Análisis de Comunidades Microbianas PDF

Análisis de comunidades microbianas
presentes en la cueva de Doña

Trinidad (Ardales, Málaga) utilizando
cultivos y métodos moleculares
basados en ADN y ARN
Memoria que presenta

Francesca Stomeo
para optar al título de Doctor en Biología
En Sevilla, a 6 de Octubre de 2008

© Francesca Stomeo
Portada: Charles Xavier Pèry Rato
Diseño y Maquetación: Francesca Stomeo
Edita: Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de
Sevilla, CSIC
ISBN: 978-84-691-5167-9
Portada: Fotografía de colonizaciones blancas sobre un espeleotema de la
entrada de la Cueva de Doña Trinidad.
Contraportada: Fotografía de pigmentos rojos presentes en una pared de la
Cueva de Doña Trinidad
Impreso en España
Análisis de comunidades microbianas
presentes en la cueva de Doña
Trinidad (Ardales, Málaga) utilizando
cultivos y métodos moleculares
basados en ADN y ARN
Visado en Sevilla, a 6 de Octubre de 2008
EL DIRECTOR
Dr D. Juan Miguel González Grau

Científico Titular del CSIC
EL TUTOR
Dr. D. Miguel Angel Caviedes Formento

Profesor Titular de Facultad de
Farmacia de la Universidad de Sevilla
Memoria que presenta
Dña. Francesca Stomeo

para optar al grado de Doctor en Biología
DOCTOR D. LUIS CLEMENTE SALAS, DIRECTOR DEL INSTITUTO DE
RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO
SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
Certifica: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Análisis de

comunidades microbianas presentes en la Cueva de Doña Trinidad (Ardales,
Málaga) utilizando cultivos y métodos moleculares basados en ADN y ARN”
presentada por Dña. Francesca Stomeo para optar al grado de Doctor en
Biología, ha sido realizada en el Departamento de Geoecología,
Biogeoquímica y Microbiología Ambiental, bajo la dirección del Dr. D. Juan
Miguel González Grau, reuniendo todas las condiciones exigidas a los
trabajos de Tesis Doctorales.
En Sevilla, a 6 de Octubre de 2008

Agradecimientos:
Este trabajo ha sido posible gracias a la financiación del proyecto europeo

MARIE CURIE ACTION (EARLY STAGE TRAINING) “Advanced Research
Training on the Conservation of Cultural Heritage” MEST-CT2004-513915 y
gracias a la Conserjería de Cultura, Dirección General de Bienes Culturales,
Convenio para el estudio de la cueva de Ardales.
Además deseo expresar mi agradecimiento al Dr. D. Juan Miguel González

Grau por haber sido desde el principio un ejemplo a seguir.
Al profesor Dr. D. Cesaréo Saíz-Jimenéz por su apoyo y disposición

constante.
A todos mis compañeros del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología

de Sevilla por el ayuda que me han ofrecido desde el principio. En particular
a Katya con la que he recorrido este camino desde el primer paso.
A todos los amigos de Sevilla quienes han hecho de mi estancia en Sevilla

una de las temporadas más felices de mi vida. Por haberme hecho sentir
siempre como en mi casa.
A los amigos de siempre, simplemente por estar a pesar de la distancia.
A mi familia, porque siempre gracias a vosotros.
A los viajes, a la música y a quien sabe sonreír.

Índice
I
II
Índice
Índice I
Capitulo1: Introducción 1
1.1 Microbiología de ambientes subterráneos 3
Diversidad microbiana 3
Microorganismos y deterioro en ambientes
subterráneos 10
Características de los ambientes subterráneos 18
1.2 Técnicas microbiológicas para el estudio

de comunidades microbianas naturales 20
1.3 Objetivos de la tesis 27
Capitulo 2: Materiales y Métodos 29
2.1 Descripción de la Cueva de Doña Trinidad 31
2.2 Estudio de las comunidades bacterianas 36
Muestreo 37
Análisis de muestras 38
2.2.1 Análisis moleculares 44
Extracción de ADN 44
Extracción de ARN 44
Amplificación por PCR de genes de ARNr 45
III
Índice
Geles de Agarosa 46
DGGE
(Electroforesis en gradiente químico desnaturalizante) 48
Construcción de genotecas 50
Selección de clones 51
Extracción de plásmidos 52
Digestión de plásmidos 52
Secuenciación de ADN 53
Bioinformática y procesamiento de clones 53
Cobertura de comunidades bacterianas por clones
secuenciados 54
2.2.2 Cultivos 55
2.2.3 Actividades enzimáticas 56
2.2.4 Metabolismo de hidratos de carbono 56
2.2.5 Colonización por Pseudonocardia 57
2.2.6 Medios de cultivos 60
Caldo de Triptona soja (TSB) 60

Medio TSA 60
Medio TSA 1/1000 60
Medio LB (Luria-Bertani) 61
Caldo Nutritivo 61
Medio NB 61
Medio Acido húmico 62
Cultivos de Acidobacteria 62
IV
Índice
Medio con suelo para Acidobacteria 62

Medio base para Acidobacteria 62
2.2.7 Soluciones y Tampones 63
Solución EDTA 0.5M, pH 8,0 63

Tris-HCL 1M pH 7,5 64
Tampón TAE 50x (Tris-Acetato-EDTA) 64
Tampón de carga para DGGE 64
Tampón de carga para electroforesis en gel de agarosa 64
Solución 0% de desnaturalizante para DGGE 64
Solución 80% de desnaturalizante para DGGE 65
Solución SDA o de alta concentración de agentes
desnaturalizantes 65
Solución SDB o de baja concentración de agentes
desnaturalizantes 65
Trace element solution 65
Solución stock de vitaminas 66
Tampón fosfato salino (PBS) 10x 67
2.3 Estudio de las comunidades fúngicas 68
Muestreo 69
2.3.1 Análisis molecular 72
Amplificación por PCR de fragmentos de genes de ITS

y genes ARNr 72
Geles de Agarosa 74
Purificación de los productos de PCR 74
V
Índice
Secuenciación de ADN 74
Procesamiento de secuencias y análisis bioinformático 75
Construcción de genotecas 75
Selección de clones y su procesamiento 75
Selección de las levaduras por DGGE y RAPD 76
Cobertura de comunidades fúngicas por aislados obtenidos 77
2.3.2 Cultivos 77
Aislamiento y caracterización morfológica 77
2.3.3 Colonización por Fusarium 78
2.3.4 Medios de cultivos 79
Medio MA (extracto de Malta-Agar) 79

Medio Czapeck Agar 79
Medio R2A 80
Medio Dextrosa Rosa Bengala 80
Medio YPD 81
Capitulo 3: Resultados 83
3.1 Comunidades bacterianas en la cueva de

Doña Trinidad 85
3.1.1 Comunidades bacterianas de las

muestras de suelo 85
Análisis de genotecas 86
VI
Índice
Genotecas de ADN 86
Genotecas de ARN 86
Cultivos 87
Comparación de los resultados obtenidos por distintos
métodos 90
3.1.2 Comunidades bacterianas de

las muestras de grabados 92
Análisis de genotecas 92
Genotecas de ADN 92
Genotecas de ARN 92
Comparación de los resultados obtenidos en base a ADN y
ARN 93
3.1.3 Comunidades bacterianas de los

pigmentos rojos 96
Análisis de las genotecas 96

Genotecas de ADN 96
Genotecas de ARN 96
ARN 97
3.1.4 Comunidades bacterianas en trazos negros 100

Genotecas de ADN 100
Genotecas de ARN 100
VII
Índice
Comparación de los resultados obtenidos a través de 101

distintos métodos
3.1.5 Comunidades bacterianas en

colonizaciones blancas 104

Genotecas de ADN 104
Genotecas de ARN 105
ARN 109
Cultivo de Pseudonocardia 109

Ensayo de colonización por Pseudonocardia 113
3.1.6 Comparación de los distintos grupos

bacterianos encontrados en las muestras
analizadas por métodos moleculares 119
3.1.7 Cultivos a partir de otras muestras 124
3.1.8 Análisis global de las secuencias obtenidas 129
3.1.9 Curvas de cobertura 133
3.2 Comunidades fúngicas en la Cueva de Doña

Trinidad 137
3.2.1 Muestras de suelo 137
VIII
Índice
3.2.2 Muestras de escalones y espeleotema 138
3.2.3 Muestras de aire de la cueva 143
3.2.4 Muestras de excrementos 144
3.2.5 Técnicas moleculares aplicadas a la

detección de hongos 147
3.2.6 Ensayo de colonización por Fusarium 148
3.2.7 Curva de cobertura 154
Capitulo 4: Discusión 157
4.1 Diversidad bacteriana en la Cueva de Doña Trinidad 159
4.1.1 Proteobacteria 161
4.1.2 Actinobacteria 167
4.1.3 Cultivos y colonización por Pseudonocardia 172
4.1.4 Grupos bacterianos minoritarios encontrados en

las muestras 173
4.1.5 Acidobacteria 177
4.1.6 Bacterias Reductoras de Sulfato 179
IX
Índice
4.1.7 Evaluación de la diversidad bacteriana en la

Cueva de Doña Trinidad y métodos empleados
para detectarla 183
4.2 Diversidad fúngica en la Cueva de Doña Trinidad 188
4.2.1 Ascomycota 189
4.2.2 Colonización por Fusarium 194
4.2.3 Otros hongos minoritarios detectados 195
4.2.4 Basidiomycota 198
4.2.5 Evaluación de la diversidad fúngica detectada en

la Cueva de Doña Trinidad y métodos empleados
para detectarla 200
4.3 Aspectos relacionados con la conservación de la

cueva (en relación con los resultados obtenidos) 204
Capitulo 5: Conclusiones 209
Bibliografía 215
Apéndice 265
Tabla 1 267
Tabla 2 275
Tabla 3 280
X
Capitulo 1: Introducción
1
2
Introducción
1.1 Microbiología de ambientes subterráneos
Diversidad microbiana
Los microorganismos constituyen el grupo de organismos más

diverso de nuestro planeta dando lugar a comunidades muy
dinámicas y con capacidades metabólicas extraordinarias (Brock y
Madigan, 2000). Además, los microorganismos también tienen la
capacidad de adaptarse rápidamente a condiciones nuevas
(Cases y otros, 2002). Sin embargo, hoy en día se considera que
aún sólo se conoce un mínimo porcentaje del total de las especies
microbianas existentes (Curtis y otros, 2002).
Las teorías actuales sobre la distribución de microorganismos en

los diferentes ecosistemas se asientan sobre la cita de Baas-
Becking (“Everything is everywhere, but, the environment selects”)
según la cual los microorganismos pueden encontrarse en
cualquier sitio, pero el ambiente los selecciona (Baas-Becking
1934; Van der Gast y otros, 2005). Estudios sobre la biodiversidad
y biogeografía microbianas (Garcia-Pichel y otros, 1996; Zwart y
otros, 1998; Richards y otros, 2005) han utilizado este principio
para explicar la estructura de comunidades microbianas y su
organización en micronichos. El papel de la dispersión de
microorganismos sobre la diversidad de comunidades microbianas
también ha sido destacado en varios estudios (Hubbel 2001; de
Wit y Thierry Bouvier, 2006; Portillo y otros, 2007a). Asimismo, en
los últimos años, algunos autores (Zhou y otros, 2002; Whitaker y
otros, 2003; Zaballos y otros, 2006) han comprobado que existen
hábitats relativamente cerrados con microorganismos
determinados, lo que confirma que el ambiente puede ser selectivo
3
Introducción
sobre la composición de dichas comunidades microbianas.
Hoy en día somos conscientes de que sólo una porción

extremadamente baja de microorganismos puede ser cultivada
utilizando métodos de cultivo convencionales (Fry, 1990). Por otro
lado, a pesar de los nuevos métodos moleculares, independientes
del cultivo, se considera que es prácticamente imposible conocer
la totalidad de la diversidad microbiana de una comunidad natural,
debido tanto a los límites de los métodos de detección como a la
elevada cantidad de microorganismos existentes (Pommier y
otros, 2005; Curtis y otros, 2002).
Los genes de ARN ribosómico (ARNr), a causa de su ubicuidad y

su alto grado de conservación, han sido seleccionados para
estudiar la filogenia de los microorganismos (Woese, 1987). Las
células de todos los organismos contienen genes ribosómicos y
por ello, sus similitudes y discrepancias pueden utilizarse para su
identificación y trazar su filogenia permitiendo construir
dendrogramas evolutivos. Dado que es imposible identificar
bacterias y hongos exclusivamente por sus características
morfológicas a través de observaciones microscópicas (Anderson
y otros, 2004), la posibilidad de asignar microorganismos a
categorías taxonómicas en base a su información genética o
molecular ha permitido un gran avance de la microbiología.
Comparando las secuencias de genes ARNr, Woese estableció un
primer árbol filogenético que sirvió para relacionar todos los seres
vivientes y obtener una visión evolutiva universal (Woese 1977,
1987). La comparación de secuencias de la subunidad pequeña
de los genes de ARNr permitió la clasificación de todas las formas
vivientes en tres dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya (Fig. 1.1).
4
Introducción
Figura 1.1. Árbol filogenético simplificado de los organismos vivos basado

en secuencias de las subunidades pequeñas de genes de ARNr. Se
destaca la distinción entre los tres dominios: Bacterias, Archaea y
Eucarya.
Los estudios filogenéticos basados en secuencias de las

subunidades pequeñas del gen ARN ribosómico de
microorganismos han enriquecido sorprendentemente el
conocimiento actual sobre la diversidad bacteriana en nuestro
planeta. En el año 1987 se conocían sólo 12 divisiones de
bacterias y gradualmente han aumentado hasta proponerse 52
divisiones bacterianas en el año 2003 (Rappé y Giovannoni,
2003). En la actualidad las bacterias se clasifican en más de cien
divisiones distintas (Fig. 1.2).
5
Introducción
Figura 1.2. Árbol filogenético de las divisiones del domino Bacteria según
Rappé y Giovannoni (2003). En negro se indican las doce divisiones
descritas por Woese (1987). En blanco las divisiones que se han
conseguido cultivar desde 1987 hasta 2003 y en gris las divisiones que a
finales de 2003 no tenían ningún representante cultivado.
6
Introducción
Por tanto, es fácil comprender el gran avance que la microbiología

ha experimentado en los últimos años. Un caso similar ha ocurrido
con las Archaea entre las que también se ha descubierto la
existencia de nuevas ramas divergentes a los dos grandes grupos
clásicos, Crenarchaeota y Euryarchaeota (Barns y otros, 1994;
1996).
La clasificación del dominio Eukarya presenta serios

inconvenientes y es muy ambigua exceptuando el caso de Plantas
y Animales. Los hongos, por ejemplo, son un amplio grupo con
graves lagunas taxonómicas (Hibbett y otros, 2007). Los hongos
son un grupo heterogéneo dentro de los organismos eucarióticos
(Hawksworth, 2001) cuya clasificación molecular en base a la
secuencia de sus genes está en sus inicios (Kirk y otros, 2000).
Por ello, los estudios moleculares de la evolución fúngica sugieren
el empleo de análisis de genes que codifican las subunidades
pequeñas (5S) y grandes (18S y 28S) de las moléculas de ARN
ribosómico (White y otros, 1990; Wainwright y otros, 2004) así
como secuencias de la región intergénica entre las subunidades
grande y pequeña del ARNr (ITS) (Liu y otros, 1997;
Vandenkoornhuyse y otros, 2002). Las ITS proporcionan una tasa
de evolución rápida que conlleva una elevada variedad entre
especies altamente relacionadas superior a la encontrada en
estudios de las regiones conservadas del 18S (Lord y otros, 2002;
Anderson y otros, 2003b). Actualmente, no hay un consenso
general con respecto a la estructura filogenética de los hongos
aunque las dos divisiones superiores, Ascomycota y
Basidiomycota, resultan claramente delineadas (James y otros,
2006). Con respecto a los hongos inferiores Zygomycota y
Chytridiomycota existen numerosas propuestas. La clasificación
7
Introducción
más reciente (Hibbett y otros, 2007) propone seis divisiones y

cuatro subdivisiones adicionales (Figura 1.3).
Figura 1.3. Árbol filogenético del reino Fungi con la adición de las ramas
recientemente propuestas (Hibbett y otros, 2007).
La taxonomía y filogenia microbiana (incluyendo los tres dominios)

presentan grandes complicaciones derivadas en general de su
enorme diversidad. Este problema se acentúa por la existencia de
errores de clasificación en bases de datos de ADN (González y
otros, 2005) así como por la ausencia de categorías taxonómicas
bien definidas (Roselló-Mora y Amann, 2001). A este respecto, por
ejemplo, el concepto de especie en Bacteriología es un término
que presenta una gran polémica (Palleroni y otros, 1997; Roselló-
Mora y Amann, 2001). Una de las consecuencias de la enorme
diversidad microbiana existente en nuestro planeta es que existe
un gran número de microorganismos con un amplio rango de
8
Introducción
metabolismos diferentes. Por ejemplo, distintos microorganismos

pueden utilizar diversos nutrientes y fuentes de energía para
desarrollarse.
En cuanto a la fuente de energía utilizada, los organismos se

pueden clasificar en fotótrofos o quimiótrofos. Los primeros utilizan
la luz como fuente de energía mientras que los quimiótrofos
dependen de las reacciones de reducción y oxidación de
compuestos orgánicos e inorgánicos para obtener energía. Los
organismos autótrofos utilizan el dióxido de carbono como fuente
principal de carbono y los heterótrofos requieren una fuente de
carbono orgánica. La combinación de las fuentes de energía y de
carbono permite clasificar los organismos dentro de las siguientes
categorías nutricionales: fotoautótrofos, fotoheterótrofos,
quimioautótrofos y quimioheterótrofos. Existen microorganismos
capaces de crecer a baja o alta temperatura (psicrófilos y
termófilos, respectivamente), a alto o bajo pH (alcalófilos y
acidófilos, respectivamente), a alta salinidad (halófilos), a elevada
presión (barófilos) y a baja disponibilidad de agua (xerófilos).
Además, los microorganismos que requieren oxígeno para vivir se
definen como aerobios estrictos. Otros sólo crecen en ausencia de
oxígeno (anaerobios estrictos) y otros pueden crecer tanto en
anaerobiosis como en aerobiosis (anaerobios/aerobios
facultativos) dependiendo del metabolismo que lleven a cabo y de
las condiciones ambientales existentes. Los microorganismos
microaerófilos viven en presencia de concentraciones bajas de
oxígeno pero menores que las presentes en el aire.
Gracias a su diversidad tan elevada, los microorganismos

participan significativamente en la mayoría de procesos
9
Introducción
biogeoquímicos en nuestro planeta y muchos de estos pasos los

realizan únicamente los microorganismos (Pace y otros 1997;
Whitman y otros 1998).
Microorganismos y deterioro en ambientes subterráneos
Los monumentos y las obras de arte están sometidos a factores

físicos, químicos y biológicos que inducen efectos negativos. Entre
estos, los producidos por microorganismos dan lugar a los
llamados procesos de biodeterioro.
Una vez que microorganismos específicos encuentran un

ambiente óptimo en el que puedan llevar a cabo su metabolismo,
se desarrollarán, generalmente creando interacciones entre sí y
con el substrato y serán capaces de colonizar tanto substratos
orgánicos como inorgánicos.
Los monumentos a menudo ofrecen un escenario adecuado para

el crecimiento de distintos microorganismos, proporcionándoles
nichos y hábitats en los cuales éstos pueden establecerse
llegando a formar complejas comunidades, muchas veces con
consecuencias negativas para el monumento estudiado.
En los últimos años se ha acumulado una considerable cantidad

de información sobre los microorganismos que colonizan
monumentos. Diferentes grupos fisiológicos de organismos han
sido definidos como “agentes biodeteriorantes”, por ejemplo,
líquenes, algas, cianobacterias, hongos y bacterias que, entre
otras acciones, pueden participar en la formación de biopelículas
que cubren los monumentos. Estas biopelículas están
10
Introducción
generalmente compuestas por comunidades complejas de

microorganismos que crecen embebidos en una matriz de
exopolisacáridos y están estrictamente asociados con el substrato,
interactuando entre ellos para facilitar su desarrollo y expansión
(Costerton, 1995).
En los ambientes subterráneos, como cuevas y catacumbas, en

los cuales la temperatura es relativamente constante y la humedad
es generalmente elevada existe un hábitat favorable para
numerosos microorganismos (Agarossi, 1992). El substrato, los
intercambios entre el exterior y el interior y muchos otros factores
influyen sobre las especies presentes en un ambiente subterráneo
y su abundancia. Esta flora microbiana en ambientes subterráneos
no está necesariamente asociada con procesos de biodeterioro;
bacterias, hongos y comunidades fototróficas se encuentran
también en ambientes donde no se perciben fenómenos
macroscópicos de alteración. A pesar de esto, si las condiciones
particulares lo permiten, la acumulación de un excesivo
crecimiento microbiano puede afectar peligrosamente a la
conservación de determinados ambientes subterráneos. Manchas
debidas a los productos del metabolismo o al crecimiento de
hongos y bacterias pueden deteriorar dichos ambientes alterando
la estética y composición de pigmentos y grabados.
Un riesgo, que no hay que subestimar, como causa de biodeterioro

o incluso como causa desencadenante de éste, es la apertura del
ambiente hipogeo a las visitas, sobre todo cuando la afluencia es
elevada y/o se han utilizado fuentes de iluminación (y en
consecuencia de calor y luz) para facilitar la visita y mejorar la
visión de las representaciones artísticas del lugar. Los cambios de
11
Introducción
temperatura y humedad y la alteración de los intercambios con el

exterior, causados por la presencia del hombre, facilitan el
asentamiento de microorganismos que pueden provocar daños,
muchas veces irreversibles. Las luces necesarias para las visitas,
inducen el crecimiento de algas y cianobacterias. En este caso
muchos son los ejemplos que se pueden enumerar, entre los
cuales caben mencionar la Cueva de Altamira (Santillana del Mar,
Cantabria) y la Cueva de Lascaux (Francia). Ambas cuevas
recibieron en el pasado un elevado número de visitantes. Hoy en
día están cerradas al público y los visitantes pueden observar sus
representaciones artísticas en las replicas de estas cuevas.
Las pinturas rupestres que se hallan en los ambientes

subterráneos, constituyen un posible hábitat para el desarrollo de
microorganismos. De hecho, por lo general, las pinturas están
compuestas por pigmentos que contienen un amplio rango de
componentes entre los cuales destacan hematita, óxido de
manganeso, arcilla y carbón vegetal mezclados con algún
aglutinante orgánico, resina o grasa. Ellos proporcionarían
diferentes nichos ecológicos que pueden ser utilizados por
microorganismos. Su desarrollo está favorecido, además, si se
consideran las particulares condiciones ambientales de estos
lugares (entre otras, temperatura estable a lo largo del año y
elevado nivel de humedad). El crecimiento de microorganismos
sobre las pinturas en cuevas puede originar daños tanto estéticos
como estructurales. Entre los daños estéticos hay que considerar
la decoloración de los pigmentos y la formación de manchas; entre
aquellos estructurales están la fractura y la desintegración de la
capa de pintura o su soporte así como trasformaciones químicas
fruto del metabolismo microbiano.
12
Introducción
Un ejemplo típico del posible daño provocado por hongos, aunque

no relacionado con ambientes subterráneos es la colonización de
hongos en los frescos del Monasterio de la Rabida (Saiz-Jiménez
y Samson, 1981). Se observó que, al principio, el crecimiento de
los hongos estaba relacionado únicamente con daños estéticos
dado que no se había detectado ninguna alteración de la
superficie pintada. Posteriormente, los hongos se desarrollaron en
profundidad. Las hifas penetraron en la capa de pintura
degradando algunos de sus componentes, produciendo una
disminución de la cohesión de la capa de pintura, exfoliación, y
fracturas. Estos daños probablemente se debían a los metabolitos
y a las enzimas extracelulares secretadas por los
microorganismos. Todo ello dio lugar a cambios de coloración en
las pinturas y afectó a su estabilidad y la de su substrato.
Asimismo, organismos fotótrofos como cianobacterias, musgos,

algas y diatomeas consiguen crecer en ambientes hipogeos a
pesar de la escasa irradiación disponible para la actividad
fotosintética. Su capacidad de adaptación gracias a la cual
consiguen ajustar la fotosíntesis y los pigmentos a la composición
espectral y a la intensidad de luz que encuentran, les permite
llegar a desarrollarse en cuevas, necrópolis y catacumbas
(Albertano y otros, 1991, 1999, 2003; Graziottini y otros, 2003;
Sánchez-Moral y otros, 2005). Estos fotótrofos en asociación con
microorganismos heterótrofos, pueden formar patinas negras,
verdes, grises o amarillas sobre pinturas y paredes
proporcionando una fuente ulterior de materia orgánica sobre la
cual otras bacterias pueden desarrollarse.
Entre los microorganismos a los que inicialmente se atribuyeron
13
Introducción
procesos de deterioro de ambientes subterráneos caben destacar

los pertenecientes a la división Actinobacteria. Las bacterias de
este grupo son sumamente pleomorfas; algunos géneros (como
Streptomyces) crecen como filamentos extensos y a menudo
ramificados. Dentro de este grupo se encuentran bacterias muy
diferentes con respecto a su bioquímica y morfología (Stach y
otros, 2003a). Algunos de sus miembros tienen gran interés por su
importancia en agricultura, ecología, industria, medicina (Stach y
otros, 2003a; McNeill y Brown, 1994) y biotecnología (Bull y otros,
2000; Mincer y otros, 2002). Las actinobacterias están
ampliamente distribuidas en ambientes terrestres (Heuer y otros,
1997, Hayakawa y otros, 2000), de aguas dulces (Goodfellow y
otros, 1983) y marinos (Goodfellow y Haynes, 1984; Takizawa y
otros, 1993). Están generalmente implicadas en la degradación de
la materia orgánica (McCarthy y otros, 1987; Schrempf, 2001) y
compuestos xenobióticos (Bunch, 1998; De Schrijver y De Mot,
1999). Estos microorganismos han sido detectados
fundamentalmente a través de métodos de cultivo en diversos
ambientes y la habilidad de formar esporas en muchos de ellos
facilita su detección en el laboratorio. Entre los ambientes
subterráneos, se han detectado en cuevas, como las de Altamira y
Tito Bustillo (Asturias) (Groth y otros, 1999a, b; Laiz y otros, 1999),
en frescos (Giacobini y otros, 1988), en las tumbas de Tarquinia en
Italia (Agarossi y otros, 1992), en la Grotta dei Cervi (Porto
Badisco, Italia) (Laiz y otros, 2000; Groth y otros, 2001) y en
muchos otros lugares de interés histórico y cultural.
La división Proteobacteria también ha sido frecuentemente

detectada en ambientes subterráneos con representaciones
artísticas. Es uno de los grupos bacterianos más abundantes y
14
Introducción
diversos conocidos en nuestro planeta (Rappé y Giovannoni,

2003; Buckley y otros, 2001; Zwart y otros, 2002). Las
proteobacterias se separan en cinco subdivisiónes: alfa, beta,
gamma, delta y epsilon. Las alfaproteobacterias incluyen bacterias
capaces de crecer a concentraciones muy bajas de nutrientes (o
sea en condiciones de oligotrofia). Dentro de esta subdivisión las
bacterias pertenecientes al orden Rhizobiales son muy
importantes en agricultura ya que son capaces de inducir la
fijación de nitrógeno en simbiosis con plantas (Madigan y otros,
2000). Las betaproteobacterias son bacterias que utilizan
nutrientes muy variados y han sido encontradas en relación con
procesos de degradación o utilización de una gran gama de
compuestos en ambientes naturales y en particular con procesos
de oxidación de amonio (Whitby y otros, 1999). Las
gammaproteobacterias constituyen el subgrupo mejor conocido de
proteobacterias e incluyen una gran variedad de tipos fisiológicos y
fenotípicos (Woese y otros, 1987). Son frecuentemente anaerobios
facultativos con metabolismo heterotrófico. Las
deltaproteobacterias contribuyen de modo importante al ciclo del
azufre ya que una fracción importante de este grupo está
representada por Bacterias Reductoras de sulfato (BRS). Estas
BRS generalmente se desarrollan en ambientes anaerobios y se
caracterizan por la utilización de sulfatos produciendo sulfuros.
También han sido detectadas en cuevas con pinturas rupestres.
En la cueva de Altamira, BRS de los géneros Desulfovibrio y
Desulfomicrobium dentro de la división Deltaproteobacteria han
sido detectadas como metabólicamente activas (Portillo y otros,
2006) indicando la existencia en esta cueva de ambientes pobres
en oxígeno. Las epsilonproteobacterias son bacilos gramnegativos
delgados, helicoidales o vibrionales a menudo implicados en
15
Introducción
proceso de oxidación de compuestos inorgánicos de azufre y

reducción de compuestos inorgánicos nitrogenados (Sievert y
otros, 2008). Bacterias pertenecientes a este grupo se han
encontrado rara vez en ambientes subterráneos mientras que
representantes de los otros grupos de Proteobacteria han sido
frecuentemente citados en estudios de cuevas con pinturas
rupestres. Por ejemplo, Portillo y otros (2007) condujeron análisis
de la diversidad microbiana en la Cueva de Altamira a partir de
métodos moleculares basados en ADN y ARN. La división
Proteobacteria resultó el grupo bacteriano más frecuentemente
detectado en las comunidades analizadas.
En la cueva de Altamira también se han detectado representantes

del grupo bacteriano Acidobacteria (Zimmermann y otros, 2005a).
En base a las secuencias del gen de ARN ribosómico 16S

recogidas en diferentes estudios, la división Acidobacteria fue
inicialmente dividida en ocho grupos o subdivisiones (Hugenholtz y
otros, 1998) con respecto a las relaciones filogenéticas de las
secuencias analizadas. Zimmermann y otros (2005a) llevaron a
cabo un estudio sobre la diversidad de Acidobacteria en la cueva
de Altamira en el que detectaron una gran variedad de
Acidobacteria en la cueva estudiada. Este estudio les llevó a
proponer la creación de cuatro nuevas subdivisiones dentro de
este grupo bacteriano.
Dentro del dominio Eukarya, los hongos también juegan un papel

importante en procesos de biodeterioro. Hongos Ascomycota son
frecuentemente detectados en suelos (Deshmukh y otros 2006;
Anderson y otros 2003a, 2004) y también han sido citados en
16
Introducción
mármoles antiguos de Turquía (Sert y otros, 2007), de Grecia

(Sterflinger y otros, 1997) y en ambientes subterráneos. Por
ejemplo, en la Cueva de Lascaux en 2001 se detectó una masiva
colonización por el género Fusarium (Alabouvette, 2006; Dupont y
otros, 2007). Este género llegó a manifestarse ampliamente en el
suelo y paredes de la cueva lo que ha creado gran incertidumbre
sobre la proliferación y sucesión de microorganismos y su
implicación en la conservación de pinturas rupestres.
Miembros pertenecientes a los géneros Fusarium y Penicillium han

sido encontrados en colonizaciones de la Catacumba de Milos
junto con bacterias del género Bacillus (Pantazidou y otros, 1997).
Frecuentemente bacterias y hongos coexisten en el mismo
ecosistema (suelo, sedimentos, etc.). Sin embargo, son escasos
los estudios que combinan el estudio de la diversidad de ambos
tipos de microorganismos en un mismo ambiente (Hattori y otros,
1997; Ogram, 2000; Kent y Triplett, 2002).
Los hongos también ostentan una considerable diversidad

fisiológica, por ejemplo el amplio rango de pH en el que pueden
desarrollarse, logran crecer en condiciones oligotróficas y, aunque
no compartan los ambientes más extremos donde se hallan las
bacteria y arqueas extremófilas, también han desarrollado
estrategias de resistencia a condiciones adversas incluyendo su
capacidad para formar esporas. Otro ejemplo de la diversidad de
los hongos son las levaduras. Las levaduras son capaces de
crecer fermentativamente en anaerobiosis aunque generalmente la
mayoría de hongos crecen en ambientes aerobios.
Cabe señalar que los hongos en condiciones de iluminación
17
Introducción
pueden asociarse a algas en la formación de líquenes y así

sobrevivir en condiciones extremas de sequedad, nutrientes e
irradiación (Oksanen, 2006; Gadd y otros, 2008). En esta relación
simbiótica los dos microorganismos están tan íntimamente
relacionados entre sí que se comportan y reproducen como una
entidad única e independiente. El hongo se encarga de proteger al
alga de las radiaciones directas del sol y proporcionarle agua y
sales minerales. El alga a su vez realiza fotosíntesis y facilita al
hongo alimento y vitaminas. Esta es una relación simbiótica
característica en muchos ambientes naturales pero rara en
ambientes subterráneos donde la iluminación es generalmente
escasa o nula y la única fuente luminosa seria la iluminación
artificial.
Características de los ambientes subterráneos
Las cuevas pueden ser clasificadas según distintos criterios, en

particular por el tipo de roca y por el método de formación (Palmer,
1991). Existen diferentes mecanismos primarios de formación de
cuevas. Las cuevas clásicas de piedras calizas como la Cueva de
Altamira, se forman a partir de sistemas cársticos en los que se ha
descrito la importancia de sistemas de disolución y precipitación de
carbonatos (Gillieson, 1996). La deposición de carbonato cálcico y
otros minerales permiten la formación de espeleotemas, como
estalactitas y estalagmitas.
Los parámetros físicos en cuevas tienden a ser relativamente

moderados, predecibles y constantes aunque la mayoría de
cuevas presentan un equilibrio ambiental que puede fácilmente
alterarse por impactos antropogénicos (Sánchez-Moral y otros,
1999, 2005).
18
Introducción
En las cuevas existen una serie de recursos tróficos que pueden

ser utilizados por los microorganismos. Uno de los principales
pueden ser materiales orgánicos e inorgánicos transportados por
el agua de infiltración desde los ecosistemas de superficie y
subsuelo. La materia orgánica presente en las paredes de las
cuevas, la deposición de compuestos orgánicos volátiles sobre las
superficies, o la biomasa orgánica constituyen fuentes de
nutrientes para el crecimiento de microorganismos. Otra fuente de
materia orgánica podrían ser, por ejemplo, los excrementos de
murciélagos ya que estos están generalmente presentes en
ambientes subterráneos donde se suelen acumular.
Compuestos difíciles de degradar como hidrocarburos aromáticos

y alifáticos (Saiz-Jiménez, 1997; Zanardini y otros, 2000),
macromoléculas complejas como la lignina (Ball y otros, 1989) y
sustancias húmicas (Groth y Saiz-Jiménez, 1999b) han sido
citados en ambientes subterráneos y representan una fuente de
nutrientes para numerosos microorganismos heterótrofos.
19
Introducción
1.2 Técnicas microbiológicas para el estudio de

comunidades microbianas naturales
Uno de los pasos necesarios en el estudio del biodeterioro y de

sus efectos sobre los monumentos es la determinación de los
microorganismos participantes con objeto de analizar las
propiedades funcionales de éstos y su papel negativo en la
conservación del patrimonio. Sólo después de que se haya
obtenido y analizado esta información, se debería proceder a
diseñar estrategias de conservación y protección del objeto de arte
considerado (González y Saiz-Jiménez, 2005).
El primer paso en esta línea, es la determinación de los

microorganismos más representativos aunque ello requiera un
esfuerzo singular y el empleo de diversas técnicas
microbiológicas.
Los primeros esfuerzos en la identificación microbiana (Pasteur,

1870) se basaban en las características morfológicas (utilizando el
microscopio), pruebas bioquímicas y fisiológicas. La forma de un
microorganismo, su movilidad y los substratos que utiliza, sirvieron
para una diferenciación y clasificación preliminar. La diversidad
microbiana del ambiente fue estudiada en base a métodos de
cultivo hasta finales de la década de los años setenta cuando tal
aplicación se comprobó que limitaba la detección de
microorganismos en comunidades de ambientes naturales como
suelo, sedimentos, aguas dulces y aguas marinas (Dauga, 2005;
Hobbie y otros, 1977). Con el paso de los años se comprobó que
la mayoría de los microorganismos presentes en ambientes
naturales no podían ser cultivados (Ward y otros, 1992; Hobbie y
20
Introducción
otros, 1977; Torsvik y otros, 1990; Amann y otros, 1995). Ello

sugirió la necesidad de utilizar nuevos métodos de detección,
cuantificación y clasificación (Ward y otros, 1992; Pace, 1997;
Delong, 2001).
Hasta ahora se conocen casi 1.5 millones de especies de

animales (la mayoría insectos), 0.3 millones de especies de
plantas y se han descrito formalmente únicamente unas 3000
especies de microorganismos (Margulis y Schwartz, 1998). Ello se
puede explicar debido a que las metodologías clásicas de cultivo
han sido capaces de detectar sólo una fracción mínima (menos del
1%) del número total de microorganismos en ecosistemas
naturales (González y Saiz-Jiménez, 2004; Hugenholtz y otros,
1998; Ward y otros, 1990). Existen diversas causas para estos
resultados aunque es fácilmente comprensible si entendemos que
los requisitos nutricionales, metabólicos y condiciones de
crecimiento de la mayoría de bacterias son desconocidos.
En cuanto a los eucariotas y en particular a los hongos, los

métodos de cultivo convencionales han permitido detectar casi un
17% del total de las especies de hongos que se estiman que
existen (Bridge y Spooner, 2001; Hawksworth y otros, 2001). Por
tanto surgen diferencias significativas entre los conocimientos
disponibles y la probabilidad de cultivar distintos grupos
bacterianos y fúngicos.
La incapacidad de cultivar en el laboratorio (Torsvik y otros, 2002a,

b; Bornemann y otros, 1996) la mayoría de bacterias y arqueas es
una consecuencia del hecho de que éstos son altamente
heterogéneos (Margulis y Schwartz, 1998; Brock y Madigan,
21
Introducción
2000). No siempre es posible reproducir en el laboratorio las

condiciones de crecimiento adecuadas para el desarrollo de un
determinado tipo de microorganismos. En el laboratorio, una
elevada porción de microorganismos en comunidades naturales se
encuentra en estadios inactivos de su ciclo de vida. Por tanto,
dentro de un ambiente y en un momento específico, unos
microorganismos manifiestan una limitada o no detectable
actividad metabólica (González y otros, 2005). Sin embargo, si las
condiciones ambientales o nutricionales cambiasen y fueran
favorables para esos microorganismos, entonces podrían
desarrollarse y competir con otros miembros de la comunidad
pudiendo establecerse como mayoritarios y alterando la estructura
de dicha comunidad.
Al igual que en las bacterias también en la detección de hongos

las limitaciones del empleo de métodos tradicionales de cultivos
han sido mencionadas (Zak y Visser, 1996; Bridge y Spooner,
2001). La introducción de técnicas moleculares en microbiología
ha permitido la detección de microorganismos hasta entonces
desconocidos, ya que no podían ser cultivados. El empleo de
métodos moleculares, como por ejemplo, los basados en el ADN,
han hecho posible la detección y clasificación de un elevado
número de microorganismos de los que previamente no se
conocía su existencia (Hunt y otros, 2004; Lynch y Thorn, 2006).
Los resultados de este tipo de enfoque han revelado que la

diversidad microbiana en la Tierra es mucho más elevada de lo
que se especulaba por los resultados obtenidos exclusivamente a
través de análisis de cultivos tanto para Bacteria (Ward y otros,
1990; Floyd y otros, 2005; Schloss y otros, 2004; Venter y otros,
22
Introducción
2004) y Archaea (Hershberger y otros, 1996) como para

Eucariotas, incluyendo hongos (Hunt y otros, 2004; Lynch y Thorn,
2006).
En la mayoría de estudios de comunidades naturales, los datos

obtenidos a través de las dos perspectivas de análisis (de cultivo y
moleculares), dan lugar a diferencias importantes, (por ejemplo en
la Cueva de Altamira) (Laiz y otros, 2003; Portillo y otros, 2007b;
Ward y otros, 1990).
La ventaja de los métodos moleculares mencionados es que se

basan en el análisis de los ácidos nucleicos de los
microorganismos presentes en una muestra. Dado que cada
microorganismo posee secuencias únicas de ADN, el análisis de
éstas permite la identificación con gran especificidad de los
microorganismos dentro de comunidades microbianas complejas.
El protocolo molecular básico, se inicia con la extracción de los

ácidos nucleicos (generalmente de ADN) de la muestra. En el caso
de muestras de Patrimonio Cultural habitualmente sólo se puede
disponer de pequeñas cantidades de muestra. A continuación, los
genes específicos de interés (generalmente el gen de ARNr 16S
para bacterias y arqueas y ARNr 18S para eucariotas) se
amplifican por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) de
modo que se pueden obtener millones de copias de fragmentos de
ADN determinados por dos secuencias que flanquean la porción
de ADN deseada, llamados cebadores o primers.
Actualmente hay disponibles cebadores específicos para cada uno

de los dominios existentes, Bacteria, Archaea y Eukarya, e incluso,
23
Introducción
para grupos o divisiones determinadas como, por ejemplo,

Bacterias Reductoras de sulfato (Daly y otros, 2000), Bacterias
Reductoras de nitrato (Petri y otros, 2000), metanotrofos (Horz y
otros, 2001) o para grupos filogenéticos específicos de hongos
(Haugland y otros, 1998; Turín y otros, 2000; Voigt y otros 1999;
Borneman y Hartin 2000) y bacterias (Joseph y otros, 2003;
Janssen y otros, 2002).
Los productos de PCR pueden ser utilizados para la construcción

de genotecas del gen de ARNr (Schmidt y otros, 1991; Dunbar y
otros, 1997) y posterior secuenciación o para obtener el perfil
molecular de la comunidad microbiana por DGGE “Denaturant
Gradient Gel Electrophoresis” (electroforesis en gel con gradiente
desnaturalizante) (Muyzer y otros, 1993; González y Saiz-Jiménez,
2004). A partir de las genotecas se seleccionan los clones de
interés y tras su secuenciación se podrá utilizar esa información
para clasificar al organismo del que dicha secuencia procede.
Utilizando estos procedimientos y tras análisis bioinformáticos es

posible obtener información de gran valor sobre comunidades
microbianas naturales tanto procariotas como eucariotas.
El enfoque basado en el análisis de la subunidad pequeña del gen

de ARN ribosómico 16S para bacterias y arqueas y 18S para
eucariotas, amplificados a partir del ADN extraído, resulta el punto
de partida para el descubrimiento de nuevos organismos dentro de
Bacteria (Ward y otros, 1990; Floyd y otros, 2005; Schloss y otros,
2004; Venter y otros, 2004), Archaea (Hershberger y otros, 1996)
y hongos (Hunt y otros, 2004). Ello proporciona información sobre
la presencia de microorganismos en un ambiente determinado.
24
Introducción
Sin embargo, estos análisis de las comunidades basados en el

ADN detectan los microorganismos sin tener en cuenta su
viabilidad o su actividad metabólica (González y otros, 2005; Mills
y otros, 2004).
Para investigar aquellos microorganismos que participan

activamente en el metabolismo y en el desarrollo de una
comunidad microbiana, se puede recurrir al empleo de técnicas
basadas directamente en el ARN en vez de en el ADN. El ARN es
un componente esencial de los ribosomas, las maquinarias de
síntesis y producción de proteínas en las células. Por ello, puesto
que la cantidad de ARN por célula es proporcional a su actividad
metabólica (Molin y Givskov, 1999), las genotecas construidas en
base a ARN extraído de un sistema reflejan la diversidad de los
microorganismos metabólicamente activos en una comunidad
microbiana.
El análisis de ARN requiere el empleo de la transcriptasa inversa,

enzima capaz de sintetizar ADN complementario (ADNc) a partir
de un molde de ARN. A partir de este paso, se puede seguir con el
mismo protocolo que para el análisis de ADN. No obstante, la
extracción y trabajo con ARN, en comparación con el de ADN,
resulta mucho más problemático debido a la presencia de las
enzimas ARNsas que presentan una elevada estabilidad térmica y
son omnipresentes en comparación con las ADNasas
(Stackebrandt y otros, 1993). Como resultado, los análisis basados
en el ARN de comunidades naturales han sido menos utilizados en
comparación con el número de estudios basados en el ADN
(Stoeck y otros, 2007). Por ejemplo, recientemente, Portillo y
colaboradores (2007b) y González y colaboradores (2006) han
utilizado análisis moleculares basados en ARN y ADN para
25
Introducción
detectar bacterias metabólicamente activas en la cueva de

Altamira.
A pesar de la gran utilidad que presentan las técnicas moleculares

basadas en análisis de ácidos nucleicos, el empleo de cultivos
también es de suma importancia. Una vez que determinados
microorganismos han sido detectados en una comunidad, las
técnicas de cultivo tradicionales resultan fundamentales a la hora
de caracterizar la fisiología, la bioquímica y las capacidades
metabólicas de estos microorganismos, así que no conviene
olvidarse de la importancia de complementar ambas técnicas para
el estudio de microorganismos en ambientes naturales y su
participación en procesos de biodeterioro.
Nuevas técnicas de cultivo se están aplicando al estudio de

microorganismos de los cuales, hasta ahora, el único conocimiento
disponible provenía de sus secuencias. Miembros de la división
Acidobacteria (Joseph y otros, 2003; Janssen y otros, 2002) y
Verrucomicrobia (Janssen y otros, 2002), por ejemplo, han sido
descritos en los últimos años gracias al avance de estas técnicas.
Resulta, por tanto, imprescindible el perfeccionamiento de las

técnicas moleculares (Gray y otros, 2001; Manefield y otros 2002),
por un lado, y de los cultivos por otro (Joseph y otros, 2003;
Zengler y otros, 2002; Ferrari y otros, 2005; Davis y otros, 2005;
Stevenson y otros, 2004), para la detección, el estudio y la
caracterización de los microorganismos que forman comunidades
microbianas naturales con objeto de describir, monitorizar y
controlar los procesos de biodeterioro en los que están implicados.
26
Introducción
1.3 Objetivos de la tesis
El presente trabajo representa el primer estudio microbiológico

llevado a cabo sobre la Cueva de Doña Trinidad y se encuadra en
un trabajo multidisciplinar encaminado a entender los fenómenos
de deterioro que pudieran afectar a la conservación de la cueva.
Los objetivos prioritarios en los que este estudio se ha centrado
han sido los siguientes:
- Detección y análisis de las bacterias presentes en la Cueva de

Doña Trinidad a través de métodos moleculares basados en
ADN.
- Detección y análisis de las bacterias metabólicamente activas

en la Cueva de Doña Trinidad a través de métodos
moleculares basados en ARN.
- Detección y análisis de las bacterias cultivables presentes en

la Cueva de Doña Trinidad.
- Detección y análisis de los hongos presentes en la Cueva de

Doña Trinidad por métodos moleculares basados en ADN.
- Detección y análisis de los hongos cultivables presentes en la

Cueva de Doña Trinidad.
- Comparación de los distintos procedimientos empleados

(ADN, ARN y cultivos) para el estudio de las comunidades
bacterianas y su diversidad en la Cueva de Doña Trinidad.
27
Introducción
- Comparación de métodos moleculares y de cultivos

empleados para la detección de hongos y el estudio de su
diversidad en la Cueva de Doña Trinidad.
- Análisis del potencial colonizador de las principales bacterias y

hongos que representan un mayor riesgo para la conservación
del arte rupestre de la Cueva de Doña Trinidad.
28
Capitulo 2: Materiales y métodos
29
30
Materiales y métodos
2.1 Descripción de la Cueva de Doña Trinidad
La Cueva de Doña Trinidad, también conocida como Cueva de

Ardales o de Calinoria, está situada en Ardales, en la provincia de
Málaga (España) (Fig. 2.1).
Figura 2.1. Localización geográfica de Ardales (Málaga, España) en cuyo

municipio se encuentra la Cueva de Doña Trinidad.
31
Es un complejo subterráneo situado a 565 metros sobre el nivel

del mar, en la falda norte del Cerro de la Calinoria. La temperatura
media de esta cueva es de 16°C con valores de humedad relativa
estables entre 90% y 100% (Sánchez-Moral, comunicación
personal). Esta cueva fue descubierta en 1821 tras un terremoto
que dejó la boca de acceso abierta, la cual había permanecido
cerrada por sedimentación durante más de 8.000 años. La
utilización turística de la cueva empezó gracias a Doña Trinidad
Gründ de Heredia que en 1852 habilitó el interior construyendo
escalinatas. Tras la muerte de Doña Trinidad en 1896, la cueva
quedó abandonada hasta que en 1918 fue visitada por el Abate
Henri Breuil que descubrió algunas pinturas y grabados. Breuil fue
el primer gran estudioso de la cueva cuyas investigaciones se
publicaron en L’ Antropologie XXXI (Breuil 1921). En 1992 la
Consejería de Cultura de la Junta de Andalucía declaró la cavidad
Bien de Interés Cultural y el Ayuntamiento de Ardales asumió su
gestión continuada abriendo las puertas de la cueva al publico de
forma controlada (Cantalejo y otros, 2006).
Según la descripción proporcionada por Cantalejo, (Cantalejo y

otros, 2006), la cavidad tiene un recorrido total de 1.577 metros,
con una distancia en planta de 1.394 metros (Fig. 2.2). El desnivel
máximo es de 34,31 metros, estando el punto más bajo en las
“Galerías Blancas” (-27,63) y el más alto en el Camarín (+6,68
metros). De forma natural, la cavidad tiene distintas salas y
galerías a las que se les asignaron nombres durante el siglo XIX o
durante las distintas exploraciones del XX. Un acceso en forma de
torca nos lleva tras una empinada rampa a las primeras galerías,
conocidas como “Sala del Saco” y “Sala de las Estrellas”.
32
Figura 2.2 Mapa (A) y perfil (B) de la cueva de Doña Trinidad donde se
sitúan las zonas en las que la cueva ha sido dividida.
33
A partir de esta zona, la cavidad ofrece formaciones de estalactitas

y estalagmitas. Desde esta última gran estancia parten varias
galerías entre las cuales destacan la “Sala del Lago” y la “Galería
de los Laberintos” presentándose esta última como una red de
pequeñas salitas y galerías, incluso estrechas, con un aspecto
laberíntico. Desde el primer tramo de los “Laberintos” se accede,
por medio de una subida de 18 metros, a las “Galerías Altas”,
sector que por su reciente descubrimiento, presenta una óptima
conservación. En el lado opuesto de la “Sala de las Estrellas” se
abre una sala empinada, de techo plano conocida como “El
Calvario” que termina en una chimenea vertical, designada como
“El Camarín” por el Abate Breuil (Breuil 1921) (Fig. 2.2 B). Este es
el sector que conserva la mayor parte del grafismo paleolítico
dedicado a las representaciones de fauna y figuras femeninas, con
numerosos signos y algunas manos. Se trata, por tanto, del lugar
más crítico en los aspectos de conservación de todas las zonas
descritas como galerías bajas o visitables. El suelo de esta galería
está ocupado por bloques desprendidos del techo que se
convirtieron durante el Paleolítico Superior en soporte de grandes
cantidades de grabados, así como las dos paredes (derecha e
izquierda) y todas las grietas y techos situados al fondo. Por tanto,
existen en la cueva dos zonas bien diferenciadas. Por un lado, las
galerías visitables, habilitadas por Trinidad Gründ durante la
primera mitad del siglo XIX, y por el otro, las galerías altas,
descubiertas en 1981, que se mantienen fuera de las visitas
culturales que recibe la cueva. Hoy, el acceso a las galerías altas
permanece sellado por un derrumbe. La única boca actual, por
tanto, es la que permite la visita a todo el conjunto.
34
La cueva de Doña Trinidad contiene numerosos vestigios

culturales de época Paleolítica. En el recorrido por la cueva se
presentan imágenes simbólicas repartidas por la mayor parte de
salas y galerías y figuras animales, localizadas en una galería del
fondo de la cueva. Entre las figuras simbólicas se encuentran
puntuaciones, bastones, líneas paralelas, etc., realizadas con
pintura, los símbolos grabados son en su mayoría haces de líneas,
reticulados, triangulares, etc. Entre los animales se encuentran
cérvidos, équidos, cápridos y peces, serpientes y varias figuras
animales de dudosa afiliación.
Desde el punto de vista geológico, la Cueva de Doña Trinidad se

encuadra en una zona de materiales carbonatados que afloran
entre las localidades de Ardales y Carratraca. La composición de
la roca es fundamentalmente dolomítica o calizo-dolomítica. En
zonas como El Saco y El Camarín, afloran materiales no
carbonatados insolubles. En el interior de la cueva se pueden
apreciar numerosos espeleotemas. De las dataciones absolutas
obtenidas de distintas estalagmitas (Durán, 1992; Durán y Lopéz,
1995), se deduce que la génesis o inicio de la karstificación de la
Cueva de Doña Trinidad, debe situarse entre el Plioceno Superior
y el Pleistoceno Inferior (anterior a 1,8 millones de años) (López y
otros, 1995).
35
2.2 Estudio de las comunidades bacterianas
A continuación se describen los pasos del protocolo experimental

(Fig. 2.3) utilizado en el análisis de las comunidades bacterianas
de muestras de la cueva estudiada.
Muestra
Extracción de ADN Extracción de ARN Cultivo y

aislamiento
PCR ADNc Transcriptasa

Inversa
Extracción
de ADN
Perfil de la Construcción
comunidad de genoteca
DGGE
Selección de clones
Perfil por DGGE PCR
molecular de
la comunidad
bacteriana
Secuenciación
Identificación
de bacterias de Análisis
la comunidad bioinformático
Figura 2.3. Protocolo experimental seguido durante este trabajo para el

análisis de las comunidades bacterianas de las muestras analizadas.
Consta, principalmente, de tres líneas de estudio, el cultivo de

bacterias, análisis moleculares de las comunidades bacterianas
36
basados en el ADN y análisis moleculares de dichas comunidades

basados en el ARN. Los cultivos han permitido detectar las
bacterias capaces de crecer bajo las condiciones proporcionadas
en el laboratorio. De esta manera es posible analizar su
metabolismo y las condiciones de crecimiento. Los análisis
moleculares basados en al ADN nos han proporcionado
información sobre la composición de las comunidades presentes
en las muestras y, fundamentalmente, aquellas más abundantes.
Los análisis moleculares basados en el ARN, en cambio, nos han
permitido detectar las bacterias que no sólo están presentes en las
comunidades de las muestras analizadas sino que también se
encuentran desarrollando una actividad metabólica significativa
dentro de dichas comunidades y que participan activamente en los
procesos de biodeterioro de las pinturas y grabados de la Cueva
de Doña Trinidad.
Muestreo
Durante este estudio se recogieron pequeñas muestras de

diferentes puntos de la cueva. Para ello se utilizó bien una
espátula estéril o bien bastoncillos de algodón estériles. Todas las
operaciones fueron llevadas a cabo en condiciones asépticas. Las
muestras fueron almacenadas en tubos Eppendorf de 1,5 ml.
Hasta la llegada al laboratorio las muestras seleccionadas para el
cultivo y aquellas seleccionadas para análisis moleculares
basados en ADN se mantuvieron a 4°C. Las muestras
seleccionadas para la extracción del ARN se preservaron en tubos
estériles con solución RNAlater® (Ambion, Foster City, California,
EE.UU.) que evita la rápida degradación del ARN por parte de las
ARNasas. En el laboratorio, aquellas muestras seleccionadas para
37
el cultivo se procesaron lo más pronto posible y aquellas para la

extracción de los ácidos nucleicos se conservaron a -80ºC hasta
su procesamiento.
Análisis de muestras
Las muestras se recogieron en las fechas 30 de Marzo de 2005 y

14 de Noviembre de 2006. En la Tabla 2.1 se presenta una lista de
todas las muestras analizadas, su origen, la fecha en la que se
efectuó el muestreo y el tipo de análisis efectuado. Las muestras
de suelo analizadas fueron: N14, S18 y Y21. Estas muestras
corresponden a suelo recogido de distintas zonas de la Galería del
Calvario. Se analizaron muestras de los grabados presentes en la
cueva; la muestra P16 corresponde al grabado del pez, mientras
que la muestra M13 corresponde al grabado de serpientes (Fig.
2.4 y 2.5). La muestra L12 corresponde a restos de pigmento rojo
sobre una pared de la cueva (Fig. 2.6). La muestra R17
corresponde a trazos negros presentes al final de la Galería del
Calvario (Fig. 2.7). La muestra AA23 se recogió en el año 2005 y
corresponde a colonizaciones blancas presentes en los escalones
de entrada de la cueva (Fig. 2.8). Estas colonizaciones blancas se
han difundido por gran parte de la cueva, fundamentalmente en la
zona cercana a la entrada de la cueva. Hoy en día estos tipos de
colonizaciones se encuentran sobre varios espeleotemas de la
cueva, en las paredes y en los escalones desde la entrada (Fig.
2.9 y 2.10). En el año 2006 se procedió a otro muestreo
correspondiente a colonizaciones blancas presentes sobre uno de
los espeleotemas de la cueva (Muestra I9, Fig. 2.10). Las
muestras A1, B2, C3, D4, E5, F6, G7 y Z22 fueron recogidas
38
desde otros puntos de la cueva (Tabla 2.1). Estas muestras fueron

utilizadas exclusivamente para cultivos.
Figura 2.4. Grabado de un pez en la Galería del Calvario.
Figura 2.5. Grabado de serpientes en la Galería del Clavario.
39
Tabla 2.1. Muestras analizadas para el estudio de la diversidad

bacteriana.
Muestra Tipo de Origen Fecha Tipo de análisis

muestra muestreo
A1 Agua de goteo Sala del Lago 30/03/2005 Cultivo
B2 Sedimento Sala del Lago 30/03/2005 Cultivo
C3 Agua de goteo Sala del Lago 30/03/2005 Cultivo
D4 Columna Gran Sala 30/03/2005 Cultivo
E5 Agua de goteo Gran Sala 30/03/2005 Cultivo
F6 Residuos Gran Sala 30/03/2005 Cultivo

negros
G7 Espeleotema Gran Sala 30/03/2005 Cultivo
Z22 Escalera Entrada 30/03/2005 Cultivo
L12 Pigmento Gran Sala 30/03/2005 Análisis molecular

rojizo (ADN, ARN)
M13 Grabados de Galería del 30/03/2005 Análisis molecular

serpientes Calvario (ADN)
N14 Suelo Galería del 30/03/2005 Cultivo, Análisis

Calvario molecular (ADN,
ARN)
P16 Grabado de Galería del 30/03/2005 Análisis molecular

pez Calvario (ADN, ARN)
R17 Trazos negros Galería del 30/03/2005 Análisis molecular

Calvario (ADN, ARN)
S18 Suelo Galería del 30/03/2005 Cultivo, Análisis

ARN)
AA23 Colonias 5° escalón 30/03/2005 Cultivo, Análisis

blancas entrada, molecular (ADN,
ARN)
Y21 Suelo rojizo Galería del 30/03/2005 Cultivo, Análisis

ARN)
I9 Colonias Detrás de
blancas estalactita de la 14/11/2006 Cultivo
entrada
40
Figura 2.6. Pigmento rojizo sobre la pared de la Gran Sala.
Figura 2.7. Trazos negros al final de la Galería del Calvario.
41
Figura 2.8. Muestra AA23 correspondiente a colonizaciones blancas del

5° escalón de entrada de la cueva.
Figura 2.9. Colonizaciones blancas presentes en las paredes de la cueva.
42
Figura 2.10. Muestra I9 correspondiente a colonizaciones blancas en un

espeleotema de la entrada de la Cueva.
43
2.2.1 Análisis moleculares
A continuación se describen los pasos que constituyen el análisis

molecular basado en el ADN y en el ARN.
Extracción de ADN
La extracción del ADN genómico de los microorganismos

presentes en las muestras analizadas se llevó a cabo utilizando el
kit de extracción NucleoSpin ® Food (Macherey-Nagel & Co.,
Düren, Alemania) siguiendo las recomendaciones del fabricante.
El ADN extraído fue utilizado como ADN molde para reacciones de
amplificación por PCR.
Extracción de ARN
Para la extracción de ARN se utilizó el kit RNAqueous-4PCR®

(Ambion, Foster City, California, EE.UU.), según las
recomendaciones del fabricante. El protocolo de extracción del
ARN total incluía un tratamiento con ADNasaI para eliminar el
ADN presente en el extracto final de ARN. Los ADN
complementarios al ARN (ADNc) de los genes ribosómicos 16S se
sintetizaron utilizando la transcriptasa inversa Thermoscript
(Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.). La transcriptasa inversa
produce ADN monocatenario (ADNc) a partir de ARN. Esta
técnica requiere particular atención en la manipulación de las
muestras, en la extracción del ARN y en la sucesiva amplificación
de los fragmentos de interés siendo el ARN una molécula
altamente sensible por la presencia de las omnipresentes
ARNasas. También se utilizaron controles sin transcriptasa inversa
para comprobar que el ARN extraído estaba libre de ADN. Las
44
reacciones de transcripción inversas se llevaron a cabo a 55°C,

durante una hora con el cebador 518R (Tabla 2.2) específico para
el gen ribosómico 16S de procariotas. El ADNc de hebra simple
fue utilizado como ADN molde para reacciones de amplificación
por PCR como se describe en el siguiente apartado.
Amplificación por PCR de genes de ARNr
TM
Se utilizó un termociclador iCycler de BioRad (Hercules,
California. EE.UU.). Salvo en los casos en los que se indiquen
otras condiciones, el programa utilizado ha sido el siguiente: un
paso de 2 min a 95°C seguido por 35 ciclos, con los siguientes
pasos, uno de desnaturalización a 95°C durante 15 s, un paso de
hibridación de cebadores a 55°C durante 15 s y un paso de
extensión a 72°C durante 10 min, finalizando a 4°C. Las
reacciones se prepararon en tubos de PCR de 0,2 ml (Greiner Bio-
One, Monroe, North Carolina, EE.UU.) y se componían de 1 μl de
solución ADN molde, 5 μl del tampón de PCR 10x Biotaq (Bioline,
Randolph, Massachussets, EE.UU.), 1,5 μl de MgCl2 (solución
stock a 50 mM), 1 μl de una mezcla de los cuatro nucleótidos
(dNTP) (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.) (concentración
stock 10 mM), 0,5 μl de cada uno de los dos cebadores necesarios
y 0,25 μl de la enzima polimerasa de ADN Biotaq (Bioline,
Randolph, Massachussets, EE.UU.) equivalente a 2,5 unidades. El
volumen final de la reacción se completó hasta 50 μl con agua
libre de ácidos nucleicos y nucleasas (Sigma-Aldrich, St.Louis,
Missouri, EE.UU.). Los cebadores empleados para PCR y
secuenciación fueron disueltos con agua libre de ácidos nucleicos
y nucleasas (Sigma-Aldrich) para preparar una solución stock de
50 μM y se utilizaron diferentes cebadores según los
microorganismos de los cuales se quería amplificar el ADN. Se
45
emplearon cebadores generales para el gen ARNr 16S para el

dominio Bacteria y cebadores específicos para dicho gen de la
división Acidobacteria y para Bacterias Reductoras de sulfato
(BRS) (Tabla 2.2). Todos los cebadores y reactivos de PCR fueron
almacenados a -20ºC.
Geles de agarosa
Para confirmar el resultado positivo de las amplificaciones por

PCR, los productos de estas reacciones fueron visualizados en
electroforesis en gel de agarosa (SeaKem®, CAMBREX Bio
Science Rockland, Rockland, New York, EE.UU.) al 1% (p/v). Para
ello, 5 μl de los productos de amplificación por PCR se mezclaron
con 1 μl de tampón de carga (pag. 64) que lleva incorporado el
colorante fluorescente SYBR® Green I (Molecular Probes,
Eugene, Oregon, EE.UU.) a una concentración final de 1/100.000
la solución comercializada. La electroforesis se realizó en una
unidad de electroforesis horizontal modelo HU10 (SCIE-PLAS,
Southham, Inglaterra) utilizando TAE 0.5x pH 8,2 (pag. 64) como
tampón de electroforesis. Se empleó una fuente de alimentación
eléctrica EPS 600 (Amersham Biosciences, New York, EE.UU.).
La electroforesis se llevó a cabo durante 20 min a 85 V. El gel fue
observado en un transiluminador (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée,
Francia) que emite luz UV a una longitud de onda de 312 nm. Los
geles se fotografiaron con una cámara digital Kodak Edas® DC290
utilizando el programa “Kodak 1D Image Análisis Software®”
(Kodak, New Haven, Connecticut, EE.UU.).
46
Tabla 2.2. Cebadores empleados en las reacciones de amplificación por

PCR y secuenciación.
Cebador1 Secuencia (5’-3’) Organismos Referencia

y genes diana
616F AGA GTT TGA Bacteria (16S) Zimmermann y otros,

TYM TGG CTC AG 2005a
907R CCC CGT CAA Bacteria (16S) Weisburg y otros,

TTC ATT TGA GTT T 1991
1522R AAG GAG GTG Bacteria (16S) González y otros,

ATC CAG CCG CA 2003
518R ATT ACC GCG Bacteria (16S) Muyzer y otros,

GCT GCT GG 1993
Hol189F GGA AGT GAA Acidobacteria Zimmermann y otros,

CCA TCT CAG (23S) 2005a
571R AAC TAG CCR Acidobacteria Zimmermann y otros,

GCT CAT TAT (23S) 2005a
DSV230F GRG YCY GCG BRS3 (16S) Daly y otros,

TYY CAT TAG C 2000
DSV838R SYC CGR CAY BRS3 (16S) Daly y otros,

CTA GYR TYC ATC 2000
T7F TAA TAC GAC Vector pCR 4 Ausubel y otros,

TCA CTA TAG GG 1992
M13R CAG GAA ACA Vector pCR 4 Ausubel y otros,

GCT ATG AC 1992
341F-GC2 TAC GGG AGG Bacteria (16S) Muyzer y otros,

CAG CAG 1993
Hol189F- GGA AGT GAA Acidobacteria No publicado

GC2 CCA TCT CAG (23S)
1
Los cebadores indicados con “F” se refieren al cebador sentido
(“forward”); aquellos con “R” se refieren a cebadores antisentido
(“reverse”).
2
Esos cebadores tienen una cola rica en GC en su extremo 5’
(CGCCCGCCGCGCGCGCGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG).
3
BRS: Bacterias Reductoras de Sulfato.
47
DGGE (Electroforesis en gradiente químico desnaturalizante)
Para visualizar el perfil representativo de las comunidades

bacterianas de las muestras analizadas, obteniendo una visión
simplificada de las comunidades complejas allí presentes, se
empleó la técnica denominada DGGE (“denaturing gradient gel
electrophoresis”) o electroforesis en gel de gradiente
desnaturalizante. Se siguió el procedimiento descrito por Muyzer y
otros (1993). Este procedimiento también se utilizó para la
selección de clones como se menciona más adelante (pag. 51).
Esta técnica consiste en la migración de fragmentos amplificados
por PCR en un gel de gradiente químico de urea y formamida. El
punto de desnaturalización de los fragmentos de ADN aumentará
con el tamaño de la secuencia de nucleótidos y su misma
composición de nucleótidos. Es entonces posible discriminar entre
dos cadenas dobles de ADN del mismo tamaño pero con
diferencias en sus secuencias. La DGGE permite visualizar
diferencias mínimas entre distintas secuencias incluso de hasta
una sola base (Muyzer y otros, 1993).
Para la preparación del gradiente químico en los geles de

poliacrilamida se empleó un aparato formador de gradiente
Gradient Delivery System® Model 475 (Bio-Rad, Munich,
Alemania). Se utilizó acrilamida (Acrilamida:Bisacrilamida 37.5:1)
(Bio- Rad) al 8% (concentración final). Los geles de poliacrilamida
con gradiente químico se prepararon utilizando dos soluciones
desnaturalizantes, SDA y SDB (pag. 65), con un volumen de 11 ml
cada una. Las soluciones stock empleadas para preparar estas
soluciones de trabajo contenían 0% y 80% de agentes químicos
desnaturalizantes (pag. 64, 65). En estas soluciones stock el 100%
de agentes químicos desnaturalizantes correspondía a 7 M urea
48
(Serva, Heidelburg, Alemania) y 40% (v/v) formamida (Applichem,

Darmstadt, Alemania). En este estudio se han utilizado geles cuyo
gradiente iba de 30% a 50% de agentes desnaturalizantes. La
polimerización de la acrilamida se catalizó con -N-N´-N´-
tetrametiletilendiamina (0,7 μl/ml) (TEMED) (Merck, Darmstadt,
Alemania) y con una solución al 10% (p/v) de persulfato amónico
(5 μl/ml) (APS) (Panreac, Barcelona, España). La parte superior de
los geles y los pocillos de los geles en los que se cargaban las
muestras se preparaban con una solución de acrilamida carente
de agentes desnaturalizantes (“stacking gel”). Esta solución se
polimerizaba con 0,5 μl/ml de TEMED y 3,5 μl/ml de solución APS.
Como tampón de electroforesis se utilizó el tampón TAE 0.5X pH
8,2 (pag. 64). Antes de cargar los productos de PCR en los
pocillos de los geles, se aplicaron a la cubeta de electroforesis
Dcode-System (Bio-Rad) las condiciones de electroforesis (carga
eléctrica: 200 V y temperatura: 60ºC) durante 20 min. Los
productos de PCR que se utilizaron para la DGGE son productos
cortos de aproximadamente 200 pb obtenidos con los cebadores
341F-GC y 518R (Tabla 2.2) en el caso de Bacteria y Bacteria
Reductoras de Sulfato y con los cebadores Hol189F-GC y 571R
en el caso de Acidobacteria. Los cebadores 341F-GC y Hol189F-
GC llevan una cola rica en GC con el objetivo de crear una zona
resistente a la desnaturalización durante la electroforesis y
estabilizar su migración en el gradiente químico. Los productos de
PCR se preparaban mezclándolos con el tampón de carga (pag.
64) en una proporción 1:1 y se cargaron 15 μl de esta mezcla en
cada pocillo del gel. Se utilizaron marcadores de migración
(Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Paenibacillus sp. y
Streptomyces caviscabies) en cada gel para localizar la posición
de determinadas bandas entre diferentes geles. La electroforesis
49
se llevó a cabo durante 3h y 30 min. Los geles se tiñeron con

bromuro de etidio (Merck) (10 μg/ml) durante 5 min seguido de un
lavado en agua destilada durante algunos minutos. Los geles se
observaron con un transiluminador (Vilber Lourmat) que emite luz
UV a una longitud de onda de 312 nm. Las imágenes de los geles
fueron obtenidas con una cámara digital Kodak® DC290 utilizando
“Kodak 1D image Analysis software”® (Kodak).
Construcción de genotecas
Con el fin de determinar las principales bacterias presentes en las

comunidades de las muestras analizadas y aquellas
metabólicamente activas, se construyeron genotecas con genes
de ARNr 16S que fueron amplificados por PCR a partir de ADN y
de ARN, respectivamente, extraídos directamente de las muestras.
Los productos de amplificación fueron purificados con el kit de
purificación “Jetquick PCR purification Spin Kit” (Genomed, Löhne,
Alemania) según las recomendaciones del fabricante. Los
productos de PCR purificados, libres de cebadores, nucleótidos y
fueron eluidos en agua estéril y utilizados para la clonación. Para
la clonación y transformación se utilizó el “TOPO-TA® Cloning kit
for secuencing” (Invitrogen, Carlsbad, California) siguiendo las
recomendaciones del fabricante. Después de una ligación con
topoisomerasas de los productos de PCR al vector de clonación, el
plásmido pCR®4-TOPO, se llevó a cabo la transformación en
células competentes de Escherichia coli DH5. El plásmido
proporciona resistencia a ampicilina y kanamicina y contiene el
gen suicida ccdB (Bernard y Couturier, 1992). Tras la
transformación, las células se sembraron en placas de medio LB
con ampicilina (100 μg/ml) (pag. 61) para seleccionar las células
50
que habían adquirido el plásmido. Las placas fueron incubadas

durante 16 horas a 37ºC y después se procedió a recoger colonias
al azar, utilizando palillos estériles. Las células se resuspendieron
en 100 μl de agua libre de ácidos nucleicos y nucleasas (Sigma-
Aldrich) para su análisis. Todos los clones se conservaron en
glicerol (15%) para su almacenamiento.
Selección de clones
Para eliminar los clones repetidos en las genotecas y seleccionar

aquellos de interés se llevó a cabo un proceso de selección de los
clones diferentes mediante DGGE (pag. 48) según González y
otros (2003). Por ello se efectuó una primera amplificación por
PCR de los fragmentos de ADN insertados en el vector de
clonación, utilizando 1 μl de suspensión de células del clon a
analizar como ADN molde y el par de cebadores específicos para
la secuencia del vector, T7F y M13R (Tabla 2.2). Esta primera
amplificación por PCR se realizó en las mismas condiciones
descritas anteriormente (pag. 45). Después se procedió a una
segunda PCR, “nested” PCR o PCR anidada, en la que se utilizó 1
μl del producto de la primera PCR como ADN molde. En esta
segunda PCR se utilizaron cebadores específicos, para el gen de
ARNr que se ha insertado en el plásmido, 341F-GC y 518R para el
caso de Bacteria y Hol189F-GC y 571R en el caso de
Acidobacteria (Tabla 2.2). Esta segunda amplificación se llevó a
cabo en las mismas condiciones descritas anteriormente (pag. 45)
excepto que el tiempo de elongación a 72ºC fue de 30 s en vez de
2 min. El producto de esta “nested PCR” se observó tras
electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (pag.
48). En algunos casos, para ahorro de tiempo, se han agrupado
51
los clones (aquellos resuspendidos en agua estéril) en grupos de

10 (González y otros, 2003) y se ha procedido de la misma
manera que con los clones individuales. Una vez seleccionados
los grupos deseados, se procede a la selección de los clones
individuales dentro de cada grupo seleccionado también mediante
DGGE tal y como se ha descrito anteriormente. Los clones
analizados fueron seleccionados a partir de filotipos caracterizados
por su patrón de migración en DGGE. Los clones que mostraban
idéntica migración se consideraron pertenecientes al mismo
filotipo.
Extracción de plásmidos
Los clones seleccionados se inocularon en 3 ml de medio LB (pag.

61) suplementado con ampicilina (100 μg/ml) y se incubaron a
37ºC durante una noche con agitación (250 rpm). Estos cultivos se
centrifugaron durante 10 min a 5000 g. Una vez recogidas las
células se procedió a la extracción del plásmido utilizando el kit
JETquick® plasmid miniprep (Genomed, Löhne, Alemania)
siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Digestión de plásmidos
Los plásmidos purificados se digirieron con la enzima EcoRI

(Fermentas, Glen Burnie, MD, EE.UU.). La mezcla de reacción
contenía 3 µl del plásmido, 10,3 µl de agua destilada, 1,5 µl del
tampón de digestión recomendado por el fabricante y 0,2 µl de
enzima EcoRI (10u/µl) por un total de 15 µl. La reacción se incubó
a 37°C durante 2-3 h y los productos se visualizaron en geles de
agarosa (pag. 46) para seleccionar los plásmidos con el fragmento
52
insertado, con ADN plasmídico digerible y a concentración

suficiente para su secuenciación.
Secuenciación de ADN
Los plásmidos seleccionados se utilizaron para la secuenciación

de los fragmentos insertados. Estos se secuenciaron utilizando el
cebador M13R (Tabla 2.2), en el secuenciador capilar ABI3700
utilizando el ABI PRISM® dye terminador sequencing core kit
(Applied Biosystem, Foster City, California, EE.UU.) en el Centro
de Investigaciones Biológicas (CIB, CSIC, Madrid) siguiendo las
recomendaciones del fabricante.
Bioinformática y procesamiento de secuencias
Los resultados de secuenciación fueron visualizados mediante el

software Chromas v.1.45 (http://www.technelysium.com.au/
chromas.html) para comprobar la calidad de las secuencias y
eventualmente editarlas. Se utilizó la base de datos de ADN de
Genbank disponible en el National Center for Biotechnology
Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) para determinar
las secuencias depositadas más cercanas a las obtenidas. Las
secuencias fueron analizadas mediante el algoritmo de búsqueda
BLAST (Altschul y otros, 1990) disponible por Internet en el NCBI.
Para el alineamiento y comparación de las secuencias se utilizó
ClustalW v.1.82 (Thompson y otros, 1994). Los números de
acceso de las secuencias obtenidas en este estudio se muestran
en la Tabla 1 del Apéndice.
53
Cobertura de comunidades bacterianas por clones obtenidos
Para determinar el nivel de cobertura de las bacterias detectadas

con respecto a la diversidad total de las comunidades bacterianas
analizadas, se representó el número de clones procesados tanto
frente al numero de divisiones o grupos bacterianos, como al
número de OTUs o unidad taxonómica operacional (“Operational
Taxonomic Unit”) obtenidos. Para ello se consideró que las
secuencias que diferían entre sí menos del 1% pertenecían a la
misma OTU. Se construyeron distintas curvas de cobertura a partir
de los clones obtenidos con cebadores generales para el dominio
Bacteria. Para su construcción se utilizó el programa “rotus” escrito
en “C” y ejecutado bajo el sistema operativo Linux. Las divisiones
bacterianas detectadas durante este estudio y cuyos clones han
sido utilizados para las curvas de cobertura se detallan en la Tabla
2.5.
Tabla 2.5. Lista de divisiones bacterianas detectadas durante este estudio
Divisiones Bacterianas
Acidobacteria
Actinobacteria
Bacteroidetes
Chloroflexi
Deinococcus/Thermus
Firmicutes
Nitrospirae
Planctomycetes
Proteobacteria
Alphaproteobacteria
Betaproteobacteria
Deltaproteobacteria
Gammaproteobacteria
54
2.2.2 Cultivos
Las muestras seleccionadas para el cultivo de bacterias se

suspendieron en solución salina (NaCl al 0.9% p/v estéril) e
inocularon en placas con medios de cultivo, generales para
bacterias o diseñados para acidobacterias. Las muestras
recogidas con los bastoncillos de algodón estériles se
distribuyeron directamente en los medios de cultivo. Las placas se
incubaron a 28°C desde 48 horas hasta casi dos meses para
permitir el crecimiento también de aquellas bacterias con
desarrollo lento. Los cultivos puros se conservaron a -80°C en
crioviales (Microbank, Quimigranel, España) donde pueden
permanecer durante años. Los microorganismos cultivados fueron
caracterizados mediante análisis de sus genes de ARNr 16S. El
primer paso fue la lisis de esas células, a través de tres ciclos de
congelación/descongelación, seguido por la amplificación por PCR
de los genes de ARNr 16S. Los productos de PCR se cargaron en
DGGE (pag. 48). En este caso, los productos de PCR fueron
sometidos a una segunda PCR con los cebadores 341F-GC y
518R (Tabla 2.2). Los cultivos analizados fueron seleccionados a
partir de filotipos caracterizados por su patrón de migración en
DGGE. Las cepas que mostraban idéntica migración se
consideraron pertenecientes al mismo filotipo. Se siguió con la
secuenciación y análisis bioinformático, como se ha descrito en
uno de los apartados anteriores (pag. 53). Para determinar el nivel
de cobertura de las cepas obtenidas con respecto a la diversidad
total de las comunidades bacterianas analizadas, se representó el
número de cultivos procesados tanto frente al numero de
divisiones o grupos bacterianos, como al número de OTUs o
unidad taxonómica operacional obtenidos como se ha descrito en
55
el caso de los clones procesados (pag. 54). Los números de

acceso correspondientes a las cepas aisladas se muestran en la
Tabla 2 del Apéndice.
2.2.3 Actividades enzimáticas
Para el estudio de las actividades enzimáticas de las cepas

aisladas de Pseudonocardia se empleó el sistema API ZYM
(BioMerieux, Marcy L´Étoile, Francia) (Tabla 2.3) según las
recomendaciones del fabricante. Este sistema permite estudiar
simultáneamente 19 actividades enzimáticas a partir de pequeñas
cantidades de muestra. La galería se compone de 20 pocillos cuyo
fondo está constituido por un soporte que contiene un substrato
enzimático con su tampón y que favorece el contacto entre la
enzima y el substrato generalmente insoluble. Los pocillos se
inoculan con una suspensión densa, que rehidrata los substratos.
Las reacciones producidas durante el periodo de incubación se
traducen en cambios de color que se revelan mediante la adición
de los reactivos recomendados por el fabricante. Los
microorganismos se inocularon por duplicado en las galerías y se
incubaron durante 4 horas a 37ºC. Entonces, se añadieron los
reactivos ZYM A y ZYM B (BioMerieux) y se observó el desarrollo
de color en cada pocillo. El cambio o no de color correspondía a
presencia o ausencia de la actividad enzimática correspondiente.
2.2.4 Metabolismo de Hidratos de carbono
Para el estudio del metabolismo oxidativo de los hidratos de

carbono de las cepas aisladas de Pseudonocardia se empleó el
sistema API 50 CH (BioMerieux, Marcy L´Étoile, Francia). Este
56
sistema está compuesto por 50 micropocillos. El primer pocillo, sin

principio activo, sirve como control negativo. Los siguientes
pocillos contienen una cantidad definida de substrato
deshidradato, perteneciente a la familia de los hidratos de carbono
y derivados (heterósidos, polialcoholes, ácidos urónicos) (Tabla
2.4). Se empleó el medio API 50 CHB/E (BioMerieux, Marcy
L´Étoile, Francia) para la inoculación de las galerías. Durante la
incubación, el catabolismo de los glúcidos produce ácidos
orgánicos que hacen cambiar el color del indicador de pH, de un
color rojo a un color amarillo. Los resultados obtenidos constituyen
el perfil bioquímico de la cepa estudiada. La inoculación de las
galerías se realizó por duplicado y la lectura de cada una de ellas
se hizo diariamente durante 10 días, hasta observar que no se
producían cambios adicionales de color. Cabe señalar que esta
galería da información sobre la producción de ácidos a partir de
compuestos orgánicos y no sobre la utilización de substratos como
fuente de carbono.
2.2.5 Colonización por Pseudonocardia
Se llevaron a cabo ensayos de colonización de suelo de la cueva

de Doña Trinidad por Pseudonocardia. El suelo fue esterilizado a
121°C durante 20 min y se hicieron diferentes ensayos con y sin la
adicción de distintos nutrientes. Los nutrientes añadidos fueron
glucosa, peptona, NH4Cl, Na3PO4, Na2SO4, todos al 0,05% p/v.
Los ensayos se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos. El suelo
se distribuyó en la base de los pocillos y se añadieron 10 µl de
cada una de las soluciones de nutrientes y 50 µl de agua
destilada. También se incluyeron controles sólo con agua, sin la
adición de nutrientes. Se preparó una suspensión en solución
57
7
salina (NaCl 0,9%) de la cepa Pseudonocardia I9-24 (3 x 10
células/ml) con la que se inocularon las muestras de suelo. Se
incubaron unas placas a 28°C y otras a 16°C. Los pocillos se
observaron al microscopio y se fotografiaron con una cámara
Canon Power Shot A620 utilizando un estereomicroscopio a una
magnificación de 10X. Las áreas colonizadas se midieron y
compararon utilizando el software ImageJ (National Institutes of
Health, USA). El procedimiento utilizado consistió en la definición
de un umbral para convertir las imágenes de 8 bits en binarias
(Rogerio Candelera y otros, 2008). Se utilizó la función Analize
particles para obtener las medidas de las áreas de interés
obteniéndose la superficie en píxeles cuadrados. Para el análisis
estadístico de las medidas obtenidas se utilizó el test de t-Student
(Sokal y Rohlf, 1981).
Tabla 2.3. Substratos correspondientes a las enzimas ensayadas en el

sistema API ZYM (BioMerieux, Marcy L´Étoile, Francia).
Enzima Substrato
Fosfatasa alcalina 2-naftil fosfato
Esterasa (C4) 2-naftil butirato
Esterasa lipasa (C8) 2-naftil caprilato
Lipasa (C14) 2-naftil miristato
Leucina aramilasa L-Leucil-2-naftilamina
Valina aramilasa L-valil-2-naftilamina
Cistina aramilasa L-cistil-naftilamida
Tripsina N-benzoil-DL-arginina-2-naftilamida
Α-quimotripsina N-glutaril-fenilalanina-2-naftilamida
Fosfatasa ácida 2-naftil fosfato
Naftol-AS-BI-fosfohidrolasa Naftol-AS-BI-fosfato
α-galactosidasa 6-Br-2-naftil-αD-galactopiranosido
β-galactosidasa 2-Naftil-βD-galactopiranósido
β-glucuronidasa Naftol-AS-BI-βD-glucuronido
α-glucosidasa 2-naftil-αD-glucopiranósido
58
Tabla 2.3. (Continuación)
Enzima Substrato
β-glucosidasa 6-Br-2-naftil-βD- glucopiranósido
N-acetil- β-glucosaminidasa 1-naftil-N-acetil-βD-glucosaminido
α-mannosidasa 6-Br-2-naftil-αD-mannopiranosido
α-fucosidasa 2-naftil-αL-fucopiranosido
Tabla 2.4. Lista de los hidratos de carbono ensayados en el sistema API

50 CH (BioMerieux, Marcy L´Étoile, Francia).
Ensayo de Componente Activo Ensayo de Componente Activo

Control Esculina
Glicerol Salicina
Eritritol D-celobiosa
D-arabinosa D-maltosa
L-arabinosa D-lactosa
D-ribosa D-melibiosa
D-xilosa D-sacarosa
L-Xilosa D-trehalosa
D-adonitol Inulina
Metil-βD-Xilopiranosida D-melezitosa
D-galactosa D-rafinosa
D-glucosa Almidón
D-fructosa Glicógeno
D-mamnosa Xilitol
L-sorbosa Gentiobiosa
L-rhamnosa D-turanosa
Dulcitol D-lizosa
Inositol D-tagatosa
D-manitol D-fucosa
D-sorbitol L-fucosa
Metil-αD-Manopiranosida D-arabitol
Metil-αD-Glucopiranosida L-arabitol
N-AcetilGlucosamina Gluconato potásico
Amigdalina 2-CetoGluconato potásico
Arbutina 5-CetoGluconato potásico
59
2.2.6 Medios de cultivos
Caldo de triptona-soja (TSB) (Oxoid, Basingstoke, Hampshire,

Inglaterra)
Caseína digerida enzimáticamente 17,0 g

Harina de soja digerida enzimáticamente 3,0 g
NaCl 5,0 g
K2HPO4 2,5 g
Glucosa 2,5 g
Completar hasta 1.000 ml con agua destilada. Esterilizar en
autoclave a 121ºC durante 20 minutos.
Medio TSA
Disolver 30,0 g de TSB y 20 g de Agar en 800 ml de agua

destilada, ajustar el pH a 7,5 y completar hasta 1.000 ml con agua
destilada. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 20 minutos.
Distribuir el medio en placas Petri.
Medio TSA 1/1000
Disolver 0,030 g de TSB y 20 g de Agar en 800 ml de agua

destilada, ajustar el pH a 7,5 y completar hasta 1.000 ml con agua
destilada. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 20 minutos.
Distribuir el medio en placas Petri.
60
Medio LB (Luria-Bertani) (Bertani y Bertani, 1970) con

ampicilina
Bacto-triptona (Difco) 10 g
Extracto de levadura 5g
NaCl 10 g
Agar 20 g
Disolver en 800 ml de agua destilada, ajustar el pH a 8 y completar
hasta 1000 ml con agua destilada. La solución se esteriliza en
autoclave a 121ºC durante 20 min. Una vez enfriado hasta 50ºC
aproximadamente, a 1 litro de medio LB se le añade 1 ml de una
solución stock de ampicilina (100 mg/ml). Distribuir el medio en
placas Petri.
Caldo nutritivo (Difco, Detroit, Michigan, U.S.A.)
Extracto de carne 3,0 g

Peptona 5,0 g
Completar hasta 1.000 ml con agua destilada. Esterilizar en
autoclave a 121ºC durante 20 minutos.
Medio NB
Disolver 0,08 g de caldo nutritivo (Difco) y 20g de Agar en 800 ml

de agua destilada. Ajustar el pH a 6,5 y completar hasta 1000 ml
con agua destilada. Autoclavar a 121°C durante 20 min y distribuir
en placas Petri.
61
Medio Acido Húmico
Acido húmico (Fluka, Buchs, Suiza) 1g

Agar 20 g
Disolver en aproximadamente 400 ml de NaOH 0.2 M. Ajustar el
pH a 7 y completar hasta 1000 ml con agua destilada. Autoclavar a
121°C durante 20 min y distribuir en placas Petri.
Cultivos de Acidobacteria
Medio con suelo para Acidobacteria
Se utilizó suelo de la cueva para el cultivo de acidobacterias. El

suelo se esterilizó en autoclave a 121°C durante 10min.
Aproximadamente 3 g de suelo se disolvieron en 10 ml de tampón
fosfato (PBS) (pag. 67) conteniendo pirofosfato de sodio (Na4P2O7
x 7H2O) 224 mM como agente dispersor y ditiotreitol (DTT) 1 mM
como agente reductor. La mezcla fue agitada vigorosamente
durante 30 min y se dejó asentar durante 30 min. 200 µl del
sobrenadante fueron diluidos en el mismo tampón PBS y se
utilizaron para suplementar el medio que se describe a
continuación.
Medio base para Acidobacteria (Stevenson y otros, 2004)
KH2PO4 0,2 g
NH4Cl 0,25 g
KCl 0,5 g
CaCl2 x 2H2O 0,15 g
NaCl 1g
62
MgCl2 x 6H2 0,62g

Na2SO4 2,84 g
Hepes (pH 6,8) 10 mM 2,38g
Trace element solution 1ml
Agar 20 g
Disolver en 800 ml de agua destilada, ajustar el pH a 6,8 y
completar hasta 1000 ml con agua destilada. Autoclavar a 121°C
durante 20 min. Dejar enfriar hasta aproximadamente 50°C y
añadir 1ml de una solución stock de vitaminas y 1ml de vitamina
B12 (50mg/l). A este mismo medio se añadieron 1 ml de una de
las siguientes soluciones:
Xilano 0,05% p/v (concentración final)

Piruvato 0,1% p/v (concentración final)
Tiosulfato de sodio 0,1% p/v (concentración final)
Formato 0,1% p/v (concentración final)
Extracto de levadura 0,05% p/v (concentración final)
2.2.7 Soluciones y Tampones
Solución EDTA 0.5M, pH 8,0
Disolver 186.1 g de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en 800

ml de agua destilada. Añadir “lentejas” de NaOH en permanente
agitación hasta obtener un pH alrededor de 8,0. Ajustar el volumen
a 1000 ml con agua destilada. La solución se esteriliza en
autoclave a 121ºC durante 20 min.
63
Tris-HCl 1M pH 7.5
Disolver 121,1 g de Tris base [Tris (hidroximetil)-aminometano] en

800 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7,5 con HCl
concentrado. Completar el volumen a 1000 ml con agua destilada.
Tampón TAE 50x (Tris-Acetato-EDTA)
Tris base [Tris (hidroximetil)-aminometano] 242 g

Ácido acético glacial 57,1 ml
EDTA 37,2 g
Completar el volumen a 1000 ml con agua destilada. Autoclavar a
121ºC durante 20 min.
Tampón de carga para DGGE
Glicerol 25 ml
EDTA 0,5M (pH8,0) 20 ml
Azul de Bromofenol 25 mg
Tampón de carga para electroforesis en gel de agarosa
Glicerol 25 ml
EDTA 0,5M (pH 8,0) 20 ml
Azul de Bromofenol 25 mg
SYBR® Green I 45 μl
Solución 0% de desnaturalizante para DGGE
Tampón TAE 50x 1,5 ml
64
Acrilamida/Bisacrilamida 37.5:1 30 ml
Ajustar el volumen a 150 ml con agua desionizada
Solución 80% de desnaturalizante para DGGE
Tampón TAE 50x 1,5 ml

Acrilamida/Bisacrilamida 37.5:1 30 ml
Formamida desionizada 48 ml
Urea 50,4 g
Ajustar el volumen a 150 ml con agua destilada
Solución SDA o de alta concentración de agentes

desnaturalizantes
Solución 0% 4,1 ml
solución 80% 6,9 ml
Solución SDB o de baja concentración de agentes

desnaturalizantes
Solución 0% 7 ml
Solución 80% 4 ml
Trace element solution
Acido nitrilotriacetico 1,5 g

MgSO4 x 7H2O 3g
MnSO4 x 2 H2O 0,5 g
NaCl 1g
FeSO4 x 7 H2O 0,1 g
65
CoSO4 x 7 H2O 0,18 g

CaCl2 x 2 H2O 0,1 g
ZnSO4 x 7 H2O 0,18 g
CuSO4 x 5 H2O 0,01 g
KAl(SO4)2 x 12 H2O 0,02 g
H3BO3 0,01 g
Na2MoO4 x 2 H2O 0,01 g
NiCl2 x 6 H2O 0,025 g
Na2SeO3 x 5 H2O 0,3 g
Disolver primero el acido nitrilotriacético en 800 ml y ajustar el pH
a 6,5 con KOH, después añadir los minerales y ajustar el pH a 7
con KOH. Completar hasta 1000 ml con agua destilada. Añadir
1ml de Trace element solution por litro de medio de cultivo antes
de autoclavar.
Solución stock de vitaminas
Biotina 2 mg
Acido fólico 2 mg
Piridoxina-HCl 10 mg
Tiamina-HCl x H2O 5 mg
Riboflavina 5 mg
Acido nicotínico 5 mg
D-Ca-pantotenato sodico 5 mg
Vitamina B12 0,1 mg
Acido p-aminobenzoico 5 mg
Acido lipoico 5 mg
66
Disolver en 1000 ml de agua destilada. Esterilizar por filtración a

través de filtros de esteres de celulosa con 0,22 µm de diámetro
de poro (Millipore, Madrid, España).
Tampón fosfato salino (PBS) 10x
NaCl 76,5 g
Na2HPO4 7,2 g
KH2PO4 2,1 g
Disolver en 800 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7,2 utilizando
NaOH. Completar hasta 1000 ml con agua destilada. Autoclavar a
121°C durante 20 min.
67
2.3 Estudio de las comunidades fúngicas
A continuación se describen los pasos seguidos en el protocolo

experimental empleado (Fig. 2.11) para el estudio de las
comunidades fúngicas presentes en la cueva de Doña Trinidad.
Muestra
Extracción de ADN Cultivo y aislamiento
Construcción PCR Caracterización morfológica

de genoteca
Selección
de clones Secuenciación
por DGGE
Búsqueda
de homólogos Identificación
Figura 2.11. Protocolo experimental seguido en el análisis de hongos a

partir de muestras de la Cueva de Doña Trinidad.
Se llevaron a cabo dos líneas principales, el cultivo de hongos y el

análisis molecular basado en ADN. A través de los cultivos se han
detectado hongos presentes en las comunidades que componían
68
las muestras analizadas, capaces de crecer bajo las condiciones

proporcionadas en el laboratorio. Los análisis moleculares
basados en el ADN se utilizaron para identificar los hongos
presentes en la Cueva de Doña Trinidad y analizar la variedad que
engloban estos organismos en el ambiente estudiado.
Muestreo
Las muestras se recogieron en tubos Eppendorf de 1,5 ml y se

conservaron a 4°C hasta la llegada al laboratorio. Una vez en el
laboratorio, las muestras seleccionadas para análisis moleculares
se conservaron a -80ºC mientras que aquellas seleccionadas para
el cultivo se procesaron lo antes posible. Las muestras analizadas
se recogieron en las fechas 30 de Marzo de 2005, 14 de
Noviembre de 2006 y 27 de Abril de 2007 y corresponden a 7
muestras de suelo de la cueva (X23, Y24, SLE, PP16, O15, Suelo
39 y Suelo 8), 2 de espeleotemas (C3, G7), una de un escalón
(D4) y excrementos de mamíferos presentes en la cueva (MM13,
K11 y LL12). También se analizaron muestras de aire (ARB P6,
ARB D4, ARB V22); las dos primeras se obtuvieron dejando
placas Petri con medio rosa bengala abiertas en diferentes zonas
de la cueva entre 22 s y 27 s (Fig. 2.12). La muestra ARB V22 se
obtuvo apoyando directamente la placa sobre colonizaciones
blancas de un espeleotema de la cueva (Fig. 2.13). Una vez
llegados al laboratorio estas placas fueron directamente incubadas
a 28°C. Se analizaron también muestras de pigmentos rojos (L12)
y grabados de serpientes (M13). En la Tabla 2.6 se resumen las
muestras analizadas, su origen y el tipo de análisis efectuado.
69
Figura 2.12. Placa Petri con el medio RB abierta para la detección de

hongos en el aire de la cueva. La placa se localiza en la Gran Sala y se
dejó abierta durante 22 s.
Figura 2.13. La placa V22 se inoculó apoyándola directamente sobre las

colonizaciones blancas que se visualizan en la foto y que se encuentran
localizadas en un espeleotema en la zona de entrada de la Cueva de
Doña Trinidad.
70
Tabla 2.6. Muestras analizadas para el estudio de la diversidad fúngica
Muestra Tipo de Origen Fecha Tipo de análisis

muestra muestreo
L12 Pigmento Gran Sala 30/03/2005 Análisis molecular (ADN)

rojizo
M13 Grabados de Galería del 30/03/2005 Análisis molecular (ADN)
serpientes Calvario
C3 Espeleotema Entrada 14/11/2006 Cultivo, Análisis molecular
(ADN)
G7 Espeleotema Entrada 14/11/2006 Cultivo, Análisis molecular
(ADN)
D4 Escalon VI Entrada 14/11/2006 Cultivo, Análisis molecular
(ADN)
X23 Suelo Gran Sala 27/04/2007 Cultivo, Análisis molecular
(ADN)
Y24 Suelo Gran Sala 27/04/2007 Cultivo, Análisis molecular
(ADN)
PP16 Suelo Galería del 27/04/2007 Cultivo, Análisis molecular
Calvario (ADN)
O15 Suelo Camarín 27/04/2007 Cultivo, Análisis molecular
(ADN)
Suelo39 Suelo Entrada 27/04/2007 Cultivo, Análisis molecular
(ADN)
Suelo8 Suelo Entrada 27/04/2007 Cultivo, Análisis molecular
(ADN)
SLE Suelo Lado 27/04/2007 Cultivo, Análisis molecular
externo (ADN)
MM13 Excrementos Gran Sala 27/04/2007 Cultivo, Análisis molecular
(ADN)
K11 Excrementos Gran Sala 27/04/2007 Cultivo, Análisis molecular
(ADN)
LL12 Excrementos Gran sala 27/04/2007 Cultivo, Análisis molecular
(ADN)
ARBP6 Aire Gran Sala 27/04/2007 Cultivo, Análisis molecular
(ADN)
ARBD4 Aire Galería del 27/04/2007 Cultivo, Análisis molecular
Calvario (ADN)
ARBV22 Aire Entrada 27/04/2007 Cultivo, Análisis molecular
(ADN)
71
2.3.1 Análisis molecular
Para la caracterización molecular se crecieron los hongos en

medio MA (pag. 79). Se recogió el micelio con espátula estéril y se
transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml conteniendo 500 µl de
tampón de lisis (50mM Tris-HCl, 50mM EDTA, 3% SDS (dodecil
sulfato sodico) y 1% β-mercaptoetanol, pH 7,5) y
aproximadamente 200 µl de bolitas de vidrio (425-600 nm, Merck,
Darmstadt, Alemania). La mezcla se agitó en un agitador (Termo
Savant FastPrep, FP120, Holbrook, EE.UU.) a máxima velocidad
durante 3 min, se incubó a 65°C durante una hora y se volvió a
agitar durante 3 min a máxima velocidad y al final fue centrifugada
durante 10 min a 14000 rpm. El sobrenadante fue transferido a un
nuevo tubo Eppendorf. El ADN extraído fue diluido 1:150 para ser
utilizado en reacciones de amplificación por PCR.
Amplificación por PCR de fragmentos de genes de ITS y

genes ARNr
Las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando el kit Master

Taq (5 prime, Eppendorf, Viena, Austria). Los cebadores utilizados
fueron ITS1-F y ITS4 para la amplificación de las regiones entre
las subunidades pequeña y grande del ARNr (ITS1 y ITS2),
mientras que para la amplificación de los genes que codifican para
el ARNr 26S, se emplearon los cebadores NL4 y 18/1184 y para la
amplificación del gen ARNr 18S los cebadores FunARBR y EukAF
(Tabla 2.7). El ADN fue amplificado en un termociclador MJ
Research PTC 200 a través de 35 ciclos del siguiente programa:
un ciclo de desnaturalización durante 1 min a 94°C, uno de
hibridación de cebadores a 50°C durante 1 min, y uno de
72
extensión a 72°C durante 1 min. A estos ciclos les siguió un ciclo

final de extensión a 72°C durante 5 min, finalizando a 4°C.
Tabla 2.7. Cebadores utilizados en las reacciones de PCR,

secuenciación y RAPD.
Cebador1 Secuencia (5’-3’) Genes Referencia

diana
ITS1F TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS1-ITS2 White y otros,

1990
ITS1F-F CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA ITS1-ITS2 White y otros,

1990
ITS3F GCATCGATGAAGAACGCAGC ITS1-ITS2 White y otros,

1990
ITS4R TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS1-ITS2 Gardes y

Bruns, 1993
NL4R GGTCCGTGTTTCAAGACGG 26S White y otros,

1990
18/1184F GACTCAACACGGGGAACTC 18S White y otros,

1990
ITS4-FGC2 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS1-ITS2 White y otros,

1990
EukAF AAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT 18S Diez y otros,
1999
FunARBR TTC CTC GTT GAA GAG CAA 18S No publicado

3
PELF ATA TCA TCG AAG CCG C Genoma Kang y otros,
total 2002
URPF13 ATC CAA GGT CCG AGA CAA CC Genoma Kang y otros,
total 2002
1
Los cebadores indicados con “F” se refieren al cebador sentido
(“forward”); aquellos con “R” se refieren a cebadores antisentido
(“reverse”).
2
Este cebador tiene una cola rica en GC en su extremo 5’
(CGCCCGCCGCGCGCGCGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG).
3
Cebadores utilizados en RAPD.
73
Geles de agarosa
Los productos de PCR se visualizaron en geles de agarosa

(Cambrex Bio Science SeaKem LE Agarose) según lo descrito en
el apartado 2.2.1 (pag. 46) con la diferencia de que en este caso el
tampón utilizado (TAE) contenía bromuro de etidio
(aproximadamente 10 mg/ml de solución).
Purificación de los productos de PCR
Las bandas se cortaron del gel asépticamente y los productos de

PCR fueron purificados utilizando el Wizard Sv Gel y PCR Clean-
up system (Promega, Madison, EE.UU.) según las
Secuenciación de ADN
Los ciclos de secuenciación se llevaron a cabo en un volumen de

20 µl que comprendía 10 µl de agua destilada, 6 µl de tampón (Big
Dye Buffer), 2 µl de Big Dye RR Mix (Applied Biosystems,
Nieuwerkerk a/d IJssel, Olanda), 1 µl de producto de PCR y 1 µl
del cebador seleccionado (concentración final). Los cebadores
utilizados para la secuenciación fueron ITS4R y NL4R y en
algunos casos se llevó a cabo también la secuenciación con los
cebadores del sentido opuesto (ITS1F y 18/1184F). Las
reacciones de secuenciación se llevaron a cabo en un
termociclador MJ Research PTC 200 con el siguiente programa:
25 ciclos de 96°C durante 30 s, 50°C durante 15 s y 60°C durante
4 min. Los productos de los ciclos de secuenciación se purificaron
utilizando el kit de purificación AutoSeqTM G-50 (Amersham
74
Biosciences, Freiburg, Alemania). La secuenciación del ADN se

llevó a cabo en un secuenciador automático ABI Prism (Applied
Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) siguiendo las
Procesamiento de secuencias y análisis bioinformático
Las secuencias se editaron utilizando el programa Seqman

(Dnastar Incc., Madison, EE.UU.) y se procesaron como se ha
descrito en el apartado 2.2.1 (pag. 53). Los números de acceso de
las cepas obtenidas y analizadas se encuentran en la Tabla 3 del
Apéndice.
Construcción de genotecas
Se construyeron genotecas a partir de muestras de pigmentos

rojos (L12) y grabados de serpientes (M13) con el fin de
determinar los principales hongos que componían las
comunidades de estas muestras. El protocolo empleado fue igual
al descrito anteriormente para bacterias (apartado 2.2.1, pag. 50) y
los cebadores utilizados en estas amplificaciones fueron FunARBR
y EukAF (Tabla 2.7).
Selección de clones y su procesamiento
La selección de los clones se llevó a cabo por digestión con las

enzimas Hin6I y MspI (Fermentas, EE.UU.). Por ello se efectuó
una primera amplificación por PCR de los fragmentos de ADN
insertados en el vector de clonación, utilizando 1 μl de suspensión
de células del clon a analizar como ADN molde y el par de
75
cebadores específicos para la secuencia del vector, T7F y M13R

(Tabla 2.2, pag. 47). Esta primera amplificación por PCR se realizó
en las mismas condiciones que las descritas en el apartado 2.2.1
(pag. 45). A continuación se procedió con una digestión por
enzimas de digestión. La mezcla de digestión contenía 10 µl de
producto de PCR, 2 µl de tampón, 0,1 µl de cada uno de las
enzimas (10u/µl), y 7,8 µl de agua destilada, por un total de 20 µl.
La reacción tuvo lugar durante 12 h a 37°C. Los productos de
digestión se visualizaron en geles de agarosa (pag. 46). Los
clones seleccionados se purificaron y se procesaron como se ha
descrito en el apartado 2.2.1 (pag. 51). Los números de acceso de
los clones obtenidos y analizados se encuentran en la Tabla 3 del
Apéndice.
Selección de las levaduras por DGGE y RAPD
Las levaduras se seleccionaron por DGGE siguiendo el protocolo

descrito en el apartado 2.2.1 (pag. 48) salvo lo que concierne al
gradiente químico utilizado y el tiempo de electroforesis. Se
ensayaron diferentes gradientes químicos y tiempos de migración
y se seleccionó un gradiente de 30% a 60% de agentes
desnaturalizantes y un tiempo de electroforesis de 5h y 30 min,
que resultaron las condiciones mas adecuadas para obtener una
buena distinción de los fragmentos de ADN fúngicos. Los
cebadores utilizados fueron el ITS4F-GC y el ITS3R (Tabla 2.7).
Las levaduras también fueron analizadas por la técnica RAPD
(Random Amplified Polimorphic DNA o Amplificación al azar de
polimorfismos de ADN). Esta técnica permite la amplificación de
regiones de ADN desconocidas a priori mediante el empleo de
cebadores arbitrarios de pocas pares de bases. Los cebadores
76
empleados fueron PELF Y URPF1 (Tabla 2.7). La amplificación

por PCR se llevó a cabo en un termociclador MJ Research termal
cycler (PTC 200). El programa de amplificación utilizado fue:
desnaturalización a 94°C durante 2 min, seguida por 40 ciclos de
94°C durante 34 s, 45°C durante 70 s, 72°C durante 90 s y un
paso final de extensión a 72°C durante 5 min. Los productos de las
reacciones se visualizaron en geles de agarosa según como se ha
descrito anteriormente (pag. 46).
Cobertura de comunidades fúngicas por aislados obtenidos
Para determinar el nivel de cobertura de los hongos detectados

con respecto a la diversidad total de las comunidades fúngicas
analizadas, se representó el número de aislados procesados
frente al número de OTUs detectadas. Se siguió el mismo
procedimiento descrito anteriormente (pag. 54). Para la
construcción de las curvas de cobertura se utilizaron los hongos
pertenecientes a las divisiones Ascomycota y Basidiomycota
obtenidos.
2.3.2 Cultivos
Aislamiento y caracterización morfológica
Aproximadamente, un gramo de las muestras seleccionadas para

el cultivo se resuspendió en 10 ml de una solución Tween 80 al
0.01% (v/v) y se agitó durante una hora. Se prepararon diferentes
diluciones. Se difundió homogéneamente un volumen de 100 µl
de las soluciones diluidas en placas Petri con diferentes medios.
Se emplearon distintos medios de cultivo para el crecimiento de
77
hongos: Extracto de Malta – Agar (MA), Czapeck Agar, Dextrosa

Rosa Bengala, Extracto de levadura – Peptona – Glucosa (YPD) y
el medio R2A. El medio R2A, característico para bacterias, se ha
empleado para determinar la presencia de las morfologías de
colonias bacterianas más comunes en comparación con los
medios para el crecimiento de hongos. Las placas fueron
incubadas a 28°C y se observó el crecimiento de los hongos
durante casi un mes. Las diferentes colonias detectadas en los
medios sólidos fueron transferidas a placas con medio fresco y
aisladas por extinción. La pureza de los cultivos se comprobó a
través de observaciones al microscopio. La caracterización
morfológica se llevó a cabo recogiendo pequeñas cantidades de
micelio que fueron observadas al microscopio y caracterizadas
según diferencias taxonómicas (Carlile y Watkinson, 1994). Las
cepas fueron caracterizadas en base a análisis moleculares como
se ha descrito anteriormente y han sido utilizadas para la
construcción de las curvas de cobertura (pag. 77).
2.3.3 Colonización por Fusarium
Se llevó a cabo un estudio de la capacidad de colonización de

suelo de la cueva por parte de Fusarium de la misma manera que
la descrita en el caso de Pseudonocardia (pag. 57). Se preparó
una suspensión de células de la cepa de Fusarium Suelo-8 (3 x
6
10 células/ml) con la que se inocularon muestras de suelo de la
cueva con y sin nutrientes. Se incubaron placas a 28° C y a 16° C.
Los pocillos se observaron al microscopio y se fotografiaron con
una cámara Canon Power Shot A620 utilizando un
estereomicroscopio a una magnificación de 10X. Las medidas de
78
las áreas colonizadas y los análisis estadísticos se llevaron a cabo

como se ha descrito en el caso de Pseudonocardia (pag. 57).
2.3.4 Medios de cultivos
Medio MA (Extracto de Malta - Agar) (Panreac, Barcelona)
Extracto de Malta 6g
Extracto de levadura 1,2 g
D(+)-Glucosa 6g
Maltosa 6g
Agar 20 g
Disolver en 800 ml de agua destilada, ajustar el pH a 4,7 ± 0,2 con
NaOH y después completar hasta 1000 ml con agua destilada.
Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 20 min y distribuir el
medio en placas Petri.
Medio Czapek Agar
Czapek Dox 48 g
Extracto de levadura 2g
Casaminoacidos 6,10 g
Triptofano 0,02 g
Agar 20 g
Disolver en 800 ml de agua destilada y ajustar el pH a 7,2.
Completar hasta 1000 ml con agua destilada. Esterilizar en
autoclave a 121°C durante 20 min y distribuir el medio en placas
Petri.
79
Medio R2A
Extracto de levadura 0,5 g

Proteosa peptona 0,5 g
Casaminoacidos 0,5 g
Glucosa 0,5 g
Almidón soluble 0,5 g
Piruvato de sodio 0,3 g
K2HPO4 0,3 g
MgSO4 x 7 H2O 0,05 g
Disolver en 800 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7,2 utilizando
K2HPO4 cristalino. Añadir 20 g/l de Agar y completar hasta 1000 ml
con agua destilada. Autoclavar durante 20 min a 121°C. Distribuir
en placas Petri.
Medio Dextrosa Rosa Bengala
Peptona 5g
Dextrosa 10g
KH2PO4 1g
MgSO4 x 7 H2O 0,5 g
Rosa de Bengala 0,05 g
Agar 20 g
Disolver en 800 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7,2 y
completar hasta 1000 ml con agua destilada. Autoclavar a 121°C
durante 20 min. Una vez que el medio se haya resfriado añadir 0,1
g de cloramfenicol. Distribuir en placas Petri.
80
Medio YPD
Extracto de levadura 10 g
Peptona 20 g
Glucosa 20 g
Agar 20 g
Disolver en 800 ml de agua destilada. Ajustar pH a 6,5. Completar
hasta 1000 ml con agua destilada y autoclavar durante 10 min a
121°C. Distribuir en placas Petri.
81
82
Capitulo 3: Resultados
83
84
Resultados
3.1 Comunidades bacterianas en la cueva de Doña

Trinidad
En total se analizaron 545 secuencias entre clones de las

genotecas de ADN, de ARN y cepas obtenidas mediante técnicas
de cultivo de muestras de suelo, grabados, pigmentos, trazos
negros y colonizaciones blancas de la cueva de Doña Trinidad.
Estas muestras se examinaron tanto a través de métodos de
cultivo como mediante técnicas moleculares basadas en ADN y
ARN. Las muestras de agua de goteo, sedimentos, fragmentos de
columnas y espeleotemas de la cueva se estudiaron
exclusivamente mediante técnicas de cultivo y se obtuvieron 38
cepas.
3.1.1 Comunidades bacterianas de las muestras de suelo
Este análisis corresponde a muestras de suelo de la Galería del

Calvario (N14, S18, Y21) recogidas en el año 2005. Se analizaron
un total de 227 secuencias utilizando cebadores generales para
Bacteria, 50 pertenecientes a genotecas de ADN y 73 a genotecas
de ARN. Utilizando cebadores específicos para Acidobacteria se
detectaron 18 secuencias (a partir del ARN). También se
detectaron 16 secuencias con el empleo de cebadores específicos
para bacterias reductoras de sulfato. Por técnicas de cultivo se
obtuvieron 70 secuencias.
85
Resultados
Análisis de las genotecas
Genotecas de ADN
Entre las secuencias pertenecientes al dominio Bacteria, la

división Proteobacteria fue la más representativa tanto por las
secuencias obtenidas a partir de ADN (80%) como de ARN (93%).
Dentro de esta división, las secuencias de la subdivisión
Gammaproteobacteria constituyeron un 76% del total de las
secuencias obtenidas a partir del ADN (Fig. 3.1 A). Entre los
órdenes detectados destaca el de las Enterobacteriales
(Escherichia). La subdivisión Deltaproteobacteria constituyó el 4%
de las secuencias de la genoteca de ADN. Los miembros
detectados dentro de esta subdivisión no estaban relacionados
con BRS. La división Firmicutes representó el 20% de las
secuencias de la genoteca de ADN representada principalmente
por el orden Clostridiales (Fig. 3.1 A).
Genotecas de ARN
Por lo que concierne a las secuencias obtenidas a partir del ARN,

es decir, aquellas bacterias que desarrollan mayor actividad
metabólica en la comunidad estudiada, la división Proteobacteria
representaba el 93% del total de las secuencias procesadas. Las
subdivisiones más frecuentemente detectadas fueron
Gammaproteobacteria (45%), Alphaproteobacteria (33%) y
Betaproteobacteria (15%). Entre la división Gammaproteobacteria
se detectaron principalmente miembros pertenecientes al orden
Enterobacteriales (Escherichia y Shigella). Las alfaproteobacterias
detectadas estaban representadas fundamentalmente por los
86
Resultados
ordenes Sphingomonadales y Rhizobiales. Herbaspirillum del

orden Burkholderiales fue el componente más característico de las
betaproteobacterias. Entre los microorganismos metabólicamente
activos, se detectaron también secuencias correspondientes a las
divisiones Firmicutes (6%) y Actinobacteria (1%) (Fig. 3.1 B)
representadas fundamentalmente por los géneros Bacillus
(Bacillales) y Propionibacterium (Actinomycetales),
respectivamente.
Gracias al empleo de cebadores específicos para la división

Acidobacteria se detectaron secuencias correspondientes a tres
subdivisiones de Acidobacteria, de acuerdo con el sistema de
clasificación propuesto por Zimmermann y colaboradores (2005a).
Estas acidobacterias presentaban actividad metabólica
significativa ya que han sido detectadas a partir de su ARN. La
subdivisiones detectadas fueron la 6 (56%), la 9 (28%) y la 4
(16%) (Fig. 3.2).
A partir de ARN, con el empleo de cebadores específicos para

BRS, se detectaron miembros pertenecientes a la división
Deltaproteobacteria. El 88% de estas secuencias correspondieron
a Desulfovibrio desulfuricans del orden Desulfovibrionales.
Cultivos
Se han utilizado distintos medios para la preparación de cultivos a

partir de las muestras de suelo. En medio TSA y en condiciones
aeróbicas se obtuvieron cultivos pertenecientes a la división
Actinobacteria (83%) fundamentalmente representada por
miembros de los géneros Streptomyces, Agromyces, Saccharotrix
87
Resultados
y Lentzea. El 10% de las cepas analizadas pertenecían a la

división Firmicutes y estaban constituidas por miembros del
genero Bacillus. La división Proteobacteria constituía el 7% de las
cepas y pertenecían a la subdivisión Gammaproteobacteria
fundamentalmente al género Pseudomonas (Fig. 3.3).
A
20%
4%
76%
Alphaproteobacteria Deltaproteobacteria
Betaproteobacteria Firmicutes
B Actinobacteria
Gammaproteobacteria
15%
1%
6%
45%
33%
Figura 3.1. Proporción de distintos grupos bacterianos detectados a partir

de ADN (A) y ARN (B) en muestras de suelo.
88
Resultados
Subdivisión 9
16%
28%
Subdivisión 6
Subdivisión 4
56%
Figura 3.2. Proporción de distintos representantes de la división

Acidobacteria detectados en muestras de suelo a partir de genotecas
construidas utilizando cebadores específicos para esta división.
Actinobacteria
Gammaproteobacteria
Firmicutes
10%
7%
83%
Figura 3.3. Proporción de distintos grupos bacterianos detectados por

técnicas de cultivos en muestras de suelo.
89
Resultados
Comparación de los resultados obtenidos por distintos

métodos
Se compararon los resultados obtenidos a partir de las tres

técnicas de detección utilizadas en este estudio (ADN, ARN y
cultivos).
La subdivisión Gammaproteobacteria fue detectada a través de los

tres métodos empleados y principalmente a partir del ADN (Fig.
3.4) aunque los tipos detectados más representativos variaban
según las técnicas empleadas: Pseudomonadales por cultivos y
Enterobacteriales por análisis de ADN y ARN. Las
Alfaproteobacterias y las Betaproteobacterias se detectaron
exclusivamente por ARN. Sin embargo, las Deltaproteobacterias
se detectaron exclusivamente en base al ADN y no pudieron ser
cultivadas a pesar de intentar medios anaeróbicos apropiados
para bacterias reductoras de sulfato típicas de esta subdivisión.
Con el empleo de cebadores específicos para BRS a partir de
ARN las deltaproteobacterias representaron el 88 % de las
secuencias procesadas. La división Actinobacteria fue la más
frecuentemente detectada a partir de cultivos mientras que a
través de los análisis moleculares sólo representaba una pequeña
fracción del ARN analizado (Fig. 3.4). La división Firmicutes se
detectó por métodos moleculares basados en ADN y ARN y por
cultivos resultando Bacillales (detectado por ambos métodos,
moleculares y de cultivo), y Clostridiales (detectado a partir de
ADN) como los ordenes más comunes de esta división en las
muestras de suelo.
90
Resultados
100
80
Porcentaje
60
40
20
0
Gammaproteobacteria
Alphaproteobacteria
Actinobacteria
Deltaproteobacteria
Betaproteobacteria
Firmicutes
Figura 3.4. Comparación de las proporciones correspondientes a los

grupos bacterianos detectados a partir de ADN ( ), ARN ( ), y cultivos
( ) en muestras de suelo.
91
Resultados
3.1.2 Comunidades bacterianas de las muestras de grabados
Se han recogido dos muestras de los grabados de la cueva

estudiada, una de los grabados de serpientes (M13) y otra del
grabado de un pez (P16). En total se obtuvieron 112 secuencias,
38 a partir de ADN y 61 a partir de ARN. Las restantes secuencias
(13) se obtuvieron utilizando cebadores específicos para
Acidobacteria. No se analizaron cultivos (a partir de estas
muestras) por la escasez de muestra disponible.
Genotecas de ADN
Los clones procesados en base al ADN correspondieron a la

división Proteobacteria. La subdivisión Gammaproteobacteria
representó el 90% del total de secuencias. Entre las
gammaproteobacterias el orden Enterobacteriales y el orden
Pseudomonadales (Acinetobacter) constituyeron los grupos más
frecuentemente obtenidos. Las alfaproteobacterias comprendían el
10 % de los clones procesados, principalmente clasificados en el
genero Aurantimonas (orden Rhizobiales) (Fig. 3.5 A).
Genotecas de ARN
En base al ARN se obtuvieron un 87% de secuencias

pertenecientes a la división Proteobacteria. La subdivisión
Alphaproteobacteria resultó la más abundante (67%) y el género
Sphingomonas (del orden Sphingomonadales) fue el más
frecuentemente detectado. La subdivisión Gammaproteobacteria
92
Resultados
constituyó el 20% del total de secuencias analizadas. Dentro de

esta subdivisión los géneros más representativos fueron
Escherichia (50%), Shigella (16%) y Pseudomonas (33%).
También se detectaron las divisiones Actinobacteria (8%),
Firmicutes (3%) y Bacteroidetes (2%) (Fig. 3.5 B). Los géneros
más representados fueron Mycobacterium y Propionibacterium
(del orden Actinomycetales) dentro de las actinobacterias, el
genero Streptococcus (del orden Lactobacillales) entre las
Firmicutes y el genero Prevotella (del orden Bacteroidales) dentro
de Bacteroidetes.
También se detectaron Acidobacteria utilizando cebadores

específicos para esta división bacteriana (a partir de su ARN).
Dentro de este grupo bacteriano el 39% de los clones procesados
correspondieron a la subdivisión 10, el 31% a la subdivisión 6, el
23% a la subdivisión 7 y un 7% de las secuencias pertenecieron a
la subdivisión 4 (Fig. 3.6). No se detectó esta división a partir de
cebadores universales para el Dominio Bacteria.

ARN
También en el caso de los grabados las proteobacterias

representaron la mayoría de las secuencias procesadas tanto a
partir de ADN como de ARN. Mientras las gammaproteobacterias
representaban una mayoría en análisis de la comunidad
bacteriana basado en ADN, las alfaproteobacterias eran los
principales componentes metabólicamente activos (en base al
ARN) en los grabados. Además de las proteobacterias se
detectaron como metabólicamente activos otros grupos,
93
Resultados
Firmicutes, Actinobacteria y Bacteroidetes que no se identificaron

en las genotecas de ADN (Fig. 3.7). La diversidad de
acidobacterias en las muestras estudiadas a partir de ARN (Fig.
3.6) era elevada.
A
10%
90%
Alphaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Firmicutes
Actinobacteria
Bacteroidetes
B 2%
8% 20%
3%
67%

de análisis de ADN (A) y de ARN (B) en muestras de grabados.
94
Resultados
Subdivisión 10 Subdivisión 4
Subdivisión 6 Subdivisión 7
7%
31%
23%
39%
Figura 3.6. Proporción de distintas subdivisiones del grupo Acidobacteria

encontradas en muestras de grabados.
100
80
Porcentaje
60
40
20
0
Gammaproteobacteria
Alphaproteobacteria
Actinobacteria
Firmicutes
Bacteroidetes
Figura 3.7. Comparación de las proporciones de distintos grupos

bacterianos obtenidos a partir del análisis de ADN ( ) y de ARN ( ) en
muestras de grabados.
95
Resultados
3.1.3 Comunidades bacterianas de los pigmentos rojos
Se recogieron muestras de pigmentos rojos de la cueva de Doña

Trinidad desde una pared (L12). En total se analizaron 59
secuencias, 43 por ADN y 16 por ARN. No se analizaron cultivos a
partir de las muestras por su escasez.
Genotecas de ADN
La mayoría de las secuencias obtenidas a través del análisis de

ADN de la muestra de pigmentos correspondieron a la división
Proteobacteria (80%). Dentro de esta división el 77% de las
secuencias obtenidas pertenecieron a las gammaproteobacterias,
las mayoría de las cuales estaban representadas por miembros
del orden Enterobacteriales. Estas representaron el 61% del total
de las secuencias procesadas. Las alfaproteobacteria
representaron el 23% de la división Proteobacteria y el 19% del
total de las secuencias; el miembro más representado de este
grupo fue Aurantimonas del orden Rhizobiales. Otras divisiones
detectadas fueron Firmicutes (11%) (Bacillus del orden Bacillales)
Actinobacteria (5%) (Corynebacterium del orden Actinomycetales)
y un 2% de Bacteroidetes (Prevotella del orden Bacteroidales) y de
Deinococci (Fig. 3.8 A).
Genotecas de ARN
Las genotecas de ARN resultaron estar constituidas por las

divisiones Proteobacteria y Actinobacteria, ambas representadas
96
Resultados
por el 50% de los clones procesados. Dentro de la primera se

detectaron principalmente miembros pertenecientes al orden
Sphingomonadales de la división Alphaproteobacteria mientras
que el género Propionibacterium (del orden Actinomycetales) fue
el más frecuentemente detectado dentro de las actinobacterias
(Fig. 3.8 B).
El empleo de cebadores específicos para Acidobacteria y BRS

enriquecieron los resultados obtenidos sobre las comunidades
metabólicamente activas de pigmentos rojos. Dentro de las
acidobacterias se detectaron miembros pertenecientes a la
subdivisión 4 y a la subdivisión 3, ambas representadas en
proporción similar (Fig. 3.9). El empleo de cebadores específicos
para BRS resultó en la detección de miembros pertenecientes a
este grupo fisiológico de la subdivisión Deltaproteobacteria
relacionados con el género Geobacter del orden
Desulfuromonadales.

ARN
Las comunidades microbianas de las muestras de pigmentos rojos

resultaron relativamente complejas. Las gammaproteobacterias
representaron la mayoría de las secuencias detectadas por ADN
pero sorprendentemente este grupo no fue detectado como
metabólicamente activo a partir de análisis de ARN. Dentro de la
comunidad metabólicamente activa de las muestras se detectaron
miembros pertenecientes a la división Alphaproteobacteria y a la
subdivisión Actinobacteria (Fig. 3.10).
Las comunidades microbianas de pigmentos rojos tenían una
97
Resultados
importante representación de miembros metabólicamente activos

de los grupos bacterianos Acidobacteria y BRS.
5% 2% 2%
11%
19% 61%
Alphaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Firmicutes
Actinobacteria
Bacteroidetes
B
Deinococci
50% 50%

de ADN (A) y ARN (B) en muestras de pigmentos rojos
98
Resultados
Subdivisión 3
Subdivisión 4
50% 50%
Figura 3.9. Proporción de las subdivisiones de Acidobacteria detectadas a

partir de ARN en la muestra L12.
80
60
Porcentaje
40
20
0
Gammaproteobacteria
Alphaproteobacteria
Actinobacteria
Deinococci
Firmicutes
Bacteroidetes
Figura 3.10. Comparación de distintos grupos bacterianos detectados a

partir de ADN ( ), y de ARN ( ) en muestras de pigmentos rojos.
99
Resultados
3.1.4 Comunidades bacterianas en trazos negros
La muestra R17 fue recogida de algunos trazos negros descritos

por Breuil (1921) al final de la Galería del Calvario. Se procedió a
su análisis tanto de ADN como de ARN con cebadores generales
para Bacteria y también de Acidobacteria mediante cebadores
específicos para esta división. Además, se llevaron a cabo cultivos
a partir de la muestra. Se analizaron un total de 63 secuencias
entre clones de las genotecas de ADN (33) y ARN (14), aquellos
obtenidos con el empleo de cebadores específicos para
Acidobacteria (4) y cultivos (12).
Genotecas de ADN
Entre las secuencias obtenidas a partir de ADN, la mayoría

correspondieron a la división Proteobacteria, representadas
fundamentalmente por el orden Enterobacteriales de las
gammaproteobacterias (97%). La división Firmicutes representó el
3% de las secuencias analizadas (Fig. 3.11 A). El orden más
frecuentemente detectado dentro de esta división fue el
Lactobacillales.
Genotecas de ARN
Dentro de las secuencias obtenidas en base al ARN, las

proteobacterias fueron las más frecuentemente detectadas
(Gammaproteobacteria 72%; Alphaproteobacteria 21% y
Betaproteobacteria 7%). Los representantes de las gamma y
100
Resultados
alfaproteobacterias fueron miembros pertenecientes a los ordenes

Enterobacteriales y Sphingomonadales, respectivamente, mientras
que las betaproteobacterias estaban representadas,
principalmente, por el género Herbaspirillum del orden
Burkholderiales (Fig. 3.11 B).
Utilizando cebadores específicos para acidobacterias y a partir de

ARN, se detectó únicamente la subdivisión 9.
Cultivos
En condiciones aeróbicas se obtuvieron cultivos pertenecientes a

la subdivisión Gammaproteobacteria (40%) principalmente
clasificados en el género Pseudomonas y 60% de las secuencias
pertenecientes a la división Firmicutes, representadas por los
géneros Bacillus y Oceanobacillus (Fig. 3.12).
Comparación de los resultados obtenidos a través de

distintos métodos
La división Gammaproteobacteria fue la única detectada a través

de los tres métodos empleados (ADN, ARN y cultivos) lo que
confirma que constituye el componente más característico de la
comunidad estudiada. Dentro de las proteobacterias, las divisiones
alfa y beta fueron detectadas únicamente por ARN y, por tanto,
constituyen un componente importante entre las bacterias
metabólicamente activas de la comunidad estudiada. Sin embargo,
las gammaproteobacterias representaban la fracción principal
entre las bacterias metabólicamente activas en trazos negros (Fig.
3.13). La división Firmicutes se detectó por ADN y cultivos y no
101
Resultados
formaba parte de la comunidad metabólicamente activa detectada

(Fig. 3.13) aunque su alta representación en cultivos se explica por
su capacidad de dispersión mediante esporas y la facilidad para
crecer en los medios y condiciones proporcionadas en el
laboratorio.
A 3%
97%
Alphaproteobacteria
Betaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Firmicutes
B
7%
21%
72%
Figura 3.11. Proporción de distintos grupos bacterianos detectados a

partir de ADN (A) y ARN (B) en muestras de trazos negros.
102
Resultados
Gammaproteobacteria
Firmicutes
40%
60%
Figura 3.12. Proporción de distintos grupos bacterianos detectados por

técnicas de cultivos en muestras de trazos negros.
100
80
Porcentaje
60
40
20
0
Gammaproteobacteria
Alphaproteobacteria
Betaproteobacteria
Firmicutes
Figura 3.13. Comparación de las proporciones correspondientes a

distintos grupos bacterianos detectados a partir de ADN ( ), ARN ( ) y
cultivos ( ) en muestras de trazos negros.
103
Resultados
3.1.5 Comunidades bacterianas en colonizaciones blancas
La muestra AA23 correspondió a colonizaciones blancas que

abundan en diferentes partes de la cueva. De esta muestra se
hizo un análisis a partir de ADN y de ARN utilizando cebadores
generales para Bacteria. También se utilizaron cebadores
específicos para Acidobacteria y BRS. Se obtuvieron en total 84
secuencias distribuidas entre clones de las genotecas de ADN (33)
y ARN (40), más los obtenidos con el empleo de cebadores
específicos para Acidobacteria (5) y Bacterias Reductoras de
Sulfato (8) y cultivos (3).
Genotecas de ADN
A diferencia de las otras muestras que se estudiaron, a partir de

ADN, las colonizaciones blancas estaban constituidas por un 55%
de las secuencias procesadas pertenecientes a la división
Actinobacteria. Dentro de esta división el género Pseudonocardia
(orden Actinomycetales) representó el 52% del total de las
secuencias obtenidas y el género Rubrobacteridae (orden
Rubrobacterales) representó el 3% restante. La división
Proteobacteria constituyó el 21% de las secuencias procesadas en
base al ADN. Entre las proteobacterias, la subdivisión
Deltaproteobacteria fue la más abundante (casi el 12%) seguida
por las Gammaproteobacterias (6%) representadas sobre todo por
miembros de los ordenes Enterobacteriales y Pseudomonadales.
Dentro de las deltaproteobacterias se detectaron miembros
relacionados con BRS pertenecientes al orden Desulfovribrionales.
104
Resultados
El orden Nitrosomonadales de la subdivisión Betaproteobacteria

representaba el 3% del total de las secuencias procesadas. El
grupo bacteriano Firmicutes representó el 15 % de las secuencias
analizadas. Los géneros más frecuentemente detectados fueron
Bacillus y Streptococcus de los ordenes Bacillales y
Lactobacillales, respectivamente. Otras divisiones detectadas a
partir del análisis del ADN y con el empleo de cebadores para
Bacteria, fueron Nitrospirae, Planctomycetes y Acidobacteria, con
un porcentaje del 3% (Fig. 3.14 A).
Genotecas de ARN
Es de destacar que el componente mayoritario (94%) de la

comunidad metabólicamente activa (análisis a partir de ARN) de
las colonizaciones blancas fue la división Actinobacteria, en
particular del género Pseudonocardia del orden Actinomycetales.
Pseudonocardia representó el 93% del total de los clones
procesados y el genero Crossiella del mismo orden representó el
restante 1%. El perfil molecular obtenido por DGGE de la
comunidad metabólicamente activa (en base al ARN) estaba
claramente constituido por una banda principal y única que
correspondía a las secuencias del genero Pseudonocardia (Fig.
3.15). Ello sugiere que la comunidad metabolicámente activa de
colonizaciones blancas que abundan en la cueva estaba casi
totalmente constituida por el género Pseudonocardia. Otros grupos
bacterianos minoritarios que formaban parte de la comunidad
metabólicamente activa fueron Chloroflexi y Planctomycetes,
ambas representadas por un 3% de los clones procesados (Fig.
3.14 B).
105
Resultados
3%
A 3% 3%
3%
12%
6% 55%
15%
Actinobacteria Nitrospirae
Firmicutes Acidobacteria
Betaproteobacteria Planctomycetes
Gammaproteobacteria Chloroflexi
Deltaproteobacteria
3% 3%
94%
Figura 3.14. Proporción de distintos grupos bacterianos detectados a

partir de ADN (A) y de ARN (B) en colonizaciones blancas.
106
Resultados
Figura 3.15. Perfil de la comunidad microbiana de los genes ARN

ribosómicos 16S. El ARN fue extraído directamente de una muestra de
colonizaciones blancas que se desarrollan en la Cueva de Doña Trinidad.
La banda más significativa (flecha blanca) corresponde al género
Pseudonocardia de la división Actinobacteria. Las flechas negras indican
la migración de los marcadores de control (desde arriba: Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli, Paenibacillus sp. y Streptomyces
caviscabies).
107
Resultados
La división Acidobacteria (que se vio representada por un 3% en la

genoteca de clones de ADN utilizando cebadores generales para
Bacteria) también fue detectada empleando cebadores específicos
para este grupo (a partir del ARN). Las subdivisiones 6 y 4
representaron el 40% de las secuencias mientras que la
subdivisión 9 constituyó el 20 % de los clones procesados (Fig.
3.16).
20%
40%
Subdivisión 9
Subdivisión 6
Subdivisión 4
40%
Figura 3.16. Proporción de las distintas subdivisiones de Acidobacteria

encontradas en colonizaciones blancas a partir de ARN y utilizando
cebadores específicos para esta división.
También se utilizaron cebadores específicos para BRS y se

detectaron miembros pertenecientes a la división
Deltaproteobacteria relacionados con el orden Desulfovibrionales
dentro de la comunidad metabólicamente activa. Esta subdivisión
representó el 12% de las secuencias procesadas a partir del ADN
utilizando cebadores generales para Bacteria.
108
Resultados

ARN
La división Actinobacteria fue el grupo bacteriano más

representativo tanto a partir del análisis de ADN como de ARN lo
que sugiere su posible importancia en los procesos de deterioro
causados por colonizaciones blancas en la cueva estudiada. A
diferencia de las otras muestras analizadas la división
Proteobacteria no fue la más frecuentemente detectada con
técnicas moleculares en colonizaciones blancas. Esta división
comprendió el 21 % de las secuencias procesadas en base al ADN
y no se detectó en base al ARN. Otras divisiones detectadas tanto
por ARN, ADN o ambos análisis representaban grupos
minoritarios. Por ejemplo, destacaron las Planctomycetes cuya
presencia fue detectada en estas colonizaciones tanto a partir de
ADN como de ARN. La división Chloroflexi fue detectada sólo por
ARN. Las divisiones bacterianas Firmicutes, Acidobacteria y
Nitrospirae se encontraron presentes ya que fueron detectadas
únicamente en base al ADN (Fig. 3.17).
Cultivo de Pseudonocardia
Considerando la importante contribución del genero

Pseudonocardia tanto a nivel de ADN como de ARN en las
comunidades bacterianas de colonizaciones blancas se intentó su
cultivo con el fin de poder llevar a cabo un análisis de sus
propiedades fisiológicas. Se utilizó una muestra recogida en un
segundo muestreo de colonizaciones blancas presentes en un
espeleotema de la cueva. Se ensayaron diferentes medios y en
medios TSA 1/1000 y AH se consiguieron aislar tres cepas que
109
Resultados
correspondían al género Pseudonocardia desde la muestra I9 (I9-

24, I9-28 y I9-21 con un porcentaje de similitud con sus homólogos
más cercanos de 98%, 98% y 97% respectivamente) (Tabla 2 del
Apéndice). Considerando el porcentaje de similitud se decidió
utilizar las cepas I9-24 y I9-28 para ensayos enzimáticos,
fisiológicos y de colonización en el laboratorio. Utilizando la galería
API 50CH ha sido posible estudiar el metabolismo de los hidratos
de carbono en las dos cepas aisladas y con el empleo de la
galería API ZYM se estudiaron sus actividades enzimáticas.
Ambas cepas producen ácido a partir de esculina y gluconato
potásico mientras parecen no hacerlo a partir de la mayoría de
compuestos analizados (Tabla 3.1). Las dos cepas presentan
diferencias en sus actividades enzimáticas en las condiciones
ensayadas. La cepa I9-24 presenta actividades enzimaticas como
esterasa (C4), esterasa lipasa (C8), lipasa (C14) (débil), leucina
arilamidasa, valina arilamidasa, fosfatasa ácida (debil), naftol-AS-
BI-fosfohidrolasa, α-glucosidasa y β-glucosidasa. La cepa I9-28
presenta actividades enzimaticas de las enzimás fosfatasa
alcalina, esterasa (C4), esterasa lipasa (C8), lipasa (C14) (débil),
leucina arilamidasa, valina arilamidasa, cistina arilamidasa,
fosfatasa acida, naftol-AS-BI-fosfohidrolasa, β-galactosidasa
(debil), α-glucosidasa (Tabla 3.2).
110
Resultados
100
80
Porcentaje
60
40
20
Chloroflexi
Actinobacteria
Gammaproteobacteria
Betaproteobacteria
Deltaproteobacteria
Acidobacteria
Nitrospiarae
Firmicutes
Planctomycetes
Figura 3.17. Comparación entre las proporciones de distintos grupos

bacterianos detectados a partir de ADN ( ) y de ARN ( ) en
colonizaciones blancas.
111
Resultados
Tabla 3.1. Resultados de la galeria API 50 CH para las cepas

Pseudonocardia I9-24 y I9-28.
Componente Resultado Componente Resultado

Activo Activo
Control - Esculina +
Glicerol - Salicina -
Eritritol - D-celobiosa -
D-arabinosa - D-maltosa -
L-arabinosa - D-lactosa -
D-ribosa - D-melibiosa -
D-xilosa - D-sacarosa -
L-Xilosa - D-trehalosa -
D-adonitol - Inulina -
Metil-βD-Xilopiranosida - D-melezitosa -
D-galactosa - D-rafinosa -
D-glucosa - Almidón -
D-fructosa - Glicógeno -
D-mamnosa - Xilitol -
L-sorbosa - Gentiobiosa -
L-rhamnosa - D-turanosa -
Dulcitol - D-lizosa -
Inositol - D-tagatosa -
D-manitol - D-fucosa -
D-sorbitol - L-fucosa -
Metil-αD-Manopiranosida - D-arabitol -
Metil-αD-Glucopiranosida - L-arabitol -
N-AcetilGlucosamina - Gluconato -
potásico
Amigdalina - 2-CetoGluconato -
potásico
Arbutina - 5-CetoGluconato +
potásico
112
Resultados
Tabla 3.2. Resultados de la galería API ZYM para las cepas

Pseudonocardia I9-24 y I9-28.
Enzima I9-24 I9-28

Fosfatasa alcalina - +
Esterasa (C4) + +
Esterasa lipasa (C8) + +
Lipasa (C14) (+) (+)
Leucina aramilasa + +
Valina aramilasa + +
Cistina aramilasa - +
Tripsina - -
Α-quimotripsina - -
Fosfatasa ácida (+) +
Naftol-AS-BI-fosfohidrolasa + +
α-galactosidasa - -
β-galactosidasa - (+)
β-glucuronidasa - -
α-glucosidasa + +
β-glucosidasa + -
N-acetil- β-glucosaminidasa - -
α-mannosidasa - -
α-fucosidasa - -
Los paréntesis indican actividad débil.
Ensayo de colonización por Pseudonocardia
Se hicieron ensayos de colonización sobre suelo recogido de la

cueva en el laboratorio con la cepa de Pseudonocardia I9-24 (Fig.
3.18). El objeto fue determinar su capacidad de colonización y los
nutrientes que pudieran limitar o potenciar su desarrollo. La
elección de esta cepa se debió a un análisis preliminar de
comparación entre las secuencias de las tres cepas aisladas con
113
Resultados
aquellas de los clones de Pseudonocardia obtenidos de la

genoteca basada en ARN. La cepa I9-24 resultó la más parecida a
los clones obtenidos. En el ensayo de colonización se vio que la
cepa I9-24 crecía mejor a 16°C que a 28°C sobre suelo de la
Cueva de Doña Trinidad (Fig. 3.18). En particular, en presencia de
Glucosa y Na3PO4 se observó un mayor crecimiento (Fig. 3.18 y
3.19). A 28°C el crecimiento fue limitado (Fig. 3.20). En los
ensayos a 16°C también se observó crecimiento débil en los
demás ensayos (Fig. 3.21). En la figura 3.22 se muestran los
valores obtenidos tras cuantificar la colonización por
Pseudonocardia. Los ensayos que mostraron mayor colonización
por Pseudonocardia resultaron aquellos con adición de glucosa y
fosfato a 16°C. El crecimiento de la cepa I9-24 tanto sobre glucosa
como fosfato fue significativamente mayor (P<0,05) con respecto a
los demás ensayos. El desarrollo de Pseudonocardia fue superior
(P<0,05) a 16°C que a 28°C. Además, el crecimiento en presencia
de glucosa fue más elevado (P<0,05) en ambos casos. La adición
de fosfato facilitaba el crecimiento de Pseudonocardia sobre el
substrato de la cueva resultando superior que en su ausencia
(P<0,05).
114
Resultados
Figura 3.18. Ensayo de colonización a 16°C de la cepa Pseudonocardia

I9-24 aislada de las colonizaciones blancas en la Cueva de Doña Trinidad.
El substrato utilizado fue suelo de la cueva enriquecido con una solución
de Glucosa 0,05%. A- Primer día de inoculación. B- Al quinto día de
crecimiento y C- Después de una semana de crecimiento. Las flechas
indican áreas de crecimiento de colonización.
115
Resultados
Figura 3.19. Ensayo de colonización a 16°C de la cepa Pseudonocardia

I9-24 aislada de las colonizaciones blancas en la Cueva de Doña Trinidad.
El substrato utilizado fue suelo de la cueva enriquecido con una solución
de Na3PO4 0,05%. A- Primer día de inoculación. B- Al quinto día de
crecimiento y C- Después de una semana de crecimiento.
116
Resultados
A D
B E
C F
Figura 3.20. Ensayos de colonización, después de una semana de

crecimiento a 28°C de la cepa Pseudonocardia I9-24 aislada de las
colonizaciones blancas en la Cueva de Doña Trinida. El substrato
utilizado fue suelo de la cueva. A- Suelo sin adición de nutrientes. B-
Suelo enriquecido con una solución de Peptona 0,05%. C- Suelo
enriquecido con una solución de Glucosa 0,05%. D- Suelo enriquecido
con una solución de NH4Cl 0,05%. E- Suelo enriquecido con una
solución de Na3PO4 0,05%. F- Suelo enriquecido con una solución de
Na2SO4 0,05%.
117
Resultados
A C
B D

crecimiento a 16°C de la cepa Pseudonocardia I9-24 aislada de las
colonizaciones blancas en la Cueva de Doña Trinidad. El substrato
utilizado fue suelo de la cueva. A- Suelo sin adición de nutrientes. B-
Suelo enriquecido con una solución de Peptona 0,05%. C- Suelo
enriquecido con una solución de NH4Cl 0,05%. D- Suelo enriquecido con
una solución de Na2SO4 0,05%.
118
Resultados
10
0
Sin Gucosa Fosfato Peptona Cloruro de Sulfato Sin Glucosa
nutrientes 16°C 16°C 16°C amonio 16°C nutrientes 28°C
16°C 16°C 28°C
Figura 3.22. Valores de intensidad de áreas de colonización por la cepa

Pseudonocardia I9-24 sobre suelo de la Cueva de Doña Trinidad sin
ningún nutriente añadido y con la adición de diferentes nutrientes, a 16°C
6 2
y a 28°C. Los valores en el eje de coordinadas representan 10 pixeles .
3.1.6 Comparación de los distintos grupos bacterianos

encontrados en las muestras analizadas por métodos
moleculares
El grupo bacteriano Proteobacteria fue el más frecuentemente

detectado en todas las muestras analizadas tanto a partir de
análisis basados en ADN como aquellos basados en ARN con la
excepción de las colonizaciones blancas (Fig. 3.23). Considerando
la presencia de la división Proteobacteria en las muestras
analizadas, se compararon las distintas porciones de esta división
detectadas en las muestras, tanto a partir de ADN como a partir de
ARN. En general, las gammaproteobacterias fueron el grupo más
abundante en todas las muestras excepto en colonizaciones
blancas. Estos microorganismos representaron más del 70% en
todas las muestras excepto en colonizaciones blancas donde
119
Resultados
constituyeron sólo el 6% de las secuencias analizadas a partir de

ADN (Fig. 3.24 A). A partir de ARN las gammaproteobacterias
representaron el 72% del total de las secuencias analizadas en
trazos negros, el 45% en suelo y el 20% en los grabados (Fig. 3.24
B). El orden Enterobacteriales fue el más frecuentemente
detectado en todos los casos mientras que el Pseudomonadales
se detectó en grabados por ARN y en colonizaciones blancas por
ADN. Las alfaproteobacterias se detectaron en grabados y
pigmentos rojos a partir de ADN en un porcentaje de 10% y 19%,
respectivamente (Fig. 3.24 A) mientras que por ARN se detectaron
en todas las muestras salvo en colonizaciones blancas. Estos
microorganismos representaron más del 60% del total de las
secuencias obtenidas a partir de ARN en grabados y el 50% del
total de las secuencias de ARN en pigmentos rojos, mientras que
en suelo y trazos negros se detectaron en menor proporción (33%
y 21% de las secuencias obtenidas por ARN, respectivamente)
(Fig. 3.24 B). El orden Sphingomonadales fue el más
frecuentemente detectado, mientras que el Rhizobiales
exclusivamente en suelo. Las betaproteobacterias se detectaron
únicamente en colonizaciones blancas por ADN, donde
representaron el 3% del total de las secuencias analizadas,
mientras que por ARN se detectaron en suelo (15%) y en trazos
negros (7%) (Fig. 3.24 A y B). El orden Burkholederiales fue el más
frecuentemente detectado en suelo y en trazos negros mientras
que en colonizaciones blancas se detectó el orden
Nitrosomonadales. La subdivisión Deltaproteobacteria se detectó
en colonizaciones blancas utilizando cebadores generales para
Bacteria a partir de ADN donde constituyeron el 12% de las
secuencias analizadas (Fig. 3.24 A) y en suelo (4%). Todo ello
sugiere que la división Proteobacteria representó la división
120
Resultados
bacteriana más abundante tanto de las comunidades bacterianas

presentes en las muestras de suelo, grabados, pigmentos rojos y
trazos negros, como de las comunidades metabólicamente activas
de estas muestras. En colonizaciones blancas se detectaron
únicamente a partir de ADN y no formaron parte de las
comunidades metabólicamente activas.
Sin embargo, la comunidad metabólicamente activa de

colonizaciones blancas se caracterizó por estar compuestas
prácticamente sólo por actinobacterias. Las comunidades
metabólicamente activas de pigmentos rojos también se
caracterizaron por un porcentaje significativo (50%) de miembros
perteneciente a Actinobacteria. En otras muestras también se
detectaron actinobacterias en baja proporción tanto por ADN como
por ARN (Fig. 3.23 A y B). Por tanto, hay una diferencia clara entre
la mayoría de las muestras analizadas y las colonizaciones
blancas. Dentro de las actinobacterias el orden más
frecuentemente detectado en todas las muestras fue
Actinomycetales. El orden Rubrobacterales se detectó
exclusivamente en colonizaciones blancas por ADN.
La división Firmicutes se detectó en suelo, pigmentos rojos,

colonizaciones blancas y trazos negros a partir de ADN, mientras
que por ARN se detectó en suelo, grabados y colonizaciones
blancas. Los ordenes más frecuentemente detectados fueron
Clostridiales (por ADN y exclusivamente en suelo), Bacillales y
Lactobacillales.
La división Bacteroidetes se detectó exclusivamente en pigmentos

rojos por ADN y en suelo por ARN, En ambos casos el orden más
121
Resultados
frecuentemente detectado fue Bacteroidales. Las divisiones

Nitrospirae, Planctomycetes y Acidobacteria se detectaron en
colonizaciones blancas a partir de ADN mientras que la división
Deinococci únicamente en pigmentos rojos (por ADN). La
comunidad metabólicamente activa de colonizaciones blancas
estaba también compuesta por una reducida porción de bacterias
pertenecientes a las divisiones Chloroflexi y Planctomycetes.
Por lo que respecta a las BRS obtenidas a partir de ARN y a través

del empleo de cebadores específicos para esta división, se
encontraron en suelo (donde constituyeron el 88%),
colonizaciones blancas y pigmentos rojos. La totalidad de las
secuencias procesadas en muestras de suelo pertenecían al orden
Desulfovibrionales. En colonizaciones blancas también se
detectaron BRS a partir de ADN incluso con cebadores generales
para el dominio Bacteria. Tanto por ADN como por ARN el orden
más frecuentemente detectado en colonizaciones blancas también
fue Desulfovibrionales. El orden Desulfuromonadales se detectó
exclusivamente en pigmentos rojos. En total se detectaron
únicamente 4 OTUs diferentes.
Se compararon los resultados obtenidos en las muestras

estudiadas utilizando cebadores específicos para la división
Acidobacteria. La subdivisión que más frecuentemente se detectó
fue la 4 que se encontraba en la totalidad de las muestras, salvo
en las de trazos negros, seguida por la 6 que no fue detectada en
pigmentos rojos y en trazos negros. Las muestras de suelo y las
colonizaciones blancas también muestran una gran variedad de
acidobacterias (Fig. 3.25). Además, en las colonizaciones blancas
miembros de Acidobacteria también representaron un 3 % de las
122
Resultados
secuencias analizadas, a partir de ADN, obtenidas con cebadores

generales para Bacteria confirmando su presencia dentro de las
comunidades más abundantes en la cueva. La comunidad
bacteriana de trazos negros estaba constituida únicamente por
miembros de la subdivisión 9. No se detectaron en este estudio
representantes de las subdivisiones 1 donde consta una de las
especies descritas (Acidobacterium capsulatum) ni la subdivisión 8
en la que se posicionan dos de las otras especies descritas
(Geothrix fermentans y Holophaga foetida).
En total se detectaron 6 subdivisiónes de Acidobacteria en la

Cueva de Doña Trinidad. El análisis de las secuencias detectadas
llevó a la detección de 21 OTUs diferentes dentro de esta división,
confirmando la elevada diversidad de acidobacterias en la Cueva
de Doña Trinidad.
También se intentó cultivar Acidobacteria a partir de muestras de

suelo de la cueva. Se utilizó el medio BSA con diferentes
nutrientes añadidos (xilano 0.05% p/v; piruvato 0.1% p/v; acetato
10%; extracto de suelo 100mL/L; tiosulfato 0.1%; extracto de
levadura 0.05%; antraquinona 2,6-disulfonato (AQDS) 0.1%).
Utilizando cebadores específicos para Acidobacteria, se procedió a
la amplificación tanto del 16S como del 23S. En medio BSA con la
adición de xilano se obtuvo un enriquecimiento en el que se
detectó la presencia de una Acidobacteria perteneciente al
subgrupo 4 (Tabla 2 del Apéndice). Tras tres transferencias con el
objeto de obtener un cultivo puro de esta Acidobacteria, dicha
bacteria detuvo su crecimiento. Estos resultados sirven para
indicar el tipo de metabolismo de esta Acidobacteria: ambiente
aeróbico y metabolismo heterotrófico basado en la
123
Resultados
descomposición de polisacáridos.
3.1.7 Cultivos a partir de otras muestras
También se prepararon cultivos a partir de otras muestras

procedentes principalmente de la Sala del Lago. Se obtuvieron 38
cepas. Los cultivos llevados a cabo en estas muestras confirmaron
los resultados obtenidos por cultivos de bacterias a partir de las
muestras anteriormente analizadas (Fig. 3.26). Las divisiones
Actinobacteria y Firmicutes representaron la mayoría de los
cultivos obtenidos. La división Firmicutes se detectó en todas las
muestras excepto en la escalera. Los géneros más
frecuentemente encontrados fueron Bacillus, Oceanobacillus y
Paenibacillus. Las actinobacterias también se detectaron en casi
todas las muestras y representaron la totalidad de los
microorganismos cultivados en la muestra de la escalera. El orden
más frecuentemente detectado fue Actinomycetales. La división
Proteobacteria se detectó en suelo, trazos negros, sedimento y
espeleotema. El orden más frecuentemente detectado fue
Pseudomonadales. En muestras de espeleotemas y sedimento
también se cultivaron miembros de las betaproteobacterias (el
género Wautersia) mientras que representantes de las
alfaproteobacterias (el género Aminobacter) se detectaron
exclusivamente en espeleotemas.
124
Resultados
100
80
Porcentaje
60
40
20
0
Firmicutes
Planctomycetes
Nitrospirae
Deinococci
Bacteroidetes
Actinobacteria
Proteobacteria
Acidobacteria
B
Suelo
Pigmentos rojos
Colonizaciones blancas
100 Grabados
80
Trazos negros
Porcentaje
60
40
20
0
Firmicutes
Planctomycetes
Proteobacteria
Chloroflexi
Bacteroidetes
Actinobacteria
Figura 3.23. Comparación de los distintos grupos bacterianos obtenidos

en las diferentes muestras analizadas por ADN (A) y ARN (B).
125
Resultados
120
100
80
Porcentaje
60
40
20
0
Suelo Grabados Pigmento rojo Trazos negros Colonizaciones
blancas
B
Alphaproteobacteria
Betaproteobacteria
Deltaproteobacteria
Gammaproteobacteria
100
80
Porcentaje
60
40
20
0
Suelo Grabados Pigmento rojo Trazos negros
Figura 3.24. Proporción de las distintas subdivisiones de Proteobacteria

detectadas a partir de ADN (A) y ARN (B) en las muestras analizadas.
126
Resultados
Suelo
Pigmentos rojos
Colonizaciones blancas
Grabados
Trazos negros
100
80
Porcentaje
60
40
20
0
3 4 6 7 9 10
Subdiv isiones
Figura 3.25. Comparación de las distintas subdivisiones de Acidobacteria

encontradas en las muestras analizadas.
127
Resultados
Actinobacteria
Proteobacteria
Firmicutes
100
90
80
70
Porcentaje
60
50
40
30
20
10
0
Trazos
Suelo
Agua lago
Sedimento
espeleotema
Columna
espeleotema
Escalera
negros
Columna
Fragmento
Goteo
lago
Goteo
Figura 3.26. Comparación de los distintos grupos bacterianos detectados

por cultivo en las muestras analizadas.
128
Resultados
3.1.8. Análisis global de las secuencias obtenidas
Para analizar la presencia de los microorganismos detectados en

la Cueva de Doña Trinidad se consideraron los principales grupos
bacterianos detectados mediante los análisis moleculares basados
en ADN y ARN y por cultivo en todas las muestras estudiadas. Se
consideraron exclusivamente los clones de las genotecas de ADN
y ARN obtenidos utilizando cebadores generales para el Domino
Bacteria. Los clones obtenidos mediante el empleo de cebadores
específicos para Acidobacteria y BRS no se tomaron en
consideración para este análisis. El número total de los clones
utilizados para el análisis global fue de 397 mientras que los
cultivos considerados han sido 89. En la figura 3.27 se muestra la
porción global de los distintos grupos bacterianos detectados en la
Cueva de Doña Trinidad a partir del análisis de ADN (A) y ARN (B).
Los resultados del análisis global a partir de cultivo de las
muestras se muestran en la figura 3.28. Los resultados de este
análisis global confirma el papel desarrollado por la división
Proteobacteria dentro de las secuencias procesadas. En orden de
abundancia a partir de ADN las gammaproteobacterias fueron las
más frecuentemente detectadas (65%) seguidas por las
alfaproteobacterias (5%), las deltaproteobacterias (3%) y
betaproteobacterias (1%). La división Proteobacteria presentó una
diversidad de OTUs muy elevada. En total las secuencias
analizadas pertenecían a 55 OTUs diferentes, distribuidas en
orden de abundancia entre gammaproteobacterias (30 OTUs),
alfaproteobacterias (19 OTUs), betaproteobacterias (4 OTUs) y
deltaproteobacterias (2 OTUs).
Las divisiones Firmicutes y Actinobacteria representaron
129
Resultados
respectivamente el 11% y el 10% del total de las secuencias

procesadas a partir de análisis basados en ADN. Estas divisiones
presentaban una diversidad relativamente significativa de OTUs
diferentes (10 OTUs diferentes para Actinobacteria y 9 para
Firmicutes). Las divisiones Acidobacteria, Bacteroidetes,
Planctomycetes, Deinococci y Nitrospirae estuvieron
representadas únicamente por el 1% de las secuencias obtenidas
en base a ADN.
La división Proteobacteria fue la más frecuentemente detectada

también dentro de las comunidades metabólicamente activas a
partir del análisis del total de los clones procesados. Las
alfaproteobacteria representaron el 36% del total de las
secuencias analizadas, seguidas por las gammaproteobacterias
(28%) y las betaproteobacterias (6%).
Las actinobacterias también constituyeron un porcentaje

significativo (24%) del total de las secuencias procesadas a partir
de ARN, seguidas por la división Firmicutes (3%). Las divisiones
Bacteroidetes, Chloroflexi y Planctomycetes representaron
únicamente el 1% del total de las secuencias obtenidas a través
de análisis basados en ARN.
Por lo que concierne al análisis global de los cultivos obtenidos,

las divisiones Actinobacteria y Firmicutes representaron
porcentajes significativos (52% y 34%, respectivamente) del total
de los aislamientos obtenidos. Estas divisiones presentaron una
diversidad elevada de OTUs diferentes (29 OTUs para
Actinobacteria y 16 OTUs para Firmicutes). La división
Proteobacteria (8 OTUs diferentes) estuvo representada por un
130
Resultados
10% de miembros pertenecientes a las gammaproteobacterias y

por un 2% de representantes de las beta y alfaproteobacterias.
A
80
60
Porcentaje
40
20
0
Actinobacteria
Acidobacteria
Deinococci
Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria
Bacteroidetes
Planctomycetes
Nitrospirae
Firmicutes
Gamma
Alpha
Delta
Beta
50
40
Porcentaje
30
20
10
0
Chloroflexi
Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria
Actinobacteria
Firmicutes
Bacteroidetes
Planctomycetes
Gamma
Alpha
Beta
Figura 3.27. Proporción de los distintos grupos bacterianos detectados

en la Cueva de Doña Trinidad a partir del análisis de los clones de ADN
(A) y ARN (B).
131
Resultados
80
70
60
Porcentaje
50
40
30
20
10
0
Firmicutes
Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria
Actinobacteria
Gamma
Alpha
Beta
Figura 3.28. Proporción de los distintos grupos bacterianos detectados en

la Cueva de Doña Trinidad a partir del cultivo.
132
Resultados
3.1.9 Curvas de cobertura
Con el fin de determinar el grado de cobertura de las bacterias

detectadas en las comunidades estudiadas, se construyeron
curvas de cobertura en las que se ha relacionado el número de
OTUs y divisiones bacterianas diferentes frente al número de
secuencias analizadas tanto por análisis moleculares basados en
ADN y ARN como por cultivo y utilizando cebadores generales
para Bacteria. En la figura 3.29 se representan las curvas de
cobertura obtenidas a partir de los clones de ADN (Fig. 3.29 A)
analizados y de ARN (Fig. 3.29 B). Analizando las curvas de
cobertura para las divisiones se pudo observar que estas
alcanzaban una asíntota para el rango de clones analizados. Ello
sugiere que aunque se analizasen un número mayor de clones no
se llegaría a descubrir más divisiones bacterianas. Las curvas de
cobertura para OTUs en cambio no alcanzaban un límite máximo.
Ello sugiere, como se discutirá más adelante, la presencia de una
gran diversidad bacteriana en la Cueva de Doña Trinidad. Esto se
confirmó al examinar las curvas de cobertura total de los clones
analizados (tanto a partir de ADN como de ARN) (Fig. 3.30). En el
caso de las curvas de cobertura construidas con el análisis de las
cepas obtenidas por cultivo (Fig. 3.31) la situación es algo
diferente. Las curvas de cobertura para las divisiones confirmaron
lo dicho en el caso de los clones mientras que, las curvas de
cobertura para OTUs, indicaron que se ha detectado por cultivos
una pequeña fracción de los microorganismos detectables con las
técnicas de cultivo empleadas en la Cueva de Doña Trinidad ya
que la curva tendía a una asintota.
A través de métodos moleculares, tanto ADN como ARN, se ha

detectado la mayor parte de los microorganismos con participación
133
Resultados
50
OTUs
Divisiénes/OTUs 40
30
20
Divisiones
10
0
0 50 100 150 200
Clones
50
40 OTUs
Divisiénes/OTUs
30
20
Divisiones
10
0
0 50 100 150 200
Clones
Figura 3.29. Curvas de cobertura del número de divisiones y OTUs de

bacterias detectadas con respecto al número de clones analizados a partir
de las genotecas de ADN (A) y ARN (B). La curva de cobertura se indica
con una línea continua ( ), la curva de acumulación con cuadrados
negros ( ). La recta de pendiente 1:1 se indica con trazo punteado (- - -).
134
Resultados
significativa por su presencia en las muestras estudiadas y por su

actividad metabólica en dichas muestras ya que las curvas de
cobertura presentan una curvatura lejana de la de pendiente 1:1.
100
90
OTUs
80
70
Divisiónes/OTUs
60
50
40
30
20
Divisiones
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Clones
Figura 3.30. Curvas de cobertura del número de divisiones y OTUs de

bacterias detectadas con respecto al número total de clones analizados
tanto a partir de las genotecas de ADN como de ARN. La curva de
cobertura se indica con una línea continua ( ) la curva de acumulación
con ( ). La recta de pendiente 1:1 se indica con trazo punteado (- - -).
135
Resultados
60
OTUs
50
Divisiones/OTUs
40
30
20
Divisiones
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Cepas
Figura 3.31. Curvas de cobertura del número de divisiones y OTUs

detectadas con respecto al número de cepas aisladas por cultivos. La
curva de cobertura se indica con una línea continua ( ), la curva de
acumulación con ( ). La recta de pendiente 1:1 se indica con trazo
punteado (- - -).
136
Resultados
3.2 Comunidades fúngicas en la Cueva de Doña

Trinidad
Considerando el potencial que los hongos y las levaduras pueden

tener en el deterioro del arte rupestre de la cueva estudiada, se
han estudiado las comunidades fúngicas presentes en la cueva de
Doña Trinidad. Se han analizado muestras de suelo, pigmentos
rojos, escalones, espeleotemas, aire y excrementos de mamíferos
de la cueva a través de técnicas de cultivo y moleculares. Los
aislamientos fúngicos fueron identificados morfológicamente,
caracterizados y clasificados a través de la secuenciación de las
dos subunidades ribosómicas (pequeña y grande) y de sus
regiones intergénicas (ITS1 e ITS2). Las cepas fueron
seleccionadas por DGGE a partir de los fragmentos de los genes
ARNr 18S. Las levaduras fueron analizadas también por RAPD
(Tabla 2.7). Se obtuvieron 45 cepas que se conservaron en la
colección del ACBR (Austrian Center of Biological Resources and
Applied Mycology, http://www.biotec.boku.ac.at./acbr.html). En las
Tablas 3.3 y 3.4 se presentan las cepas obtenidas que se
describen a continuación.
3.2.1 Muestras de suelo
Se analizaron 7 muestras distintas de suelo (X23, PP16, Y24, O15,

SLE, Suelo 8 y Suelo 39) recogidas desde la entrada de la cueva
hasta la zona del Camarín.
Se procedió al cultivo de las muestras de suelo preparando

diferentes medios de cultivo. Los resultados obtenidos indicaron
una gran variedad morfológica de hongos en el suelo de la cueva.
137
Resultados
La totalidad de las cepas obtenidas pertenecieron al grupo

Ascomycota. Dentro de esta división el género Aspergillus (Fig.
3.32) del orden Eurotiales fue el más frecuentemente detectado.
También se detectaron en menor cantidad los géneros Eurotium
(Orden Eurotiales), Massarina (orden Pleosporales) y
Pseudallescheria (orden Microascales). A través de la
identificación morfológica se detectaron también los géneros
Simplicillium y Fusarium (orden Hypocreales). La identificación
molecular de estas cepas llevó a la asignación de sus afiliaciones
taxonómicas que coincidió con las identificaciones morfológicas.
Los homólogos más cercanos a estas cepas aisladas fueron,
Aspergillus fumigatus, Aspergillus sidowii, Eurotium amstelodami,
Massarina rubi, Pseudallescheria fimeti, Simplicillum lamellicola y
Fusarium solani.
3.2.2 Muestras de escalones y espeleotemas
Se analizaron tres muestras procedentes de diferentes escalones

y espeleotemas (C3, G7 y D4) de la cueva. Se detectaron
miembros pertenecientes a la división Ascomycota, entre ellos
Aspergillus. Las cepas identificadas a través de técnicas
moleculares (secuenciando las regiones ITS) resultaron
homólogas a Aspergillus versicolor (Fig. 3.33). Esas cepas fueron
también caracterizadas mediante un análisis morfológico
detectándose los mismos géneros. Asimismo se detectaron
miembros del orden Onygenales en particular los géneros
Arthoderma (Fig. 3.34) y Aphanoascus (Fig. 3.35). A través de la
secuenciación de las secuencias ITS de las cepas analizadas se
identificaron Arthoderma fulvum y Aphanoascus fulvescens como
homólogos más cercanos a las secuencias obtenidas.
138
Resultados
Tabla 3.3. Hongos detectados en la cueva de Doña Trinidad. Se

presentan los homólogos más cercanos, el porcentaje de similitud, el
número de aislamientos obtenidos y el origen de la muestra.
Cepa1 Homólogo % N° Origen
AR C3-18 Arthroderma fulvum - AB193719 98 1 Espeleotema

AR G7-34 Aphanoascus fulvescens - AF038357 93 1 Escalón
AR PP16-1 Aspergillus fumigatus - EF495242 97 8 Suelo
AR C3-20.1 Aspergillus sidowii - AB267812 94 3 Suelo
AR D4-1 Aspergillus versicolor - EF125026 100 1 Escalón
AR M13-2.1 Penicillium crustosum - EU128607 96 2 Excrementos
AR X23-15 Penicillium glabrum - AY373915 98 1 Excrementos
ARB P6-2 Penicillium granulatum - DQ681334 98 2 Aire
AR PP16-4 Eurotium amstelodami - EF653135 96 3 Aire,
excrementos
AR SLE-3.1 Pseudallescheria fimeti - AY879799 92 2 Suelo,
excrementos
AR SLE-2 Massarina rubi - AF383963 87 1 Suelo
ARB D4-1 Gliomastix murorum - EF029216 98 1 Aire
ARB A1-3 Cladosporium sp. - AJ971408 97 2 Aire
ARB A1-2 Ustilago cynodontis - AY740168 97 1 Aire
ARB G7-1 Myxotrichum deflexum - AF062814 96 1 Aire
AR Suelo-8 Fusarium solani - EF397944 99 3 Suelo, Aire
1
Las letras AR se refieren al lugar de muestreo (Cueva de Ardales). ARB
se refiere a las muestras de aire de la cueva recogidas utilizando placas
Petri con medio Rosa Bengala.
139
Resultados
Figura 3.32. Microfotografias de la cepa Suelo 39.2 Aspergillus fumigatus.
140
Resultados
Figura 3.33. Microfotografias de la cepa D4-1 Asperigillus versicolor.
141
Resultados
10 µm
10 µm
Figura 3.34. Microfotografias de la cepa C3-18 Arthoderma fulvum
142
Resultados
10 µm
Figura 3.35. Microfotografia de la cepa G7-34 Aphanoascus fulvescens
3.2.3 Muestras de aire de la cueva
Se analizaron 3 muestras de aire (ARB P6, ARB D4 y ARB V22)

de la cueva. Se determinó la presencia de hongos en el aire de la
Cueva de Doña Trinidad. En este caso la división Ascomycota no
fue la única detectada. Los órdenes más representados fueron
Capnodiales (el género Cladosporium), Eurotiales (Penicillium), y
la familia Myxotrichaceae (Myxotrichum).
En esta muestra también se detectó el género Fusarium del orden

Hypocreales y el orden Ustilaginales (con el genero Ustilago)
dentro de los Basidiomycota. Por técnicas moleculares se
obtuvieron los siguientes homólogos más cercanos a las
secuencias amplificadas: Cladosporium sp., Penicillium
granulatum, Myxotrichum deflexum, Fusarium solani y Ustilago
143
Resultados
cynodontis.
3.2.4 Muestras de excrementos
Se analizaron tres muestras (MM13, K11 y L12) de excrementos

de mamíferos encontrados en la cueva. Dentro de la división
Ascomycota se detectaron miembros del orden Eurotiales (con los
géneros Penicillium y Eurotium) y del orden Microascales (con el
género Pseudallescheria). Utilizando métodos moleculares se
detectaron las especies Penicillium glabrum, Penicillium
crustosum, Eurotium amstelodami y Pseudallescheria fimeti.
A diferencia de las otras muestras en las que no se pudieron aislar

levaduras, en los excrementos se encontraron levaduras
pertenecientes tanto a la división Ascomycota como a la
Basidiomycota. Las levaduras estaban relacionadas con los
géneros Galactomyces (Ascomycota, orden Saccharomycetales) y
Trichosporon (Basidiomycota, orden Tremellales).
El perfil de DGGE de estas cepas permitió únicamente diferenciar

estos dos géneros (Figura 3.36). Con la intención de caracterizar
estas cepas se efectuaron análisis moleculares basados en la
secuenciación de la subunidad grande del gen ARN ribosómico y
en perfiles de RAPD a partir de las cepas aisladas. Los resultados
de secuenciación indicaron que las cepas del género Trichosporon
se podían clasificar en 4 grupos principales relacionados con
secuencias de las especies: Trichosporon laibachii, Trichosporon
multisporum, Trichosporon akiyoshidainum, y Trichosporon sp. El
homólogo más cercano de la cepa de Galactomyces era
Galactomyces geotrichum.
144
Resultados
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 3.36. Perflil de DGGE de las levaduras aisladas. La cepa

correspondiente a la del carril 9 está relacionada con el género
Galactomyces geotrichum. Las otras cepas cargadas en el gel están todas
relacionadas con el género Trichosporon.
Considerando los resultados obtenidos utilizando los cebadores

URPF1 y PELF (Fig. 3.37 A y B) con la técnica de RAPD a partir
del ADN total de las cepas obtenidas, se pudo claramente
constatar que las cepas obtenidas pertenecientes al género
Trichosporon representaban una diversidad muy superior a la
obtenida por los 4 grupos mencionados (Tabla 3.4). De hecho los
perfiles RAPD (Fig. 3.37) llevados a cabo muestran que las cepas
analizadas fueron claramente distintas aunque los resultados
obtenidos por secuenciación del gen 26S muestran porcentajes de
similitud entre 96% y 100% lo que sugiere que pertenezcan al
mismo género, lo que se ha confirmado por comparación de esas
secuencias con bases de datos de ADN, validando su asignación a
Trichosporon.
145
Resultados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M
Figura 3.37. Perfiles de RAPD con el primer URPF1 (A) y PELF (B) de las
levaduras aisladas. 1: AR M13-3.1; 2: AR M13-8; 3: AR M13-9; 4: AR
M13-5; 5: AR M13-7; 6: AR M13-10; 7: AR M13- 14; 8: AR M13-4; 9: AR
K11-10; 10: AR K11- 7; 11: AR K11-9; 12: AR K11-11.
146
Resultados
Tabla 3.4. Levaduras detectadas en la Cueva de Doña Trinidad desde

muestras de excrementos. Se indican los homólogos mas cercanos y el
porcentaje de similitud.
Cepa Homólogo %
AR M13-3.1 Trichosporon sp. - U289353 98

AR M13-8 Trichosporon laibachii - EF653931 99
AR M13-9 Trichosporon multisporum - AF414695 96
AR M13-5 Trichosporon sp. - EU289353 99
AR M13-7 Trichosporon sp. - AJ608948 96
AR M13-10 Trichosporon laibachii - EF460551 100
AR M13-14 Trichosporon sp. - EU289353 96
AR M13-4 Galactomyces geotrichum - EU194453 98
AR K11-10 Trichosporon sp. - EU289353 98
AR K11-7 Trichosporon akiyoshidainum - DQ914693 98
AR K11-9 Trichosporon sp. - EU289353 97
AR K11-11 Trichosporon laibachii - EF653931 97
3.2.5 Técnicas moleculares aplicadas a la detección de

hongos
Las muestras de suelo (N14 y S18), grabados (M13 y P16),

pigmentos rojos (L12 y Y21), trazos negros (R17), y
colonizaciones blancas (AA23) fueron analizadas mediante
técnicas moleculares encaminadas a la detección de hongos. Por
ello se utilizaron cebadores específicos para hongos y se procedió
a la amplificación del ADN extraído directamente de las muestras.
Los productos de amplificación obtenidos a partir de muestras de
pigmentos rojos (L12) y de grabados (M13) se utilizaron para la
construcción de genotecas de genes de ARNr. Los clones fueron
seleccionados por comparación de perfiles de digestión por las
enzimas Hin6I y MspI simultáneamente. Todas las secuencias
147
Resultados
obtenidas resultaron estar relacionadas con el genero Fusarium

cuyo homólogo más cercano era Fusarium solani con un
porcentaje de similitud del 99%. Cabe destacar el hecho de que
este género también se cultivó a partir de muestras de suelos y
aire de la cueva.
3.2.6 Ensayo de colonización por Fusarium
En el caso de Fusarium también se hicieron ensayos de

colonización utilizando substrato de la cueva esterilizado.
Considerando el porcentaje de similitud de las cepas Fusarium
aisladas, se decidió utilizar las cepas Suelo-8 (con un porcentaje
de similitud de 97%) que se aisló de una muestra de suelo (Fig.
3.38). Se observó que la cepa Suelo-8 crecía mejor a 28°C que a
16°C y generalmente en suelo sin tratamientos que suplementado
con la adición de diversos nutrientes (Fig. 3.39), excepto en el
caso de adición de NH4Cl (Fig. 3.40) en el que se mejoraba su
desarrollo sobre el substrato de la cueva. En el ensayo a 28°C con
la adición de peptona (Fig. 3.41A) no se observó un mayor
crecimiento cuando se compara con el mismo substrato sin adición
de nutrientes. En los ensayos a 16°C el crecimiento de Fusarium
fue inferior que a 28°C en todos los casos estudiados (Fig. 3.42).
En la figura 3.43 se muestran los valores tras cuantificar la
colonización por la cepa Suelo-8. Se destaca un mayor
crecimiento a 28°C (P<0,05) y un fomento de la colonización con
la adición de amonio (P<0,05) tanto a 16°C como a 28°C.
148
Resultados
10 µm
Figura 3.38. Microfotografia de la cepa Suelo-8 Fusarium solani aislada

desde suelo de la cueva.
149
Resultados
Figura 3.39. Ensayo de colonización a 28°C de la cepa Fusarium Suelo-8

aislada de una muestra de suelo de la Cueva de Doña Trinidad. El
substrato utilizado fue suelo de la misma cueva sin ningún nutriente
añadido. A- Primer día de inoculación. B- Al décimo día de crecimiento y
C- Después de dos semanas de crecimiento. Las flechas indican áreas de
colonización.
150
Resultados
Figura 3.40. Ensayo de colonización a 28°C de la cepa Fusarium Suelo-8

aislada de una muestra de suelo de la Cueva de Doña Trinidad. El
substrato utilizado fue suelo de la misma cueva enriquecido con una
solución NH4Cl 0,05%. A- Primer día de inoculación. B- Al décimo día de
crecimiento y C- Después de dos semanas de crecimiento. Las flechas
indican áreas de colonización.
151
Resultados
A C
B D

crecimiento a 28°C de la cepa Fusarium Suelo-8 aislada de una muestra
de suelo de la Cueva de Doña Trinidad. El substrato utilizado fue suelo de
la misma cueva. A- Suelo enriquecido con una solución de Peptona
0,05%. B- Suelo enriquecido con una solución de Glucosa 0,05%. C-
Suelo enriquecido con una solución de Na3PO4 0,05%. D- Suelo
enriquecido con una solución de Na2SO4 0,05%.
152
Resultados
A D
B E
C F

crecimiento a 16°C de la cepa Fusarium Suelo-8 aislada de una muestra
de suelo de la Cueva de Doña Trinidad. El substrato utilizado fue suelo de
la misma cueva. A- Suelo sin ningún nutriente. B- Suelo enriquecido con
una solución de Peptona 0,05%. C- Suelo enriquecido con una solución
de Glucosa 0,05%. D- Suelo enriquecido con una solución de NH4Cl
0,05%. E- Suelo enriquecido con una solución de Na3PO4 0,05%. F- Suelo
enriquecido con una solución de Na2SO4 0,05%.
153
Resultados
12
10
0
Sin nutrientes Peptona 28°C Cloruro de Sin nutrientes Cloruro de
28°C amonio 28°C 16°C amonio 16°C
Figura 3.43. Valores de intensidad de áreas de colonización por la cepa

Fusarium Suelo-8 sobre suelo de la Cueva de Doña Trinidad sin ningún
nutriente añadido y con la adicción de distintos nutrientes a 28°C y 16°C.
6 2
Los valores en el eje de coordinadas representan 10 pixeles .
3.2.7 Curva de cobertura
Con el fin de determinar el grado de cobertura de los hongos

detectados en comparación con la diversidad total de las
comunidades analizadas, se construyó la curva de cobertura en la
que se ha relacionado el número de OTUs fúngicas diferentes
frente al número de secuencias obtenidas. Analizando la curva de
cobertura obtenida (Fig. 3.44) se observó que no se alcanzaba
una asintota aunque la curvatura se separaba claramente de la
recta de pendiente 1:1 lo que sugiere que durante este estudio se
ha detectado una proporción altamente representativa de los
hongos presentes en la Cueva de Doña Trinidad. Ello sugiere,
como se discutirá más adelante, la presencia de una gran
diversidad fúngica en la Cueva de Doña Trinidad superior a la ya
detectada.
154
Resultados
60
50
40
OTUs
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Cepas
Figura 3.44. Curvas de cobertura del número de OTUs detectadas con

respecto al número de hongos aislados por cultivo. La curva de cobertura
se indica con una línea continua ( ), la curva de acumulación con
cuadrados negros ( ). La recta de pendiente 1:1 se indica con trazo
punteado (- - -).
155
156
Capitulo 4: Discusión
157
158
Discusión
4.1 Diversidad bacteriana en la cueva de Doña

Trinidad
La cueva de Doña Trinidad (Ardales, Málaga) contiene una serie

de pinturas y grabados rupestres datados de hace unos 20.000
años. El interés público en su conservación ha motivado el
desarrollo de proyectos de investigación multidisciplinares entre
los que se engloba el estudio de los microorganismos que se
desarrollan en este ambiente. Este trabajo es el primero llevado a
cabo sobre las comunidades microbianas de la Cueva de Doña
Trinidad. El gran interés en la conservación de las pinturas
rupestres y grabados encontrados en esta cueva representa el
punto de partida para este estudio. En la mayoría de los casos los
estudios de las comunidades microbianas en ambientes
subterráneos no combinan los análisis bacterianos y fúngicos en
un mismo ambiente. Sin embargo, hongos y bacterias
generalmente coexisten en el mismo ambiente interactuando y
relacionándose entre sí.
En este estudio se han utilizado métodos moleculares basados

tanto en el ADN como en el ARN, lo que nos ha permitido detectar
los microorganismos presentes (ADN) y aquellos metabólicamente
activos (ARN) dentro de las comunidades bacterianas. En algunos
casos, también se ha llevado a cabo el cultivo de los
microorganismos lo que nos ha permitido comparar los resultados
obtenidos a través de los dos tipos de técnicas, moleculares y de
cultivo. Ello supone una combinación infrecuente en estudios de
microbiología del patrimonio ya que la mayoría de análisis se
centran únicamente bien en cultivos o bien en la detección de
microorganismos basada en el ADN. Además, se ha evaluado el
159
Discusión
potencial colonizador de los componentes bacterianos y fúngicos

más característicos en la cueva de Doña Trinidad con el fin de
analizar su capacidad de colonización y riesgo en dicha cueva.
Se han analizado un total de 583 secuencias entre clones de

genotecas de ADN, de ARN y cultivos. A continuación, se
comentan los resultados obtenidos en las diferentes muestras
analizadas basándonos en los grupos bacterianos y fúngicos
detectados.
Considerando el papel desarrollado por la división Proteobacteria

en casi todas las muestras analizadas, se empezará por examinar
más de cerca este grupo. Posteriormente, se discutirán las demás
bacterias detectadas tanto por análisis moleculares como por
cultivos, poniendo especial atención sobre las actinobacterias y su
papel en las muestras de colonizaciones blancas. Otro punto
importante es la presencia de dos grupos bacterianos
determinados, Acidobacteria y BRS, ambos detectados en las
muestras analizadas. También se discutirá la diversidad fúngica en
la Cueva de Doña Trinidad con énfasis sobre aquellos hongos más
frecuentemente detectados y que pudieran estar implicados en
procesos de colonización de las paredes, pinturas y grabados de
la cueva estudiada. Tanto en el caso de bacterias como de hongos
se examinará la variedad de grupos detectados en la cueva
estudiada y los métodos empleados para detectarla. Finalmente,
se examinaran algunos aspectos relacionados con la conservación
de las representaciones artísticas de la Cueva de Doña Trinidad
en base a los datos obtenidos.
160
Discusión
4.1.1 Proteobacteria
La mayoría de los estudios sobre colonizaciones microbianas en

ambientes subterráneos se limitan al análisis de muestras de
pinturas, de rocas y de agua de infiltración (Northup y otros, 1994;
Vlasceanu y otros, 2000; Engel y otros, 2001, 2004; Holmes y
otros, 2001; Schabereiter-Gurtner y otros, 2002a, b, 2004; Portillo
y otros, 2007b) pero no de suelo. Sin embargo, un gramo de suelo
puede albergar hasta diez billones de microorganismos (Roselló-
Mora y Amann, 2001) y más de 30000 taxones bacterianos (Curtis
y otros, 2002). El suelo es a menudo descrito como uno de los
ambientes naturales más heterogéneos existentes en la Tierra
(Torsvik y otros, 2002a).
Varios estudios han resaltado la participación de los

microorganismos en la ecología y geoquímica de ambientes
naturales (Northup y otros, 2001; Laiz y otros, 1999; Portillo y
otros, 2007a), aunque son relativamente escasos los estudios
sobre este tema y en particular sobre suelos de cuevas con
pinturas rupestres (Zhou y otros, 2007). Un número considerable
de secuencias analizadas en este estudio pertenece a muestras
de suelo de la cueva de Doña Trinidad.
La división Proteobacteria fue claramente la más representativa no

sólo en estas muestras sino también en las demás, a excepción de
colonizaciones blancas. Las proteobacterias, como ya se ha
mencionado, son generalmente reconocidas como uno de los
grupos más abundantes del planeta (Rappé y Giovannoni, 2003;
Buckley y otros, 2001; Zwart y otros, 2002).
161
Discusión
Estudios basados en métodos moleculares han revelado que las

proteobacterias son frecuentes en cuevas (Holmes y otros, 2001;
Schabereiter-Gurtner y otros, 2002a, b, 2004; Northup y otros,
2003) y se ha citado que podrían tener un papel clave en los
procesos biogeoquímicos de las cuevas analizadas. En la Cueva
de Altamira también se detectaron miembros de esta división en
muestras de colonizaciones amarillas y grises (Portillo y otros,
2007b) y en suelo (Portillo y González, comunicación personal), lo
que confirma que las proteobacterias son un componente típico de
ambientes subterráneos y entre ellos, de cuevas con pinturas
rupestres.
En la mayoría de las muestras estudiadas de la Cueva de Doña

Trinidad, dentro de la división Proteobacteria, detectada a partir de
ADN, la subdivisión más representativa ha sido la
Gammaproteobacteria. Dentro de los órdenes detectados, el más
frecuente ha sido el de las Enterobacteriales, un grupo importante
de bacterias que no sólo habitan en el tracto intestinal de los seres
humanos y de otros animales, sino que también se han detectado
en otros ambientes naturales. Casi todas las enterobacterias son
heterótrofas y anaerobias facultativas. Ello supone que pueden
desarrollarse bajo un rango amplio de condiciones y que la
presencia de materia orgánica en la cueva seria esencial para su
crecimiento.
A través del cultivo de las muestras de suelo también se han

podido cultivar representantes de la subdivisión
Gammaproteobacteria, en particular cepas del género
Pseudomonas. Este es el género más importante en este grupo y
el que más frecuentemente ha sido aislado en este trabajo. Las
162
Discusión
especies del género Pseudomonas son muy comunes en suelos y

en otros ambientes naturales y suelen poseer una gran
variabilidad metabólica. Algunas son capaces de degradar
compuestos aromáticos y otros compuestos difícilmente
degradables. Por ello, es probable que representen un eslabón
importante en la descomposición de componentes orgánicos en la
cueva. Si bien los microorganismos del género Pseudomonas se
clasifican como aerobios, algunos pueden sustituir el oxígeno por
nitrato como aceptor terminal de electrones y dar lugar a un
metabolismo significativo en condiciones anaeróbicas. Cabe
mencionar que algunas especies de Pseudomonas se han
utilizado con éxito en biorestauración de monumentos tal como
citan Ranalli y otros (2003). Estos autores aplicaron cepas viables
de Pseudomonas stutzeri directamente sobre frescos deteriorados
de Italia. Las cepas fueron capaces de degradar la materia
orgánica (pegamentos y resinas) que deterioraban los frescos
utilizando proteasas producidas por esta bacteria (Ranalli y otros,
2003).
Otro de los miembros detectados, específicamente en grabados a

partir de ADN, ha sido Acinetobacter (Gammaproteobacteria). Los
representantes de este género son bacterias ubicuitas y han sido
aisladas frecuentemente a partir de muestras naturales,
incluyendo suelos y aguas (Jawad y otros, 1994; Baumann, 1968;
Kim y otros, 2008). También existen especies patógenas,
responsables de infecciones (Beck-Sagué y otros, 1990). Las
propiedades nutricionales de Acinetobacter y su presencia en
suelos y aguas sugieren que estos microorganismos pueden ser
agentes muy importantes en la mineralización aerobia de la
materia orgánica en la naturaleza (Baumann y otros, 1968). Una
163
Discusión
de sus propiedades más impresionantes es su capacidad de

utilizar una gran variedad de compuestos orgánicos como fuente
de carbono y nitrato como única fuente de nitrógeno (Baumann y
otros, 1968; Stanier y otros, 1966). Este género ha sido detectado
también en muestras de agua de infiltración de la Cueva de
Altamira (Laiz y otros, 1999).
Ya que las proteobacterias representaron el componente más

característico dentro de los microorganismos metabólicamente
activos (detectados por ARN) de las comunidades microbianas de
las muestras estudiadas se puede confirmar su posible implicación
en los procesos biogeoquímicos de la cueva estudiada. La
subdivisión Alphaproteobacteria fue la más frecuentemente
detectada junto con la Gammaproteobacteria ya mencionada y
seguida por la Betaproteobacteria. Las alfaproteobacterias
incluyen la mayor parte de las proteobacterias conocidas capaces
de crecer a concentraciones muy bajas de nutrientes (oligotrofia).
Ello podría explicar su importancia en la Cueva de Doña Trinidad
pudiendo desarrollarse incluso con un aporte muy limitado de
nutrientes orgánicos (Northup y otros, 2001). Dentro de las
betaproteobacterias la presencia del orden Burkholderiales, que
constituyó la mayoría de las secuencias analizadas, podría estar
relacionada con su capacidad para degradar compuestos
orgánicos aromáticos en aerobiosis (Yuste y otros, 2000; Kasai y
otros, 2005; Hamamura y otros, 2006).
Tanto en las muestras de grabados como de pigmentos rojos, una

pequeña porción de las secuencias analizadas a partir del ADN
pertenecía a las alfaproteobacterias, en particular al genero
Aurantimonas del orden Rhizobiales. El genero Aurantimonas
164
Discusión
comprende 4 especies entre las cuales consta también la especie

Aurantimonas altamirensis (Jurado y otros 2006) y con la que
están más relacionadas las secuencias detectadas en la Cueva de
Doña Trinidad. El genero Sphingomonas ha sido el más
frecuentemente detectado en grabados, pigmentos rojos y trazos
negros, como miembro metabólicamente activo de las
comunidades estudiadas. Especies pertenecientes a este género
están ampliamente distribuidas en la naturaleza (White y otros,
1996), presentan un interés biotecnológico muy importante debido
a su capacidad de degradar compuestos xenobióticos (Ederer y
otros, 1997) y también por su potencial para producir carotenoides
como β-caroteno, nostoxantina (Silva y otros, 2004) y
exopolisacáridos útiles en la industria (White y otros, 1996). La
síntesis de exopolisacáridos podría fomentar la agregación de
bacterias en los grabados y en las pinturas de la cueva pudiendo
favorecer la formación de colonizaciones indeseadas.
Considerando el amplio rango de compuestos y nutrientes

presentes en suelos y la gran variedad de metabolismos que los
miembros de Proteobacteria pueden llevar a cabo, estos
microorganismos presentarían la capacidad de crecer
habitualmente en la cueva en estudio. La pregunta sería si las
proteobacterias existirían como componente natural de la cueva
estudiada o serían una adquisición más reciente como
consecuencia de visitas o de su apertura al público. Dado que las
proteobacterias son uno de los grupos bacterianos más comunes
en suelos y otros muchos ambientes naturales y considerando su
dominancia en la mayoría de muestras analizadas durante este
trabajo (excepto en colonizaciones blancas) y el hecho de que no
se hayan detectado colonizaciones visibles y puntuales
165
Discusión
compuestas principalmente por estas bacterias en la Cueva de

Doña Trinidad, podríamos considerarlas como propias de la cueva.
Sin embargo, esta cuestión permanece abierta dada la dificultad
en definir claramente que microorganismos son autóctonos de la
cueva o alóctonos. Ello se debe, en primer lugar a la complejidad
de las comunidades microbianas naturales, y en segundo lugar a
carecer de un buen control de referencia para establecer claras
diferencias entre el ambiente natural de la cueva y la comunidad
importada. La cita de Baas-Becking (“everything is everywhere,
but, the environmente selects”) (Baas-Becking, 1934) confirmaría
la dificultad en discernir sin ambigüedad el origen de estas
bacterias dominantes en la Cueva de Doña Trinidad.
Considerando la presencia significativa de las proteobacterias

dentro de las comunidades metabólicamente activas de grabados
de la Cueva de Doña Trinidad, se confirma el riesgo potencial
para su conservación en caso de que estos miembros se
desarrollasen masivamente y colonizasen visiblemente los
grabados dando lugar a manchas de color, lo que ha ocurrido en
varias cuevas con pinturas rupestres. En la cueva de Altamira, por
ejemplo, se detectaron en colonizaciones amarillas y grises
(Portillo y otros, 2007b) dominadas por gamma y
alfaproteobacterias.
Este estudio claramente demuestra la importancia de las

proteobacterias en la Cueva de Doña Trinidad ya que ampliamente
dominan sus comunidades bacterianas. Por tanto, los resultados
discutidos hasta ahora sugieren que las proteobacterias, y
probablemente las gammaproteobacterias y las
alfaproteobacterias, representen buenos indicadores para el
166
Discusión
análisis de la proliferación bacteriana en esta cueva y la

monitorización del posible riesgo para la conservación de las
representaciones artísticas en este sistema.
4.1.2 Actinobacteria
Las técnicas tradicionales de cultivos han permitido aislar en

diferentes ecosistemas, una cantidad considerable de miembros
pertenecientes a la división Actinobacteria. Ello se debe
principalmente al hecho de que son fácilmente cultivables en
medios de cultivo y que su capacidad de formar esporas y
germinar en dichos medios facilita su análisis por cultivos.
Las actinobacterias también juegan un papel importante en

ambientes subterráneos (Goodfellow y Williams, 1983; Laiz y
otros, 2003; Groth y otros, 2001) y este se ha resaltado
frecuentemente en procesos de biodeterioro (Monte y Ferrari,
1993; Groth y otros, 1999a, b). Sin embargo, los diferentes
métodos (moleculares y tradicionales de cultivos) utilizados para
su detección indican una gran divergencia de los resultados sobre
su presencia en comunidades microbianas naturales. Mientras que
a partir de técnicas de cultivo, este grupo representa el
componente mayoritario en cuevas como la de Altamira (Laiz y
otros, 1999), la de Tito Bustillo (Groth y otros, 1999), en
catacumbas como las Tumbas de Tarquinia en Italia (Agarossi y
otros, 1992) y en otros ambientes subterráneos como la Grotta dei
Cervi en Italia (Laiz y otros, 2000), los métodos moleculares
sugieren que este grupo representa sólo una pequeña fracción de
las comunidades microbianas no sólo de cuevas con pinturas
rupestres, sino también en otros ambientes naturales
(Schabereiter-Gutner y otros, 2002a, b; 2004; Laiz y otros, 2003;
167
Discusión
Portillo y otros, 2008; Heuer y otros, 1997, Hayakawa y otros,

2000).
Los miembros de este orden son habitantes de suelos donde

participan generalmente en la descomposición aeróbica de materia
orgánica. Cañaveras y colaboradores (2006) han conducido un
estudio sobre la formación de depósitos de carbonatos en cuevas
y han sugerido que las actinobacterias serían los principales
responsables de esta formación. Estudios de cultivos en
laboratorio también confirman que las actinobacterias pueden
inducir la precipitación de carbonatos (Laiz y otros, 1999). Sin
embargo, Portillo y otros (2007b) en el estudio de la diversidad
bacteriana de formaciones de colonizaciones amarillas y grises en
la Cueva de Altamira han concluido que las actinobacterias no son
un grupo bacteriano significativo en las comunidades de las
muestras analizadas, tanto a partir de ADN como de ARN.
En esta tesis las actinobacterias constituyeron el componente

mayoritario en colonizaciones blancas de la Cueva de Doña
Trinidad, como se ha detectado por su presencia (análisis basados
en el ADN) y por su actividad metabólica predominante (en base a
análisis de ARN). Estos resultados representan una diferencia
importante con todas las demás muestras estudiadas en las que
predominan las proteobacterias.
Actualmente, en la cueva de Doña Trinidad, se observan áreas

colonizadas por manchas blancas. Estas están presentes en
diferentes partes de la cueva, sobre las paredes, en las escaleras
de entrada y sobre los espeleotemas de la cueva generalmente
cercanas a la zona de entrada (Fig. 2.8, 2.9, 2.10).
168
Discusión
Las actinobacterias en colonizaciones blancas han sido

detectadas utilizando cebadores universales para Bacteria, y no ha
sido necesario utilizar cebadores específicos para este grupo tanto
en el caso de las genotecas construidas a partir de ADN como de
ARN. Ello demuestra el gran papel desarrollado por esta división
dentro de la comunidad microbiana de estas colonizaciones. Sin
embargo, varios estudios (McVeigh y otros, 1996; Heuer y otros,
1997; Ludemann y Conrad, 2000; Stach y otros, 2003a, b), han
necesitado el empleo de cebadores específicos para esta división
con objeto de incrementar la detección de miembros de este grupo
ya que representaban una fracción reducida en esos sistemas.
Dentro del orden Actinomycetales, el género Pseudonocardia fue

el más frecuentemente detectado por ambos métodos moleculares
(ADN y ARN). Es interesante subrayar el hecho de que este
género fue el componente mayoritario y prácticamente exclusivo
dentro de las actinobacterias detectadas en la comunidad
metabólicamente activa de colonizaciones blancas, lo que se
confirmó con el perfil basado en ARN y obtenido por DGGE (Fig.
3.15) y con la frecuencia de clones pertenecientes a este género
en genotecas de ADN y ARN.
Recientemente, el género Pseudonocardia también ha sido

detectado en colonizaciones blancas de la cueva de Santimamiñe
(Kortézubi, Biscay) donde representaba el 65.7% de las
secuencias procesadas a partir de una genoteca de clones
basadas en ARNr 16S (Stomeo y otros, 2007). Es decir, también
en este caso Pseudonocardia representaba el componente
mayoritario de las comunidades metabólicamente activas en
aquellas colonizaciones blancas. Igual que en la Cueva de Doña
Trinidad, el perfil molecular de los microorganismos activos de la
169
Discusión
comunidad también se caracterizó por la presencia de una banda

principal en análisis por DGGE correspondiente al género
Pseudonocardia (Stomeo y otros, 2007). Por tanto,
Pseudonocardia representa el componente que mayoritariamente
contribuye a la expansión de las colonizaciones blancas tanto en
la cueva de Doña Trinidad como en la de Santimamiñe,
representando un riesgo potencial si su colonización continúa
extendiéndose por la cueva y, sobre todo, si se asentase sobre las
pinturas y grabados de estas cuevas.
A diferencia de la Cueva de Doña Trinidad, estudios llevados a

cabo en la Cueva de Altamira (Portillo y otros, 2008) demostraron
que colonizaciones blancas en esa cueva estaban formadas por
una comunidad bacteriana altamente compleja. La división
Actinobacteria se detectó principalmente por ADN donde
representó el 32% de las secuencias analizadas. Por ARN
representó únicamente el 8% de las secuencias. Las comunidades
metabólicamente activas de las colonizaciones blancas de la
Cueva de Altamira estaban principalmente constituidas por la
división Proteobacteria (60%). Otras divisiones detectadas tanto a
partir de ADN como de ARN fueron Firmicutes (3% por ADN y
10% por ARN), Planctomycetes (8% por ADN y 3% por ARN),
Bacteroidetes (11% por ADN y 1% por ARN), Acidobacteria (3%
por ADN y 1% por ARN) y Chloroflexi (3% por ADN). En las
colonizaciones blancas de la Cueva de Santimamiñe también se
detectaron otros grupos bacterianos. Las alfaproteobacteria
representaron el 9% de las secuencias obtenidas a partir del
análisis del ARN y las Planctomycetes representaron el 6% de
estas secuencias. Otros grupos minoritarios que componían las
comunidades metabólicamente activas de las colonizaciones
170
Discusión
blancas de la Cueva de Santimamiñe fueron Acidobacteria, Beta-

Proteobacteria y Nitrospirae, (las tres con un 3% cada una). Estas
divisiones también han sido detectadas en colonizaciones blancas
de la Cueva de Doña Trinidad aunque en muy baja proporción.
Ello sugiere la presencia de comunidades bacterianas
relativamente complejas también en las colonizaciones blancas de
la cueva estudiada. A pesar de ello, y a diferencia de la Cueva de
Altamira, las actinobacterias y en particular el género
Pseudonocardia resultaron los principales microorganismos
metabólicamente activos responsables de los procesos de
colonización en las cuevas de Santimamiñe y Doña Trinidad.
Los resultados de Portillo y colaboradores (2008) junto con los

presentados en este estudio en la Cueva de Doña Trinidad y los
de la cueva de Santimamiñe (Stomeo y otros, 2007), sugieren que
no todo tipo de colonizaciones de coloración blanca que afectan a
la conservación de cuevas con pinturas rupestres han de estar
formadas por las mismas comunidades bacterianas. Aunque la
novedad de los resultados encontrados en la Cueva de Doña
Trinidad se confirman con otro caso similar encontrado en
Santimamiñe.
Este trabajo en la Cueva de Doña Trinidad sugiere que distintos

puntos de la cueva pueden albergar comunidades diferentes. El
ejemplo está en el predominio de las proteobacterias en la Cueva
de Doña Trinidad con excepción de las colonizaciones blancas. En
las colonizaciones blancas se detectó un completo predominio de
actinobacterias del género Pseudonocardia. Debido a que las
colonizaciones blancas parecen distribuirse principalmente
alrededor de la zona de entrada, se podría proponer que
Pseudonocardia representa bien un microorganismo alóctono que
171
Discusión
ha invadido el sistema de la cueva estudiada, o bien que aún

siendo parte de la comunidad de la cueva, ha experimentado un
crecimiento excesivo dando lugar, recientemente, a la aparición y
dispersión de colonizaciones blancas en la cueva. Esta hipótesis
confirmaría que Pseudonocardia podría representar un modelo de
bacteria invasora de la cueva en contraposición con el grupo de
las proteobacterias que en general constituirían componentes
autóctonos de las comunidades bacterianas de la Cueva de Doña
Trinidad. Como consecuencia, convendría monitorizar el desarrollo
y expansión de las colonizaciones blancas y específicamente de
representantes del género Pseudonocardia en la Cueva de Doña
Trinidad.
4.1.3 Cultivos y colonización por Pseudonocardia
Considerando el papel significativo que Pseudonocardia podría

tener en los procesos de colonización de la cueva dando lugar, al
menos, a efectos estéticos indeseados, el éxito obtenido en el
cultivo de miembros de este género resulta muy importante ya que
ha permitido confirmar que Pseudonocardia es capaz de
desarrollarse en el laboratorio bajo condiciones semejantes a la
cueva y refuerza el hecho de que es capaz de representar el
mayor componente bacteriano de colonizaciones blancas.
Los resultados de estos ensayos indican que en las condiciones

de temperatura actualmente presentes en la cueva,
Pseudonocardia se ve favorecida y puede proliferar. A la
temperatura media de la cueva se obtuvo un aumento del
crecimiento de Pseudonocardia sobre todo en tratamientos
suplementados con glucosa o Na3PO4. Por tanto, un aumento de
172
Discusión
los nutrientes orgánicos disponibles en la cueva impulsaría el

crecimiento de Pseudonocardia en las condiciones de la cueva
estudiada. Generalmente, los fosfatos no presentan proporciones
considerables en la composición de suelos, pero su presencia ha
sido comprobada por varios estudios (Bargagli, 1998). Por ello y
considerando los ensayos de colonización y la presencia de
materia orgánica disuelta en la cueva, se puede suponer que las
condiciones actuales de la cueva favorecen el crecimiento de
Pseudonocardia, lo que es corroborado por el aparente poder
invasor de las colonizaciones blancas en la actualidad.
Por tanto, el fosfato pudiera ser uno de los nutrientes que limitaría
la proliferación de Pseudonocardia en la Cueva de Doña Trinidad.
Otro nutriente limitante del crecimiento de Pseudonocardia sería la
fuente de carbono ya que suplementando el suelo con glucosa
aumentaría la proliferación de Pseudonocardia.
Esta bacteria es capaz de desarrollarse en la Cueva de Doña

Trinidad y el aumento de nutrientes orgánicos y de fosfatos podría
desencadenar un incremento en la proliferación de
Pseudonocardia en la cueva. Esto representa un riesgo que habría
que prevenir para conservar la Cueva de Doña Trinidad en las
mejores condiciones posibles.
4.1.4 Grupos bacterianos minoritarios encontrados en las

muestras
Miembros de la división Firmicutes también son representantes

comunes de ambientes subterráneos. Por ejemplo, en las cuevas
de Altamira, de Lechuguilla y Spider (Mejico) y en las de Llonín y
173
Discusión
La Garma, la división Firmicutes fue detectada por métodos

moleculares basados en el ADN (Portillo y otros, 2007b; Northup y
otros, 2003; Schabereiter-Gurtner y otros, 2004). En la Cueva de
Doña Trinidad las secuencias pertenecientes a esta división fueron
detectadas tanto en base a ADN (11%) como al ARN (3%)
confirmando la presencia de algunos de estos microorganismos
como miembros metabólicamente activos.
Varios estudios indican que miembros de la división Firmicutes

están implicados en los procesos de precipitación de carbonatos
en cuevas. Baskar y colaboradores (Baskar y otros, 2006)
condujeron un estudio sobre el posible origen de estalactitas en la
cueva de Sahastradhara (Dehradun, India) a partir de la
precipitación de carbonato inducida por cepas del género Bacillus.
También en la Cueva de Doña Trinidad, la actividad microbiana de
este grupo bacteriano en determinadas condiciones, podría
representar un factor clave en la inducción de la precipitación de
carbonatos y en formaciones de tipo moonmilk (Cañaveras y otros,
2006).
El grupo bacteriano Bacteroidetes incluye varios géneros de

bacterias anaerobias, entre ellos los géneros Bacteroides y
Prevotella. Las bacterias de este grupo exhiben una gran variedad
de fenotipos incluyendo su habilidad de digerir y crecer sobre una
gran variedad de substratos complejos como celulosa, agar y
quitina (Gupta y Lorenzini, 2007). Ello sugiere que podrían estar
relacionadas con procesos implicados en el control natural de
crecimiento de hongos de la cueva ya que la quitina es el
componente principal de la pared celular de los hongos (Portillo,
2007). En el presente estudio el género Prevotella sólo ha sido
174
Discusión
detectado en muestras de grabados por ADN y ARN en una

proporción baja. Esta división ha sido detectada también en otras
cuevas a partir de métodos moleculares: en la Cueva de Nullarbor
en Australia (Holmes y otros, 2001), en la de Altamira
(Schabereiter-Gurtner y otros, 2002a), y en la cueva de Tito
Bustillo (Schabereiter-Gurtener y otros, 2002b).
Las Planctomycetes son un grupo abundante de bacterias que

representan una línea importante en el dominio Bacteria. Gran
parte de los representantes de esta división se han detectado
únicamente por métodos moleculares. Antes de la detección de
miembros de este grupo en suelos (Liesack y Stackebrandt, 1992)
se pensaba que los representantes de esta división se distribuían
exclusivamente en ambientes acuáticos. Desde entonces las
Planctomycetes han sido encontradas en suelos y en muchos
otros ambientes (Buckley y otros, 2006). El conocimiento general
de esta división se ve limitado debido a que se han descrito y
caracterizado pocas especies. Miembros de esta división han sido
detectados en otros ambientes subterráneos (Holmes y otros,
2001; Zhou y otros, 2007) y se piensa que desempeñen un papel
ecológico importante en muchos ecosistemas (Kuske y otros,
1997; Ludwig y otros, 1997; Holmes y otros, 2001). Un proceso
típico atribuido a representantes de esta división es la oxidación
anaerobia de amonio (ANAMMOX) (Zhang y otros, 2008).
Durante este estudio, esta división se ha encontrado

exclusivamente en las colonizaciones blancas donde representó el
3% de las secuencias procesadas tanto a partir de ADN como de
ARN. Ello indica que estos microorganismos también participan en
el desarrollo de las comunidades de colonizaciones blancas.
175
Discusión
Debido al escaso conocimiento sobre el metabolismo llevado a

cabo tanto por bacterias pertenecientes al grupo bacteriano
Planctomycetes como aquellas pertenecientes a otros grupos
minoritarios detectados en este estudio (Nitrospirae, Chloroflexi y
Deinococci) no es fácil sugerir el papel que puedan tener en los
procesos implicados en el posible deterioro del arte rupestre de la
Cueva de Doña Trinidad.
Los miembros de la división Chloroflexi se conocen como

bacterias verdes no sulfurosas. Este grupo es extremadamente
diverso a nivel fenotípico (Hanada y Pierson, 2002). Su hábitat
usual, en general, son sedimentos profundos de lagos y estanques
aunque también se han encontrado en diferentes cuevas
(Scharebeiter-Gurtner y otros 2002a, b). La división Nitrospirae
comprende microorganismos quimioorganotrofos aerobios que
oxidan nitrito a nitrato (Garrity y Holt, 2001). Miembros de esta
división han sido encontrados a partir de métodos moleculares en
estudios sobre diversidad microbiana también en cuevas (Holmes
y otros, 2001; Zhou y otros, 2007). La división Deinococci nunca
ha sido detectada en cuevas. En este estudio la comunidad de
microorganismos presentes en pigmentos rojos estaba constituida
por una fracción baja de microorganismos pertenecientes a este
grupo bacteriano. Los miembros de esta división difieren de las
otras bacterias gram-positivas en numerosas propiedades
fisiológicas y químicas. Estas especies son altamente resistentes a
radiaciones. El hábitat natural de estas bacterias no ha sido bien
definido ya que todas las especies descritas son
quimioorganotrofas, requieren medios complejos para el
crecimiento y han sido aisladas en diferentes lugares (Chan y
O’Toole, 1999) pero no en cuevas con pinturas rupestres.
176
Discusión
4.1.5 Acidobacteria
Las bacterias pertenecientes al grupo bacteriano Acidobacteria

han sido detectadas en diferentes ambientes e identificadas
utilizando técnicas moleculares basadas en la construcción de
genotecas del gen ribosómico 16S a partir de ADN extraído
directamente de muestras naturales (Ludwig y otros, 1997;
Hugenholtz y otros, 1998; Barns y otros, 1999; Quaiser y otros,
2003; Horn y otros, 2003; Zimmermann y otros, 2005a, b; Janssen,
2006; Penn y otros, 2006). Hasta ahora más de 3000 secuencias
representan esta división en las bases de datos y casi todas
representan microorganismos no cultivados en muestras de suelo
(Cole y otros, 2005; Janssen y otros, 2006). Considerando su
diversidad filogenética y su perfil de distribución ecológica, la
división Acidobacteria es un grupo genética y metabólicamente tan
diverso que puede ser comparado con el bien conocido grupo de
las proteobacterias (Hugenholtz y otros, 1998; Barns y otros,
1999). En contraste con la ubicuidad y la abundancia de las
secuencias pertenecientes a bacterias de este grupo, el
conocimiento de las acidobacterias resulta escaso debido al hecho
de que han sido descritas sólo unas pocas especies (Lee y otros,
2008). Actualmente, esta división comprende siete especies
(Acidobacterium capsulatum, Geothrix fermentans, Holophaga
foetida, Edaphobacter aggregans, Edaphobacter modestus,
Chloracidobacterium thermophilum y Terriglobus roseus)
(Kishimoto y otros, 1991; Liesack y otros, 1994; Coates y otros,
1999; Bryant y otros, 2007; Eichorst y otros, 2007; Koch y otros,
2008). Distintos laboratorios están constantemente trabajando
para obtener cultivos dentro de este grupo y elucidar el nicho
ecológico de esta división. Hoy en día se han citado 99 aislados
177
Discusión
(Janssen y otros, 2002; Sait y otros, 2002, 2006; Joseph y otros,

2003; Stevenson y otros, 2004; Davis y otros, 2005). El papel
ecológico de este grupo resulta todavía desconocido en cuevas
con pinturas rupestres aunque se sabe que es altamente diverso.
Miembros de este grupo han sido frecuentemente detectados en

hábitats como desiertos (Gundlapally y Garcia-Pichel, 2006),
sistemas terrestres y marinos hidrotermales (Lopez-Garcia y otros,
2003; Glamoclija y otros, 2004) y suelos (Norris y otros, 2002).
Representantes de esta división también han sido detectados en
ambientes subterráneos; en cuevas como la de Tito Bustillo
(Schabereiter-Gurtner y otros, 2002b), en las cuevas de Llonín y
La Garma (Schabereiter-Gurtner y otros, 2004), en la de Altamira
(Zimmermann y otros, 2005a) y en catabumbas como la de San
Callisto en Roma (Zimmermann y otros, 2005b). La presencia de
Acidobacteria en estos ambientes hipogeos sugiere su
participación en procesos de biodeterioro (en cooperación con
otros microorganismos).
En este estudio se utilizaron cebadores específicos para la división

Acidobacteria, a partir de ARN directamente extraído de las
muestras. Las secuencias obtenidas representan miembros de
Acidobacteria con actividad metabólica significativa y, por lo tanto,
participan en el desarrollo de las comunidades microbianas de las
muestras analizadas en la Cueva de Doña Trinidad. Todas las
secuencias procesadas en este estudio estaban relacionadas con
representantes de acidobacterias detectados en la cueva de
Altamira.
178
Discusión
Considerando los resultados obtenidos, las muestras de grabados

son las que tienen más variedad de acidobacterias con hasta 4
subdivisiones presentes y metabólicamente activas en estas
muestras. Ello sugiere que estos microorganismos podrían adquirir
ventajas fisiológicas en la acumulación de materiales en los
grabados obteniendo un nicho donde desarrollarse.
En este estudio también se intentó el cultivo de acidobacterias

obteniendo un enriquecimiento en el que se detectó la presencia
de una bacteria perteneciente al subgrupo 4 de la división
Acidobacteria. Aunque la bacteria aislada detuvo su crecimiento
tras tres transferencias se pudo de todas maneras deducir el tipo
de metabolismo de esta Acidobacteria: ambiente aeróbico y
metabolismo heterotrófico basado en la descomposición de
polisacáridos. Ello es interesante considerando la pertenencia a la
subdivisió 4 de Acidobacteria, que fue la más frecuentemente
detectada en las muestras analizadas dentro de las acidobacterias
que desarrollaban actividad metabólica significativa.
4.1.6 Bacterias reductoras de sulfato
Las bacterias reductoras de sulfato (BRS) constituyen un grupo

muy diverso de microorganismos que comparten la habilidad de
utilizar sulfato como aceptor terminal de electrones mientras
oxidan varias fuentes de carbono en anaerobiosis (Miletto y otros,
2007). La reducción del sulfato juega un papel importante en el
ciclo global del azufre y representa un proceso importante de
mineralización de materia orgánica en diversos ambientes, desde
aguas marinas (Dhillon y otros, 2003) y dulcícolas (Holmer y
Storkholm, 2001) hasta suelos y plantas de tratamiento de
179
Discusión
residuos y aguas (Ito y otros, 2002a, b), películas oxigenadas y

anóxicas (Santegoeds y otros, 1998) y sedimentos (Jonkers y
otros, 2005). En contraste con el importante papel que las BRS
tienen en la biogeoquímica de suelos (Loy y otros, 2004) y su
potencial en la bioremediación de suelos y ambientes superficiales
(King y otros, 2002), existe escasa información sobre las BRS de
ambientes terrestres. Las BRS son un grupo muy diverso
filogenéticamente que incluye las divisiones Deltaproteobacteria,
Firmicutes, varios otros grupos bacterianos e incluso Archaea
(Daly y otros, 2000). En las ultimas décadas ha habido un cambio
en la perspectiva general de la fisiología de estas bacterias (Stahl
y otros, 2002). Las BRS se han mencionado por su participación
en procesos de degradación de compuestos aromáticos
(incluyendo benceno, naftaleno y fenantreno) y xenobióticos
(Hansen, 1994; Phelps y otros, 1998; Weiner y Lovely 1998). Las
BRS también han sido detectadas en cuevas como la de Altamira
(Portillo y otros, 2006).
En este estudio se han utilizado cebadores específicos para BRS

a partir de ARN. Por ello, las secuencias obtenidas pertenecen a
microorganismos metabólicamente activos dentro de las
comunidades analizadas. En algunos casos (colonizaciones
blancas) también se detectaron BRS (pertenecientes a la división
Deltaproteobacteria) a partir de ADN confirmando así su presencia
en las comunidades bacterianas de la Cueva de Doña Trinidad.
Desulfovibrio desulfuricans (Deltaproteobacteria) fue el taxón más
frecuentemente detectado (88%) en el suelo de la cueva. Como
los sulfatos son generalmente comunes en suelos, estas bacterias
podrían utilizarlos para su crecimiento y colonizar también otras
partes de la cueva dando lugar a efectos negativos.
180
Discusión
Estas bacterias utilizan compuestos orgánicos como lactato, etanol

o ácidos grasos como donadores de electrones. Esto reduce el
azufre o el sulfato a H2S. Cuando este ultimo reacciona con el
hierro forma FeS que es insoluble, produciendo oscurecimiento de
la zona donde se lleve a cabo este tipo de metabolismo. En el
caso de los ambientes subterráneos y en particular en la cueva
estudiada, la expansión de estos microorganismos sobre las
pinturas o los grabados podría dar lugar a daños importantes.
En las genotecas basadas en ADN y ARN de grabados de la

cueva, analizadas en este estudio no se detectó la presencia de
estos microorganismos. Se puede entonces deducir que en la
actualidad estas bacterias no representan una elevada proporción
de las comunidades bacterianas presentes ni de aquellas
metabólicamente activas de grabados en la cueva. Sin embargo,
considerando su presencia significativa en el suelo y su detección
a partir de ADN en las colonizaciones blancas, se debería
monitorizar su crecimiento para llevar a cabo un control de su
posible proliferación en la cueva.
Además, si consideramos que estas bacterias han sido

detectadas con el empleo de cebadores específicos para el grupo
de Desulfovibrio/Desulfomicrobium (Daly y otros, 2000), se podría
suponer que la diversidad de BRS en la Cueva de Doña Trinidad
alcanzaría un nivel aún mayor ya que existen también otros grupos
bacterianos (como Firmicutes) que incluyen también géneros de
BRS (Portillo y otros, 2006) y algunos de ellos (por ejemplo,
Desulfotomaculum) son bastante frecuentes en suelos.
181
Discusión
La detección de estos microorganismos anaerobios estrictos en la

cueva estudiada sugiere la presencia de nichos anaerobios en los
cuales estos puedan desarrollarse y la posibilidad de que otros
microorganismos anaerobios también puedan crecer y colonizar
este ambiente.
Las BRS pertenecientes a las deltaproteobacterias junto con otros

grupos de BRS como algunas Firmicutes también pueden estar
implicadas en la precipitación de carbonato ya que pueden dar
lugar a aumentos de pH. La producción de H2S por BRS puede
incrementar significativamente el pH lo que induciría la
precipitación de carbonatos (Baskar y otros, 2006).
En cuevas este mecanismo podría traducirse en la formación de

depósitos cristalinos en sus paredes (Portillo y otros, 2008).
Además, se ha citado que algunas BRS pueden producir
sustancias exopoliméricas (Purishch y otros, 2004) que
posteriormente contribuirían a cambios de pH y a formaciones de
depósitos cristalinos (Braissant y otros, 2007). Ello en el caso de
cuevas con pinturas rupestres provocaría efectos estéticos
negativos sobre pinturas y grabados pudiendo llegar a cubrirlos
parcial o totalmente.
182
Discusión
4.1.7 Evaluación de la diversidad bacteriana en la Cueva de

Doña Trinidad y métodos empleados para detectarla
Varios estudios sobre comunidades de ambientes naturales

indican que la diversidad microbiana es altamente elevada y que la
mayoría de las veces se llega a detectar únicamente una parte de
esta (Hughes y otros, 2001).
Durante este estudio, las curvas de cobertura presentadas para el

número de OTUs y divisiones sirvieron para obtener una visión
aproximada de la diversidad microbiana en la Cueva de Doña
Trinidad. Los resultados de este análisis sugirieron la presencia de
una elevada diversidad bacteriana en la cueva estudiada.
En la Cueva de Doña Trinidad las curvas de cobertura para las

divisiones detectadas por análisis moleculares indicaron que
aunque se analizase un número mayor de clones no se llegarían a
descubrir más divisiones adicionales que las ya detectadas en
este estudio. Al analizar las curvas de cobertura correspondientes
al número de OTUs se observa que aunque existiera aún un cierto
número de OTUs diferentes por detectar, la elevada inclinación de
las curvas de cobertura obtenidas confirma que se han llegado a
detectar los componentes más representativos y la mayoría de los
constituyentes de las comunidades estudiadas (Fig. 3.29 y 3.30).
Por tanto, los datos obtenidos constituyen una visión relativamente
completa de las comunidades bacterianas en la Cueva de Doña
Trinidad y este fue el caso tanto para análisis moleculares llevados
a cabo en base al ADN como al ARN.
183
Discusión
Las curvas de cobertura para las divisiones en el caso de los

cultivos indicaron que las divisiones detectadas por cultivo no
aumentarían al aumentar el número de microorganismos
cultivados en las condiciones empleadas ya que se alcanzó la
asintota correspondiente. En cambio, las curvas de coberturas
para el número de OTUs diferentes indicaron que se ha detectado
sólo una pequeña fracción de los microorganismos presentes en la
Cueva de Doña Trinidad ya que la curva presentaba una reducida
inclinación lejos de acercarse a la asintota correspondiente (Fig.
3.31).
Esto indica que los métodos de cultivo presentan una seria

limitación frente a los análisis moleculares a la hora de detectar la
diversidad bacteriana de muestras naturales lo que confirma las
conclusiones de otros autores (Ward y otros, 1990; González y
otros, 2003). De hecho, en la mayoría de los estudios sobre
comunidades naturales se emplean análisis moleculares sobre
todo basados en el ADN ya que las técnicas de cultivo resultan
claramente insuficientes para el análisis de comunidades
bacterianas naturales. En la mayoría de los casos durante
estudios de comunidades naturales, los datos obtenidos a través
de las dos perspectivas de análisis (de cultivos y moleculares) dan
lugar a diferencias importantes en la detección de distintos grupos
bacterianos. Un ejemplo son los datos aportados sobre la cueva
de Altamira (Laiz y otros, 2003; Portillo y otros, 2007b; 2008).
En este estudio los resultados elaborados a partir del cultivo de las

muestras analizadas (Fig. 3.26) confirmaron los obtenidos en otros
estudios tanto de cuevas con pinturas rupestres (Groth y otros,
1999; Laiz y otros, 1999; Baskar y otros, 2006) como en otros
ambientes naturales (Ward y otros, 1992; Torsvik y otros, 1990).
184
Discusión
El gran predominio de las divisiones Firmicutes y Actinobacteria en

cultivos puede ser explicado por el hecho de que la mayoría de
sus miembros producen esporas y consiguen crecer óptimamente
en los medios de cultivo tradicionales utilizados en el laboratorio,
mientras que otros grupos bacterianos requieren el empleo de
medios de cultivos más complejos o condiciones específicas. Los
métodos tradicionales de cultivo son inapropiados a la hora de
detectar aquellos microorganismos que participan en el desarrollo
de comunidades naturales. En este estudio, por ejemplo, las
comunidades bacterianas se han analizado tanto a partir de ADN
como de ARN y numerosos microorganismos pertenecientes a
grupos bacterianos que no se han detectado por cultivos han
podido ser evidenciados.
Sin embargo, gracias al avance de técnicas de cultivo ha sido

posible aislar microorganismos hasta ahora no cultivados de
ambientes naturales (Joseph y otros, 2003; Zengler y otros, 2002;
Janssen y otros, 2002; Ferrari y otros, 2005; Davis y otros, 2005;
Stevenson y otros, 2004). Conseguir aislar microorganismos
meramente presentes en una comunidad bacteriana natural (por
ejemplo que hayan sido detectados previamente a través de un
análisis basado en el ADN), aunque no muestren actividad
metabólica significativa, sería muy útil ya que estos mismos,
llegadas condiciones favorables en el ambiente considerado,
podrían incrementar su crecimiento y volverse participantes
activos dentro de la nueva comunidad. Obtener cultivos puros de
los microorganismos presentes y/o metabólicamente activos de
una comunidad microbiana significaría poder estudiar su
metabolismo y el posible papel que juegan en la comunidad
considerada.
185
Discusión
En este estudio, las técnicas de cultivo han sido fundamentales

por varios aspectos. Por ejemplo, el aislamiento de
Pseudonocardia ha permitido estudiar más de cerca su potencial
colonizador, los factores tanto de temperatura como de nutrientes
que pudieran favorecer o limitar su desarrollo, sus actividades
enzimáticas y su metabolismo sobre hidratos de carbono. En
cuevas con pinturas y grabados rupestres cuya conservación es
una prioridad, la posibilidad de trabajar directamente con los
microorganismos más implicados en procesos de colonización o
biodeterioro del arte prehistórico examinado, resulta de una gran
importancia.
Asimismo, por lo que se refiere a la división Proteobacteria, el

grupo bacteriano mayoritario en las muestras analizadas, resulta
significativo haber sido capaz de aislar algunos de sus miembros
más frecuentemente detectados (por ejemplo Pseudomonas). En
el caso de que fuera necesario llevar a cabo análisis bioquímicos y
fisiológicos de estos microorganismos estas cepas estarían
disponibles.
Las técnicas de cultivo nos han servido también para obtener

informaciones sobre el metabolismo de bacterias pertenecientes a
Acidobacteria, uno de los grupos bacterianos más diversos
detectados en este trabajo. Aunque no se haya podido obtener
cultivos puros de estas bacterias, los intentos llevados a cabo nos
han proporcionado información útil para futuros ensayos y para
deducir el posible papel de las acidobacterias en la Cueva de
Doña Trinidad.
186
Discusión
Por tanto, en el estudio de comunidades microbianas complejas

como las muestras naturales, resulta imprescindible combinar los
dos tipos de enfoque, molecular y de cultivos. Las técnicas
moleculares son muy útiles a la hora de detectar aquellos
microorganismos más abundantes en las comunidades analizadas
(por ADN) o mejor aún aquellos que se encuentran
metabólicamente activos participando en procesos de la
comunidad (por ARN). Una vez que los microorganismos de la
comunidad hayan sido identificados a través de estos análisis, las
técnicas de cultivo resultan fundamentales a la hora de realizar
estudios metabólicos y fisiológicos de las bacterias de interés y en
el caso del Patrimonio, de aquellas implicadas en procesos de
biodeterioro.
187
Discusión
4.2 Diversidad fúngica en la cueva de Doña Trinidad
Los hongos son frecuentes en la mayoría de ambientes y

desempeñan un amplio rango de funciones ecológicas
importantes. En particular, se ha citado que participan de modo
significativo en la descomposición de la materia orgánica en
suelos y juegan un papel esencial en la formación de humus
(Christensen, 1989). Diferentes autores (Diakumaku y otros, 1995;
Saiz- Jiménez, 1995; Saiz-Jiménez y otros, 1995) indican que los
metabolitos producidos por hongos (melanina y productos de
polimerización intracelular) pueden causar pigmentación de
materiales y crear defectos en la estructura, fracturas y
deformación, lo que puede ocurrir también en cuevas con pinturas
rupestres.
Debido a su forma de crecimiento y su alto potencial de

adaptación, los hongos han sido detectados también en ambientes
subterráneos y, en concreto, en aquellos representativos del
Patrimonio Cultural (Saiz-Jiménez y Samson, 1981; Alabouvette,
2006; Sert y otros, 2007). No obstante, a pesar del papel que los
hongos pueden jugar en los procesos de biodeterioro de cuevas
con pinturas rupestres, la mayoría de los estudios sobre ambientes
subterráneos se han enfocado principalmente en la detección y en
el análisis de las comunidades bacterianas que se desarrollan en
los sitios estudiados (por ejemplo, Groth y otros, 1999; Laiz y
otros, 2003; Portillo y otros 2007b) y pocos estudios existen sobre
las comunidades fúngicas (Dickson y Kirk, 1976; Northup y otros,
1994; Cunningham y otros, 1995). Estudios de análisis
simultáneos de comunidades bacterianas y fúngicas en cuevas
con pinturas rupestres son muy escasos (Pantazidou y otros,
188
Discusión
1997). Sin embargo hongos y bacterias generalmente coexisten en

un mismo ecosistema así que a la hora de estudiar fenómenos de
biodeterio en cuevas con pinturas rupestres resulta fundamental
analizar ambas comunidades microbianas.
En este estudio se han utilizado métodos tradicionales de cultivo y

moleculares para la detección y la caracterización no sólo de las
comunidades bacterianas presentes en la cueva sino también de
los hongos. A continuación se discutirán los resultados obtenidos
con énfasis sobre los hongos y las levaduras detectadas que
pudieran representar factores críticos para la conservación de la
cueva. También se evaluará la diversidad fúngica encontrada en la
Cueva de Doña Trinidad y los métodos empleados para su
detección.
4.2.1 Ascomycota
La división Ascomycota, es la más diversa dentro del reino Fungi.

Comprende casi el 50% de todas las especies fúngicas conocidas
y aproximadamente el 80% de las especies patógenas y
oportunistas (de Hoog y otros, 2000).
Casi la totalidad de los hongos detectados en este estudio

pertenecen a esta división. La mayoría de estas cepas fueron
caracterizadas inicialmente a partir de un análisis morfológico. Los
mismos aislamientos fueron identificados también a partir de la
secuenciación de las regiones intergénicas (ITS) y de las
subunidades del gen ribosómico 18S y 26S con el fin de comparar
los resultados obtenidos a través de la caracterización morfológica
y molecular. Los resultados obtenidos sugieren, como se discutirá
189
Discusión
más adelante, que ambas técnicas se complementan y resultan

útiles para la detección y clasificación de aislados individuales y se
pueden integrar para confirmar la caracterización de nuevos
hongos aislados.
Dentro de los Ascomycota, el orden Eurotiales ha sido

frecuentemente detectado en las muestras analizadas durante
este estudio. Los géneros más representativos fueron Penicillium y
Aspergillus. Estos géneros son hongos cosmopolitas que pueden
crecer utilizando numerosos substratos. Algunas especies de
Aspergillus (Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus, por
ejemplo) producen aflatoxinas, un grupo de compuestos de bajo
peso molecular conocido como extremadamente tóxico para
animales y seres humanos (Bennet y Klich, 2003). No todos los
miembros de estas especies son tóxicos (Thapar, 1988) y también
dentro de aquellas cepas con potencial tóxico, el crecimiento no
siempre se ve necesariamente acompañado por la producción de
toxinas. Esta producción se relaciona con condiciones ambientales
favorables, una de las cuales es la humedad (da Silva y otros,
2000). El genero Penicillium es muy conocido por la producción
del antibiótico penicilina (producido por el genero Penicillium
chrysogenum). Su taxonomía ha sido siempre muy compleja ya
que existe un gran número de especies descritas, cepas y
variedades aisladas (de Hoog y otros, 2000) procedentes de varios
ambientes naturales (Greenhill y otros, 2007; Suihko y otros,
2007). Especies de Penicillium también han sido detectadas en
pinturas murales (Pepe y otros, 2008) y en ambientes
subterráneos (Šimonovičová y otros, 2004; Saarela y otros, 2004).
190
Discusión
La detección de algunos de esos géneros de hongos en la cueva

estudiada podría también relacionarse con la presencia humana.
Saarela y colaboradores (Saarela y otros, 2004) en un estudio
sobre las comunidades microbianas de catacumbas romanas,
vieron que la incidencia de Penicillium y Aspergillus en las
catacumbas era mayor en los días de visitas que en los días sin
visitas. Esto, junto con otros aspectos, sugiere que las visitas de
cuevas con pinturas rupestres deben ser monitorizadas y
controladas para minimizar el crecimiento y la dispersión de estos
microorganismos.
El orden Hypocreales, fue otro frecuentemente detectado en la

Cueva de Doña Trinidad. El género Fusarium (el más
representativo de este orden en la cueva estudiada) ha atraído el
interés de un amplio número de investigadores y más que
cualquier otro grupo de hongos debido a su amplia distribución por
todo el mundo y su contribución en patologías de plantas, de
animales y de seres humanos (de Hoog y otros, 2000). Un
problema fundamental inherente con la identificación de Fusarium
es que sus especies pueden tener una amplia variedad de
características morfológicas y fenotípicas. Debido a la complejidad
de este género, han sido necesarios numerosos esfuerzos
taxonómicos para llegar a un acuerdo sistemático entre los
micólogos (Booth y otros, 1971; Nelson y otros, 1983, 1994;
O’Donnel y otros, 2000, 2008; Zhang y otros, 2006).
Fusarium fue el único género detectado en muestras de grabados

y pigmentos de la cueva a partir de ADN, por lo que se deduce
que los miembros de este género constituyen una proporción
significativa de las comunidades presentes en las muestras
191
Discusión
analizadas y que la dispersión de Fusarium se produce por su

capacidad de formar esporas. Esto permitiría la distribución de
Fusarium por toda la cueva lo que produciría daños estéticos
visibles sobre los grabados de la cueva si este hongo llegase a
proliferar.
Fusarium solani, basándose en características morfológicas, forma

parte de un complejo de 45 especies filogenéticas y/o biológicas,
que lleva el nombre de complejo de las especies Fusarium solani
(FSSC) (Nelson y otros, 1983; Zhang y otros, 2006). Los miembros
de este género son principalmente patógenos de plantas (Domsch
y otros, 2007), animales y seres humanos (Zhang y otros, 2006) y
muchas cepas causan queratitis (de Hoog y otros, 2000).
Miembros de este complejo han sido frecuentemente encontrados

en varios ambientes tanto en suelos donde crecen
saprofíticamente sobre materia orgánica (Olivain y otros, 2006),
como en ambientes subterráneos (Dickson y Kirk, 1976; Northup y
otros, 1994; Rutherford y Huang, 1994; Cunningham y otros, 1995;
Koilraj y otros, 1999; Dupont y otros, 2007). Fusarium solani ha
sido encontrado también en asociación con escarabajos (Claydon
y Grove, 1984) y artrópodos (Kubátová y Dvořák, 2005).
En la Cueva de Lascaux en 2006 hubo una amplia invasión por

miembros de este complejo se cree que como consecuencia de
las obras de reparación de un sistema de aire acondicionada
(Dupont y otros, 2007). Un aporte de residuos orgánicos pudiera
haber sido utilizado por Fusarium para su crecimiento y dispersión
(Holden, 2003; Allemand, 2005). Dupont y colaboradores (2007)
llegaron a la conclusión que la causa más probable pero no cierta
192
Discusión
de la masiva difusión por Fusarium en Lascaux tenia que

encontrarse en el posible transporte de esporas desde el exterior
de la cueva hasta el interior por animales y seres humanos
(Dupont y otros, 2007). Una vez en la cueva estas esporas habrían
encontrado condiciones favorables para su germinación y su
sucesivo crecimiento.
La presencia de Fusarium en la Cueva de Doña Trinidad

representa un serio riesgo ya que como se ha demostrado podría
proliferar masivamente si las condiciones ambientales le son
favorables.
Una de las posibles causas de la presencia de Fusarium en la

Cueva de Doña Trinidad también podría encontrarse en la difusión
de esporas desde el exterior de la cueva hasta el interior. Sin
embargo, como en el caso de las proteobacterias no se puede
afirmar con certidumbre que Fusarium sea un componente
alóctono y no natural de la cueva estudiada. Además, en este
estudio Fusarium ha sido aislado en muestras de aire y suelo
recogidas también en zonas lejanas al paso de los visitantes. Ello
indica que este hongo está presente en la cueva, lo que se
confirmó por análisis molecular que favorecen la detección de
aquellos hongos numéricamente más abundantes y con una
cantidad relativamente elevada de micelio vegetativo (Smit y otros,
1999). En la actualidad, esporas de Fusarium podrían encontrar en
la cueva condiciones favorables para su expansión (humedad
constante, presencia de material orgánico muerto o procedente de
aguas de infiltración). La difusión de Fusarium por gran parte de la
cueva se vería favorecida por las corrientes de aire presentes en
la cueva. Ello representa un riesgo potencial para la conservación
193
Discusión
de la Cueva de Doña Trinidad y su arte rupestre. Sánchez-Moral y

colaboradores (comunicación personal) están actualmente
llevando a cabo estudios sobre la presencia y la caracterización de
corrientes de aire en la Cueva de Doña Trinidad y su relación con
el crecimiento de microorganismos (tanto bacterias como hongos)
implicados en procesos negativos para la conservación de su arte
rupestre.
4.2.2 Colonización por Fusarium
Considerando el papel que este género podría jugar en procesos

de biodeterioro de las pinturas y grabados presentes en la cueva
de Doña Trinidad y siendo el único detectado por ADN en la cueva
estudiada, se llevaron a cabo ensayos de colonización sobre
substratos de la cueva, como se realizó con el componente
bacteriano más representativo de las colonizaciones blancas
(Pseudonocardia). La cepa inoculada se aisló de una muestra de
suelo de la cueva así que el hecho de que creciera bien en el
ensayo del suelo sin suplemento de nutrientes significaría que el
mismo suelo de la cueva representaría condiciones adecuadas
para el crecimiento de este hongo. Sin embargo, el hecho de
mostrar crecimiento prácticamente nulo a la temperatura ambiental
(media) de la cueva (16°C) indica que no prolifera (o lo haría muy
lentamente) en las condiciones actuales de la cueva de Doña
Trinidad. No obstante, en condiciones de temperatura elevada
(28°C) parece que se potencia el crecimiento de Fusarium. A la
temperatura de 28°C, el crecimiento de Fusarium sobre suelo se
vería impulsado con la adición de fuentes de nitrógeno (por
ejemplo, peptona o cloruro de amonio) que parecen limitar su
crecimiento. El nitrógeno puede ser limitante para el crecimiento
194
Discusión
de microorganismos en suelos como se ha descrito previamente

(Bargagli y otros, 1998). Por tanto, sería importante limitar el
aporte de fuentes de nitrógeno con objeto de garantizar la no
proliferación de Fusarium. Mantener constante o evitar
incrementos de temperatura parece otro factor esencial para
limitar el crecimiento de Fusarium en la Cueva de Doña Trinidad.
4.2.3 Otros hongos minoritarios detectados
En las muestras de suelos y aire, que resultaron ser las que

poseían mayor variedad de hongos, se detectaron, en menor
proporción, los ordenes Pleosporales (el genero Massarina) y
Microascales (detectado también en las muestras de
excrementos). Dentro de este orden, el género más
frecuentemente detectado fue Pseudallescheria que se encuentra
comúnmente en suelos y otros ambientes naturales (de Hoog y
otros, 1994). Miembros del orden Pleosporales han sido
detectados en mármoles antiguos (Sert y otros, 2007) donde se ha
resaltado su papel en el deterioro de estos materiales (Krumbein y
Urzí, 1993; Wollenzien y otros, 1995) pero no existen citas en
ambientes subterráneos.
En el aire de la cueva también se detectó la especie Gliomastix

murorum que pertenece a los Ascomycota mitospóricos. Estos son
hongos que no tienen ninguna conexión ni con Ascomycota, ni con
Basidiomycota y producen sólo micelios estériles o micelios con
conidios (Guarro y otros, 1999). En cuevas con pinturas rupestres
miembros de estas divisiones no han sido previamente
detectados.
195
Discusión
En las muestras de aire se detectó también el orden Capnodiales

(con el género Cladosporium), la familia Myxotrichaceae
(Myxotrichum) y hongos Basidiomycota del orden Ustilaginales
(Ustilago).
Las especies del género Cladosporium son ubicuas y

particularmente abundantes en el aire de donde pueden ser
fácilmente aisladas (Sterflinger y Prillinger, 2001). Existen
evidencias de que estos microorganismos eucariotas juegan un
papel importante en procesos de biodeterioro (de la Torre y otros,
1993) aunque no se hayan detectado en cuevas con pinturas
rupestres si se han citado en ambientes subterráneos
(Simonovicová y otros, 2004).
El representante detectado en este estudio perteneciente al

género Ustilago dentro de los Basidiomycota, resultó relacionado
con la especie Ustilago cynodontis que es un hongo aerobio
obligado, dimorfo, capaz de crecer tanto como micelio como
levadura. El crecimiento como levadura es inducido por
cloranfenicol y bromuro de etidio, dos inhibidores de las funciones
mitocondriales (Mery-Drugeon y otros, 1981; Durieu-Trautmann y
otros, 1976). Miembros de este género no se han detectado en
ambientes subterráneos; sin embargo se han encontrado en otros
monumentos (Schabereiterr-Gurtner y otros, 2001). Las especies
del genero Myxotrichum habitan generalmente en hábitats
específicos y utilizan, por ejemplo, materiales ricos en celulosa
(Greif y otros, 2007). Este punto sugiere que convendría evitar
materiales de madera en la cueva con el fin de evitar el
crecimiento masivo de estos hongos, ya que en diversas cuevas el
empleo de pilares de maderas ha originado algunos problemas de
196
Discusión
colonizaciones, principalmente por hongos (Altamira y

Santimamiñe, por ejemplo).
Los géneros Arthroderma y Aphanoascus (del orden Onygenales),

detectados en muestras de escalera y espeleotemas, pertenecen
a los hongos queratinofilicos. Miembros del orden Onygenales han
sido detectados en suelos (Deshmukh y otros, 2008). Son
importantes a nivel ecológico porque descomponen una de las
proteínas animales más abundantes y estables en la tierra, la
queratina, que utilizan como substrato de crecimiento. La
distribución de estos hongos depende de diferentes factores, entre
los cuales uno de los más importantes es la presencia humana o
de animales (Deshmukh y otros, 2008). Ello sugiere que la
presencia de estos aislamientos podría deberse a factores
antropogénicos (las visitas de la cueva).
Las muestras de excrementos fueron las únicas en las que se

detectaron levaduras. El género Galactomyces contiene especies
muy importantes a nivel biológico y sus actividades bioquímicas
resultan significativas en la industria alimenticia (Naumova y otros,
2001). Algunas especies también pueden ser asociadas con
patógenos de plantas y, ocasionalmente, con enfermedades
pulmonares humanas (Naumova y otros, 2001). En las muestras
de excrementos se detectaron también otras levaduras
pertenecientes a la división Basidyomicota, de las cuales se
hablará más en detalle en el siguiente apartado, prestando más
atención a las técnicas utilizadas para su detección y
caracterización.
197
Discusión
4.2.4 Basidiomycota
Dentro de esta división se han clasificado diferentes levaduras

(Guarro y otros, 1999). Durante este estudio, aislamientos del
género Trichosporon han sido las únicas levaduras detectadas en
las muestras de excrementos junto con Galactomyces geotrichum
(Ascomycota) de la que se ha hablado anteriormente. El perfil de
DGGE de estas levaduras permitió únicamente diferenciar entre
los dos géneros, Trichosporon y Galactomyces (Fig. 3.36). La
secuenciación de las ITS y del gen ARNr 26S de los aislamientos
pertenecientes al género Trichosporon llevó a la detección de
cuatro grupos principales dentro de este género: Trichosporon
laibachii, Trichosporon multisporum, Trichosporon akiyoshidainum
y Trichosporon sp.
Las especies del género Trichosporon son capaces de asimilar

numerosas fuentes de carbono, degradar urea y pueden ocupar
diversos nichos ecológicos (Guého y otros, 1992). Este género ha
sido aislado también de guano en cuevas habitadas por
murciélagos en Japón (Sugita y otros, 2005). El guano de
murciélagos es considerado una fuente potencialmente rica en
levaduras. Los murciélagos también están presentes en la cueva
de Doña Trinidad y esta podría ser la fuente de estas levaduras en
la cueva estudiada.
Actualmente están descritas 21 especies dentro del género

Trichosporon, que comprenden especies que ocupan nichos
ecológicos específicos (Guarro y otros, 1999). Algunas especies
son habitantes de suelo y otras están asociadas con animales e
incluso seres humanos (Guarro y otros, 1999). Cinco especies
198
Discusión
tienen implicaciones clínicas (de Hoog y otros, 2000),

Trichosporon asahii, Trichosporon asteroides, Trichosporon
cutaneum, Trichosporon inkin y Trichosporon mucoides.
La especie Trichosporon laibachii es la más común, tiene una

distribución mundial en suelos, sedimentos, barro y detritus de
plantas (Domsch y otros, 2007), no está asociada con seres
humanos y se diferencia muy bien de especies patógenas. Sugita
y otros (2005) encontraron siete nuevas especies de Trichosporon
en muestras de guano de murciélagos en cuevas de Japón que
fueron incluidas en los cuatro diferentes serotipos en los que se
dividen las especies de Trichosporon (Sugita y otros, 2004). Las
especies Trichosporon laibachii y Trichosporon multisporum se
incluyen en el grupo Gracile-Porosum y en los serotipos I-III,
mientras que la especies Trichosporon akiyoshidainum no fue
detectada en las cuevas japonesas.
Partiendo del supuesto que Trichosporon es un género que

comprende especies con una taxonomía confusa (Lopandic y
otros, 2004), con el fin de caracterizar los cuatro grupos
principales de este género detectados en este estudio y cuyo
rango de porcentaje de similitud iba del 97% al 100%, se utilizó la
técnica RAPD. Los perfiles de RAPD dentro de estos grupos son
claramente diferentes. Ello indica que las cepas aisladas eran
diferentes entre sí y pudieran representar distintas especies dentro
del género Trichosporon y distintas a las detectadas por
secuenciación del gen ARNr 26S (Stomeo y otros, 2008).
Como se discutirá en el siguiente apartado, la caracterización

molecular basada en las secuencias del gen que codifica para la
199
Discusión
subunidad 26S del gen ARNr y el análisis por DGGE tienen una
resolución limitada a la hora de examinar especies muy cercanas
entre ellas, como es el caso de las especies del género
Trichosporon.
Como en el caso de las cuevas japonesas (Sugita y otros, 2005)

los resultados obtenidos demuestran la presencia de una amplia
diversidad dentro del género Trichosporon en la cueva de Doña
Trinidad aunque el empleo de técnicas moleculares como RAPD
parecen indispensables para su diferenciación.
4.2.5 Evaluación de la diversidad fúngica detectada en la

Cueva de Doña Trinidad y métodos empleados para detectarla
A partir de los hongos detectados, como en el caso de bacterias,

se construyeron curvas de cobertura para el número de OTUs
diferentes con lo cual ha sido posible observar el nivel de
diversidad fúngica detectada a través de este estudio en la Cueva
de Doña Trinidad. Al observar que esta curva de cobertura tendía
a crecer y no daba señales de alcanzar una asintota (Fig. 3.44) se
dedujo la presencia de una elevada diversidad fúngica en el
ambiente estudiado. Sin embargo, a diferencia de la curva de
cobertura construida en el caso de bacterias cultivadas (Fig. 3.31)
la curva de cobertura obtenida con el análisis de los hongos
detectados en este estudio sugiere que los métodos de cultivo en
el caso de los hongos son algo más adecuados a la hora de
analizar las comunidades fúngicas de muestras naturales ya que
la curva estaba más alejada de alcanzar una asintota que en el
caso de las bacterias.
200
Discusión
De hecho, la aplicación de métodos de cultivo en la detección de

hongos en ambientes naturales sigue siendo una de las técnicas
más utilizadas aunque sus limitaciones se hayan citado
frecuentemente (Zak y Visser, 1996; Bridge y Spooner, 2001).
La mayoría de las técnicas moleculares propuestas han sido

utilizadas en estudios sobre diversidad fúngica en suelos (Clapp y
otros, 2002) y también en este caso estas técnicas han servido
exclusivamente para identificar aislados y no para analizar la
distribución, diversidad y actividad de los hongos en los suelos
considerados (Anderson y otros, 2004). Por ello en los últimos
años varios grupos han intensificado su esfuerzo en perfeccionar
técnicas moleculares dirigidas al análisis de la diversidad fúngica
de ambientes naturales (Bornemann y otros, 2000; Bridge y
Spooner, 2001; Anderson y otros, 2004).
En este estudio, las técnicas moleculares se han utilizado tanto

por la identificación de los aislamientos caracterizados
morfológicamente, como por la construcción de genotecas a partir
de productos de PCR amplificados de ADN directamente extraído
de las muestras. Los resultados obtenidos demostraron que las
caracterizaciones morfológicas de las cepas aisladas sirvieron
para la identificación de estos aislamientos a nivel de género. Con
el empleo de las técnicas moleculares ha sido posible comprobar
el género detectado a nivel morfológico y también distinguir entre
cepas y especies. Ello sugiere que las dos técnicas se
complementan y pueden utilizarse conjuntamente para la
detección y la identificación de hongos en ambientes naturales.
201
Discusión
Las genotecas basadas en ADN nos sirvieron para detectar los

principales hongos presentes en las comunidades naturales de las
muestras analizadas. El género Fusarium resultó el único hongo
detectado a través de este análisis. Ello no significa que este
género sea el único hongo presente en las comunidades de las
muestras analizadas, ya que por ADN generalmente se detectan
aquellos microorganismos más abundantes en dichas
comunidades. La detección de Fusarium por ADN podría deberse
a la dispersión de esporas de este hongo y de ahí a la facilidad de
detectarlo. Sin embargo, resulta claro que este hongo está
presente en la Cueva de Doña Trinidad ya que ha sido detectado
por métodos moleculares y aislado en el laboratorio por métodos
de cultivo.
También en este caso, como en el caso de Pseudonocardia, los

métodos de cultivo han sido fundamentales a la hora de indagar
sobre el potencial colonizador que este hongo podría tener en la
cueva estudiada.
En el análisis de la diversidad fúngica de la Cueva de Doña

Trinidad, otra técnica utilizada, dirigida a la caracterización de las
levaduras detectadas, ha sido la técnica RAPD.
Los géneros de Trichosporon detectados en las muestras de

excrementos de mamíferos de la cueva, fueron en primer lugar
analizados por DGGE. Esta técnica resultó útil para distinguir entre
los dos géneros de levaduras encontradas en las muestras, pero
fue ineficaz a la hora de discriminar las cepas obtenidas
pertenecientes al género Trichosporon. Gracias a la secuenciación
del gen de ARNr 26S se pudieron dividir los aislamientos
202
Discusión
pertenecientes al género Trichosporon en 4 grupos de especies

diferentes. Con el empleo de la técnica RAPD se pudo afirmar que
estas cepas se caracterizaban por perfiles diferentes. Ello indicó la
presencia de aún más especies que las detectadas por
secuenciación del gen ARNr 26S o por DGGE.
La técnica RAPD se basa en el ADN total del microorganismo

considerado y no sólo en las regiones ITS o en fragmentos de las
subunidades de genes ARNr. Por ello, la técnica RAPD parece ser
más sensible que el análisis de las secuencias de genes ARNr
para la diferenciación de especies altamente relacionadas entre si
(Stomeo y otros, 2008).
De hecho, aunque la reproducibilidad de la técnica RAPD ha sido

criticada en varios estudios (Meunier y Grimont 1993;
Muralidharan y Wakeland, 1993; Tyler y otros, 1997), otros han
subrayado su utilidad a la hora de discriminar entre diferentes
especies de levaduras muy cercanas (Lopandic y otros, 2004,
2006). Ello indica que el rango taxonómico de las levaduras no
puede ser definido exclusivamente por secuenciación del gen
ARNr 26S sino que debería ser complementada con otras técnicas
fenotípicas y genotípicas.
203
Discusión
4.3 Aspectos relacionados con la conservación de la cueva

(en relación con los resultados obtenidos)
Como ya se ha mencionado, el primer paso ineludible en el

estudio del biodeterioro de monumentos y obras de arte es la
detección de los microorganismos que participan de manera activa
en dichos procesos negativos. Una vez obtenida esta información
ya se estaría en posición de idear estrategias dirigidas a su
conservación (González y Saiz-Jiménez, 2005).
En cuevas con pinturas rupestres habitan comunidades

microbianas muy complejas que interactúan entre sí y cuyo
desarrollo no es fácil de prever. Por ello, las medidas de
conservación que se lleven a cabo, tienen que ser muy prudentes
y guiarse por estudios de los microorganismos que participan en
los procesos de biodeterioro y específicos del ambiente
subterráneo en el que se trabaja.
Muchos son los ejemplos de cueva con pinturas rupestres en las

que se han utilizado medidas ineficaces, e incluso perjudiciales,
para su conservación. La Cueva de Lascaux es uno de los más
emblemáticos. Esta cueva fue descubierta en 1940 y en 1963 se
cerró al publico ya que se detectó una progresiva colonización por
microorganismos fotosintéticos. Tras el empleo de un biocida
(formaldehído) dirigido a la eliminación de esas comunidades, el
problema pareció haberse resuelto hasta que en 2001 la cueva se
vio invadida por el hongo Fusarium cuyo crecimiento y dispersión
se vio favorecido por los sistemas de aire acondicionado que se
instalaron en la cueva. El empleo de un fungicida detuvo
temporalmente su crecimiento. Otra bacteria (Pseudomonas)
204
Discusión
estaba asociada al crecimiento de Fusarium y comenzó a

desarrollarse como consecuencia de la materia orgánica producida
(Holden, 2003).
En la cueva de Altamira también se ha evaluado el empleo de

biocidas como el cloruro de benzalconio en algunas zonas muy
restringidas de la cueva. A partir de un análisis molecular basado
en ADN (Portillo, 2007) se detectó la presencia de Crenarchaeota
entre otros procariotas. Este autor sugirió que la biodegradación
del cloruro de benzalconio dio lugar a la producción de amonio
(Patrauchan y Oriel, 2003) y este pudo ser utilizado por algunos de
esos microorganismos detectados en las zonas tratadas con
biocida ya que, por ejemplo, las Crenarchaeota de temperaturas
bajas son típicos oxidadores de amonio (Konneke y otros, 2005).
Ello indica que el empleo de biocidas y fungicidas es una medida

poco apropiada para la conservación de cuevas con pinturas
rupestres ya que simplemente se transfiere el problema a otros
microorganismos que pueden desarrollarse en las nuevas
condiciones dando lugar a fenómenos impredecibles.
Otro de los factores que más alteran el equilibrio de las cuevas y

sus comunidades microbianas es la instalación de sistemas de
iluminación y las variaciones ambientales generadas por la
afluencia de los visitantes (Sánchez-Moral, 2005). La presencia de
corrientes de aire que favorece la dispersión de esporas de los
microorganismos que las producen es otro factor a tener muy
presente. Limitar o controlar la presencia de estas corrientes sería
otra medida apropiada para la conservación de las
representaciones artísticas de cuevas. Como ya se ha
205
Discusión
mencionado, en el caso de la Cueva de Doña Trinidad, este

camino ya se ha tomado en consideración. En este estudio se ha
presentado, por ejemplo, el caso de la posible dispersión de
hongos y bacterias gracias a corrientes de aire y presencia de
visitantes. La eliminación de luz permanente en la Cueva de Doña
Trinidad ha reducido el riesgo de colonizaciones basadas en
microorganismos fotótrofos.
Como ejemplos concretos deducidos de este trabajo se

plantearían dos procesos sencillos para la conservación de la
cueva de Doña Trinidad. Para el caso de la proliferación de
colonias blancas constituidas principalmente por Pseudonocardia,
se recomendaría especial atención a aumentos de los aportes de
materia orgánica y fosfatos al interior de la cueva con objeto de
evitar un mayor desarrollo de las colonizaciones blancas presentes
en la cueva. Con respecto a hongos como es el caso de Fusarium,
se deberían evitar incrementos de la temperatura de la cueva y
aportes de fuentes de nitrógeno con objeto de limitar las
posibilidades de proliferación de este hongo.
En ambos casos habrá que monitorizar periódicamente la

presencia de estos microorganismos y concentraciones de
nutrientes que podrías utilizarse de indicadores para evaluar los
riesgos microbiológicos para la Cueva de Doña Trinidad.
Nuevos métodos para el control del crecimiento de

microorganismos están en fase de experimentación y en el futuro
podrían proponerse también nuevos procedimientos para la
conservación de cuevas con pinturas rupestres. Estos métodos
deberán estudiarse minuciosamente por equipos multidisciplinares
206
Discusión
incluyendo el estudio de las comunidades microbianas asociadas

a estos procesos. Como ejemplos, podemos citar el caso de unos
investigadores finlandeses que están llevando a cabo
experimentos con un grupo de compuestos llamados sideroforos
(siderophores). Las bacterias normalmente los utilizan para la
absorción de hierro, un nutriente que requieren para la producción
de algunos enzimas esenciales. El empleo juicioso de estos
compuestos, producidos en el laboratorio, podrían servir para
absorber el hierro antes que las bacterias lo utilicen y de esta
manera detener su crecimiento (Castellani, 2005). Otros métodos
se basan en el empleo de compuestos químicos que bloquean la
comunicación intracelular entre bacterias “quórum sensing”
(Castellani, 2005). Estos dos métodos servirían para impedir
colonizaciones microbianas lo que en el caso de cuevas con
pinturas rupestres resultaría muy útil, pero nunca han sido
utilizados en cuevas y necesitan ser meticulosamente evaluados.
Por tanto, una consecuencia importante de este estudio enfatiza el

riesgo que supone el emplear drásticos métodos de limpieza que
pudieran alterar el equilibrio de las comunidades microbianas
actuales en la Cueva de Doña Trinidad y en otras cuevas con
pinturas rupestres y facilitar la dispersión de microorganismos.
A este respecto, convendría reseñar la frase de Allemand y Bahn

(2005) “Best way to protect rock art is to leave it alone”, que
resume el mejor camino que hoy en día tenemos si queremos
preservar el Patrimonio histórico cultural de cuevas con
representaciones artísticas debido a los riesgos que implican otras
intervenciones sin estudios apropiados que las avalen.
207
208
Capitulo 5: Conclusiones
209
210
Conclusiones
Conclusiones:
Los resultados obtenidos durante este trabajo han dado lugar a las
siguientes conclusiones generales:
1. La división Proteobacteria es el componente más

característico de las comunidades bacterianas de la
Cueva de Doña Trinidad. Las subdivisiones
Gammaproteobacteria y Alphaproteobacteria representan
la mayor actividad metabólica en las muestras estudiadas.
2. En la Cueva de Doña Trinidad se ha detectado un

desarrollo de colonizaciones blancas que representan
comunidades bacterianas características. Están
compuestas principalmente por la división Actinobacteria,
específicamente por el género Pseudonocardia.
3. En las comunidades bacterianas de la Cueva de Doña

Trinidad también se encuentran otros grupos bacterianos.
Uno de ellos son las acidobacterias que presentan una
gran diversidad en la Cueva de Doña Trinidad aunque su
metabolismo es poco conocido. Otro grupo importante en
el suelo de la cueva fueron las Bacterias Reductoras de
sulfato (Deltaproteobacteria). Otros grupos detectados en
menor proporción fueron Betaproteobacteria, Chloroflexi,
Planctomycetes, Deinococci, Nitrospirae y Bacteroidetes.
El papel de estas divisiones bacterianas en la cueva
estudiada es prácticamente desconocido.
211
Conclusiones
4. En la Cueva de Doña Trinidad se ha detectado la

presencia de hongos. Entre ellos, los ordenes Hypocreales
y Eurotiales dentro de la división Ascomycota y el orden
Tremellales dentro de los Basidiomycota. Fusarium
(Hypocreales) es el género más característico.
5. Los métodos moleculares basados en ADN han permitido

detectar los componentes bacterianos y fúngicos
presentes en la cueva estudiada. Los métodos
moleculares basados en ARN han servido para identificar
aquellas bacterias metabólicamente activas en las
comunidades estudiadas. La técnica empleada es esencial
para la clasificación de hongos siendo útil la combinación
de cultivos y determinadas técnicas moleculares. Por
ejemplo, el cultivo de bacterias y hongos ha hecho posible
el estudio de su capacidad para proliferar en distintas
condiciones.
6. A través de este estudio se ha detectado la mayoría de

los componentes bacterianos y fúngicos de las
comunidades microbianas de la Cueva de Doña Trinidad.
Entre estos Pseudonocardia (Bacteria) y Fusarium (Fungi)
constituyen los riesgos más significativos para la
conservación de la Cueva.
7. En cuanto a la colonización por Pseudonocardia,

convendría mantener un control de los aportes de materia
orgánica y fosfatos al interior de la cueva para limitar su
proliferación.
212
Conclusiones
8. Con respecto a la posible colonización por Fusarium,

convendría evitar un aumento de la temperatura de la
cueva y limitar aportes de nitrógeno inorgánico (amonio)
con objeto de restringir las posibilidades de proliferación
de este hongo.
213
214
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215
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263
264
Apéndice
265
266
Apéndice
Tabla 1. Secuencias de los clones obtenidos durante este estudio a partir de las
genotecas de ADN y ARN utilizando cebadores generales para Bacteria,
cebadores específicos para Acidobacteria y Bacterias Reductoras de Sulfato. Se
muestran las categorías taxonómicas (división, subdivisión en caso de
Proteobacteria, orden y género), las muestras de origen, los clones analizados y su
análisis molecular (ADN o ARN), el número de acceso, el número de bases
secuenciadas y el porcentaje de similitud con el homólogo más cercano.
Muestra Clon N° de Bases Afiliación Homólogo %

Acceso
Proteobacteria DQ819134 99
N14 B9 EU810954 923 Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Shigella
Proteobacteria EU589312 94
N14 B11 EU810955 929 Deltaproteobacteria
Proteobacteria EU472935 97
N14 C6 EU810956 924 Gammaproteobacteria
Actinobacteria EU538242 94
N14 B8 EU810957 380 Actinomycetales
Propionibacterium
Proteobacteria AM157425 99
N14 E1 EU8109581 528 Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Escherichia
N14 E3 EU8109591 509 Firmicutes AJ252578 96
Bacillales
1
N14 E6 EU810960 503 Proteobacteria AY960264 95
Gammaproteobacteria
1
N14 B1 EU811028 496 Proteobacteria DQ234100 93
Gammaproteobacteria
1,2
N14 A4 EU810994 467 Acidobacteria AY705452 89
Subdivisión 6
1,2
N14 F4 EU810997 467 Acidobacteria AY705452 89
Subdivisión 6
1,2
N14 G4 EU810998 439 Acidobacteria AY705456 85
Subdivisión 4
1,2
N14 E6 EU811000 497 Acidobacteria AY705464 85
Subdivisión 9
1,2
N14 H6 EU811002 444 Acidobacteria AY705478 100
Subdivisión 4
1,2
N14 E12 EU811003 467 Acidobacteria AY705452 89
Subdivisión 6
1
S18 A10 EU810964 471 Proteobacteria EU148768 94
Alphaproteobacteria
Sphingomonadales
S18 C1 EU8109651 471 Proteobacteria EU148768 99
Alphaproteobacteria
Sphingomonadales
S18 E9 EU8109661 463 Proteobacteria EU071484 97
Alphaproteobacteria
Sphingomonadales
Sphingomonas
1
Secuencias obtenidas a partir de ARN.
2
Secuencias obtenidas con el empleo de cebadores específicos para
Acidobacteria.
3
Secuencias obtenidas con el empleo de cebadores específicos para Bacterias
Reductoras de Sulfato.
267
Apéndice
Tabla1. (Continuación)

acceso
S18 F1 EU8109671 467 Proteobacteria EU450234 97

Alphaproteobacteria
Sphingomonadales
S18 G7 EU8109681 517 Proteobacteria EF615021 98
Alphaproteobacteria
Sphingomonadales
Sphingomonas
S18 H10 EU8109691 517 Proteobacteria EU540385 100
Gammaproteobacteria
1,2
S18 G7 EU811007 504 Acidobacteria AY705453 88
Subdivisión 9
1,2
S18 G8 EU811010 528 Acidobacteria DQ139445 89
Subdivisión 6
1,2
S18 H8 EU811011 529 Acidobacteria DQ139445 89
Subdivisión 6
Y21 B3 EU810900 931 Proteobacteria EU472935 99
Gammaproteobacteria
Y21 B4 EU810901 931 Proteobacteria DQ234143 99
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Escherichia
Y21 B11 EU810902 931 Firmicutes AM992116 99
Clostridiales
Clostridium
Y21 D4 EU810903 928 Proteobacteria EU530456 99
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Shigella
Y21 D10 EU810904 929 Proteobacteria EU472935 99
Gammaproteobacteria
Y21 D12 EU810905 923 Proteobacteria CP000948 99
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Escherichia
Y21 E3 EU810906 931 Proteobacteria DQ819134 99
Gammaproteobacteria
Y21 E8 EU810907 729 Proteobacteria EF702470 85
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Y21 F8 EU810908 927 Proteobacteria EU530456 99
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Shigella
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Shigella
Y21 G3 EU810910 928 Proteobacteria EU471043 99
Gammaproteobacteria
Y21 H5 EU810911 930 Proteobacteria AJ487022 99
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Y21 H5 EU8109121 466 Proteobacteria EU537516 94
Gammaproteobacteria
268
Apéndice
Tabla1. (Continuación)

acceso

Betaproteobacteria
Burkholderiales
Herbaspirillum
Y21 E11 EU8109141 479 Proteobacteria AY360587 99
Alphaproteobacteria
Methylobacteriaceae
Y21 E10 EU8109151 475 Proteobacteria DQ088788 99
Gammaproteobacteria
1
Y21 E6 EU810916 534 Proteobacteria AM157425 99
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Escherichia
Y21 B4 EU8109171 479 Proteobacteria CP000908 99
Alphaproteobacteria
Methylobacteriaceae
Y21 B3 EU8109181 534 Proteobacteria EU471144 99
Gammaproteobacteria
1
Y21 H6 EU810919 477 Proteobacteria EU622282 98
Alphaproteobacteria
Sphingomonadales
Sphingomonas
Gammaproteobacteria
1
Betaproteobacteria
Burkholderiales
Herbaspirillum
Betaproteobacteria
Burkholderiales
Herbaspirillum
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Shigella
Y21 G2 EU8110191,3 304 Proteobacteria AF098671 99
Deltaproteobacteria
Desulfovibrionales
Desulfovibrio
M13 B1 EU810890 849 Proteobacteria DQ256313 89
Gammaproteobacteria
Pseudomonadales
M13 D2 EU810891 916 Proteobacteria EU567051 99
Gammaproteobacteria
Pseudomonadales
Acinetobacter
P16 A8 EU810924 833 Proteobacteria EU470780 99
Gammaproteobacteria
P16 E1 EU810925 928 Proteobacteria EU530456 99
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Shigella
P16 F7 EU810926 926 Proteobacteria CP000970 99
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Escherichia
269
Apéndice
Tabla 1. (Continuación)

acceso
P16 G2 EU810927 926 Proteobacteria AJ487022 99

Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
G3 EU810928 923 Proteobacteria EU472684 99
P16 Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
P16 G9 EU810929 471 Proteobacteria EF447087 100
Alphaproteobacteria
P16 G11 EU810930 928 Proteobacteria EU535079 99
Gammaproteobacteria
1
P16 B9 EU810931 444 Firmicutes AY568584 96
Lactobacillales
Streptococcus
P16 B6 EU8109321 536 Bacteroidetes AY349397 98
Bacteroidales
Prevotella
P16 A10 EU8109331 476 Proteobacteria EU148768 98
Alphaproteobacteria
1
P16 A6 EU810934 511 Actinobacteria AF513962 99
Actinomycetales
Propionibacterium
P16 A5 EU8109351 469 Proteobacteria AY328649 93
Alphaproteobacteria
1
P16 A1 EU810936 490 Proteobacteria AY749436 96
Alphaproteobacteria
Sphingomonadales
Sphingomonas
P16 E9 EU8109371 471 Proteobacteria AY749436 99
Alphaproteobacteria
Sphingomonadales
Sphingomonas
Alphaproteobacteria
Sphingomonadales
Sphingomonas
Alphaproteobacteria
Methylobacteriaceae
P16 C9 EU8109401 522 Proteobacteria AY275479 99
Gammaproteobacteria
Pseudomonadales
Pseudomonas
P16 C7 EU8109411 471 Proteobacteria AY527757 99
Alphaproteobacteria
1
P16 C2 EU810942 528 Proteobacteria EU009194 99
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Shigella
P16 G10 EU8109431 499 Actinobacteria AY215258 98
Actinomycetales
Mycobacterium
P16 G9 EU8109441 523 Proteobacteria EU418726 96
Alphaproteobacteria
Sphingomonadales
Sphingomonas
270
Apéndice

acceso
P16 G2 EU8109451 471 Proteobacteria AY749436 99

Alphaproteobacteria
Sphingomonadales
Sphingomonas
P16 F11 EU8109461 471 Proteobacteria AY749436 99
Alphaproteobacteria
Sphingomonadales
Sphingomonas
P16 F4 EU8109471 471 Proteobacteria AY162053 99
Alphaproteobacteria
1
P16 F3 EU810948 473 Proteobacteria EF363045 97
Alphaproteobacteria
1
P16 E12 EU810949 471 Proteobacteria EU148768 99
Alphaproteobacteria
1
P16 B10 EU810950 534 Firmicutes AF003929 99
Lactobacillales
Streptococcus
P16 H2 EU8109511 528 Proteobacteria EU530456 99
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Shigella
P16 H4 EU8109521 471 Proteobacteria AY749436 99
Alphaproteobacteria
Sphingomonadales
Sphingomonas
P16 D5 EU8109841,2 498 Acidobacteria AY705482 89
Subdivisión 10
1,2
P16 D8 EU810985 474 Acidobacteria AY705489 94
Subdivisión 6
1,2
Subdivisión 6
1,2
Subdivisión 6
1,2
Subdivisión 10
1,2
P16 E7 EU810989 437 Acidobacteria AY705462 88
Subdivisión 4
1,2
Subdivisión 7
1,2
Subdivisión 10
1,2
P16 F10 EU810994 498 Acidobacteria AY705482 89
Subdivisión 10
L12 A11 EU810888 873 Proteobacteria DQ351777 93
Alphaproteobacteria
L12 B12 EU810889 865 Proteobacteria EU442518 96
Alphaproteobacteria
Rhizobiales
Aurantimonas
L12 4 EU810892 920 Proteobacteria AB105442 97
Gammaproteobacteria
L12 7 EU810893 897 Actinobacteria AF145257 99
Actinomycetales
Corynebacterium
L12 22 EU810894 863 Proteobacteria DQ289935 94
Alphaproteobacteria
271
Apéndice

acceso
L12 15.1 EU810895 921 Firmicutes EU260097 98

Bacillales
Bacillus
L12 16.1 EU810896 907 Actinobacteria EU379022 98
Actinomycetales
Corynebacterium
L12 22.1 EU810897 862 Proteobacteria AY162047 99
Alphaproteobacteria
L12 44 EU810898 736 Bacteroidetes DQ518919 91
Bacteroidales
Prevotella
L12 54 EU810899 905 Deinococci AF513964 93
Deinococcus
L12 C1 EU810961 731 Firmicutes EU029340 99
Bacillales
Bacillus
L12 D10 EU811027 570 Proteobacteria EF620926 99
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Escherichia
L12 B2 EU8109621 506 Actinobacteria AM157438 99
Actinomycetales
Propionibacterium
L12 B5 EU8109631 469 Proteobacteria AY527757 99
Alphaproteobacteria
1,2
L12 D4 EU811006 454 Acidobacteria AY705461 92
Subdivisión 3
1,3
L12 C6 EU811016 306 Proteobacteria EU284513
Deltaproteobacteria
Desulfuromonadales
R17 E3 EU810970 787 Firmicutes AM696853 99
Bacillales
R17 F3 EU810971 434 Proteobacteria EF447087 100
Alphaproteobacteria
R17 B4 EU811026 921 Proteobacteria CP000948 99
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Escherichia
R17 A5 EU8109721 471 Proteobacteria EU148768 99
Alphaproteobacteria
1
R17 B2 EU810973 528 Proteobacteria AM157425 98
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Escherichia
R17 C4 EU8109741 499 Proteobacteria EU090893 98
Betaproteobacteria
Burkholderiales
Herbaspirillum
R17 H2 EU8109751 470 Proteobacteria EU148768 99
Alphaproteobacteria
1
R17 C5 EU811029 528 Proteobacteria AM157425 98
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Escherichia
R17 B4 EU8110081,2 506 Acidobacteria AY705453 89
Subdivisión 9
1,2
R17 C4 EU811009 504 Acidobacteria AY705453 88
Subdivisión 9
272
Apéndice

acceso
AA23 A9 EU447071 921 Proteobacteria AY921716 95

Betaproteobacteria
AA23 A10 EU447072 937 Proteobacteria AJ252641 94
Deltaproteobacteria
AA23 C2 EU447073 899 Actinobacteria AY571815 95
Actinomycetales
Pseudonocardia
AA23 C7 EU447074 915 Proteobacteria DQ205300 99
Gammaproteobacteria
Pseudomonadales
Pseudomonas
AA23 D1 EU447075 929 Firmicutes DQ207729 99
Bacillales
Bacillus
AA23 D8 EU447076 902 Planctomycetes DQ207729 90
AA23 F5 EU447077 991 Actinobacteria AY395379 97
Rubrobacteridales
Actinomycetales
Pseudonocardia
Actinomycetales
Pseudonocardia
AA23 F11 EU447080 924 Acidobacteria AY382609 98
AA23 G8 EU447081 931 Firmicutes DQ207729 99
Bacillales
Bacillus
AA23 H2 EU447078 896 Actinobacteria AY571815 95
Actinomycetales
Pseudonocardia
AA23 H4 EU447082 922 Proteobacteria U00096 99
Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Escherichia
AA23 H7 EU447064 915 Nitrospirae AJ252684 99
AA23 H9 EU447065 926 Firmicutes AY281078 99
Lactobacillales
Streptococcus
Actinomycetales
Pseudonocardia
Actinomycetales
Pseudonocardia
AA23 A8 EU4470681 542 Planctomycetes AY704400 93
AA23 B6 EU4470691 496 Chloroflexi DQ154873 90
AA23 B8 EU4470671 505 Actinobacteria AY494649 99
Actinomycetales
Pseudonocardia
AA23 B10 EU4470701 507 Actinobacteria DQ228713 95
Actinomycetales
Crossiella
AA23 B10 EU8109761,2 445 Acidobacteria AY705486 97
Subdivisión 4
1,2
AA23 B11 EU810977 493 Acidobacteria AY705464 89
Subdivisión 9
273
Apéndice

acceso
AA23 C8 EU8109791,2 444 Acidobacteria AY705486 97
Subdivisión 4
1,2
AA23 C9 EU810980 480 Acidobacteria AY705452 91
Subdivisión 6
1,3
AA23 F4 EU811021 307 Proteobacteria EF662438 92
Deltaproteobacteria
1,3
AA23 H7 EU811023 306 Proteobacteria EU134569 96
Deltaproteobacteria
274
Apéndice
Tabla 2. Secuencias de las cepas aisladas durante este estudio por cultivo a partir
de las muestras utilizando cebadores generales para Bacteria y cebadores
específicos para Acidobacteria. Se muestran las categorías taxonómicas (división,
subdivisión en caso de Proteobacteria, orden y género), las muestras de origen, las
cepas analizadas y su análisis molecular (ADN o ARN), el número de acceso, el
número de bases secuenciadas y el porcentaje de similitud con el homólogo más
cercano.
Muestra Cepa N° de Bases Afiliación Homólogo %

Acceso
A1 1 EU810811 818 Actinobacteria AY442265 97

Actinomycetales
Kitasatospora
A1 3 EU810847 849 Actinobacteria EU570570 98
Actinomycetales
Streptomyces
B2 7 EU81012 871 Actinobacteria AB249908 98
Actinomycetales
Streptomyces
B2 2 EU810822 881 Proteobacteria DQ205300 99
Gammaproteobacteria
Pseudomonadales
Pseudomonas
B2 4 EU810830 861 Actinobacteria AM114429 99
Actinomycetales
Arthrobacter
B2 1 EU810836 899 Firmicutes AM950301 99
Bacillales
Bacillus
B2 6 EU810838 1035 Actinobacteria AM397442 93
Actinomycetales
Kitasatospora
B2 8 EU810839 1084 Firmicutes EU417673 98
Bacillales
Bacillus
B2 5.1 EU810848 840 Actinobacteria AY442265 99
Actinomycetales
Kitasatospora
B2 5.2 EU810849 860 Proteobacteria EF101830 99
Betaproteobacteria
B2 9 EU810850 905 Proteobacteria AY622320 99
Gammaproteobacteria
Pseudomonadales
Pseudomonas
C3 1 EU810869 907 Firmicutes AY043084 98
Bacillales
Bacillus
D4 2.1.1 EU810868 830 Firmicutes AM162325 97
Bacillales
Paenibacillus
D4 13.1 EU810875 849 Actinobacteria EU677786 97
Actinomycetales
Amycolatopsis
D4 24 EU810876 734 Actinobacteria AB249907 99
Actinomycetales
Streptomyces
D4 35 EU810877 783 Actinobacteria AB271058 98
Actinomycetales
Jiangella
275
Apéndice

Acceso
E5 2 EU810819 802 Actinobacteria EU699628 99

Actinomycetales
Streptomyces
Actinomycetales
Streptomyces
Actinomycetales
Micromonospora
Actinomycetales
Streptomyces
F6 4 EU810852 886 Firmicutes AJ315058 99
Bacillales
Bacillus
F6 5 EU810853 895 Firmicutes EU625359 99
Bacillales
Bacillus
F6 9 EU810854 901 Firmicutes AM293001 99
Bacillales
Bacillus
F6 13 EU810855 901 Firmicutes AM293003 99
Bacillales
Bacillus
F6 14 EU810870 980 Firmicutes EU563375 97
Bacillales
Bacillus
G7 8 EU810813 768 Actinobacteria EU098031 98
Actinomycetales
Streptomyces
G7 12 EU810816 849 Firmicutes EF690424 95
Bacillales
Paenibacillus
G7 4 EU810823 970 Proteobacteria EU013944 98
Betaproteobacteria
Burkholderiales
Wautersia
G7 13 EU810824 899 Proteobacteria DQ196478 98
Alphaproteobacteria
Rhizobiales
Aminobacter
G7 1 EU810831 581 Proteobacteria EF101860 85
Betaproteobacteria
G7 11 EU810835 917 Firmicutes EU290157 97
Bacillales
Paenibacillus
G7 3 EU810837 864 Proteobacteria AY277555 96
Gammaproteobacteria
Pseudomonadales
Pseudomonas
G7 2 EU810840 1137 Proteobacteria EU013944 98
Betaproteobacteria
Burkholderiales
Wautersia
G7 13.1 EU810856 845 Proteobacteria AM285009 99
Alphaproteobacteria
Rhizobiales
Aminobacter
276
Apéndice

Acceso
G7 14 EU810857 891 Firmicutes AM950300 99

Bacillales
Bacillus
G7 15 EU810858 885 Firmicutes AM950300 99
Bacillales
Bacillus
G7 6 EU810871 1036 Firmicutes AF414443 98
Bacillales
Bacillus
G7 4.1 EU810882 826 Actinobacteria EU677780 100
Actinomycetales
Streptomyces
Z22 3 EU810817 691 Actinobacteria EU699736 87
Actinomycetales
Streptomyces
Z22 4 EU810825 955 Actinobacteria EU603366 97
Actinomycetales
Streptomyces
N14 10 EU810815 897 Actinobacteria EF491601 97
Actinomycetales
Streptomyces
N14 5 EU810820 916 Actinobacteria EU699535 98
Actinomycetales
Streptomyces
N14 6 EU810828 600 Actinobacteria AB297961 97
Actinomycetales
Lentzea
N14 21 EU810884 863 Actinobacteria AY158025 99
Actinomycetales
Agromyces
Actinomycetales
Streptomyces
Actinomycetales
Lentzea
N14 14 EU810845 1114 Proteobacteria DQ205300 98
Gammaproteobacteria
Pseudomonadales
Pseudomonas
Actinomycetales
Saccharothrix
Actinomycetales
Saccharothrix
S18 4 EU810818 967 Actinobacteria EU603366 98
Actinomycetales
Streptomyces
S18 16 EU810821 671 Actinobacteria AY465234 99
Actinomycetales
Streptomyces
S18 6 EU810826 972 Firmicutes EF612335 98
Bacillales
Bacillus
Actinomycetales
Streptomyces
277
Apéndice

Acceso
S18 1 EU810844 1088 Firmicutes DQ993300 99

Bacillales
Bacillus
S18 8.2 EU810846 1076 Firmicutes EU124558 97
Bacillales
Bacillus
S18 7 EU810863 898 Firmicutes EU124558 99
Bacillales
Bacillus
Actinomycetales
Streptomyces
Y21 1 EU810829 668 Actinobacteria EU593656 98
Actinomycetales
Streptomyces
Y21 6 EU810865 1188 Actinobacteria AB249908 100
Actinomycetales
Streptomyces
Y21 7 EU810866 863 Actinobacteria EF491601 98
Actinomycetales
Streptomyces
Y21 8.2 EU810867 809 Firmicutes EF522800 86
Bacillales
Bacillus
R17 5 EU810814 914 Firmicutes DQ842538 98
Bacillales
Oceanobacillus
R17 4 EU810885 691 Firmicutes EU124558 92
Bacillales
Bacillus
R17 7 EU810886 593 Proteobacteria DQ205300 99
Gammaproteobacteria
Pseudomonadales
Pseudomonas
R17 8 EU810832 863 Firmicutes EU647709 98
Bacillales
Bacillus
R17 1 EU810841 1131 Firmicutes AM293003 97
Bacillales
Bacillus
R17 2 EU810860 892 Proteobacteria EF447074 99
Gammaproteobacteria
Pseudomonadales
Pseudomonas
R17 5.2.2 EU810861 896 Firmicutes DQ842538 99
Bacillales
Oceanobacillus
R17 6 EU810862 880 Proteobacteria EF447074 99
Gammaproteobacteria
Pseudomonadales
Pseudomonas
H 6 EU8108741 367 Acidobacteria AY703474 95
Subdivisión 4
1
Secuencia procedente del enriquecimiento obtenido para el cultivo de
Acidobacteria.
278
Apéndice

Acceso
I9 21 EU810879 701 Actinobacteria AY376893 97

Actinomycetales
Pseudonocardia
I9 24 EU810880 715 Actinobacteria EU274337 98
Actinomycetales
Pseudonocardia
I9 28 EU810881 896 Actinobacteria AY376893 98
Actinomycetales
Pseudonocardia
279
Apéndice
Tabla 3. Secuencias de los hongos obtenidos durante este estudio a partir del
cultivo de las muestras y de técnicas moleculares basadas en ADN. Se muestran
las categorías taxonómicas (división, orden y género), las muestras de origen, las
cepas y los clones analizados, el número de acceso, el número de bases
secuenciadas y el porcentaje de similitud con el homólogo más cercano.
Muestra Cepa/ N° de Bases Afiliación Homólogo %

Clon Acceso
C3 18 EU779669 282 Ascomycota AB193719 98

Onygenales
Arthoderma
C3 20.1 EU779672 264 Ascomycota EU833210 94
Eurotiales
Aspergillus
C3 20 EU779693 254 Ascomycota AF033494 95
Eurotiales
Penicillium
D4 1 EU779673 289 Ascomycota EU833210 100
Eurotiales
Aspergillus
G7 34 EU779670 396 Ascomycota AF038357 93
Onygenales
Aphanoascus
X23 15 EU779675 499 Ascomycota EF200097 99
Eurotiales
Penicillium
PP16 4b EU779677 251 Ascomycota EF652084 98
Eurotiales
Eurotium
PP16 1b EU779690 332 Ascomycota EF652084 97
Eurotiales
Eurotium
PP16 10 EU779671 373 Ascomycota EU693451 97
Eurotiales
Aspergillus
Suelo 2 EU779689 259 Ascomycota EU693451 95
39 Eurotiales
Aspergillus
Suelo 1 EU779695 494 Ascomycota AB214656 99
39 Eurotiales
Simplicillum
Suelo 8 EU779684 280 Ascomycota EU710828 97
Eurotiales
Fusarium
SLE 2b EU779679 549 Ascomycota AF383963 87
Pleosporales
Massarina
SLE 3.1 EU779678 520 Ascomycota AY879799 93
Microascales
Pseudallescheria
MM13 2.1 EU779674 439 Ascomycota DQ132843 96
Eurotiales
Penicillium
MM13 19 EU779694 446 Ascomycota EF568080 95
Microascales
Scedosporium
EU779691 366 Ascomycota DQ810186 97
K11 4 Eurotiales
Penicillium
280
Apéndice

Clon Acceso
K11 5 EU779692 335 Ascomycota EF634415 98

Eurotiales
Penicillium
ARB P6 2 EU779676 430 Ascomycota EU833227 98
Eurotiales
Penicillium
ARB P6 3 EU779681 182 Ascomycota AJ971408 97
Capnodiales
Cladosporium
ARB P6 2b EU779682 388 Basidiomycota AY345000 98
Ustilaginales
Ustilago
ARB D4 1 EU779680 436 Ascomycota EF029216 99
Ascomycota mitosporicos
Gliomastix
ARB D4 1b EU779697 213 Ascomycota DQ780380 97
Capnodiales
Cladosporium
ARB V22 2 EU779696 280 Ascomycota EU710828 97
Eurotiales
Fusarium
ARB V22 1 EU779683 315 Ascomycota AF062814 96
Myxotrichaceae
Myxotrichum
L12 E3 EU8110241 884 Ascomycota EF397944 99
Eurotiales
Fusarium
L12 E9 EU8110251 852 Ascomycota EF397944 99
Eurotiales
Fusarium
MM13 3.1 EU779685 444 Basidiomycota EU289353 98
Tremellales
Trichosporon
MM13 8 EU779686 407 Basidiomycota EF653931 99
Tremellales
Trichosporon
MM13 10 EU779698 365 Basidiomycota EF460551 100
Tremellales
Trichosporon
MM13 14 EU779699 305 Basidiomycota EU289353 96
Tremellales
Trichosporon
MM13 4 EU779700 495 Ascomycota, EU194453 98
Saccharomycetales
Galactomyces
MM13 9 EU779687 509 Basidiomycota AF414695 96
Tremellales
Trichosporon
MM13 7 EU779705 120 Basidiomycota AJ608948 96
Tremellales
Trichosporon
MM13 5 EU779688 363 Basidiomycota EU289353 99
Tremellales
Trichosporon
1
Secuencias de clones obtenidos a partir de la genoteca de ADN.
281
Apéndice

Clon Acceso
K11 10 EU779701 338 Basidiomycota EU289353 98

Tremellales
Trichosporon
K11 9 EU779702 400 Basidiomycota EU289353 97
Tremellales
Trichosporon
K11 11 EU779703 306 Basidiomycota EF653931 97
Tremellales
Trichosporon
K11 7 EU779704 399 Basidiomycota DQ914693 98
Tremellales
Trichosporon
282

Análisis de Comunidades Microbianas PDF

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Análisis de comunidades microbianas

presentes en la cueva de Doña

Memoria que presenta

En Sevilla, a 6 de Octubre de 2008

Visado en Sevilla, a 6 de Octubre de 2008

Dr D. Juan Miguel González Grau

Dr. D. Miguel Angel Caviedes Formento

Memoria que presenta

Dña. Francesca Stomeo

Certifica: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Análisis de

En Sevilla, a 6 de Octubre de 2008

Este trabajo ha sido posible gracias a la financiación del proyecto europeo

Además deseo expresar mi agradecimiento al Dr. D. Juan Miguel González

Al profesor Dr. D. Cesaréo Saíz-Jimenéz por su apoyo y disposición

A todos mis compañeros del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología

A todos los amigos de Sevilla quienes han hecho de mi estancia en Sevilla

A los amigos de siempre, simplemente por estar a pesar de la distancia.

A mi familia, porque siempre gracias a vosotros.

A los viajes, a la música y a quien sabe sonreír.

1.1 Microbiología de ambientes subterráneos 3

1.2 Técnicas microbiológicas para el estudio

1.3 Objetivos de la tesis 27

Capitulo 2: Materiales y Métodos 29

2.1 Descripción de la Cueva de Doña Trinidad 31

2.2 Estudio de las comunidades bacterianas 36

2.2.1 Análisis moleculares 44

2.2.3 Actividades enzimáticas 56

2.2.4 Metabolismo de hidratos de carbono 56

2.2.5 Colonización por Pseudonocardia 57

2.2.6 Medios de cultivos 60

Caldo de Triptona soja (TSB) 60

Medio con suelo para Acidobacteria 62

2.2.7 Soluciones y Tampones 63

Solución EDTA 0.5M, pH 8,0 63

2.3 Estudio de las comunidades fúngicas 68

2.3.1 Análisis molecular 72

Amplificación por PCR de fragmentos de genes de ITS

Aislamiento y caracterización morfológica 77

2.3.3 Colonización por Fusarium 78

2.3.4 Medios de cultivos 79

Medio MA (extracto de Malta-Agar) 79

3.1 Comunidades bacterianas en la cueva de

3.1.1 Comunidades bacterianas de las

3.1.2 Comunidades bacterianas de

3.1.3 Comunidades bacterianas de los

Análisis de las genotecas 96

3.1.4 Comunidades bacterianas en trazos negros 100

Análisis de las genotecas 100

Comparación de los resultados obtenidos a través de 101

3.1.5 Comunidades bacterianas en

Análisis de las genotecas 104

Cultivo de Pseudonocardia 109

3.1.6 Comparación de los distintos grupos

3.1.7 Cultivos a partir de otras muestras 124

3.1.8 Análisis global de las secuencias obtenidas 129

3.1.9 Curvas de cobertura 133

3.2 Comunidades fúngicas en la Cueva de Doña

3.2.1 Muestras de suelo 137

3.2.2 Muestras de escalones y espeleotema 138

3.2.3 Muestras de aire de la cueva 143

3.2.4 Muestras de excrementos 144

3.2.5 Técnicas moleculares aplicadas a la

3.2.6 Ensayo de colonización por Fusarium 148