-MOX]-[ERY-CLI ]

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-tst-sec/p-egc1-ear-splF

C114/06

HQ

S26

t012

(ST30)

30

III

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta/b-tst-sea/c-egc2

C117/06

PN

S30

G1

t002

(ST5)

II

[AMP-OXA]-[GEN-KAN]-[ERY-CLIC]-MUP-[CIP-MOX(I)]/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-etb-sec-egc1-splF

C128/06

HQ

S31

t166

(ST34)

30

III

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-tst-sec/h-egc2

C132/06

HQ

S32

t024

ST8

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta/b/d-tst-sec/d/j/r-egc1-splF-bsaB

C133/06

HQ

S33

30

III

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b-tst-sea-egc2

C177/06

PN

S26

t021

ST30

30

III

AMP-[ERY-CLIC]

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-etb-tst-sea/c-egc2-ear-splF

C180/06

PN

S7

G1

II

AMP

hla/d/g/gv-lukED-etb-sea/b/p-egc1-ear-splF

C183/06

PN

S34

G2

II

[AMP-OXA]-[KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-CIP-RIF-FOS/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED-eta-sec/p-egc2-ear-splF

C192/06

HQ

S18

G1

III

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sec/p-egc1-splF

C193/06

SP

S18

G1

II

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-eta-sec-egc1-splF

C200/06

PN

S35

30

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-eta-tst-egc1

C203/06

HQ

S5

30

III

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-sea/b/c-egc1-splF

C205/06

HQ

S6

G2

II

AMP-[KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-CIP-FOS

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-sea/b/c/h-egc1-ear-splF

7. Anexos

A14

Tabla IIa (Continuacin). Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes del Hospital Universitario Central de Asturias durante el
periodo 2005-2006 (Articulo 1).
MLSTb CCc Tipo
Perfil Resistenciad/SCCmec
agr
(ST125) 5
II
[AMP-OXA]-[KAN-TOB]-ERY-[CIP-MOX]-FOS/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-sea/b/c/d/h/j/r-egc1-ear-splF

C214/06

Cuadro PFGE Clster Tipo


clnicoa SmaI PFGE
spa
SP
S6
G2
t067

C217/06

HQ

S36

t160

ST12

12

II

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b-tst-sea/c-egc1-ear-splF

C221/06

HQ

S26

30

III

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-tst-sea/c/h-egc2-splF

C222/06

SP

S37

30

III

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-tst-sea/k/q-egc1-splF

C224/06

HQ

S38

G2

t067

(ST125) 5

II

AMP-KAN-ERY-CHL-MUP-[CIP-MOX(I)]

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta/b-sea/b/c/p/q-egc1-ear-splF

C227/06

PN

S39

G2

II

[AMP-OXA]-[KAN-TOB]-CIP-ERY/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-sea/b/c/p-egc1-ear-splF

Cepa/Ao

Perfil Virulenciae

C232/06

HQ

S39

G2

II

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b-sec/p-egc1-splF

C233/06

HQ

S34

G2

II

[AMP-OXA]-KAN-[ERY-CLIC]-CHL-[CIP-MOX(i)]-RIF-FOS//IVc

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b-sea/b/c/d/j/p-egc1-splF

C234/06

HQ

S40

45

IV

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-etb/d-seb/c-egc1-splF-bsaB

C235/06

SP

S24

G2

II

[AMP-OXA]-KAN-ERY-CHL-[CIP-MOX]/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b-sea/b/c/p-egc1-ear-splF

C236/06

SP

S41

t1494 -

45

II

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b/d-egc1-ear

C237/06

HQ

S42

30

III

AMP-[ERY-CLIC]

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b-tst-sea/c-egc2-splF

C238/06

HQ

S43

t081

(ST25)

25

II

AMP-[ERY-CLI ]

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b/d-sea/b/c/d/h/j/r-egc1-ear-splF-bsaB

C239/06

SP

S44

t383

ST47

45

[AMP-OXA]-[ERY-CLII]-MUP-CIP/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b/d-sea/b/c/d/h/j/r-egc1-splF-bsaB

C240/06

HQ

S43

t081

ST25

25

AMP-[ERY-CLIC]

hla/b/d/g/gv-lukED-etb/d-tst-sea/c-egc1-ear-splF-bsaB

C241/06

ID

S45

t1494 -

45

II

AMP-[ERY-CLIC]

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b-seb/c-egc1

C242/06

ID

S41

t081

25

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-etb/d-seb/c-egc1-bsaB

(ST25)

C243/06

IU

S46

t067

(ST125) 5

II

AMP-[ERY-CLI ]-MUP

C244/06

PN

S47

t084

ST15

15

II

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-etb/d-seb/c/d/h/j/r-egc1-ear

C245/06

ID

S28

G1

II

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-seb-egc1-ear

72

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b-sed/j/r-egc1-ear

HQ

S48

t148

(ST72)

[AMP-OXA]-[KAN-TOB]-MUP-CIP/IVc

hla/b/d/gv-lukED-eta/b-seb/c/d/j-egc1-ear

HQ

S25

t109

(ST228) 5

II

[AMP-OXA]-[GEN-KAN]-[ERY-CLIC]-MUP-CIP/I

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-sea/c-egc1

C248/06

PN

S34

G2

II

[AMP-OXA]-[KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-[CIP-MOX(I)]-RIF/IVc

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-seb-egc1-ear

C249/06

HQ

S6

G2

II

[AMP-OXA]-[AMK-GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-[CIP-MOX(I)]/IVc

hla/b/d/gv-lukED-etb-sec/p-egc1-splF

C250/06

ID

S47

t084

(ST15)

15

II

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b-seb-egc1-ear-splF

C251/06

SP

S28

G1

t002

(ST5)

II

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-sed/j/r-egc1-ear

A15

7. Anexos

C246/06
C247/06

7. Anexos

A16
Tabla IIa (Continuacin). Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes del Hospital Universitario
Central de Asturias durante el periodo 2005-2006 (Articulo 1).
MLSTb

CCc

45

C252/06

Cuadro
clnicoa
HQ

C253/06

PN

S50

G1

t002

(ST5)

C254/06

HQ

S49

45

Cepa/Ao

PFGE
SmaI
S49

Clster
PFGE
D

Tipo
spa
t282

Tipo
agr
II

Perfil Resistenciad/SCCmec

Perfil Virulenciae

AMP

hla/b/g/gv-lukED-eta/b-tst-egc1-bsaB

II

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b-seb/c/d/j/r-egc1

IV

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b/d-tst-sec/d/j/l/r-egc1-ear-bsaB

HQ, infeccin en herida quirrgica; PN, neumona; ID, infeccin directa; IU, infeccin aparato urinario; SP, sepsis; SSSS, sndrome de la piel escaldada.
Las secuencias tipo (ST) entre parntesis se corresponden a ST presuntivos segn el tipo spa.
c
Complejo clonal (CC) en base a los resultados de la agrupacin en clsteres de los perfiles PFGE SmaI y de la tipificacin por spa y MLST.
d
Perfil de resistencia frente a los antimicrobianos: ampicilina-penicilina (AMP), oxacilina-meticilina (OXA), amikacina (AMK), kanamicina (KAN), gentamicina (GEN),
tobramicina (TOB), cloranfenicol (CHL), eritromicina (ERY), clindamicina (CLIC constitutiva, CLII inducible), tetraciclina (TET), ciprofloxacina (CIP), moxifloxacina
(MOX), linezolid, mupirocina (MUP), rifampicina (RIF), sulfametoxazol/trimetoprima, tigeciclina y vancomicina. (I), resistencia intermedia. Concentracin mnima
inhibitoria a mupirocina: 8g/ml (C87), 10g/ml (C243), 20g/ml (C239, C246), 30g/ml (C65, C247), 1000g/ml (C117, C224), >2000g/ml (C13, C61, C80).
e
Hemolisina (hl), exfoliatina (et), leucotoxina (luk), enterotoxina (se), egc1 (cluster con seg-sem-sen-sei-seo), egc2 (cluster con seg-sem-sen-sei-seo-seu).
b

Tabla IIb. Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes del Hospital Monte Naranco durante el periodo 1996-2006 (Articulo 2 y 3).
MLSTc

C16/96

Cuadro
RM
clnicoa
testb
SP
CC5

Tipo
spa
t045

ST5

C17/97

SP

t350

ST45

Cepa/Ao

CC45

CCd
CC5

Tipo
Perfil Resistenciae/SCCmec
agr
II
[AMP-OXA]-[GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLII]-TET-CHL-RIF/IVc

hla/b/d/gv-lukED/PV-etd-sea/c/p-egc2

CC45

IV

AMP

hla/d/g-lukED-sea/b/c/l-egc1-ear-splF
hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sec-egc2-splF

Perfil Virulenciaf

C18/97

SP

nt

t5111 ST15

CC15

II

AMP

C19/98

SP

CC5

t045

ST5

CC5

II

[AMP-OXA]-[AMK-GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-MUP-CIP-RIF-SXT-FOS/II hla/d/gv-lukED/PV-sec-egc1-splF

C20/98

SP

CC8/239 t051

ST247

CC8/239 I

AMP-[GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-MUP-TET-[CIP-MOX]

hla/d/g/gv-lukED/PV-sea-egc1-splF-bsaB

C21/98

SP

CC45

ST45

CC45

AMP

hla/d/g-lukED-eta-tst-sec/l-egc1-ear

t015

C22/98

SP

CC45

t015

(ST45)

CC45

AMP

hla/d/g-lukED-etd-tst-sea/c/l-egc2-ear

C24/99

SP

CC45

t015

(ST45)

CC45

AMP-[GEN(I)-KAN-TOB]

hla/d/g-lukED-eta-tst-sec/l-egc1-ear

C25/99

SP

nt

t084

ST15

CC15

II

hla/d/g/gv-lukED-sec-egc1-splF
hla/b/d/gv-lukED/PV-eta/d-tst-sea/c/d/h/j/k/q/r-egc2-splF-bsaB

C26/99

SP

CC1

t127

ST1

CC1

III

AMP

C27/00

SP

CC5

t002

ST5

CC5

II

AMP-KAN-ERY(I)-MUP

hla/b/d/gv-lukED/PV-etd-tst-sea/c/j/r/s/t-egc2-bsaB

C28/00

SP

CC5

t002

(ST5)

CC5

II

AMP

hla/b/d/g-lukED-etd-tst-sec/h-egc2

CC30

C29/00

SP

CC30

t012

ST30

III

AMP-KAN

hla/d/g-lukED-etd-sea-egc2-splF

C30/01

SP

nt

t272

(ST121) CC121

IV

AMP

hla/d/gv-lukED/PV-eta-tst-sec-egc2-splF

C31/01

SP

nt

t272

ST121

CC121

IV

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-eta-tst-sec-egc2-splF

C32/01

SP

CC30

t012

(ST30)

CC30

III

AMP-[KAN-TOB]-MUP-TET

hla/d/g-lukED-tst-sea/c-egc2-splF

C33/01

SP

CC5

t002

ST146

CC5

AMP

hla/d/gv-lukED-eta-tst-sea-egc1-splF

C34/03

SP

CC45

t065

ST45

CC45

[AMP-OXA]-CHL-[ERY-CLIC]/IVc

hla/d/g-lukED-sec-egc2

C35/01

SP

CC5

t002

(ST5)

CC5

II

AMP-[KAN-TOB]

hla/b/d/g/gv-lukED-eta-tst-sea/c-egc1-splF

C36/02

SP

CC5

t002

(ST5)

CC5

II

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED-sec/d/j/r-egc2-ear-splF
hla/b/d/g/gv-lukED-etd-tst-sec-egc2-splF

C38/02

SP

nt

t1814 ST88

CC88

III

AMP

C39/02

SP

nt

t1814 (ST88)

CC88

III

AMP

hla/b/d/gv-lukED/PV-eta/b-tst-sea/c-egc1-ear

C40/02

SP

nt

t1814 (ST88)

CC88

III

AMP

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta/b-tst-sea/c-egc1-ear-splF

C42/03

SP

CC45

t015

(ST45)

CC45

AMP

hla/d/g/gv-lukED-sec/l-egc1-ear-splF

C43/03

SP

CC45

t015

(ST45)

CC45

AMP

hla/b/d/g-lukED-sec-egc1-ear

C44/03

SP

CC8/239 t351

ST8

CC8/239 I

AMP-[ERY-CLII]

hla/b/d/gv-lukED/PV-eta-sea/c/d/j/r-egc2-bsaB

7. Anexos

A17

C47/03

RM
Cuadro
testb
clnicoa
SP
CC5

CCd
Tipo MLSTc
spa
t6488 ST5
CC5

Tipo
Perfil Resistenciae/SCCmec
agr
II
[AMP-OXA]-[AMK-GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-CIP-FOS/IVc

C50/04

IR

CC5

t067

ST125

CC5

II

C51/04

SP

CC5

t002

(ST5)

CC5

II

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-eta-seb/c/d/j/r-egc1-splF

C53/05

SP

CC5

t067

(ST125) CC5

II

AMP-[KAN-TOB-]-CHL-[CIP-MOX]-FOS

hla/b/d/g/gv-lukED/PV-etb-tst-sec/p-egc1-ear

C57/06

SP

CC5

t081

ST25

CC25

IV

AMP

hla/b/d/gv-lukED-etd-egc2-bsaB

C258/96

HQ

CC8

t051

ST247

CC8

[AMP-OXA]-[GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-TET-CIP/I

hla/d/gv-lukED-etd-sea/b-egc1*-ear-splF-bsaB

Cepa/Ao

[AMP-OXA]-[AMK-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-MUP-[CIP-MOX] /IVc

Perfil Virulenciaf
hla/b/d/gv-lukED/PV-etd-tst-sec-egc2-splF
hla/d/gv-lukED-etd-tst-sea/c/d/j/p-egc2-ear

C259/96

HQ

CC45

t1078 (ST45)

CC45

hla/d/g/gv-lukED-sea/b/c/l-egc1-ear-splF

C260/96

HQ

CC5

t001

ST5

CC5

II

[AMP-OXA]-[GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-CIP/II

hla/b/d/gv-lukED-sea/c-egc1-ear-splF-bsaB

C261/96

HQ

CC8

t051

(ST247) CC8

[AMP- OXA]-[GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-TET- CIP/I

hla/b/d/gv-lukED-etd-sea/c-egc1*-ear-splF-bsaB

C262/96

HQ

CC8

t051

(ST247) CC8

[AMP-OXA]-[GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-TET-[ CIP-MOX(I)] /I

hla/b/d/gv-lukED-etd-sea/k/q-egc1-ear-splF-bsaB

C263/96

HQ

CC8

t051

(ST247) CC8

[AMP-OXA]-[GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-TET-[ CIP-MOX(I)] /I

hla/b/d/gv-lukED-sea/b/k/q-egc1-ear-splF-bsaB

C264/96

HQ

nt

t216

ST59

CC59

I/IV

AMP-GEN-[ERY-CLII]

hla/b/d/gv-lukED-sea/k/q-egc1-ear-bsaB

C265/96

HQ

CC5

t001

(ST5)

CC5

II

AMP-ERY-[GEN-KAN-TOB]-[CIP-MOX(I)]
C

hla/b/d/gv-lukED-sea/b/c-egc1-ear-splF-bsaB

C266/97

HQ

CC8/239 t051

ST247

CC8/239 I

[AMP-OXA]-[GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLI ]-[CIP-MOX] /I

C267/97

HQ

CC5

t001

(ST5)

CC5

II

AMP-GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-[CIP

hla/b/d/g/gv-lukED-sea-egc1-ear-splF

C268/97

HQ

CC5

t001

(ST5)

CC5

II

AMP-GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-[CIP

hla/b/d/gv-lukED-eta-sea/b/c-egc1-ear-splF-bsaB

C269/97

HQ

CC5

t001

ST5

CC5

II

AMP-[GEN-KAN-TOB]

hla/b/d/gv-lukED-sea/e-egc1-ear-splF-bsaB

C270/97

HQ

CC8/239 t051

(ST247) CC8/239 I

[AMP-OXA]-[GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-[CIP-MOX] /I

hla/b/d/gv-lukED-sea-egc1-ear-splF-bsaB

C271/98

HQ

CC8/239 t037

ST239

CC8/239 I

[AMP-OXA]-[GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-TET-CIP/III

hla/b/d/gv-lukED-sea-egc1-ear-splF

C272/99

HQ

nt

t084

(ST15)

CC15

II

hla/d/g/gv-lukED-sec-egc1-splF

C273/99

HQ

CC45

t1078 ST45

CC45

[AMP-OXA]-[AMK-GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-MUP-CIP-SXT-FOS/III

hla/b/d/gv-lukED-etd-sea/b/c/k/q-egc1-ear-splF-bsaB

C274/00

HQ

CC8/239 t037

ST239

CC8/239 I

[AMP-OXA]-[AMK-GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-[TET-[CIP-MOX(I)]-SXT-FOS/III hla/b/d/gv-lukED-sea/k/q-egc1-ear-splF-bsaB

C275/00

HQ

CC5

t001

(ST5)

CC5

II

AMP-[GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]

hla/b/d/gv-lukED/PV-sea-egc1-ear-splF

C276/00

HQ

CC5

t067

ST125

CC5

II

[AMP-OXA]-[AMK-GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-TET-[CIP-MOX(I)]-SXT-FOS/III

hla/b/d/gv-lukED-sea/b/k/q-egc1-ear-splF

C277/01

HQ

CC8/239 t037

(ST239) CC8/239 I

[AMP-OXA]-[AMK-GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-TET-CIP-SXT-FOS/III

hla/b/d/gv-lukED/PV-sea/c-egc1-ear-splF

C278/01

HQ

CC5

ST125

[AMP-OXA]-[KAN-TOB]-CHL-[ERY-CLIC]-[CIP-MOX(I)] /V

hla/b/d/gv-lukED-etd-sea/b/d/e/j/p/r-egc1-ear-splF-bsaB

t067

CC5

II

hla/d/gv-lukED-sea/c-egc1-ear-splF-bsaB

7. Anexos

A18
Tabla IIb (Continuacin). Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes del Hospital Monte Naranco durante el periodo 1996-2006
(Articulo 2 y 3).

Tabla IIb (Continuacin). Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes del Hospital Monte Naranco durante el periodo 1996-2006
(Articulo 2 y 3).
MLSTc

CCd

C279/02

Cuadro
clnicoa
HQ

RM
testb
CC5

Tipo
spa
t019

ST228

CC5

II

[AMP- OXA]-[ERY-CLIC]-[GEN-KAN-TOB]-[CIP-MOX]/I

hla/b/d/gv-lukED/PV-eta/d-seb/d/j/r-egc1-ear-bsaB

C280/02

HQ

nt

t279

ST15

CC15

II

AMP

hla/d/gv-lukED/PV-sea/b/c/e-egc1-ear-splF-bsaB

Cepa/Ao

Tipo
agr

Perfil Resistenciae/SCCmec

Perfil Virulenciaf

C281/02

HQ

nt

t084

ST15

CC15

II

AMP

hla/b/d/gv-lukED-sea/b-egc1-ear-splF

C282/03

HQ

CC8/239

t351

ST8

CC8/239

AMP

hla/b/d/gv-lukED/PV-eta-sea/c/d/j/r-egc1-ear-splF-bsaB

C283/03

HQ

nt

t279

ST14

CC15

II

[AMP-OXA]-[KAN-TOB]-[CIP-MOX(I)]-SXT-FOS/V
I

hla/b/d/gv-lukED-sea/b/c-egc1-ear-splF

C284/04

HQ

nt

t085

ST582

CC15

II

AMP-[ERYCLI ]

hla/d/gv-lukED-eta-sea/b/c-egc1-ear-splF

C285/06

HQ

CC5

t081

ST25

CC25

IV

AMP

hla/b/d/gv-lukED-etd-egc2-bsaB

C286/06

HQ

CC5

t067

ST125

CC5

II

[AMP-OXA]-[AMK-GEN-KAN]-CIP/IVa

hla/b/d/gv-lukED-eta/d-sea/c/d/e/j/p/r-egc1-splF

C287/06

HQ

CC5

t002

ST5

CC5

II

hla/d/gv-lukED-sec/d/j/p/r-egc1

C289/03

HQ

CC72

t148

ST72

CC72

I/IV

AMP-ERY

hla/d/gv-egc1-splF

HQ, infeccin en herida quirrgica; ID, infeccin respiratoria; SP, sepsis.


Test de restriccin-modificacin para deteccin de complejos clnales de Cockfield et al. (J Med Microbiol 2007, 56: 614-619). nt, no tipiflicable.
c
Las secuencias tipo (ST) entre parntesis se corresponden a ST presuntivos segn el tipo spa.
d
Complejo clonal (CC) en base a los resultados de la tipificacin por RM test, spa y MLST.
e
Perfil de resistencia frente a los antimicrobianos: ampicilina-penicilina (AMP), oxacilina-meticilina (OXA), amikacina (AMK), kanamicina (KAN), gentamicina (GEN), tobramicina (TOB), cloranfenicol (CHL), eritromicina
(ERY), clindamicina (CLIC constitutiva, CLII inducible), tetraciclina (TET), ciprofloxacina (CIP), moxifloxacina (MOX), linezolid, mupirocina (MUP), rifampicina (RIF), sulfametoxazol/trimetoprima (SXT), tigeciclina y
vancomicina. (I), resistencia intermedia. Concentracin mnima inhibitoria a mupirocina: 20 g/ml (C27, C273), 30 g/ml (C19), 60g/ml (C50), 80g/ml (C20), 100g/ml (C32).
f
Hemolisina (hl), exfoliatina (et), leucotoxina (luk), enterotoxina (se), egc1 (cluster con seg-sem-sen-sei-seo), egc2 (cluster con seg-sem-sen-sei-seo-seu).
b

7. Anexos

A19

Cepa LMUOa/
Ao
5/97

PFGE
SmaIb
S5

RM testc

6/97

S23

MLSTd

CC30

Tipo
spa
t012

(ST30)

CC25

t6489

(ST25)

CCe
CC30

Tipo
agr
III

HindIII
Pl Perfilf
p0

AMP/blaZ::Tn552/nd

CC25

IV

pR3

AMP/blaZ::Tn552/pl

Perfil Resistenciag

10/97

S25

CC30

t012

(ST30)

CC30

III

p0

AMP/blaZ/nd

3/99

S7

CC30

t122

(ST30)

CC30

III

p0

AMP-KAN/blaZ::Tn552/nd-[aphA/nd-aadE-sat4]-qacA/B

8/99

S13

CC30

t021

(ST30)

CC30

pR4

AMP/blaZ::Tn552/pl

12/99

S32

CC45

t015

(ST45)

CC45

-/-

15/99

S15

CC1

t177

(ST3)

CC1

III

pR16

[ERY-CLII]/blaZ::Tn552/nd-[ermC/pl-msrB/pl]

95/99

S3

CC30

t253

(ST36)

CC30

III

pR26

AMP-[GEN-KAN-TOB]-TET(I)/blaZ::Tn552/pl-[aacA+aphD/nd]- tetK/pl

1/01

S4

CC30

t012

(ST30)

CC30

III

pc1

AMP/blaZ::Tn552/nd

2/01

S3

CC30

t7785

CC30

III

p0

AMP/blaZ::Tn552/nd

3/01

S55

CC25

t167

(ST25)

CC25

IV

pR5

AMP/blaZ::Tn552/pl

4/01

S31

CC45

t1618

(ST45)

CC45

pR4

AMP/blaZ::Tn552/pl

5/01

S51

CC5

t002

(ST5)

CC5

II

pR6

AMP/blaZ::Tn552/pl

6/01

S3

CC30

t275

(ST605)

CC30

III

pc13

AMP-ERY/blaZ/nd-msrB/nd

7/01

S70

nt

t084

(ST15)

CC15

II

pR17

AMP-[ERY-CLII]/blaZ::Tn552/nd-ermC/pl

8/01

S55

CC25

t167

(ST25)

CC25

IV

pc2

AMP-KAN/blaZ::Tn552/nd-[aphA/nd-aadE-sat4]

9/01

S3

CC30

t275

(ST605)

CC30

III

p0

AMP/blaZ::Tn552/nd

10/01

S31

CC45

t015

(ST45)

CC45

pR4

AMP/blaZ::Tn552/pl

11/01

S56

CC25

t1054

ST25

CC25

IV

pR18

AMP-[ERY-CLIC]/blaZ::Tn552/pl-[ermC/pl-msrB/pl]

12/01

S52

CC5

t002

(ST5)

CC5

II

pR1

AMP/blaZ/pl

13/01

S62

CC30

t275

(ST605)

CC30

III

p0

AMP/blaZ::Tn552/nd

14/01

S26

nt

t216

ST59

CC59

IV

pR7

AMP/blaZ::Tn552/pl

15/01

S31

CC45

t015

(ST45)

CC45

pR3

AMP/blaZ::Tn552/pl

16/01

S31

CC45

t015

(ST45)

CC45

pR3

AMP/blaZ::Tn552/pl

17/01

S33

CC45

t015

(ST45)

CC45

pR3

AMP/blaZ::Tn552/pl

18/01

S71

nt

t2949

(ST15)

CC15

II

pR26

AMP-TET/blaZ::Tn552/pl-tetK/pl

7. Anexos

A20
Tabla IIc. Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes de portadores sanos durante el periodo 1997-2002
(Artculos 4 y 6).

Tabla IIc (Continuacin). Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes de portadores sanos durante el periodo 1997-2002
(Artculos 4 y 6).
Cepa LMUOa/ PFGE RM testc Tipo
Ao
SmaIb
spa
19/01
S57
nt
t159
20/01

S71

nt

MLSTd
ST121

t7248 -

CCe

Tipo HindIII
Perfil Resistenciag
agr Pl Perfilf
CC121 IV
p0
AMP-KAN-FOS/blaZ/nd-[aphA/nd-aadE-sat4]
CC15

II

pR4

AMP/blaZ::Tn552/pl

21/01

S28

nt

t375

(ST121)

CC121 III

pc3

CLI/linA/linA

22/01

S11

CC30

t018

(ST30)

CC30

III

pR8

AMP-KAN/blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]

23/01

S70

nt

t084

ST15

CC15

II

pR4

AMP/blaZ::Tn552/pl

24/01

S62

nt

t018

(ST30)

CC30

III

pR27

[ERY-CLIC]-TET/blaZ::Tn552/pl-ermC/pl-tetK/nd

(ST620)

25/01

S72

nt

t346

CC15

II

pR37

AMP-KAN-ERY-CHL/blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]-msrB/pl-cat::pC221/pl

26/01

S63

nt

t3201 ST1

CC1

II

pR19

AMP-[ERY-CLII]/blaZ/pl-[ermC/pl-msrB/pl]

27/01

S31

CC45

t798

CC45

pR4

AMP/blaZ::Tn552/pl

28/01

S65

nt

t2949 -

CC15

II

pR26

AMP-TET/blaZ::Tn552/pl-tetK/pl

29/01

S73

nt

t2949 (ST15)

CC15

II

pR28

AMP-TET/blaZ::Tn552/pl-tetK/pl

(ST45)

30/01

S51

CC5

t002

(ST5)

CC5

II

-/-

31/01

S9

CC30

t942

CC30

III

p0

AMP/blaZ::Tn552/nd

32/01

S70

nt

t084

(ST15)

CC15

II

pR9

AMP-ERY/blaZ::Tn552/pl-[msrA/nd-msrB/nd]

33/01

S73

nt

t346

(ST620)

CC15

II

pR4

AMP/blaZ::Tn552/pl

34/01

S53

CC5

t242

(ST5, ST149) CC5

II

pR20

[ERY-CLII]/blaZ::Tn552/pl-ermC/pl

35/01

S51

CC5

t002

(ST5)

II

pR21

AMP-KAN-[ERY-CLIC]/blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]-[ermC/pl-msrB/pl]

CC5

36/01

S54

CC5

t002

(ST5)

CC5

II

pc10

KAN-ERY/[aphA/nd-aadE-sat4]-msrA/nd

1/02

S74

CC1

t267

(ST97)

CC97

pR29

AMP-KAN-TET/blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]-tetK/pl

2/02

S51

CC5

t002

(ST5)

CC5

II

pR21

AMP-[ERY-CLII]/blaZ::Tn552/pl-[ermC/pl-msrB/pl ]

3/02

S75

CC5

t002

(ST5)

CC5

II

pR10

AMP-KAN/blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]

4/02

S60

CC1

t267

ST97

CC97

pR38

AMP-KAN-CHL/[blaZ/nd-Tn552/pl]-[aphA/pl-aadE-sat4]-cat ::pC194/pl

5/02

S31

CC45

t040

(ST45)

CC45

pR30

AMP-[ERY-CLIC]-TET/[blaZ::Tn552/nd]-[ermB/nd-ermC/pl-msrB/pl]-tetK/pl

6/02

S31

CC45

t040

(ST45)

CC45

pR16

AMP-[ERY-CLIC]-[CIP-MOF]/blaZ/nd-[ermB/nd-ermC/pl-msrB/pl]-[glrA(Ile45 to Met)-glrB(Asp422 to Glu)]

S42

CC5

t002

ST5

CC5

II

pR10

AMP-[AMK-GEN-KAN-TOB]/blaZ::Tn552/pl-[ aacA+aphD/nd]

S11

CC30

t018

(ST30)

CC30

III

pR10

AMP-KAN/blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]

9/02

S3

nt

t7785 -

CC30

III

pR31

AMP-[AMK-GEN-KAN-TOB]-TET/ blaZ::Tn552/pl-[ aphA/pl-aadE-sat4-aacA+aphD/pl]-tetK/pl

A21

7. Anexos

7/02
8/02

Cepa LMUOa/ PFGE RM testc Tipo


Ao
SmaIb
spa
10/02
S42
CC5
t002

MLSTd

CCe
CC5

Tipo HindIII
agr Pl Perfilf
II
pR11
AMP/blaZ::Tn552/pl

11/02

S74

nt

t1877 (ST97)

CC97

II

pR3

AMP/blaZ::Tn552/pl

12/02

S31

CC45

t040

(ST45)

CC45

pR31

AMP-[ERY-CLIC]-TET/blaZ::Tn552/pl-[ermC/pl-msrB/pl]-tetK/pl

13/02

S58

nt

t159

(ST121) CC121

IV

pc4

AMP-KAN-CLI/blaZ/nd-[aphA/nd-aadE-psat4]-linA/linA

14/02

S42

CC5

t002

(ST5)

II

pR21

AMP-[GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]/blaZ::Tn552/pl-[ermC/pl-msrB/pl]-[aacA+aphD/nd]

ST5

CC5

15/02

S31

CC45

t015

(ST45)

CC45

-/-

16/02

S31

CC45

t1618 (ST45)

CC45

IV

pR4

AMP-KAN/blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]

17/02

S55

CC25

t287

(ST25)

CC25

IV

pR10

AMP/blaZ::Tn552/pl

Perfil Resistenciag

18/02

S27

nt

t3952 (ST59)

CC59

IV

pR12

AMP/blaZ::Tn552/pl

19/02

S3

CC30

t017

(ST30)

CC30

III

pR1

AMP-KAN-CLI/blaZ/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]-linA/linA

20/02

S18

CC8/239 t008

ST8

CC8/239 I

pR32

AMP-TET/blaZ/nd-tetK/pl

21/02

S3

CC30

t017

(ST30)

CC30

III

pR33

AMP-KAN-TET/blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]-tetK/pl

22/02

S70

nt

t7756 -

CC15

II

pR5

AMP-KAN-CLI/blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]-linA/linA

23/02

S52

CC5

t002

CC5

II

pR12

AMP-KAN/blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]

24/02

S52

CC5

t1340 -

CC5

II

p0

KAN/[aphA/nd-aadE-sat4]

(ST5)

LMUO, Laboratorio de Microbiologa de la Universidad de Oviedo.


Perfiles basados en los publicados en Fueyo et al. (FEMS Microbiol Lett 2005, 243: 447-454).
c
Test de restriccin-modificacin para deteccin de complejos clnales de Cockfield et al. (J Med Microbiol 2007, 56: 614-619). nt, no tipiflicable.
d
Las secuencias tipo (ST) entre parntesis se corresponden a ST presuntivos segn el tipo spa.
e
Complejo clonal (CC) en base a los resultados de la agrupacin en clsteres de los perfiles PFGE SmaI y de la tipificacin por RM test, spa y MLST.
f
Perfiles plsmidicos obtenidos tras digestin con el enzima HindIII. p0, ausencia de plsmidos; pc, plsmido sin resistencia asociada; pR, plsmido de resistencia.
g
Perfil de resistencia frente a los antimicrobianos: ampicilina-penicilina (AMP), oxacilina-meticilina (OXA), amikacina (AMK), kanamicina (KAN), gentamicina (GEN), tobramicina (TOB), cloranfenicol
(CHL), eritromicina (ERY), clindamicina (CLIC constitutiva, CLII inducible), tetraciclina (TET), ciprofloxacina (CIP), moxifloxacina (MOX), linezolid, mupirocina (MUP), rifampicina (RIF),
sulfametoxazol/trimetoprima, trimetoprima, tigeciclina y vancomicina.
b

7. Anexos

A22
Tabla IIc (Continuacin). Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes de portadores sanos durante el periodo 1997-2002
(Artculos 4 y 6).

Tabla IId. Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes de portadores sanos durante el periodo 2004-2006 (Artculos 4, 5 y 6).
Cepa LMUOa/ PFGE RM
Ao
SmaIb Testc
1/04
S70
nt

Tipo
spa
t085

MLSTd

2/04

S135

CC1

t189

(ST188) CC1

3/04

S136

CC30 t166

CC30 III

p0

AMP-KAN/blaZ::Tn552/nd-[aphA/nd-aadE-sat4]

hla/b/d/g-lukED-tst-sea/c/h-egc2-splF

4/04

S127

CC30 t7785 -

CC30 III

p0

AMP/blaZ::Tn552/nd

hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sea/h-egc2-splF

5/04

S3

CC30 t253

CC30 III

p0

AMP/blaZ::Tn552/nd

hla/d/g-lukED-tst-sea/c-egc2

ST15
ST34
(ST36)

Tipo HindIII
Perfil Resistenciag
agr Pl Perfilf
CC15 II
-/-

CCe

pR34

Perfil Virulenciah
hla/d/g/gv-lukED-sea/c-splF

AMP-[AMK-KAN-TOB]-TET/blaZ::Tn552/pl-[aphA/pl-aadE-sat4-aadD/nd]-tetK/pl hla/b/d/g/gv-lukED--sea-splF

1/05

S133

CC1

t209

ST109

CC9

II

pR39

AMP-[ERY-CLI ]-CHL/blaZ/nd-ermC/nd-cat::pC194/pl

hla/b/d/g/gv-lukED-eta-sea/d/h/j/r-egc2

2/05

S150

CC1

t209

(ST109) CC9

II

pc5

AMP/blaZ/nd

hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sea/c/k/l/q-egc1

3/05

S133

nt

t209

(ST109) CC9

II

pc11

AMP-[ERY-CLII]/blaZ/nd-ermC/nd

hla/b/d/g/gv-lukED-eta-sea-egc2

4/05

S137

CC1

t209

(ST109) CC9

II

pc6

hla/b/d/g/gv-lukED-eta-tst-sea/h-egc2

5/05

S131

CC25 t078

hla/d/g/gv-lukED-eta/d-sea/c/l-egc1

6/05

S128

CC5

t548

(ST5)

CC5

II

pc7

AMP-[AMK-KAN]/blaZ-Tn552/nd-[aphA/nd-aadE-sat4]
AMP-[AMK-GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLII]/
blaZ::Tn552/pl-[aphA/pl-aadE-sat4-aacA+aphD/pl-aadD/nd]-[ermC/pl-msrB/pl]
AMP-FOS/blaZ::Tn552/nd

7/05

S130

CC5

t306

(ST5)

CC5

II

pc8

KAN/blaZ::Tn552/nd-[aphA/nd-aadE-sat4]

hla/b/d/g/gv-lukED--sea/c/l/p-egc1

t346

ST25

CC25 I

pR35

8/05

S148

nt

9/05

S138

CC45 t026

10/05

S142

nt

t166

(ST34)

CC30 II

11/05

S52

CC5

t002

(ST5)

CC5

12/05

S126

CC30 t1515 (ST30)

p0

t002

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/b/d-sea/b/c-egc2-ear-splF-bsaB

(ST620) CC15 II

pR22

AMP-ERY/blaZ/pl-msrB/pl

hla/d/gv--sea

(ST45)

Sensible/-

hla/d/g/gv-lukED-eta/d-tst-sea/b/c/h-egc1

FOS/-

hla/b/d/g/gv-lukED-eta/d-tst-sea/b-egc2

pR2

AMP/blaZ/pl

hla/b/d/g/gv-lukED-sea-egc1

AMP/blaZ::Tn552/nd

hla/d/g-tst-sea-egc2

(ST5)

CC45 I
II

CC30 III

13/05

S139

CC5

pc12

ERY/[msrA/nd-msrB/nd]-qacA/B

hla/b/d/g-lukED-eta/d-tst-sea/c/h/p-egc2

14/05

S126

CC30 t1515 (ST30)

CC30 III

CC5

II

p0

AMP/blaZ::Tn552/nd

hla/b/d/g/gv-lukED-eta-tst-sea-egc2

15/05

S31

CC45 t1618 (ST45)

CC45 I

pR4

AMP/blaZ::Tn552/pl

hld/g-egc1-ear

16/05

S140

CC5

(ST5)

CC5

pR13

AMP/blaZ::Tn552/pl

hla/b/d/g/gv-lukED-etd-sed/j/r-egc1-splF

t179

II

17/05

S3

CC30 t012

(ST30)

CC30 III

p0

AMP/blaZ::Tn552/nd

hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sea/c-egc2-splF

18/05

S51

CC5

t002

(ST5)

CC5

-/-

hla/b/d/g/gv-lukED-egc1-splF

19/05

S127

nt

t6713 -

CC30 III

pR4

AMP/blaZ::Tn552/pl

hla/b/d/g/gv-lukED-sea/b/h

20/05

S134

nt

t216

CC59 IV

pR14

AMP-KAN-[ERY-CLII]/blaZ::Tn552/pl-[aphA/nd-aadE-sat4]-[ermC/nd-msrB/nd]

hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sea/b/c/d/j/k/l/q/r-egc2-ear-bsaB

(ST59)

II

21/05

S3

CC30 t012

(ST30)

CC30 III

pR4

[ERY-CLI ]/blaZ-Tn552/nd-[ermC/pl-msrB/nd]

hla/b/d/g/gv-lukED-etd-tst-sea/b/c/d/h/j/k/q/r-egc2-ear

22/05

S127

CC30 t012

(ST30)

CC30 III

pR4

AMP*/blaZ::Tn552/nd-msrB/nd

hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sea/c/d/j/r-egc2

7. Anexos

A23

Cepa
LMUOa/
Ao
23/05

PFGE
SmaIb

RM
Testc

Tipo
spa

MLSTd

CCe

Tipo
agr

HindIII
Perfil Resistenciag
Pl Perfilf

Perfil Virulenciah

S70

nt

t346

(ST620)

CC15

II

p0

[AMK-KAN]/[aphA/nd-aadE-sat4]

hla/d/g/gv-lukED-etb-tst-sea/h-ear

24/05

S11

CC30

t018

ST30

CC30

III

pR4

AMP/blaZ::Tn552/nd

hla/b/d/g/gv-tst-sea/b/d/j/r-egc2

25/05

S131

CC25

t078

(ST26)

CC25

IV

pR3

AMP/blaZ::Tn552/pl

hla/b/d/g/gv-lukED-etd-seb-egc1

26/05

S141

nt

t148

ST72

CC72

pR16

AMP-[ERY-CLII]/blaZ/nd-[ermC/pl-msrB/pl]

hla/b/d/g/gv-lukED-etd-sea/b/c/l-egc1-ear

27/05

S143

CC30

t6490

ST34

CC30

pc9

AMP/blaZ::Tn552/nd

hla/b/d/g-lukED-etd-tst-seh-egc2

28/05

S3

CC30

t021

ST30

CC30

III

p0

AMP/blaZ::Tn552/nd

hla/b/d/g-lukED-tst-sea-egc2-splF

29/05

S33

CC45

t026

ST45

CC45

p0

AMP/blaZ/nd

hla/b/d/g-sea-egc2

30/05

S51

CC5

t071

(ST5)

CC5

II

pR2

AMP/blaZ/pl

hla/b/d/g/gv-lukED-etb/d-sea/p-egc2-splF

31/05

S144

CC45

t026

(ST45)

CC45

pR23

AMP-ERY/blaZ/nd-msrB/pl

hla/d/g/gv-lukED/PV-etb/d-tst-sea/h/p/-egc2

32/05

S145

nt

t148

(ST72)

CC72

pc2

AMP/blaZ/nd

hla/b/d/gv-lukED-sea/c/p-egc2-splF

33/05

S146

nt

t1618

(ST45)

CC45

pR36

AMP-TET/blaZ::Tn552/pl-tetK/pl

hla/b/d/gv-lukED-tst-sea/c-egc2

1/06

S129

CC5

t548

(ST5)

CC5

II

pR24

AMP-ERY/blaZ::Tn552/pl-msrB/pl

hla/b/d/g/gv-lukED-etb-sed/j/k/p/q/r-egc1-ear-splF

2/06

S55

CC25

t287

(ST25)

CC25

IV

pR3

AMP-CLI/blaZ::Tn552/pl-linA/linA

hla/b/d/g/gv-lukED-etd-sec/d/l/p/j/r-egc1-ear-splF

3/06

S132

CC45

t050

(ST45)

CC45

pR25

AMP-[ERY-CLII]/blaZ::Tn552/pl-[msrA/pl-msrB/pl-ermC/pl]

hla/d/g-lukED-sec/d/j/l/r-egc1-ear

4/06

S147

CC1

t177

ST3

CC1

III

pR15

5/06

S149

CC25

t078

(ST26)

CC25

pR40

AMP/blaZ::Tn552/pl
hla/b/d/g/gv-etb/d-seb/c/d/h/j/r-egc1-splF-bsaB
AMP-[AMK-GEN-KAN-TOB]-[ERY-CLIC]-MUP/blaZ/pl-[aphA/pl-aadEhla/d/gv-lukED-etd-sed/j/r-egc1-splF
sat4-aacA+aphD/nd-aadD/nd]-[ermC/pl-msrA/nd-msrB/nd-linA/linA]-qacA/B

LMUO, Laboratorio de Microbiologa de la Universidad de Oviedo.


Perfiles basados en los publicados en Fueyo et al. (FEMS Microbiol Lett 2005, 243: 447-454).
Test de restriccin-modificacin para deteccin de complejos clnales de Cockfield et al. (J Med Microbiol 2007, 56: 614-619). nt, no tipiflicable.
d
Las secuencias tipo (ST) entre parntesis se corresponden a ST presuntivos segn el tipo spa.
e
Complejo clonal (CC) en base a los resultados de la agrupacin en clsteres de los perfiles PFGE SmaI y de la tipificacin por RM test, spa y MLST.
f
Perfiles plsmidicos obtenidos tras digestin con el enzima HindIII. p0, ausencia de plsmidos; pc, plsmido sin resistencia asociada; pR, plsmido de resistencia.
g
Perfil de resistencia frente a los antimicrobianos: ampicilina-penicilina (AMP), oxacilina-meticilina (OXA), amikacina (AMK), kanamicina (KAN), gentamicina (GEN), tobramicina (TOB), cloranfenicol (CHL),
eritromicina (ERY), clindamicina (CLIC constitutiva, CLII inducible), tetraciclina (TET), ciprofloxacina (CIP), moxifloxacina (MOX), linezolid, mupirocina (MUP), rifampicina (RIF), sulfametoxazol/trimetoprima
(SXT), trimetoprima (TMP), tigeciclina y vancomicina. Concentracin mnima inhibitoria a mupirocina de la cepa LMUO 5/06: 60g/ml. *Aislamiento sensible a eritromicina pero si resistente a otro macrolido
(oleandomicina).
h
Hemolisina (hl), exfoliatina (et), leucotoxina (luk), enterotoxina (se), egc1 (cluster con seg-sem-sen-sei-seo), egc2 (cluster con seg-sem-sen-sei-seo-seu).
b
c

7. Anexos

A24
Tabla IId (Continuacin). Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes de portadores sanos durante el periodo 2004-2006
(Artculos 4, 5 y 6).

Tabla IIe. Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes de alimentos, brotes y manipuladores de alimentos durante el
periodo 1997-2008 (Articulo 7).
Origen (N)a/Ao
B1-MA1 (2)/02

Nombre
RM
Aislamientos
testb
B1-1 a 2
CC30

Tipo
spa
t021

MLSTc
ST30

CCd
CC30

Tipo
Perfil Resistenciae
agr
III
AMP/blaZ::Tn552

Perfil Virulenciaf
hla/b/d/g-lukED-egc1-splF

B1-MA2/02

B1-3

nt

t120

ST15

CC15

II

MUP/mupA

hla/d/gv-lukED--splF

B1-CA (5)/02

B1-4 a 8

CC45

t050

ST45

CC45

AMP/blaZ::Tn552

hla/d/g-lukED-sec/l-egc1-ear

B1-SM (5)/02

B1-9 a 13

CC45

t050

(ST45)

CC45

AMP/blaZ::Tn552

hla/d/g-lukED-sec/l-egc1-ear

B1-P (4)/02

B1-14 a 17

CC45

t050

(ST45)

CC45

AMP/blaZ::Tn552

hla/d/g-lukED-sec/l-egc1-ear

B1-TC (2)/02

B1-18 a 19

CC45

t050

(ST45)

CC45

AMP/blaZ::Tn552

hla/d/g-lukED-sec/l-egc1-ear

B2-MA3/02

B2-1

CC1

t177

ST3

CC1

III

AMP-[ERY-CLI ]-MUP/blaZ::Tn552-[ermA-ermC]

hla/d/g/gv-eta

B2-MA4/02

B2-2

CC30

t012

(ST30)

CC30

III

AMP-[ERY-CLII]-MUP/blaZ::Tn552-ermC

hla/d/g/gv-eta-lukED-tst-sea-egc2-splF

B2-MA5/02

B2-3

CC30

t136

ST34

CC30

III

AMP-[ERY-CLII]-MUP/blaZ::Tn552-ermC

lukED-tst-seh-egc2-splF

B2-TC/02

B2-4

CC5

t616

ST1619

CC5

IV

AMP-ERY/blaZ-[msrA-msrB]

hla/b/d/g/gv-lukED-seh-egc2

B2-VG/02

B2-5

CC8/239 t701

ST6

CC5

IV

AMP-[ERY-CLII]-TET / blaZ::Tn552-ermC-tetK

hla/b/d/gv-sea-bsaB-splF

B2-VG/02

B2-6

CC22

t790

ST217

CC22

AMP/blaZ

hla/b/d/g/gv-lukED-sec-egc1-ear

t790

hla/b/d/g/gv-lukED-sec-egc1-ear

B2-SL/02

B2-7

CC22

ST217

CC22

AMP/blaZ

B3-MA6/02

B3-1

CC8/239 t701

(ST6)

CC5

IV

AMP-[ERY-CLII]-TET/blaZ::Tn552-ermC-tetK

hla/b/d/gv-sea-bsaB-splF

B3-MA7/02

B3-2

CC8/239 t008

ST8

CC5

IV

AMP/blaZ

lukED-sek/q-ear-bsaB-splF

B3-MA8/02

B3-3

CC5*

CC25

IV

AMP/blaZ::Tn552

hla/d/gv-etd-lukED-seb-egc1-ear-bsaB-splF

B3-MA9/02

B3-4

CC8/239 t701

(ST6)

CC5

IV

AMP-[ERY-CLII]-TET/blaZ::Tn552-ermC-tetK

hla/b/d/gv-sea-bsaB-splF

B3-CC/02

B3-5

CC8/239 t701

(ST6)

CC5

IV

AMP-[ERY-CLII]-TET/blaZ::Tn552-ermC-tetK

hla/b/d/gv-sea-bsaB-splF

B3-SM (2)/02

B3 (6-1)

CC5

CC5

II

AMP/blaZ

hla/b/d/gv-lukED-egc1-splF

B3 (6-2)

CC5

t1560 (ST146)

CC5

II

hla/d/gv-lukED-egc1-splF

B3 (7-1)

CC5

t1560 (ST146)

CC5

II

hla/b/d/gv-lukED-egc1-splF

B3 (7-2)

CC5

t1560 (ST146)

CC5

II

AMP/blaZ

hla/b/d/gv-lukED-egc1-splF

B4-ER/06

LSP062266

CC30

t012

(ST30)

CC30

III

AMP/blaZ::Tn552

hld/g-tst-sea-egc2

LSP-PT/97

LSP 5836

CC5

t002

(ST5, ST231)

CC5

II

ERY/msrB

hla/b/d/g/gv-lukED-etd-sea/b/d/j/p/r-egc2-ear

LSP-PT/97

LSP 5919

CC8/239 t008

(ST8)

CC8/239 IV

AMP/blaZ

hla/b/d/g/gv-lukED-sea/b/d/j/p-egc2

B3-TC (2)/02

t7125 ST26

t1560 ST146

7. Anexos

A25

7. Anexos

A26
Tabla IIe (Continuacin). Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes de alimentos, brotes y manipuladores de
alimentos durante el periodo 1997-2008 (Articulo 7).
Origen (N)a/Ao
LSP-PT/97

Nombre
Aislamientos
LSP 6592

RM
testb
CC5

Tipo
spa
t002

MLSTc
ST5

CCd
CC5

Tipo
Perfil Resistenciae
agr
II
ERY/msrA-msrB-linA/linA
I

Perfil Virulenciaf
hla/d/gv-lukED-sed/j/p-egc1-ear-splF

LSP-HR/06

LSP061741

CC45

t015

ST45

CC45

AMP-[ERY-CLI ]/blaZ::Tn552-[ermA-ermC]

hla/b/d/g/gv-lukED-sea/c/l-egc2-ear

LSP-PT (5)/07

LSP071048-1

CC45

t015

(ST45)

CC45

AMP/blaZ::Tn552

hld/g-lukED-sea/c/l-egc2-ear

LSP-PT (5)/07

LSP071049-1 a -5

CC30

t840

ST30

CC30

III

AMP/blaZ::Tn552

hld/g-lukED-tst-sea-egc2

LSP-PT (5)/07

LSP071159-1 a -5

nt

t216

ST59

CC59

IV

hla/b/d/g/gv-sea/b/c/k/q-egc2-ear

LMUO-QU/07

LMUO-A4

CC30

t012

(ST30)

CC30

III

agrIII

LMUO-HG/07

LMUO-A2

CC45

t015

(ST45)

CC45

hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sea/d/j/r-egc2-ear

LMUO-HG/07

LMUO-A5

CC45

t604

ST546

CC45

III

hla/b/d/g/gv-lukED-tst-sea/d/j/r-egc1

LMUO-HG/07

LMUO-A6

CC5

t002

ST5

CC5

II

LMUO-HG/07

LMUO-A7

CC5

t2173 ST5

CC5

II

hla/d/gv-lukED-ear

CMA-MA10/08

LMUO-MA1

CC30

t166

ST34

CC30

III

AMP/blaZ::Tn552
[AMP-OXA]-[ AMK-GEN-KAN-TOB]-MUP
/[blaZ-SCCmec IVd]-[aacA+aphD-aphA]
[AMP-OXA]-CLI-[ AMK-GEN-KAN-TOB]-MUP
/[blaZ-SCCmec IVd]-nd-[aacA+aphD-aphA]
-

CMA-MA11/08

LMUO-MA2

nt

t3474 ST15

CC15

II

CMA-MA12/08

LMUO-MA3

nt

t272

ST51

CC121

IV

hla/b/d/gv-etb-egc2

CMA-MA13/08

LMUO-MA4

CC30

t166

(ST34)

CC30

III

hla/b/d/g-tst-seh-egc2-splF

hla/b/d/gv-lukED-sed/j/r-egc1-splF
hla/b/d/g/gv-lukED-sea/d/j/r-egc2-splF
hla/b/d/g-lukED-tst-egc2-splF

Las muestras proceden de cuatro brotes de intoxicacin alimentaria (B, de 1 a 4); del Programa de Seguridad alimentaria de la Agencia de Sanidad Ambiental y Consumo llevado a cabo
en el Laboratorio de Salud Publica del Principado de Asturias (LSP); de alimentos analizados en el Laboratorio de Microbiologa de la Universidad de Oviedo (LMUO); y de muestras
nasales de asistentes al curso para obtener el certificado de manipulador de alimentos (CMA). CA, cordero asado; CC, carro de centollo; EM, ensalada de marisco; ER, ensaladilla rusa;
HG, hamburguesa; HR, huevos rellenos; MA, muestra nasal de manipulador de alimentos; P, paella; PT, pastel; QU, queso; SM, salpicn de marisco; SL, solomillo de ternera; TC, tarta
de crema; VG, vegetales. N, nmero de aislamientos.
b
Test de restriccin-modificacin para deteccin de complejos clnales de Cockfield et al. (J Med Microbiol 2007, 56: 614-619). nt, no tipiflicable.
c
Las secuencias tipo (ST) entre parntesis se corresponden a ST presuntivos segn el tipo spa.
d
Complejo clonal (CC) en base a los resultados de la tipificacin por RM test, spa y MLST.
e
Perfil de resistencia frente a los antimicrobianos: ampicilina-penicilina (AMP), oxacilina-meticilina (OXA), amikacina (AMK), kanamicina (KAN), gentamicina (GEN), tobramicina
(TOB), cloranfenicol (CHL), eritromicina (ERY), clindamicina (CLIC constitutiva, CLII inducible), tetraciclina (TET), ciprofloxacina (CIP), moxifloxacina (MOX), linezolid, mupirocina
(MUP), rifampicina (RIF), sulfametoxazol/trimetoprima (SXT), trimetoprima (TMP), tigeciclina y vancomicina. Concentracin mnima inhibitoria a mupirocina: 40g/ml (B2-1, B2-2);
60g/ml (LMUO-A6, LMUO-A7); 1250g/ml (B1-3).
f
Hemolisina (hl), exfoliatina (et), leucotoxina (luk), enterotoxina (se), egc1 (cluster con seg-sem-sen-sei-seo), egc2 (cluster con seg-sem-sen-sei-seo-seu).

Tabla IIf. Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes de animales durante el periodo 2004-2008 (Artculos 10, 11 y 12).
Tipo
Perfil Resistenciac
agr
I
[MET-OXA]-[ERY-CLI-QUI/DAL(I)]-TET-[SXT-TMP]/blaZ-SCCmec V-[ermA-ermB]-[tetK-tetM]-dfrG

07S00011/07 AP-E

PFGE PFGE Clster Tipo


SmaI Cfr9I PFGE
spa
nt
C1
C
t034

ST398

07S00022/07 AP-E

nt

C2

t108

(ST398) I

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET/blaZ-SCCmec V-ermC-tetM

hla/b/d/g

07S00042/07 AP-E

nt

C3

t011

(ST398) I

[MET-OXA]-[GEN-KAN]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec nt-[aacA-aphD-aadD]-ermB-[tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

07S00077/07 AP-E

nt

C4

t011

ST398

[MET-OXA]-[GEN-KAN]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec IVa-[aacA-aphD-aadD]-ermC-[tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

07S00101/07 AP-E

nt

C5

t2576 (ST398) I

[MET-OXA]-TET/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

07S00107/07 AP-E

nt

C6

t2346 ST398

[MET-OXA]-TET/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

07S00112/07 AP-E

nt

C7

t034

(ST398) I

[MET-OXA]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-aadD-[ermA-ermB-ermC]-[tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

(ST398) I

Cepa/Ao

Origena

MLSTb

I
I

07S00122/07 AP-E

nt

C6

t011

07S00130/07 AP-E

nt

C8

t1451 (ST398) I

Perfil Virulenciad
hla/b/d/g

[MET-OXA]-TET-CIP/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

[MET-OXA]-TET/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]

hla/b/d/g
hla/b/d/g

07S00131/07 AP-E

nt

C6

t2011 (ST398) I

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-aadD-ermB-[tetK-tetL-tetM]-dfrK

07S00133/07 AP-E

nt

C8

t1451 ST398

[MET-OXA]-TET/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

07S00138/07 AP-E

nt

C6

t011

[MET-OXA]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

07S00159/07 AP-E

nt

C6

t1985 ST398

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-ermB-[tetK-tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

07S00167/07 AP-C

nt

C9

t034

07S00171/07 AP-B

nt

C10

t1255 ST398

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET/blaZ-SCCmec V-ermC-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/SCCmec V*-aadD-[ermA-ermB]-[tetL-tetM]

hla/b/d/g

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[ermA-ermB]-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

(ST398) I
I

(ST398) I

[MET-OXA]-[GEN-KAN]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V*-[aacA-aphD]-[ermA-ermB]-tetM-[dfrS1-dfrD] hla/b/d/g

07S00244/07 AP-C

nt

C11

t1928 ST398

07S00254/07 AP-E

nt

C1

t034

07S00289/07 AP-E

nt

C6

t2346 (ST398) I

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET/blaZ-SCCmec V-ermC-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

07S00295/07 AP-E

nt

C6

t1451 (ST398) I

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET/blaZ-SCCmec V-ermC-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

07S00347/07 AP-D

nt

C1

t108

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-[SXT-TMP]/blaZ-SCCmec V-ermC-[tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g
hla/b/d/g

(ST398) I

ST398

07S00361/07 AP-D

nt

C3

t1793 (ST398) I

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec nt-aadD-[ermA-ermB]-[tetL-tetM]-dfrK

07S00427/07 AP-E

nt

C6

t2970 ST398

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-ermA-[tetK-tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

07S00431/07 AP-E

nt

C1

t034

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-ermA-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

07S00435/07 AP-E

nt

C12

t108

(ST398) I

[MET-OXA]-TET-CHL/SCCmec V-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

07S00436/07 AP-E

nt

C13

t108

(ST398) I

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-CHL-TET-CIP/blaZ-SCCmec V*-ermC-tetM

hla/b/d/g

07S00448/07 AP-E

nt

C14

t011

(ST398) I

[MET-OXA]-KAN-TET-CIP-TMP/blaZ-SCCmec V-aphA-[tetK-tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

(ST398) I

7. Anexos

A27

7. Anexos

A28
Tabla IIf (Continuacin). Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes de animales durante el periodo 2004-2008 (Artculos 10, 11 y 12).
07S00449/07

AP-E

PFGE PFGE Clster Tipo


SmaI Cfr9I PFGE
spa
nt
C15
B
t011

(ST398)

Tipo
Perfil Resistenciac
agr
I
[MET-OXA]-[GEN-KAN]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec nt-ermC-[aacA-aphD-aadD]-[tetL-tetM]-dfrK

07S00450/07

AP-E

nt

C12

t108

(ST398)

[MET-OXA]-KAN-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-aadD-ermC-[tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

07S00464/07

AP-E

nt

C3

t034

(ST398)

[MET-OXA]-[GEN-KAN]-TET-TMP/blaZ-SCCmec nt-aadD-[ermA-ermB-ermC]-[tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

07S00467/07

AP-E

nt

C15

t011

(ST398)

[MET-OXA]-[GEN-KAN]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec IVa-[aacA-aphD]-ermC-tetM-dfrK

hla/b/d/g

Cepa/Ao

Origena

MLSTb

Perfil Virulenciad
hla/b/d/g

07S00475/07

AP-E

nt

C16

t034

(ST398)

[MET-OXA]-KAN-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec nt-aadD-[ermA-ermB-ermC]-[tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

07S00488/07

AP-E

nt

C6

t011

(ST398)

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-ermC-[tetK-tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

07S00491/07

AP-E

nt

C15

t011

(ST398)

[MET-OXA]-[GEN-KAN]-TET-TMP/blaZ-SCCmec IVa-[aacA-aphD]-tetM-dfrK

hla/b/d/g

07S00532/07

AP-A

nt

C17

t1250

ST398

[MET-OXA]-KAN-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec nt-aadD-[ermA-ermB-ermC]-[tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

07S00573/07

AP-D

nt

C1

t034

(ST398)

[MET-OXA]-[ERY-CLI-QUI/DAL]-TET-TMP/SCCmec V-[ermA-ermC]-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

07S00580/08

AP-B

nt

C12

t2576

(ST398)

[MET-OXA]-GEN(I)-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[aacA-aphD, aadD]-ermB-[tetK-tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

07S00605/08

AP-D

nt

C5

t034

(ST398)

[MET-OXA]-KAN-[ERY-CLI-QUI/DAL]-CHL-TET-TMP/SCCmec V-aphA-ermC-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

07S00610/08

AP-C

nt

C9

t034

(ST398)

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-CIP-TMP/blaZ-SCCmec V*-aadD-[ermA-ermB-ermC]-[tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

07S00622/08

AP-C

nt

C10

t1580

(ST398)

[MET-OXA]-TET/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

07S00632/08

AP-A

nt

C9

t571

(ST398)

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V*-aadD-[ermA-ermB]-[tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

07S00634/08

AP-A

nt

C12

t2576

(ST398)

[MET-OXA]-KAN-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-aadD-ermB-[tetK-tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

07S00640/08

AP-A

nt

C12

t2576

(ST398)

[MET-OXA]-TET/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

08S00001-1/08

nt

C18

t011

(ST398)

[MET-OXA]-KAN(I)-[ERY-CLI]-TET/blaZ-SCCmec V-aadD-ermC-[tetK-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

08S00001-2/08

PC
PC

nt

C18

t011

(ST398)

[MET-OXA]-KAN(I)-TET/blaZ-SCCmec V-aadD-ermC-[tetK-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

08S00001-5/08

PC

nt

C9

t034

(ST398)

[MET-OXA]-KAN-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V*-aadD-[ermA-ermB]-[tetL-tetM]

hla/b/d/g

08S00008-1/08

PC

nt

C19

t011

(ST398)

[MET-OXA]-[GEN-KAN]-TET/blaZ-SCCmec V-[aacA-aphD]-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

08S00156/08

PC

nt

C20

t034

(ST398)

[MET-OXA]-[ERY-CLI-QUI/DAL(I)]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[ermA-ermC]-[tetK-tetM]-[dfrG-dfrK]

hla/b/d/g

08S00177/08

PC

nt

C5

t011

(ST398)

[MET-OXA]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-ermB-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

08S00205/08

PC

nt

C1

t2510

ST398

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-aadD-ermB-[tetK-tetL-tetM]

hla/b/d/g

08S00294/08

PC

nt

C21

t011

(ST398)

[MET(I)-OXA]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

08S00020/04

MC

nt

C9

t034

(ST398)

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET/blaZ-SCCmec V*-ermA-tetM

hla/b/d/g

08S00023/04

MC

nt

C22

t011

(ST398)

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-CHL-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-aadD-[tetK-tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

Tabla IIf (Continuacin). Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes de animales durante el periodo 2004-2008 (Artculos 10, 11 y 12).
08S00027/04 MC

PFGE PFGE Clster Tipo


SmaI Cfr9I PFGE
spa
nt
C1
C
t034

Tipo
Perfil Resistenciac
agr
(ST398) I
[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[ermA-ermB-ermC]-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

08S00047/05 MC

nt

(ST398) I

hla/b/d/g

Cepa/Ao

Origena

C23

t034

MLSTb

[MET(I)-OXA]-[ERY-CLI]-TET-CIP-TMP/blaZ-SCCmec V-ermC-[tetK-tetM]-dfrG

Perfil Virulenciad

08S00051/05 MC

nt

C18

t011

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-[ERY-CLI]-TET/blaZ-SCCmec V-ermC-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

08S00053/05 MC

nt

C9

t034

(ST398) I

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V*-aadD-[ermA-ermB]-[tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

08S00063/05 MC

nt

C24

t034

(ST398) I

[MET-OXA]-[ERY-CLI-QUI/DAL]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-aadD-[ermA-ermB]-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

08S00074/05 MC

nt

C25

t011

(ST398) I

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-aadD-ermC-[tetK-tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

08S00078/06 MC

nt

C26

t108

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-TET-[SXT(I)-TMP]/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

08S00081/06 MC

nt

C5

t011

(ST398) I

[MET-OXA]-TET/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

08S00098/06 MC

nt

C5

t1451 ST398

[MET(I)-OXA]-CHL-TET-CIP-TMP/blaZ-SCCmec V-linA/linA'-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

08S00111/06 MC

nt

C11

t034

(ST398) I

[MET-OXA]-KAN-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V*-aadD-[ermA-ermC]-[tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

08S00115/06 MC

nt

C1

t034

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]-[ermA-ermB]-dfrG

hla/b/d/g

08S00116/06 MC

nt

C27

t034

(ST398) I

[AMP-PEN]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-ermC-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

08S00121/07 MC

nt

C6

t011

ST398

[AMP-PEN]-[TET/blaZ-SCCmec V-linA/linA'-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

08S00130/07 MC

nt

C16

t034

(ST398) I

hla/b/d/g

08S00133/07 MC

nt

C28

t011

(ST398) I

08S00134/07 MC

nt

C29

t034

(ST398) I

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[ermA-ermC]-[tetK-tetM]-dfrG
[MET(I)-OXA]-[GEN-KAN]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[aacA-aphD]-[ermB-linA/linA']-[tetK-tetLtetM]-dfrK
[MET-OXA]-KAN(I)-[ERY-CLI]-CHL-TET-TMP/blaZ-SCCmec V*-aadD-ermA-[tetL-tetM]-dfrK

08S00138/07 MC

nt

C14

t034

(ST398) I

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-ermA-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

08S00139/07 MC

nt

C5

t011

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-KAN(I)-[ERY-CLI]-CHL-TET/blaZ-SCCmec V-aadD-fexA-[tetK-tetL-tetM]-cfr

hla/b/d/g

hla/b/d/g
hla/b/d/g

08S00140/07 MC

nt

C14

t108

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-KAN(I)-[ERY-CLI]-CHL -TET-[SXT(I)-TMP]/blaZ-SCCmec V-aadD-[tetL-tetM]-ermC-dfrK

hla/b/d/g

08S00141/07 MC

nt

C14

t011

(ST398) I

hla/b/d/g

41-089/07

MC

nt

C20

t011

(ST398) I

41-090/05

MC

nt

C12

t108

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-CHL-TET-CIP-TMP/blaZ-SCCmec V-fexA-[tetK-tetM]-dfrG
[MET(I)-OXA]-[GEN-KAN]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[aacA-aphD-aadD]-ermC-[tetK-tetL-tetM]dfrK
[MET(I)-OXA]-KAN-[ERY-CLI]-TET-CIP-TMP/blaZ-SCCmec V-aadD-ermC-[tetL-tetM]-dfrK

41-092/06

MC

S1

S1

t318

ST433

-/-

hla/b/d/g-lukM-egc2-splF

41-093/06

MC

nt

C6

t011

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-KAN-TET/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

41-096/05

MC

S2

S2

t337

ST9

[AMP-PEN]-GEN-[ERY-CLI]-TET/blaZ-ermC-tetM

hla/b/d/gv-egc1

41-100/06

MC

nt

C6

t011

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-TET/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

III
III

hla/b/d/g
hla/b/d/g

7. Anexos

A29

7. Anexos

A30
Tabla IIf (Continuacin). Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes de animales durante el periodo 2004-2008 (Artculos 10, 11 y 12).
41-112/05

MC

PFGE PFGE Clster Tipo


SmaI Cfr9I PFGE
spa
nt
C5
C
t011

41-122/06

MC

nt

Cepa/Ao

Origena

C16

Tipo
Perfil Resistenciac
agr
(ST398) I
[MET(I)-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-/SCCmec V-aadD-[ermB-ermC]-[tetK-tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

MLSTb

Perfil Virulenciad

t034

(ST398) I

[AMP-PEN]-[ERY-CLI ]-TET/blaZ-aadD-ermC-tetM

hla/b/d/g

(ST398) I

[MET-OXA]-KAN-[ERY-CLI]-TET/blaZ-SCCmec V-aadD-ermC-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

08S00004/06 CP

nt

C12

t011

08S00007/08

S3

S3

t1430 ST9

08S00305/08 CC

nt

C1

t034

III

[MET-OXA]-KAN-[ERY-CLI]-TET-CIP-TMP/blaZ-SCCmec IVa-aadD-ermB-tetL-dfrK

hla/b/d/gv-egc1

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[ermA-ermB]-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

08S00415/08 CC

nt

C14

t034

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]-[dfrG-dfrK]

hla/b/d/g

08S00427/08

S4

S4

t002

ST5

[MET-OXA]-KAN-[ERY-CLI]-TET-CIP/blaZ-SCCmec nt-aphA-ermA-[tetK-tetM]

hla/d/gv-lukED-egc1-splF

08S00428/08 CC

nt

C18

t011

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-[ERY-CLI]-TET/blaZ-SCCmec V-ermC-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

IV

08S00434/08 CC

nt

C1

t034

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-[ERY-CLI-QUI/DAL]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[ermA-ermB-ermC]-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

08S00436/08 CC

nt

C16

t034

(ST398) I

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET/blaZ-SCCmec nt-ermA-tetM

hla/b/d/g

(ST398) I

08S00438/08 CC

nt

C11

t571

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V*-aadD-[ermA-ermB]-[tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

08S00440/08 CO

nt

C24

t5210 (ST398) I

[MET(I)-OXA]-[ERY-CLI-QUI/DAL(I)]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[ermA-ermB]-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d

08S00441/08 CO

nt

C30

t011

(ST398) I

[MET-OXA]-[GEN-KAN]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec IVa-[aacA-aphD-aadD]-ermB-[tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

08S00443/08 CO

nt

C30

t779

(ST398) I

[MET-OXA]-[GEN-KAN]-[ERY-CLI]-TET-TMP/SCCmec IVa-[aacA-aphD-aadD]-[tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g

08S00448/08 CC

nt

C12

t108

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-[ERY-CLI]-TET/blaZ-SCCmec V-ermC-tetM

hla/b/d

08S00452/08 CC

nt

C5

t034

(ST398) I

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-ermA-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

08S00453/08 CV

nt

C6

t011

(ST398) I

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET/blaZ-SCCmec V-[ermA-ermC]-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

08S00455/08 CO

nt

C31

t034

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-[ERY-CLI-QUI/DAL(I)]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[ermA-ermB]-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

08S00326/08 LV

nt

C6

t011

(ST398) I

[MET-OXA]-TET/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

08S00337

LV

nt

C18

t011

(ST398) I

TET/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

08S00352

LV

nt

C6

t011

(ST398) I

[MET-OXA]-TET/blaZ-/SCCmec V-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

08S00423

LV

nt

C18

t011

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-TET/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

08S00424

LV

nt

C6

t011

(ST398) I

[MET-OXA]-TET/SCCmec V-aadD-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

08S00290

PV

nt

C33

t011

(ST398) I

[MET(I)-OXA]-[GEN-KAN]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[aacA-aphD-aadD]-ermC-[tetK-tetL-tetM]-dfrK hla/b/d/g

08S00292

PV

nt

C1

t034

(ST398) I

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-[ermA-ermB-ermC]-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

MRSA 1/06

MH

nt

C34

t011

ST398

[MET-OXA]-GEN-[ERY-CLI]-TET/blaZ-SCCmec V-ermC-[tetK-tetM]

hla/b/d/g-seb

Tabla IIf (Continuacin). Caractersticas de los aislamientos de Staphylococcus aureus procedentes de animales durante el periodo 2004-2008 (Artculos 10, 11 y 12).
MRSA 2/07

MH

PFGE
SmaI
nt

MRSA 307

MH

nt

C12

t1457

ST398

[MET-OXA]-TET/blaZ-SCCmec V-[tetK-tetM]

MRSA 407

MH

nt

C14

t011

ST398

[MET-OXA]-TET-CIP-TMP/blaZ-SCCmec V-linA/linA'-[tetK-tetM]-dfrG

hla/b/d/g

MRSA 507

MH

nt

C35

t011

ST398

[MET-OXA}-KAN(I)-TET-TMP/blaZ-SCCmec V-aadD-[tetK-tetL-tetM]-dfrK

hla/b/d/g-seb

MRSA 3707

MC

nt

C32

t108

ST398

[AMP-PEN]-[ERY-CLI-QUI/DAL]-TET/blaZ-[ermA-ermC]-[tetK-tetM]

hla/b/d/g

Cepa/Ao

Origena

PFGE
Cfr9I
C2

Clster
PFGE
C

Tipo
spa
t108

ST398

Tipo
agr
I

[MET-OXA]-[ERY-CLI]-TET/blaZ-SCCmec V-ermA-[tetK-tetM]

Perfil
Virulenciad
hla/b/d/g
hla/b/d/g

MLSTb

Perfil Resistenciac

AP, cerdo portador nasal asintomtico del matadero A, B, C, D o E; CC, carne de cerdo; CP, carne de pollo; CO, carne de pavo; CV, carne de vaca; LV, leche de vaca; MC, muestra clnica de cerdo enfermo; MH,
muestra de heces de cerdo; PC, polvo de granja de ganado porcino, PV, polvo de granja de ganado vacuno; nt, no tipiflicable.
b
Las secuencias tipo (ST) entre parntesis se corresponden a ST presuntivos segn el tipo spa y/o PFGE Cfr9I.
c
Perfil de resistencia frente a los antimicrobianos: meticilina (MET), oxacilina (OXA), kanamicina (KAN), gentamicina (GEN), cloranfenicol (CHL), eritromicina (ERY), clindamicina (CLI), quinupristina-dalfopristina
(QUI/DAL), tetraciclina (TET), ciprofloxacina (CIP), linezolid, mupirocina (MUP), rifampicina (RIF), sulfametoxazol/trimetoprima (SXT), trimetoprima (TMP) y vancomicina. En las cepas sensibles a meticilina y
oxacilina se testaron tambin los antibiticos ampicilina (AMP) y penicilina (PEN).
g
Hemolisina (hl), exfoliatina (et), leucotoxina (luk), enterotoxina (se), egc1 (cluster con seg-sem-sen-sei-seo), egc2 (cluster con seg-sem-sen-sei-seo-seu).

7. Anexos

A31

7. Anexos

A32

Tesis Doctoral
Universidad de Oviedo

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