El cannabidiol induce la elevación del calcio intracelular y Citotoxicidad en

oligodendrocitos

POR: SUSANA MATO, MARIA VICTORIA SANCHEZ-GOMEZ Y CARLOS MATUTE

RESUMEN
El consumo excesivo de marihuana se ha relacionado con alteraciones histológicas de la
materia blanca. Sin embargo, el impacto del cannabis constituyentes en restos
fisiopatológicos oligodendrogliales mal entendido. Aquí, investigamos los efectos in vitro
de cannabidiol, el principal componente de marihuana no psicoactivo, en los
oligodendrocitos. Exposición al cannabidiol inducida un aumento intracelular de Ca21 en
los oligodendrocitos del nervio óptico eso no estuvo mediado principalmente por la
entrada desde el espacio extracelular, ni por interacciones con ryanodina o receptores IP3.
Aplicación del protonóforo mitocondrial carbonilcianuro-p-trifluorometoxifenilhidrazona
(FCCP; 1 lM) evitó por completo el posterior cannabidiol inducido Ca21 respuestas. Por el
contrario, el aumento de Ca21 citosólico los niveles provocados por FCCP se redujeron
después de la exposición previa al cannabidiol, lo que sugiere que las mitocondrias actúan
como la fuente del aumento de Ca21 provocado por el cannabidiol en los
oligodendrocitos. Además, breve exposición al cannabidiol (100 nM – 10 lM) condujo a
una disminución dependiente de la concentración de la viabilidad oligodendroglial que no
fue impedida por los antagonistas de CB1, CB2, receptores vanilloides, A2A o PPARg, pero
en cambio reducido en ausencia de Ca21 extracelular. El efecto oligodendrotóxico del
cannabidiol fue parcialmente bloqueado por inhibidores de caspasa-3, -8 y -9, PARP-1 y
calpaínas, lo que sugiere la activación de caspasa-dependiente e independiente vías de
muerte. El cannabidiol también provocó una alteración dependiente de la concentración
del potencial de membrana mitocondrial, y un aumento en las especies reactivas de
oxígeno (ROS) que fue reducido en ausencia de Ca21 extracelular. Finalmente, la
citotoxicidad inducida por el cannabidiol fue parcialmente prevenida por ROS carroñero
trolox. Juntos, estos resultados sugieren que el cannabidiol causa desregulación
intracelular de Ca21 que puede conducir a la desaparición de oligodendrocitos.
INTRODUCCIÓN
La planta de cáñamo (Cannabis sativa, marihuana) es la la droga ilícita más utilizada en
todo el mundo. La mayor parte del cannabis los usuarios lo experimentan por primera vez
en la adolescencia, con casi la mitad de personas mayores de 12 años en los EE. UU. Que
lo han probado en al menos una vez durante su vida (SAMSHA, 2007). La adolescencia es
un período crítico para el neurodesarrollo que incluye mecanismos como la formación o
remodelación de proyecciones axonales y la mielinización del blanco tractos de materia
(Giorgio et al., 2008). Recientemente, el desarrollo de nuevas técnicas de resonancia
magnética que proporcionan medios sensibles para detectar patología de la materia
blanca ha permitido monitorear anormalidades estructurales sugestivas de mielinización
deteriorada en varias sustancias blancas zonas de consumidores de cannabis adolescentes
y adultos jóvenes (Arnone et al., 2008; Ashtari et al., 2009; Bava et al., 2009). Estos datos
son indicativos de que los componentes de la marihuana pueden alterar los mecanismos
involucrados en la formación y mantenimiento de la vaina de mielina.
La marihuana contiene alrededor de 80 componentes terpenofenólicos llamados
cannabinoides, responsables de los efectos de derivados del cannabis en la función
cerebral. El principal componente psicoactivo de la marihuana, (2)-D9-
tetrahidrocannabinol (D9-THC), ejerce la mayor parte de su actividad biológica a través de
la interacción con dos receptores acoplados a proteínas G proteínas conocidas como
receptores cannabinoides CB1 y CB2 (Izzo et al., 2009). Sin embargo, las preparaciones de
cannabis contienen varios otros cannabinoides bioactivos que ejercen efectos múltiples a
través de diferentes mecanismos, a menudo independientes de los receptores CB1 y CB2.
Entre estos compuestos, (2) -cannabidiol (CBD) es el más abundante en extractos de
cannabis, y el que muestra el más amplio gama de acciones farmacológicas. El CBD exhibe
efectos antiinflamatorios, analgésicos, antioxidantes y neuroprotectores, que lo
convierten en un agente prometedor para el tratamiento de diferentes afecciones
patológicas, que incluyen enfermedades desmielinizantes (Pryce y Baker, 2005). CBD
También se ha demostrado que induce la apoptosis en las células tumorales a través de
mecanismos que dependen del tipo de célula y que incluir la desregulación de la
homeostasis Ca21 y la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Ligresti et al.,
2006; Massi et al., 2004; McKallip et al., 2006). Objetivos para las acciones farmacológicas
de CBD incluyen la modulación del receptor transitorio potencial vanilloide 1 canales
(TRPV1), receptores 5-HT1A, receptores de glicina, transportador de membrana de
adenosina y receptores A2A, receptor-g activado por proliferador de peroxisoma (PPAR-g),
receptores CB2 y el endocannabinoide enzima degradante ácido graso amida hidrolasa,
entre otros (Izzo et al., 2009).
Un número limitado de estudios ha abordado los efectos de los componentes del cannabis
en oligodendrocitos (OL), las células responsables de la formación de la vaina de mielina
en el sistema nervioso central. Recientemente informó que D9-THC reduce los transitorios
de Ca21 provocados en OL por despolarización de membrana, a través de ambos CB1
mecanismos dependientes e independientes del receptor (Mato et al., 2009). En este
estudio, buscamos investigar los efectos del CBD sobre la homeostasis oligodendroglial de
Ca21 y viabilidad. Informamos que el CBD induce una elevación dependiente de la
concentración de Ca21 intracelular junto con una interrupción del potencial de membrana
mitocondrial (MMP) y un aumento de la producción de ROS, que culminan en una
reducción de la viabilidad oligodendroglial mediada por la activación de caspasa
dependiente e independiente cascadas de la muerte.
MATERIALES Y MÉTODOS
Drogas
(2) - Canabidiol (CBD), AM251, AM630 y GW9662 fueron suministrados por Tocris
Bioscience (Bristol, Reino Unido), resuspendidos en dimetilsulfóxido (DMSO) hasta 10 mM
finales soluciones de almacenamiento y almacenado a 220 C hasta su uso. Los inhibidores
específicos de caspasa-3, -8/6 y -9 Ac-DEVD-CHO, Ac-LEHD-CHO y Ac-IETD-CHO se
compraron de Péptidos Internacional (Louisville, KY). El inhibidor de PARP-1 DPQ, el
compuesto antioxidante trolox y el el antagonista del receptor IP3 2-APB se obtuvo de
Calbiochem (La Jolla, CA). Ryanodine fue comprado de Ascent Scientific (Bristol, Reino
Unido), y se obtuvo carbonilcianuro-ptrifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) de Sigma-
Aldrich (Madrid, España). Otros productos químicos eran del grado comercial más alto
disponible.
Animales
Los animales fueron alojados en las instalaciones de animales de la Universidad del País
Vasco y mantenidos en una temperatura (21 C 6 1 C) y humedad (55% 6 10%) controladas
habitación con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Comida y agua fueron disponible ad
libitum. Los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices de las
Comunidades Europeas.
Directiva 86/609 / CEE del Consejo y fueron aprobadas por el comité Ético de
Investigación Animal de nuestra institución.
Cultivos de oligodendrocitos
Los cultivos OL se prepararon a partir de Sprague de 12 días. Dawley nervios ópticos de
rata como se describió anteriormente (S anchez-G omez et al., 2003). Las células se
sembraron en 24- placas de pocillos con cubreobjetos de 14 mm de diámetro recubiertos
con poli-D-lisina (10 lg / mL) a 10,000 células por pocillo, y mantenido a 37 ° C y 5% de CO2
en forma química medio definido.
Culturas de neuronas corticales
Se obtuvieron cultivos de neuronas corticales de E18 los embriones de rata Sprague-
Dawley como se describe en otra parte (Ruiz et al., 2009). Las neuronas fueron
resuspendidas en B27 medio neurobasal más 10% de FBS y luego sembrado en placas de
48 pocillos recubiertas con poli-L-ornitina a 1.5 3 105 células por pozo El medio fue
reemplazado por suero libre, B27-medio neurobasal suplementado 24 h después. Los
cultivos estaban esencialmente libres de astrocitos y microglía y se mantuvieron a 37 ° C y
5% de CO2.
Medición de [Ca21]
[Ca21] se calculó mediante el método de relación 340/380 como descrito anteriormente
(Alberdi et al., 2010). OLs fueron cargado con fura-2 AM (5 lM; Invitrogen, Carlsbad, CA) y
se lavó durante 5 minutos en la solución de baño que contiene 137 mM NaCl, 5.3 mM KCl,
0.4 mM KH2PO4, 0.35 mM Na2HPO4, HEPES 20 mM, NaHCO3 4 mM, glucosa 10 mM,
MgCl2 1 mM, CaCl2 2,5 mM y BSA 0,5 mg / ml, pH 7.4. La solución libre de Ca21 se
preparó omitiendo CaCl2 y añadiendo EGTA 50 lM. Los experimentos se realizaron en una
cámara de cubreobjetos perfundida continuamente con tampón de incubación a 1 ml /
min exponiendo las células a CBD en ausencia o presencia de antagonistas. La
concentración final de DMSO en las soluciones de baño fue 0.1%, que no produjo un
efecto significativo sobre el oligodendroglial [Ca21] i. Después de cada experimento la
perfusión sistema y la cámara de grabación fueron cuidadosamente lavar con etanol
diluido y agua destilada para evitar cualquier traspaso de CBD. La cámara de perfusión fue
montada en el escenario de un Zeiss (Oberkochen, Alemania) microscopio de
epifluorescencia invertido (Axiovert 35), equipado con una lámpara de xenón de 150 W
policromada IV (T.I.L.L. Photonics, Martinsried, Alemania) y un Plan Neofluar 403 objetivo
de inmersión en aceite (Zeiss). Las células eran visualizado con un blanco y negro digital de
alta resolución Cámara CCD (ORCA, Hamamatsu Photonics Ib erica, Barcelona, España), y
las imágenes se adquirieron cada 5 s.
Se realizó la adquisición de imágenes y el análisis de datos utilizando el programa de
software AquaCosmos (Hamamatsu Photonics Ib erica). Los resultados se calculan como
área bajo la curva (AUC) de la respuesta para cada celda del inicio de la aplicación de CBD.
Los datos se expresaron como el media 6 SEM de al menos tres experimentos
independientes, y los porcentajes de inhibición para cada condición siempre se calcularon
versus experimentos de control llevados a cabo en paralelo.
Ensayos de viabilidad celular
La viabilidad de OLs (1 DIV) y neuronas (8 DIV) fue determinado a las 24 h después de la
exposición al CBD (20–30 min). La viabilidad oligodendroglial se evaluó utilizando calceína-
AM (1 lM; Molecular Probes, Barcelona, España), como descrito anteriormente (Domercq
et al., 2010). Viabilidad de las neuronas se determinaron midiendo el nivel de lactate
deshidrogenasa (LDH; Cytotox 96, Promega, Madison, WI) liberada de las células dañadas
en el cultivo medios de comunicación. Calceína fluorescente y Citotox 96 colorimétrico la
reacción se estimó usando un fluorímetro Synergy-HT (Instrumentos de Bio-Tek, Beverly,
MA). Los resultados fueron expresados como porcentaje de muerte celular versus control,
y al menos tres experimentos independientes por triplicado se realizaron para cada
condición.
Medición de especies reactivas de oxígeno
La generación intracelular de ROS se determinó utilizando 5- (y-6) -clorometil-20 70
-acetato de diclorodihidrofluoresceína diacetato (CM-H2DCFDA). OLs fueron cargados con
CM-H2DCFDA a 30 lM durante 30 minutos después de la exposición al CBD, y se usó
calceína-AM (1 lM) para cuantificar el número de celdas dentro del campo de lectura.
Fluorescencia se midió usando un fluorímetro Synergy-HT, y los resultados se expresaron
como la media de 6 SEM de al menos tres experimentos independientes realizados por
triplicado.
Determinación de mitocondriales
Potencial de membrana
5,50 6,60-Tetracloro-1,10, 3,30 -tetraetilbencimidazolilcarbiocianina yodo (JC-1,
Invitrogen) se utilizó para medir el potencial de membrana mitocondrial (MMP) en OLs
(Domercq et al., 2010). Las células fueron cargadas con JC-1 (1 lM) durante 15 min y se
lavó dos veces. La fluorescencia roja / verde se midió usando un fluorímetro Synergy-HT
antes de agregar CBD, y en diferentes momentos después de la adición de la droga. El
agonista del receptor de glutamato AMPA se usó como control para la despolarización
mitocondrial en estos experimentos (S anchez-G omez et al., 2003).
Todos los experimentos se realizaron por cuadruplicado y los valores proporcionados
(media 6 S.E.M. de al menos tres experimentos independientes) se expresan como
porcentajes de cambio versus pozos de control.
Análisis de los datos
En los experimentos de medición de Ca21, n corresponde a el número de celdas utilizadas
para cada condición, mientras que en el resto de ensayos corresponde al número de
cultivos probados. Los datos fueron analizados con Excel (Microsoft, Seattle, WA) y Prism
(GraphPad Software, San Diego, CA) software. Significación estadística entre dos datos.
Los conjuntos se probaron utilizando la prueba t de Student con una evaluación crítica
probabilidad de P <0.05.
RESULTADOS
El cannabidiol induce Ca21 intracelular elevaciones en oligodendrocitos la exposición de
OLs de nervio óptico de rata a CBD provocó una elevación sostenida y dependiente de la
concentración de [Ca21] i (Fig. 1A). El aumento de [Ca21] i inducido por CBD (1 lM) no fue
impedido por la aplicación previa de CB1 (AM281, 1 lM) o antagonista del receptor CB2
(AM630, 1 lM), ni por el bloqueador TRMV1 capsazepina (1 lM) (Fig.1B). Exposición de OLs
a una solución de baño libre de Ca21 indujo una disminución sostenida de [Ca21] i (datos
no se muestra) y solo impidió parcialmente la respuesta de Ca21 provocado por CBD (1
lM) (42,6% 6 3% de inhibición; n 5 68 células, P <0,0001) (Fig. 1B). Informes anteriores
sugieren esa afluencia de Ca21 a través de canales de Ca21 activados por voltaje y / u
operados por la tienda (VGCC y SOCC) podría contribuir a la elevación [Ca21] i inducida
por CBD en OL (Mato et al., 2009; Paez et al., 2009). Sin embargo, la aplicación de baño
del antagonista de VGCC y SOCC LaCl3 (50 lM) no contrarrestar el aumento de [Ca21] i
provocado por CBD (Fig. 1B). Del mismo modo, el bloqueo de los VGCC de tipo L, que
median la mayoría de la entrada de Ca21 inducida por la despolarización en nuestros
cultivos OL (Mato et al., 2009), con nifedipina (10 lM) no evitó las respuestas inducidas por
CBD (Fig. 1B). El bloqueo de los receptores de ryanodina e IP3 con ryanodina (50 lM) y 2-
APB (50 lM) respectivamente, no prevenir el aumento [Ca21] i inducido por CBD, lo que
sugiere que el retículo endoplásmico no está involucrado en la elevación de CBDevoked
[Ca21] i en OLs (Fig. 1B). Finalmente, para probar la contribución de las mitocondrias a
CBD-inducida [Ca21] i respuestas, evaluamos la capacidad de FCCP, un desacoplador de la
síntesis de ATP que causa Ca21 mitocondrial fuga, para evitar el efecto del CBD en [Ca21]
i. La aplicación de FCCP (1 lM) provocó una elevación sostenida en [Ca21] i y
completamente abrogado el [Ca21] i aumento evocado por CBD (Fig. 1C, E). Luego
razonamos que si la liberación de Ca21 de las mitocondrias es la ruta principal para CBD-
inducida [Ca21] me elevo en OLs, preexposición a El CBD debería reducir la capacidad de
FCCP para elevar el Ca21 citosólico. De hecho, la aplicación de CBD en el baño (1 lM) evitó
parcialmente la posterior FCCP inducida [Ca21] i respuestas (24.3% 6 3% inhibición; n 5 60
células, P < 0,0001) (Fig. 1D, E). Juntos, estos datos indican que el CBD desencadena
elevaciones [Ca21] i en las OL principalmente a través de Ca21 liberación de las
mitocondrias.
El cannabidiol desencadena la muerte oligodendroglial se ha propuesto la desregulación
de [Ca21] i inducida por CBD tener consecuencias fisiopatológicas opuestas según el tipo
de célula, incluida la protección contra apoptóticos señalización que implica disfunción
mitocondrial [Ca21] i en neuronas (Ryan et al., 2009) y activación de apoptosis en células
transformadas (Ligresti et al., 2006). Exposición de OLs (1) DIV) a CBD (100 nM – 1 lM)
durante 20–30 min indujo una reducción dependiente de la concentración en la viabilidad
celular que fue no observado en cultivos de neuronas corticales (8 DIV) (Fig. 2A), mientras
que la activación de los receptores AMPA (con AMPA 25 lM junto con ciclotiazida 100 lM),
utilizada como control positivo, fue tóxico (28,6% 6 8% de disminución en la viabilidad
neuronal). Bloqueo selectivo de los receptores CB1 (AM281, 1 lM), receptores CB2
(AM630, 1 lM), receptores TRPV1 (capsazepina, 1 lM), receptores PPARg (GW9662, 100
nM) o adenosina A2A receptores (ZM241385, 100 nM) no previenen el CBD tóxico a los
oligodendrocitos (Fig. 2B). Por el contrario, y recuerda el efecto de la eliminación de Ca21
de las soluciones de baño sobre las respuestas de [Ca21] i inducidas por CBD,
olidodendroglial la muerte se redujo parcialmente cuando las células estaban expuestas a
CBD en ausencia de Ca21 extracelular (50.4% 6 18% de inhibición; n 5 5, P <0.05) (Fig. 2B),
lo que sugiere que la desregulación de [Ca21] i homeostasis contribuye al daño
oligodendroglial inducido por CBD.

Papel de las caspasas, PARP-1 y Calpain en Oligodendrotoxicidad inducida por CBD

Para investigar los mecanismos moleculares de Oligodendrotoxicidad inducida por CBD,
evaluamos la muerte celular en presencia de diferentes inhibidores de caspasa. Selectivo
inhibición de caspasa-3 con DEVD (100 lM) significativamente redujo la disminución de la
viabilidad OL provocada por la exposición a 100 nM y 1 lM CBD, pero no impidió efecto
tóxico de 10 lM CBD (Fig. 3A, B), lo que indica que la concentración del compuesto
cannabinoide determina la activación de diferentes vías de muerte. Para más caracterizar
el mecanismo de toxicidad inducida por CBD en OLs, los experimentos posteriores se
llevaron a cabo utilizando 1 lM de CBD. El daño oligodendroglial por CBD (1 lM)
fueparcialmente prevenido por inhibidores de caspasas aguas arriba de caspase-3, como
el inhibidor de caspase-8 IETD (100 lM) (60.9% 6 16% de inhibición, n 5 6, P <0.05) y el
inhibidor de caspasa-9 asociado a mitocondrias LEHD (100 lM) (63.2% 6 14% de inhibición,
n 5 4, P <0.05) (Fig. 3B), lo que sugiere que el efecto citotóxico del CBD implica la
activación concomitante de extrínseca y vías apoptóticas intrínsecas o mitocondriales.
La falta de efecto del inhibidor de caspasa-3 para bloquear completamente la muerte de
OL inducida por CBD puede indicar la contribución de las vías de muerte apoptóticas y / o
necróticas independientes de caspasa al efecto citotóxico del compuesto cannabinoide.
Un activador importante de la muerte celular independiente de la caspasa es una
flavoproteína mitocondrial llamado factor inducido por apoptosis (AIF), que media
condensación de cromatina y fragmentación de ADN cuando translocado al núcleo (Hong
et al., 2004). Lanzamiento de AIF de las mitocondrias puede desencadenarse por
diferentes mecanismos, incluida la activación de la poli (ADPribose) polimerasa-1 (PARP-
1). Para verificar si la activación de esta enzima nuclear participa en el CBD inducido
muerte oligodendroglial, utilizamos el inhibidor selectivo de PARP-1 DPQ solo, y en
combinación con el inhibidor de caspasa3 DEVD. Preincubación de OLs con DPQ (30 lM)
previno parcialmente el efecto citotóxico de 1 lM CBD (22.6% 6 15% de inhibición, n 5 4, P
<0.05), pero no contrarrestó la muerte oligodendroglial en 10 lM CBD (34.8% 6 9% de
muerte celular en el control vs. 31.3% 6 8% en DPQ, n 5 4). Inhibición concomitante de
PARP-1 y caspasa-3 usando ambos inhibidores bloqueados casi por completo la reducción
de la viabilidad oligodendroglial inducida por 1 CBD 1M (99.2% 6 12% de inhibición, n 5 3,
P <0.01) (Fig. 3B). Finalmente, un mecanismo adicional que podría contribuir a la
citotoxicidad inducida por CBD es la activación de la calpaína de cisteína proteasa sensible
a Ca21, que ha sido implicado en oligodendroglial excitotóxico muerte (Liu et al., 2002).
Pretratamiento de OLs con PD150606 (100 lM) también redujo la muerte oligodendroglial
por 1 lM CBD (52% 6 20% de inhibición, n 5 7, P <0.05) (Fig. 3B), que indica la participación
de calpaína en el efecto tóxico del compuesto cannabinoide. En general, estos datos
sugieren la participación de ambos dependientes de caspasa y mecanismo independiente
en la muerte oligodendroglial inducida por CBD.

La exposición al cannabidiol interrumpe el Potencial de membrana mitocondrial y

Aumenta la generación de ROS
Cambios en MMP y permeabilización posterior de la membrana mitocondrial son pasos
críticos en muerte celular dependiente de mitocondrias (Galluzzi et al., 2009; Ijima et al.,
2006). Por lo tanto, para investigar más a fondo la participación de las mitocondrias en el
daño oligodendroglial inducido por CBD, examinamos el efecto del compuesto
cannabinoide en MMP utilizando la sonda sensible al voltaje JC-1. La exposición al CBD
condujo a una alteración dependiente del tiempo y la concentración de MMP
oligodendroglial (Fig. 4A). Por lo tanto, el CBD (1 lM) provocó una hiperpolarización
sostenida de MMP que fue estadísticamente significativo en todos los tiempos probados.
Por el contrario, la concentración más alta de CBD analizada (10 lM) provocó una
hiperpolarización inicial de la membrana mitocondrial, seguido de despolarización
sostenida de MMP. No lo hicimos detectar efectos significativos de bajo CBD (100 nM) en
MMP.
Aplicación de AMPA (100 lM) 1cyclothiazide (100 lM) como un control positivo condujo a
una pérdida de tiempo dependiente de MMP (Fig. 4A), como se describió previamente
(Sanchez-G omez et al., 2003). Estos datos indican que la desregulación de MMP puede
contribuir al efecto tóxico de un alto CBD concentraciones en OLs.
La producción excesiva de ROS se ha asociado con la activación de la vía apoptótica
mitocondrial (Galluzzi et al., 2009). Además, la muerte del tumor inducida por CBD las
células se han relacionado con la producción de ROS (Ligresti et al., 2006; McKallip et al.,
2006). Por lo tanto, decidimos examinar la participación de ROS en la muerte
oligodendroglial desencadenada por CBD. La exposición de OLs a CBD provocó un
aumento dependiente de la concentración en ROS intracelular niveles (Fig. 4B). Cabe
destacar, el efecto de CBD (1 lM) en la producción de ROS dependía de Ca21, ya que se
redujo significativamente cuando se realizaron experimentos en el ausencia de Ca21
extracelular (94,6% 6 15% de inhibición, n 5 5, P <0,05). Finalmente, el papel de las ROS
inducidas por CBD la producción de muerte oligodendroglial se confirmó aún más al
examinar la muerte celular en presencia de ROS carroñero trolox. Preincubación de OLs
con trolox (100 lM) condujo a una reducción significativa de CBD-inducida muerte celular
(35.4% 6 6% inhibición, n 5 6, P <0.05) (Fig. 4C). En general, estos datos sugieren que
depende de Ca21 la producción de ROS participa en la oligodendrotoxicidad inducida por
CBD.
DISCUSIÓN
CBD induce Ca21 intracelular Movilización en OLs

La regulación de [Ca21] i homeostasis juega un papel crítico en fisiología oligodendroglial, con

patrones de señalización de Ca21 que determinan si estas células proliferan, migrar, diferenciar y
mielinizar axones, someterse dañar, reparar o morir (Butt, 2006; Matute, 2010). CBD se ha
informado que provoca elevaciones de [Ca21] i en diferentes tipos de células, incluidas las
neuronas primarias y las células transformadas (Drysdale et al., 2006; Ligresti et al., 2006; Ryan et
al., 2009). La exposición al CBD indujo una respuesta [Ca21] i dependiente de la concentración en
OLs, en marcado contraste con los efectos de otros compuestos cannabinoides en estas células
(Mato et al., 2009). De hecho, tenemos recientemente se demostró que las altas concentraciones
(3 lM) de diferentes agonistas de los receptores CB1 y / o CB2, incluido el fitocannabinoide
psicoactivo D9 -THC, no modular niveles basales de [Ca21] i en OLs, argumentando en contra de la
posibilidad de que los receptores CB1 y CB2 estén involucrados en elevaciones de [Ca21] i
inducidas por CBD en estas células. Consecuentemente, los antagonistas de los receptores CB1 y
CB2 no contrarrestaron la respuesta Ca21 desencadenada por CBD en OLs, ya que ninguno de los
dos hizo el bloqueo de los receptores TRPV1, VGCC o SOCC.

Estos últimos resultados contrastan con la contribución observada de los VGCC a la respuesta
[Ca21] i desencadenada por CBD en neuronas primarias (Drysdale et al., 2006), lo que sugiere que
el tipo regulación inducida por CBD de la homeostasis de Ca21.

El hecho de que la señal [Ca21] i inducida por CBD no se anule por completo cuando Ca21 se
elimina de la solución de baño señala claramente una importante contribución de las fuentes
intracelulares al efecto del compuesto cannabinoide. Sin embargo, un papel para extracelular
Ca21 no se puede concluir inequívocamente a partir de estos experimentos, ya que la eliminación
de Ca21 de la solución de baño indujo una disminución sostenida del oligodendroglial [Ca21] i que
podría modular per se CBD inducida [Ca21] i respuesta. La alta naturaleza lipofílica de los
cannabinoides les otorga acceso directo a objetivos intracelulares tales nosotros las mitocondrias,
y el trabajo anterior ha demostrado la contribución directa de este organelo a CBD inducido [Ca21]
i respuesta (Ryan et al., 2009). De acuerdo con esta idea, la aplicación en el baño del protonóforo
mitocondrial FCCP, conocido por provocar la liberación de Ca21 del compartimento mitocondrial,
provocó un rápido aumento de [Ca21] i y evitó completamente nuevas respuestas de Ca21 por
CBD Además, la capacidad de FCCP para elevar [Ca21] i en OLs se redujo significativamente por la
aplicación previa de CBD, lo que sugiere que el compuesto cannabinoide provoca un agotamiento
parcial de Ca21 mitocondrial. Finalmente, la elevación inducida por CBD [Ca21] i no fue alterada
por los bloqueadores de ryanodina y receptores IP3. En conjunto, nuestros hallazgos indican que
las mitocondrias son la principal fuente de [Ca21] i elevaciones desencadenadas por CBD en OLs.

El CBD desencadena la muerte oligodendroglial vía dependiente de caspasa e independiente

caminos

La sobrecarga de Ca21 citosólica está involucrada en una serie de condiciones patológicas que
implican muerte oligodendroglial (Matute, 2010). Exposición a corto plazo de OLs del nervio óptico
a CBD indujo una reducción dependiente de la concentración de viabilidad celular que no se
observó en las neuronas corticales.
Nuestros hallazgos en neuronas están de acuerdo con anteriores informa sobre la ausencia de
efectos tóxicos de altas concentraciones de CBD en una variedad de células no transformadas
(Hampson et al., 1998; Ligresti et al., 2006) y muestran que los OL in vitro muestran una
vulnerabilidad inusual a este compuesto cannabinoide. Con reminiscencias de la respuesta
inducida por CBD [Ca21] i en OLs, el efecto citotóxico de el CBD en estas células no fue prevenido
por antagonistas de receptores CB1, CB2 o TRPV1, ni por bloqueo de otros objetivos informados
de CBD, como adenosina A2A y receptores PPARg (Izzo et al., 2009), pero en cambio reducido
cuando los experimentos se realizaron en un Ca21- medio de cultivo libre. En conjunto, estos
datos sugieren que la elevación de [Ca21] i contribuye a la oligodendrotoxicidad inducida por CBD,
de acuerdo con datos previos sobre mecanismos subyacentes a la actividad nociva de este
compuesto cannabinoide en células tumorales (Ligresti et al., 2006).

Desde un punto de vista mecanicista, nuestros datos sugieren La implicación de las vías
apoptóticas dependientes de caspasa en el efecto tóxico de 100 nM y 1 lM CBD, como el DEVD
inhibidor de caspasa-3 específico reducido efectivamente la disminución de la viabilidad
oligodendroglial inducida por estas concentraciones del compuesto cannabinoide. Por contraste,
ni DEVD ni el inhibidor de PARP-1 DPQ previno la muerte celular después de la exposición a 10 lM
CBD, sugiriendo que se activan altas concentraciones de CBD principalmente vías necróticas. Estos
resultados sugieren que la concentración de CBD determina la contribución relativa de diferentes
cascadas bioquímicas que conducen a la muerte oligodendroglial, que bien podría estar
relacionada con la diferente grado de sobrecarga de Ca21, disfunción mitocondrial y producción
de ROS (discutido más adelante), como se informó anteriormente para los eventos moleculares
que conducen a la excitotoxicidad en OL (S anchez-G omez et al., 2003). Los inhibidores de
caspasa-8 y -9 fueron protectores contra muerte celular por 1 lM CBD, lo que indica que los
mediadores de las vías apoptóticas extrínsecas e intrínsecas se activan y apuntan a un papel
importante de las mitocondrias en la toxicidad inducida por CBD. La vía extrínseca de la apoptosis
que implica el reclutamiento de caspasa-8 es desencadenado a través de la activación de
receptores de muerte como nosotros Fas / CD95 y TNFaR1, mientras que la apoptosis mitocondrial
se desencadena por estímulos intracelulares como Ca21 sobrecarga y ROS (Galluzzi et al., 2009;
Kaufmann y Hengartner, 2001). Alternativamente, la apoptosis extrínseca la vía puede ser
reclutada por diafonía de la vía mitocondrial, ya que varios estudios han demostrado la activación
de caspasa-8 aguas abajo de caspasa-3 (Wieder et al., 2001; von Haefen et al., 2003). En este
sentido, nuestros datos (sobrecarga de Ca21, implicación de caspase9 y alteración de MMP)
favorecen una activación secundaria de la vía extrínseca a la apoptosis después de la exposición al
CBD. Por otro lado, muerte oligodendroglial en respuesta al CBD (1 lM) también se evitó
parcialmente por inhibición de la enzima reparadora de ADN PARP-1. La activación de PARP1 es un
evento clave en la vía de muerte celular inducida por AIF, un mediador importante de la neuronal
independiente de caspasa y muerte oligodendroglial que se libera de las mitocondrias tras un
estímulo que interrumpe la MMP (Hong et al. al., 2004; Jurewicz et al., 2005). Finalmente,
inducido por CBD la muerte oligodendroglial también podría prevenirse mediante la inhibición de
la calpaína cisteína proteasa dependiente de Ca21, que puede desencadenar la muerte celular
tanto dependiente de caspasa como independiente después de la sobrecarga de Ca21, que tiene
estado involucrado en la excitotoxicidad oligodendroglial (Liu et al., 2002; Sánchez-Gómez et al.,
2003). En total, estos los datos sugieren que tanto la caspasa como la AIF dependen las vías de
muerte contribuyen al efecto citotóxico del CBD en oligodendrocitos.
Papel de la disfunción mitocondrial y producción de ROS en CBD-inducida Oligodendrotoxicidad

Alteraciones en la estructura y función mitocondrial desempeñar un papel clave en la regulación

de la muerte celular, y es generalmente aceptado que los cambios en la integridad de la
membrana mitocondrial preceden a la apoptosis (Galluzzi et al., 2009).

La exposición al CBD provocó una alteración dependiente del tiempo y la concentración de MMP,
con 1 lM induciendo un hiperpolarización sostenida, mientras que 10 lM indujeron una
hiperpolarización inicial y una despolarización posterior. Estos resultados recuerdan hallazgos
anteriores mostrando que la desregulación de MMP depende de la intensidad y duración del
insulto, ya que tanto la hiperpolarización y se ha informado que la despolarización ocurre en
respuesta a la isquemia en neuronas (Ijima, 2006). Anterior los estudios en diferentes tipos de
células sugieren que la hiperpolarización de MMP es un punto fundamental temprano en las vías
apoptóticas, que puede conducir a la liberación de citocromo c, activación del verdugo caspase-3
(Poppe et al., 2001), y del Cascada PARP-1 / AIF (Kim et al., 2003). Trabajo reciente de nuestro
laboratorio ha vinculado la hiperpolarización MMP con daño a los OL en respuesta a las células
microgliales activadas por lipopolisacárido (Domercq et al., 2007). Sobre el por otro lado, la
despolarización de la mitocondria interna membrana y liberación de moléculas proapoptóticas
como el citocromo cy AIF son características conocidas en el daño oligodendroglial desencadenado
por diferentes estímulos, que incluyen excitotoxicidad, isquemia y exposición a beta amiloide
oligómeros (Alberdi et al., 2010; Domercq et al., 2010; Sanchez-Gomez et al., 2003).
Hiperpolarización de la la membrana mitocondrial puede ocurrir en respuesta a ROS producción (Li
et al., 1999; Nagy et al., 2003) y, por el contrario, la interrupción de MMP puede desencadenar
intracelular elevación ROS (Skulachev 2006). Por lo tanto, la disfunción mitocondrial grave
asociada con la despolarización y la permeabilización de la membrana mitocondrial ha sido
vinculado consistentemente a un aumento de los niveles de ROS en diferentes tipos de células,
incluidos los OL (Alberdi et al., 2010; Galluzzi et al., 2009; S anchez-G omez et al., 2003). Notable,
se ha informado que diferentes compuestos cannabinoides desencadenar la despolarización
mitocondrial, la producción de ROS, y muerte celular independientemente de los receptores CB
(Athanasiou et al., 2007). La exposición de los OL al CBD provocó una elevación significativa de los
niveles de ROS en todas las concentraciones probado, y la participación de ROS en la citotoxicidad
inducida por CBD, confirmada por el efecto protector del antioxidante trolox, está de acuerdo con
la conocida vulnerabilidad de estas células a los efectos nocivos del estrés oxidativo (Alberdi et al.,
2010; Benjamins y col. 2003; Liu et al., 2002; Sánchez-Gómez et al., 2003). Aunque la capacidad del
CBD para inducir la producción de ROS en OLs puede parecer sorprendente en vista de su
antioxidante propiedades cuando se usa en altas concentraciones (Hampson et al., 1998), aquí
proporcionamos evidencia a favor de un posible mecanismo responsable de la producción de ROS
por CBD además de la desregulación reportada de la MMP, que es la elevación de [Ca21] i. De
hecho, el aumento de Ca21 intracelular inducido por CBD ocurrió en el mismo rango de
concentraciones que desencadenan la producción de ROS y oligodendrotoxicidad. Además, la
capacidad del CBD generar ROS parece ser dependiente de Ca21, como lo fue borrado cuando
Ca21 fue eliminado del medio de cultivo. En general, la interpretación más obvia de nuestro los
hallazgos son que el CBD induce disfunción mitocondrial y estrés oxidativo resultante de la muerte
oligodendroglial, que recuerda informes anteriores sobre los mecanismos subyacente a los efectos
antitumorales de este compuesto (Ligresti et al., 2006; McKallip et al., 2006).
Implicaciones Fisiológicas

Estudios recientes de imágenes cerebrales han proporcionado evidencia que el consumo

temprano y / o intenso de marihuana está relacionado con el blanco anormalidades de la
microestructura de la materia que sugieren regional mielinización defectuosa y / o disminuida
(Arnone et al., 2008; Ashtari et al., 2009; Bava et al., 2009; Matochick et al., 2005). Aunque la
fisiopatología subyacente mecanismos siguen siendo poco conocidos, estos hallazgos indican que
los componentes del cannabis pueden desregular la fisiología oligodendroglial y conducir a
defectos posteriores en la maduración de la vaina de mielina, que continúa hasta finales de la
adolescencia. En este contexto, tenemos previamente informó que la activación de los receptores
CB1 en OL por D9 - El THC reduce la afluencia de Ca21 inducida por la despolarización en estos
células, con un posible efecto en el reconocimiento axonal y el inicio de mielina (Mato et al.,
2009). Los resultados actuales mostrando que el CBD modula la homeostasis de Ca21 y la
viabilidad de los OL son el primer informe sobre la actividad de la constituyente principal no
psicoactivo de los derivados del cannabis en estas células. Aunque la sensibilidad del ser humano
OL a los efectos del CBD in vivo aún no se han determinado, una consideración importante al
evaluar estos los datos son que las concentraciones de CBD por encima de 100 nM han sido
medido en el plasma de los consumidores de cannabis (Agurell et al., 1986). Nuestros resultados
proporcionan un mecanismo adicional por el cual el abuso de cannabis puede afectar
negativamente formación, mantenimiento y reparación de la vaina de mielina.

Aunque las consecuencias fisiológicas de las anormalidades de la sustancia blanca en los

consumidores de cannabis no están claras, dos líneas de evidencia respaldan la posibilidad de que
contribuyan a el posterior desarrollo de trastornos psiquiátricos.

Primero, el abuso de cannabis se ha asociado constantemente a mayor riesgo de afecciones

psiquiátricas como la esquizofrenia (Arseneault et al., 2004; Henquet et al., 2005) y depresión
mayor (Bovasso 2001; Medina et al., 2007). Segundo, la acumulación de datos converge para
implicar anormalidades en la conectividad de la materia blanca, pensada para surgir de disfunción
oligodendroglia o incluso la muerte, en la patogenia de la esquizofrenia y la depresión. (Davis et
al., 2003; Fields 2008; Medina et al., 2007). En este sentido, nuestros resultados sugieren que la
desregulación inducida por CBD de la fisiología oligodendroglial puede contribuir a los efectos
nocivos del cannabis en la salud mental.