BACTERIOLOGÍA II

TALLER: BACILLUS, LISTERIA Y CORYNEBACTERIUM

2020-B

GRUPO 2

Integrantes: Ángela Gutiérrez, Ariatna Amaya, Andrea Álvarez, Yohandris Figueroa

1)Teniendo en cuenta que la identificación de los bacilos Gram positivos comienza

con las características microscópicas observadas de morfología, agrupación y algunas
estructuras típicas que los caracterizan, realice la caracterización fenotípica de los
géneros Bacillus, Listeria y Corynebacterium, mediante la revisión de las características
morfológicas, microscópicas y macroscópicas de las colonias de estos tres géneros.
Respuesta:
Caracterización fenotípica de Bacillus sp.
Características morfológicas y microscópicas

Son bacilos Gram positivos con forma de bastón alargado

recto, con bordes redondos, presentan gran número de
flagelos alrededor del cuerpo, algunas especies
son inmóviles que suelen observar en cadenas cortas y/o
largas.
Tienen esporas refringentes, la ubicación de esta se da de
acuerdo a la especie.

Características macroscópicas

En agar sangre se observan colonias de color grisáceo, beta- hemolíticas con diámetros
que oscilan desde los 2-8 mm de acuerdo a la especie.

Bacillus cereus Caracterización

Bacillus anthracis fenotípica desubtilis
Bacillus Listeria sp.
Características morfológicas y microscópicas
Son bacilos Gram positivos cortos, regulares, no esporulados ni ramificados, que suelen
observarse en disposición individual o formando cadenas cortas. En cultivos viejos pueden
aparecer formando filamentos de 6-20 mm de longitud. Presentan de 1 a 5 flagelos
peritricos que les confieren movilidad a 28ºC.

Características macroscópicas

En agar sangre se observan colonias pequeñas (de 1 a 2 mm

tras 24 o 48 h de incubación) y lisas. Al observarse a la lupa
con epiiluminación, con un ángulo de la luz de 45º-60º, se
observan reflejos de color azul-verdoso sobre una superficie
finamente granular.

Caracterización fenotípica Corynebacterium sp.

Características morfológicas y microscópicas

Son bacterias Gram positivas, exhiben dos o más formas estructurales durante su ciclo de
vida, pueden tener forma de cocobacilo, de varilla
filamentosa, de garrote o de mango de látigo. Pueden ser
rectas o con los extremos incurvados (es decir, son
pleomórficas). No son móviles, ni encapsulados y no
forman esporas, por lo general son rectos o ligeramente
curvados, formando agrupaciones denominadas letras
chinas. Su longitud va a estar comprendida entre 2 y 6
μm, mientras que su diámetro va estar cerca de los 0,5
μm.

Características macroscópicas

En agar sangre se observan colonias pequeñas,

granulosas, de color variable, blanco amarillento, gris o
negro. Sus bordes pueden ser continuos, dentados o
intermedios entre estos.
2) Realice el esquema para la identificación de estos tres géneros bacterianos: Para
esto, puede utilizar tablas, cuadros o flujogramas que le permitan identificar las especies

Identificación de bacilos Gram

positivos aerobios

Morfologia con tincion de

Gram

Bacilos rectos con bordes

Cocobacilos, bacilos cortos
redondeados

Listeria
Bacillus
Corynebacterium

Tincion de Albert Productor de esporas

Presencia de granulos Movilidad a

metacromaticos 28°C

Corynebacterium Listeria

Identificacion de Listeria
monocytogenes
 sangre

Cocobacilos Rojo metilo

Gram Positiva Colonias con Hidrolisis de TSI A/A Fermentacion de
positivos B-hemolisis esculina Positivo azucares
GAS (-)
positiva Urea
H2S (-)
Negativo
Prueba CAMP Nitratos
Glucosa,
Positiva Negativo maltosa,ramnosa
Motilidad , salicina
Positiva a Positivo
22°C Manitol
Negativo

3) De acuerdo al siguiente caso clínico, la patología del paciente y las características

fenotípicas microscópicas y macroscópicas de las colonias referenciadas, diga que
posible bacteria es la implicada en el proceso infeccioso y cuáles serían las pruebas
bioquímicas que usted haría para su identificación y confirmación de género y especie
(recuerden que las pruebas deben ir acompañadas con su respectiva foto explicar la
técnica y la interpretación de los resultados):

Mujer con 8 meses y medio de embarazo que presenta síntomas enfermedad

gripal leve auto limitada y más tarde presenta ligeros síntomas de sepsis por lo
que es hospitalizada y controlan permanentemente su estado físico. A los tres
días del parto el neonato presenta síntomas meníngeos y le solicitan un
hemocultivo. A las 24 horas de incubación, se observan pequeñas colonias
beta hemolíticas catalasa negativas y en el Gram se reporta pequeños bacilos y
cocobacilos Gram positivos. Con los datos de este caso clínico, diga cuál sería el
agente bacteriano implicado en este proceso infeccioso y realice un esquema de las
pruebas bioquímicas que se hacen para la identificación de este patógeno

Respuesta:
Pruebas bioquímicas

Tinción de Gram: Se procede a realizar un inoculo en la lámina, procurando extenderlo en

el centro de esta, se agrega cristal violeta en cantidad suficiente para cubrir el frote (2 a 3
gotas) y dejar actuar 1 minuto. Lavar con el mínimo de agua para eliminar el exceso de
colorante. Agregar lugol en cantidad suficiente para cubrir el frote (2 a 3 gotas) y dejar
actuar 1 minuto. Lavar con el mínimo de agua para eliminar el exceso de mordente.
Decolorar con alcohol acetona hasta que el efluente salga incoloro (30 segundos). Lavar
con agua para eliminar el exceso de disolvente. Agregar safranina en cantidad suficiente
hasta cubrir el frotis (2 o 3 gotas) y dejar actuar 1 minuto por ultimo lavar con agua para
eliminar el exceso del colorante de contraste, se deja secar la preparación a temperatura
ambiente y se observa al microscopio con los objetivos de 10x, 40x y 100x.

Catalasa: La catalasa es un enzima presente en la mayoría de los microorganismos que

poseen citocromos. Las bacterias que sintetizan catalasa hidrolizan el peróxido de
hidrógeno en agua y oxigeno gaseoso que se libera en forma de burbujas. Se coloca una
gota de H2O2 al 3% sobre un portaobjetos y luego se transfiere una porción de colonia
sobre el H2O2 realizándose una emulsión. En lo posible debe tomarse la colonia a partir de
un medio sin sangre ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasa y pueden falsear los
resultados. Esta prueba también puede realizarse en un aislamiento en tubo, simplemente
colocando unas gotas de H2O2 dentro del mismo.
Hidrolisis de la esculina: Se basa en la capacidad de ciertas bacterias para hidrolizar la
esculina en presencia de 1-4% de sales biliares. Procedimiento: Se inocula el
microorganismo en la superficie de un pico de flauta. Incubar 24 h. Interpretación: La beta
glucosada escinde la esculina en glucosa y esculetina. Esta última es soluble en el medio y
forma un complejo de color negro con Fe 3+. La hidrólisis de esculina se observa como un
oscurecimiento del medio (color negro) en 24 h de incubación a 35ºC, raramente se
requieren 48 h de incubación hasta que la hidrólisis sea aparente.
TSI: El agar TSI o agar hierro triple azúcar es un medio de cultivo sólido que sirve
como prueba bioquímica para orientar la identificación inicial de los bacilos Gram
negativos. Se fundamenta en evidenciar la fermentación de los azúcares presentes, y la
producción de sulfuro de hidrógeno y gas. Para realizar la prueba se inocula los tubos de
TSI con un asa de punta, se introduce la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo, luego de
retirar el asa del fondo, se estría el pico con un movimiento en zigzag, de un lado al otro.
Se incuba a 35 - 37°C durante 24 horas.
INTERPRETACIÓN: Se debe considerar los cambios de color en el pico y el fondo del tubo
y la formación de burbujas.
Cuando el medio es ácido (A) este se torna de color amarillo y cuando es alcalino (K)
permanece de color rojo.
El medio contiene glucosa, lactosa y sacarosa. Si el microorganismo sólo fermenta la
glucosa, el ácido producido en el fondo acidifica el medio en esa zona y se torna de color
amarillo (A).
Cuando el microorganismo fermenta la lactosa y la sacarosa, el ácido producido es
suficiente como para virar el color del medio a amarillo (A).
El medio permanece rojo cuando no se produce fermentación de ninguno de los azúcares
(K)
Si hay formación de gas durante el proceso de fermentación, en el fondo del medio se
observan burbujas o la ruptura del agar
Si las bacterias son productoras de SH2 este se evidencia como un precipitado negro en el
fondo del tubo. 
Rojo metilo: Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo
de fermentar la glucosa con producción de ácido por la vía ácido mixta o con producción de
un producto final neutro (acetoína) por la vía butanodiólica. Para la prueba Inocule con el
asa de platino el caldo R.M.V.P transfiriendo una porción de cultivo puro. Incube a 35°C por
24 a 48 horas.
Transfiera 5 mL del cultivo a un tubo y añada 5 gotas de solución indicadora de Rojo de
Metilo.
Una coloración roja, indicadora de la presencia de ácidos provenientes de la fermentación
de la glucosa, constituye un resultado positivo, una coloración amarilla constituye una
reacción negativa.

Urea: Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando una

molécula de dióxido de carbono y dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima
ureasa. Para la prueba se Inocula el medio de cultivo mediante estría en la superficie
inclinada e incubara 37 ºC durante 24 horas. Las bacterias que hidrolizan la urea hacen
que el medio de cultivo tome color fucsia, debido a la alcalinización del mismo por
producción de amonio, que manifiesta por un viraje del indicador de pH (rojo de fenol).

Reducción de nitratos: En esta prueba se detecta una respiración anaerobia: la que utiliza
nitrato como aceptor final de electrones. Los nitratos se reducen a nitritos y algunas
bacterias reducen los nitritos a productos gaseosos ( N 2 y N2O). Las enzimas responsables
de ambas reducciones se denominan nitrato y n, respectivamente.
Para la prueba, con el asa de platino transfiera al medio (caldo nitratado) una porción de
cultivo puro. Incube a 35°C por 12 a 24 horas.
Para determinar si el nitrato ha sido reducido a nitrito, después de la incubación, añádale al
medio de cultivo, 2 gotas de solución A, y luego 2 gotas de la solución B del reactivo de
Griess y mezcle. La aparición de una coloración rosada o roja indica que los nitratos han
sido reducidos a nitritos.

Fermentación de azucares: Las bacterias utilizan hidratos de carbono por uno de dos
procesos metabólicos, fermentativo u oxidativo. La principal diferencia es la necesidad de
oxígeno atmosférico y una fosforilación inicial. Por prueba se inoculan dos tubos de medio
y uno de ellos se sella con aceite mineral o parafina para impedir la entrada de oxígeno. La
fermentación requiere de una fosforilación inicial, utiliza las vías de la Glucólisis (Embden-
Meyerhof-Parnas EMP), de las Pentosas fosfato y Entner-Doudoroff. La oxidación de la
glucosa produce ácido pirúvico por una vía de derivación (Shunt), ocurre en condiciones
aerobias y no requiere de fosforilación inicial.
Para la prueba se utilizan medios de cultivo en tubo Hugh Leifson, se inoculan dos tubos
con el microorganismo, a uno se le agrega parafina con el fin de crear un medio
anaeróbico, se incuba a 35°C por 24 y se observa su color.

Motilidad: Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus
flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos, aunque existen algunas formas de cocos móviles. El medio
manitol movilidad permite la realización de esta prueba gracias a ser semisólido ya que presenta solamente 3,5 g/l de
agar. En estas condiciones, las bacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del medio debido a la
distribución aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmóviles permanecerán en la misma línea de
la picadura en que se sembraron.

Tinción de Albert: Es una coloración simple y de gran utilidad para el género

Corynebacterium. Muchos microorganismos, tanto procarióticos como eucarióticos, pueden
acumular gránulos de volutina, que se tiñen con colorantes básicos tales como azul de
metileno. Estos cuerpos de denominan también gránulos metacromáticos, porque
presentan un efecto metacromático, viéndose rojos cuando se tiñen con un colorante azul.
En las micrografías electrónicas aparecen como cuerpos extraordinariamente densos a los
electrones. Los gránulos deben su comportamiento metacromático a la presencia de
grandes cantidades de polifosfato inorgánico que constituyen una fuente de reserva
intracelular de fosfato.
Técnica: 1.- Efectuar un extendido fino. Fijar a la llama. 2.- Cubrir con colorante durante un
minuto. 3.- Lavar el portaobjeto con agua.

Prueba de CAMP: Es una prueba usada para identificar el grupo B de estreptococos

porque este grupo produce un péptido (CAMP) que actúa en presencia de la beta hemolisis
que produce S. aureus y se observa como un aumento en el efecto hemolítico. La prueba
se hace en agar de sangre y se inocula el S. aureus horizontal a la inoculación recta del
descocido. Si es positivo la prueba entonces se observa una hemolisis como en forma de
flecha.

Positivo

Negativo

Bibliografía:

 MARTINEZ, R.; VILLALOBOS DE B., L. Aislamiento de Listeria monocytogenes en

atún fresco expedido en la ciudad de Cumaná, Venezuela. Rev. Científ.,
FCV/LUZ. XIV(4): 354-357. 2014.
 ALMUZARA, N. Actualización en Bacilos Gram- positivos aerobios, no esporulados
de importancia clínica. Argentina. 2018
RYAN, K.; C. RAY, G., Sherris. Microbiología médica, 6e