UNIVERSIDAD NACIONAL DE HUANCAVELICA

FACULTAD DE CIENCIAS DE INGENIERÍA

CA ESCUELA PROFESIONAL DE ZOOTECNIA

GGG

INFORME DE LA PRACTICA N° 7 AISLAMIENTO E

IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

CURSO: MICROBIOLOGÍA

DOCENTE: Ing. Msc. CHÁVEZ ARAUJO, Elmer R.

ALUMNO: CONTRERAS FERNÁNDEZ, Filimón

CICLO: V

Huancavelica – 2018
 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

I. INTRODUCCIÓN
Los microorganismos en general defieren en su cantidad metabólica, que un
microorganismo pueda crecer y reproducirse, es decir sea capaz de llevar
acabo subproceso de biosíntesis, debe disponer de sus nutrientes necesarios.
Entre estos nutrientes tenemos: elementos energéticos, constituyentes,
elementos específicos que son variantes en cada microorganismo, y
condiciones fisicoquímicas adecuadas.
Todos estas condiciones son propias de un microorganismo y de acuerdo a
ello podemos aislarlo usando el medio apropiado e identificarlos tomando en
cuenta sus requerimientos nutricionales. En el comercio se encuentran
disponibles una variedad de medios bioquímicas para identificar la bacteria.
II. OBJETIVOS
 Aprender a usar las técnicas de la identificación de los
microorganismos.
III. MATERIAL Y MÉTODOS
Materiales:
 Muestra de agua de albañal
 Muestras de heces de animales
 Muestra de alimentos (leche de tigre)
 Placas Petri
 Agar macconkey
 Agar nutritivo
 Agar. SS
 Medio TSI
 Sim Medium
 Medio LIA
 Medio citrato de kosser
 Tubos de ensayo
 Asa bacteriológica
 Mechero
 Matraz
  Vaso precipitado

Para realizar el aislamiento e identificación de los microorganismos se preparó

medios de cultivo, ya que estos medios constituyen el aporte de nutrientes
indispensables para el crecimiento de los microorganismos.

Los microorganismos que sembramos fueron de heces de vacuno, agua de

albañal, muestra de alimento (leche de tigre).

Se preparo los medios de cultivo: Agar hierro y tripla azúcar (TSI), Agar citrato
de Simons, Agar lisina (lysine iron Agar: LIA) Y Sim Medium, cada una de
estos medios tiene sus funciones y de acuerdo a sus indicaciones que esta en el
envase, se preparo en 500 ml de agua destilada.

Agar citrato de Simons:

para la determinación de utilidad del citrato en enterobacterias. De acuerdo a las
indicaciones se prepara 24.2 g en un litro de agua (1000 ml), entonces para
nuestro medio que es de 500 ml será la mitad de 24.2 g, que es igual 12.1 g.
Tiene un pH: 6.9 +- 0.2 a 25° C.

Lysine Iron Agar: LIA: Este medio es para la

diferenciación de enterobacterias en especial salmonela y Arizona. Su
preparación es de 34.56 g en un litro de agua. Para 500
ml utilizamos 17.22 g de Lysine Iron Agar. Que tiene un pH: 6.7 +- 0.2 a 25°
C.

Agar hierro y triple azúcar. Es un medio para la diferenciación de los

microorganismos (enterobacterias). Su preparación es 64 g en un litro de agua. Y
para 500 ml utilizamos 32 g .tiene un pH: 7.3+- 0.2 a 25° C.

Sim Medium: es un medio para ver movilidad de los

microorganismos entéricos y hacer prueba de indol , su preparación es de 36.23
g en un litro de agua. Para 500 ml utilizamos 18.12 g . su pH: 7.3+- 0.2 a 25° C.

PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS.

Nota : Antes de realizar estos procedimientos de esterilizo las placas para

realizar nuestra siembra de microorganismos.
1. Se pesó cada uno de los medios en una balanza analítica de acuerdo nuestro
requerimiento. (para 500 ml)

2. S e p a r a m o s a
pesados, cubrimos con algodón, papel y sujetamos con un pabilo antes de pones
en la estufa para su ebullición.

3.
Agitamos suavemente poniendo al calor de una estufa hasta que realice la ebullición.

4. Teniendo todos
los medios realizados su ebullición llevamos al autoclave. Durante una hora.
5. Después de haber transcurrido el tiempo determinado sacamos del autoclave los
matraces con los medios y llevamos a la cámara de bioseguridad para servir el
medio a las placas que ya fueron esterilizadas.

6. L o s m e d i o s q u e

su posterior siembra por picadura.

 Teniendo los medios de cultivos preparados realizamos la siembra por estría.

Nota: para realizar la siembra tenemos que esterilizar o limpiar muestro área de
trabajo.

Método:

AISLAMIENTO DE Escherichia coli

1. Siembra por estría en placas que

contengan agar Mac Conkey e
incubamos a 37° C por 24 a 28
horas.

2. Después de las 48 horas sacamos

las placas del horno y observamos
el crecimiento de las colonias rojo
oscuro, blancas y negros que
contienen 0.5 mm de diámetro a
más.
3. Seleccionamos colonias
individuales y transferimos a tubos
de agar nutritivo en pico de flauta
y incubamos a 37° C por 24 horas.
Luego sembramos por picaduras
en tubos, TSI, LIA, Medio cítrico
kosser y el medio SIM. Estos
tubos serán debidamente
rotulados.

4. Después de incubar a 37° C a 24 a

72 anotamos los resultados. De
acuerdo al tés de identificación de
enterobacterias.y las reacciones
bioquímicas de enterobacterias.

Para ver en la tabla debemos considerar que los tubos hayan cambiado de color o
no, así como hay presencia de gases, y tener en cuenta que tipo de
microorganismo se ha sembrado. En este caso se sembró un agar Mac Conkey (-).

Tener en cuenta:
Hidrogeno sulfurado: (H2O) positivo: ( color negro en el tubo)
Anaerogénicos (gas negativo) : No hay presencia de gas en el tubo.
Anaerogénicos (gas positivo) : Hay presencia de gas en el tubo. (+, 2+,3+,4+)
K/K: No cambia de color (No fermentación de glucosa y lactosa)
K/A: Cambia de color (fermentación de glucosa solamente)
A/A: Cambio total de color (fermentación de glucosa y lactosa)

RESULTADOS
 Hidrogeno sulfurado (H2O) (-)
Anaerogénicos (Gas) (+) ; 3+
TSI K/A
LIA K/K
CITRATO (+)
Medio SIM (-)
Teniendo estos resultados de acuerdo a la prueba de bioquímica identificamos
una serratia (marcescens).
AISLAMIENTO DE Salmonella sp.

1. Sembramos por estría en placas

que contienen agar SS, e
incubamos a 37° C por 24 a 48
horas.

2. Luego picamos las colonias

representativas (redondas sin
coloración) y sembramos en los
tubos con agar en pico de flauta,
y incubamos a 37° C por 24
horas.

3. Luego sembramos por picadura

en los tubos en pico de flauta
contenidos de : 2 tubos TSI, 2
tubos de LIA, 2 tubos de Medio
cítrico de kosser y 2 tubos de Sim
Medium.
 4. Finalmente incubamos a 37° C
por 24 horas. Luego sacamos del
horno y anotamos los resultados.

RESULTADOS
Hidrogeno sulfurado (H2O) (-)
Anaerogénicos (Gas) (+) ; 3+
TSI K/A
LIA K/K
CITRATO (+)
Medio SIM (-)
Teniendo estos resultados de acuerdo a la prueba de bioquímica identificamos
una serratia (marcescens). Como en el caso anterior.

IV. RESULTADOS
AISLAMIENTO DE Escherichia coli

RESULTADOS
Hidrogeno sulfurado (H2O) (-)
Anaerogénicos (Gas) (+) ; 3+
TSI K/A
LIA K/K
CITRATO (+)
Medio SIM (-)
Teniendo estos resultados de acuerdo a la prueba de
bioquímica identificamos una serratia
(marcescens).

RESULTADOS
Hidrogeno sulfurado (H2O) (-)
Anaerogénicos (Gas) (+) ; +
TSI K/A
LIA K/K
CITRATO (+)
Medio SIM (-)
Teniendo estos resultados de acuerdo a la prueba de bioquímica identificamos
una serratia (marcescens). Como en el caso anterior.
Se encontró el mismo tipo de bacterias en los dos pruebas bioquímicas. Para
determinar esto nos basamos a la prueba de indol.

V. CONCLUSIONES

Concluimos la practica de aislamiento e identificación e microorganismos

conociendo todos los procedimientos que se realiza para identificar un
microorganismo, siguiendo los pasos que indico el docente.

Esta practica se concluyo identificando diferentes tipos de microorganismos en

los distintos grupos o mesas que se tuvo dentro del laboratorio.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Madigan M.T, Martingo J. M. y Jack Parker. 2004. Décima Edición.
Brock Biología de los Microorganismos Prentice Hall
 Mahon, C. and Manuselis G. 2000. Textbook of Diagnostic Microbiolgy.
Second Edition. W.B. Saunders Company. USA
 http://www.simiconsultora.com.ar/hobbyciencia/esterilizacion/esterilizac
ion htm
 http://www.alfinal.com/salud/esterelizo.html
 http://www.lafacu.com/apuntes/medicina/desinfectantes/default.htm
 Hajna, A. A. 1945. Triple-sugar iron agar medium for the identification
of the intestinal group of bacteria. J. Bacteriol. 49:516-517
 ACTIVIDAD:

1. Investigar sobre la identificación microbiana basados en métodos de biología

molecular.

Identificación microbiana: Se refiere a la identificación de los diferentes tipos de

microorganismos: Los métodos más utilizados para la identificación microbiana, los
podemos clasificar en:

O Métodos basados en criterios morfológicos

O Métodos basados en tinción diferencial
O Métodos basados en pruebas bioquímicas
O Métodos basados en tipificación con fagos
O Métodos basados en pruebas serológicas
O Métodos basados en detección molecular
Métodos basados en criterios morfológicos:
Los rasgos morfológicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas por muchos años
a clasificar organismos. Los organismos superiores tienen rasgos anatómicos tan
diferentes que pueden ser fácilmente utilizados en su clasificación, pero con respecto a
los microorganismos, éstos lucen bajo el microcoscopio tan similares que se dificulta su
clasificación. Es decir, que estos microorganismos que se ven tan parecidos bajo un
microscopio, pueden diferir en propiedades bioquímicas, fisiológicas y/o serológicas. Sin
embargo, aun cuando la morfología celular dice poco sobre las relaciones filogenéticas,
sigue siendo útil para la identificación bacteriana. Por ejemplo: la presencia de
endosporas y su localización resulta de mucha utilidad en la identificación de bacilos
esporulados.

Métodos basados en tinción diferencial

Es posible sacar conclusiones en relación con la morfología de una bacteria, examinando
una lámina que fue sometida a un proceso de tinción diferencial. Estos criterios
morfológicos encabezan las primeras etapas del proceso de identificación bacteriana. La
mayor parte de las bacterias, teñidas con Gram, las podemos clasificar como gram
positivas o gram negativas, otras tinciones diferenciales, como la ácido resistente, se
aplican a otro tipo de bacterias, como por ejemplo micobacterias. Un examen
microscópico de una lámina teñida por medio de gram o de una tinción diferencial es útil
para obtener una información rápida sobre la calidad de un ambiente clínico. Por otro
lado, un médico también puede obtener suficiente información de un reporte técnico de
laboratorio para comenzar el tratamiento apropiado de un paciente.

Métodos basados en pruebas bioquímicas

Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias. Estas
pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar
azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de compuestos, la producción de
compuestos coloreados, etc. Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden separarse en
dos especies diferentes con base a pruebas bioquímicas. Por ejemplo, las bacterias
entéricas gram negativas, forman un grupo muy grande y heterogéneo cuyo hábitat
natural es el tracto gastrointestinal de humanos y otros animales. Esta familia,
Enterobacteriaceae, incluye a varios patógenos que causan síndromes diarreicos. Un gran
número de ensayos han sido desarrollados de manera de identificar rápidamente al
patógeno, para que posteriormente el médico, con base al reporte, indique el tratamiento
adecuado, o para que los epidemiólogos puedan localizar la fuente de la infección.

Métodos basados en tipificación con fagos

La interacción entre un virus bacteriano (fago) y su célula bacteriana sensible es
sumamente específica, ya que el proceso de adsorción se encuentra mediado por
receptores específicos tanto en el virus como en la célula bacteriana. A una placa con
medio de cultivo sólido inoculado con un cultivo puro de una determinada bacteria, se le
añade una alícuota de un fago específico; éste puede ocasionar la lisis de las bacterias,
hecho que se evidencia en el cultivo como zonas claras definidas, denominadas placas,
que indican que hubo infección y lisis celular. El uso de fagos específicos permite
identificar y subclasificar bacterias dentro de una misma especie.

Métodos basados en pruebas serológicas

Los métodos serológicos, implican la utilización de preparaciones de inmunoglobulinas

específicas provenientes del suero o de un reactivo, y que pueden ser de gran utilidad en
la identificación microbiana en muestras puras o en muestras biológicas. Cada uno de los
métodos tiene su fundamento particular, pero en líneas generales, todos se basan en la
reacción de un antígeno presente en el agente microbiano con su anticuerpo
correspondiente. La solución que contiene los anticuerpos se denomina antisuero.
Métodos basados en biología molecular

Modernamente adquiere más importancia el uso de métodos basados en biología molecular

donde, a través de procedimientos y reactivos, se pueden detectar determinadas secuencias de
ADN que son propias de un determinado agente microbiano. El método que se está utilizando
ampliamente en los laboratorios de diagnóstico es el PCR (Polymerase Chain Reaction), que se
aplica generalmente para la identificación de- microorganismos que no pueden ser cultivados
por los métodos convencionales. A través de este método, puede aumentarse la cantidad de
ADN hasta niveles detectables mediante electroforesis o mediante sondas de ADN.

2. Averiguar el fundamento teórico del uso de Medio TIS, Medio LIA, Medio de
citrato de kosser.

Medio TIS:

Hajna desarrolló la fórmula de agar TSI añadiendo sacarosa a la fórmula de azúcar doble
(glucosa y lactosa) de agar Kligler hierro El agar triple azúcar hierro contiene tres
carbohidratos (glucosa, lactosa y sacarosa ). Cuando dichos carbohidratos se fermentan,
la producción resultante de ácido es detectada por el indicador rojo fenol. Se producen
cambios de color: amarillo para la producción de ácido y rojo para la alcalinización. Dado
que la lactosa y la sacarosa se encuentran presentes en concentraciones mucho más
elevadas que la glucosa, la formación de ácido en la base del tubo se debe a dichos
azúcares, mientras que la formación de ácido a partir de la glucosa es suprimida por la
rápida oxidación de una pequeña cantidad de ácido en el área inclinada del tubo, lo que
genera una reacción de pH neutro o alcalino cuando se fermenta sólo glucosa.

REACTIVOS:

BD Triple Sugar Iron Agar

Formula por litro de agua.

Digerido pancreático de caseína 10.0 g

Digerido péptico de tejido animal 10.0 g
Cloruro sódico 5.0 g
Lactosa 10.0 g
Sacarosa 10.0 g
Sulfato ferroso de amonio 0.2 g
Tiosulfato sódico 0.2 g
Rojo fenol 0.025 g
agar 13.0 g
pH: 7.3+_0.2. a 25° C Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de
rendimiento. Su preparación es 64 g en un litro de agua

Medio LIA:

Edwards y Fife diseñaron LIA en 1961 para identificar presuntivamente especies de

Salmonella, incluida la lactosa que fermenta Salmonella arizonae, que ha sido implicada
en brotes de gastroenteritis transmitidas por los alimentos. Esto se logra mediante la
eliminación de lactosa del medio, ya que algunas cepas de S. arizonae fermentan
activamente lactosa, que puede suprimir la producción de sulfuro de hidrógeno. Como
resultado, estas colonias pueden pasarse por alto en los medios que contienen lactosa, ya
que no se ven las colonias oscuras o negras características. Al eliminar la lactosa, estos
organismos producirán una gran cantidad de sulfuro de hidrógeno en el medio y pueden
detectarse. La incorporación de lisina es otra adición importante, ya que la mayoría de las
especies de Salmonella producen la enzima lisina descarboxilasa. Las especies de Proteus
y Providencia también pueden ser presuntamente identificadas en este medio, ya que
producen un sesgo rojo y un extremo alcalino.
REACTIVOS.
Lysine Iron Agar: LIA
Formula por un litro de agua.
Digerido pancreático de gelatina 5.0 g
Extracto de levadura 3.0 g
dextrosa 1.0 g
l-lisina 10.0 g
Citrato férrico de amonio 0.5 g
Tiosulfato sódico 0.04 g
Purpura de bromocresol 0.02 g
agar 13.5 g
Su preparación es de 34.56 g en un litro de agua. Para 500 ml utilizamos 17.22 g
de Lysine Iron Agar. Que tiene un pH: 6.7 +- 0.2 a 25° C.

Medio de citrato de kosser:

Simmons Citrate Agar (agar citrato Simmons) es un medio de cultivo para la
diferenciación de bacterias gram negativas mediante la utilización de citrato.
REACTIVOS
Su preparación es 5.3 g por litro de agua.